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DE69116993T2 - Verfahren zum nukleotidsequenzennachweis mittels technik der sandwich-hybridisierung - Google Patents

Verfahren zum nukleotidsequenzennachweis mittels technik der sandwich-hybridisierung

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DE69116993T2
DE69116993T2 DE69116993T DE69116993T DE69116993T2 DE 69116993 T2 DE69116993 T2 DE 69116993T2 DE 69116993 T DE69116993 T DE 69116993T DE 69116993 T DE69116993 T DE 69116993T DE 69116993 T2 DE69116993 T2 DE 69116993T2
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sequence
probe
target
uptake
dna
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DE69116993T
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DE69116993D1 (de
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Patrice F-69290 Grezieu-La-Varenne Allibert
Philippe F-69005 Lyon Cros
Claude F-69100 Villeurbanne Mabilat
Francois F-69100 Villeurbanne Mallet
Bernard F-69100 Villeurbanne Mandrand
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Biomerieux SA
Original Assignee
Biomerieux SA
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Publication date
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Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erkennung einer Nukleotidsequenz eines Einfachstranges in einer Probe, die eine solche Sequenz enthält oder dazu befähigt ist, eine solche auf Basis einer Sandwich-Hybridisierungsmethode aufzunehmen. Dieses Verfahren ist insbesondere in der Diagnostik von Infektions- oder Erbkrankheiten wie auch Erkrankungen vom Zelltypisierung anwendbar.
  • Es ist bekannt, daß eine der kennzeichnenden Eigenschaften von Nukleinsäuren die Möglichkeit der Wechselwirkung mit einer Komplementärsequenz durch intermediäre Wasserstoffbindungen darstellt, wobei nach der Gesetzmäßigkeit der Paarung A-T und G-C ein stabiles Hybrid gebildet wird.
  • Ein Nukleinsäure läßt sich daher als Sonde zur Abklärung einer Nukleotidsequenz in einer Probe ("Target" genannt) mit einem Gehalt an einer Sequenz einsetzen, welche zu jener der Sonde komplementär ist. Die Markierung des aus dem Target und der Sonde gebildeten Hybrids ermöglicht die Erkennung und quantitative Bestimmung des Targets in der Probe. Diese Technik wurde von E.M. SOUTHERN zur Analyse der RNS(RNA)-Fragmente nach der Auftrennung durch die Gelelektrophorese benutzt: J. Mol. Biol., 98, Seiten 503 ff., (1975).
  • Eine Modifizierung dieser Technik, welche insbesondere den Vorteil bietet, daß keine Reinigung der Probe mit einem Gehalt an dem Target erforderlich ist, besteht in der Verwendung einer Vorgehensweise, die "Sandwich" genannt wird. Eine erste Nukleotidsonde (Aufnahmesonde), welche auf einem festen Träger fixiert ist, dient dazu, das Gen oder Genfragment in der Probe abzufangen und zu erkennen. Eine zweite Sonde (Erkennungssonde), welche zu einem anderen Bereich des Targets komplementär ist, ermöglicht die Erkennung durch einen intermediären Marker, beispielsweise durch einen radioaktiven Marker, vgl. beispielsweise A.R. DUNN und J.A. HASSEL, Cell, 12, (1977), Seiten 23 ff.; M. RANKI et al., Gene, 21, (1983), Seiten 77 ff.; A. PALVA et al.., FEMS Microbiol.Lett., 23, (1984), Seiten 83 ff.; R. POLSKY-CYNKIN et al., Clin. Chem., 31, (1985), Seiten 1438 ff.
  • Die Sandwich-Hybridisierungsmethode läßt sich in einem einzigen Schritt unter Hinzufügen der zu analysierenden Probe und der Erkennungssonde in einem Behälter, worin sich die auf einem Träger fixierte Aufnahmesonde befindet, durchführen. In diesem Falle handelt es sich um die Sandwich-Hybridisierungsmethode, welche auch "Simultanverfahren" genannt wird, vgl. beispielsweise die Publikationen von RANKI et al., PALVA et al., POLSKY-CYNKIN et al., wie obenstehend zitiert.
  • Die Sandwich-Hybridisierungstechnik läßt sich aber auch in zwei Schritten durchführen, vgl. beispielsweise J.A. LANGDALE et al., Gene, 36, (1985), Seiten 201 ff., und J.W. ZOLG et al., Mol. Biochem. Parasitol., 22, (1987), Seiten 145 ff.
  • Zum Ermöglichen des Einsatzes dieser Hybridisierungstechniken bei Routineaustestungen ist es notwendig, den radioaktiven Marker aus der Erkennungssonde freizusetzen. Zu diesem Zweck wurde der Vorschlag gemacht, auf verschiedene Systeme zurückzugreifen, beispielsweise auf ein durch einen Antikörper erkanntes Hapgen oder durch ein Affinitätsprotein. Es wurde auch der Vorschlag gemacht, insbesondere verschiedene DNS- oder RNS-Markierungsverfahren auf der Grundlage von Biotin oder dessen Derivaten anzuwenden, vgl. insbesondere die europäischen Patentanmeldungen Nrn. 0 285 057, 0 285 058, 0 286 898 sowie 0 097 373; FORSTER et al., Nucleic Acid Res., 13, (1985), Seiten 745 ff.; A. CHOLLET und E.H. KAWASHIMA, Nucleic Acid Res., 13, (1985), Seiten 1529 ff.; B.C. CHIN et al., Nucleic Acid Res., 11, (1983), Seiten 6513 ff.; A.J. COCUZZA, Tetrahedron Lett., 30, (1989), Seiten 6287 ff. Auf jeden Fall mangelt es bei den Erkennungssystemen unter Verwendung von nicht-radioaktiven Markierungsverfahren immer noch an der Empfindlichkeit, vgl. beispielsweise ZOLG et al., obenstehend zitierte Publikation.
  • Im übrigen erfordern die Diagnostik von Erbkrankheiten, die Zelltypisierung und sogar in bestimmten Fällen die Identifizierung von Virusmutanten die Erkennung von punktförmigen Mutationen bei dem Genom. Bei derartigen Fällen ist es schwierig, Aufnahmesonden mit ausreichender Empfindlichkeit zur Erkennung einer punktförmigen Mutation in der komplementären Targetregion der Sequenz der Aufnahmesonde zur Verfügung zu stellen. Die derzeit im Handel erhältlichen Sondensysteme zur Durchführung dieses Types von Erkennung sind ziemlich unpraktisch, da jedes handelsübliche System auf eine vorgegebene Temperatur eingestellt werden muß, welche je nach dem benutzten System variiert und was ein Hindemis bei der Durchführung verschiedener Bestimmungen beim Einsatz automatischer Geräte darstellt, welche bei einer einzigen Temperatur arbeiten.
  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erkennung von Nukleotidsequenzen anhand einer Sandwich-Hybridisierungstechnik mit einer ausreichenden Empfindlichkeit zur Durchführung des Einsatzes einer Sonde mit nicht-radioaktiver Erkennung. Dies wurde aufgrund der Verwendung sehr kurzer Aufnahmesonden möglich gemacht, bei denen sich herausgestellt hat, daß sie der Sandwich-Austestung eine außerordentliche Spezifität unter Beibehaltung einer günstigen Empfindlichkeit verleihen, wobei diese die Erkennung und Differenzierung homologer Sequenzen an einem nahe befindlichen Nukleotid gestatten. Die Verwendung von Oligonukleotiden geringer Größe erleichtert den Zusammenbau von Sonden in großen Mengen mit einer akzeptablen Ausbeute und ermöglicht es, ein breites Spektrum selektiver Möglichkeiten zur Verfügung zu stellen. Dieses ist insbesondere in dem Fall von HLA-Typisierung von Nutzen, wobei die Mutationen, welche den Zelltyp charakterisieren, an den kurzen Abschnitten des Genes lokalisiert sind.
  • Darüber hinaus hat sich auch herausgestellt, daß die Durchführung einer direkten Passivadsorption von Oligonukleotidsonden außerordentlich kleiner Größe auf einem Polymerträger, wie z.B. Polystyrol (bis zu minimal 11 Nukleotide), wie auch die Passivfixierung von noch kürzeren Sonden (bis zu minimal 9 Nukleotide) über ein intermediäres Protein, an welches die Sonde in kovalenter Weise gebunden ist, möglich ist. Es handelt sich dabei um ein bislang überraschendes Ergebnis, wobei bisher im allgemeinen als Aufnahmesonden Sequenzen mit einem Umfang von mehr als 100 Basen (im allgemeinen mehrere hundert Basen) oder Sequenzen mit 15 bis 100 Nukleotiden, welche in kovalenter Weise an einen Festträger (Patentanmeldung WO 88/01302) gebunden waren, verwendet wurden, zumal auch die Oligonukleotidsequenzen (dT)&sub1;&sub5; nicht in passiver Weise (d.h. durch Adsorption) auf dem Polystyrol fixiert werden, vgl. M.J. LACY und E.W. VOSS, J. of Immunol. Methods, 116, (1989), Seiten 87-98. Andere Autoren waren auf der Suche nach Unterstützung des Fixierens der Aufnahmesonde durch die Sättigung des Polystyrolträgers mit Poly(dT)&sub4;&sub0;&sub0;&sub0; und Ankoppeln der Aufnahmesonde mit mehreren Dutzend Basen an einen "Schwanz" aus Poly(dA) mit 30 bis zu höchstens 100 Einheiten, vgl. D.V. MORRISSEY und M.L. COLLINS, Molecular and Cellular Probes, 3, (1989), Seiten 89-207. Nach den Erfahrungen der Patentinhaberin verbessert die Sättigung des festen Trägers mit Poly(dT) die Erkennung nicht.
  • Darüber hinaus ermöglicht es das erfindungsgemäße Verfahren aufgrund der Verwendung von Sonden kurzer Länge, welche eine erhöhte Empfindlichkeit zur Verfügung stellen, die Auswahl einer beliebigen Temperatur unter im voraus festgelegten Betriebsbedingungen sowie in jedem Falle die Konstruktion von Sonden mit jeweils angepaßter Länge mit der Fähigkeit, die Bestimmungen der verschiedensten Targetobjekte bei der gleichen Temperatur nach im voraus festgelegten Betriebsbedingungen durchzuführen. Es werden somit in bequemer Weise eine Vereinfachung des Verfahrens sowie daraus resultierende Möglichkeiten zur Automatisation geschaffen.
  • Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Erkennung einer Nukleotidsequenz als einfachem Strang in einer Probe mit einem Gehalt davon oder einer Probe, die dazu befähigt ist, eine solche zu enthalten, und zwar auf Basis einer Sandwich-Hybridisierungstechnik mit einer Aufnahmesonde, die in passiver Weise auf einem festen Träger fixiert ist, sowie einer Erkennungssonde, die mit einem nicht-radioaktiven Marker markiert ist, wobei die Aufnahmesonden und die Erkennungssonden jeweils zur Hybridisierung befähigt sind und jeweils mit zwei nicht-überlappenden Regionen der gesuchten Nukleotid-Targetsequenz, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß die Aufnahmesonde mit 9 bis 30 Nukleotiden, insbesondere 9 bis 25 Nukleotiden und insbesondere mit 9 bis 20 Nukleotiden in passiver Weise auf diesen festen Träger fixiert ist, der in hydrophobem Material ausgeführt ist.
