DE69127975T2

DE69127975T2 - Impfstoffe

Info

Publication number: DE69127975T2
Application number: DE69127975T
Authority: DE
Inventors: Martin Ford
Original assignee: Evans Medical Ltd
Current assignee: UCB Pharma Ltd
Priority date: 1990-08-24
Filing date: 1991-08-23
Publication date: 1998-02-12
Anticipated expiration: 2011-08-24
Also published as: WO1992003162A1; JP3396478B2; ES2112275T3; EP0546036A1; JPH06503555A; DE69127975D1; DK0546036T3; EP0546036B1; GR3025679T3; GB9018690D0; ATE159173T1

Description

Diese Erfindung betrifft Liposomen, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und pharmazeutische Zusammensetzungen, welche diese enthalten.
Im allgemeinen werden die schlechtesten Antworten bzw. Responsereaktionen auf Influenza- Impfstoffe bei älteren Patienten beobachtet, für welche die größte Gefahr von Komplikationen und des Todes im Anschluß an eine Infektion mit Influenza besteht. Zusätzlich zu diesen Problemen sind Influenza-Impfstoffe, da man von ihnen annimmt, unwirksam zu sein, und aufgrund der Furcht vor Injektionen, unpopulär.
Die GB-A-1 564 500 beschreibt antigene Präparationen mit einer Vielzahl von unilamellaren Mikrovesikeln, welche anderweitig als Virosomen bekannt sind, wobei jeder Mikrovesikel eine einzelne Lipiddoppelschicht umfaßt, auf deren äußerer Oberfläche ein antigenes, aus einem Virus abgeleitetes, Protein gebunden ist. Die GB-A-1 564 500 steht im Zusammenhang mit zwei U.S.-Teilfortsetzungs-Patenten, der US-A-4 196 191 und der US-A-4 148 876. Die US- A-4 148 876 beschreibt antigene Virosomenpräparationen des in der GB-A-1 564 500 beschriebenen Typs, in welchen das antigene Protein durch hydrophobe Bindung gebunden ist und eine Hämagglutinin- und Neuraminidase-Untereinheit eines schützenden Oberflächenantigens ist, welches aus einem Myxovirus abgeleitet ist, und einen hydrophoben Bereich besitzt.
Hosaka et al., Biken J. 25, 51-62, 1982, berichtet, daß ein Influenzavirus mit einer hitzeinaktivierten Neuraminidase-Aktivität eine hämolytische Aktivität aufwies und in der Lage war, Zellfusion und Hüllen-Fusion einzuleiten. Die Druckschrift von Hosaka et al. enthält keinen Hinweis, daß ein solcher Virus als ein Impfstoff verwendet werden könnte.
Die EP-A-0 356 339 beschreibt eine Influenza-Immunisierungsdosierungsform, welche ein Liposom, gegebenenfalls einen multilamellaren Vesikel, und ein Influenza-Immunogen umfaßt, wobei das Liposom und das Immunogen in einer Immunisierungsdosis vorhanden sind, und worin das Influenza-Immunogen gegebenenfalls das Hämagglutinin-Fragment oder das Bromelain-Fragment umfaßt.
Die WO88/08718 betrachtet ein Immunisierungsverfahren gegen virale Infektion durch intranasales Verabreichen einer immunogen wirksamen Menge eines Impfstoffs aus einer viralen Hüll-Untereinheit, welcher ein mit einem Lipid komplexiertes Glykoprotein umfaßt. Das Glykoprotein kann das Parainfluenzavirus-Glykoprotein HN oder F sein. Von diesen Glykoproteinen nimmt man an, daß sie jeweils für die Anlagerungs- oder Hämagglutinations- und Neuraminidase(HN)-Aktivitäten bzw. für den Fortschritt der Infektion (F) verantwortlich sind.
Die CH-A-471896 beschreibt ein Verfahren zur Inaktivierung von Myxoviren durch Kontaktieren der Viren in einer wäßrigen Suspension bei einem pH-Wert zwischen 6 und 8 in Gegenwart von mindestens etwa 0,05 % (w/v) eines nicht-ionischen hydrophilen oberflächenaktiven Mittels mit einem vollständig oder teilweise chlorierten, oder chlorierten und fluorierten, Nieder-Kohlenwasserstoff, welcher bei Raumtemperatur flüssig ist.
Wir haben nun herausgefunden, daß Influenza-Virosomen, welche rekonstituierte Virushüllen umfassen und welche behandelt wurden, um die Neuraminidase zu inaktivieren, in hohem Maße immunogen sind, wenn sie intranasal verabreicht werden. Es wurden signifikante IgA- Antworten in der Lungen-Waschflüssigkeit von Mäusen beobachtet, welche intranasal, jedoch nicht parenteral, immunisiert worden waren. Diese Feststellungen besitzen allgemeine Anwendbarkeit. Folglich stellt die vorliegende Erfindung Liposomen zur Verfügung, welche auf ihrer Oberfläche ein Polypeptid aufweisen, das fähig zur Bindung an einer Schleimhautzelloberfläche von Mensch oder Tier ist und das die Liposomen fusogen macht, und welche im wesentlichen frei von aktiver Neuraminidase sind. Bei den Liposomen handelt es sich typischerweise um Virosomen.
Liposomen sind Lipidvesikel, welche einen dreidimensionalen Raum umschließen. Hüll-Viren umfassen eine Lipidhülle. Liposomen gemäß der vorliegenden Erfindung können deshalb aus dem Lipid eines Hüll-Virus hergestellt werden. Die Virushülle kann rekonstituiert werden, nachdem ein Hüll-Virus, zum Beispiel durch ein Detergenz, aufgebrochen worden ist, wodurch Liposomen gebildet werden.
