[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

CN101062407A - 促红细胞生成素在预防或治疗视网膜损伤中的用途 - Google Patents

促红细胞生成素在预防或治疗视网膜损伤中的用途 Download PDF

Info

Publication number
CN101062407A
CN101062407A CNA2006100262423A CN200610026242A CN101062407A CN 101062407 A CN101062407 A CN 101062407A CN A2006100262423 A CNA2006100262423 A CN A2006100262423A CN 200610026242 A CN200610026242 A CN 200610026242A CN 101062407 A CN101062407 A CN 101062407A
Authority
CN
China
Prior art keywords
retinal
cells
erythropoietin
epo
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA2006100262423A
Other languages
English (en)
Inventor
徐国彤
李维业
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Original Assignee
Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS filed Critical Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority to CNA2006100262423A priority Critical patent/CN101062407A/zh
Priority to US12/299,006 priority patent/US20090209455A1/en
Priority to CNA2007800243393A priority patent/CN101534850A/zh
Priority to AU2007247679A priority patent/AU2007247679B2/en
Priority to EP07720997.1A priority patent/EP2037952B1/en
Priority to JP2009506902A priority patent/JP5238690B2/ja
Priority to CA002650877A priority patent/CA2650877A1/en
Priority to PCT/CN2007/001424 priority patent/WO2007128222A1/en
Publication of CN101062407A publication Critical patent/CN101062407A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1816—Erythropoietin [EPO]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0048—Eye, e.g. artificial tears
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明公开了一种预防或治疗哺乳动物视网膜损伤的方法，所述的方法包括：向需要预防或治疗的对象眼睛的玻璃体腔内给予有效剂量的促红细胞生成素(EPO)。本发明首次证实，EPO具有有效保护血－视网膜屏障以及视网膜血管和神经元等作用。此外，采用眼内局部给药EPO，可降低用药量且不会对体内其它器官或组织产生不良影响。

