JPH06503555A - ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ワクチン 本発明はリポソーム、それらの調製方法およびそれらを含有する薬剤組成物に関 するものである。

各種の不活化されたウィルスはよい免疫原である一方、ワクチンとしてそれらを 使用する場合に重大な損失を示す発熱原でもあることか知られている。この一つ の例か現在のインフルエンザワクチンである。これらはウィルス全体からなり、 卵タンパク質への感受性同様発熱性の問題を被る。代わりのものとしてはウィル スのサブユニットからなるインフルエンザワクチンを用いることであるか、これ らは不十分な免疫原であり、生感染に比較して不十分な防御しか促進しない。

一般に、インフルエンザワクチンへの最も不十分な応答がインフルエンザの感染 に続く併発症および死の危機に陥った初老の患者で観察されている。これらの問 題に加えて、インフルエンザワクチンは効果がないと考えられており、注射の恐 怖のため一般的でない。

ＧＢ−Ａ−１５６４５００はウイロソームとして知られる多数の単層微小水胞を 含む抗原の調製を提示し、それぞれの微小水胞はウィルス由来の抗原タンパク質 が結合する表面上に単一脂質二重層からなる。ＧＢ−Ａ−１５６４５００は二つ の連続した米国特許ＵＳ−Ａ−４１９６１９１およびＵＳ−Ａ−４１４８８７６ に関連するものである。ｔＪｓ−Ａ−４１４８８７６は、ＧＢ−Ａ−１５６４５ ００で提示される型の抗原ウイロソームの調製を示しており、その中で、抗原タ ンパク質は疎水性結合により結合され、ヘマグルチニンおよびミキソウイルス由 来て、疎水性領域をもつ防御表面抗原のニューラミニダーゼサブユニットである 。

我々は再構築ウィルスエンベロープを含み、ニューラミニダーゼを不活化する処 理をされたインフルエンザウイロソームか鼻腔内投与されると、高度に免疫原性 をもつことを見いだした。著しい［ｇＡ応答が鼻腔内で免疫されたマウスの肺洗 浄液には観察されたが、非経口で免疫された場合には観察されなかった。これら の発見は一般１応用性をもつ。したかって、本発明はヒトまたは動物の粘膜細胞 表面への結合能があるポリペプチドがその表面に存在し、基本的に活性ニューラ ミニダーゼをもたないリポソームを供給することである。リポソームは典型的に はウイロソームである。

リポソームは三次元空間を囲まれた脂質小胞である。

エンベロープウィルスは脂質エンベロープからなる。本発明に記載のリポソーム はそれ故エンベロープウィルスの脂質から作製される。ウィルスエンベロープは 例えば界面活性剤によりエンベロープウィルスか破壊された後、それによりリポ ソームを形成するために再構築される。

作動なリポソームはまた、１２から２０個の炭素原子の一つのＩＩＷ肪酸鎖およ び少なくとも８個の炭素原子、例えば１２から２０個の炭素原子の一つの脂肪酸 鎖をもつ天然または合成のホスホコリンを含む脂肪から作製される。そのような 脂肪はシミリストイルホスファチジルコリン、ジオレイルホスファチジルコリン 、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルグリセ ロール、ジステアロイルホスファチジルコリン、ホスファチジルコリン、ホスフ ァチジルセリンおよびスフィンゴミエリンを含む。好ましくは全脂質成分の３０ ％（Ｗ／Ｗ）以下として存在する、例えばコレステロールのような他の脂質もま たリポソームに含まれる。脂質はさらに正または負の電荷を供給する物質、ホス ファチジン酸、ジセチルリン酸、ホスファチジルセリンまたはホスファチジルイ ノシトールのような負の電荷を供給する物質、または正の電荷を供給するための ステアリルアミンまたは他の一次アミンを含む。

本発明で用いられるリポソームは単層または複層のいずれかで、好ましくは単層 である。それらは典型的には生物分解される。それらが構成される脂質は一般に は非抗原性である。リポソームは例えば抗体、抗原または薬剤のような物質をカ プセル化する。それらはそれ故カプセル化される成分の運搬システムとして用い られる。リポソームは一般的な運搬システムとしても利用される。

典型的にはリポソーム内部の環境は水性環境である。

ペプチド、タンパク質またはアジュバントのような各種は免疫応答を誘導したい 物質に対するものである。カプセル化される物質はヘルペスシンプレックスウィ ルス、Ａ型肝炎ウィルスおよびＢ型肝炎ウィルスのような多くの型のウィルスか ら調製された抗原サブユニットを含む。

クラス１のＴ−細胞エピトープを含むタンパク質またはペプチドか用いられる。

この物質のウイロソーム内へのカプセル化はそれらに対する細胞毒性Ｔ−細胞応 答をつくる助けとなる。

リポソームは好ましくは鼻腔内投与に適した形態である。それ故、好ましくは粘 膜細胞表面結合ポリペプチドはリポソームに鼻腔粘膜または肺粘膜への結合能を 与える。好ましくはリボソーｊ−ノ直径は５から１１０００ｎて、例えば１０か ら４００ｎｍ　、最も好ましくは２０から１１００ｎである。

粘膜細胞表面に結合能をもつポリペプチドはグリコジル化されているか、または グリコジル化されていない。

ポリペプチドはそれ膜糖タンパク質の形態である。好ましくはポリペプチドはリ ポソームに融合性を賦与するので、リポソームは宿主細胞膜と単に結合するとい うよりはむしろ融合することができる。これらの膜は外膜またはエンドサイト− シスに続くエンドサイトの膜のいずれかである。ポリペプチドは典型的にはウイ ルスエンベローブポリペプチド、またはウイルスエンベローブポリペプチド由来 のものである。全てのエンベロープウィルスは表面結合機能をもつ。ポリペプチ ドはそれ故エンベロープウィルスの表面に存在し、細胞表面結合能をもつリポソ ームを供給するポリペプチドである。ウィルスはインフルエンザ、おたふくかぜ または麻疹ウィルスのようなミキソウイルスである。特に、ポリペプチドは例え ばインフルエンザウィルスＡ、ＢまたはＣ型のようなインフルエンザウィルスエ ンベロープタンパク質であるか、またはそれに由来するものである。