Nützliche Liposomen können ebenfalls aus natürlichen oder synthetischen Phosphocholin-enthaltenden Lipiden mit einer Fettsäurekette mit 12 bis 20 Kohlenstoffatomen und einer Fettsäurekette mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen, zum Beispiel 12 bis 20 Kohlenstoffatomen, hergestellt werden. Derartige Lipide schließen Dimyristoylphosphatidylcholin, Dioleoylphosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylglycerin, Disteraroylphosphatidylcholin, Phosphatidylcholin, Phosphatidylserin und Sphingomyelin ein. Auch ein anderes Lipid kann in den Liposomen eingeschlossen werden, zum Beispiel Cholesterin, welches vorzugsweise zu weniger als 30 % (w/w) der Gesamt-Lipidzusammensetzung vorhanden ist. Die Lipide können ferner ein Material umfassen, um eine positive oder negative Ladung bereitzustellen, wie Phosphatidsäure, Dicetylphosphat, Phosphatidylserin oder Phosphatidylinositol, zur Bereitstellung einer negativen Ladung, oder Stearylamin oder andere primäre Amine, zur Bereitstellung einer positiven Ladung.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Liposomen können entweder unilamellar oder mulitlamellar, bevorzugt unilamellar, sein. Sie sind typischerweise biologisch abbaubar. Das Lipid, aus dem sie aufgebaut sind, ist im allgemeinen nicht-antigen. Die Liposomen können eine Substanz einkapseln, zum Beispiel eincn Antikörper, ein Antigen oder ein Arzneimittel. Sie können deshalb als ein Zuführungssystem für den eingekapselten Bestandteil verwendet werden. Die Liposomen können als ein allgemeines Zuführungssystem verwendet werden.
Bei der Umgebung innerhalb der Liposomen handelt es sich typischerweise um eine wäßrige Umgebung. Eine Vielzahl von Substanzen kann innerhalb der Liposomen eingekapselt werden, wie Peptide, Proteine oder Adjuvanzien. Bei der Substanz kann es sich um eine Substanz handeln, gegen welche es erwünscht ist, eine Immun-Antwort zu induzieren. Substanzen, welche eingekapselt werden können, schließen antigene Untereinheiten ein, die aus vielen Typen von Viren, wie dem Herpes Simplex-Virus, dem Hepatitis A-Virus und dem Hepatitis B-Virus, hergestellt werden. Proteine oder Peptide mit T-Zell-Epitopen der Klasse 1 können verwendet werden. Die Einkapselung dieses Materials innerhalb der Virosomen kann dabei helfen, eine cytotoxische T-Zell-Antwort gegen sie zu erzeugen.
Die Liposomen liegen bevorzugt in einer Form vor, welche für die intranasale Verabreichung geeigent ist. Deshalb vermittelt das Schleimhautzelloberflächen-bindende Polypeptid den Liposomen bevorzugterweise die Fähigkeit, an die Nasenschleimhaut oder die Schleimhaut der Lungen zu binden. Der Durchmesser der Liposomen beträgt vorzugsweise 5 bis 1 000 nm, zum Beispiel 10 bis 400 nm, und am stärksten bevorzugt von 20 bis 100 nm.
Das Polypeptid, welches in der Lage ist, an eine Schleimhautzelloberfläche zu binden, kann glykosyliert oder nicht glykosyliert sein. Das Polypeptid kann deshalb in der Form eines Glykoproteins vorliegen. Das Polypeptid macht die Liposomen fusogen, so daß sie in der Lage sind, mit Wirtszellmembranen zu fusionieren, anstatt lediglich daran zu binden. Diese Membranen können entweder die Außenmembran der Wirtszelle oder die Membran von Endosomen im Anschluß an eine Endocytose sein. Das Polypeptid ist typischerweise ein Virus- Hüllpolypeptid oder ist aus einem Virus-Hüllpolypeptid abgeleitet. Alle Hüll-Viren haben eine Oberflächen-bindende Funktion. Das Polypeptid kann deshalb ein Polypeptid sein, welches natürlicherweise auf der Oberfläche eines Hüll-Virus vorhanden ist und welches die Liposomen mit der Fähigkeit, an eine Zelloberfläche zu binden, versieht. Das Virus kann ein Myxovirus, wie ein Infuenza-, Mumps- oder Masern-Virus, sein. Insbesondere kann das Polypeptid ein Influenzavirus-Hüllprotein, zum Beispiel vom Influenza-Virustyp A, B oder C, sein oder davon abgeleitet sein.
Das zur Bindung an eine Zelloberfläche fähige Polypeptid kann zum Beispiel ein Hämagglutinin sein. Hämagglutinin ist ein in Myxoviren vorhandenes integrales Membran-Glykoprotein, welches häufig aus drei Monomeren oder Untereinheiten aufgebaut ist. Während der Infektion von Wirtszellen übt es zwei Funktionen aus. Erstens heftet es das Virus durch die Bindung von auf zellulären Glykoproteinen und Glykolipiden vorhandenen Sialinsäureresten an die Zelle. Zweitens löst, nach der Internalisierung des Virus in zelluläre Endosomen, die anschließende Ansäuerung Konformationsänderungen im Hämagglutinin aus, welche zur Fusion der viralen und zellulären Membranen führen. Hämagglutinine sind antigen und stimulieren die Erzeugung von Antikörpern in Wirten.
Ein anderer Typ von zur Bindung an eine Zelloberfläche fähigem Polypeptid kann ein bakterielles Adhäsionsprotein sein, wie die β-Untereinheit des Choleratoxins (CTB) oder die hitzelabile Enterotoxin-β-Untereinheit von E. coli (LTB). Dieses kann auch als ein Adjuvans in Kombination mit Hämagglutinin verwendet werden.
Neuraminidase ist ein anderes Glykoprotein, welches als ein integrales Membranprotein in Myxoviren gefunden wird. Es wirkt dahingehend, die Sialinsäurereste zu spalten und die irreversible Bindung des Virus an eine Wirtszellmembran durch Hämagglutinin zu verhindern. Wenn aktive Neuraminidase in den Liposomen vorhanden ist, wird eine signifikant geringere immunologische Antwort beobachtet. Wenn aktive Neuraminidase anderweitig in den Liposomen vorhanden ist, muß sie inaktiviert werden. Neuraminidase kann durch Wärme oder durch Inkubation mit einem Neuraminidaseinhibitor, wie 2,3-Dehydro-2-desoxy-N-acetylneuraminsäure (DDAN), inaktiviert werden.
Die vorliegenden Liposomen werden durch ein Verfahren hergestellt, welches das Bilden von Liposomen umfaßt, welche auf ihren Oberflächen ein Polypeptid aufweisen, das fähig zur Bindung an eine Schleimhautzelloberfläche von Mensch oder Tier ist und das die Liposomen fusogen macht, und welche im wesentlichen frei von aktiver Neuraminidase sind.
Das Polypeptid, welches fähig zur Bindung an eine Zelloberfläche ist und welches die Liposomen fusogen macht, kann den Lipidmaterialien vor, während oder nach der Bildung der Liposomen zugesetzt werden. Alternativ dazu können Virosomen unter Verwendung des natürlichen Lipids der Hülle eines Hüll-Virus verwendet werden, um die notwendige Lipid- Komponente bereitzustellen. Wenn sich das Polypeptid nicht auf natürliche Weise mit den Lipiden assoziiert, kann es an eine Fettsäure, wie Phosphatidylethanolamin (PE), durch Verwendung eines Vernetzungsmittels, wie Succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrat (SMPB), gekoppelt werden.