Description

促红细胞生成素在预防或治疗视网膜损伤中的用途
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及一种可预防或治疗哺乳动物视网膜损伤的方法；本发明还涉及一种眼内注射制剂以及含有所述眼内注射制剂的药盒。
背景技术
糖尿病视网膜病变(DR)是20-70岁糖尿病患者的主要致盲原因。目前对糖尿病视网膜病变的认识是：糖尿病视网膜病变不仅是微血管病变，它还涉及到视网膜中各种类型的细胞的病变(Gardner TW等，Diabetic retinopathy：more thanmeets the eye.Surv Ophthalmol 47：S253-S262，2002；Erich Lieth等(The PennState Retina Research Group)：Retinal neurodegeneration：early pathology indiabetes.Clinical and Experimental Ophthalmology.28：3-8，2000)。糖尿病视网膜病变的早期临床表现是血-视网膜屏障(Blood-Retinal Barrier，BRB)的破坏和多种视觉功能的障碍(Sokol S，Moskowitz A，Skarf B：Contrast sensitivity indiabetics with and without background retinopathy.Arch Ophthalmol 103：51-54，1985)。对于中晚期出现的眼底可见损害的患者，可使采用激光眼底照射、玻璃体切割手术等方法治疗，但效果和预后都不理想。理想的防治办法是在早期进行干预，但目前对早期轻度到中度的糖尿病视网膜病变(ETDRS)尚缺乏有效的治疗。
促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)是一种糖蛋白激素，分子量约34kD。血浆中存在的EPO由165个氨基酸组成，糖基化程度很高，糖基成分主要是唾液酸。根据碳水化合物含量不同，天然存在的EPO分为两种类型，α型含34％的碳水化合物，β型含26％的碳水化合物。两种类型在生物学特性、抗原性及临床应用效果上均相同。人类的EPO基因位于7号染色体长臂22区。1985年促红细胞生成素cDNA被成功克隆，并利用基因重组技术开始大批量生产重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin，rHuEPO)，广泛用于临床。传统认识中，EPO是一种作用于骨髓造血细胞，促进红系祖细胞增生、分化，最终成熟的内分泌激素，对机体供氧状况发挥重要的调控作用。在胚胎早期，EPO由肝生成，然后逐渐向肾转移，出生后主要由肾小管间质细胞分泌。随着近年来研究不断进展，对于EPO的认识产生了一次革命性的飞跃。促红细胞生成素是一种多功能的蛋白质，在成人主要是由肾脏产生并分泌，在胎儿阶段主要是由肝脏产生。越来越多的证据显示，促红细胞生成素具有保护神经和血管免受损伤的功能(Buemi M等，The Pleiotropic Effects of Erythropoietin in the CentralNervous System.J Neuropathol Exp Neurol，Vol 62，March，2003)。
在糖尿病患者中，促红细胞生成素的生成减少(Winkler AS，Marsden J：Erythropoietin depletion and anaemia in diabetes mellitus.Diabetic Medicine16：813，1999)，并且在并发贫血时患者体内的EPO活性下降(Cotroneo P.MariaRicerca B：Blunted erythropoietin response to anemia in patients with Type 1diabetes.Diabetes/Metabolism Research Reviews.16：172，2000)，表明在糖尿病患者体内促红细胞生成素的生成、代谢和功能发生了紊乱。
但是，现有技术中EPO的应用仅仅局限在对脊髓损伤或颅脑损伤等的治疗，并且仅仅局限于全身给药(如肌肉注射和血液给药)，这种给药模式无法使足够量的有效成分到达眼内，无法真正对视网膜产生有效的保护。并且这种全身给药会产生由于红细胞生成和血管生成增加而产生较为严重的副作用。
因此，目前迫切需要开发出一种新的治疗视网膜损伤的方法以及相应的产品，以方便、有效地治疗视网膜损伤。
发明内容
本发明的目的在于提供一种治疗哺乳动物视网膜损伤的方法。将促红细胞生成素局部给药于眼部玻璃体，能够对视网膜产生很好的保护作用。
本发明的另一目的在于提供一种促红细胞生成素的新用途，用于制备预防或治疗视网膜损伤的药物。
本发明的另一目的在于提供一种眼内注射制剂。
本发明的另一目的在于提供一种用于治疗或预防哺乳动物视网膜损伤的药盒。
在本发明的第一方面，提供一种预防或治疗哺乳动物视网膜损伤的方法，所述方法包括：向需要预防或治疗的对象眼睛的玻璃体腔内给予有效剂量的促红细胞生成素。
在本发明的另一优选例中，所述的视网膜损伤选自：视网膜细胞损伤、或视网膜组织损伤。
在本发明的另一优选例中，所述的视网膜细胞损伤选自以下细胞的损伤：视网膜色素上皮细胞、视网膜神经元、视网膜血管内皮细胞、或周细胞。
在本发明的另一优选例中，所述的视网膜神经元选自下组：视锥细胞、视杆细胞、外极细胞、Muller细胞、水平细胞、无长突细胞、神经节细胞、或神经胶质细胞。
在本发明的另一优选例中，所述的视网膜组织损伤为黄斑变性(更特别地，为年龄相关的黄斑变性)。
在本发明的另一优选例中，所述的细胞损伤是细胞凋亡。
在本发明的另一优选例中，所述的哺乳动物是人。
在本发明的另一优选例中，所述的有效剂量为1.33-60μg/眼/次。更佳地，所述的治疗有效剂量为15-30μg/眼/次。
在本发明的另一优选例中，所述的需要预防的对象是糖尿病患者。
在本发明的另一优选例中，所述的哺乳动物是人。
在本发明的第二方面，提供一种促红细胞生成素的用途，用于制备治疗或预防视网膜组织或细胞损伤的药物。
在本发明的另一优选例中，所述的视网膜损伤选自：视网膜细胞损伤、或视网膜组织损伤。
在本发明的另一优选例中，所述的细胞损伤选自以下细胞的损伤：视网膜色素上皮细胞、视网膜神经元细胞、视网膜血管内皮细胞、或周细胞。
在本发明的另一优选例中，所述的视网膜神经元细胞选自下组：视锥细胞、视杆细胞、外极细胞、Muller细胞、水平细胞、无长突细胞、神经节细胞、或神经胶质细胞。
在本发明的另一优选例中，所述的细胞损伤是细胞凋亡。
在本发明的另一优选例中，所述的药物为眼内注射剂。
在本发明的第三方面，提供一种眼内注射制剂，其含有1.33-60μg/剂的促红细胞生成素，以及药学上可接受的载体。
在本发明的另一优选例中，所述的眼内注射制剂含有15-30μg/剂的促红细胞生成素，以及药学上可接受的载体。
在本发明的第四方面，提供一种用于治疗或预防哺乳动物视网膜损伤的药盒，所述的药盒包括：
一个或多个容器，所述的容器中含有1.33-60μg的促红细胞生成素；
一个用于眼内给药的眼内注射器。
在本发明的另一优选例中，所述的注射器具有：
(i)一空腔本体，所述的空腔本体用于容纳待注射的液体；
(ii)一注射针头，所述注射针头的尾端与(i)所述的空腔本体相连通；
(iii)一活塞，所述的活塞与(i)所述的空腔本体内壁密切接合，并可与空腔本体发生相对移动，从而可将溶液吸收入空腔本体内或将空腔本体内的溶液注入哺乳动物眼内；
(iv)一活塞驱动装置，可施压于所述活塞，以使活塞与空腔本体发生相对移动。
在本发明的另一优选例中，所述的容器和眼内注射器是一体化的。更佳地，所述的眼内注射器包括一个空腔和一个注射针头，所述的空腔内含有有效剂量的促红细胞生成素。
在本发明的另一优选例中，所述的有效剂量为1.33-60μg/剂。
在本发明的另一优选例中，所述的容器为玻璃制品、或为塑料制品。
在本发明的另一优选例中，所述的容器为可透见的。
在本发明的另一优选例中，所述的眼内注射器的针头约为30号(相应长度为3/8-1/2英寸)。
在本发明的另一优选例中，所述的药盒中还含有一份使用说明书。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1A显示了大鼠注射STZ后的血糖变化；图1B显示了实验过程中各组大鼠的体重变化。
图2显示了少量胰岛素皮下注射对血-视网膜屏障功能检测没有影响。
图3显示了不同时间STZ糖尿病大鼠的血-视网膜屏障功能检测及EPO的保护作用。
图4显示了EPO对糖尿病时血-视网膜屏障的保护作用呈剂量依赖关系。
图5显示了三组大鼠视网膜各层厚度随患病时间的变化。
图6显示了三组大鼠视网膜外核层(ONL)以及内核层(INL)的细胞计数。
图7显示了糖尿病大鼠的视网膜神经元的凋亡情况及EPO的保护作用。
图8显示了糖尿病大鼠视网膜的超微结构变化。
图9显示了大鼠玻璃体腔内注射EPO的半衰期测定。
图10显示了通过玻璃体腔内注射EPO，在糖尿病大鼠中逆转了血-视网膜屏障的损坏。
图11显示了用EPO处理或不用EPO处理的糖尿病大鼠的视网膜的EM观察。
图12显示了用EPO处理或不用EPO处理的糖尿病大鼠中视网膜细胞的凋亡状况。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，发现眼内局部给药有效量的促红细胞生成素(EPO)能够预防视网膜损伤和保护视网膜不受损伤，特别是保护糖尿病时视网膜神经及血管细胞不受损伤。并且，本发明人还发现，眼内局部给药的方法用药量低、效果好，且不会对体内其它器官或组织产生不良影响。基于此完成了本发明。
促红细胞生成素(EPO)
红细胞生成素(erythropoietin，EPO)是一种糖蛋白激素，血浆中存在的EPO由165个氨基酸组成，天然存在的EPO分为α型和β型，两种类型在生物学特性、抗原性及临床应用效果上均相同。人类EPO基因位于7号染色体长臂22区。自从1985年EPO的cDNA被成功克隆并利用基因重组技术开始，可大批量生产重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin，rHuEPO)。
在本发明中，所用的促红细胞生成素可以是天然存在的，比如其可被纯化和分离自哺乳动物。优选的，所述天然存在的促红细胞生成素的氨基酸序列可以与GenBank登录号：CAA26059所示的序列基本上相同。
此外，所述的促红细胞生成素也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因重组技术来生产重组人促红细胞生成素。并且，本发明所用的促红细胞生成素也可从商业途径购买，比如可购自EPOGEN、Amgen公司。
优选的，本发明采用重组的人促红细胞生成素。