細胞表面に結合能のあるポリペプチドは、例えばヘマグルチニンである。ヘマグ ルチニンはミキソウイルスに存在する、通常三つの単量体またはサブユニットか らなる不可欠な膜種タンパク質である。宿主細胞への感染中に、ヘマグルチニン は二つの機能を果たす。第一に、細胞の糖タンパク質および糖脂質に存在するシ アル酸残基の結合により細胞にウィルスを接着する。第二に、細胞エンドサイト へのウィルスの内在化の後、次の酸性化がウィルスおよび細胞膜の融合を起こさ せるヘマグルチニンに立体配置の変化を誘発する。ヘマグルチニンは抗原性で、 宿主の抗体産生を促進する。

細胞表面への結合能をもつ別の型のポリペプチドはコレラ毒のβ−サブユニット （ＣＴＢ）または大腸菌の熱不安定性エンテロトキシンβ−サブユニット（ＬＴ Ｂ）のような細菌接着タンパク質である。これはまたへマグルチニンと組み合せ てアジュバントとして用いられる。

ニューラミニダーゼはミキソウイルスに不可欠な膜タンパク質として見いだされ る別の糖タンパク質である。

これはシアル酸残基を切断し、ヘマグルチニンによる宿主細胞膜へのウィルスの 不可逆的な結合を阻害するように機能する。活性ニューラミニダーゼかリポソー ムに存在すると、その場合は著しく低い免疫学的応答か観察される。活性ニュー ラミニダーセか同様にリポソームに存在するならば、それは不活化されるへきで ある。ニューラミニダーゼは熱処理または２，３−デヒドロ−２−デオキシ＝Ｎ 〜アセチルニューラミン酸（ＤＤＡＮ）のようなニューラミニダーゼ阻害剤との インキュベーションにより不活化される。

本リポソームはヒトまたは動物の粘膜細胞表面への結合能をもつポリペプチドか その表面に存在し、基本的に活性ニューラミニダーゼをもたないリポソームを形 成することよりなる過程により調製される。

細胞表面への結合能をもつポリペプチドは、リポソームの形成前、形成中または 形成後に、脂質物質に添加される。あるいは、ウイロソームは必要な脂質成分を 供給するためにエンベロープウィルスのエンベロープの天然脂質を用いて調製さ れる。ポリペプチドが天然に脂質と結合しないならば、サクシニミジル−４−（ ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）のような架橋剤の利用により ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）のような脂肪酸に結合される。

リポソームは例えば脂質開始物質を溶媒に溶解し、溶媒を蒸発させることにより 調製される。脂質層はその後（小胞形成後にポリペプチドをリポソームに取り込 むつもりならば）生理的食塩水または緩衝液に、または（ポリペプチド存在下で 小胞を形成するつもりならは）ポリペプチドの水性懸濁液に分散される。分散液 はその後、例えば超音波により撹拌される。リポソーム表面にはまだ取り込まれ ていないポリペプチドか添加され、小胞は再び撹拌される。

別の方法は脂質開始物質を水層に添加し、ゆっくり混合液を熱処理することであ る。これはリポソームを形成するために、それから撹拌される。水層はポリペプ チドを含んでいるか、または続いて添加される。

リポソームを調製するさらに別の方法は、脂質のエタノール溶液の生理的食塩水 または予め窒素封入された緩衝液への急速注入を含む。得られたリポソーム調製 品はその後より大きな不均一ではないリポソームの形成を避けるために低圧で窒 素存在下、急速撹拌しながらの限外濾過により濃縮される。エタノールは小胞画 分から分析または限外濾過膜を用いた洗浄により除去される。ポリペプチドは水 溶液に存在するか、または代わりとして限外濾過後に得られるリポソーム画分が ポリペプチドと共に軽（超音波処理される。

上述のように得られたリポソーム調製品は脂質小胞の分散液を含む。

リポソームがニューラミニダーゼを含むならば、その後不活化される。これは活 性ニューラミニダーセを含むリポソームの分散液を、例えば３０から６０°Ｃ１ 例えば５０から６０°Ｃ１より好ましくは５３から５８°Ｃ１最も好ましくは約 ５５°Ｃの温度での熱処理により行われる。ニューラミニダーゼ不活化に必要な 時間の長さはウィルス株および温度に依存するか、典型的には５分から５時間、 例えば１５分から３時間である。低温、例えば３０°Ｃては、より長い時間の熱 処理か必要であるか、より高い温度ではより短い時間か必要とされる。我々はイ ンフルエンザウィルスについて、最適効果を得るために５５°Ｃての熱処理は１ ２０分またはそれ以上、例えば１８０分まてであることを見いたした。しかし、 ５６°Ｃでは熱処理の最適時間は６から１０分、例えば約８分である。

あるいは、活性ニューラミニダーゼはＤＤＡＮのようなニューラミニダーセ阻害 剤とリポソームをインキュベーションすることにより不活化される。さらに代わ るものとして、活性ニューラミニダーゼはリポソームへの取込みの前に熱処理ま たはニューラミニダーセ阻害剤とのインキュベーションにより不活化される。

リポソームを調製する適当な方法は、（ａ）　ミキソウイルスを破壊し、ウィル スゲノムおよび内部ウィルスタンパク質を除去すること、（ｂ）残りの物質、特 にエンベロープタンパク質存在下でリポソームを形成すること、および（Ｃ）こ のように形成されたリポソームに存在するニューラミニダーゼを不活化すること からなる。

段階（ａ）は界面活性剤によるウィルス粒子の可溶化および内部ウィルスタンパ ク質およびＲＮＡの除去により達成される。リポソームを調製する別の方法で、 細胞表面結合ポリペプチドは組換えＤＮＡ技術により調製される。