  • Im Hinblick darauf, daß die Aufnahmesonde mindestens 11 Nukleotide enthält, ist im allgemeinen die Fixierung in nichtspezifischer Weise (d.h. durch Adsorption) auf dem Träger möglich, wobei im allgemeinen der Träger in hydrophobem Polymermaterial, wie z.B. Polystyrol oder einem Copolymer auf Basis von Styrol, insbesondere einem Butadien/Styrol-Copolymer oder einem seiner Analoga ausgeführt ist. Unter den Styrol-Copolymeren wären insbesondere solche zu nennen, welche mindestens 20 Gew.-% Styroleinheiten, insbesondere solche, die mindestens 30 Gew.-% Styroleinheiten aufweisen. Das den festen Träger bildende Material, welches erfindungsgemäß eingesetzt wird, kann zusätzlich noch aus einem Gemisch aus Polystryol und/oder einem Styrol-Copolymer (insbesondere Butadien/Styrol) mit einem weiteren Polymer bestehen, das insbesondere die Verbesserung der Eigenschaften des festen Trägers (mechanische Eigenschaften, Transparenz usw. ...) ermöglicht. Dieses zusätzliche Polymer stellt beispielsweise ein Styrol/Acrylnitril, ein Methyl-Styrol/Methacrylat, ein Polypropylen oder ein Polycarbonat bzw. ein analoges Polymer davon dar. Das den festen Träger bildende Polymergemisch enthält infolgedessen mindestens noch 10 Gew.-%, vorzugsweise mindestens 30 Gew.-% Styroleinheiten. Als fester Träger läßt sich ein konischer Träger verwenden, der von der Firma VITEK (USA) vertrieben wird und der in Butadien/Styrol-Copolymermaterial ausgeführt ist, welches unter der Handelsbezeichnung K-Resin verkauft wird.
  • Es wäre auch denkbar, daß es im Hinblick auf die außerordentliche Kürze der Aufnahmesonde (insbesondere weniger als 11 Nukleotide aufweist) sogar erforderlich sein könnte, Mittel zur Verfügung zu stellen, welche eine Verbesserung der Fixierung der Aufnahmesonde auf dem festen Träger gestatten.
  • Wie im vorstehenden bereits ausgeführt, läßt sich die Aufnahmesonde in kovalenter Weise anhand von an sich bekannten Verfahren mit einem Protein verknüpfen, das sich von alleine in passiver Weise auf dem Träger (der in den bereits genannten Materialien ausgeführt ist) fixiert. Selbstverständlich darf das die Fixierung der Aufnahmesonde fördernde Protein bei der Erkennung keine Störungen hervorrufen; beispielsweise darf im Falle des Markierens der Erkennungssonde mit einem Enzym das auf dem festen Träger fixierte Protein keine störende enzymatische Aktivität entfalten. Unter den für die passive indirekte Fixierung der Aufnahmesonde auf dem Träger verwendbaren Proteinen wären das Säugeralbumin (beispielsweise Rinderalbumin) oder ein bakterielles Proteintoxin, wie z.B. das Tetanustoxin, zu nennen. Vorzugsweise wird ein Protein- und/oder ein Verfahren zum Ankoppeln ausgewählt werden, welche die Fixierung eines oder zweier Moleküle der Aufnahmesonde durch das Proteinmolekül ermöglichen.
  • Das Verkuppeln des Oligonukleotids mit dem Protein läßt sich beispielsweise durch einen intermediären Alkylenarm mit 3 bis 12 Kohlenstoffatomen durchführen, der in der äußeren Position 5' des Oligonukleotids, das die Aufnahmesonde bildet, während der automatischen Synthese angefügt wird. Dieser Arm trägt eine primäre Aminofunktion, welche nach der Aktivierung aufgrund eines homobifunktionellen Kupplungsmittels, wie z.B. das DITC (Phenylen-1,4-diisothiocyanat), das DSS (Disuccinimidylsuberat) oder die DIBS (4,4'-Diisothiocyanostilben-2,2'-disulfonsäure), das Aufpfropfen auf die NH&sub2;- Funktionen, welche sich an den Lysinen des Albumins befinden, ermöglicht wird. Das Konjugat wird durch Hochleistungsflüssigchromatographie auf einer lonenaustauschersäule gereinigt. Es wurde festgestellt, daß die passive Fixierung der Aufnahmesonde über das intermediäre Zwischenprodukt, wie obenstehend angegeben, von großem Vorteil ist, insbesondere deswegen, weil diese Ergebnisse mit einem höheren Grad an Reproduzierbarkeit liefert.
  • Die Erkennungssonde kann sogar selbst eine kurze Sonde mit 9 bis 30 Nukleotiden darstellen. Auf jeden Fall enthält die Erkennungssonde vorzugsweise mindestens 15 Nukleotide zur Sicherstellung der gewünschten Spezifität, beispielsweise 15 bis 30 Nukleotide, und zwar im Hinblick darauf, daß die Aufnahmesonde außerordentlich kurz ist und insbesondere weniger als 15 Nukleotide enthält. Die Erkennungssonde ist in kovalenter Weise mit einem nicht-radioaktiven Marker, beispielsweise einem Enzym verkuppelt. Die kovalente Kupplung wird anhand von bekannten Verfahren durchgeführt, insbesondere mittels des Verfahrens, das obenstehend in bezug auf die Kupplung des Oligonukleotids, aus dem die Aufnahmesonde besteht, mit einem Protein beschrieben ist. Als enzymatischer Marker läßt sich insbesondere eine Peroxydase, wie z.B. die z.B. die Meerrettichperoxydase, eine alkalische Phosphatase, eine saure Phosphatase, die β-Galactosidase, die Glycoseoxydase usw. einsetzen.
  • Selbstverständlich ist es zur Konstruktion von Aufnahmesonden und Erkennungssonden notwendig, die Sequenz oder eine Teilsequenz des Targets zu erkennen oder die Sequenz oder eine Teilsequenz des für das Target codierenden Proteins zu erkennen. Sodann lassen sich Oligonukleotide, aus denen die Sonden bestehen, mit einem automatischen Synthesegerät für DNS, wie z.B. die Modelle 380 und 381, wie sie von der APPLIED BIOSYSTEMS vertrieben werden, synthetisieren.
  • Die Aufnahme- und/oder Erkennungssonden können aus DNS oder RNS bestehen.
  • Dartiber hinaus können die erfindungsgemäß eingesetzten Sonden aus im Vergleich zu natürlichen Nukleotiden analogen α-Nukleotiden bestehen oder solche enthalten; siehe insbesondere das französische Patent Nr.2 607 507. Die α-Nukleotide lassen sich in automatischen Synthesegeräten darstellen. Sie sind an den äußeren Positionen 3' oder 5' derivatisierbar und können mit Proteinen in derselben Weise wie bei den β-Oligonukleotiden verkuppelt werden. Sie weisen den Vorteil einer guten Stabilität gegenüber den Nukleasen auf (siehe N.T. THUONG et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 84, (1987), Seiten 5129 ff.]. Die konjugierten cr-Oligonukleotidenzyme sind in Lösung stabiler als die β-Analoga und gestatten eine jeweils längere Aufbewahrungsdauer bei schwächeren Verdünnungen.
  • Die zu erkennende Nukleinsäure (Target) kann doppelsträngige DNS sein, einfachsträngige DNS oder ein Hybrid aus DNS-RNS oder auch RNS (ribosomale oder Messenger-RNS). Selbstverständlich ist es im Falle eines doppelsträngigen Nukleinsäuretargets oder eines DNS-RNS-Hybrids zweckmäßig, bis zu seiner Denaturierung vor der Durchführung des Erkennungsverfahrens durch die Sandwich-Hybridisierungsmethode vorzugehen. Der DNS- Doppelstrang selbst kann nach dem Extrahieren mittels bekannter Verfahren erhalten werden, wobei die Nukleinsäuren einer zu überprüfenden Probe extrahiert werden. Diese Extraktion läßt sich durch die Proteolyse von Zellen, die von einer Extraktion mit Phenol/Chloroform [siehe beispielsweise MANIATIS et Coll., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (1982)] gefolgt ist, durchführen, oder direkter noch durch eine alkalische Behandlung in Anwesenheit eines Tensids und/oder durch eine Ultraschallbehandlung oder auch durch ein jegliches anderes Verfahren zur Freisetzung von Nukleinsäuren in flüssiger Phase. Die Behandlungsprobe kann ein Gemisch aus Zellen, Bakterien, Hefen, Viren oder anderen Mikroorganismen enthalten. Der so gewonnene Doppelstrang aus DNS kann direkt nach dem Denaturieren anhand bekannter Techniken verwendet werden oder er kann auch als Matrix für die Vermehrung von Nukleinsäuren zum Zwecke der Gewinnung ausreichender Mengen zum Ermöglichen der Erkennung eingesetzt werden.
  • Zur Gewinnung der Form des Einfachstranges, ausgehend von einem RNS-DNS-Hybrid oder einer doppelsträngigen DNS, kann mittels physikalischer, chemischer oder enzymatischer Denaturierung vorgegangen werden. Eine der physikalischen Denaturierungsmethoden entspricht der Auftrennung der beiden Stränge durch Erhitzen des Hybrids bis zur vollständigen Denaturierung, beispielsweise bei einer Temperatur von 80 bis 105ºC während der Zeitdauer von einigen Sekunden bis zu einigen Minuten. Die chemische Denaturierungsmethode besteht beispielsweise darin, eine Probe eines Doppelstrangs mit einer 0,2 M Natriumhydroxidlösung während der Zeitdauer von 10 Minuten in Berührung zu bringen, wobei auf diese Behandlung eine Neutralisierung mit Essigsäure gleicher Konzentration (0,2 M) bis zum Erhalt eines pH-Wertes, der zwischen 6 und 8 beträgt, folgt. Ein enzymatisches Denaturierungsverfahren besteht in der Verwendung einer Helicase. Die Techniken der Verwendung von Helicasen werden insbesondere von RADDING, Ann. Rev. Genetics, 16, (1982), Seiten 405-437, beschrieben. Es sind auch andere Enzyme mit der gleichen Funktionsweise für denselben Zweck verwendbar.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise anhand einer Simultanmethode durchgeführt.
  • Diese Methode umfaßt die folgenden Schritte:
  • - die passive Fixierung der Oligonukleotid-Aufnahmesonde auf dem festen Träger, und zwar in direkter Weise oder intermediär über ein Protein gemäß obenstehender Beschreibung; es wird so vorgegangen, daß der Träger mit einer wäßrigen Lösung mit einem Gehalt an der Sonde in Berührung gebracht wird;
  • - die Spülung des Trägers und das eventuelle Trocknen zu seiner Konservierung;
  • - gleichzeitiges Kontaktieren des so erhaltenen Trägers mit einer Lösung mit einem Gehalt an der zu analysierenden Probe und mit einer Lösung mit einem Gehalt an der markierten Oligonukleotid-Erkennungssonde, wobei die Probe und die Erkennungssonde in Form des Gemisches oder auch getrennt voneinander hinzugefügt werden können;
  • - Inkubierung des erhaltenen Gemisches;
  • - die Spülung des Trägers zum Beseitigen von auf den Träger durch Hybridisierung nicht fixierten Bestandteilen;
  • - sowie qualitative oder quantitative Erkennung mittels einer Reaktion zum Sichtbarmachen des auf dem Träger fixierten Markers, beispielsweise durch Kolorimetrie, Fluoreszenz oder Lumineszenz.
  • Im nachstehenden wird eine besondere Art und Weise der Ausgestaltung ohne beschränkenden Charakter zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens gegeben.
    • 1. Fixierung der Aufnahmesonde
  • Die Fixierung der Aufnahmesonde wird dadurch erreicht, daß beispielsweise 100 µl einer Lösung mit einem Gehalt von 0,1 pg/ml bis 10 µg/ml an Oligonukleotiden, vorzugsweise 1 µg/ml in Form einer Lösung in einem Puffer PBS 3X (0,45 M NaCl, 0,15 M Natriumphosphat bei einem pH von 7,0) in jedes Näpfchen einer Mikrotitrierplatte eingebracht wird.