本发明也可采用经修饰或改良的促红细胞生成素，比如，可采用为了促进其半衰期、有效性、代谢、和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的促红细胞生成素。所述经过修饰或改良的促红细胞生成素可以是一种促红细胞生成素的共轭物，或其可包含被取代的或人工的氨基酸。所述经过修饰或改良的促红细胞生成素可以是与天然存在的促红细胞生成素具有较小的共同点，但也能预防或治疗哺乳动物的视网膜损伤，且不会带来其它不良影响或毒性。也就是说，任何不影响促红细胞生成素的生物活性的变化形式都可用于本发明中。
在本发明一种方式中，可将所述的促红细胞生成素直接给药于哺乳动物(比如人)，或者，可将编码促红细胞生成素的基因通过常规的方法克隆到适当的载体中，将所述的载体导入到可表达所述促红细胞生成素的细胞中，使所述的细胞表达促红细胞生成素。可通过将适量的所述细胞引入到玻璃体腔内实现体内促红细胞生成素的表达。
优选的，可将编码促红细胞生成素的基因或携带所述基因的载体通过常规的方法引入到靶细胞中实现促红细胞生成素的表达。所述的靶细胞包括但不限于：视网膜色素上皮细胞、视网膜神经元、视网膜血管内皮细胞、周细胞、胚胎干细胞、或多潜能成熟祖细胞；所述细胞可以转移入视网膜中。
视网膜病变
本发明人的研究发现，在眼内给药有效量的促红细胞生成素，可预防或治疗其它多种视网膜疾病，包括但不限于：视网膜血管性疾患、黄斑部病变(尤其是年龄相关的黄斑部病变)、视网膜变性、糖尿病视网膜病变、视网膜毛细血管扩张、视网膜血管闭塞等。
如本发明所用，糖尿病(diabetes mellitus)是以糖代谢紊乱为主的全身性疾病，由胰岛素绝对或相对分泌不足和胰高血糖素增高以及胰岛素利用障碍引起。
糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病的严重并发症之一。在全部糖尿病患者中，当病程足够长时，发生DR者超过90％。根据传统的分类方法，糖尿病视网膜病变属于微血管病变，其特征包括：血-视网膜屏障的破坏，毛细血管基底膜的增厚，周细胞的丢失和微血管瘤的形成。有文献报道，在糖尿病大鼠的9天至14天就存在内皮细胞的凋亡(Joussen AM等，Leukocyte-mediated endothelial cell injury and death in the diabetic retina.American Journal of Pathology.158(1)：147-52，2001 Jan.)。本发明人的研究发现，通过STZ诱导的糖尿病大鼠与临床上早期糖尿病视网膜病变的病人表现出了相似的形态和功能特征。在糖尿病病人和大鼠中都表现出血管内皮细胞和周细胞的凋亡的增加，并且细胞的凋亡不是仅发生在糖尿病的晚期阶段，早期即可出现。
视网膜是由色素上皮层和视网膜神经上皮层组成，视网膜色素上皮层与脉络膜紧密相连，是由排列整齐的单层六角形柱状色素上皮细胞组成。这些细胞具有皱褶的基底膜、胞体，细胞顶部的黑色素颗粒和微绒毛。相邻的细胞间有连接复合体，其紧密连接构成血-视网膜外屏障。视网膜神经上皮层由三级神经元、神经胶质细胞和血管组成。最外层为第一级神经元，称光感受器细胞，是接受、转变光刺激的神经上皮细胞。细胞有两种：一种是视锥细胞，主要集中在黄斑区，有辨色作用；一种是视杆细胞，分布在黄斑区以外的视网膜，无辨色功能，形成周边视力。居于内层的为第三级神经元是向大脑传导神经冲动的神经节细胞，其轴突汇集一起形成视神经。第二级神经元主要为双极细胞，位于第一、第三级神经元之间，起联络作用。此级的神经元还通过水平细胞、无长突细胞等形成横向及交错的神经元连络。在组织学上，视网膜神经上皮层由外向内分为：视杆及视锥层、外界膜、外核层、外网状层、内核层、内网状层、神经节细胞层、神经纤维层、内界膜。
“血-视网膜屏障”在眼中是分隔、限制物质在血管及眼组织之间自由交换的机制，结构上分为由相邻的视网膜色素上皮细胞通过连接复合体紧密连接构成的外屏障和血管内皮细胞构成的内屏障。本发明人的研究表明，在糖尿病发生的1天-2周内就存在血-视网膜屏障的破坏和细胞的损伤。在糖尿病发病的4天后就存在血-视网膜屏障的破坏。同时早期血-视网膜屏障的破坏在其他研究组中也有报道(Zhang SX等，Genetic difference in susceptibility to theblood-retina barrier breakdown in diabetes and oxygen-induced retinopathy.American Journal of Pathology.166(1)：313-21，2005 Jan)。用电镜检测大鼠眼的超微结构，发现糖尿病发病1周时，就可以观察到视网膜血管内皮细胞的凋亡(图8，en-D)。作为血-视网膜外屏障，视网膜色素上皮细胞(RPE)本身在此时并未表现出很明显的改变，但其临近的Bruch膜断裂、胶原纤维增生以及色素上皮细胞与Bruch膜之间的间隙增大，都表示RPE已经受到了不同影响。实际上，在早期糖尿病大鼠中由于色素上皮细胞的功能缺陷而导致通透性增加也有其它报道。因此，血-视网膜屏障的功能和屏障的完整性，以及血管内皮细胞和神经元的存活可作为筛选治疗早期糖尿病视网膜病变候选药物的指标。在糖尿病视网膜病变早期对血-视网膜外屏障的保护对防治糖尿病视网膜病变具有重要意义。
越来越多的证据表明，视网膜内神经元和胶质细胞在糖尿病早期就发生了改变，而且有文献报道视网膜神经元病变早于微血管病变(Aizu Y等，Degeneration of retinal neuronal processes and pigment epithelium in the earlystage of the streptozotocin-diabetic rats.Neuropathology.22(3)：161-70，2002 Sep)。在发病的1周内就可以检测到少量外核层细胞的凋亡。TUNEL阳性的细胞绝大多数是神经元，因为在切片上并未发现血管内皮细胞的凋亡。电镜观察的结果也证实了早期外核层的细胞凋亡。本发明的研究结果表明在糖尿病视网膜病变的早期就发生了视网膜神经元和血管内皮细胞的凋亡，而且这些病变是普遍现象。因此，尽早对糖尿病视网膜血管和神经元进行保护是非常有必要的。
黄斑部处于视网膜的中心，是视网膜最重要的中心区域，黄斑部感光神经细胞密度最高，因此具有最敏锐的视觉分辨力。黄斑变性(Macular Degeneration)是黄斑部发生的退行性病变，黄斑变性多见于老年人(称为年龄相关的黄斑变性，Age-Related Macular Degeneration)。黄斑变性可缓慢地或突发性引起无痛性视力下降。本发明的研究结果提示，在眼内给药有效量的促红细胞生成素，能够有效地黄斑部色素沉着、瘢痕形成、出血或渗出；可见其具有保护视网膜的黄斑部、防止其变性的突出效果。
玻璃体腔内给药
在眼内，玻璃体(vitreous)为透明、无血管、无神经具有一定弹性的胶体。充满在晶状体后的空腔内，是眼屈光间质之一。玻璃体主要由胶原纤维及酸性粘多糖组成，其表层致密，形成玻璃样膜。
本发明人发现，玻璃体腔内(IVI)注射特别适用于EPO的给药治疗眼底疾病。IVI注射与其他给药途径相比有显著优越性，即药物作用目标针对性强，可以增加治疗效果，降低全身毒性反应。在进行注射给药(或施用)时，本发明人采用的是常规的玻璃体腔内注射技术。
在本发明的一个实施例中，本发明人采用Evans Blue法来定量检测血-视网膜屏障的通透性，表明眼内注射EPO能有效地降低渗漏到视网膜组织中的EvansBlue的含量，阻断糖尿病时大鼠的血-视网膜屏障发生的损害，保护其功能在正常水平。
在本发明的另一实施例中，利用冰冻切片进行的大鼠视网膜组织学检查表明，给予EPO处理的糖尿病大鼠，视网膜各层的厚度均保持在正常对照组水平。
在本发明人目前使用的动物模型中，玻璃体腔注射EPO的保护作用表现出明显的剂量依赖性，曲线呈“U”字型。这种典型的剂量依赖曲线表明并非给予高剂量就能有更好是治疗效果，比如给予大鼠单次眼内注射200ng的EPO并不比50ng有效。有趣的是，EPO治疗组大鼠在两周的Evans Blue通透性甚至低于正常对照组。这种现象到第3周就消失了，即与正常对照组相比没有显著性差异。这可能是由于包括对照组在内的眼内注射导致的机械性损伤影响了血-视网膜屏障，而EPO对这种损伤也有保护作用，提示这与其抗炎症的机制有关。
为了证明玻璃体腔内注射EPO能延缓或阻止视网膜内神经元的凋亡，在大鼠发生糖尿病的当天给予玻璃体腔内注射EPO。在EPO处理大鼠，直到4周，其视网膜外核层内没有发现细胞凋亡，而同期的糖尿病大鼠的外核层里，可见明显的细胞凋亡。尽管在EPO处理的糖尿病大鼠到注射6周时也可以在视网膜外核层内发现细胞凋亡，但其程度明显低于未治疗的糖尿病组。在糖尿病大鼠，以外核层为主的视网膜的厚度明显变薄，细胞数目也明显减少。而在给予EPO治疗后，视网膜的厚度则不发生明显改变，细胞数目也基本与正常对照相同。在6周时，EPO治疗大鼠的外核层也仅仅是略有轻微的变薄。这种结果表明，尽管玻璃体腔内注射EPO时其的浓度在3天内就回落到基础水平，但单次注射EPO对视网膜血管和神经元的保护作用至少能维持1个月。
本发明首次揭示了在玻璃体腔内注射EPO能够保护大鼠早期糖尿病视网膜病变时血-视网膜屏障和功能的完整性，并保护视网膜血管和神经元免受凋亡。并且，本研究表明其在玻璃体腔内的半衰期在24-36小时，较其血液半衰期更长。但72小时后，玻璃体腔内的EPO浓度回落到基础水平。而以往EPO在用于其它用途时，其在血液中的半衰期为4-13小时，这明显地表明EPO对糖尿病视网膜病变的保护作用与其促进红细胞生成的作用机制是不同的。基于目前的研究，通过向玻璃体腔内注射EPO可以作为治疗早期糖尿病视网膜病变的一种有效手段。
本领域技术人员应理解，除了注射给药以外，也可采用其它的玻璃体腔内给药方式或装置。其它的给药方式比如：采用生物可降解的聚合物来递送所述的促红细胞生成素，所述的携带聚合物可插入到眼内，发挥长期给药的作用。如在美国专利6,251,090中所述。这些装置和方法可进一步包括转巩膜(transscleral)递送装置，如在美国专利申请2005/0208103、2005/0074497、和2005/0064010中所描述的。
眼内注射剂
本发明还提供了一种药物组合物，优选的，所述的药物组合物为一种眼内注射剂。它含有1.33-60μg/剂(更优选的，为15-30μg/剂)所述的促红细胞生成素，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。
本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。
如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