Liposomen können zum Beispiel durch Auflösen des Lipidausgangsmaterials in einem Lösungsmittel und Verdampfen des Lösungsmittels hergestellt werden. Die Lipidschicht wird dann mit wäßriger Kochsalzlösung oder einem Puffer (wenn es beabsichtigt ist, das Polypeptid nach der Vesikelbildung in die Liposomen einzubauen) oder mit einer wäßrigen Suspension des Polypeptids (wenn es beabsichtigt ist, Vesikel in Gegenwart des Polypeptids zu bilden) dispergiert. Die Dispersion wird danach, zum Beispiel durch Ultraschallbehandlung, geschüttelt. Das Polypeptid kann danach zugegeben werden, wo es nicht bereits in die Oberfläche der Liposomen eingebaut ist, und die Vesikel werden erneut geschüttelt bzw. gerührt.
Bei einem alternativen Verfahren handelt es sich darum, das Lipidausgangsmaterial einer wäßrigen Phase hinzuzusetzen und die Mischung langsam zu erwärmen. Sie wird dann geschüttelt, um Liposomen zu bilden. Die wäßrige Phase kann das Polypeptid enthalten, oder es kann anschließend zugegeben werden.
Ein weiteres Verfahren zur Herstellung von Liposomen umfaßt die rasche Einspritzung einer ethanolischen Lösung aus Lipid in wäßrige Kochsalzlösung oder einen Puffer, welcher zuvor mit Stickstoff durchblasen wurde. Die resultierende Liposomenpräparation wird dann durch Ultrafiltration bei schnellem Rühren unter Stickstoff bei niedrigem Druck konzentriert, um die Bildung von größeren, nicht-heterogenen Liposomen zu vermeiden. Das Ethanol kann durch Analyse oder Waschen mit einem Ultrafilter aus der Vesikelfraktion entfernt werden. Das Polypeptid kann in wäßriger Lösung vorhanden sein, oder alternativ dazu kann die nach der Ultrafiltration erhaltene Liposomenfraktion mit dem Polypeptid sanft ultraschallbehandelt werden.
Die auf die obenstehend beschriebene Weise erhaltenen Liposomenpräparationen umfassen wäßrige Dispersionen der Lipidvesikel.
Wenn die Liposomen Neuraminidase umfassen, dann muß diese inaktiviert werden. Dies kann durch Erwärmen der wäßrigen Dispersion der aktive Neuraminidase umfassenden Liposomen auf eine Temperatur von zum Beispiel von 30 bis 60ºC, zum Beispiel 50 bis 60ºC, weiter bevorzugt 53 bis 58ºC, und am stäksten bevorzugt etwa 55ºC, erreicht werden. Der benötigte Zeitraum zur Neuraminidase-Inaktivierung wird vom Virus-Stamm und der Temperatur abhängen, beträgt jedoch typischerweise 5 Minuten bis 5 Stunden, zum Beispiel 15 Minuten bis 3 Stunden. Bei niedrigen Temperaturen, z. B. 30ºC, wird eine längere Erwärmungsdauer benötigt, wohingegen bei höheren Temperaturen eine kürzere Dauer erforderlich ist. Wir haben herausgefunden, daß für den Influenza-Virus die Erwärmung bei 55ºC 120 Minuten oder länger erfolgen muß, zum Beispiel bis zu 180 Minuten, um eine optimale Wirkung zu erreichen. Bei 56ºC beträgt die optimale Dauer für die Erwärmung jedoch 6 bis 10 Minuten, zum Beispiel etwa 8 Minuten.
Alternativ dazu kann die aktive Neuraminidase durch Inkubation der Liposomen mit einem Neuraminidase-Inhibitor, wie DDAN, deaktiviert werden. Als weitere Alternative kann aktive Neuraminidase durch Wärme oder Inkubation mit einem Neuraminidase-Inhibitor vor dem Einbau in die Liposomen inaktiviert werden.
Ein geeigneter Weg zur Herstellung der Liposomen umfaßt folgendes:
(a) Aufbrechen eines Myxovirus und Entfernen des viralen Genoms und des internen viralen Proteins oder der viralenProteine; und
(b) Bilden von Liposomen in Gegenwart des verbleibenden Materials, insbesondere Hüll- Protein oder -Proteinen; und
(c) Inaktivieren der in den so gebildeten Liposomen vorhandenen Neuraminidase.
Der Schritt (a) kann durch Detergenz-Solubilisierung von viralen Partikeln und Entfernen von internen viralen Proteinen und RNA erreicht werden. Auf einem alternativen Weg zur Herstellung der Liposomen kann das Zelloberflächen-bindende Polypeptid mittels eines rekombinanten DNA-Verfahrens hergestellt werden. Es wird dann notwendigerweise frei von Neuraminidase bereitgestellt, so daß notwendigerweise Liposomen, welche im wesentlichen frei von aktiver Neuraminidase sind, erhalten werden.
Die Liposomen der vorliegenden Erfindung können in Form einer pharmazeutischen oder tiermedizinischen Zusammensetzung verabreicht werden, welche zusätzlich ein geeignetes pharmazeutisch oder tiermedizinisch annehmbares Träger- oder Verdünnungsmittel umfaßt. Die Zusammensetzungen sind für die intranasale Verabreichung geeignet.
Die Zusammensetzungen werden bevorzugt in einer sterilisierten Form zur Verfügung gestellt. Sie können die Form eines Aerosols einnehmen. Die Zusammensetzungen können ferner Konservierungsmittel, Stabilisatoren und andere herkömmliche Impfstoff-Excipienten umfassen, sofern erforderlich.
Die Dosierung der Liposomen wird in Abhängigkeit von einer Vielzahl von Faktoren variieren. Diese schließen die Natur des an die Zelloberfläche bindenden Proteins, des Empfängers (Mensch oder Tier), des Impfungs-Zeitplans und des durch die Präparation hervorgerufenen Grads der Adjuvanseigenschaft ein. Im allgemeinen kann eine Dosis von Liposomen als eine Einzeleinheit oder als eine Mehrzahl einer Subdosierung über eine Zeitdauer hinweg intranasal verabreicht werden. Typischerweise beträgt die Einheitsdosis für die intranasale Zufuhr an einen Menschen 2 bis 500 µg.