  • Man läßt die Platte in Kontakt mit der Lösung der Aufnahmesonden während der Zeitdauer von mindestens zwei Stunden bei einer Temperatur von 37ºC, wonach mit einer Lösung aus PBS 1X (NaCl 150 mM, Natriumphosphatpuffer 50 mM, pH 7,0 mit einem Gehalt an 0,5% Tween 20) gewaschen wird.
    • 2. Simultane Inkubierung der Proben und der markierten Aufnahmesonde
  • Die Proben (Target) werden auf die Platte aufgetragen, nachdem erforderlichenfalls die Denaturierungsbehandlung darauf vollzogen worden war, und zwar in Form einer Lösung in dem Puffer PBS 3X mit einem Gehalt an der heterologen DNS, beispielsweise von DNS aus Lachssperma zu 10 µ/ml.
  • Die markierte Sonde wird in dem vorstehenden Puffer bis zu einer Konzentration von 20 bis 100 pgiml verdünnt. Es werden 50 ml dieser Lösung in die das Target enthaltenden Näpfchen eingetragen.
  • Die Mikrotitrierplatte wird dann während einer Zeitdauer, welche beispielsweise zwischen 30 und 120 Minuten bei der jeweils gewählten Temperatur variieren kann, beispielsweise bei 37ºC oder mindestens solange inkubiert, bis eine geringfügige Sensibilität erworben ist.
    • 3. Waschen
  • Das Waschen wird beispielsweise mit einem Puffer PBS 1X mit einem Gehalt an 0,5% Tween 20 (Merck 82 21 84) durchgeführt.
    • 4. Enzymatisches Sichtbarmachen
  • Das Sichtbarmachen wird mit dem Substrat durchgeführt, das dem verwendeten Enzym entspricht. Beispielsweise kann o-Phenylendiamin (o-PD) in dem Fall hinzugegeben werden, daß der Marker die Meerrettichperoxidase des p-Nitrophenylphosphats (p-NPP) ist oder 5-Methylumbelliferylphosphat (MUP) in dem Fall, daß der Marker die alkalische Phosphatase darstellt.
  • Die Zeit für die Sichtbarmachung des Substrats beträgt im allgemeinen zwischen 1 bis 30 Minuten, wonach die Reaktion durch die Zugabe von 1N NaOH im Falle der alkalischen Phosphatase oder durch 1N H&sub2;SO&sub4; im Falle der Meerrettichperoxydase gestoppt wird.
  • Das Ablesen erfolgt mittels eines Lesegeräts für Mikronäpfchen bei einer Wellenlänge von 405 nm für p-NPP, bei einer Wellenlänge von 492 nm für o-PD und für MUP im Fluoreszenzverfahren (Anregung 340 nm, bei einer Emission von 460 nm).
  • Nachstehend wird auf die Inkubierungsphasen und nachfolgende Waschphasen zurückgekommen, welche die Schlüsselschritte der Sandwich- Hybridisierungstechnik ausmachen. Diese Inkubierungsvorgänge und Waschvorgänge werden jeweils bei einer konstanten Temperatur durchgeführt, die zwischen 20 und 60ºC, vorzugsweise zwischen 25 und 40ºC beträgt. Einer der wesentlichen Vorteile der Verwendung von kurzen Sonden besteht in dem Ermöglichen der Durchführung von Sandwichtests zur Erkennung verschiedener Targets, indem zur Durchführung dieser verschiedenen Bestimmungen bei einer einzigen, vorher bestimmten Temperatur gearbeitet wird, welche vorzugsweise 37ºC betragen wird, da alle Analysenlaboratorien mit thermostatisierten Geräten ausgestattet sind, welche auf diese Temperatur eingeregelt sind.
  • Es ist bekannt, daß die DNS-Hybride eine Dissozuerungstemperatur besitzen, welche von der Anzahl der hybridisierten Basen abhängt (wobei die Temperatur mit der Größe des Hybrids zunimmt) und welche in gleicher Weise von der Natur der hybridisierten Basen und bezüglich jeder hybridisierten Base von der Natur der benachbarten Basen abhängt.
  • Die Dissozuerung der Hybride stellt sich in einem Intervall von einigen ºC ein und läßt sich leicht durch die UV-Spektroskopie bestimmen: in der Tat ist die optische Dichte des Hybrids im Vergleich zu den entsprechenden einsträngigen Sequenzen geringer. Es ist daher möglich, in jedem Fall eine Temperatur der Hemi-Dissoziierung zu ermitteln, welche für das untersuchte Hybrid charakteristisch ist.
  • Die Kenntnis der Entropie und der Entalphie der Reaktion gestattet im übrigen die Berechnung der Temperatur (Vant'Hoff'sches Gesetz) der Hemi-Dissoziierung eines unter Standardbedingungen gegebenen Hybrids (beispielsweise in einer Salzlösung entsprechend einer 1M Lösung von NaCl) in Abhängigkeit von der Gesamtkonzentration an Nukleinsäure in der Lösung; siehe beispielsweise K.J. BRESLAUER et al. PNAS, 83, (1986), Seiten 3476 ff.; W. RYCHLIK und R.E. RHOADS, Nucl. Acid. Res., 17, (1989), Seiten 8543 ff.; sowie S.M. FREIER et al., PNAS, 83, (1986), Seiten 9373 ff.
  • In der Praxis ist es immer möglich, experimentell die Temperatur der Hemi-Dissoziierung des durch die gegebene Sonde mit dem Target der komplementären Sequenz gebildeten Hybrids durch einfache Routineexmperimente zu bestimmen.
  • Die Hybridisierungstemperatur der Sandwich-Verfahrensvorschrift (Inkubationstemperatur und/oder Waschtemperatur) wird offensichtlich unterhalb der Temperatur der Hemi-Dissoziierung ausgewählt, wobei im Falle des Verfehlens dieser Temperatur das Target nicht mit der Aufnahmesonde und/oder der Erkennungssonde hybridisieren wird, wobei die Testergebnisse falsch sein werden.
  • Es versteht sich von selbst, daß die vorliegenden Betrachtungen bezüglich der Temperatur der Hemi-Dissoziierung das am wenigsten stabile Hybrid (d.h. ein solches, welches die niedrigste Hemi-Dissoziierungstemperatur besitzt) aus zwei Hybriden betreffen, welche das Target mit einem Teil der Aufnahmesonde und einem anderen Teil der Erkennungssonde bildet. In der Tat ist es zum korrekten Ablauf der Sandwich-Verfahrensweise für den Fall, daß ein positives Ergebnis gesucht wird, notwendig, daß diese beiden Hybride bei der jeweiligen Betriebstemperatur stabil sind.
  • Eine punktuelle Mutation zieht eine Fehlpaarung bei einem einzelnen Basenpaar in dem Hybrid nach sich und bewirkt eine Modifizierung, im allgemeinen einen Abfall der Temperatur der Hemi-Dissoziierung.
  • Ein wesentlicher Vorteil resultiert aus der Verwendung von kurzen Sonden in der Weise, daß eine derartige einzigartige Fehlpaarung einen relativ bedeutsamen Abfall der Temperatur der Hemi-Dissoziierung in der Größenordnung von 2 bis 4ºC bewirken kann. Dieses ist bei langen Sonden nicht der Fall, bei denen ein derartiges bloßes Nichterscheinen eine äußerst schwache Variierung der Temperatur der Hemi-Dissoziierung bewirkt.
  • Es hat sich nunmehr herausgestellt, daß es möglich ist, einen Vorteil aus der Verwendung von kurzen Sonden zur Durchführung der Bestimmungen anhand der Sandwich-Verfahrensweise bei einer einzigen vorherbestimmten Temperatur, beispielsweise 37ºC, wie obenstehend angegeben, zu ziehen.
  • Aus dem folgenden werden zum Zwecke der Exemplifizierung für den im allgemeinen bevorzugten Fall, bei dem die Aufnahmesonde, welche mit dem gesuchten Target ein weniger stabiles Hybrid als das Hybrid Target- Erkennungssonde ergibt, die entsprechenden Schlußfolgerungen gezogen. Aber es ist offensichtlich, daß ein System übernommen werden kann, wo es umgekehrt ist, d.h. es die Hybridsonde für Erkennung/Target ist, welche am wenigsten stabil ist (es würde dann genügen, im folgenden den Ausdruck "Aufnahmesonde" durch "sonde, welche mit dem Target das am wenigsten stabile Hybrid ergibt" im denkbar allgemeinsten Fall zu ersetzen, um die Schlußfolgerung in Einklang damit zu bringen).
  • Es ist selbstverständlich notwendig, mit einer Aufnahmesonde (und einer Erkennungssonde) zu arbeiten, welche eine ausreichende Länge aufweist, damit die Temperatur der Hemi-Dissoziierung höher ist als die gewählte Temperatur. Falls ein äußerst empfindlicher Test durchgeführt werden soll (insbesondere ein gegenüber einer einzigen Mutation empfindlicher Test), wird es zweckdienlich sein, eine passende Aufnahmesonde (und/oder eine Erkennungssonde) zu verwenden, d.h. mit einer ausreichend kurzen Länge und einer solchen Sequenz, daß die Temperatur der Hemi-Dissoziierung nur geringfügig oberhalb der vorherbestimmten Hybridisierungstemperatur liegt, wobei der Unterschied zwischen den beiden Temperaturen beispielsweise zwischen 1 und 3ºC beträgt, da es zweckmäßig ist, dann bei der maximal zulässigen Temperatur zum Vermeiden unspezifischer Hybridisierungen zu arbeiten, diese erscheinen dann möglich, wenn eine zu niedrige Temperatur im Vergleich zur perfekt komplementären Dissoziierungstemperatur des Hybrids übernommen würde. In der Tat läßt sich der zulässige Temperaturunterschied in jedem Falle durch einfache Routineexperimente ermitteln.
  • Bei dem soeben bezeichneten Fall wird bei der fixierten Hybridisierungstemperatur einzig und allein ein zur Aufnahmesonde perfekt homologes Target auf der Sonde fixiert bleiben, während ein Target, welches eine punktuelle Mutation in der komplementären Region der Sonde trägt, nicht fixiert werden wird.
  • In der vorstehenden Diskussion wurde vor allen Dingen ein Akzent auf die Auswahl einer Aufnahmesonde gesetzt, welche an die Hybridisierungstemperatur, welche sich im wesentlichen durch die Einstellung der Sondengröße richtet, angepaßt. Es ist jedoch für die Experten offenkundig, daß es möglich ist, bei der Auswahl der Sondensequenz einen Spielraum zu haben, da die Temperatur der Hemi-Dissoziierung in Abhängigkeit von der Natur der bei der Bildung des Hybrids eine Rolle spielenden Basen variieren kann. Es ist auch möglich, einen Spielraum bei den Hybridisierungsbedingungen zur Verfügung zu haben, insbesondere in bezug auf die Salzkonzentration der Inkubationslösung und/oder der Lösung, welche für die der Inkubation folgenden Waschung benutzt wird. Es ist in der Tat bekannt, daß die Erhöhung der Salzkonzentration eine Erhöhung der Temperatur der Hemi-Dissoziierung bewirkt.
  • Bei der praktischen Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird auf zweierlei Weise bei der Verwendung einer Aufnahmesonde und/oder von Hybridisierungsbedingungen, welche an die gewählte, vorherbestimmte Temperatur angepaßt sind, vorgegangen werden können.
  • Nach einer ersten Ausgestaltung der Durchführung wird der Inkubationsschritt bei der vorherbestimmten Temperatur durchgeführt, wobei das Waschen bei dieser Temperatur oder auch einer niedrigeren Temperatur erfolgt. Diese Ausgestaltung der Durchführung wird dadurch ermöglicht, daß bei der Arbeitstemperatur einzig und allein ein zur Aufnahmesonde perfekt homologes Target hybridisiert werden konnte, und zwar in der Weise, daß kein Risiko zur Fixierung eines nicht perfekt homologen Targets besteht, und zwar sogar dann, wenn das Waschen bei einer niedrigeren Temperatur als der Inkubierungstemperatur durchgeführt wird.