在本发明中，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的载体的充分说明。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。
本发明的眼内注射剂可直接用于视网膜疾病(特别是糖尿病视网膜病变)的治疗。此外，还可同时与其他治疗剂或辅剂(比如消炎滴剂等)联合使用。
本发明的眼内注射剂含有安全有效量的促红细胞生成素以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的眼内注射剂可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。眼内注射剂宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。
本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。
使用眼内注射剂时，是将安全有效量的促红细胞生成素施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常是1.33-60μg/眼，而且在大多数情况下不超过约60μg//眼，较佳地该剂量是约15-30μg/眼，更佳地该剂量是约15-20μg/眼。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况、玻璃体腔的大小等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
眼内注射器
本发明还提供了一种用于治疗或预防哺乳动物视网膜损伤的药盒，所述的药盒包括：
一个或多个容器，所述的容器中含有1.33-60μg的促红细胞生成素；
一个用于眼内给药的眼内注射器。
优选的，所述的注射器具有：
(i)一空腔本体，所述的空腔本体用于容纳待注射的液体；
(ii)一注射针头，所述注射针头的尾端与(i)所述的空腔本体相连通；
(iii)一活塞，所述的活塞与(i)所述的空腔本体内壁密切接合，并可与空腔本体发生相对移动，从而可将溶液吸收入空腔本体内或将空腔本体内的溶液注入哺乳动物眼内；
(iv)一活塞驱动装置，可施压于所述活塞，以使活塞与空腔本体发生相对移动。
更优选的，所述的容器和眼内注射器是一体化的，也即在眼内注射器的空腔内容纳有有效量的促红细胞生成素，便于使用和储藏。
在本发明的一种优选方式中，空腔内的促红细胞生成素是固体状态的(如冻干制剂)，在需要使用时，用注射器吸取适量的可溶解所述固体状态的促红细胞生成素的药学上可接受的载体，充分混合后，用于注射玻璃体腔。
在本发明的另一种优选方式中，空腔内的促红细胞生成素制剂是预先配制好的液体状态制剂，可直接用于注射玻璃体腔。
更优选的，所述的容器为玻璃制品、或为塑料制品。
更优选的，所述的眼内注射器的针头约为30号(相应长度约为3/8-1/2英寸)。
更优选的，所述的药盒中还含有一份使用说明书，以便于医师的使用。
此外，可直接将促红细胞生成素或促红细胞生成素的药物组合物制成冻干粉的形式，置于注射器的容器内，在需要施用时，用注射器吸收入生理上可接受的溶解介质(如生理盐水，或蒸馏水等)，溶解后注射入眼内。或者，可将促红细胞生成素或促红细胞生成素的药物组合物制备成溶液的形式，在需要施用时，直接注射即可。
预防或治疗视网膜组织或细胞损伤的方法
本发明提供了一种治疗哺乳动物视网膜组织或细胞损伤的方法，包括向患者每个眼睛的玻璃体腔内注射有效量的促红细胞生成素。当用于治疗人的视网膜病变时，优选采用重组人促红细胞生成素。在进行治疗时，促红细胞生成素的有效量一般为1.33-60μg/眼；更优选的，所述的有效量为15-30μg/眼；最优选的，所述的效量为15-20μg/眼(如18μg/眼)。
当采用上述的有效量进行治疗时，在一个疗程内，每隔约30天向玻璃体腔内注射所述的促红细胞生成素，可以有效地预防、缓解或治愈糖尿病视网膜病变。
在本发明的一个优选方式中，所述糖尿病视网膜病变在发生的早期进行预防和治疗。
应理解，当用于治疗视网膜损伤时，所用的促红细胞生成素的有效剂量可随待治疗的对象的严重程度而变化。具体情况根据受试者的个体情况来决定，这在熟练医师或营养师可以判断的范围内。
本发明的主要优点在于：
(1)首次揭示了促红细胞生成素的新的用途，用于保护血-视网膜屏障，并保护视网膜血管和神经元。可用于治疗糖尿病、AMD等眼底疾病。
(2)采用眼内局部给药促红细胞生成素(EPO)的方法，用药量低且不会对体内其它器官或组织产生不良影响。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
I.通用材料和方法
本发明具体实施方式中使用到以下的材料和方法，以下方法和实施例中使用的各种材料试剂等都是作为进一步例证和解释本发明的工具和手段，而并非用于对本发明的限制。
并且，常规的注射、麻醉、解剖、计数等操作是本领域现有技术人员所熟知的，在本发明中不作详细描述。
1.材料
Evans Blue(Sigma)溶于生理盐水，配成30毫克/毫升的溶液。超声助溶5分钟后，经5-微米的过滤器过滤。
促红细胞生成素(EPO，Sigma公司)溶于生理盐水中配成0.1微克/微升溶液。
链脲霉素(STZ，Sigma)溶于0.05摩尔/升的柠檬酸缓冲液中(pH 4.5)，使用时新鲜配制。
灌注液采用新鲜配制的含0.05摩尔/升柠檬酸缓冲(pH3.5)的1％多聚甲醛溶液，灌注前在37℃温浴。
细胞凋亡检测试剂盒和EPO ELISA试剂盒购自罗氏公司。
30,000分子量的超滤管购自Millipore公司。
2.大鼠糖尿病模型的建立及眼内注射
雄性SD大鼠由中科院上海生科院Sllacas公司供应，体重约160克。研究中，大鼠根据需要被随机分成至少三组：对照组、糖尿病组及糖尿病接受EPO治疗组(简称治疗组)。
实验开始时将大鼠饥饿24小时，然后对糖尿病组以及治疗组大鼠行腹腔内注射STZ(60毫克/千克体重)，而对照组则给同体积的柠檬酸缓冲液。注射30分钟后，大鼠恢复正常饮食和饮水。2小时后，用2％戊巴比妥钠(50毫克/千克体重)对各组大鼠进行全身麻醉，眼睛局部用利多卡因点眼麻醉。角膜反射消失后，用带301/2号针头的微量注射器行玻璃体腔内注射。对照组和糖尿病组注射2微升生理盐水，治疗组注射等体积的EPO溶液。注射时，沿角膜巩膜缘后2毫米处进针，针尖朝向视神经方向以避免刺伤晶状体。注射后小心抽出针头，观察大鼠的生命体征。大鼠复苏后送回动物房，给予正常饮食及饮水。24小时后开始，取尾血检测血糖。对于连续3天血糖值高于250毫克/分升的STZ注射大鼠，确定为糖尿病鼠。
为维持糖尿病大鼠的健康状况，保持其存活，在试验过程对所有STZ注射大鼠给予小量胰岛素(2-6单位，每周一次)。
3.血-视网膜屏障功能检测(Evans Blue定量试验)
大鼠经2％戊巴比妥钠麻醉后，解剖并分离出左侧髂动静脉：动脉穿刺并埋留置针(注射肝素抗凝)，静脉穿刺埋留置针后快速注射Evans Blue(30毫克/千克体重)，10秒左右注射完毕。很快会观察到大鼠全身变蓝，此时开始从髂动脉中取血并开始计时。此后，每15分钟取血一次，共抽8次。每次取血约0.1毫升。取血后，开胸行全身灌注(120毫米汞柱，2分钟完成)。灌注完毕后，取出眼球，在解剖显微镜下仔细分离出视网膜。将视网膜放入离心管内，37℃浓缩干燥1.5-2小时，称取视网膜干重。然后向离心管中加入甲酰胺300微升，70℃孵育18小时，间断振荡以促进Evans Blue从视网膜中释放。孵育后，用超滤离心管将样品离心(4℃，3,000g.，45分钟)，并测超滤液的体积。血样用10,000g离心1-2分钟，取2微升上清液，1∶5,000稀释。血样稀释液和视网膜提取液在紫外分光度计下测量其光吸收值(Evans Blue的最大的吸光值在620纳米，最小的吸光值在740纳米)。根据标准曲线计算样品中的Evans Blue的浓度，并按以下公式计算出视网膜中Evans Blue的量(单位是：微升血浆/视网膜干重(g)/小时)：Evans Blue(微克)/视网膜干重/平均血样浓度/循环时间。
4.形态学研究的样本制备
将大鼠深度麻醉后行颈椎离断处死后，在外眦处的眼球表面做标记用来定位。将眼球剜出后，用PBS缓冲的4％的多聚甲醛固定24小时，然后沿角巩膜缘打开眼球。去掉角膜和晶状体后，保留眼后节的眼杯，并通过10-30％的蔗糖梯度脱水。脱水后将眼杯包埋在OCT中做冰冻切片。沿眼球的背侧和腹侧进行切片，并且经过视神经。切片厚度为10微米，用来做视网膜厚度测量、视网膜各层细胞计数和TUNEL染色。
5.测量视网膜各层厚度和细胞计数
将切片用H.E.染色，用光镜在200倍放大条件下测量视网膜各层的厚度，包括：(1)外界膜到内界膜的厚度；(2)外界膜到节细胞层的厚度；(3)外核层到外网层的厚度；(4)内核层的厚度；(5)内网层的厚度。测量部位选择在距视盘1毫米处，测量视网膜各种层次的厚度。每张切片上，在视神经乳头的两侧分别测量。每一组选用5-6只大鼠进行测量。对外核层、内核层和节细胞层的细胞计数在相同的区域放大1,000倍进行测量，所有的细胞计数采用离视神经乳头1毫米处25微米宽的区域进行计数。细胞的密度表示为细胞数/毫米。
6.细胞凋亡原位检测(TUNEL)
采用脱氧核苷酸转移酶末端标记法(TUNEL)进行检测：取大鼠眼球，在含4％磷酸盐缓冲液的多聚甲醛中固定2小时以上，然后在解剖显微镜下切除眼前节。眼球后节经蔗糖溶液中梯度脱水后进行冰冻切片(10微米)。冰冻切片置与磷酸盐缓冲液中浸泡30分钟，再经含0.1％柠檬酸钠缓冲的0.1％Triton-X 100透膜2分钟(4℃)。经磷酸盐缓冲液冲洗一次后，将切片四周擦干并加含脱氧核苷酸转移酶的混和液(每个样本约10微升，酶液与底物的体积比为1∶10)，37℃孵育1小时。样品用磷酸盐缓冲液冲洗3次，在显微镜下观察(蓝光激发，激发波长450-490纳米)。同步制备阴性对照和阳性对照：阴性对照只加底物液，阳性对照将样品先经DNase I处理后再加酶混和液。
7.电镜检测
大鼠深度麻醉后，开胸后用磷酸盐缓冲的2.5％的戊二醛(pH 7.4)进行全身灌注。然后将眼球取出，并沿赤道部解剖然后浸入磷酸盐缓冲的2.5％的戊二醛24小时。在显微镜下根据电镜的要求解剖出视网膜，并用1％的锇酸固定。通过乙醇梯度脱水后的样本用618树脂包埋。视网膜后极部的超薄切片用柠檬酸铅和乙酸双氧铀染色。然后采用电镜检测(GM-120；PHLIP，Holland)。
8.促红细胞生成素在大鼠玻璃体腔内半衰期的测定
玻璃体腔内注射EPO后，大鼠在不同的时间点处死后取样。取出眼球后，在显微镜下仔细的去掉巩膜外的结缔组织和肌肉，然后沿着角巩膜缘剪掉角膜，并切除虹膜。然后用吸水纸仔细干燥剩余的部分，然后再在玻璃体和视网膜之间打开一个缺口，在离心管中室温700g离心15分钟，吸取上清液，至少需要收集50微升的玻璃体液然后根据EPO ELISA测定试剂盒的操作手册进行测量。