Die Impfstoffe der Erfindung zeigen Vorteile gegenüber derzeitigen Influenza-Impfstoffen. Diese schließen die Immunogenität, die Bequemlichkeit der intranasalen Verabreichung und die Erzeugung lokaler Schleimhaut-Immunität ein.
Die Erfindung wird nun mittels des nachfolgenden Beispiels weiter veranschaulicht. In den begleitenden Zeichnungen gilt folgendes:
Die Figur 1A zeigt die ELISA-Titer gegen den X31-Influenzavirus in Seren aus Balb/c- Mäusen, welche intranasal (i.n.) mit erhitzten(m) und Säure-behandelten(m) Virosomen oder Virus immunisiert wurden;
Die Figur 1B zeigt die ELISA-Titer gegen denaturierten Virus in Seren aus Mäusen, welche i.n. mit erhitzten(m) und Säure-behandelten(m) Virosomen oder Virus immunisiert wurden;
Die Figur 1C zeigt die Neutralisations-Titer von Seren aus Mäusen, welche i.n. mit erhitzten(m) und Säure-behandelten(m) Virosomen oder Virus immunisiert wurden;
Die Figur 1D zeigt die HAI-Titer gegen das Virus in Seren aus Mäusen, welche i.n. mit erhitzten(m) und Säure-behandelten(m) Virosomen oder Virus immunisiert wurden;
Die Figur 2A zeigt die ELISA-Titer gegen das Virus in Seren aus Mäusen, welche i.n. mit erhitztem und Säure-behandeltem Virus immunisiert wurden;
Die Figur 2B zeigt die Neutralisations-Titer gegen das Virus in Seren aus Mäusen, welche i.n. mit erhitztem und Säure-behandeltem Virus immunisiert wurden;
Die Figur 3A zeigt die ELISA-Titer gegen das Virus in Seren aus Mäusen, welche i.n. mit erhitzten und Säure-behandelten Virosomen immunisiert wurden;
Die Figur 3B zeigt die Neutralisations-Titer gegen das Virus in Seren aus Mäusen, welche i.n. mit erhitzten und Säure-behandelten Virosomen immunisiert wurden;
Die Figur 4A zeigt die ELISA-Titer gegen das Virus in Seren aus Mäusen, welche i.n. mit erhitzten und Säure-behandelten Virosomen immunisiert wurden, welche die internen Proteine und RNA einkapselten ("Virosomen-Cores");
Die Figur 4B zeigt die Neutralisations-Titer gegen das Virus in Seren aus Mäusen, welche i.n. mit erhitzten und Säure-behandelten Virosomen-Cores immunisiert worden waren;
Die Figur 5A zeigt die ELISA-Titer gegen das Virus in Seren aus Mäusen, welche i.n. mit erhitzten und Säure-behandelten Ovalbumin-einkapselnden Virosomen immunisiert worden waren ("Ova-Virosomen");
Die Figur 5B zeigt die Neutralisations-Titer gegen das Virus in Seren aus Mäusen, welche i.n. mit erhitzten und Säure-behandelten Ova-Virosomen immunisiert worden waren;
Die Figur 6A zeigt die individuellen ELISA-Titer gegen das Virus in Seren (zwei Tage nach der "Antigenstimulation bzw. Challange" abgenommenes Blut) aus Mäusen, welche i.n. mit erhitztem und Säure-behandeltem Virus immunisiert worden waren;
Die Figur 6B zeigt die individuellen Neutralisations-Titer gegenüber dem Virus in Seren (zwei Tage nach der "Antigenstimulation" abgenommenes Blut) aus Mäusen, welche i.n. mit erhitztem und Säure-behandelten Virus immunisiert worden waren;
Die Figur 7A zeigt die individuellen ELISA-Titer gegen das Virus in Seren (Blut abgenommen zwei Tage nach der "Antigenstimulation") aus Mäusen, welche i.n. mit erhitzten und Säure- behandelten Virosomen immunisiert worden waren;
Die Figur 7B zeigt die die individuellen Neutralisations-Titer gegen das Virus in Seren (Blut abgenommen zwei Tage nach der "Antigenstimulation") aus Mäusen, welche i.n. mit erhitzten und Säure-behandelten Virosomen immunisiert worden worden waren;
Die Figur 8A zeigt die individuellen ELISA-Titer gegen das Virus in Seren (Blut abgenommen zwei Tage nach der "Antigenstimulation") aus Mäusen, welche i.n. mit erhitzten und Säure- behandelten Virosomen-Cores immunisiert worden waren;
Die Figur 8B zeigt die individuellen Neutralisations-Titer gegenüber dem Virus in Seren (Blut abgenommen zwei Tage nach der "Antigenstimulation") aus Mäusen, welche i.n. mit erhitzten/Säure-behandelten Virosomen-Cores immunisiert worden waren;
Die Figur 9A zeigt die individuellen ELISA-Titer gegen das Virus in Seren (Blut abgenommen zwei Tage nach der "Antigenstimulation") aus Mäusen, welche i.n. mit erhitzten und Säure- behandelten Ova-Virosomen immunisiert worden waren;
Die Figur 9B zeigt die individuellen Neutralisations-Titer gegen Virus in Seren (Blut abgenommen zwei Tage nach der "Antigenstimulation") aus Mäusen, welche i.n. mit erhitzten/- Säure-behandelten Ova-Virosomen immunisiert worden waren;
Die Figur 10A zeigt ELISA-Titer, welche die Auswirkung einer Erwärmung auf die Immunogenität von i.n. verabreichten Virosomen aufzeigen;
Die Figur 10B zeigt die Neutralisations-Titer, welche die Auswirkung einer Erwärmung auf die Immunogenität von i.n. verabreichten Virosomen aufzeigen;
Die Figur 11 vergleicht die Anti-Virus- und Neutralisierungs-Antikörper-Antwort im Anschluß an eine Immunisierung mit erhitzten Virosomen.
Die Figur 12A zeigt die Auswirkung des Erwärmens bei 55ºC auf die Immunogenität von i.n. verabreichten Virosomen;
Die Figur 12B zeigt die Auswirkung des Erwärmens auf 55ºC auf die Immunogenität von i.n. verabreichten Virosomen;
Die Figur 13 zeigt den Effekt der Vorbehandlung von Virosomen oder von Mäusen mit Gangliosiden auf die Immunogenität von i.n. verabreichten Virosomen;
Die Figur 14A zeigt die ELISA-Ergebnisse von Seren aus Mäusen, welche i.n. an den Tagen 0 und 43 mit unterschiedlichen Dosen von Influenza-Virosomen immunisiert worden waren; und
Die Figur 14B zeigt die Neutralisations-Ergebnisse von Seren aus Mäusen, welche i.n. an den Tagen 0 und 43 mit unterschiedlichen Dosen von Influenza-Virosomen immunisiert worden waren.