  • Gemäß einer zweiten Ausgestaltung der Durchführung wird der Inkubationsschritt bei einer niedrigeren Temperatur als der vorherbestimmten Temperatur durchgeführt, wobei das Waschen bei dieser vorherbestimmten Temperatur ausgeführt wird. In der Tat wird in diesem Falle die Waschtemperatur das ausschlaggebende Merkmal darstellen, wobei jegliches gegebenenfalls bei der Inkubationstemperatur gebildetes Hybrid aus Aufnahmesonde und nicht perfekt homologem Target bei der Waschtemperatur nicht stabil sein wird und daher auch nicht auf dem Träger fixiert sein wird.
  • Zur Erkennung einer punktförmigen Mutation kann auf zweierlei Weise gearbeitet werden:
  • - entweder die Aufnahmesonde enthält die komplementäre Mutation im Vergleich zur gesuchten Mutation, wobei in diesem Falle einzig und allein das mutierte Target unter den Bedingungen der Testhybridisierung hybridisieren wird;
  • - oder die Aufnahmesonde ist zur komplementären Sequenz des nicht-mutierten Targets perfekt homolog, wobei in diesem Falle einzig und allein die nicht-mutierten Targets hybridisieren werden.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich insbesondere in den folgenden Fällen zur Anwendung bringen:
  • - bei der Erkennung von DNS oder Boten-RNS von Viren oder der RNS von Retrovieren;
  • - bei der Erkennung von DNS, Boten-RNS oder ribosomaler RNS sowie DNSc-RNS-Hybriden von Bakterien, Parasiten und Hefen; sowie
  • - bei der Bestimmung von Vertebraten-DNS, insbesondere beim Menschen zur Durchführung der HLA-Typisierung oder zur Erkennung von Erbkrankheiten (Myopathie, Diabetes, Mukoviszidose usw. ...).
  • Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung ohne jegliche Beschränkung.
  • Bei diesen Beispielen wurden die Nukleotidsequenzen gemäß üblicher Festlegung mit der Stellung in der äußeren Position 5, links dargestellt.
  • Die Erfindung betrifft auch noch die Verwendung von Sonden, wie sie in den Beispielen zur Erkennung des angegebenen Targets beschrieben sind. Es ist daher leicht zu verstehen, daß die erwähnten Sonden gemäß den Beispielen als Minimumsequenzen betrachtet werden müssen, welche (innerhalb der angegebenen Grenzen von maximal 30, 25 oder 20 Nukleotiden) durch die Anknüpfung von ergänzenden Nukleotiden verlängert sein können, die selbstverständlich ausgewählt werden können, damit die Sonde mit dem Target homolog ist, wobei die Sequenz des Targets hiermit als bekannt vorausgesetzt wird. Die erwähnten Sonden, wie sie gemäß den Beispielen zufriedenstellende Eigenschaften aufweisen, ermöglichen sämtlich eine Arbeitstemperatur von 37ºC.
  • Bei den Beispielen, für welche zwei Sequenzen für die Aufnahmesonde angegeben sind (oder auch für die Erkennungssonde), bedeutet, daß eine der beiden Sonden oder auch beide Sonden verwendet werden können. Die Verwendung von zwei Aufnahmesonden und/oder zwei Erkennungssonden ermöglicht die Erhöhung des Signals, da die Ergebnisse mit einer einzigen Sonde nicht zufriedenstellend sind.
  • Die Angaben bezüglich der beigefügten Abbildungen 1 und 2 sind jeweils für die Beispiele 10 und 15 gedacht.
    • BEISPIEL 1 Herstellung der Phosphoramidit-Seitenkette durch Zugabe einer NH&sub2;-Seitenkette in der Stellung 5' eines Oligonukleotids.
  • Es werden 21,0 g (0,2 Mol) 5-Amino-1-pentanol (Aldrich 12304-8) in 90 ml THF aufgelöst, wonach 5,3 g Na&sub2;CO&sub3; hinzugegeben werden. Das Gemisch wird bis auf -5ºC abgekühlt, wonach tropfenweise 14 g (0,067 Mol) Trifluoressigsäureanhydrid (Aldrich 10623-2) hinzugegeben werden, welche in 50 ml THF innerhalb einer Stunde aufgelöst war.
  • Die Mischung wird eine Stunde lang unter Rühren beim Raumtemperatur belassen. Nach dem Abfiltrieren und Evaporieren des THF wird das Produkt unter Vakuum abdestilliert. Die Fraktion E0,3 mm = 75-90ºC wird aufgefangen und über Silikagel mittels eines Gemisches aus CH&sub2;Cl&sub2; und MeOH im Verhältnis 80:20 gereinigt.
  • Das gewünschte Produkt zeigt einen RF-Laufwert von 0,6. Die Ausbeute beträgt 66%.
  • Es werden 0,7 g geschützter Aminoalkohol (3,48 10&supmin;³ Mol) mit Pyridin getrocknet (2 x 3 ml), mit 3 ml N-Ethyldiisopropylamin (13,92 10&supmin;³ Mol) vermischt und in 15 ml CH&sub2;Cl&sub2; aufgelöst. Dann werden 1,65 g (6,96 10&supmin;³ Mol) 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylchlorphosphoramidit (Aldrich 30230-9) unter Argongas bei Raumtemperatur während der Zeitdauer von 35 Minuten hinzugegeben. Es werden 0,2 ml MeOH hinzugefügt und nach 10-minütigem Rühren 30 ml Ethylacetat hinzugegeben. Die organische Phase wird in der Kälte zweimal mit 60 ml Na&sub2;CO&sub3; in 10%iger Lösung und danach mit 2 x 80 ml gesättigter NaCl-Lösung gewaschen und über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, wonach das Evaporieren mit einem Rotationsverdampfer erfolgt.
  • Das Rohprodukt wird auf einer Silikasäule mit einem Gemisch aus Ethylacetat, CH&sub2;Cl&sub2;, NEt&sub3; im Verhältnis 45:45:10 gereinigt. Die aufgesammelte Fraktion (Rf = 0,75) wird mit dem Rotationsverdampfer eingeengt und unter Argon aufbewahrt.
    • BEISPIEL 2 Herstellung eines konjugierten Oligonukleotids - -Konjugats mit Rinderserumalbumin (ASB):
  • Das Oligonukleotid wird in einem automatischen Gerät "APPLIED 381A" unter Einsatz der Phosphoramiditchemie dargestellt. Die Phosphoramiditseitenkette, welche in wasserfreiem Acetonitril in einer 0,2-molaren Konzentration aufgelöst worden war, wird an der Stelle X des Synthesegerätes angehängt, wobei die Addition der Seitenkette nach der Standardverfahrensweise am Schluß der Synthese erfolgt. Nach dem Entfernen der Schutzgruppen über Nacht bei 55ºC in 33%igem NH&sub4;OH und dem Ausfällen in Ethanol bei -20ºC wird das Oligonukleotid im Vakuum getrocknet und in 1 ml Wasser aufgenommen. Es werden im Vakuum 3 10&supmin;&sup8; Mol Oligonukleotid getrocknet und in 25 µl Natriumborat-Puffer von 0,1 M bei einem pH von 9,3 aufgenommen. Dann werden 500 µl einer Lösung mit 30 mg/ml DITC (Fluka 78480) in DMF hinzugefügt.
  • Das Gemisch wird eineinhalb Stunden bei Raumtemperatur vor der Zugabe von 3 ml Wasser gerührt. Nach dem Extrahieren der Lösung mit Butanol (3 x 3 ml) wird die verbliebene wäßrige Phase (500 µl) im Vakuum getrocknet, wonach sie mit 1 10&supmin;&sup7; Mol (6,6 mg) BSA (Pierce 30444) in 200 µl Boratpuffer aufgenommen wird. Nach Rühren über Nacht bei Raumtemperatur wird das Konjugat durch lonenaustausch über HPLC in einer Säule AX300 (BROWNLEE 4,6 x 100 mm) über einen Kochsalzgradienten (Tabelle 1) gereinigt. Der Peak des Konjugats wird gegen Wasser dialysiert (2 x 1 Liter), im Vakuum eingeengt, in 1 ml Wasser aufgenommen und bei -20ºC aufbewahrt. Tabelle 1 LÄNGE OLIGONUKLEOTID Tr* min Verhältnis Oligo/ASB * Tr = Retentionszeit in Abhängigkeit von der Konzentration an NaCl * Der Elutionsgradient beträgt 10% zu 56% Puffer B innerhalb von 25 Minuten mit Puffer A = 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,00 Puffer B = Puffer A mit einem Gehalt an 2M oder 1 M NaCl
    • BEISPIEL 3 Herstellung eines Konjugats Oligonukleotid/Meerrettichperoxidase
  • Das gemäß Beispiel 2 unter Vakuum getrocknete, aktivierte Oligonukleotid wird in 200 pl Boratpuffer mit 1,25 10&supmin;&sup7; Mol (5 mg Meerrettichperoxidase/Boehringer 413470) aufgenommen.
  • Der Reinigungsvorgang ist identisch: das Konjugat wird bei -20ºC in einem Puffer mit 50 mM Tris HCl bei einem pH von 7,0 und 40% Glycerin aufbewahrt.
  • Die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2 TYP SEQUENZ Verh. ollgo/HRP BGLUCUSENIDASE BGLOBINE C. TRACHOMATIS * Tr = Retentionszeit in Minuten in Abhängigkeit von der Salzkonzentration (1M oder 2M) * Die Gradientenbedingungen sind mit jenen identisch, wie sie in dem Beispiel 2 beschrieben sind
    • BEISPIEL 4 Herstellung eines Konjugats Oligonukleotid/alkalische Phosphatase
  • Das gemäß Beispiel unter Vakuum getrocknete, aktivierte Oligonukleotid wird durch 5,7 10&supmin;&sup8; Mol (8,0 mg) alkalische Phosphatase (Boehringer 567752) in dem Puffer des Herstellers aufgenommen.
  • Der Reinigungsvorgang ist identisch (Tabelle 3). Das Konjugat wird bei +4ºC in einem Puffer mit Tris HCl 30 mM, 1M NaCl, 1 mM MgCl&sub2; und einem pH von 8,0 aufbewahrt. Tabelle 3 DNS-Typ OLIGONUKLEOTID Tr min Verhältnis Oligo/Enzym * Tr = Retentionszeit in Minuten in Abhängigkeit von der Salzkonzentration * Die Bedingungen der Gradienten sind dieselben wie im Beispiel 2
    • BEISPIEL 5 Erkennung einer Nukleinsäuresequenz durch die Sandwich-Verfahrensweise
  • Es wird eine Lösung aus dem Oligonukletid 5'-TCAGAGGAAGAAAACGATGA- 3' in einer Menge von 1 ng/µl (0,15 µM) in PBS 3X (0,45 M NaCl 0,15 M Natriumphosphat, pH gleich 7,0) auf eine Mikrotiterplatte aus Polystyrol (Nunc 439454) verbracht. Die Platte wird zwei Stunden lang bei 37ºC inkubiert.
  • Nach dreimaligem Waschen mit 300 µl PBS Tween (0,15 M NaCl, 0,05 M Natriumphosphat, pH = 7,0, PBS Tween 20 (MERCK 822184)] werden 50 µl dersequenz(5'-AAGGTCAACCGGAATTTCATTTTGGGGCTCTAAATGCAATACAATGTCTTGCAATGTTGCCTTA-3') in verschiedenen Konzentrationen von jeweils 100 pg/µl (5 nM) bis zu 0,01 pg/µl (0,5 pM) in dem PBS-Lachspuffer [PBS3X + DNS aus Lachssperma in einer Menge von 10 µg/ml (Sigma D9156)] in die Näpfchen eingebracht, gefolgt von 50 µl einer Lösung aus dem Konjugat Oligonukleotid/Peroxidase in einer Konzentration von 0,1 ng/µl (15 nM) Oligonukleotid in dem PBS-Pferdepuffer [PBS3X + 10% Pferdeserum (BioMérieux 55842)]. Die Platte wird eine Stunde lang bei 37ºC inkubiert und dreimal mit jeweils 300 µl PBS Tween mit 100 µl Substrat o-PD (o-Phenylendiamin Cambridge Medical Biotechnology ref1456) in einem o-PD-Puffer (0,05 M Zitronensäure, 0,1 M Na&sub2;&sub2;HPO&sub4;, pH = 4,93) in einer Konzentration von 4 mg/ml gewaschen, wozu in situ zubereitete 1/1000 Lösung aus H&sub2;O&sub2; zu 30 Volumina in die Näpfchen hinzugegeben werden.
  • Nach 20-minütiger Reaktionsdauer wird die Aktivität des Enzyms durch 100 µl N H&sub2;SO&sub4; blockiert und das Ablesen auf einem Axia Microreader (BioMérieux) bei 492 nm durchgeführt. Empfindlichkeit (Tabelle 4): Tabelle 4 Target (pg) Wert O.D. 0.D. = Optische Dichte
  • Die Erkennungsgrenze liegt bei 2 pg des Targets mit 10&supmin;¹&sup7; Mol.
  • Das System ist perfekt spezifisch, weil die Näpfchen mit einem Gehalt an DNS aus Lachs, welche in Form eines Einfachstranges vorliegt, nicht erkannt wird (Näpfchen = 0 pg/µl Target).
    • BEISPIEL 6
  • Wie schon im Zusammenhang mit der Sichelzellenanämie oder mit Onkogenen (in: "Human Genetic diseases, a practical approach", K.E. DAVIES ed., IRL press, 1986) sind die punktuellen Mutationen an den spezifischen Positionen auf einem Gen für Erbkrankheiten verantwortlich und lassen sich durch die Hybridisierung der genomischen DNS mit Nukleinsäuresonden erkennen. Unter bestimmten Bedingungen kann eine Fehlpaarung einer Base ein DNS-Oligonukleotid-Hybrid destabilisieren. Auf diese Weise erkennen R.B. WALLACE et Coll. (Nucl. Acid. Res., 6, Seiten 3543 ff., 1979) eine Mutation am-3 (A-C für das mutierte Gen an der Stelle von C-G im Normalgen) auf dem Gen des Bakteriophagen φX174 mittels eines Hybridisierungssystems über Direktfiltration.
  • Zuletzt durchgeführte Arbeiten haben aufgezeigt, daß die Mutationen vom Standpunkt der Destabilisierung eines Hybrids aus gesehen, nicht äquivalent waren.
  • So fanden F. ABOUBELA et Coll. (Nucl. Acid. Res., 13, Seiten 4811 ff., 1985), daß die Fehlpaarungen mit einem Gehalt an einem Guanin (GT-GG-GA) weniger destabilisierend sind als die Fehlpaarungen mit einem Gehalt an einem Cytosin (CA-CC) oder einer Fehlpaarung zwischen zwei Pyrimidinen (TT-CC- TC).
  • S. IKUTA et. Coll. (Nucl. Acid. Res., 15, Seiten 797 ff., 1987) zeigen, daß die Fehlpaarungen von GT und GA weniger destabilisierend ist als AA, TT, CT und CA.
  • Das vorliegend beschriebene Beispiel stellt ein Erkennungsverfahren einer perfekt homogolen DNS durch die Sandwich-Verfahrensweise bei 37ºC dar. Die Aufnahme-Oligonukleotide werden passiv auf der Platte fixiert. Die fünf ausgewählten Targets sind in der Tabelle 5 beschrieben. Tabelle 5
  • 4 verschiedene Mutationen wurden in 4 Targetsequenzen eingebaut, die sich von der Sequenz X durch eine einzige Mutation unterscheiden.
  • Die Mutationen sind in der Zone 32 bis 35 des Targets gelegen. Die vier Fehlpaarungen sind jeweils vom Typ GT (XGT), AA (XAA), TT (XTT) sowie AG (XAG), wobei zwei Fehlpaarungen GT und AG aufgefunden werden, welche die am wenigsten destabilisierende Wirkung auf das Hybrid ausüben.
  • Die Erkennungssonde D1 5'-TAAGGCAACATTGCAAGACA-3' ist zur Region 1-20 des Targets komplementär und für alle Targets gemeinsam. Sie ist am äußeren Ende 5' mit der Peroxidase gemäß Beispiel 3 markiert.
  • Die Spezifität des Systems ist auf die Aufnahme-Oligonukleotide (Tabelle 6) zurückzuführen. Tabelle 6 OLIGONUKLEOTID Aufnahme
  • Tm wird unter Hybridisierungsbedingungen berechnet, d.h. 600 mM in Form des Salzes für die beiden Targetkonzentrationen 10&supmin;&sup8; und 10&supmin;&sup9; molar.
  • Die fünf Oligonukleotide besitzen in der Position 5' eine C&sub5;NH&sub2;-Seitenkette zur Ermöglichung der kovalenten Kupplung an das Rinderserumalbumin (C15, C13, C12, C11 und C9).
  • Wenn nichts Gegenteiliges angegeben ist, ist die Sandwich-Verfahrensweise mit jener im Beispiel 5 beschriebenen identisch.
  • Das Target wird in einer Menge von 10&supmin;&sup9; Mol/l, 20 pg/µl (Tabelle 7), 10&supmin;&sup8; Mol/l oder 200 pg/µl (Tabelle 8) aufgetragen. Tabelle 7 Target Wert der O.D bei 492nm Tabelle 8 Target Wert der O.D bei 492nm
  • Das mit dem Target gebildete Hybrid mit einem Gehalt an einer Fehlpaarung vom Typ GT ist am wenigsten destabilisiert und daher am schwersten zu erkennen. Das Verhältnis Signal X/Signal XGT kann daher als Bezugsmaßstab zur Messung der Leistungen des Systems (Tabelle 9) dienen: Tabelle 9 Verhältnis X/XGT
  • Das Aufnahme-Oligonukleotid C12 ermöglicht die Erkennung einer beliebigen Fehlpaarung in der Nukleinsäuresequenz unter Beibehaltung eines schwächeren Signals als 9,100 für beide Konzentrationen und ein Verhältnis von X/XGT > 10 in bezug auf alle Fehlpaarungen.
    • BEISPIEL 7 Erkennungsverfahren einer perfekt homologen DNS.
  • Die Aufnahme-Oligonukleotide werden an ASB gekuppelt und passiv auf der Platte fixiert.
  • Die Sandwich-Verfahrensweise ist mit jener gemäß Beispiel 5 identisch.
  • Die Aufnahme-Oligonukleotide werden an ASB gemäß dem Beispiel 2 gekuppelt.
  • Die Aufnahmesonde stellt die gleiche wie im Beispiel 6 dar.
  • Die Ergebnisse sind in den Tabellen 10, 11 und 12 dargestellt. Tabelle 10 Target (1,00E-08 M) Wert der O.D bei 492nm Tabelle 11 Target (1,00E-09 M) Wert der O.D bei 492nm Tabelle 12 Verhältnis X/XGT
  • Das Aufnahme-Oligonukleotid C11, das an ASB gekuppelt ist, ermöglicht die Erkennung einer beliebigen Fehlpaarung in der Nukleinsäuresequenz unter Beibehaltung eines schwächeren Signals als 0,100 in beiden Konzentrationen und bei einem Verhältnis von X/XGT > 10 in bezug auf alle Fehlpaarungen.
    • BEISPIEL 8 Erkennungsverfahren einer perfekt homologen DNS bei verschiedenen Temperaturen
  • Die Verfahrensweise der Erkennung stellt dieselbe wie in Beispiel 7 dar.
  • Das Aufnahme-Oligonukleotid C11 wird an ASB gekuppelt und passiv auf der Platte fixiert. Die Konzentration an dem Target ist konstant, wobei die Fixierung bei einer 10&supmin;&sup9; molaren Konzentration erfolgt. Die Hybridisierungstemperatur ist variabel (Tabelle 13). Tabelle 13 TEMPERATUR ºC
    • BEISPIEL 9 Erkennungsverfahren einer pefekt homologen DNS bei verschiedenen Temperaturen
  • Die Verfahrensweise der Erkennung stellt dieselbe wie im Beispiel 7 dar.
  • Das Aufnahme-Oligonukleotid C13 wird passiv auf der Platte direkt fixiert. Die Konzentration des Targets ist konstant, wobei die Fixierung bei einer 10&supmin;&sup8; molaren Konzentration erfolgt. Die Hybridisierungstemperatur ist variabel (Tabelle 14). Tabelle 14 TEMPERATUR ºC
    • BEISPIEL 10 Spezifische Erkennung der DNS- oder RNS-Sequenz, welche einem Gen der β-Lactamase von E.coli (Tem) entspricht
  • In dem Fall, daß die zu erkennende Sequenz der Boten-RNS entspricht, wird diese ausgehend von der spezifischen Reinigung der RNS erhalten (MANIATIS et Coll. in Molecular Cloning, a Laboratory Manual, New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) oder ausgehend von einer direkten bakteriellen Lyse nach der Zugabe von Natriumcarbonat (0,2 M Endlösung) zur Bakterienkultur. Das benutzte Erkennungssystem ist mit dem Strang der Boten-RNS, welche dem Gen Tem entspricht, komplementär.
  • Dieses System besteht aus zwei Aufnahme-Oligonukleotiden. Die passive Adsorption wird bei einer Gesamtkonzentration von 0,15 µM durchgeführt, wie sie gemäß Beschreibung im Beispiel 5 verwendet wird.
  • Die Erkennung wird durch den Einsatz von zwei durch Peroxidase markierte Oligonukleotide bei einer Gesamtkonzentration von 15 nM durchgeführt.
  • Die verwendeten Oligonukleotidsequenzen sind wie folgt:
  • Aufnahme 1 = 5'-GCACTGCATAATTCTT-3'
  • Aufnahme 2 = 5'-TACTGTCATGCCATCC-3'
  • Erkennung 1 = 5'-GTTGGCCGCAGTGTTAT-3'
  • Erkennung 2 = 5'-CACTCATGGTTATGGCA-3'
  • Erkennung auf nicht vermehrter, gereinigter RNS (Tabelle 15): Tabelle 15 Gereinigte RNS Wert O.D. RNS spezifisch 10 µg RNS unspezifisch
  • Erkennung auf ungereinigten Kolonien von RNS (Tabelle 16): Tabelle 16 Kolonie Nr. Wert O.D. spezifische Kolonien unspezifische Kolonien
  • Die Erkennungsgrenze des Systems mit RNS ohne Vermehrung beträgt 1 µg vollständig gereinigte RNS und 10&sup6; bis 10&sup7; bakterielle Kolonien.
  • In dem Fall, daß die zu erkennende Sequenz der nicht vermehrten DNS entspricht (Plasmid PBR 322 mit einem Gehalt an dem β-Lactamasegen). In dem Fall wird die Erkennung direkt mit denaturierter DNS nach den vorstehend beschriebenen Bedingungen durchgeführt.
  • Das verwendete Erkennungssystem ist wie folgt:
  • Aufnahme 1 = 5'-GGATGGCATGACAGTA-3'
  • Aufnahme 2 = 5'-AGAGAATTATGCAGTGC-3'
  • Erkennung 1 = 5'-TGCCATAACCATGAGTG-3'
  • Erkennung 2 = 5'-ATAACACTGCGGCCAAC-3'
  • Die Ergebnisse sind wie folgt (Tabelle 17): Tabelle 17 Wert O.D. 10 µg Lachs-DNS
  • Die Empfindlichkeit mit nicht vermehrter DNS beträgt 0,1 µg, d.h. 3,48 10&supmin;¹&sup4; Mol, entsprechend 2 10¹&sup0; tatsächlichen Molekülen.