9.统计学检验
数据表示为均数±标准误。统计学分析采用学生t检验，P＜0.05时定义为具有统计学意义的差异。
II.具体实施例
实施例1 实验大鼠糖尿病模型的血糖和体重变化
根据I中所述的方法进行分组以及制备大鼠糖尿病模型后，本实施例中主要观察以下指标：(1)大鼠注射STZ后的血糖变化和(2)体重变化。
作为观察糖尿病的黄金指标，血糖的变化可以比较准确地反映出大鼠糖尿病的情况和模型的稳定性。在本发明中，单次STZ腹腔注射后，血糖出现一个急剧而短暂的升高，并在24小时内回落到正常水平。第二天开始，血糖再次升高，并在以后的时间里保持在400-700mg/dL之间，表明糖尿病模型稳定(见图1A)。同时可见，糖尿病组大鼠和治疗组大鼠的血糖水平基本平行，表明眼内注射EPO对全身血糖水平没有影响。也即说明，如果EPO眼内能够保护视网膜，其保护作用应该是局部的。
糖尿病患者的另一个重要临床表现是消瘦(体重)。作为佐证，本发明人也观察了大鼠注射STZ后的体重变化情况。从图1B可以看出，正常的对照组大鼠在健康成长，体重在实验期间不断增加。而糖尿病组大鼠，体重在整个实验期间处于下降并很缓慢增加的过程。同样，眼内注射EPO的治疗组大鼠，体重与糖尿病组大鼠基本一致，从而证明眼内注射的EPO不经过全身发挥作用。
实施例2 糖尿病大鼠的早期血-视网膜屏障功能破坏及玻璃体腔内注射EPO的保护作用
本发明人采用Evans Blue法来定量检测血-视网膜屏障的通透性。这种检测方法对早期糖尿病大鼠血-视网膜屏障的破坏很敏感。Evans Blue在血液中主要是与白蛋白结合，因此在正常情况下不能渗漏到血管之外。本发明人采用STZ建立的糖尿病模型属于1型糖尿病，容易发生糖尿病酮症酸中毒。考虑到血液酸碱度可能会影响Evans Blue与白蛋白的结合。同时，在酸性条件下，游离EvansBlue的血管通透性增大。为了排除酸性条件对Evans Blue通透性的影响。本发明人采用少量胰岛素(4IU/周)皮下注射来防止糖尿病酮症酸中毒的发生，同时监测血pH的变化(表1)以及视网膜Evans Blue定量(图2)。
表1和图2的结果显示，实验2周后，胰岛素处理的糖尿病大鼠的血液pH与未给胰岛素的糖尿病组以及正常对照组相比都没有显著差异。同时视网膜EvansBlue通透性测定结果表明，在眼内注射EPO的大鼠，给胰岛素注射与不给胰岛素处理两组之间没有显著差异。因此，在所述的实验条件下，可以排除血液的酸碱度对各组大鼠的Evans Blue定量试验的影响。各组大鼠的视网膜Evans Blue通透性如有不同，主要是眼局部的屏障功能的不同所致。
图3显示糖尿病大鼠1-4周的血-视网膜功能状况以及EPO处理的影响。可以看出，在1、2、3和4周的检查时，糖尿病组大鼠的视网膜Evans Blue通透性显著增高，表明血-视网膜屏障功能都受到明显破坏。大鼠在发生糖尿病1周后，其视网膜Evans Blue含量比对照组大鼠升高了56.8％(n＝8，p≤0.05，表明STZ诱发的糖尿病大鼠在早期就出现血-视网膜屏障的破坏。2周时，视网膜EvansBlue通透性的增加达到峰值，比对照组高出了62.9％(n＝7，p≤0.05，以后则维持在较高的水平到4周。图3也表明，眼内注射EPO能有效地降低渗漏到视网膜组织中的Evans Blue的含量(n＝7，p≤0.05，其水平甚至低于对照组，表明眼内给EPO能阻断糖尿病时大鼠的血-视网膜屏障发生的损害，保护其功能在正常水平。至于在2周时EPO处理组的Evans Blue含量低于对照组，提示EPO对可能存在的眼内注射的机械性损伤引起的血-视网膜屏障破坏也有保护作用。
         表1 少量胰岛素皮下注射对血液酸碱度的影响
  组别   平均值±SD   T值   p值
  对照EPO+胰岛素EPO-胰岛素   7.444±0.0177.409±0.0137.430±0.011   0.845-2.7161.841   0.4460.0530.125
实施例3 EPO对血-视网膜屏障的保护作用是剂量依赖关系
糖尿病大鼠，在发病时接受不同剂量的EPO(0.05-200ng/眼)玻璃体腔内注射，同时给正常对照大鼠和糖尿病对照大鼠的玻璃体腔内注射等体积的生理盐水。两周后测定各组的视网膜Evans Blue通透性。
结果表明，EPO的这种血-视网膜屏障保护作用存在明显的剂量依赖关系。如图4所示，低剂量的EPO没有作用。剂量增加到5ng/眼时，开始表现出保护作用，50ng/眼时的保护作用最好。但给予高剂量(200ng/眼)，药物对血-视网膜屏障的保护作用反而减弱。但这种减弱的作用，与糖尿病对照组相比，还是具有明显的保护的。因此，根据本实验的结果可见，大鼠眼内注射EPO的最适剂量是50ng/眼。
实施例4 EPO对糖尿病大鼠视网膜神经元的保护作用
根据前面所述的方法，利用冰冻切片进行的大鼠视网膜组织学检查表明，在STZ糖尿病发病过程中，视网膜的厚度逐渐减低，特别是以外核层厚度的减少最为明显，在4周时糖尿病大鼠视网膜的厚度的减少达到高峰(n＝72，p＜0.001)(见图5)。与这种变化相对应，视网膜各核层的细胞数目也随着糖尿病的发展而减少。其中以外核层的细胞数目减少最为明显，与对照组大鼠相比，糖尿病大鼠的外核层细胞为正常对照大鼠的84.61％，(n＝52，p＜0.001)(见图6)。内核层细胞计数的减少不明显(为正常对照组的98.21％，糖尿病组n＝54，对照组n＝65，p＞0.05)。给予EPO处理的糖尿病大鼠，视网膜各层的厚度均保持在正常对照组水平(n≥52，p＞0.05)。
实施例5 糖尿病大鼠的视网膜神经元凋亡检查及EPO的作用
在实验的第1至6周分别取出大鼠眼球进行组织学检查。TUNEL染色结果显示，正常对照组大鼠的视网膜神经元很少发生调亡(图7，C1、C2、C4)，尽管该技术可能检测到由于细胞坏死导致的DNA片断。但在糖尿病大鼠，第1周的样本中就可以检测到轻度的神经元调亡，并且主要集中在外核层(图7，D1)。第2周和第4周的检查所表明的趋势与第1周相同，但糖尿病组的外核层神经元调亡随病程增加而更加严重(图7，D2、D4)。到第6周，可以看到糖尿病组大鼠的视网膜神经元调亡不仅在外核层非常明显，同时也累及内核层和节细胞层。图7还表明，眼内注射EPO能非常有效地保护视网膜神经元，使之不发生调亡(图7，E1、E2、E4)。EPO不仅在早期有效，在给予一次性较高浓度的注射后，能保护糖尿病大鼠的视网膜在第6周时也不发生调亡，该组的TUNEL染色结果与正常对照组基本相同。
实施例6 玻璃体腔注射EPO对糖尿病大鼠视网膜血管和神经元保护作用的电镜观察
用电镜对糖尿病大鼠视网膜的超微结构改变进行的观察表明，在糖尿病发病的7-10天就可以检测到视网膜各层的细胞和组织的损伤(图8)。比较明显的改变是视网膜微血管内皮细胞(包括：以细胞核固缩为特征的内皮细胞凋亡、以及血管外组织间隙的明显水肿和渗出，图8，en-D)、视网膜色素上皮细胞(Bruch’s膜断裂、胶原纤维增生及所导致的Bruch’s膜与视网膜色素上皮细胞的间隙增大，图8，rpe-D)、光感受器细胞外节的严重损伤(表现在磨盘的溶解、排列紊乱以及磨盘间间隙的增大，图8，r/c-D)、以及视锥视杆细胞的损伤(凋亡细胞增多、细胞固缩以及细胞间隙的增宽，图8，onl-D)。这些电镜的改变与TUNEL检测的结果是相符合的，都是以外核层凋亡细胞的改变为主。
电镜的观察也同样表明，EPO处理大鼠的视网膜得到很好的保护，各种改变比糖尿病组大鼠轻的多，更接近正常对照组大鼠的情况(图8，en-E、rpe-E、r/c-E和onl-E)。
实施例7 玻璃体腔内EPO的半衰期的测定
向正常大鼠玻璃体腔内注射EPO后，在不同时间点测定眼内EPO的浓度变化发现，EPO注射后在玻璃体腔内迅速达到峰值浓度，然后很快下降到基线水平，其药代动力学参数符合一级动力学特征(图9)。本实施例的条件下，玻璃体腔内注射后EPO的半衰期在24-36小时之间。
实施例8 玻璃体腔内注射EPO干预糖尿病视网膜病变
首先进行实验动物分组，将SD大鼠分成以下3组(每组4-6只大鼠)：
(1)对照组：非STZ处理、玻璃体腔内注射2μl/眼的生理盐水；
(2)糖尿病组：使用STZ来诱导糖尿病，玻璃体腔内注射2μl/眼的生理盐水；
(3)EPO-处理组：使用STZ来诱导糖尿病，以及根据不同的实验要求，在玻璃体腔内注射50-200ng/眼EPO。
糖尿病大鼠和实验方法都根据前述的标准和步骤来进行，除了进行AP(碱性磷酸酶)染色检测，使用如下步骤：在TUNEL荧光检测后，将样品干燥，加入30μl Converter-AP(与AP偶联的荧光抗体)。将样品在湿润室中在37℃孵育30分钟，用PBS洗涤玻片上的样品3次。然后在样品上加上30μl的底物溶液(BCIP/NBT)。反应时间为30分钟，在室温和黑暗状态下进行。再用PBS洗涤玻片3次，固定在盖玻片下，在显微镜下分析。
在糖尿病发生1周或2周后进行玻璃体腔内注射EPO或生理盐水。在EPO处理1周后收集样品，具体见图10-12。
通过玻璃体腔内注射EPO，在糖尿病大鼠中逆转了血-视网膜屏障的损坏，结果见图10。通过检测玻璃体腔内注射EPO的干预影响来测定糖尿病大鼠中EPO的注射对于血-视网膜屏障功能的保护作用。在由STZ诱导糖尿病发生1周后，给予EPO。通过测定视网膜的Evens Blue渗透来检测血-视网膜屏障功能。每组采用4到6只大鼠。与糖尿病组大鼠相比，EPO组中Evens Blue渗透量较少。
用EPO处理或不用EPO处理的糖尿病大鼠的视网膜的EM观察见图11。其中C：对照；D：糖尿病；E：EPO处理的糖尿病大鼠；en：内皮细胞；rpe：视网膜色素上皮细胞；inl：内核层；onl：外核层；r/c：视杆和视锥层。在所有的五层中都检测到明显的糖尿病病理变化，但是通过在糖尿病发生1周后将EPO(50ng/眼)注射到玻璃体腔内而得到了改善。
用EPO处理或不用EPO处理的糖尿病大鼠中视网膜细胞的凋亡状况见图12。在糖尿病发生2周后用EPO干预。在玻璃体腔内注射EPO(200ng/眼)1周后收集样品。在糖尿病大鼠的视网膜的ONL中呈现更多的TUNEL阳性细胞(凋亡细胞)，而EPO处理改善了这种对视网膜的损伤。采用与AP(碱性磷酸酶)偶联的荧光抗体和底物(BCIP/NBT)反应，进行免疫组织化学分析，结果与TUNEL染色检测一致。
实施例9 眼内注射剂的配方
按照表2所示配方，用常规方法制备眼内注射剂。
          表2 眼内注射剂的配方
  促红细胞生成素   载体
 配方1   15μg/50ul   pH6～8的磷酸盐缓冲液
 配方2   30μg/50ul   pH6～8的磷酸盐缓冲液
根据上述配方1和配方2置于眼内注射器(针头为30号)中，然后注射于患有糖尿病视网膜病变的人的玻璃体腔内，检测结果发现，两种配方均达到了预防或改善视网膜损伤的效果。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (24)