BEISPIEL

1. METHODEN

Herstellung von Virosomen

Das Verfahren zur Herstellung der rekonstituierten Virushüllen war ähnlich zu demjenigen, welches von Metsikko et al. (EMBO J. 5, 3429-3435, 1986) und Stegmann et al. (EMBO J. 6, 2651-2659, 1987) beschrieben wurde. Ein Pellet aus X31-Influenzavirus (5 mg) wurde 20 Minuten lang bei Raumtemperatur in 0,7 ml 100 mM Octaethylenglykol-monododecylether (C&sub1;&sub2;E&sub8;) in Dialysepuffer (145 mM NaCl, 5 mM Hepes, pH 7,4) solubilisiert. Die Mischung wurde 30 Minuten lang bei 170 000 g zentrifugiert, um die internen Proteine und RNA zu entfernen. 0,56 ml des Überstands wurden 160 mg an nassen Bio-Beads SM-2 (Warenzeichen) zugegeben und auf einem Rotationstisch bzw. Schütteltisch (etwa 400 Upm) 1 Stunde lang bei Raumtemperatur geschüttelt. Der Überstand wurde von den Perlen mit einer 23 g-Nadel, welche an einer 1 ml-Spritze angebracht war, abgenommen und zu 80 mg nassen Bio-Beads SM-2 gegeben und auf einem Schütteltisch (etwa 500-600 Upm) 8 Minuten lang geschüttelt, was eine trübe Suspension ergab. Der Überstand wurde mit einer 23 g-Nadel und einer Spritze entnommen. Die Virosomen wurden von dem nicht-eingebauten Protein durch diskontinuierliche Sucrose-Gradienten (40 %/5 % oder 40 %/20 %/5 %) abgetrennt, welche 90 Minuten lang bei 170 000 g zentrifugiert wurden. Die Morphologie der Virosomen wurde durch Elektronenmikroskopie unter Verwendung von Negativ-Färbung mit Phosphowolframat analysiert.
Virosomen mit eingekapselten Proteinen, z. B. Ovalbumin (Virosomen + Ova), wurden wie obenstehend beschrieben hergestellt, außer daß 100 µl 200 mg/ml Ovalbumin vor der Zugabe der SM-2-Perlen zugesetzt wurden. Virosomen-Kerne bzw. -"Cores" wurden wie obenstehend beschrieben hergestellt, außer daß die internen Proteine und RNA nicht durch Zentrifugation entfernt wurden.

ELISA-Assays

Anti-Virus-Antikörper in dem Serum aus geimpften Mäusen wurden mittels ELISA (Enzyme- Linked-Immunoadsorbent-Assay) gemessen. Das Virus-Antigen wurde in Carbonat-Beschichtungspuffer, pH 9,5, verdünnt: Es handelte sich um eine 1/50-Verdünnung von Allantoinflüssigkeit aus mit dem Virus angeimpften Hühnereiern oder 1 µg/ml gereinigtem, in Eiern herangezogenem Virus. Die Mikrotiterplatten wurden mit Antigen beschichtet und 1 Stunde lang bei 37ºC und danach über Nacht bei 4ºC stehengelassen. Nach dreimaligem Waschen der Platten in 0,05 % Tween 20 (Warenzeichen) in PBS wurden 100 µl 1%iges BSA zugegeben und 1 Stunde lang bei 37ºC stehengelassen, um die Platten abzublocken. Die zu testenden Antiseren wurden absteigend oder quer über die Platte in verdoppelnden oder halblogarithmischen Verdünnungen in 1 % BSA in PBS verdünnt und über Nacht bei 4ºC stehengelassen. Die Platten wurden mit Tween/PBS gewaschen, bevor der Enzym-konjugierte zweite Antikörper bei 1/500 - 1/1000 in 1%igem BSA in PBS zugegeben wurde. Die Platten wurden 2 Stunden lang bei 37ºC stehengelassen und in Tween/PBS gewaschen. Das Substrat, o-Phenylendiamindihydrochlorid (OPD) (10 mg/100 ml) in Citratpuffer mit 0,01 % H&sub2;O&sub2; wurde den Platten zugegeben und die Reaktion in H&sub2;SO&sub4; gestoppt. Die Platten wurden bei 492 nm auf einem Mikroplatten-Leser abgelesen. Die Titer waren die Endpunkt-Titer, welche durch Heranziehen des Titers ermittelt wurden, bei dem der OD-Wert gleich dem mittleren OD-Wert, welcher mit einer 1/10-Verdünnung von Kontroll-Normalseren erhalten wurde, plus zwei Standardabweichungen, war.

In Vitro-Neutralisations-Assay

Wir haben einen auf Mikrotiterplatten basierenden Neutralisations-Assay an Madin Darby- Kaninchennieren(MDCK)-Zellen etabliert. Antikörper-Verdünnungsreihen wurden mit 2 Logs Virus 1 Stunde lang bei 37ºC inkubiert. Diese wurden auf Mikrotiterplatten mit 70-90 % konfluenten MDCK-Zellen in "Minimal-Essentiell-Medium"(MEM)-Medium ohne Serum überführt. Nach einstündiger Inkubation bei 37ºC wurde der Überstand entfernt und frisches MEM mit 10 µg/ml Trypsin zugegeben. Die Platten wurden nach 48-72 Stunden gefärbt und die Neutralisationstiter per Auge abgelesen.

HAI-Hämagglutinations-Inhibitionsassay

Hämagglutinations- und Hämagglutinations-Inhibitions-Assays wurden, wie von Fazekas de St. Groth und Webster, (J. Exp. Med. 124; 331-345, 1966) beschrieben, durchgeführt.