必ずニューラミニダーセをもたないように準備されるので、基本的に活性ニュー ラミニダーセをもたないリポソームか必ず得られる。

本発明のリポソームは、さらに適当な薬学的に、または獣医学的に受容可能な運 搬体または希釈剤を含む薬学あるいは獣医学的組成物の形態で投与される。成分 は鼻腔内投与に適している。

成分は好ましくは滅菌された形で供給される。それらは噴霧剤の形をとる。成分 はさらに必要ならば、防腐剤、安定化剤および他の慣例的なワクチン賦形剤から なる。

リポソームの投与量は各種因子に依存して変化する。

これらには細胞表面結合タンパク質の性質、患者（ヒトまたは動物）、予防接種 の計画、および調製により与えられる補助性の程度か含まれる。一般に、リポソ ームの投与は単一の単位として、または時間をかけた繰り返しの再投与により鼻 腔内へ行われる。典型的にはヒトへの鼻腔内投与の単位は２から５００μｇであ る。

我々はまた基本的に不活性なニューラミニダーゼをもたない不活化されたインフ ルエンザウィルスは鼻腔内に投与されると、高度な免疫原性をもつことを見いだ した。

この発見はまた一般に応用可能である。それ故、発明はさらに、インフルエンザ ウィルスとして用いるための、感染性のない、基本的に活性ニューラミニダーセ をもたないインフルエンザウィルスおよびインフルエンザワクチンとして用いる ための医薬品の調製における感染性のない、基本的に活性ニューラミニダーゼを もたないインフルエンザウィルスの使用を供給する。

インフルエンザウィルスはいずれかのインフルエンザウィルス、例えばＡ、Ｂま たはＣ型である。ウィルスは予防接種したいものに対するウィルスである。ニュ ーラミニダーゼは熱処理または特異的阻害剤により不活化される。ウィルスの水 溶液は熱処理される。熱処理は例えば３０から６０℃、より好ましくは５３から ５８°Ｃおよびさらに好ましくは約５５°Ｃの温度で行われる。

ニューラミニダーゼの不活化を確実にするために行われる熱処理の時間の長さは ウィルスの株および温度に依存するが、典型的には５分から５時間、例えば１５ 分から３時間である。低温、例えば３０°Ｃては、より高温の場合より、より長 い熱処理か必要とされる。我々は最適効果を達成するために、５５°Ｃての熱処 理は１２０分以上、例えば１８０分までであることを見いだした。しかし、５６ °Ｃての熱処理の最適時間は６から１０分、例えば８分である。

インフルエンザウィルスは不活化される。特に、ウィルスの感染性は不活化され る。これはニューラミニダーゼを不活化するための熱処理により達成される。し かし、典型的には絶対安全な不活化方法を供給する紫外線照射により達成される 。これはニューラミニダーゼを不活化するための処理前、同時にまたは処理後に 実施される。

照射は例えば２４０から２５０ｎｍの短波長で、４００　μＷ／ｃａ＋雪、少な くとも５分間、例えば５から６０分行われる。紫外線不活化および熱処理された ウィルスは２から３日間胚含有ニワトリ卵の尿膜液中で生育、回収され、ショ糖 勾配で精製される。

基本的に活性ニューラミニダーゼをもたない不活化インフルエンザウィルスはさ らに適当な薬学的に受容可能な運搬体または希釈剤を含む薬学的成分の形態で投 与される。成分は鼻腔内投与に適している。

成分は好ましくは滅菌された形態で供給される。それらは噴霧液の形態をとる。

成分はさらに必要ならば、防腐剤、安定化剤およびその他の慣例的な賦形剤を含 む。

不活化ウィルスの投与量は各種の因子に依存して変化する。基本的に活性ニュー ラミニダーゼをもたない効果的な量の不活化インフルエンザウィルスは予防接種 か必要な、特に前記ウィルスに対する予防接種が必要な人に投与される。投与量 を評価するために考慮すべき因子は供与体の年齢、予防接種の計画および調製に より付与されるアジュバント性の程度を含む。一般に、服用は単一ユニットとし て、または一定時間の多重再投与として鼻腔内に投与される。典型的には鼻腔内 投与のためのユニット投与量は２から５００μｇである。

発明のワクチンは現在のインフルエンザワクチン以上の利点を示す。これらは免 疫原性、鼻腔内投与の簡便さおよび局部的な粘膜の免疫の生産を含む。

発明はさらに以下の例により示される。添付の図において、 図ＩＡは熱および酸処理したウイロソームまたはウィルスで鼻腔内（ｉ、ｎ、） 免疫されたＢａ１ｂ／ｃマウスの血清中のＸ３１インフルエンザウイルスに対す るＥＬ［ＳＡの力価を示す。

図ＩＢは熱および酸処理したウイロソームまたはウィルスで１．０．免疫された Ｂａ１ｂ／ｃマウスの血清中の変性ウィルスに対するＥＬＩＳＡの力価を示す。

図ＩＣは熱および酸処理したウイロソームまたはウィルスてｉ、　ｎ、免疫され たマウスの血清の中和力価を示す。

図１０は熱および酸処理したウイロソームまたはウィルスで！、ｎ、免疫された マウスの血清中のウィルスに対するＨＡ［の力価を示す。

図２Ａは熱および酸処理したウィルスでｉ、　ｎ、免疫されたマウスの血清中の ウィルスに対するＥＩＪＳＡの力価を示す。

図２Ｂは熱および酸処理したウィルスてｉ、　ｎ、免疫されたマウスの血清中の ウィルスに対する中和力価を示す。

図３Ａは熱および酸処理したウイロソームでｉ、　ｎ、免疫されたマウスの血清 中のウィルスに対するＥＬＩＳＡの力価を示す。

図３Ｂは熱および酸処理したウイロソームでｉ、ｎ、免疫されたマウスの血清中 のウィルスに対する中和力価を示す。

図４Ａは内部タンパク質およびＲＮＡをカプセルで被った熱および酸処理したウ イロソーム（ウイロソームコア）でｉ、　ｎ、免疫されたマウスの血清中のウィ ルスに対するＥＬＩＳＡの力価を示す。