  • In dem Fall, daß die zu erkennende DNS der durch die Kettenreaktion vermehrten DNS unter Verwendung einer Polymerase entspricht, sind die für die Vermehrung verwendeten Oligonukleotide wie folgt:
  • Startpunkt 1 = 5'-ATCAGCAATAACCAGC-3'
  • Startpunkt 2 = 5'-CCCCGAAGAACGTTTTC-3'
  • Die zu erkennende DNS wird durch das vorstehend angegebene Verfahrensschema denaturiert. Die Erkennung läßt sich unter Verwendung eines der in diesem Beispiel beschriebenen Systeme durchführen.
  • Die Abb. 1 zeigt die Ergebnisse, welche mit den Abszissen der DNS-Menge in ng und der Ordinate der optischen Dichte erhalten wurden.
  • Die Empfindlichkeit ist in der Größenordnung von 1 ng DNS, welche nach der Vermehrung unter Berücksichtigung der Gesamtmenge an erzeugter DNS erhalten wurde, die nach der Vermehrung in der Größenordnung von 2,0 µg liegt.
  • Bezüglich eines vermehrten Fragmentes mit 560 Basenpaaren liegt die Erkennungsschwelle daher in der Größenordnung von 2,95 10&supmin;¹&sup5; Mol oder 1,7 10&sup9; tatsächlichen Molekülen.
    • BEISPIEL 11 Erkennung der dem Gen E7 des Papillomavirus vom Humantyp 6 entsprechenden Sequenz
  • In dem Fall, daß die zu erkennende Sequenz eine vermehrte DNS darstellt, sind die verwendeten Sequenzen wie folgt:
  • Startpunkt 1 = 5'-TACACTGCTGGACAACATGC-3'
  • Startpunkt 2 = 5'-GTGCGCAGATGGGACACAC-3'
  • Die gegebenenfalls vermehrte DNS läßt sich durch das folgende System erkennen (Erkennungsstrang -)
  • Aufnahmestelle 1 = 5'-CAGTGTACAGAAACA-3'
  • Aufnahmestelle 2 = 5'-GAGTGCACAGACGGA-3'
  • Erkennungsstelle 1 = 5'-GACCCTGTAGGGTTACATT-3'
  • Erkennungsstelle 2 = 5'-TGACCTGTTGCTGTGGA-3'
    • BEISPIEL 12 Erkennung der dem Gen E7 des Papillonavirus vom Humantyp 11 entsprechenden DNS-Sequenz
  • In dem Fall, daß die zu erkennende Sequenz eine vermehrte DNS darstellt, sind die verwendeten Sequenzen wie folgt:
  • Startsteile 1 = 5'-TACACTGCTGGACAACATGC-3'
  • Startstelle 2 = 5'-GTGCGCAGATGGGACACAC-3'
  • Die gegebenenfalls vermehrte DNS läßt sich durch das folgende System erkennen (Erkennungsstrang -)
  • Aufnahmestelle 1 = 5'-GAGTGCACAGACGGA-3'
  • Aufnahmestelle 2 = 5'-CAACTACAAGACCTTTTGC-3'
  • Erkennungsstelle 1 = 5'-GACCCTGTAGGGTTACATT-3'
  • Erkennungsstelle 2 = 5'-TGACCTGTTGCTGTGGA-3'
    • BEISPIEL 13
  • Erkennung der den Genen E7 vom Papillomaviren vom Humantyp 6 und 11 entsprechenden DNS-Sequenz
  • In dem Fall, daß die zu erkennende Sequenz eine vermehrte DNS darstellt, sind die verwendeten Sequenzen wie folgt:
  • Startpunkt 1 = 5'-TACACTGCTGGACAACATGC-3'
  • Startpunkt 2 = 5'-GTGCGCAGATGGGACACAC-3'
  • Die gegebenenfalls vermehrte DNS läßt sich durch das folgende System erkennen (Erkennungsstrang -)
  • Aufnahmestelle 1 = 5'-AGACAGCTCAGAAGATGAGG-3'
  • Aufnahmestelle 2 = 5'-CAGCAACGT(T/C)CGACTGGTTG-3'
  • Erkennungsstelle 1 = 5'-GACCCTGTAGGGTTACATT-3'
  • Erkennungsstelle 2 = 5'-TGACCTGTTGCTGTGGA-3'
    • BEISPIEL 14 Erkennung der dem Gen E7 des Papillonavirus vom Humantyp 16 entsprechenden DNS-Sequenz
  • In dem Fall, daß die zu erkennende Sequenz eine vermehrte DNS darstellt, sind die verwendeten Sequenzen wie folgt:
  • Startstelle 1 = 5'-CCCAGCTGGTAATCATGCATGGAGA-3'
  • Startstelle 2 = 5'-GTGTGCCCAUAACAGGTCTTCCA-3'
  • Die gegebenenfalls vermehrte DNS läßt sich durch das folgende System erkennen (Erkennungsstrang -)
  • Aufnahmestelle 1 = 5'-TATATGTTAGATTTGCAACC-3'
  • Aufnahmestelle 2 = 5'-GACAACTGATCTCTAC-3'
  • Erkennungsstelle 1 = 5'-CCGGACACGAGCCCATTAC-3'
  • Erkennungsstelle 2 = 5'-CTCTACGCTTCGGTTGTGC-3'
    • BEISPIEL 15 Erkennung der dem Gen E7 des Papillonavirus vom Humantyp 18 entsprechenden DNS-Sequenz
  • In dem Fall, daß die zu erkennende Sequenz eine vermehrte DNS darstellt, sind die verwendeten Sequenzen wie folgt:
  • Startstelle 1 = 5'-CGACAGGAACGACTCCAACG-3'
  • Startstelle 2 = 5'-GCTGGTAAATGTTGATGATTAACT-3'
  • Die gegebenenfalls vermehrte DNS läßt sich durch das folgende System erkennen (Erkennungsstrang -)
  • Aufnahmestelle 1 = 5'-TCAGAGGAAGAAAACGATGA-3'
  • Aufnahmestelle 2 = 5'-ATGTCACGAGCAATTAAGCG-3'
  • Erkennungsstelle 1 = 5'-GTATTGCATTTAGAGCCCCA-3'
  • Erkennungsstelle 2 = 5'-TAAGGCAACATTGCAAGACA-3'
  • Die zu erkennende DNS wird durch das vorstehend angegebene Verfahrensschema denaturiert. Die Abb. 2 stellt die erhaltenen Resultate dar, und zwar als Abszissen, die DNS-Menge und in den Ordinaten die optische Dichte (in der Abb. 2 ist zu sehen, daß allein 1'HPV 18 erkannt wird, 1'HPV 16 jedoch nicht).
  • Die Empfindlichkeit liegt in der Größenordnung von 1 ng DNS.
    • BEISPIEL 16 Erkennungssystem des Papi liomavirus vom Humantyp 6, 11, 16 und 18
  • Das Beispiel beschreibt die Erkennung jeden Typs nach einer unspezifischen Vermehrung mittels der Kettenreaktion unter Verwendung einer Polymerase.
  • Diese wird mit einem Gemisch aus allen in den Beispielen 11, 12, 13, 14 und 15 beschriebenen Beispielen durchgeführt.
  • Jedes Oligonukleotid wird in einer Konzentration von 0,3 µM verwendet.
  • Die Aufnahme läßt sich unter Benutzung der Gesamtheit der Aufnahme- Oligonukleotide, die in den Beispielen 11, 1 2, 13, 14 und 1 5 beschrieben sind (passive Adsorption, Verfahrensweise gemäß Beschreibung im Beispiel 5) vornehmen.
  • Die Erkennung läßt sich in spezifischer Weise unter Verwendung einer der Kupplungen von peroxidasemarkierten Oligonukleotiden gemäß der Beschreibung in den Beispielen 11, 12, 13, 14 und 15 durchführen.
  • Die erhaltenen Ergebnisse und Spezifität sind wie folgt, jedoch ohne den Fall, daß die Erkennung mit dem 1/100sten des Vermehrungsproduktes durchgeführt wird (Tabelle 18). Tabelle 18 Erkennungssystem Vermehrte DNS HPV 2 unspezifisch wasser: unspezifischer Vergleich
    • BEISPIEL 17 Erkennung der DNS-Sequenz, welche dem Gen des größeren Proteins der äußeren Membran (MOMP) von Chlamydia trachomatis entspricht
  • In dem Fall, daß die zu erkennende Sequenz vermehrte DNS darstellt, sind die verwendeten Sequenzen wie folgt:
  • Vermehrungsstartstelle 1 = 5'-CACCATAGTAACCCATACGC-3'
  • Vermehrungsstartstelle 2 = 5'-GCCGCTTTGAGTTCTGCTTCC-3'
  • Die gegebenenfalls vermehrte DNS läßt sich durch das folgende System (Erkennungsstrang -) erkennen:
  • Aufnahmestelle 1 = 5'-GCCGCTTTGAGTTCTGCTTCC-3'
  • Aufnahmestelle 2 = 5'-CTTGCAAGCTCTGCCTGTGG-3'
  • Erkennungsstelle 1 = 5'-AATCCTGGCTGAACCAAGCCT-3'
  • Erkennungsstelle 2 = 5'-AAGGTTTCGGCGGAGATCCT-3'
    • BEISPIEL 18 Erkennung der DNS-Sequenz, welche der Region gag des Retrovirus HIV 1 entspricht
  • In dem Fall, daß die zu erkennende Sequenz eine vermehrte DNS darstellt, sind die verwendeten Sequenzen wie folgt:
  • Startstelle 1 = 5'-GGACATCAAGCAGCCATGC-3'
  • Startstelle 2 = 5'-CTAGTAGTTCCTGCTATGTC-3'
  • Die gegebenenfalls vermehrte DNS läßt sich durch das folgende System erkennen:
  • Aufnahmestelle 1 = 5'-AATGTTAAAAGAGAC-3'
  • Erkennungsstelle 1 = 5'-GAAGCTGCAGAATGGGA-3'
    • BEISPIEL 19 Erkennung der DNS-Sequenz, welche der Region gag des Retrovirus HIV 2 entspricht
  • In dem Fall, daß die zu erkennende Sequenz eine vermehrte DNS darstellt, sind die verwendeten Sequenzen wie folgt:
  • Startstelle 1 = 5'-GACCATCAAGCAGCCATGC-3'
  • Startstelle 2 = 5'-CTTGTTGTCCCTGCTATGTC-3'
  • Die gegebenenfalls vermehrte DNS läßt sich durch das folgende System erkennen:
  • Aufnahmestelle 1 = 5'-CTTACCAGCGGGGCAGC-3'
  • Erkennungsstelle 1 = 5'-GAAGCTGCAGAATGGGA-3'
    • BEISPIEL 20 Erkennung der DNS-Sequenz, welche der Region env des Retrovirus HIV 1 entspricht
  • In dem Fall, daß die zu erkennende Sequenz eine vermehrte DNS darstellt, sind die verwendeten Sequenzen wie folgt:
  • Startstelle 1 = 5'-CAGGAAGCACTATGGGCGC-3'
  • Startstelle 2 = 5'-GCTGCTTGATGCCCCAGAC-3'
  • Die gegebenenfalls vermehrte DNS läßt sich durch das folgende System erkennen:
  • Aufnahmestelle 1 = 5'-TGTCTGGTATAGTGCA-3'
  • Erkennungsstelle 1 = 5'-AACAATTTGCTGAGGGCTAT-3'
    • BEISPIEL 21 Erkennung der DNS-Sequenz, welche der Region env des Retrovirus HIV 2 entspricht
  • In dem Fall, daß die zu erkennende Sequenz eine vermehrte DNS darstellt, sind die verwendeten Sequenzen wie folgt:
  • Startstelle 1 = 5'-CAGGCAGTTCTGCAATGGG-3'
  • Startstelle 2 = 5'-GGTTTTTCGTTCCCCAGACG-3'
  • Die gegebenenfalls vermehrte DNS läßt sich durch das folgende System erkennen:
  • Aufnahmestelle 1 = 5'-GCAACAGCAACAGCTGTTGGA-3'
  • Erkennungsstelle 1 = 5'-GGTCAAGAGACAACAAGAA-3'
    • BEISPIEL 22 Erkennung der DNS-Sequenz, welche der Region pol des Retrovirus HIV 1 entspricht
  • In dem Fall, daß die zu erkennende Sequenz eine vermehrte DNS darstellt, sind die verwendeten Sequenzen wie folgt:
  • Startstelle 1 = 5'-ATTAGCAGGAAGATGGCCAG-3'
  • Startstelle 2 = 5'-CTGCCATTTGTACTGCTGGTC-3'
  • Die gegebenenfalls vermehrte DNS läßt sich durch das folgende System erkennen:
  • Aufnahmestelle 1 = 5'-GACAATGGCAGCAATTTCACC-3'
  • Erkennungsstelle 1 = 5'-GCCTGUGGTGGGC-3'
    • BEISPIEL 23 Erkennung der DNS-Sequenz, welche dem Gen der Region β-Glucuronidase von E.coli entspricht
  • In dem Fall, daß die zu erkennende Sequenz eine vermehrte DNS darstellt, sind die verwendeten Sequenzen wie folgt:
  • Startstelle 1 = 5'-CAATACGCTCGAACGACGT-3'
  • Startstelle 2 = 5'-CACGGGTTGGGGTTCTAC-3'
  • Die gegebenenfalls vermehrte DNS läßt sich durch das folgende System erkennen (Erkennungsstrang -):
  • Aufnahmestelle 1 = 5'-TGGCTTCTGTCAACGCTGTT-3'
  • Aufnahmestelle 2 = 5'-ATGCGATCTATATCACGCTG-3'
  • Erkennungsstelle 1 = 5'-GATCGCGGTGTCAGTTCTTT-3'
  • Erkennungsstelle 2 = 5'-TTCCATGGGTTTCTCACAGA-3'
    • BEISPIEL 24 Erkennung der DNS-Sequenz, welche dem Gen der Region β-Humanglobin entspricht
  • In dem Fall, daß die zu erkennende Sequenz eine vermehrte DNS darstellt, sind die verwendeten Sequenzen wie folgt:
  • Startstelie 1 = 5'-GACTCAGAATAATCCAGCCT-3'
  • Startstelle 2 = 5'-TGTTTACGCAGTCTGCCTAG-3'
  • Die gegebenenfalls vermehrte DNS läßt sich durch das folgende System erkennen (Erkennungsstrang -):
  • Aufnahmestelle 1 = 5'-TGTTTACGCAGTCTGCCTAG-3'
  • Aufnahmestelle 2 = 5'-CACATATTGACCAAATCAGG-3'
  • Erkennungsstelle 1 = 5'-GTATCATGCCTCTTTGCACC-3'
  • Erkennungsstelle 2 = 5'-TTTCTGGGTTAAGGCAATAGC-3'
    • BEISPIEL 25 Erkennung der DNS-Sequenz, welche dem Oncogen ras entspricht
  • In dem Fall, daß die zu erkennende Sequenz eine vermehrte DNS darstellt, sind die verwendeten Sequenzen wie folgt:
  • Startstelle 1 = 5'-TGTTATGATGGTGAAACCTG-3'
  • Startstelle 2 = 5'-CTGTAGAGGTTAATATCCGCAAA-3'
  • Die gegebenenfalls vermehrte DNS läßt sich durch das folgende System erkennen (Erkennungsstrang -):
  • Aufnahmestelle 1 = 5'-CAGTGCCATGAGAGACCAAT-3'
  • Aufnahmestelle 2 = 5'-CGACGCAGCCATGGTCGATGC-3'
  • Erkennungsstelle 1 = 5'-TTCCTCTGTGTATTTGCCAT-3'
  • Erkennungsstelle 2 = 5'-ACATGAGGACAGGCGAAGGC-3'
    • BEISPIEL 26 Verwendung eines peroxidasemarkierten α-Oligonukleotids zur Erkennung
  • Verfahrensweise gemäß dem Beispiel 5. Target:
  • Aufnahmestelle: 5'-TCAGAGGAAGAAAACGATGA-3'
  • Die verwendete Erkennungssonde stellt das α-Oligonukleotid 5'-ACCCCGAGATTTAGGTTATGT-3' dar, das auf die Meerrettichperoxidase gemäß dem Beispiel 3 gepfropft ist.
  • Die Erkennungsgrenze liegt bei 5 pg Target bzw. 5 10&supmin;¹&sup7; Mol (Tabelle 19). Tabelle 19 Target (pg)
    • BEISPIEL 27 Alkalische Phosphatase als Erkennungsenzym für die Kolorimetrie
  • Verfahrensweise gemäß Beispiel 5:
  • Die Erkennungssonde 5'-TAAGGCAACATTGCAAGACA-3' wird mit der alkalischen Phosphatase gemäß Beispiel 4 verkuppelt.
  • Es werden 100 µl des Substrats PNPP (Sigmal 104-0) in einer Konzentration von 2 mg/ml (in einem Puffer mit 1,29 M Diethanolamin, 0,56 mM MgSO&sub4;, 0,38 mM NaN&sub3;, 0,012 N HCl und einem pH gleich 9,8) in die Näpfchen eingetragen. Nach 20-minütiger Reaktionsdauer wird die Enzymaktivität durch 100 µl N NaOH blockiert und das Ablesen mit dem Axia-Microreader (Bio- Mérleux) bei 402 nm durchgeführt.
  • Aufnahmestelle: 5'-TCAGAGGAAGAAAACGATGA-3'
  • Target: Plasmid pBR322, enthaltend das Gen von PVH vom Typ 18 bis 20 µg/ml Tabelle 20 Verdünnung des Targets weiß Wert O.D.
  • Die Erkennungsgrenze liegt bei 1/2000 an Target (Tabelle 20), d.h. eine Größenordnung von 500 pg bzw. 1,8 10&supmin;¹&sup6; Mol.
    • BEISPIEL 28 Alkalische Phosphatase als Erkennungsenzym für die Fluoreszenz
  • Die Verfahrensweise ist die gleiche wie im Beispiel 27, wobei jedoch als Substrat 100 µl 4-Methylumbelliferylphosphat (MUP, Boehringer ref. 405663) in einem Glycinpuffer mit 100 mM NaOH, 1 mM MgCl&sub2;, 0,1 mM ZnCl&sub2;, 0,5 gil NaN&sub3; bei einem pH = 10,3 und in einer Konzentration von 80 µg/ml hinzugefügt werden.
  • Die Reaktion wird nach 20 Minuten durch 100 µl 0,5M KH&sub2;PO&sub4; bei einem pH von 10,4 und 10 mM EDTA blockiert, wonach die Ablesung mit dem Fluormeter (Erregung bei 340 nm, Emission bei 460 nm, siehe Tabelle 21) erfolgt. Tabelle 21 Targetverdünnung weiß Fluoreszenzeinheiten
    • BEISPIEL 29 Erkennung des Virus HIV 1 a) Region NEF
  • Zur Vermehrung werden die folgenden Sequenzen benutzt:
  • Startstelle 1 = 5'-CATTGGTCTTAAAGGTACCTG-3'
  • Startstelle 2 = 5'-AAGATGGGTGGCAAITGGTC-3'
  • Die Aufnahme- und Erkennungssonden sind wie folgt:
  • Aufnahme = 5'-GAGGAGGTIGGTTTTCCAGTCA-3'
  • Erkennung = 5'-GGATGGCCTICTITAAGGGAAAGAATG-3'
    • b) Region VPR
  • Zur Vermehrung werden die folgenden Sequenzen benutzt:
  • Startstelle 1 = 5'-TGGAACAAGCCCCAGIAGACC-3'
  • Startstelle 2 = 5'-TGCTATGTIGACACCCAATTCTG-3'
  • Die Aufnahme- und Erkennungssonden sind wie folgt:
  • Aufnahme = 5'-TATGAAACTTATGGGGATAC-3'
  • Erkennung = 5'-GAAGCTGTTAGACATTTTCCTAG-3'
    • c) Region POL
  • Die Aufnahme- und Erkennungssonden sind wie folgt:
  • Aufnahme = 5'-TGAACAAGTAGATAAATTAG-3'
  • Erkennung = 5'-GGAATCAGIAAAGTACTATT-3'

Claims (62)

1. Verfahren zur Erkennung einer Nukleotidsequenz als einfachen Targetstrang in einer Probe, die eine solche Sequenz enthält oder dazu befähigt ist, eine solche aufzunehmen oder zu enthalten auf Basis einer Sandwich-Hybridisierungsmethode, dadurch gekennzeichnet, daß die folgenden Schritte miteingeschlossen sind:
(a) inkubieren der Probe:
(i) mit einer auf einem festen Träger fixierten Aufnahmesonde, wobei der feste Träger aus einem hydrophoben Material gefertigt und die Aufnahmesonde aus einem Oligonukleotid besteht, das dazu befähigt ist, auf diesem festen Träger oder durch ein an ein Protein kovalent gebundenes Oligonukleotid durch Absorption fixiert zu werden und wobei dieses Oligonukleotid durch Adsorption auf diesem festem Träger entweder direkt oder mittels dieses Proteins fixiert wird, sofern letzteres vorhanden ist und wobei dieses Oligonukleotid 9-30 Nukleotide aufweist, und zwar mit der Maßgabe, daß, wenn die Aufnahmesonde aus einem nicht an ein Protein gebundenen Oligonukleotid besteht, dieses Oligonukleotid mindestens 11 Nukleotide aufweist sowie
(ii) mit einer Erkennungssonde, die mit einem nicht-radioaktiven Marker markiert ist, wobei die Aufnahme- und Erkennungssonden zur Hybridisierung befähigt sind, mit zwei nicht überlappenden Regionen der gesuchten Target-Nukleotidsequenz und schließlich
(b) Waschen des festen Trägers zur Entfernung der nicht fixierten Reaktanten durch Hybridisieren und
(c) Erkennen der Targetsequenz mittels der Erkennungsreaktion des auf dem Träger fixierten Markers.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das hydrophobe Material ein hydrophobes Polymer ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer ein Styrolpolymer oder Styrolcopolymer darstellt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligonukleotid höchstens 25, insbesondere höchstens 20 Nukleotide enthält.
5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß bei einer vorbestimmten Temperatur gearbeitet wird, daß die Aufnahmesonden und die Erkennungssonden eine ausreichende Länge und eine so große Sequenz besitzen und daß das Hybrid, das jeweils durch die Sonde mit dem gesuchten Target gebildet wird, bei dieser Temperatur unter den zum Einsatz gelangenden Hybridisierungsbedingungen stabil ist.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Aufnahmesonde und/oder die Erkennungssonde ausreichend kurz ist, und eine Sequenz von einer Größe besitzt, daß allein bei Anwesenheit einer Komplementärsequenz mit perfekter Entsprechung in dem Target die Bildung eines stabilen Hybrids bei dieser Temperatur unter den zum Einsatz gelangenden Hybridisierungsbedingungen mit dieser Sonde von hinreichender Kürze ermöglicht wird.
7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Inkubationsschritt bei dieser vorbestimmten Temperatur durchgeführt wird und das Waschen bei jener oder auch einer niedrigeren Temperatur erfolgt.
8. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Inkubationsschritt bei einer niedrigeren Temperatur als der vorbestimmten Temperatur durchgeführt wird und daß das Waschen bei der vorbestimmten Temperatur erfolgt.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5-8, dadurch gekennzeichnet, daß die vorbestimmte Temperatur zwischen 20 und 60ºC, insbesondere zwischen 25 und 40ºC beträgt und insbesondere 37ºC beträgt.
10. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkennungssonde mindestens 9 Nukleotide enthält.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkennungssonde mindestens 15 Nukleotide enthält.
12. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das aus der Aufnahmesonde und dem gesuchten Target gebildete Hybrid mindestens so stabil ist wie das aus dem Target mit der Erkennungssonde gebildete Hybrid.
13. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkennungssonde im Hinblick auf die Anzahl der Nukleotide länger ist als die Aufnahmesonde.
14. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Aufnahme- und/oder Erkennungssonde α-D-Nukleotide enthält oder aus solchen besteht.
15. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein Säugeralbumin oder bakterielles Eiweißtoxin ist.
16. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger in Form von Röhrchen, Kügelchen, Partikeln, oder einer kegelförmigen Pipettierspitze oder in Form von Mikrotiterplatten vorliegt.
17. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß nach der simultanen Sandwich-Hybridisierungsmethode gearbeitet wird.
18. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligonukleotid entweder eine perfekt homologe Sequenz der Komplementärsequenz des Targets oder eine Sequenz mit einem Gehalt an einer punktuellen Mutation in bezug auf die Komplementärsequenz des Targets darstellt.
19. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Target die DNA-Sequenz des Human-Papillomavirus HPV 18 darstellt und die Aufnahmesonde die Sequenz
TCAGAGGAAGAAAACGATGA.
20. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkennungssonde die Sequenz
TMGGCAACAIIGCAAGACA
enthält.
21. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche 1-18, dadurch gekennzeichnet, daß das Target eine Messenger-RNA-Sequenz darstellt, die dem β-Lactamasegen von E. Coli (Tem) entspricht und daß die Aufnahmesonde die folgende Sequenz enthält:
5'-GCACTGCATAATTCTT-3' oder
5'-TACTGTCATGCCATCC-3'
22. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkennungssonde die folgende Sequenz enthält:
5'-GTTGGCCGCAGTGTTAT-3' oder
5'-CACTCATGGTTATGGCA-3'.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-18, dadurch gekennzeichnet, daß das Target eine DNA-Sequenz darstellt, die ein β-Lactamasegen aus E. Coli enthält, und daß die Aufnahmesonde die folgende Sequenz enthält:
5'-GGATGGCATGACAGTA-3' oder
5'-AGAGAATTATGCAGTGC-3'
24. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkennungssonde die folgende Sequenz enthält:
5'-TGCCATAACCATGAGTG-3' oder
5'-ATAACACTGCGGCCAAC-3'
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-18, dadurch gekennzeichnet, daß das Target die dem Papillomavirus-Humantyp 6-Gen-E7 entsprechende DNA-Sequenz darstellt und daß die Aufnahmesonde die folgende Sequenz enthält:
5'-CAGTGTACAGAAACA-3' oder
5'-GAGTGCACAGACGGA-3'
26. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkennungssonde die folgende Sequenz enthält:
5'-GACCCTGTAGGGTTACATT-3' oder
5'-TGACCTGTTGCTGTGGA-3'
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-18, dadurch gekennzeichnet, daß das Target die dem Papillomavirus-Humantyp 11-Gen-E7 entsprechende DNA- Sequenz darstellt und daß die Aufnahmesonde die folgende Sequenz enthält:
5'-GAGTGCACAGACGGA-3' oder
5'-CAACTACAAGACCTTTTGC-3'
28. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkennungssonde die folgende Sequenz enthält:
5'-GACCCTGTAGGGTTACATT-3' oder
5'-TGACCTGTTGCTGTGGA-3'
29. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-18, dadurch gekennzeichnet, daß das Target die den E7-Genen des Papillomavirus-Humantyps 6 oder 11 entsprechende DNA-Sequenz darstellt und daß die Aufnahmesonde die folgende Sequenz aufweist:
5'-AGACAGCTCAGAAGATGAGG-3' oder
5'-CAGCAACGT(T/C)CGACTGGTTG-3'
30. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkennungssonde die folgende Formel enthält:
5'-GACCCTGTAGGGTTACATT-3' oder
5'-TGACCTGTTGCTGTGGA-3'
31. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-18, dadurch gekennzeichnet, daß das Target die dem Papillomavirus-Hurnantypl 6-Gen-E7 entsprechende DNA- Sequenz darstellt und daß die Aufnahmesonde die folgende Sequenz aufweist:
5'-TATATGTTAGATTTGCAACC-3' oder
5'-GACAACTGATCTCTAC-3'
32. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkennungssonde die folgende Formel enthält:
5'-CTCTACGCTTCGGTTGTGC-3' oder
5'-CCGGACAGAGCCCATTAC-3'
33. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-18, dadurch gekennzeichnet, daß das Target die dem Papillomavirus-Humantypl 8-Gen-E7 entsprechende DNA- Sequenz darstellt und daß die Aufnahmesonde die folgende Sequenz aufweist:
5'-TCAGAGGAAGAAAACGATGA-3' oder
5'-ATGTCACGAGCAATTAAGCG-3'
34. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkennungssonde die folgende Sequenz aufweist:
5'-GTATTGCATTTAGAGCCCCA-3' oder
5'-TAAGGCAACATTGCAAGACA-3'
35. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-18, dadurch gekennzeichnet, daß das Target die dem Papillomavirus-Hurnantypl 8 entsprechende DNA-Sequenz darstellt und daß die Aufnahmesonde die folgende Sequenz aufweist:
5'-TCAGAGGAAGAAAACGATGA-3'
36. Verfahren nach dem vorstehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkennungssonde die folgende Sequenz aufweist:
5'-TAAGGCAACATTGCAAGACA-3'
37. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-18, dadurch gekennzeichnet, daß das Target die dem größeren externen Mernbranproteingen (MOMP) von Chlamydia trachomatis entsprechende DNA-Sequenz darstellt und daß die Aufnahmesonde die folgende Sequenz enthält:
5'-GCCGCTTTGAGTTCTGCTTCC-3' oder
5'-CTTGCAAGCTCTGCCTGTGG-3'
38. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkennungssonde die folgende Sequenz enthält:
5'-AATCCTGGCTGAACCAAGCCT-3' oder
5'-AAGGTTTCGGCGGAGATCCT-3'
39. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-18, dadurch gekennzeichnet, daß das Target eine Sequenz darstellt, die in Form der DNA der gag-Region des Retrovirus' HIV1 entspricht und daß die Aufnahmesonde die folgende Formel aufweist:
5'-AATGTTAAAAGAGAC-3'
40. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkennungssonde die folgende Sequenz enthält:
5'-GAAGCTGCAGAATGGGA-3'
41. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-18, dadurch gekennzeichnet, daß das Target eine Sequenz darstellt, die in Form der DNA der gag-Region des Retrovirus' HIV2 entspricht und daß die Aufnahmesonde die folgende Sequenz aufweist:
5'-CTTACCAGCGGGGCAGC-3'
42. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkennungssonde die folgende Sequenz enthält:
5'-GAAGCTGCAGAATGGGA-3'
43. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-18, dadurch gekennzeichnet, daß das Target eine Sequenz darstellt, die in Form der DNA der env-Region des Retrovirus' HIV1 entspricht und daß die Aufnahrnesonde die folgende Sequenz aufweist:
5'-TGTCTG GTATAGTG CA-3'
44. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkennungssonde die folgende Sequenz enthält:
5'-AACAATTTGCTGAGGGCTAT-3'
45. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-18, dadurch gekennzeichnet, daß das Target eine Sequenz darstellt, die in Form der DNA der env-Region des Retrovirus' HIV2 entspricht und daß die Aufnahmesonde die folgende Sequenz enthält:
5'-GCAACAGCAACAGCTGTTGGA-3'
46. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkennungssonde die folgende Sequenz enthält:
5'-GGTCAAGAGACAACAAGAA-3'
47. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-18, dadurch gekennzeichnet, daß das Target eine Sequenz darstellt, die in Form der DNA der pol-Region des Retrovirus' HIV1 entspricht und daß die Aufnahmesonde die folgende Sequenz enthält:
5'-GACAATGGCAGCAATTTCACC-3'
48. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkennungssonde die folgende Sequenz enthält:
5'-GCCTGTTGGTGGGC-3'
49. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-18, dadurch gekennzeichnet, daß das Target die DNA-Sequenz darstellt, die dem Gen der β-Glucuronidase-Region von E. Coli entspricht und daß die Aufnahmesonde die folgende Sequenz aufweist:
5'-TGGCTTCTGTCAACGCTGTT-3' oder
5'-ATGCGATCTATATCACGCTG-3'
50. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkennungssonde die folgende Sequenz enthält:
5'-GATCGCGGTGTCAGTTCTTT-3' oder
5'-TTCCATGGGTTTCTCACAGA-3'
51. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-18, dadurch gekennzeichnet, daß das Target die DNA-Sequenz darstellt, die dem β-Humanglobingen entspricht und daß die Aufnahmesonde die folgende Sequenz aufweist:
5'-TGTTTACGCAGTCTGCCTAG-3' oder
5'-CACATATTGACCAAATCAGG-3'
52. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkennungssonde die folgende Sequenz aufweist:
5'-GTATCATGCCTCTTTGCACC-3' oder
5'-TTTCTGGGTTAAGGCAATAGC-3'
53. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-18, dadurch gekennzeichnet, daß das Target die DNA-Sequenz darstellt, die dem ras-Onkogen entspricht und daß die Aufnahmesonde die folgende Sequenz enthält:
5'-CAGTGCCATGAGAGACCAAT-3' oder
5'-CGACGCAGCCATGGTCGATGC-3'
-
54. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkennungssonde die folgende Sequenz enthält:
5'-TTCCTCTGTGTATTTGCCAT-3' oder
5'-ACATGAGGACAGGCGAAGGC-3'
55. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-18, dadurch gekennzeichnet, daß das Target die DNA-Sequenz vorn HPV-Typ-18 darstellt und daß die Aufnahmesonde die folgende Sequenz aufweist:
5'-TCAGAGGAAGAAAACGATGA-3'
56. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkennungssonde die folgende (α-Nukleotid)-Sequenz enthält:
α-Oligonukleotid 5'-ACCCCGAGATT
57. Verfahren nach einem der Anspriche 1-18, dadurch gekennzeichnet, daß das Target eine Sequenz darstellt, die der NEF-Region des Retrovirus' HIV1 entspricht und daß die Aufnahrnesonde die folgende Sequenz aufweist:
5'-GAGGAGGTTGGTTTTCCAGTCA-3'
58. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkennungssonde die Sequenz
5'-GGATGGCCTTCTTTAAGGGAAAGAATG-3'
enthält.
59. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-18, dadurch gekennzeichnet, daß das Target eine Sequenz darstellt, die der VPR-Region des Retrovirus' HIV1 entspricht und daß die Aufnahmesonde die Sequenz
5'-TATGAAACTTATGGGGATAC-3'
enthält.
60. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkennungssonde die Sequenz
5'-GAAGCTGTTAGACATTTTCCTAG-3'
enthält.
61. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-18, dadurch gekennzeichnet, daß das Target eine Sequenz darstellt, die der pol-Region des Retrovirus' HIV1 entspricht und daß die Aufnahmesonde die Sequenz
5'-TGAACAAGTAGATAAATTAG-3'
enthält.
62. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkennungssonde die Sequenz
5'-GGAATCAGIAAAGTACTATT-3'
enthält.
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