Experimente

Die Experimente wurden wie folgend durchgeführt, wobei auf die Figuren Bezug genommen wird:

Figur 1

Dosis: 5 µg X31-Virus/Virosomen pro Maus in 30 µl i. n. gegebenem Volumen.
Alle Virosomen wurden 5 Minuten lang UV-inaktiviert (400 µW/cm²)
Erwärmung : Die Erwärmung wurde 20 min lang bei 55ºC durchgeführt.
Säurebehandlung: 1/100 Volumen an 3 M Acetatpuffer, pH 4,8, wurde den Virosomen zugegeben. Diese wurden 15 Minuten lang bei 37ºC stehengelassen, bevor eine Neutralisierung der Säure mit 1 M Tris, pH 7,5, stattfand.
Zweite Immunisierung: 6 Wochen
Test von abgenommenem Blut: 12 Wochen

Figuren 2-5

Dosis: 5 µg X31-Virus/Virosomen pro Maus in 30 µl i. n. gegebenem Volumen.
Die Virosomen wurden 5 Minuten lang UV-inaktiviert (400 µW/cm²)
Erwärmung: Die Erwärmung wurde 20 Minuten lang bei 55ºC durchgeführt.
Säurebehandlung 1/100 Volumen an 3 M Acetatpuffer, pH-Wert 4,8, wurde den Virosomen zugegeben. Diese wurden 15 Minuten lang bei 37ºC stehengelassen, bevor eine Neutralisierung der Säure mit 1 M Tris, pH-Wert 7,5, stattfand.
Zweite Immunisierung: 6 Wochen

Figuren 6-9

Dosis: 5 µg X31-Virus/Virosomen pro Maus in 30 µl i. n. gegebenem Volumen.
Die Virosomen wurden 5 Minuten lang UV-inaktiviert (400 µW/cm²)
Erwärmung: Die Erwärmung wurde 20 Minuten lang bei 55ºC durchgeführt.
Säurebehandlung: 1/100 Volumen an 3 M Acetatpuffer, pH-Wert 4,8, wurde den Virosomen zugegeben. Diese wurden 15 Minuten lang bei 37ºC stehengelassen, bevor eine Neutralisierung der Säure mit 1 M Tris, pH-Wert 7,5, stattfand.
Zweite Immunisierung: 6 Wochen
Testen von abgenommenem Blut: 12 Wochen

Figur 10

Dosis: 3 µg X31-Virosomen pro Maus in 30 µl i. n. gegebenem Volumen.
Die Virosomen wurden 5 Minuten lang UV-inaktiviert (400 µW/cm²)
Erwärmung: Die Erwärmung wurde über die angegebenen Zeiten hinweg bei 55ºC durchgeführt.
Zweite Immunisierung: 6 Wochen

Figur 11

Dosis: 3 µg X31-Virosomen pro Maus in 30 µl i. n. gegebenem Volumen.
Die Virosomen wurden 5 Minuten lang UV-inaktiviert (400 µW/cm²)
Erwärmung: Die Erwärmung wurde über die angegebenen Zeiten hinweg bei 55ºC durchgeführt.
Zweite Immunisierung: 6 Wochen
Testen des abgenommenen Bluts: 8 Wochen

Figur 12

Dosis: 3 µg an X31-Virosomen pro Maus in 30 µl i. n. gegebenem Volumen.
Die Virosomen wurden 5 Minuten lang UV-inaktiviert (400 µW/cm²)
Erwärmung: Die Erwärmung wurde über die angegebenen Zeiten hinweg bei 55ºC durchgeführt.
Zweite Immunisierung: 6 Wochen
Testen des abgenommenen Bluts: 12 Wochen

Figur 13

Präinkubation mit Gangliosiden und Antikörper

Die Virosomen wurden gegen Hepes-Puffer (145 mM NaCl, 5 mM Hepes, pH 7,4, plus 3 mM EDTA) dialysiert. Diese Virosomen wurden 1 Stunde lang bei 55ºC erwärmt.
Dosis: 3 µg/Maus in einem Volumen von 30 µl.
Inkubation mit Gangliosiden: Die Virosomen wurden bei 37ºC 1 Stunde lang und dann bei 4ºC über Nacht mit einem 12molaren Überschuß von Gangliosiden gegenüber dem viralen Hämagglutinin inkubiert.
Vorbehandlung der Mäuse mit Gangliosiden: 100molarer Überschuß an Gangliosiden gegenüber viralem Hämagglutinin.
Inkubation mit Antikörper: 20 µg Virosomen wurden in 40 µg gereinigtem HC2-Antikörper oder 20 µg HC2-Fab-Fragmenten 2 Stunden lang bei 37ºC inkubiert.

Verabreichung der Virosomen mit CTB

2 µg CTB (B-Untereinheit des Choleratoxins) wurden zusammen mit 3 µg Virosomen jeder Maus verabreicht.
Zweite Immunisierung: 6 Wochen
Testen des abgenommenen Bluts: 12 Wochen

Behandlung mit DDAN

20 µg Virosomen wurden 1 Stunde lang bei 37ºC und dann über Nacht bei 4ºC mit 1mM DDAN inkubiert.
Dosis pro Maus = 3 µg in 30 µl Volumen i.n.
Zweite Immunisierung: 6 Wochen
Testen des abgenommenen Bluts: 12 Wochen

Figur 14 (Dosis-Antwort)

Dosis: variable Dosis von X31-Virosomen in einem i.n. gegebenen Volumen von 30 µl.
Die Virosomen wurden 5 Minuten lang UV-inaktiviert (400 µW/cm²)
Erwärmung: Die Erwärmung wurde über die angegebenen Zeiten bei 55ºC durchgeführt.
Zweite Immunisierung: 6 Wochen

2. ERGEBNISSE

Effekt der Säurebehandlung auf die Immunogenität des Virus und der Virosomen

Das Influenzavirus, Influenzavirosomen oder Influenzavirosomen mit Kernen bzw. Cores (HBcAg) oder Ovalbumin wurden 30 Minuten lang bei 37ºC mit Säure (pH-Wert 4,8) behandelt. Die Säurebehandlung des Virus oder der Virosomen führte zu einer dramatischen Verringerung der Immunogenität von über den intranasalen Weg gegebenem Virus oder Virosomen, wie es durch Serum-ELISA-Titer gegen das native Virus geprüft wurde (Figuren 1A und 2A-5A). Dies beruhte nicht auf der Tatsache, daß die Säure einige der Neutralisationsepitope auf dem Hämagglutinin zerstört, weil geringere Antworten auch beobachtet wurden, wenn die Seren gegen SDS-denaturierten Virus getestet wurden (Figur 1B). Darüber hinaus waren die Spiegel an induziertem neutralisierenden Antikörper beträchtlich verringert, wenn das Inokulum säurebehandelt wurde (Figur 1C und 2B-5B).
Es schien ein gewisser Schutz gegen Säure-Inaktivierung von "Cores" enthaltenden Virosomen zu bestehen, aber dies kann auf der ungenügenden Ansäuerung des Verstärkungs-Inokulums beruhen (siehe Figur 4A & B). Wenn die Antwort individueller Tiere analysiert wurde, lag eine konsistente Verminderung der Antwort vor, wenn der Virus oder die Virosomen Säure- behandelt worden waren (Figuren 6-9). Wir betrachteten ebenfalls die Hämagglutinations- Inhibitions(HI)-Aktivität der Seren (Figur 1D), welche gleichfalls eine Verminderung des Titers der stimulierten Antikörper aufzeigt, wenn die Virosomen vor der Inokulation Säure- behandelt wurden.
Die Säure-Behandlung (pH-Wert 4,8) des Virus hebt die Fähigkeit des Virus auf, mit Zellen zu fusionieren, wohingegen die Virus-Anlagerung unbeeinträchtigt bleibt. Dies beruht auf der irreversiblen Konformationsänderung in der Konformation von Hämagglutin, welche normalerweise innerhalb des Endosoms nach Aufnahme des Virus in "Coated Pits" stattfindet. Diese Ergebnisse legen nahe, daß das Virus oder die Virosomen nicht lediglich an die Schleimhaut- Oberflächen binden müssen, sondern auch mit den epithelialen Zellen fusionieren müssen, um optimale Antworten zu stimulieren.