図４８は熱および酸処理したウイロソームコアで１．１．免疫されたマウスの血 清中のウィルスに対する中和力価を示す。

図５Ａはオブアルブミンをカプセルで被った熱および酸処理したウイロソーム（ オバウイロソーム）でｉ、　ｎ、免疫されたマウスの血清中のウィルスに対する ＥＬ［ＳＡの力価を示す。

図５Ｂは熱および酸処理したオバウイロソームでｉ、　ｎ、免疫されたマウスの 血清中のウィルスに対する中和力価を示す。

図６Ａは熱および酸処理したウィルスでｉ、　ｎ、免疫されたマウスの血清（採 血２日後）中のウィルスに対する個々のＥＬＩＳＡの力価を示す。

図６Ｂは熱および酸処理したウィルスでｉ、　ｎ、免疫されたマウスの血清（採 血２日後）中のウィルスに対する個々の中和力価を示す。

図７Ａは熱および酸処理したウイロソームでｉ、　ｎ、免疫されたマウスの血清 （採血２日後）中のウィルスに対する個々のＥＬ［ＳＡの力価を示す。

図７Ｂは熱および酸処理したウイロソームでｉ、　ｎ、免疫されたマウスの血清 （採血２日後）中のウィルスに対する個々の中和力価を示す。

図８Ａは熱および酸処理したウイロソームコアでｉ、ｎ、免疫されたマウスの血 清（採血２日後）中のウィルスに対する個々のＥＬＩＳＡの力価を示す。

図８Ｂは熱および酸処理したウイロソームコアで１．ｎ、免疫されたマウスの血 清（採血２日後）中のウィルスに対する個々の中和力価を示す。

図９Ａは熱および酸処理したオバウイロソームで１．ｎ、免疫されたマウスの血 清（採血２日後）中のウィルスに対する個々のＥＬＩＳＡの力価を示す。

図９Ｂは熱および酸処理したオバウイロソームでｉ、　ｎ、免疫されたマウスの 血清（採血２日後）中のウィルスに対する個々の中和力価を示す。

図１０Ａはｉ、　ｎ、投与されたウイロソームの免疫原性に対する熱処理の効果 を示すＥＬＩＳＡの力価を示す。

図１０Ｂはｉ、　ｎ、投与されたウイロソームの免疫原性に対する熱処理の効果 を示す中和力価を示す。

図１１は熱処理されたウイロソームで免疫した後の抗ウィルスおよび中和抗体の 応答を比較している。

図１２Ａはｉ、ｎ、投与されるウイロソームの免疫原性に対する５５°Ｃでの熱 処理の効果を示す。

図１２Ｂは１．ｎ、投与されるウイロソームの免疫原性に対する５５°Ｃでの熱 処理の効果を示す。

図１３は１１口、投与されるウイロソームの免疫原性に対するガングリオシドで のウイロソームまたはマウスの前処理の効果を示す。

図１４Ａは異なる投与量のインフルエンサウイロソームで１．１．免疫されたマ ウスの０日および４３日の血清のＥＬＩＳＡの結果を示す。

図１４Ｂは異なる投与量のインフルエンザウイロソームてｉ、　ｎ、免疫された マウスの０日および４３日の血清の中和の結果を示す。

再構築ウィルスエンベロープを作るための方法はＭｅｔｓｉｋｋｏら（ＥＭＢＯ Ｊｌ、第５巻、３４２９から３４３５ページ、１９８６年）およびＳｔｅｇｍａ ｎｎら（ＥＭＢＯＪ、、第６巻、２６５１から２６５９ページ、１９８７年）に より記述されたものに類似したものである。Ｘ３１インフルエンザウイルスのペ レット（５ｍｇ）が透析緩衝液（１４５ｍＭ　ＮａＣ１、５ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　 、　ｐＨ７，４）に溶解した１００ｍＭオクタエチレングリコールモノドデシル エーテル（ＣＩ２２８）の０．７ｍｌに２０分間室温で溶解された。

混合液は内部タンパク質およびＲＮＡを除去するために１７ｏ、　０００ｇで３ ０分間遠心分離に付された。０．５６ｍ１の上清か１６０ｍｇの湿ったＢｉｏ　 −Ｂｅａｄｓ　５Ｍ−２に添加され、室温で１時間回転台で振盪された（約４０ ０ｒｐｍ）。上溝はビーズから１ｍｌシリンジに付けた２３ｇ針を用いて取り出 され、８０ｍｇの湿ったＢｉｏ　−Ｂｅａｄｓ　５Ｍ−２に添加され、回転台で ８分間振盪され（約５００から６０Ｏｒｐｍ）　、濁った懸濁液が得られた。上 清か２３ｇ針とシリンジを用いて取り出された。ウイロソームは１７０．０００ ｇで９０分間遠心される不連続なショ糖勾配（４０％７５％または４０％７２０ ％７５％）により取り込まれないタンパク質から分離された。ウイロソームの形 態はリンタングステン酸の逆染色を用いた電子顕微鏡により解析された。

被膜タンパク質、例えはオブアルブミンを含むウイロソーム（ウイロソーム＋卵 ）は１００μｌの２００ｍｇ／ｍ１オブアルブミンか５Ｍ−２ヒーズに添加され る前に添加されることを除いて上述のように作製された。ウイロソームコアは内 部タンパク質およびＲＮＡか遠心分離により除去されないことを除いて上述のよ うに作製された。