1.一种预防或治疗哺乳动物视网膜损伤的方法，其特征在于，所述方法包括：向需要预防或治疗的对象眼睛的玻璃体腔内给予有效剂量的促红细胞生成素。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的视网膜损伤选自：视网膜细胞损伤、或视网膜组织损伤。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的视网膜细胞损伤选自以下细胞的损伤：视网膜色素上皮细胞、视网膜神经元、视网膜血管内皮细胞、或周细胞。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的视网膜神经元选自下组：视锥细胞、视杆细胞、外极细胞、Muller细胞、水平细胞、无长突细胞、神经节细胞、或神经胶质细胞。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的细胞损伤是细胞凋亡。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的视网膜组织损伤包括黄斑变性。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的哺乳动物是人。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的有效剂量为1.33-60μg/眼/次。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的需要预防的对象是糖尿病患者。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的哺乳动物是人。
11.一种促红细胞生成素的用途，其特征在于，用于制备治疗或预防视网膜组织或细胞损伤的药物。
12.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述的视网膜损伤选自：视网膜细胞损伤、或视网膜组织损伤。
13.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述的细胞损伤选自以下细胞的损伤：视网膜色素上皮细胞、视网膜神经元细胞、视网膜血管内皮细胞、或周细胞。
14.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述的视网膜神经元细胞选自下组：视锥细胞、视杆细胞、外极细胞、Muller细胞、水平细胞、无长突细胞、神经节细胞、或神经胶质细胞。
15.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述的细胞损伤是细胞凋亡。
16.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述的药物是眼内注射制剂。
17.一种眼内注射制剂，其特征在于，含有1.33-60μg/剂的促红细胞生成素，以及药学上可接受的载体。
18.如权利要求17所述的眼内注射制剂，其特征在于，含有15-30μg/剂的促红细胞生成素，以及药学上可接受的载体。
19.一种用于治疗或预防哺乳动物视网膜损伤的药盒，其特征在于，所述的药盒包括：
一个或多个容器，所述的容器中含有1.33-60μg的促红细胞生成素；
一个用于眼内给药的眼内注射器。
20.如权利要求19所述的药盒，其特征在于，所述的注射器具有：
(i)一空腔本体，所述的空腔本体用于容纳待注射的液体；
(ii)一注射针头，所述注射针头的尾端与(i)所述的空腔本体相连通；
(iii)一活塞，所述的活塞与(i)所述的空腔本体内壁密切接合，并可与空腔本体发生相对移动，从而可将溶液吸收入空腔本体内或将空腔本体内的溶液注入哺乳动物眼内；
(iv)一活塞驱动装置，可施压于所述活塞，以使活塞与空腔本体发生相对移动。
21.如权利要求19所述的药盒，其特征在于，所述的容器和眼内注射器是一体化的。
22.如权利要求19所述的药盒，其特征在于，所述的容器为玻璃制品、或为塑料制品。
23.如权利要求19所述的药盒，其特征在于，所述的容器为可透见的。
24.如权利要求19所述的药盒，其特征在于，所述的眼内注射器的针头为30号。
CNA2006100262423A 2006-04-29 2006-04-29 促红细胞生成素在预防或治疗视网膜损伤中的用途 Pending CN101062407A (zh)