Effekt der Erwärmung auf 55ºC auf die Immunogenität des Virus

Intranasal mit 20 min lang erwärmtem X31-Influenza-Virus inokulierte Mäuse zeigten signifikant größere Serum-ELISA-, HAI- oder neutralisierende Antikörper-Titer als Mäuse, welche den nicht-erwärmten Virus erhielten (Figuren 1A-D). Sowohl die ELISA-Titer gegen nativen Virus als auch die neutralisierenden Titer näherten sich denjenigen, welche im Anschluß an eine Immunisierung mit derselben Dosis an infektiösem Virus beobachtet wurden (Figur 2). In einem weiteren Experiment wurde das Virus lediglich 8 Minuten lang erwärmt, und dies führte wiederum zu einem Ansteigen der Antwort im Anschluß an eine intranasale Inokulation (Tabelle 1).
Die Antworten sowohl auf den erwärmten als auch den infektiösen Virus wurden mindestens 21 Tage vor den Antworten auf inaktivierten Virus beobachtet. Als die Antwort individueller Tier untersucht wurde, bestand ein Anstieg in der Antwort, wenn das Virus erwärmt wurde, und die ELISA-Titer waren parallel zu den neutralisierenden Titern (Figur 6). Es bestand allerdings eine beträchtliche Variation, die wahrscheinlich auf die Effizienz der Inokulation zurückzuführen war.

Effekt der Erwärmung auf 55ºC auf die Immunogenität von Virosomen

In einem vorbereitenden Experiment wurden Mäuse intranasal mit Virosomen oder mit "Cores" oder Ovalbumin enthaltenden Virosomen, welche 20 Minuten lang erwärmt worden waren, inokuliert. Diese erwärmten Virosomen stimulierten vergleichbare oder größere Serum- ELISA- oder neutralisierende Titer als bei Mäusen, welche nicht erwärmte Virosomen erhielten (Figuren 1-5). Die Figur 4 zeigt, daß UV-inaktivierte, erwärmte Virosomen, welche virale "Cores" enthalten, eine viel frühere Antwort stimulieren als UV-inaktivierte oder Säure- behandelte Virosomen. Darüber hinaus gab es, wenn die Antwort von individuellen Tieren untersucht wurde, eine geringe Variation innerhalb der Tier-Gruppen (Figur 7). Die Neutralisations-Titer zeigten eine größere Variation, waren aber parallel zu den ELISA-Titern. Es sollte bemerkt werden, daß diese Virosomen bei 4ºC aufbewahrt wurden, so daß es möglich ist, daß viel von der Neuraminidase-Aktivität verloren wurde.
Die Mäuse wurden mit frischen Virosomen immunisiert, welche bei -20ºC in 50 % Glycerin aufbewahrt wurden. Ein drastischer Zuwachs der Immunogenität wurde beobachtet, wenn die Virosomen bis zu 128 Minuten lang erwärmt wurden; (Figuren 10A und 11, Tabelle 1). Die Spiegel der neutralisierenden Antikörper zeigten einen drastischeren Zuwachs bei gesteigerten Erwärmungsdauern (Figuren 10B und 11). Mit nicht-erwärmten Virosomen immunisierte Tiere wiesen nicht nachweisbare Spiegel an neutralisierenden Antikörpern auf, was nahelegt, daß die in den vorhergehenden Experimenten mit nicht-erwärmten Virosomen beobachteten hohen Antworten auf eine teilweise Inaktivierung der Neuraminidase-Aktivität während der Lagerung bei 4ºC zurückzuführen waren. Darüber hinaus wurde, wenn Serum aus individuellen Mäusen analysiert wurde, ein signifikanter Anstieg im ELISA- und neutralisierenden Antikörper-Titer in Seren aus Mäusen beobachtet, welche Virosomen erhielten, die über zunehmende Zeitdauern hinweg erwärmt worden waren (Tabelle 2, Figur 12).

Effekte der spezifischen Inaktivierung von Neuraminidase auf die Immunogenität von intranasal dargereichten Virosomen

Wir haben ein Experiment durchgeführt, um zu bestimmen, ob der beim Erwärmen von Virosomen beobachtete Anstieg der Immunogenität auf der Inhibition von Neuraminidase (NA) beruhte. Daher wurde die NA in den Virosomen spezifisch mit dem Neuraminsäure- Analog DDAN inaktiviert. DDAN-behandelte Virosomen stimulierten eine größere Antwort als unbehandelte Virosomen (Logarithmus des Titers von 2,2 im Vergleich zu 1,6), was zeigt, daß die Inhibition von Neuraminidase zu einer Steigerung der Immunogenität von intranasal verabreichten Virosomen führt.

Effekt der spezifischen Blockierung der Virosomen-Anlagerung durch Präinkubation mit Gangliosiden auf die Immunogenität von intranasal dargereichten Virosomen

Um den Effekt der Blockierung der Virosomenanlagerung auf die Immunogenität von intranasal verabreichten Virosomen zu untersuchen, haben wir Virosomen in verschiedenen Sialinsäure-haltigen Gangliosiden präinkubiert. Die Immunogenität von intranasal (i.n.) verabreichten Influenza-Virosomen konnte durch die Vorbehandlung der Virosomen mit GM1- oder GD1a-Gangliosiden, aber nicht durch Vorbehandeln mit GT1b oder einer Gangliosidmischung, teilweise aufgehoben werden (Figur 13). In ähnlicher Weise haben wir festgestellt, daß die Virosomen-vermittelte Hämagglutination nur von den GM1- und GB1a-Gangliosiden teilweise inhibiert wurde. Diese Experimente zeigen, daß die Bindung von Virosomen an Sialinsäurerezeptoren ausschlaggebend für ihre Immunogenität ist.