ＥＬ［Ｓ、Ａ法 予防接種されたマウスの血清中の抗ウイルス抗体はＥＬＩＳＡ（酵素免疫吸着法 ）により測定される。ウィルス抗原は炭酸コーティング緩衝液、ｐＨ９，５で、 ウィルスを接種されたニワトリ卵の洗浄液またはｌμｇ／ｍｌの精製された卵で 生育したウィルスか１７５０に希釈された。マイクロタイタープレートは抗原で コートされ、３７°Ｃで１時間、さらに４°Ｃて一晩放置された。プレートを３ 回０，０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳて洗浄した後、１％ＢＳＡか１００μ ｌ添加され、プレートをブロックするために３７°Ｃて１時間放置された。

試験される抗血清は１％ＢＳＡを含むＰＢＳで倍々にまたは半対数的にプレート て希釈され、４°Ｃて一晩放置された。

プレートは１％ＢＳＡを含むＰＢＳて１１５００から１／１０００に希釈した酵 素結合二次抗体を添加する前に洗浄された。プレートは３７℃で２時間放置され 、Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳて洗浄された。

０．０１％Ｈ２Ｏ２を含むクエン酸緩衝液に溶解した基質である０−フェニレン ジアミンジヒドロクロリド（ＯＰＤ）かプレートに添加され、反応は硫酸で止め られた。プレートは４９２ｎｍでマイクロプレートリーダーで読まれた。力価は 、対照の正常血清の１７１０希釈で得られる平均ＯＤ値＋２標準偏差に等しいＯ Ｄ値をとる力価により決定される端点の力価我々はＭＤＣＫ細胞でのマイクロタ イタープレートを用いた中和法を確立した。連続的に希釈した抗体は３７°Ｃで １時間２対数のウィルスとインキュベートされた。これらは無血清ＭＥＭ培地中 で７０から９０％融合したＭＤＣＫ細胞の入ったマイクロタイタープレートに移 された。３７°Ｃで１時間のインキュベーションの後、上清か除去され、ｌＯμ ｇ／ｍｌのトリプシンを含む新鮮なＭＥＭか添加された。プレートは４８から７ ２時間後に染色され、中和力価が目で読まれた。

ｌＡｌ−血球凝集反応阻害アッセイ 血球凝集反応および血球凝集反応阻害アッセイはＦａｚｅｋａｓ　ｄｅ　Ｓｔ、 　ＧｒｏｔｈおよびＷｅｂＳｔｅｒにより記述されたように行なわれた（Ｊ、Ｅ ｘｐ、Ｍｅｄ、　、第１２４巻、３３１から３４５ページ、１９６６年）。

実験 実験は以下のように、図に参照されるように行なわれた。

投与量−１，０，投与で３０μｌの容量中にマウスあたり５μｇのＸ３１ウイル ス／ウイロソーム 全てのウィロソームは５分間（４００μＷ／ｃｍ”）ＵＶ不活化された。

熱処理−熱処理は２０分間５５°Ｃで行われた。

酸処理−１／１００容の３Ｍ　酢酸緩衝液、ｐＨ４，８がウィロソームに添加さ れた。ＩＭ　Ｔｒｉｓ　、　ｐＨ７，５で酸を中和する前に、これらは３７°Ｃ で１５分間放置された。

二次免疫−６週 採血試験−１２週 図２から５ 投与量−ｉ、　ｎ、投与で３０μＩの容量中にマウスあたり５μｇのＸ３１　ウ ィルス／ウイロソームウイロソームは５分間（４００μＷ／ｃｍすＵＶ不活化さ れた。

熱処理−熱処理は２０分間５５°Ｃで行われた。

酸処理−１／１００容の３Ｍ　酢酸緩衝液、ｐＨ４，８がウィロソームに添加さ れた。ＩＭ　Ｔｒｉｓ　、　ｐＨ７，５で酸を中和する前に、これらは３７℃で １５分間放置された。

二次免疫−６週 図６から９ 投与量−ｉ、ｎ、投与で３０μｌの容量中にマウスあたり５μｇのＸ３１ウイル ス／ウイロソーム ウイロソームは５分間（４００μＷ／ｃｍ”）ＵＶ不活化された。

熱処理−熱処理は２０分間５５°Ｃで行われた。

酸処理−１／１００容の３Ｍ　酢酸緩衝液、ｐＨ４，８がウィロソームに添加さ れた。ＩＭ　Ｔｒｉｓ　、　ｐＨ７，５で酸を中和する前に、これらは３７℃で １５分間放置された。

二次免疫−６週 採血試験−１２週 図１０ 投与量−ｉ、ｎ、投与で３０μｌの容量中にマウスあたり３μｇのＸ３１ウイロ ソーム ウイロソームは５分間（４００μＷ／ｃｍ２）ＵＶ不活化された。

熱処理−熱処理は特定の時間５５°Ｃで行われた。

二次免疫−６週 図１１ 投与量−ｉ、ｎ、投与で３０μｌの容量中にマウスあたり３μｇのＸ３１ウイロ ソーム ウイロソームは５分間（４００μＷ／ｃｍ２）ＵＶ不活化された。

熱処理−熱処理は特定の時間５５°Ｃで行われた。

二次免疫−６週 採血試験−８週 図１２ 投与量−ｉ、　ｎ、投与で３０μｌの容量中にマウスあたり３μｇのＸ３１ウイ ロソーム ウイロソームは５分間（４００μｌｉｔ／ｃｍ２）ＵＶ不活化された。

熱処理−熱処理は指定された時間５５°Ｃて行われた。

二次免疫−６週 採血試験−１２週 ガングリオシドおよび抗体を用いた前処理ウイロソームはＨｅｐｅｓ緩衝液（１ ４５ｍＭ　ＮａＣ１、５ｍＭＨｅｐｅｓ　、　ｐＨ７，４および３ｍＭ　ＥＤＴ Ａ）で透析された。これらのウイロソームは５５°Ｃて１時間熱処理された。

投与量−３０μｌてマウスあたり３μｇガングリオシドとのインキュベーション ーウイロソームはウィルスのへマグルチニンに対して１２Ｍ過剰のガングリオシ ドとともに３７°Ｃで１時間、さらに４°Ｃで一晩インキユベートされた。

ガングリオシドでのマウスの前処理−ウィルスのへマグルチニンに対して１００ Ｍ過剰のガングリオシド抗体とのインキュベーション−２０℃ｇのウイロソーム が４０℃ｇの精製ＨＣ２抗体または２０℃ｇのＨＣ２のＦａｂ断片と２時間３７ °Ｃでインキュベートされた。

ＣＴＢとウイロソームの投与 それぞれのマウスに対して、２μｇのＣＴＢ（コレラ毒のβ−サブユニット）が ３μｇのウイロソームと共に投与された。

二次免疫−６週 採血試験−１２週 ＤＤＡＮでの処理 ２０℃ｇのウイロソームが１ｍＭ　ＤＤＡＮと共に１時間３７°Ｃで、さらに４ °Ｃで一晩インキユベートされた。

マウスあたりの投与量＝ｉ１口、て３０μｌ中３μｇ二次免疫−６週 採血試験−１２週 図１４（投与量に対する応答） 投与量−３０μｌの容量で各種の量のＸ３１ウイロソームがｉ、　ｎ、で与えら れる ウイロソームは５分間（４００μＷ／ｃｍ２）ＵＶ不活化された。

熱処理−熱処理は指定された時間５５°Ｃで行われた。

二次免疫−６週 インフルエンザウィルス、インフルエンザウイロソームまたはコア（ＨＢｃＡｇ ）あるいはオブアルブミンを含むインフルエンザウイロソームは３０分間３７° Ｃで酸処理された（ｐＨ４，８）。ウィルスまたはウイロソームの酸処理は生ウ ィルスに対する血清ＥＬ［ＳＡの力価による測定の場合、鼻腔内径路で与えられ たウィルスまたはウイロソームの免疫原性を劇的に減少させた（図ＩＡおよび図 ２Ａから５Ａ）。

血清がＳＤＳで変性されたウィルスに対して試験された場合に、より低い応答が また観察されたので（図１Ｂ）、これは酸がへマグルチニン上のいくつかの中和 エピトープを破壊するという事実によるものではなかった。さらに、誘導される 中和抗体のレベルは接種物が酸処理されているならば、かなり減少した（図ＩＣ および図２Ｂから５Ｂ）。

コアを含むウイロソームの酸による不活化に対する防御があると思われたか、こ れは二回目の接種の不十分な酸性化によるものではない（図４ＡおよびＢを参照 せよ）。

個々の動物の応答か解析された場合、ウィルスまたはウイロソームが酸処理され ているならば、応答に一定の減少かあった（図６から９）。我々はまた血清の血 球凝集反応阻害（旧）活性を観察したところ（図ＩＤ）、接種前にウイロソーム か酸処理されると促進される抗体の力価か減少することか示された。

ウィルスの酸処理（ｐＨ４，８）はウィルスの接着は影響されないにもかかわら ず、ウィルスの細胞への融合能をなくす。これは通常では被われたピット内への ウィルスの取込みの後にエンドソーム内に起きるヘマグルチニンの立体配置の不 可逆的な立体配置シフトによるものである。

これらの結果はウィルスまたはウイロソームが粘膜表面に結合するだけでなく、 最適な応答を促進するために上皮細胞と融合しなければならないことを示唆する 。

ウィルスの免疫原性に対する５５゛Ｃでの熱処理の効果２０分間熱処理されたＸ ３１インフルエンザウイルスを鼻腔内に接種されたマウスは非熱処理ウィルスを 接種されたマウスよりも著しく大きな血清ＥＬＩＳＡ　、　ＨＡＩまたは中和抗 体力価を示した（図ＩＡからＤ）。生ウィルスに対するＥＬ［ＳＡの力価および 中和力価は感染ウィルスの同一投与量で免疫した後に観察される力価に達した（ 図２）。さらに別の実験では、ウィルスは８分間たけ熱処理され、再び鼻腔内接 種に続く応答に増加か見られた（表１）。

熱処理された、または感染ウィルスに対する応答は不活化されたウィルスに対す る応答の少なくとも２１日前に観察された。個々の動物の応答か試験された場合 、ウィルスが熱処理されたときに応答に増加かあり、ＥＬ、ＩＳＡの力価は中和 力価と平行であった（図６）。しかし、おそらく接種効率のためにかなりの変動 かあった。

ウイロソームの免疫原性に対する５５°Ｃでの熱処理の効果予備実験で、マウス は２０分間熱処理されたウイロソームまたはコアあるいはオブアルブミンを含む ウイロソームを鼻腔内に接種された。これらの熱処理されたウイロソームは非熱 処理のウイロソームを接種されたマウスと同様あるいはそれ以上の血清ＥＬ［Ｓ Ａまたは中和力価を促進した（図１から５）。図４はウィルスコアを含むＵＶ不 活化および熱処理されたウイロソームがＵＶ不活化または酸処理されたウイロソ ームよりもかなり初期の応答を促進することを示している。さらに、個々の動物 の応答が試験された場合、動物群内の変動は殆どなかった（図７）。

中和力価はより大きな変動を示したが、ＥＬＩＳＡの力価とは平行であった。こ れらのウイロソームが４°Ｃで保存されていたことは注目すべきことで、そのた めにニューラミニダーゼ活性の多くが失われた可能性がある。

マウスは５０％グリセロール中で、−２０°Ｃで保存された新鮮なウイロソーム で免疫された。ウイロソームが１２８分までの熱処理をされた場合、免疫原性に 劇的な増加が観察された（図１０Ａおよび図１１、表１）。中和抗体のレベルは 熱処理の時間を増加するにつれてより劇的な増加を示した（図１０ＢおよびＩＩ ）。非熱処理のウイロソームで免疫された動物は中和抗体か検出てきないレベル で、これは非熱処理のウイロソームを用いた前の実験で観察された高い応答は４ °Ｃての保存中のニューラミニダーセ活性の部分的な不活化のためであることを 示唆している。

さらに、個々のマウスの血清を解析した場合、ＥＬ［ＳＡおよび中和抗体力価の 著しい増加か、時間を増加した熱処理をしたウイロソームを接種されたマウスの 血清で観察された（表２、図１２）。

鼻腔内に与えられたウイロソームの免疫原性に対するニューラミニダーゼの特異 的不活化の効果我々はウイロソームの熱処理で観察された免疫原性の増加かニュ ーラミニダーゼ（ＮＡ）の阻害によるものであるかを決定するための実験を行な った。それ故、ウイロソーム中のＮＡは特異的にニューラミン酸類似体であるＤ ＤＡＮで不活化された。ＤＤＡＮ処理されたウイロソームは未処理のウイロソー ムより大きな応答を促進しくｌｏｇ　力価２．２ｃｆ　１．６）　、これはニュ ーラミニダーゼの阻害により鼻腔内投与されたウイロソームの免疫原性が増加す ることを示している。

鼻腔内投与されたウイロソームの免疫原性に対するガングリオシドでの前処理に よるウイロソーム接着の特異的阻止の効果 鼻腔内投与されたウイロソームの免疫原性に対するウイロソーム接着の阻止効果 を研究するために、我々は各種のソアル酸を含むガングリオシド中でウイロソー ムを前処理した。鼻腔内（ｉ、ｎ、）投与されたインフルエンザウイロソームの 免疫原性は、ＧＭＩまたはＧＤｌａガングリオシドでウイロソームを前処理する ことにより部分的になくなるか、ＧＴｌｂまたはガングリオシド混合液での前処 理ではなくならない（図１３）。同様に、我々はウイロソームか仲介する血球凝 集反応がＧＭＩおよびＧＢ１ａガングリオシドだけにより部分的に阻害されるこ とを見いだした。これらの実験はウイロソームのシアル酸受容体への結合がその 免疫原性に危急のものであることを示している。

鼻腔内に与えられたウイロソームに対するマウスの応答に対するガングリオシド て前処理されたマウスの効果我々は各種のガングリオシドでマウスを鼻腔内で前 処理することにより、ウイロソームに対する応答に対する呼吸系粘膜表面にウィ ルス受容体が増加することについての効果について研究した（図１３）。おそら く受容体の密度の増加またはウイロソームのより大きな結合および取込みを促進 する粘膜表面のより高い親和性をもつ受容体に置き換わったために、ＧＤｌａ、 　ＧＴｌｂまたはガングリオシド混合物ではなく、ＧＭＩガングリオシドによる 前処理により応答の増加がもたらされた。

鼻腔内に与えられたウイロソームの免疫原性に対する中和単クローン抗体前処理 によるウイロソーム接着の特異的阻止の効果 中和単クローン抗体（全体またはＦａｂ断片）とウイロソームの前処理は完全に 血球凝集反応を阻害した。しかし、ウイロソームの免疫原性は抗体全体またはＦ ａｂ断片でのウイロソームの前処理または未処理のウイロソーム接種２時間後の Ｆａｂ断片のｉ、ｎ、接種により影響されなかった。この結果は驚くべきことで 、いくつかの中和抗体はウィルスの結合または粘膜上皮への進入ではなく、その 後の出来事（例えば、第二のアンコーティング）を阻害しないことを示している 。抗体処理したウィルスまたはウイロソームの運命を研究することは、気管にお ける体液免疫の機構についての見識を提供する。さらに、ヒトの鼻腔内予防接種 に関して、部分的な中和抗体の存在が鼻腔内投与されたウイロソームの免疫原性 を減少させないならば、励みになるものである。

我々はＣＴＢが鼻腔内に投与されたウイロソームに対しての応答を促進するかを 調べた。図１３はＣＴＢが与えられた場合、ウィロソームに対する応答に劇的な 増加（１０倍）があったことを示している。

我々は鼻腔内投与されたウイロソームの投与量の範囲に対する応答について研究 した。これらのウイロソームは熱処理されず、新鮮であったので、抗体の応答は 比較的低い。明かな投与量に対する応答の効果は最小免疫原投与量であるｌμｇ で観察された（図１４＞。我々はさらにより免疫原性をもつと予想される熱処理 されたウイロソームを用いてこの実験を繰り返した。

感染に対しての防御 ウィルスまたはウイロソームの鼻腔内免疫を受けた全ての動物は生ウィルスを感 染され、２日後に肺が摘出された。予備感染した肺の力価は、酸処理されていな いウィルスまたはウイロソームで免疫された動物は完全に感染から防御されたこ とを示している。

６３Ａ　ウイロソーム　非熱処理　３　μｇ　１．９０（０，２５）６３Ｂ　ウ イａソーム　熱処理２　分　３　μｇ　２．０２（０，２５）６３Ｃウイロソー ム　熱処理８　分　３　μｇ　２．５２（０，４３）６３Ｄ　ウイＵｉ−ム　熱 処理３２分　３　μｇ　２．８０（０，５４）６３Ｂ　ウイσソーム　熱処理１ ２８分　３　μｇ　３．０９（０，６４）６３Ｆ　ウィルス　非熱処理　３μｇ 　２．４４（０，４４）６３Ｇ　ウィルス　熱処理８分　３μｇ　２．８７（０ ，７７）６３ＨＰＢＳ　コント叶ル　＜１．５０（０，１７）表２−　インフル エンザウイロソームを用いたＢＡＬＢ／Ｃマウ６３Ａ　ウイロソーム　非熱処理 　Ｇ　１゜２１　１．２３Ｙ　１．９８　１．８９ Ｍ　１．２６　１，１４　１．８４　１．４４Ｗ　１．４８　１．２３ Ｒ１，３１１，１０ ６３Ｂ　ウイロソーム　熱処理２分　Ｍ　＜１．００　＜１．００Ｗ　＋、３８ 　１．０２ Ｇ　２．０２　１．３８　１．６４　１．２４Ｒ１，２４１，２２ ６３Ｃウイロソーム　熱処理８分　Ｒ２，２６１，９９Ｙ　１．２１　１．０６ Ｇ　１．７２　１．８１　１．９５　１．６９Ｗ　１．８６　１．８０ Ｍ　２．１２　１．１３ ６３Ｄ　ライｌ】ソーム　熱処理３２分　Ｍ　２．３３　１．７５Ｙ　２．２２ 　２．２８ Ｒ１，７８２，１６２，１２２，０４ Ｇ　２．２５　２．１９ Ｗ　ｉ、６５　１．０７ ６３Ｅ　ウイロブーム　熱延［１２８分　Ｒ２，３３２，３３Ｙ　２．５９　２ ．２４ Ｍ　１．８４　１．５１　２．３１　２．４６Ｗ　＋、８８　１．４８ Ｇ　２．４７　２．９９ 採血試験・３０／３／９０−二次免疫後４週間浄書（内容に変更なし） ＋コア　＋卵 Ｆｉ（］、ＩＣ 十コア　＋卵 Ｆｉｇ、２Ａ 日数 Ｆｉ（Ｊ、５Ａ 日数 日数 ＦｉＣＪ、６Ａ ＦｉＣＪ、７Ａ ＋ｕｖ　＋ｕｖ十酸　十Ｕ十熱 Ｆｉｇ、８Ａ ＋Ｕ十酸　十Ｕ十熱 Ｆｉｇ、９Ａ ＦｉＣ］、ｉｏＡ 日数 （０【９０］）見ｌＹ東べＵ　ＶＳＩＩヨ手続補正書（自発） 特許庁長官殿　祖５　＊　５　Ｊ１２４−り事件の表示 ワクチン ザ　ウェルカム　ファウンデーシコン　リミテッド４、代理人 ６、補正により増加する請求項の数 ７−補正の対象 明細書、請求の範囲及び要約書翻訳文 ８−　補正の内容　別紙のとおり 明細書、請求の範囲及び要約書翻訳文の浄書（内容に変更なし）手続補正書防式 ） １−事件の表示 ワクチン 氏名（名称） ザ　ウェルカム　ファウンデーシコン　リミテッド４−代理人 ６−補正により土岐カロする言胃求項の数７−補正の対象 図面の翻訳文 国際調査報告　。、、７．。。。１．。、４２６ＯｒＴ／ＱＱ（Ｎ／ｎ１４’６

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒトまたは動物の粘膜細胞表面への結合能のあるポリペプチドがその表面に 存在するリボソームで、実質的に活性ニューラミニダーゼをもたないリボソーム 。
2. ２．ヘマグルチニンがミキソウイルスのヘマグルチニンである請求項１に記載の リボソーム。
3. ３．ミキソウイルスがインフルエンザ、おたふくかぜ、または麻疹ウイルスであ る請求項２に記載のリボソーム。
4. ４．ポリペプチドが細菌の接着ポリペプチドである請求項１に記載のリボソーム 。
5. ５．生理学的に活性のある物質をカプセルで被った前述の請求項のいずれかに記 載のリボソーム。
6. ６．請求項５に記載のリボソームで、物質がペプチド、タンパク質またはアジュ バントであるリボソーム。
7. ７．前述の請求項のいずれかに記載のリボソームの調製方法で、その表面に前記 ポリペプチドが存在し、実質的に活性ニューラミニダーゼをもたないリボソーム を形成することを含む方法。
8. ８．請求項７に記載の方法で、（ａ）ミキソウイルスを破壊し、ウイルスゲノム および内部活性タンパク質を除去すること、（ｂ）残留物質存在下でリボソーム を形成すること、（ｃ）このように形成されたリボソームに存在するニューラミ ニダーゼを不活化することを含む方法。
9. ９．請求項８に記載の方法で、ニューラミニダーゼが熱またはニューラミニダー ゼ阻害剤とのインキュベーションにより不活化される方法。
10. １０．請求項９に記載の方法で、不活化が５０から６０℃の温度の熱処理、また は２，３−デヒドロ−２−デオキシ−Ｎ−アセチルニューラミン酸とのインキュ ベーションにより行なわれる方法。
11. １１．請求項７に記載の方法で、リボソームが組換えポリペプチドである前記ポ リペプチドを用いて形成される方法。
12. １２．薬学的に受容可能な運搬体または希釈剤に関連して、請求項１から６のい ずれかに記載のリボソームを含む薬剤組成物。
13. １３．鼻腔内投与に適した形態の請求項１２に記載の組成物。
14. １４．治療によるヒトまたは動物体の処理方法に用いるための、感染せず、実質 的に活性ニューラミニダーゼをもたないインフルエンザウイルス。
15. １５．インフルエンザワクチンに用いるための請求項１４に記載のウイルス。
16. １６．請求項１４または１５に記載のウイルスで、ニューラミニダーゼを不活化 するために熱処理されたウイルス。
17. １７．請求項１６に記載のウイルスで、前記熱処理が５０から６０℃の温度で行 なわれたウイルス。
18. １８．請求項１４から１７のいずれかに記載のウイルスで、紫外線処理により非 感染性となったウイルス。
19. １９．インフルエンザワクチンとしての使用のための医薬の調製における非感染 性で、実質的に活性ニューラミニダーゼをもたないインフルエンザウイルスの使 用。
20. ２０．請求項１９に記載の使用で、ニューラミニダーゼを不活化するためにウイ ルスが熱処理されている使用。
21. ２１．請求項２０に記載の使用で、前記熱処理が５０から６０℃の温度で行なわ れる使用。
22. ２２．請求項１９から２１のいずれかに記載の使用で、ウイルスが紫外線での処 理により非感染性となった使用。