Priority Applications (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNA2006100262423A CN101062407A (zh) 2006-04-29 2006-04-29 促红细胞生成素在预防或治疗视网膜损伤中的用途
US12/299,006 US20090209455A1 (en) 2006-04-29 2007-04-28 Vitreous administration of erythropoietin
CNA2007800243393A CN101534850A (zh) 2006-04-29 2007-04-28 促红细胞生成素的玻璃体腔内给药
AU2007247679A AU2007247679B2 (en) 2006-04-29 2007-04-28 Vitreous administration of erythropoietin
EP07720997.1A EP2037952B1 (en) 2006-04-29 2007-04-28 Vitreous administration of erythropoietin
JP2009506902A JP5238690B2 (ja) 2006-04-29 2007-04-28 エリスロポエチンの硝子体投与
CA002650877A CA2650877A1 (en) 2006-04-29 2007-04-28 Vitreous administration of erythropoietin
PCT/CN2007/001424 WO2007128222A1 (en) 2006-04-29 2007-04-28 Vitreous administration of erythropoietin

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNA2006100262423A CN101062407A (zh) 2006-04-29 2006-04-29 促红细胞生成素在预防或治疗视网膜损伤中的用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101062407A true CN101062407A (zh) 2007-10-31

Family

ID=38667434

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2006100262423A Pending CN101062407A (zh) 2006-04-29 2006-04-29 促红细胞生成素在预防或治疗视网膜损伤中的用途
CNA2007800243393A Pending CN101534850A (zh) 2006-04-29 2007-04-28 促红细胞生成素的玻璃体腔内给药

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2007800243393A Pending CN101534850A (zh) 2006-04-29 2007-04-28 促红细胞生成素的玻璃体腔内给药

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20090209455A1 (zh)
EP (1) EP2037952B1 (zh)
JP (1) JP5238690B2 (zh)
CN (2) CN101062407A (zh)
AU (1) AU2007247679B2 (zh)
CA (1) CA2650877A1 (zh)
WO (1) WO2007128222A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103745257A (zh) * 2013-12-23 2014-04-23 温州医科大学眼视光器械有限公司 一种基于图像识别的锥细胞密度的计算方法
CN114272363A (zh) * 2021-12-10 2022-04-05 中南大学 诱导型一氧化氮合酶在制备治疗急性高眼压的早期血视网膜屏障损伤药物中的应用