Effekt der Vorbehandlung von Mäusen mit Gangliosiden auf die Antwort von Mäusen gegenüber intranasal dargebotenen Virosomen

Wir haben den Effekt der Zunahme der viralen Rezeptoren auf den respiratorischen Schleimhautoberflächen durch intranasale Vorbehandlung von Mäusen mit verschiedenen Gangliosiden auf die Antwort gegenüber Virosomen untersucht (Figur 13). Die Vorbehandlung mit GM1-Gangliosid, aber nicht mit GD1a, GT1b oder einer Gangliosidmischung, führte zu einer Erhöhung der Antwort, vermutlich aufgrund eines Anstiegs der Dichte der Rezeptoren oder des Austauschs durch höher affine Rezeptoren auf den Schleimhautoberflächen, was eine größere Bindung und Aufnahme der Virosomen vereinfachte.

Effekt der spezifischen Blockierung der Virosomenanlagerung durch Präinkubation mit neutralisierenden monoklonalen Antikörpern auf die Immunogenität von intranasal dargebotenen Virosomen

Die Präinkubation von Virosomen mit einem neutralisierenden monklonalen Antikörper (entweder ganzer oder Fab-Fragmente) inhibierte die Hämagglutination vollständig. Allerdings blieb die Immunogenität der Virosomen unbeeinflußt von einer vorherigen Inkubation von Virosomen in Gesamt-Antikörper oder Fab-Fragmenten, oder einer i.n.-Inokulation von Fab- Fragmenten 2 Stunden nach der Inokulation mit unbehandeltem Virosomen. Dieses Ergebnis ist überraschend und kann darauf hinweisen, daß einige neutralisierende Antikörper nicht die Bindung oder den Eintritt des Virus in die Schleimhautepithelien verhindern, sondern ein späteres Ereignis (z.B. sekundäres "Dekapsidieren"). Die Untersuchung des Schicksals von Antikörper-behandeltem Virus oder Virosomen sollte eine Einsicht in die Mechanismen der humoralen Immunität im respiratorischen Trakt gewähren. Darüber hinaus ist es, hinsichtilch der intranasalen Impfung von Menschen, ermutigend, wenn die Gegenwart von lokalen neutralisierenden Antikörpern darin fehlschlägt, die Immunogenität von intranasal verabreichten Virosomen zu verringern.

Effekt der intranasalen Verabreichung der B-Untereinheit von Choleratoxin (CT-B) zusammen mit Virosomen auf die Immunogenität der Virosomen

Wir haben untersucht, ob CTB die Antworten auf intranasal verabreichte Virosomen steigern könnte. Die Figur 13 zeigt, daß eine dramatische Steigerung (10fach) der Antwort auf die Virosomen vorlag, wenn diese mit CTB dargeboten wurden.

Dosis/Antwort-Untersuchung von intranasal verabreichten Virosomen

Wir haben die Antwort auf einen Bereich von Dosierungen von intranasal verabreichten Virosomen untersucht. Diese Virosomen waren nicht-erwärmt und frisch; daher sind die Antikörper-Antworten verhältnismäßig niedrig. Es wurde ein deutlicher Dosis/Antwort-Effekt beobachtet, wobei die minimale immunogene Dosis sich auf 1 µg belief (Figur 14). Wir haben dieses Experiment unter Verwendung von erwärmten Virosomen wiederholt, von denen wir erwarten würden, viel stärker immunogen zu sein.

Schutz gegene Infektion (Challange)

Alle die Tiere, welche intranasale Immunisierungen von Virus oder Virosomen erhielten, wurden mit dem lebendigen Virus konfrontiert, und die Lungen wurden 2 Tage später entnommen. Vorläufige Infektions-Lungen-Titer zeigen, daß mit dem Virus oder Virosomen, die nicht Säure-behandelt worden waren, immunisierte Tiere vollständig gegen die Infektion geschützt waren. Tabelle 1- INTRANASALE IMMUNISIERUNG VON BALB/C-MÄUSEN MIT INFLUENZA- VIROSOMEN Tabelle 2 - INTRANASALE IMMUNISIERUNG VON BALB/C-MÄUSEN MIT INFLUENZA-VIRUSOMEN: ANTWORT VON EINZELNEN MÄUSEN

Claims

1. Liposomen, welche auf ihrer Oberfläche ein Polypeptid aufweisen, welches fähig zur Bindung an einer Schleimhautzelloberfläche eines Menschen oder eines Tieres ist und welches die Liposomen fusogen macht, und welche im wesentlichen frei von aktiver Neuraminidase sind.

2. Liposomen gemäß Anspruch 1, in denen das Haemaglutinin ein Haemaglutinin eines Myxovirus ist.

3. Liposomen gemäß Anspruch 2, bei welchen es sich bei dem Myxovirus um Influenza-, Mumps- oder Masern-Viren handelt.

4. Liposomen gemäß Anspruch 1, in welchen das Polypeptid ein bakterielles Adhäsionspolypeptid ist.

5. Liposomen gemäß mindestens einem der vorstehenden Ansprüche, welche eine physiologisch aktive Substanz einkapseln.

6. Liposomen gemäß Anspruch 5, worin die Substanz ein Peptid, Protein oder Adjuvans ist.

7. Verfahren zur Herstellung von Liposomen gemäß mindestens einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Verfahren das Bilden von Liposomen umfaßt, welche auf ihrer Oberfläche das Polypeptid aufweisen und welche im wesentlichen frei von aktiver Neuraminidase sind.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, welches folgendes umfaßt:

(a) Aufbrechen eines Myxovirus und Entfernen des viralen Genoms und des/der internen viralen Proteins oder Proteine;

(b) Bilden von Liposomen in Gegenwart des verbleibenden Materials;

(c) Inaktivieren der in den derartig gebildeten Liposomen vorhandenen Neuraminidase.

9. Verfahren gemäß Anspruch 8, worin die Neuraminidase durch Wärme oder durch Inkubation mit Neuraminidaseinhibitor inaktiviert wird.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9, worin die Inaktivierung durch Erwärmen auf eine Temperatur von 50 bis 60ºC oder durch Inkubation mit 2,3-Dehydro-2-desoxy-N- acetylneuraminsäure erreicht wird.

11. Verfahren gemäß Anspruch 7, worin Liposomen unter Verwendung des Polypeptids gebildet werden, bei welchem es sich um ein rekombinantes Polypeptid handelt.

12. Pharmazeutische Zusammensetzung, welche Liposomen nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6 in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel umfaßt.

13. Zusammensetzung gemäß Anspruch 12, welche in einer für die intranasale Verabreichung geeigneten Form vorliegt.