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012003960A1 (en) * 2010-07-06 2012-01-12 Augustinus Bader Topical application of erythropoietin for the treatment of eye disorders and injuries
CN102872464A (zh) * 2012-10-17 2013-01-16 汕头大学·香港中文大学联合汕头国际眼科中心 一种新型脉络膜新生血管基因治疗药物及其用途
US10695402B2 (en) 2017-03-16 2020-06-30 University Of Rochester Erythropoietin for gastrointestinal dysfunction
WO2022159414A1 (en) 2021-01-22 2022-07-28 University Of Rochester Erythropoietin for gastroinfestinal dysfunction

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4703008A (en) 1983-12-13 1987-10-27 Kiren-Amgen, Inc. DNA sequences encoding erythropoietin
NZ210501A (en) 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
JPS62171696A (ja) 1986-01-23 1987-07-28 Sumitomo Chem Co Ltd ヒトエリスロポエチンの製造方法
DK173067B1 (da) 1986-06-27 1999-12-13 Univ Washington Humant erythropoietin-gen, fremgangsmåde til ekspression deraf i transficerede cellelinier, de transficerede cellelinier sa
US4954437A (en) 1986-09-15 1990-09-04 Integrated Genetics, Inc. Cell encoding recombinant human erythropoietin
US6153407A (en) 1992-07-28 2000-11-28 Beth Israel Deaconess Medical Center Erythropoietin DNA having modified 5' and 3' sequences and its use to prepare EPO therapeutics
TW402639B (en) 1992-12-03 2000-08-21 Transkaryotic Therapies Inc Protein production and protein delivery
IL192290A0 (en) 1993-08-17 2008-12-29 Kirin Amgen Inc Erythropoietin analogs
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5725493A (en) 1994-12-12 1998-03-10 Avery; Robert Logan Intravitreal medicine delivery
US5846528A (en) 1996-01-18 1998-12-08 Avigen, Inc. Treating anemia using recombinant adeno-associated virus virions comprising an EPO DNA sequence
SI0964702T1 (sl) 1996-08-02 2007-02-28 Ortho Mcneil Pharm Inc Polipeptidi, ki imajo posamezen kovalentno vezan N-terminalni vodotopni polimer
CN1151258C (zh) 1997-07-23 2004-05-26 罗切诊断学有限公司 通过内源基因活化制备促红细胞生成素
ES2208798T3 (es) 1997-09-01 2004-06-16 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Eritropoyetina humana recombinante con un perfil de glicosilacion ventajoso.
US6310078B1 (en) 1998-04-20 2001-10-30 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Substituted amino acids as erythropoietin mimetics
ES2273497T3 (es) 1998-06-15 2007-05-01 Gtc Biotherapeutics, Inc. Proteina de fusion de la albumina serica humana de eritropoyetina analoga.
US6309374B1 (en) 1998-08-03 2001-10-30 Insite Vision Incorporated Injection apparatus and method of using same
EP1154691A4 (en) 1999-01-05 2004-07-07 Massachusetts Eye & Ear Infirm TARGETED ADMINISTRATION OF REGULATED RELEASE MEDICINE TO RETINA AND CHOROID THROUGH SCLEROTIC
MXPA01010177A (es) * 1999-04-13 2004-09-10 Kenneth S Warren Inst Inc Modulacion de la funcion del tejido excitable mediante eritropoyetina administrada en forma periferica.
PE20010288A1 (es) 1999-07-02 2001-03-07 Hoffmann La Roche Derivados de eritropoyetina
AU2003273615B2 (en) * 2002-06-11 2010-07-29 Brigham And Women's Hospital Neuroprotective synergy of erythropoietin and insulin-like growth factor
US20050074497A1 (en) 2003-04-09 2005-04-07 Schultz Clyde L. Hydrogels used to deliver medicaments to the eye for the treatment of posterior segment diseases
CA2539324A1 (en) 2003-09-18 2005-03-31 Macusight, Inc. Transscleral delivery
WO2006043965A1 (en) 2004-10-14 2006-04-27 Allergan, Inc. Therapeutic ophthalmic compositions containing retinal friendly excipients and related methods

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103745257A (zh) * 2013-12-23 2014-04-23 温州医科大学眼视光器械有限公司 一种基于图像识别的锥细胞密度的计算方法
CN103745257B (zh) * 2013-12-23 2016-08-17 温州医科大学眼视光器械有限公司 一种基于图像识别的锥细胞密度的计算方法
CN114272363A (zh) * 2021-12-10 2022-04-05 中南大学 诱导型一氧化氮合酶在制备治疗急性高眼压的早期血视网膜屏障损伤药物中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
JP2009535308A (ja) 2009-10-01
US20090209455A1 (en) 2009-08-20
EP2037952A4 (en) 2010-08-04
JP5238690B2 (ja) 2013-07-17
CN101534850A (zh) 2009-09-16
AU2007247679B2 (en) 2012-12-06
EP2037952B1 (en) 2015-10-21
EP2037952A1 (en) 2009-03-25
WO2007128222A1 (en) 2007-11-15
AU2007247679A1 (en) 2007-11-15
CA2650877A1 (en) 2007-11-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Abdelkader et al. Internal limiting membrane peeling in vitreo-retinal surgery
CN1200698C (zh) 角膜硬化剂在制备治疗眼睛屈光不正的药物中的用途
Buzzonetti et al. Transepithelial corneal cross-linking in pediatric patients: early results
Kahraman et al. Umbilical cord derived mesenchymal stem cell implantation in retinitis pigmentosa: a 6-month follow-up results of a phase 3 trial
CN1203531A (zh) 用胶质细胞系衍生神经营养因子(gdnf)蛋白产物治疗视网膜神经节细胞损伤的方法
CN101062407A (zh) 促红细胞生成素在预防或治疗视网膜损伤中的用途
Barsegian et al. Corneal neuropathy: an underrated manifestation of diabetes mellitus
CN103432572A (zh) 一种恒河猴糖尿病肾病模型的制备方法
Črnej et al. Effect of penetrating keratoplasty and keratoprosthesis implantation on the posterior segment of the eye
Atli et al. The relationship of serum asprosin level with diabetic and non-diabetic retinopathy.
CN1901919A (zh) 治疗眼病的组合物和微管蛋白结合剂用法
Silpa-Archa et al. Prevalence and associated factors of diabetic retinopathy in Chandrubeksa Hospital, Directorate of Medical services, Royal Thai Air Force
CN102058845B (zh) 一种治疗黄斑变性的药物组合物
Beato et al. Corneal structure and endothelial morphological changes after uneventful phacoemulsification in type 2 diabetic and nondiabetic patients
Urrets-Zavalía et al. Macular and extramacular optical coherence tomography findings in X-linked retinoschisis
Yang et al. The anterior chamber of the eye technology and its anatomical, optical, and immunological bases
CN1527704A (zh) 治疗眼病的组合物和微管蛋白结合剂用法
ELKady et al. Corneal endotheleal cells changes after phacoemulsification in type II diabetes mellitus
Wang et al. Efficacy and safety of scleral crosslinking using poly (ethylene glycol) ether tetrasuccinimidyl glutarate for form-deprivation myopia progression in rabbits
CN114099665B (zh) 一种具有抗眼底新生血管协同作用的混合物及其用途
Abdeen et al. Changes in Corneal Endothelium after Phacoemulsification in Diabetic and Non-diabetic Cataract Patients in Zagazig University Hospitals
CN110179780A (zh) 双醋瑞因在角膜ⅱ-ⅲ度碱烧伤治疗中的应用
RU2810890C1 (ru) Способ прижизненного получения образца внутренней пограничной мембраны сетчатки
Robaszkiewicz et al. Triple therapy: Phaco-vitrectomy with ILM peeling, retinal endophotocoagulation, and intraoperative use of Bevacizumab for diffuse diabetic macular edema
Saliem Corneal endothelial cells changes after phacoemulsification in diabetic patients

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication