DE3854470T2

DE3854470T2 - Verfahren für Affinitätsuntersuchungen durch Verwendung von Ziel-Amplifizierung.

Info

Publication number: DE3854470T2
Application number: DE3854470T
Authority: DE
Inventors: Mark Leo Collins; Donald Neil Halbert; Walter King; Jonathan Michael Lawrie
Original assignee: BP Corp North America Inc
Current assignee: BP Corp North America Inc
Priority date: 1987-12-21
Filing date: 1988-12-21
Publication date: 1996-03-28
Anticipated expiration: 2008-12-22
Also published as: AU2735988A; JP2817926B2; EP0328829B1; JPH01211500A; DE3854470D1; ATE127854T1; EP0328829A3; EP0328829A2

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren, Reagentien, Zusammensetzungen, Kits und Vorrichtungen zur Verwendung zum Einfangen von Zielmolekülen. Insbesondere betrifft die Erfindung Verfahren, Reagentien, Zusammensetzungen und Kits zum Einfangen von Desoxyribonukleinsäure (DNA) oder Ribonukleinsäure (RNA) aus klinischen Proben. Ausführungsformen der Erfindung betreffen Verfahren zum raschen, empfindlichen Nachweis von Zielnukleinsäuren in klinischen Proben, die nichtradioaktiven Markierungstechniken und der Automatisierung angepaßt werden können.
Die folgenden Definitionen werden zur Erleichterung des Verständnisses der vorliegenden Erfindung gegeben. Der Ausdruck "biologisches Bindungspaar", wie er in der vorliegenden Anmeldung verwendet wird, betrifft jedes Paar von Molekülen, das eine natürliche Affinität oder Bindungsfähigkeit besitzt. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung betrifft der Ausdruck "Ligand" ein Molekül des biologischen Bindungspaares, und der Ausdruck "Antiligand" oder "Rezeptor" betrifft das entgegengesetzte Molekül des biologischen Bindungspaares. Beispielsweise können ohne Beschränkung Ausführungsformen der Erfindung auf Nukleinsäure-Hybridisierungsassays angewendet werden, bei denen das biologische Bindungspaar zwei Komplementärstränge einer Polynukleinsäure umfaßt. Einer der Stränge wird als Ligand bezeichnet und der andere Strang als der Antiligand bezeichnet. Jedoch kann das biologische Bindungspaar Antigene und Antikörper, Arzneimittel und Arzneimittel-Rezeptorstellen und Enzyme und Enzymsubstrate umfassen.
Der Ausdruck "Sonde" bezeichnet einen Liganden mit bekannten Qualitäten mit der Fähigkeit, selektiv an einen Ziel- Antiliganden zu binden. Bei Anwendung auf Nukleinsäuren bezeichnet der Ausdruck "Sonde" einen Strang einer Nukleinsäure mit einer Basensequenz, die der eines Zielstranges komplementär ist.
Der Ausdruck "Marker" bezeichnet eine Moleküleinheit mit der Fähigkeit zum Nachweis einschließlich beispielsweise und ohne Beschränkung radioaktiver Isotope, Enzyme, lumineszierender Mittel und Farbstoffe. Der Ausdruck "Mittel" wird in einem breiten Sinn verwendet und umfaßt jede Moleküleinheit, die an Reaktionen teilnimmt, die zu einer nachweisbaren Antwort führen. Der Ausdruck "Cofaktor" wird in einem breiten Sinne verwendet und umfaßt jede Moleküleinheit, die an den Reaktionen mit dem Mittel teilnimmt.
Der Ausdruck "wiedergewinnbar" wird in einem breiten Sinne verwendet und beschreibt eine Einheit, die in einem Medium wesentlich dispergiert werden kann und aus dem Medium durch Immobilisieren, Filtrieren, Verteilen oder dergleichen entfernt oder abgetrennt werden kann.
Der Ausdruck "Träger" umfaßt bei alleiniger Verwendung herkömmliche Träger, wie Filter und Membranen, sowie wiedergewinnbare Träger.
Der Ausdruck "reversibel" bedeutet in Bezug auf die Bindung von Liganden und Antiliganden Mittel mit der Fähigkeit zur Bindung oder Freisetzung bei Einführen von Veränderungen, die die gesamte chemische Natur der Liganden und Antiliganden nicht permanent ändern. Beispielsweise umfaßt, ohne Beschränkung, die reversible Bindung eine solche Bindung und Freisetzung, die durch Veränderungen des pH-Werts, der Temperatur und der Ionenstärke, die den Liganden oder Antiliganden nicht zerstören, kontrolliert werden.
Der Ausdruck "amplifizieren" wird in breitem Sinne verwendet und bedeutet die Erzeugung eines Amplifikationsproduktes, das beispielsweise zusätzliche Zielmoleküle oder dem Zielmolekül ähnliche Moleküle, die ähnlich dem Zielmolekül funktionieren können, oder ein Molekül, das anstelle des Zielmoleküls Detektionsstufen unterworfen wird, wobei die Moleküle durch die Anwesenheit des Zielmoleküls in der Probe erzeugt werden, umfassen kann. Wenn das Zielmoleküle ein Polynukleotid ist, können ein zusätzliches Zielmolekül oder ein dem Zielmolekül ähnliches Molekül oder nachweisbare Moleküle enzymatisch mit DNA- oder RNA-Polymerasen oder Transkriptasen erzeugt werden.
Die genetische Information wird in den lebenden Zellen in fadenähnlichen DNA-Molekülen gespeichert. In vivo ist das DNA-Molekül eine Doppelhelix, bei der jeder Strang aus einer Kette von Nukleotiden besteht. Jedes Nukleotid ist durch eine der vier Basen Adenin (A), Guanin (G), Thymin (T) und Cytosin (C) charakterisiert. Die Basen sind in dem Sinne komplementär, daß infolge der Orientierung der funktionellen Gruppen bestimmte Basenpaare einander über Wasserstoffbrückenbindungen anziehen und aneinander binden. Adenin in einem DNA-Strang paart mit Thymin in einem gegenüberliegenden Komplementärstrang. Guanin in einem DNA- Strang paart mit Cytosin in einem gegenüberliegenden Komplementärstrang. In der RNA ist die Base Thymin durch Uracil (U) ersetzt, welches mit Adenin in einem gegenüberliegenden Komplementärstrang paart.
Die DNA besteht aus covalent verknüpften Desoxyribonukleotidketten, und die RNA besteht aus covalent verknüpften Ribonukleotidketten. Der genetische Code eines lebenden Organismus ist auf dem DNA-Strang in der Sequenz der Basenpaare gespeichert.
Jede Nukleinsäure wird durch eine Phosphordiesterbrücke zwischen der 5'-Hydroxylgruppe des Zuckers eines Nukleotids und der 3'-Hydroxylgruppe des Zuckers eines benachbarten Nukleotids verknüpft. Jeder lineare Strang natürlich vorkommender DNA oder RNA besitzt ein terminales Ende mit einer freien 5'-Hydroxylgruppe und ein anderes terminales Ende mit einer 3'-Hydroxylgruppe. Die terminalen Enden der Polynukleotide werden oft als 5'-Enden oder 3'-Enden, bezogen auf die jeweilige freie Hydroxylgruppe, bezeichnet. Komplementärstrange von DNA und RNA bilden antiparallele Komplexe, in denen das 3'-terminale Ende eines Stranges auf das 5'-Ende des gegenüberliegenden Stranges orientiert ist.
Nukleinsäure-Hybridisierungsassays basieren auf der Tendenz von zwei Nukleinsäuresträngen, in komplementären Regionen zu paaren. Gegenwärtig werden Nukleinsäure-Hybridisierungsassays in erster Linie verwendet, um einzigartige DNA- oder RNA-Basensequenzen oder spezielle Gene in einem vollständigen DNA-Molekül in Gemischen von Nukleinsäuren oder in Gemischen von Nukleinsäurefragmenten zu detektieren und zu identifizieren.
Die Identifikation einzigartiger DNA- oder RNA-Sequenzen oder spezifischer Gene aus der Gesamtheit der aus Gewebs- oder Kulturproben extrahierten DNA oder RNA kann das Vorliegen von physiologischen oder pathologischen Zuständen anzeigen. Insbesondere kann die Identifikation einzigartiger DNA- oder RNA-Sequenzen oder spezieller Gene aus der Gesamtheit der aus menschlichem oder tierischem Gewebe extrahierten DNA oder RNA das Vorliegen von genetischen Erkrankungen oder Zuständen, wie Sichelzellanämie, Gewebsverträglichkeit, Krebs und präcancerösen Zuständen oder bakterieller oder viraler Infektion anzeigen. Die Identifikation einzigartiger DNA- oder RNA-Sequenzen oder spezielle Gene aus der Gesamtheit der aus bakteriellen Kulturen oder Bakterien-enthaltendem Gewebe extrahierten DNA oder RNA kann das Vorliegen von Antibiotikaresistenz, Toxinen, Viren oder Plasmiden anzeigen oder eine Identifizierung zwischen den Bakterientypen ermöglichen.
So besitzen Nukleinsäure-Hybridisierungsassays ein großes Potential bei der Diagnose und beim Nachweis einer Erkrankung. Ein weiteres Potential liegt in der Landwirtschaft und in der Lebensmittelverarbeitung, wobei Nukleinsäure-Hybridisierungsassays verwendet werden können, um eine pflanzliche Pathogenese oder Toxin-produzierende Bakterien nachzuweisen.
Eines der am häufigsten verwendeten Nukleinsäure-Hybridisierungsassayverfahren ist als das Southern-Blot-Filter-Hybridisierungs-Verfahren oder einfach das Southern-Verfahren (Southern, E., J. Mol. Biol. I. 98,503, 1975) bekannt. Das Southern-Verfahren wird verwendet, um Ziel-DNA- oder -RNA- Sequenzen zu identifizieren. Dieses Verfahren wird im allgemeinen durch Immobilisieren von Proben-RNA oder -DNA an Nitrocellulosefolien durchgeführt. Die immobilisierte Proben-RNA oder -DNA wird mit radioaktiv markierten Sondensträngen von DNA mit einer Basensequenz, die der Zielsequenz komplementär ist und eine nachweisbare radioaktive Einheit trägt, in Kontakt gebracht. Man läßt die Hybridisierung zwischen der Sonde und der Proben-DNA stattfinden.
Das Hybridisierungsverfahren ist im allgemeinen sehr spezifisch. Die markierte Sonde verbindet sich mit Proben-DNA oder -RNA, wenn die zwei Nukleotideinheiten nicht einen im wesentlichen komplementären Basenpaar-Organisationsstandard teilen. Die Hybridisierung kann 3 bis 48 Stunden in Abhängigkeit von den gegebenen Bedingungen dauern.
Jedoch kommt es in der Praxis immer zu einer nichtspezifischen Bindung der markierten Sonde an Träger, was als "Hintergrundrauschen" bei der Detektion erscheint. Das Hintergrundrauschen verringert die Empfindlichkeit eines Assays. Nichthybridisierte DNA-Sonde wird anschließend weggewaschen. Die Nitrocellulosefolie wird auf eine Folie eines Röntgenfilms gegeben und exponieren gelassen. Der Röntgenfilm wird entwickelt, wobei die exponierten Flächen des Films DNA-Fragmente identifizieren, die mit der DNA-Sonde hybridisiert hatten und daher die Basensequenz von Interesse tragen.
Die Verwendung von radioaktiven Markierungsmitteln zusammen mit den Southern-Assay-Techniken erlaubte die Anwendung von Nukleinsäureassays auf klinische Proben. Der radioaktive Zerfall ist selbst in klinischen Proben, die fremdes proteinartiges und organisches Material enthalten, nachweisbar. Jedoch kann das Vorliegen von fremdem proteinartigem und organischem Material zur unspezifischen Bindung der Sonde an den festen Träger beitragen. Ferner benötigt die Verwendung von radioaktiven Markierungstechniken eine lange Expositionszeit, um die Banden auf dem Röntgenfilm sichtbar zu machen. Ein typisches Southern-Verfahren kann 1 bis 7 Tage für die Exposition benötigen. Die Verwendung von radioaktiven Markierungsmitteln benötigt ferner spezielle Laborverfahren und Genehmigungen.
Die vorstehenden Probleme im Zusammenhang mit Assays mit radioaktiven Markern führten zur Entwicklung von Techniken, bei denen nichtisotope Marker verwendet werden. Beispiele für nichtisotope Marker umfassen Enzyme, lumineszierende Mittel und Farbstoffe. Lumineszierende Marker emittieren nach Anregung durch eine externe Energiequelle Licht und können in Abhängigkeit von der Quelle der Anregungsenergie in Kategorien gruppiert werden, welche umfassen: radiolumineszierende Marker, die Energie aus hochenergetischen Teilchen ableiten; chemilumineszierende Marker, die Energie aus chemischen Reaktionen erhalten; biolumineszierende Marker, bei denen die Anregungsenergie in einem biologischen System angewendet wird; und photolumineszierende oder fluoreszierende Marker, die durch Einheiten von elektromagnetischer Bestrahlung (Photonen) von infrarotem, sichtbarem oder ultraviolettem Licht anregbar sind. Vergleiche im allgemeinen Smith et al., Ann. Clin. Biochem., 18 : 253, 274 (1981).
Nichtisotope Assaytechniken, bei denen durch nichtradioaktive Energiequellen anregbare Marker verwendet werden, vermeiden die Gesundheitsgefahren und die Zulassungsprobleme, auf die man bei den Assaytechniken mit den Radioisotopen als Markern trifft. Ferner versprechen nichtisotope Assaytechniken einen raschen Nachweis, bei dem die lange Expositionszeit im Zusammenhang mit der Verwendung eines Röntgenfilms vermieden wird.
Jedoch haben die nichtisotopen Assays nicht die Empfindlichkeit oder Spezifität den Assayverfahren verliehen, die notwendig sind, damit sie als zuverlässig gelten. Bei Lumineszensassays kann das Vorliegen von Proteinen oder anderer Moleküle, die in biologischen Proben vorhanden sind, eine Brechung des anregenden Lichts verursachen oder Licht im Emissionsspektrum des lumineszierenden Markers absorbieren, was zu einem Löschen der Lumineszenssonde führt.
In enzymatischen Assays kann das Vorliegen von Proteinen und anderen Molekülen, die in biologischen Proben vorhanden sind, die Aktivität des Enzyms stören.
Auf ähnliche Weise kann bei kolorimetrischen Assays die Farbveränderung gegenüber Proteinen und anderen Materialien, die in biologischen Proben vorhanden sind, nicht nachweisbar sein.
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung betreffen das Einfangen von Zielmolekülen und des Hintergrunds auf Trägern und auf wiedergewinnbaren Trägern einschließlich Magnetteilchen. Magnetteilchen wurden als Träger für die Synthese von organischen Verbindungen einschließlich Oligomeren, wie DNA, RNA, Polypeptiden und anderer Moleküle mit vielen Einheiten, die definierte Sequenzen besitzen, vorgeschlagen. Vergleiche beispielsweise europäische Patentanmeldung Nr. 83 112 493.8 von Steven A. Benner und Genetics Institute. Jedoch wurden Magnetteilchen nicht als wiedergewinnbare Träger für den zielgerechten Einfang und die Entfernung des Hintergrunds vorgeschlagen.
Eine andere Verwendung von Magnetteilchen umfaßte magnetische Flüssigkeiten im Blut, R. Neubauer, IEEE transactions on magnetics MAG-9, 445 (1973); die Befestigung von funktionellen Gruppen zur Trennung von Biomolekülen, U.S. Patent Nr. 3 970 518 von I. Giaver; die Markierung von Zelloberflächenrezeptoren, S. Margel et al., Jour. Imm. Meth. 28 : 341-53 (1979); die Bindung von Arzneimitteln für die magnetische zielgerechte Bindung während der Therapie, A. Senyei et al., J., App. Phys., 49 (6): 3578 (1978), K. Wieder et al., Pro. Soc. of Exp. Bio. Med. 58 : 141 (1978), K. Mosbach und U. Shroeder, FEBS letters 102 : 112 (1979); die selektive Trennung von Viren, Bakterien und anderen Zellen, R. Molday et al., Nature 268 : 438 (1977); und die Einarbeitung von Magnetteilchen als Träger bei der Affinitätsgelchromatographie für biologische Polymere, K. Mosbach und L. Anderson, Nature 270 : 359 (1977).
Die Verwendung eines Zweisondensystems zum zielgerechten Einfang auf herkömmlichen nicht-wiedergewinnbaren Trägern wurde in einem Artikel mit den Autoren Ann-Christine Syuänen, Matti Laaksonen und Hans Söderlund und dem Titel "Fast Quantification of Nucleic Acid Hybrids by Affinity-Based Hybrid Collection"; Nucleic Acids Research, 14(12): 5037 (1986) vorgeschlagen.
Die EP-A-0 265 244 beschreibt Methoden für den Einfang von Zielmolekülen und Hintergrund und eine Vorrichtung für Affinitätsassays.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren, Reagentien, Zusammensetzungen, Kits und Vorrichtungen zur Durchführung von Assays zur zielgerechten Bindung von Molekülen von Interesse bereitzustellen. Weitere Aufgaben werden nachstehend dargelegt. Der Einfachheit halber können ohne Beschränkung die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung in die Bereiche zielgerechter Einfang, Hintergrundeinfang und Kombinationen davon aufgeteilt werden.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Amplifikation eines möglicherweise in einer Probe mit Nicht-Ziel-Polynukleotiden vorhandenen Ziel-Polynukleotid-Moleküls, umfassend die Stufen:
a. Inkontaktbringen der möglicherweise das Zielmolekül enthaltenden Probe mit einem ersten Träger und einer ersten Sonde mit der Fähigkeit, speziell mit dem Zielmolekül unter bindenden Bedingungen zu assoziieren, und weiterhin mit der Fähigkeit, mit dem ersten Träger unter bindenden Bedingungen zu assoziieren;
b. Trennung des ersten Trägers von der verbleibenden Probe unter Bildung eines Entfernungsprodukts, das bei Anwesenheit des Zielmoleküls das Zielmolekül umfaßt;
c. Unterwerfen des Entfernungsprodukts der Amplifikation, die bei Anwesenheit des Zielmoleküls ein Amplifikationsprodukt bildet.
Die Erfindung betrifft auch ein Kit zum Einfangen und Amplifizieren eines Ziel-Polynukleotids, das in einem Probenmedium enthalten ist, das möglicherweise das Zielmolekül mit Nicht-Ziel-Polynukleotiden enthält, umfassend:
a) eine erste Sonde mit der Fähigkeit, an einen Träger und das Zielmolekül unter bindenden Bedingungen zu binden;
b) einen Träger mit der Fähigkeit, eine im wesentlichen homogene Dispersion in einem Probenmedium zu bilden, und mit der Fähigkeit zur Abtrennung davon unter Bildung eines Entfernungsprodukts, das bei Anwesenheit des Zielmoleküls in der Probe das Zielmolekül umfaßt; und
c) Amplifikationsreagentien, die der Anwendung auf das Entfernungsprodukt angepaßt sind.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Vorrichtung zur Durchführung von Assays auf die gemäß dem vorstehend definierten Verfahren Ziel-Polynukleotide umfassend:
eine Reaktionskammer, die der Aufnahme von Ziel-Polynukleotiden und Nicht-Ziel-Polynukleotiden in einem Probenmedium angepaßt ist, und einen Träger mit der Fähigkeit zur im wesentlichen homogenen Dispersion in dem Probenmedium und der Fähigkeit zur Bildung eines Komplexes mit dem Zielmolekül;
Mittel zur Abtrennung des Trägers von dem Probenmedium unter Bildung eines Entfernungsprodukts, das bei Anwesenheit des Zielmoleküls in dem Medium das Zielmolekül enthält, wobei das Entfernungsprodukt im wesentlichen frei von Nicht-Ziel-Polynukleotiden ist;
Mittel zur Amplifikation des Zielmoleküls als Teil eines Entfernungsprodukts unter Bildung eines Amplifikationsproduktes; und
Mittel zum Nachweis des Amplifikationsproduktes.
Bezüglich des Einfangs eines Zielmoleküls betrifft eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Einfang- und Freisetzungszyklen zur Isolierung der Zielmoleküle. Bei dem Verfahren wird ein Probenmedium, das möglicherweise die Zielmoleküle enthält, mit Sonden und einem Träger, der assoziiert ist oder die Fähigkeit besitzt, mit mindestens einer Sonde unter bindenden Bedingungen zu assoziieren, in Kontakt gebracht. Die Sonden können selektiv und reversibel an das Zielmolekül binden, wobei ein Komplex einschließlich der Zielsonde und des ersten wiedergewinnbaren Trägers gebildet wird. Dann wird der Träger von dem Probenmedium abgetrennt und mit einem zweiten Medium in Kontakt gebracht. Dann wird der Träger Freisetzungsbedingungen unterworfen, um das Zielmolekül von dem Träger freizusetzen, und dann wird der Träger von dem zweiten Medium abgetrennt. Dann wird ein zweiter Träger mit dem zweiten Medium unter bindenden Bedingungen in Kontakt gebracht. Der zweite Träger ist mit mindestens einer Sonde mit der Fähigkeit, selektiv an das Zielmolekül zu binden, assoziiert oder kann damit assoziieren. Unter bindenden Bedingungen bildet das Zielmolekül einen Komplex mit der mit dem zweiten Träger assoziierten Sonde zur weiteren Verarbeitung.
Bevorzugt ist der erste Träger in dem Sinne wiedergewinnbar, daß er zur im wesentlichen homogenen Dispersion innerhalb des Probenmediums befähigt ist und im wesentlichen physikalisch abgetrennt, wiedergewonnen oder in dem Probenmedium immobilisiert werden kann.
Die Trennung des ersten Trägers von dem ersten Medium entfernt unspezifisch gebundene Zelltrümmer, die an den ersten Träger gebunden sind. Die weitere Bindung des Zielmoleküls an einen zweiten Träger konzentriert weiterhin das Zielmolekül zum Nachweis und erlaubt weitere Freisetzungs-Einfangzyklen zur größeren Reinigung.
Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens betrifft einen wiedergewinnbaren Träger. Bei dem Verfahren wird die möglicherweise die Ziel-Nukleinsäure enthaltende Probe mit einem wiedergewinnbaren Träger zusammen mit einer Sondeneinheit in Kontakt gebracht. Der wiedergewinnbare Träger ist zur im wesentlichen homogenen Dispersion in einem Probenmedium befähigt. Die Sondeneinheit kann mit dem wiedergewinnbaren Träger beispielsweise durch covalente Bindung der Sondeneinheit an den wiedergewinnbaren Träger, durch Affinitätsassoziation, Wasserstoffbindung oder nichtspezifische Assoziation assoziiert sein
Der Träger kann viele Formen annehmen einschließlich beispielsweise Nitrocellulose, die zu teilchenförmiger Form verkleinert ist und nach Leiten des Probenmediums, das den Träger enthält, durch ein Sieb wiedergewinnbar ist; Nitrocellulose oder mit Magnetteilchen imprägnierte Materialien oder dergleichen, die eine Wanderung der Nitrocellulose in dem Probenmedium nach Anbringen eines Magnetfeldes erlauben, Kügelchen oder Teilchen, die filtriert werden können oder elektromagnetische Eigenschaften zeigen und Polystyrolkügelchen, die sich auf der Oberfläche eines wäßrigen Mediums verteilen.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt einen wiedergewinnbaren Träger, umfassend Magnetkügelchen, die durch ihre Fähigkeit gekennzeichnet sind, im wesentlichen homogen in einem Probenmedium dispergiert zu sein. Bevorzugt tragen die Magnetkügelchen primäre Amin- oder Carboxylfunktionen, die die covalente Bindung oder Assoziation einer Sondeneinheit an magnetische Trägerteilchen erleichtern. Bevorzugt sind die magnetischen Trägerkügelchen, Magnete mit einer einzelnen Domäne und sind superparamagnetisch ohne Restmagnetismus. Die erste Sonde umfaßt einen Sondenliganden mit der Fähigkeit, spezifisch an einen Antiliganden unter bindenden Bedingungen zu binden. Der wiedergewinnbare Träger kann im wesentlichen homogen in den Probenmedien verteilt werden und umfaßt mindestens einen Antiligandteil mit der Fähigkeit, an den Liganden unter bindenden Bedingungen zu binden, wodurch ein Zielmolekül- Sonde-Trägerkomplex gebildet wird. Dann werden der wiedergewinnbare Träger und das Probenmedium getrennt, um die weitere Verarbeitung des Probenmediums zu erlauben.
Ausführungsformen der Erfindung sind geeignet, Zielmoleküle aus einem klinischen Probenmedium, das Fremdmaterial enthält, einzufangen. Die Reihenfolge, in der das Probenmedium mit der Sonde oder dem wiedergewinnbaren Träger in Kontakt gebracht wird, kann gewählt werden. Jedoch kann die Wahl durch die Bindungskinetiken zwischen der Sonde und dem Zielmolekül einerseits und zwischen dem Sondenliganden und dem Träger-Antiliganden andererseits beeinflußt werden.
Bei Anwendung auf Polynukleotid-Zielmoleküle und homopolymere Liganden und Antiliganden ist die Homopolymer-Liganden- und Antiliganden-Bindung im allgemeinen schneller als die Sondenbindung an das Zielmolekül. Die Sondenbindung an das Zielmolekül wird sterisch verschlechtert, nachdem der Sondenligand an den Träger-Antiliganden gebunden ist. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das Probenmedium mit dem Reagens in Kontakt gebracht, und das Gemisch Hybridisierungsbedingungen unterworfen. Dann wird der wiedergewinnbare Träger in dem Reagens und dem Probenmedium dispergiert, was die Bildung eines Zielmolekül-Sondenkomplexes vor der Bildung der Sonde-Trägerkomplexe erlaubt.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Mehrfachsondensystem.
Bevorzugt umfaßt das Verfahren ein Reagens einschließlich einer ersten Sonde, wie vorstehend beschrieben, und mindestens einer zweiten Sonde mit der Fähigkeit, an das Zielmolekül zu binden, und mit nachweisbaren Markereinheiten. Die zweite Sonde kann einen Zielmolekül-(erste und zweite)- Sonde-Trägerkomplex bilden. Die Stufe der Trennung des wiedergewinnbaren Trägers von dem Probenmedium entfernt nicht nur Fremdmaterial von dem Zielmolekül-(erste und zweite)- Sonde-Trägerkomplex, sondern trennt auch jede zweite Sonde, die nicht an das Zielmolekül gebunden ist, ab. Die zweite nicht an das Zielmolekül gebundene Sonde trägt zum Hintergrundrauschen bei, falsche Signale, die die Anwesenheit des Zielmoleküls anzeigen.
Die weitere Verarbeitung kann die Freisetzung des Zielmolekül-(erste und zweite) -Sonde-Komplex aus dem wiedergewinnbaren Träger in ein zweites Medium und die erneute Bindung des Zielmolekül-(erste und zweite) -Sonde-Komplex an einen neuen Träger umfassen. Der erste wiedergewinnbare Träger kann unspezifisch gebundene Materialien tragen, die die Assayverfahren stören können. So kann nach der Freisetzung des Zielmolekül-Sonde-Komplexes aus dem wiedergewinnbaren Träger und der Entfernung der wiedergewinnbaren Träger ein zweiter Träger mit einer Antiligandeneinheit mit der Fähigkeit, an den Sondenliganden zu binden, in Kontakt mit dem Zielmolekül-Sonde-Komplex unter bindenden Bedingungen gebracht werden, um einen weiteren Zyklus der Bindung des Zielmoleküls an die Sonde oder des Einfangs für die weitere Reinigung und Konzentrierung des Zielmolekül-Sonde-Komplexes zu bewirken.
Die weitere Verarbeitung kann den Einfang des Hintergrunds umfassen. Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt ein Verfahren, bei dem die zweite Sonde eine zweite Ligandeneinheit besitzt. Das Verfahren umfaßt weiterhin einen Hintergrundträger mit einer zweiten Antiligandeneinheit. Die zweite Ligandeneinheit und die zweite Antiligandeneinheit können unter bindenden Bedingungen nur dann stabil binden, wenn die zweite Sonde nicht an das Zielmolekül gebunden ist. Das Verfahren umfaßt weiterhin eine Stufe, bei der ein Medium, das möglicherweise eine zweite Sonde, die nicht an das Zielmolekül bindet, enthält, mit einem Hintergrundträger unter bindenden Bedingungen in Kontakt gebracht wird. Dann wird der Hintergrundträger von dem Medium entfernt, um die nichtgebundene zweite Sonde zu entfernen, wodurch das Hintergrundrauschen verringert wird.
Der Ausdruck "Hintergrundträger" wird in herkömmlichem Sinne verwendet und umfaßt Filter und Membranen sowie wiedergewinnbare Träger. Die Bindung an den Hintergrundträger braucht nicht umkehrbar zu sein.
Ein bevorzugter wiedergewinnbarer Träger umfaßt beispielsweise ohne Beschränkung Teilchen, Körnchen, Kügelchen oder Fasern mit der Fähigkeit zur Dispersion in und Trennung aus einem Medium. Verfahren zur Trennung umfassen beispielsweise ohne Beschränkung Filtration, Zentrifugation, Präzipitation, Oberflächenflotation, Absetzen oder die Anlegung von elektromagnetischen Feldern.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auf Polynukleotid-Zielmoleküle angewandt werden. Bevorzugt binden die ersten und zweiten Sonden rasch an ein Polynukleotid-Zielmolekül "in Lösung" im Gegensatz zu der Situation, bei der entweder das Zielmolekül oder die Sonde immobilisiert sind.
Der wiedergewinnbare Träger, der in einer Lösung im wesentlichen dispergiert werden kann, erlaubt Wechselwirkungen zwischen dem wiedergewinnbaren Träger und Sonden, die eine Hybridisierung "in Lösung" nachahmen. In Lösung kann die Hybridisierung in etwa 3 bis 15 Minuten vollendet werden. Die raschen Hybridisierungen und die Einfachheit der erfindungsgemäßen Verfahren erlauben eine Automatisierung. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die Trennung -von Nukleinsäuresequenzen, die in klinischen Proben vorhanden sind, von Fremdmaterial, was die Anwendung der Verfahren auf nichtisotope Markierungstechniken erlaubt.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, bei der das Zielmolekül ein Polynukleotid ist, umfaßt das Inkontaktbringen eines Probenmediums mit einem Reagens unter bindenden Bedingungen. Das Reagens umfaßt mindestens eine erste Polynukleotidsonde und mindestens eine zweite Polynukleotidsonde. Die erste Sonde kann einen Komplex mit dem Zielmolekül binden und besitzt eine erste homopolymere Ligandeneinheit. Die zweite Sonde kann einen Komplex mit dem Zielmolekül zusätzlich zu der ersten Sonde bilden. Die zweite Sonde umfaßt eine Markereinheit, die eine zweite homopolymere Ligandeneinheit besitzt, die sich von dem ersten homopolymeren Liganden der ersten Sonde unterscheidet. Dann werden das Reagens und das Probenmedium mit einem Hintergrundträger und einem Träger zum Einfangen des Zielmoleküls in Kontakt gebracht. Der Hintergrundträger umfaßt mindestens eine zweite homopolymere Antiligandeneinheit mit der Fähigkeit, an die zweite homopolymere Ligandeneinheit der zweiten Sonde zu binden, wenn die zweite Sonde an das Zielmolekül nicht gebunden ist. Der Träger zum Einfangen des Zielmoleküls umfaßt mindestens eine erste homopolymere Einheit mit der Fähigkeit, an die erste homopolymere Ligandeneinheit der ersten Sonde zu binden. Der Hintergrundträger und der Träger zum Einfang des Zielmoleküls entfernen das Hintergrundrauschen, und der Träger zum Einfang des Zielmoleküls konzentriert weiterhin den Zielmolekül-(erste und zweite)-Sonde-Komplex für die weitere Verarbeitung und trennt den Zielmolekül-(erste und zweite)-Sonde-Komplex von den Zelltrümmern. Die weitere Verarbeitung umfaßt die Detektion der Markereinheit, die das Vorhandensein des Zielmoleküls anzeigt. Was nun genauer die Ausführungsformen der Erfindung, die sich auf das Einfangen des Hintergrunds beziehen, betrifft, so umfaßt eine Ausführungsform bin Verfahren, bei dem eine Sonde und ein Zielmolekül einen Komplex bilden können. Als nächster Schritt wird die nichtkomplezierte Sonde mit einem Träger unter bindenden Bedingungen in Kontakt gebracht. Der Träger kann selektiv die nicht-gebundene Sonde binden. Dann wird der Träger von dem Sonde-Zielmolekül-Komplex abgetrennt.
Eine noch weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt ein Verfahren zur Abtrennung einer Vielzahl von Zielmolekülen für die weitere Verarbeitung.
Eine Ausführungsform umfaßt die stufenweise Zugabe und Entfernung von Sonden, die für Zielmoleküle spezifisch sind, auf einer Vielzahl von Trägern. Eine weitere Ausführungsform umfaßt ein Verfahren, bei dem man eine Probe mit einer ersten Reihe von Sonden in Kontakt bringt und das Zielmolekül und die Sonde auf einer Vielzahl von Trägern einfängt. Die erste Reihe von Sonden umfaßt einen Liganden mit der Fähigkeit zur Assoziation mit dem Träger. Die erste Reihe von Sonden umfaßt Sonden für die gesamte Vielzahl von Zielmolekülen, die an Träger, die für jedes Zielmolekül spezifisch sind, binden können. Die Träger können voneinander abgetrennt werden, wobei deren Trennung dazu führt, daß einzelne Gruppen von Zielmolekülen mit dem Träger isoliert werden.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt eine Reagenszusammensetzung. Die Reagenszusammensetzung umfaßt eine erste Sonde und eine zweite Sonde. Die erste Sonde kann mit einem Zielmolekül einen Komplex bilden und umfaßt eine Sonde-Ligand-Einheit mit der Fähigkeit, spezifisch an den Antiliganden unter bindenden Bedingungen zu binden. Die zweite Sonde kann einen Komplex mit dem Zielmolekül bilden und umfaßt eine detektierbare Markereinheit. Die Reagenszusammensetzung kann verwendet werden, um das Zielmolekül in einem Probenmedium bei Verwendung mit einem wiedergewinnbaren Träger mit Antiligandeneinheiten einzufangen und nachzuweisen.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Reagenszusammensetzung umfaßt eine zweite Sonde mit einer zweiten Ligandeneinheit mit der Fähigkeit, stabil an den Antiliganden nur dann zu binden, wenn die zweite Sonde an das Zielmolekül nicht gebunden ist. Die Reagenszusammensetzung erlaubt die Verringerung des Hintergrundrauschens dadurch, daß man die möglicherweise eine nicht-gebundene zweite Sonde enthaltende Probe mit einem Hintergrundträger mit einer zweiten Antiligandeinheit in Kontakt bringt.
Eine weitere Ausführungsform umfaßt einen Träger mit der Fähigkeit, im wesentlichen homogen in einem Probenmedium zu dispergieren, und besitzt Oligonukleotid-Antiliganden, die der Bindung an Oligonukleotidliganden auf Sonden angepaßt sind.
Eine bevorzugte Ausführungsform des Trägers umfaßt beispielsweise Teilchen, Körnchen, Fasern und Kügelchen, die abgetrennt werden können. Mittel zur Abtrennung umfassen beispielsweise ohne Beschränkung, Präzipitation, Absetzen, Flotation, Filtration, Zentrifugation und Elektromagnetismus.
Eine bevorzugte Ausführungsform umfaßt Polystyrolkügelchen mit einem Durchmesser zwischen 10 und 100 um, die im wesentlichen in einem Medium homogen dispergiert werden können und daraus durch Filtration oder Flotation abgetrennt werden können. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform umfaßt ferromagnetische Kügelchen. Ein ferromagnetisches Kügelchen, das unter dem Warenzeichen BIO-MAG verkauft wird, kann im wesentlichen homogen in einem wäßrigen Medium dispergiert werden und kann durch ein elektromagnetisches Feld gewonnen oder immobilisiert werden. Das ferromagnetische Kügelchen umfaßt einen Eisenkern, der mit einem reaktiven Aminüberzug beschichtet ist. Die Kügelchen sind im allgemeinen kugelförmig und besitzen einen Durchmesser von 1 Mikrometer. Die Polystyrolkügelchen und die ferromagnetischen Kügelchen werden so behandelt, daß sie Antiligandeneinheiten umfassen.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt ein Kit zur Durchführung von Assays auf Zielmoleküle, die Teil eines biologischen Bindungspaares sind. In dem Fall, in dem das Zielmolekül ein Polynukleotid mit einer spezifischen Basensequenz ist, umfaßt das Kit ein Reagens, bei dem das Reagens eine erste Polynukleotidsonde und eine zweite Polynukleotidsonde umfaßt. Die ersten und zweiten Sonden können an wechselseitig ausschließliche Teile des Zielmoleküls binden, wobei ein Komplex gebildet wird, bei dem beide Sonden an das Zielmolekül gebunden sind. Die erste Sonde kann reversibel an einen ersten Träger unter bindenden Bedingungen binden, und die zweite Sonde umfaßt eine Markereinheit, die nachgewiesen werden kann. Das Kit umfaßt weiterhin einen ersten Träger, der die Komplexbildung des Trägers mit dem Zielmolekül und den Sonden erlaubt, die selektiv von dem Probenmedium abgetrennt werden können.
Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kits umfaßt eine zweite Sonde und einen Hintergrundträger. Die zweite Sonde kann, wenn sie nicht an das Zielmolekül gebunden ist, selektiv an einen Hintergrundträger binden. Der Hintergrundträger kann von einem Medium, das ein Reagens enthält, entfernt werden, um die nichtspezifisch gebundene zweite Sonde zu entfernen.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt eine Vorrichtung zur Durchführung der Assays gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren. Wenn das Zielmolekül ein Polynukleotid ist, umfaßt die Vorrichtung eine Reaktionskammer, die so angepaßt ist, daß sie das Reagens und das Zielmolekül in einem im wesentlichen homogen vermischten Zustand aufnehmen kann. Das Reagens umfaßt eine erste und eine zweite Polynukleotidsonde. Jede Sonde kann an wechselseitig ausschließende Teile des Zielmoleküls binden, wobei ein Komplex gebildet wird, bei dem beide Sonden an das Zielmolekül gebunden sind. Die erste Sonde kann reversibel an einen ersten Träger unter bindenden Bedingungen binden, und die zweite Sonde umfaßt eine nachweisbare Markereinheit. Die Vorrichtung umfaßt weiterhin Mittel, um einen ersten Träger mit dem Reagens und der Probe in Kontakt zu bringen, wobei die erste Sonde und der Zielmolekül-Sonde-Komplex an den Träger gebunden werden können. Die Vorrichtung umfaßt weiterhin Mittel, um die Probe, das Reagens und den Träger unter bindende Bedingungen zu bringen, wodurch an den Träger gebundene Zielmolekül-Sonde-Komplexe gebildet werden. Die Vorrichtung umfaßt weiterhin Mittel, um die erste Sonde unter Freisetzungsbedingungen zu bringen. Schließlich umfaßt die Vorrichtung Mittel zur Abtrennung des Trägers von der Probe und von dem Reagens.
Der Ausdruck "Reaktionsgefäß" wird in einem breiten Sinne verwendet, um jede Art von Behältnis zu umfassen, und umfaßt beispielsweise ohne Beschränkung Küvetten, Reagensgläser, Kapillaren und dergleichen.
Geeignete Mittel, um die Probe, das Reagens und den Träger unter bindende Bedingungen zu bringen, oder um das Reagens und den Träger unter Freisetzungsbedingungen zu bringen, umfassen beispielsweise Temperaturkontrollen, die die Temperatur der Probe, des Reagenses und des Trägers erhöhen oder erniedrigen können, um selektiv Polynukleotidstränge zu denaturieren oder zu assoziieren.
Geeignete Mittel zur Abtrennung des Trägers von dem Reagens oder der Probe umfassen beispielsweise Elektromagneten zur gemeinsamen Verwendung mit Magnetkügelchen, Fasern, die an einen ankernden Träger geknüpft sind, Zentrifugen zur Verwendung mit Polystyrolkörnchen und dergleichen.
Weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen Mittel, um das Reagens und das Zielmolekül in Kontakt mit dem Hintergrundträger unter bindenden Bedingungen zu bringen, um alle zweiten Sonden mit Markereinheiten zu entfernen, wobei die zweiten Sonde nichtspezifisch an das Zielmolekül gebunden sind.
Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Vorrichtung, die der Verwendung mit lumineszierenden Markereinheiten angepaßt sind, umfassen geeignete Mittel zur Anregung des Markers. Vorrichtungen zur Verwendung mit fluoreszierenden Markereinheiten umfassen Laser- oder Licht-emittierende Kollektoren mit Filtern, um die geeigneten Wellenlängen zu definieren. Vorrichtungen zur Verwendung mit chemilumineszierenden Markereinheiten umfassen Injektionsapparate zur Injektion von Cofaktoren in die Reaktionskammer.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Assay einer Probe auf ein Ziel-Polynukleotid, wobei die Probe das Ziel- Polynukleotid und die Nicht-Ziel-Polynukleotide enthält, wobei die Probe mit einer Polynukleotidsonde, die mit dem Ziel-Polynukleotid einen Komplex bilden kann, in Kontakt gebracht wird, im wesentlichen der Komplex von den Nicht- Ziel-Polynukleotiden in der Probe abgetrennt wird, das Ziel-Polynukleotid amplifiziert wird, wodurch ein Amplifikationsprodukt gebildet wird, und das amplifizierte Ziel- Polynukleotid gemessen oder nachgewiesen wird. Dieses Verfahren kann vorteilhafterweise bei den Stufen des Einfangs des Zielmoleküls und des Einfangs des Hintergrunds, wie vorstehend beschrieben, verwendet werden.

Kurze Beschreibung der Figuren

Die Fig. 1 bis 3 sind Fließdiagramme, die die Stufen, Vorrichtungen und Reagentien, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, zeigen. Der Ausdruck "Fig. 1" bezieht sich kollektiv auf Fig. 1a und Fig. 1b. In ähnlicher Weise bezieht sich der Ausdruck "Fig. 2" kollektiv auf die Fig. 2a und die Fig. 2b.
Die Fig. 4-6 sind diagrammartige Darstellungen von erfindungsgemäßen Einfang-Amplifikationsmethoden.
Die Fig. 7 ist ein Diagramm, das die Eigenschaften einer Vorrichtung gemäß einer erfindungsgemäßen Ausführungsform zeigt.
Die Fig. 8 ist eine diagrammartige Darstellung einer erfindungsgemäß verwendeten genetischen Konstruktion.

Ausführliche Beschreibung

Bezüglich der Figuren, die erläuternd bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung darstellen und insbesondere besondere Fig. 1, wird ein Durchführungsverfahren mit den notwendigen Reagenszusammensetzungen in schematischer Form für einen Assay auf Ziel-Polynukleotidstränge erläutert. Herkömmliche Assaytechniken umfassen viele Zielstränge, und viele Sondenstränge müßten zur Durchführung eines Assays verwendet werden. Jedoch zeigt, um das weitere Verständnis der Erfindung zu vereinfachen, die Darstellung nur eine begrenzte Anzahl von Sonden, Trägereinheiten und Zielmolekülen. Die Fig. 1 zeigt ein Verfahren, bei dem wiedergewinn bare Träger verwendet werden.
Die Stufe 1 des in Fig. 1 dargestellten Assays beginnt mit einer klinischen Probe, die als Erläuterung Zellen enthält. Die Zellen tragen möglicherweise eine Ziel-Nukleinsäure, entweder DNA oder RNA, welche eine Basensequenz von speziellem Interesse besitzt, die Krankheitserreger, genetische Zustände oder erwünschte Gefleigenschaften anzeigt. Die klinischen Proben können aus allen Ausscheidungen oder physiologischen Flüssigkeiten, wie Stuhl, Urin, Sputum, Eiter, Serum, Plasma, Augenlinsenflüssigkeit, Spinalflüssigkeit, Lymphe, Genitalwaschungen oder dergleichen, erhalten werden. Für einen Fachmann kann es zweckmäßig sein, die Biopsieproben auf einzelzellige Suspensionen oder kleine Klumpen nach auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren zu verringern. Beispielsweise können Biopsieproben von festen Geweben effektiv auf einzelzellige Suspensionen oder auf kleinen Zellklumpen durch Rühren der Biopsieprobe in einem Gemisch aus 0,5 M Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 0,14 M Phosphatpuffer, pH 6,8, und 25 mg/ml Cyclohexamid verringert werden. Die Isolierung spezifischer Zelltypen nach auf dem Fachgebiet etablierten Verfahren, wie Differentialzentrifugation, Dichtegradientenzentrifugation oder anderen Methoden, kann ebenfalls in dieser Stufe angewendet werden.
Die Zellen werden dann behandelt, um ihre DNA und/oder RNA freizusetzen. Die chemische Lyse ist auf dem Fachgebiet gut bekannt. Die chemische Lyse kann mit verdünntem wäßrigem Alkali, beispielsweise 0,1 bis 1,0 M Natriumhydroxid, durchgeführt werden. Das Alkali dient auch dazu, die DNA oder RNA zu denaturieren. Andere Denaturierungs- und Lysemittel umfassen erhöhte Temperaturen, organische Reagentien, beispielsweise Alkohole, Amide, Amine, Harnstoffe, Phenole und Sulfoxide, oder bestimmte anorganische Ionen, beispielsweise chaotrope Salze, wie Natriumtrifluoracetat, Natriumtrichloracetat, Natriumperchlorat, Guanidinisothiocyanat, Natriumiodid, Kaliumiodid, Natriumisothiocyanat und Kaliumisothiocyanat.
Die klinische Probe kann auch verschiedenen Restriktionsendonukleasen unterworfen werden, um die DNA oder RNA in getrennte Segmente zu spalten, welche leichter handhabbar sind. Nach Beendigung der Stufe der Verarbeitung der Probe umfaßt die klinische Probe die Probennukleinsäure, Zelltrümmer und Verunreinigungen. In der Vergangenheit wurde die Probennukleinsäure von den Zelltrümmern und Verunreinigungen durch nichtspezifische Bindung der Nukleinsäure an Filter oder Membranen und Waschen der Zelltrümmer und Verunreinigungen von dem Filter und der Membran gereinigt. Jedoch werden in der Praxis einige Zelltrümmer und einige Verunreinigungen sowie Nicht-Ziel-Nukleinsäuren unspezifisch an den Filter oder die Membran gebunden und durch Waschungen nicht entfernt.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, wie in Stufe 1 erläutert, umfaßt das Inkontaktbringen der möglicherweise die Ziel-Nukleinsäure enthaltenden Probe mit einem wiedergewinnbaren Träger, an den eine Sondeneinheit assoziiert ist. Der wiedergewinnbare Träger kann im wesentlichen homogen in einem Probenmedium dispergiert werden. Die Sondeneinheit kann an den wiedergewinnbaren Träger, beispielsweise durch covalente Bindung der Sondeneinheit an den wiedergewinnbaren Träger durch Affinitätsassoziation, Wasserstoffbindung oder unspezifische Assoziation geknüpft werden.
Der Träger kann viele Formen annehmen einschließlich beispielsweise Nitrocellulose, die auf teilchenförmige Form verkleinert wurde und nach Leiten des Probenmediums, das den Träger enthält, durch ein Sieb wiedergewinnbar ist, Nitrocellulose oder mit Magnetteilchen imprägnierte Materialien oder dergleichen, welche die Nitrocellulose in dem Probenmedium nach Anlegen eines magnetischen Felds wandern lassen, Kügelchen und Teilchen, die filtriert werden können oder elektromagnetische Eigenschaften zeigen, und Polystyrolkügelchen, die sich auf der Oberfläche eines wäßrigen Mediums verteilen.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt einen wiedergewinnbaren Träger, der Magnetteilchen umfaßt, die durch ihre Fähigkeit gekennzeichnet sind, im wesentlichen homogen in einem Probenmedium dispergiert werden zu können. Bevorzugt enthalten die Magnetkügelchen funktionelle primäre Amingruppen, die die covalente Bindung oder Assoziation der Sondeneinheit an die Teilchen des magnetischen Trägers erleichtern. Bevorzugt sind die Kügelchen des Magnetträger Magneten mit einer einzelnen Domäne und sind superparamagnetisch und zeigen keinen Restmagnetismus.
Die Teilchen oder Kügelchen können aus Magnetteilchen bestehen, obwohl sie auch ein anderes magnetisches Metall oder Metalloxide, sei es in unreiner, legierter oder zusammengesetzter Form, sein können, solange sie eine reaktive Oberfläche besitzen und die Fähigkeit, mit einem Magnetfeld zu reagieren, zeigen. Andere Materialien, die einzeln oder in Kombination mit Eisen verwendet werden können, umfassen ohne Beschränkung Kobalt, Nickel und Silicium. Verfahren zur Herstellung von Magnetit- oder Metalloxidteilchen sind in Vandenberghe et al., "Preparation and Magnetic Properties of Ultrafine Cobalt Ferrites", J. of Magnetism and Magnetic Materials, 15 through 18 : 1117-18 (1980); E. Mat&ijlig;evic, "Mono Dispersed Metal (Hydrous") Oxide--A Fascinating Field of colloidal Science", Acc. Chem. Res., 14 : 22-29 (1981) offenbart, worauf hiermit Bezug genommen wird.
Ein Magnetkügelchen, das für die Anwendung auf die vorliegende Erfindung geeignet ist, umfaßt ein Magnetkügelchen, das primäre Aminfunktionen enthält, welches unter dem Warenzeichen BIO-MAG von Advanced Magnetics, Inc. verkauft wird. Ein bevorzugtes Magnetteilchen ist nicht porös und erlaubt dennoch die Assoziation mit einer Sondeneinheit. Die reaktiven Stellen, die an der Assoziation einer Sondeneinheit nicht beteiligt sind, werden bevorzugt blockiert, um die unspezifische Bindung anderer Reagentien, Verunreinigungen und zellulären Materials zu verhindern. Die Magnetteilchen liegen bevorzugt als im wesentlichen kolloidale Suspensionen vor. Reagentien und Substrate und mit der Oberfläche des Teilchens assoziierte Sondeneinheiten erstrecken sich direkt in die das Teilchen umgebende Lösung. Die Sondeneinheiten reagieren mit den aufgelösten Reagentien und Substraten in der Lösung mit Geschwindigkeiten und Ausbeuten, die für Reaktionen in Lösung charakteristisch sind, eher als mit Geschwindigkeiten, die mit Reaktionen an festen Trägern verbunden sind. Ferner nimmt mit der Erniedrigung der Teilchengröße das Verhältnis von spezifischer Oberfläche zu Teilchenvolumen zu, wodurch mehr funktionelle Gruppen und Sonden pro Gewichtseinheit der Magnetteilchen gebunden werden können.
Kügelchen mit reaktiven Aminfunktionen können mit Polynukleotiden umgesetzt werden, um das Polynukleotid covalent an das Kügelchen zu binden. Die Kügelchen werden mit 10% Glutaraldehyd in Natriumphosphatpuffer umgesetzt und anschließend in einem Phosphatpuffer mit einem Ethlyendiaminaddukt des phosphorylierten Polynukleotids in einem Verfahren umgesetzt, das ausführlicher in dem folgenden Versuchsprotokoll dargelegt werden wird.
Rückkehrend nun zu Stufe 2 wird der wiedergewinnbare Träger mit den assoziierten Sondeneinheiten in Kontakt mit der klinischen Probe gebracht und unter Fortschreitung zur Stufe 3 unter bindende Bedingungen gebracht. Die für das Zielmolekül von Interesse spezifische Sondeneinheit wird an die Zielstränge, die in der klinischen Probe vorhanden sind, gebunden. Der wiedergewinnbare Träger, der in der Probe und dem Reagensmedium dispergiert ist, erlaubt die Hybridisierung der Sondeneinheiten und des Zielmoleküls so, als wären sie frei in Lösung.
Die Hybridisierungen der Sonde an das Zielmolekül können in etwa 15 Minuten durchgeführt werden. Im Gegensatz dazu benötigen Hybridisierungen, bei denen entweder die Sonde oder das Zielmolekül auf einem Träger immobilisiert sind, der nicht Fähigkeit zur Dispersion in dem Medium besitzt, 3 bis 48 Stunden.
Fremd-DNA, RNA, Zelltrümmer und Verunreinigungen werden nichtspezifisch an den Träger gebunden. Jedoch können in der Praxis eine kleine Menge Fremd-DNA, RNA, Zelltrümmer und Verunreinigungen unspezifisch an jede Einheit, die in dem Reaktionsgefäß vorhanden ist einschließlich des wiedergewinnbaren Trägers, gebunden werden und werden auch gebunden. Die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung erleichtern die weitere Reinigung klinischer Proben, wodurch Fremd-DNA, RNA, Zelltrümmer und weitere Verunreinigungen von den Ziel-Polynukleotiden entfernt werden.
Die Stufe 4 der Fig. 1 zeigt die Trennung des Trägers der klinischen Probe und die Suspendierung des Trägers in ein zweites Medium. Das zweite Medium umfaßt somit den wiedergewinnbaren Träger mit der assoziierten Sonde in Bindung an die Ziel-Polnukleotidstränge. Ebenfalls von dem wiedergewinnbaren Träger mitgetragen werden die Fremd-DNA, RNA, Zelltrümmer und unspezifisch an den Träger gebundene Verunreinigungen, aber in einer viel niedrigeren Konzentration als ursprünglich in der klinischen Probe gefunden wurde. Einem Fachmann ist klar, daß einige unerwünschte Materialien durch Waschen des Trägers vor der Suspendierung in dem zweiten Medium verringert werden können.
Der wiedergewinnbare Träger mit der assoziierten Sonde und die in dem zweiten Medium suspendierten Zielstränge werden weiter denaturiert, wie in Stufe 5 dargestellt ist, wodurch das Zielmolekül von der Sondeneinheit des wiedergewinnbaren Trägers dissoziieren kann. Das Denaturierungsverfahren kann unspezifisch gebundene Fremd-DNA, RNA, Zelltrümmer oder Verunreinigungen von dem wiedergewinnbaren Träger freisetzen oder auch nicht. Jedoch erlaubt Stufe 5 des erfindungsgemäßen Verfahrens die Entfernung des wiedergewinnbaren Trägers von dem zweiten Medium, das mit sich viele der unspezifischen gebundenen Zelltrümmer, Verunreinigungen und der Fremd-DNA und RNA, die ursprünglich aus dem ersten Medium der klinischen Probe mitgeschleppt wurden, trägt.
Wie in Stufe 6 dargelegt, kann ein neuer Träger in das zweite Medium unter bindenden Bedingungen eingeführt werden, um erneut Ziel-Polynukleotidstränge auf mit dem wiedergewinnbaren Träger assoziierten Sondeneinheiten einzufangen. Einem Fachmann ist klar, daß der neue Träger in der Tat den ursprünglichen wiedergewinnbaren Träger nach Recyclingstufen umfassen kann, um unspezifische gebundene DNA, RNA, Zelltrümmer und Verunreinigungen weiter zu reinigen und zu entfernen. So umfassen die einzigen Verunreinigungen, die in dem zweiten Medium vorhanden sind, DNA, RNA, Zelltrümmer und Verunreinigungen, die ursprünglich unspezifisch an den Träger gebunden waren, der anschließend aus dem ersten Träger freigesetzt wurde und in dem zweiten Medium aufgelöst oder suspendiert wurde.
Jedoch können solche Verunreinigungen von den Ziel-Polynukleotiden weiter entfernt werden, indem der zweite wiedergewinnbare Träger aus dem zweiten Medium entfernt wird und der Zyklus des Einschleusens des wiedergewinnbaren Trägers in ein weiteres Medium, Denaturieren und Entfernen des alten Träger wiederholt wird. Einem Fachmann ist klar, daß die erfindungsgemäß beschriebenen Magnetkügelchen aus einer Lösung entfernt werden können oder bei Entfernung einer Lösung an ihrem Platz gehalten werden können oder einem gefäßartigen Behältnis zugesetzt werden können.
Die Fähigkeit der Magnetkügelchen, an Reaktionen teilzunehmen, die Stränge mit "Nichtlösungskinetiken" nachahmen, erlaubt die Vollendung eines Zyklus aus Denaturieren und Binden an das Zielmolekül in 3 bis 15 Minuten.
Nach einer ausreichenden Reinigung und Konzentration kann das Zielmolekül durch auf dem Fachgebiet bekannte lumineszierende oder radioaktive Methoden, wie in Stufe 8 angezeigt, nachgewiesen werden. Die Reinigung des das Zielmolekül enthaltenden Mediums erlaubt die Detektion von nichtisotopen Markereinheiten ohne Zelltrümmer und Verunreinigungen.
Bezüglich Fig. 2, die ein Mehrfachsonden-Verfahren zeigt, wird eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Assayverfahrens erläutert, welches mit einer klinischen Probe, die ein Polynukleotid-Zielmolekül enthält, die wie die klinische Probe der vorstehenden Figur, mit Einbringen von Solubilisierungsmitteln und Reagentien verarbeitet wird, beginnt. Das Reagens des in Fig. 2 dargestellten Assayverfahrens umfaßt einen ersten Polynukleotid-Sondenstrang (P&sub1;) und einen zweiten Polynukleotid-Sondenstrang (P&sub2;) mit der Fähigkeit, einen Komplex mit dem Zielmolekül zu bilden, wobei beide Sonden (P&sub1; und P&sub2;) an das Zielmolekül gebunden sind. Die erste Sonde (P&sub1;) kann mit einem wiedergewinnbaren Träger (S&sub1;) unter bindenden Bedingungen assoziieren. Die zweite Sonde besitzt eine nachweisbare Markereinheit. Die Markereinheit ist in den Figuren mit einem Sternchen oder Stern gekennzeichnet. Nach der Einbringung der Solubilisierungsmittel und des Reagens unter denaturierenden Bedingungen umfaßt die die klinische Probe enthaltende Lösung möglicherweise Polynukleotide und das Reagens in Form der ersten und zweiten Sonden, ferner Zelltrümmer, Solubilisierungsmittel, Verunreinigungen und Fremd-RNA, und DNA.
Unter bindenden Bedingungen, wie in Stufe 2 erläutert, binden die erste und die zweite Sonde (P&sub1; und P&sub2;) an wechselseitig ausschließliche Teile des Zielmoleküls. Die Hybridisierung der Sonden (P&sub1; und P&sub2;) an das Zielmolekül in Lösung ist rasch und wird durch die Assoziation mit einem festen Träger nicht verschlechtert. Um die Bindung des Zielmoleküls an die ersten und zweiten Sondenstränge (P&sub1; und P&sub2;) zu gewährleisten, wird ein Überschuß an Sonde verwendet. Selbst wenn ein Überschuß an Sonde (P&sub1; und P&sub2;) nicht verwendet werden würde, würde jedoch ein gewisser Anteil der Sonde das Zielmolekül nicht auffinden und in dem Probenmedium unhybridisiert verbleiben. Die unhybridisierte zweite Sonde (P&sub2;) mit einer Markereinheit stellt das Hintergrundrauschen dar, sofern während der Detektion vorhanden.
Die erste Sonde (P&sub1;) kann einen Träger (S&sub1;) mittels eines Liganden, mit der Fähigkeit zur Bindung an eine Antiligandeneinheit auf einem Träger zu binden, binden. Der Ligand (L&sub1;) umfaßt beispielsweise einen Schwanzteil, umfassend ein Homopolymeres. Der Träger (S&sub1;) umfaßt einen Antiliganden (A&sub1;) mit der Fähigkeit, den Liganden (L&sub1;) aufzunehmen und daran zu binden. Der Antiligand (A&sub1;) umfaßt beispielsweise ein Homopolymeres, das dem Liganden (L&sub1;) der Sonde (P&sub1;) komplementär ist.
Bezüglich Stufe 3 assoziiert unter bindenden Bedingungen die Antiligandeneinheit (A&sub1;) des Trägers (S&sub1;) mit der Ligandeneinheit (L&sub1;) der ersten Sonde (P&sub1;) oder bindet daran, welche ihrerseits an das Zielmolekül gebunden wird und an die zweite Sonde (P&sub2;) geknüpft wird. Der Träger kann viele Formen annehmen. Kügelchen oder teilchenförmige Träger können in einer Lösung dispergiert werden und nehmen an der Bindung mit den Zielmolekül-Sonde-Reaktionenteil, die Kinetiken zeigen, die denen in Lösung nahekommen. Ferner können wiedergewinnbare Kügelchen und teilchenförmige Träger Sonde-Zielmolekül-Komplexe von nichtauflösbaren Zelltrümmern trennen, ohne daß Probleme des Verstopfens auftreten, die für herkömmlichere Filter oder Membranen typisch sind.
Jedoch können herkömmliche Membranen und Filter oder Celluloseträger für einige Anwendungen auch verwendet werden, bei denen das Verstopfen kein Problem ist. Infolge der raschen Hybridisierung der Sonden an das Zielmolekül in Lösung kann ein fester Nicht-Kügelchen-artiger oder nichtteilchenförmiger Membran- oder Filterträger in das Reaktionsgefäß eingebracht werden. Die Lösung des Reagenses und der Probe kann durch den Träger geleitet werden, um das Einfangen des Zielmoleküls zu bewirken. Der Träger (S&sub1;) ist in Fig. 2 als ein wiedergewinnbarer Träger dargestellt.
In der Lösung mit dem Zielmolekül-Sonde-Trägerkomplex befinden sich nichtgebundene erste und zweite Sondeneinheiten, nichtgebundenes Zielmolekül, Solubilisierungsmittel, Verunreinigungen und Zelltrümmer. Die nichtgebundene zweite Sonde (P&sub2;), die Markereinheiten besitzt, erzeugt Rauschen, was ein Signal ergibt, das die Anwesenheit eines Zielmoleküls nachahmt. Eine kleine Menge fremder Zelltrümmer, Solubilisierungsmittel und Verunreinigungen und Sonden kann auch nichtspezifisch an den wiedergewinnbaren Träger gebunden werden.
In der Stufe 4 wird der Träger (S&sub1;) von dem Medium der klinischen Probe abgetrennt. Wenn ein wiedergewinnbarer Träger verwendet wird, kann die Trennung entweder durch Immobilisieren des wiedergewinnbaren Trägers in einem Reaktionsgefäß oder durch direktes Entnehmen des wiedergewinnbaren Trägers aus dem Probenmedium durchgeführt werden. Ein Fachmann wird erkennen, daß der immobilisierte Träger gewaschen werden kann, um unerwünschtes Material zu minimieren.
Bezüglich Stufe 5 ist der Zielmolekül-Sonde-Trägerkomplex im wesentlichen frei von Fremd-RNA, DNA, Solubilisierungsmitteln, Verunreinigung und Zellmaterial und kann auf die Anwesenheiten der Markereinheiten, die die Anwesenheit des Zielmoleküls anzeigen, überwacht werden. Jedoch kann eine kleine Menge Fremd-DNA, RNA, Solubilisierungsmittel, Verunreinigungen und Zellmaterialien immer noch nichtspezifisch an den Träger (S&sub1;) gebunden werden. Ferner kann in dem Sinne nichtgebundene zweite Sonde (P&sub2;), daß sie mit dem Zielmolekül nicht assoziiert ist, auch nichtspezifisch an den Träger (S&sub1;) gebunden werden und kann die Signale aus den nichtisotopen Markereinheiten beeinträchtigen. Das Vorliegen einer nichtgebundenen zweiten Sondeneinheit (P&sub2;) mit Markereinheiten ist eine signifikante Ursache eines Hintergrundrauschens, wodurch die Genauigkeit des Assayverfahrens vermindert wird.
So kann als eine alternative Stufe 5 der erste Träger (S&sub1;) in einem zweiten Medium suspendiert werden, in dem der Träger (S&sub1;) von dem Zielmolekül-Sonde-Komplex durch Denaturierung abgetrennt wird. Nach der Denaturierung wird in Stufe 6 der erste Träger (S&sub1;) von dem zweiten Medium entfernt und durch einen zweiten Träger (S&sub2;) ersetzt. Der zweite Träger umfaßt eine Antiligandeneinheit (A&sub1;) mit der Fähigkeit, an die Ligandeneinheit (L&sub1;) der ersten Sonde zu binden.
Bei Stufe 7 reassoziiert sich unter bindenden Bedingungen der Zielmolekül-Sonde-Komplex mit dem zweiten Träger (S&sub2;) Die Entfernung des ersten Trägers (S&sub1;) entfernt Fremdmaterial, Zelltrümmer und nichtspezifisch an den ersten Träger (S&sub1;) gebundene Sonden aus dem Assaymedium. Wie in Stufe 8 dargestellt, kann das den Zielmolekül-Sonde-Komplex enthaltende Medium auf die Anwesenheit der Marker überwacht werden. Jedoch kann eine weitere Reinigung des Assaymediums durchgeführt werden, um das Vorliegen eines Hintergrunds und von Fremdmaterialien weiter zu vermindern, die aus dem Probenmedium in nichtspezifischer Bindung an den ersten wiedergewinnbaren Träger (S&sub1;) mitgeschleppt wurden und anschließend von dem ersten Träger (S&sub1;) in das zweite Medium aufgelöst oder abdissoziiert wurden.
So kann der zweite wiedergewinnbare Träger (S&sub2;) in Kontakt mit einem dritten Medium gebracht werden, wobei das Medium Bedingungen unterworfen wird, bei denen der Zielmolekül- Sonde-Komplex von dem Träger freigesetzt wird, und der Träger entfernt wird, wodurch ein weiterer Zyklus vollendet wird. Die Anzahl der Zyklen kann in Abhängigkeit von dem Probentyp, dem Typ der Markereinheiten und der Empfindlichkeit der Detektionsvorrichtung ausgewählt werden. Verschiedene Trägertypen können zu verschiedenen Zeiten verwendet werden. So kann ein wiedergewinnbarer Träger verwendet werden, um die Zielmolekül-Sonde-Komplexe aus den Probenmedien oder Lösung anfänglich zu gewinnen oder zu konzentrieren, um die für Membranen oder Filter typischen Verstopfungsprobleme zu vermeiden. Der zweite oder dritte Träger umfaßt bevorzugt eine Membran oder einen Filter mit Antiligandeneinheiten (A&sub1;), die an die Ligandeneinheit (L&sub1;) der ersten Sonde (P&sub1;) binden. Die Membran oder Filterträger können die Verfahrensstufen vereinfachen, was eine Durchflußwiedergewinnung der Zielmolekül-Sonde-Komplexe erlaubt.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eignet sich besonders für die Verminderung der Hintergrundrauschens. Bezüglich Fig. 3 wird eine Modifikation des vorstehenden Assayverfahrens gemäß Fig. 2 beschrieben. In Fig. 3 bildet ein Ziel-Polynukleotid einen Komplex mit einer ersten und einer zweiten Sondeneinheit (P&sub1; und P&sub2;), ähnlich den in Fig. 2 beschriebenen Sondeneinheiten. Jedoch umfaßt die zweite Sonde einen zweiten Liganden (L&sub2;). Der zweite Ligand (L&sub2;) kann beispielsweise ein einzelnes endständiges Ribonukleotid umfassen, das mit einem Boratantiliganden, einem alternierenden Copolymeren, das sich an ein komplementäres Copolymeres bindet, einem Biotinliganden, der sich an einen Avidinliganden bindet, oder, wie erläutert, einem homopolymeren Liganden (L&sub2;) und einem komplementären homopolymeren Antiliganden (A&sub2;) einen Komplex bildet.
Bezüglich Stufe 1 wird ein Hintergrundträger mit der Fähigkeit, selektiv an die zweite Sonde (P&sub2;) zu binden, nur wenn sie nicht an das Zielmolekül gebunden ist, mit dem Medium, das den Zielmolekül-Sonde-Komplex enthält, in Kontakt gebracht. Das Medium umfaßt ferner freie disassoziierte erste und zweite Sonden (P&sub1; und P&sub2;). Die markierte zweite Sonde (P&sub2;), die zu dem Hintergrundrauschen beiträgt, wird spezifisch an den Hintergrundträger (P&sub1;) durch einen großen molaren Überschuß an Antiligandeneinheiten (A&sub2;), die mit dem Hintergrundträger (P&sub1;) assoziiert sind, gebunden. Nach der Bindung der nichtgebundenen markierten Sonde (P&sub2;) an den Hintergrundträger (P&sub1;) wird der Hintergrundträger (P&sub1;) von dem Medium wie in Stufe 2 erläutert, entfernt. Das den Zielmolekül-Sonde-Komplex enthaltende Medium kann auf die Anwesenheit des Markers, der von der zweiten Sonde (P&sub2;) getragen wird, überwacht werden, wodurch das Hintergrundrauschen vermindert wird. Alternativ kann das den Zielmolekül-Sonde-Komplex enthaltende Medium weiter verarbeitet werden.
Die weitere Verarbeitung kann die weitere Verminderung des Hintergrunds durch Wiederholung der in Fig. 3 beschriebenen Stufen 1 bis 3 oder zuvor im Zusammenhang mit Fig. 2 beschriebenen Stufen umfassen. Beispielsweise können die Stufen zur Verminderung des Hintergrunds in die Verarbeitung einer klinischen Probe, wie in Fig. 2 erläutert, zu jedem Zeitpunkt, zu dem die Liganden- und Antiligandeneinheiten der ersten und zweiten Sonden nicht stören und das Zielmolekül mit der ersten und zweiten Sonde komplexiert ist, eingebracht werden.
Eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann mit zusätzlichen Amplifikationsstufen durchgeführt werden, um ein Amplifikationsprodukt zu erzeugen, um die Empfindlichkeit des Assays zu verbessern. Bezüglich der Fig. 4, 5 und 6 umfaßt jede Figur eine Stufe 1, bei der das Zielmolekül unter Verwendung einer Einfangsonde und eines wiedergewinnbaren Trägers in Form eines Kügelchens eingefangen wird. Das Polynukleotid-Zielmolekül umfaßt als a¹, b¹ und c¹ definierte Flächen. Die Polynukleotidsonde umfaßt eine Fläche "a" mit der Fähigkeit, an ihr Komplement "a¹" des Zielmoleküls zu binden. Die Sonde umfaßt weiterhin einen Liganden mit der Fähigkeit, an den mit dem Kügelchen assoziierten Antiliganden zu binden. Wie erläutert sind der Ligand der Sonde und der Antiligand des Kügelchens komplementäre Homopolymere.
In Stufe 2 der Fig. 4, 5 und 6 wird das Zielmolekül von den Fremdpolynukleotiden, den Verunreinigungen, dem zellulären Material und den Solubilisierungsmitteln aus den Verfahren der Probenverarbeitung getrennt.
In Stufe 3 der Fig. 4, 5 und 6 wird das isolierte Zielmolekül nichtspezifisch amplifiziert, wodurch eine Vielzahl an Amplifikationsprodukten gebildet wird.
Fig. 4, Stufe 3 zeigt eine Amplifikation der Ziel-DNA, wodurch ein nachweisbares Amplifikationsprodukt, komplementäre RNA, durch das Enzym Core-RNA-Polymerase gebildet wird. In Fig. 4, Stufe 3 wird die Einfangsonde mit dem recA-Protein komplexiert, um die Sonde-Zielmolekülbindung zu erleichtern. Core-RNA-Polymerase erzeugt eine der DNA- Zielmatrize komplementäre RNA. Wenn das Enzym die Zielsequenzen durchliest, werden die RNA-Sondenfläche "a" und die anschließenden neuen Nukleotidsequenzen von dem Zielmolekül entfernt, das an neue recA-beschichtete Sonden binden kann, wodurch eine Vielzahl an RNA-Polynukleotiden mit einer Fläche "c" gebildet werden, die nachgewiesen werden können.
Die ganze Zahl "n" bedeutet eine Vielzahl von Amplifikationsprodukten.
Wenn das Zielmolekül eine RNA ist, wie ribosomale RNA (rRNA) oder Boten-RNA (mRNA), kann die Ziel-RNA nichtspezifisch durch Denaturieren der RNA und Behandeln der RNA mit einem Enzym, wie Qβ-Replikase oder reverser Transkriptase, repliziert werden.
Die Fig. 5 erläutert die Anwendung eines Amplifikationssystems aus zwei Enzymen. In Stufe 3(a) der Fig. 5 wird die DNA-Polymerase zusammen mit hexameren Primern verwendet, um DNA-Segmente zu erzeugen, die dem Zielmolekül komplementär sind. In Stufe 3(b) wird Core-RNA-Polymerase verwendet, um zusätzliche RNA-Komplemente sowohl für die Ziel-DNA als auch die DNA-Zielkomplemente zu bilden.
Die Fig. 6 erläutert die Anwendung eines enzymatischen Amplifikationssystems, basierend auf dem Enzym DNA-Polymerase. So wird in Stufe 3(a) das Zielmolekül, das von Fremdpolynukleotiden, Verunreinigungen und Zelltrümmern abgetrennt ist, mit DNA-Polymerase zusammen mit nichtspezifischen hexameren Primern behandelt. Die DNA-Polymerase erzeugt DNA-Segmente, die dem anfänglichen Zielmolekül komplementär sind. Das neue DNA-Produkt, das von der Ziel-DNA gebildet wurde, ist ebenfalls ein Substrat für die Replikation. Das Zielmolekül und die Komplemente werden zyklisierenden Stufen unterworfen, um das Zielmolekül und die Zielkomplemente zu denaturieren, wobei neues Enzym zugesetzt wird, um neue Kopien des Zielmoleküls und des Zielmolekülkomplements zu erzeugen.
Nach der Bildung des Enzymprodukts erläutert die Stufe 4 der Fig. 4-6 den Einfang des Zielmoleküls und/oder des Enzymprodukts, wie vorstehend beschrieben, mit einer weiteren Sonde und einem Träger. Das Zielmolekül und/oder das Produkt der Enzymreaktion werden weiteren Verfahrensstufen einschließlich der Detektion unterworfen.
Eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren kann mit Hilfe einer Vorrichtung, wie in schematischer Form in Fig. 7 dargestellt ist, durchgeführt werden. Die Vorrichtung umfaßt die folgenden Hauptelemente: mindestens ein Behältnis, Mittel zur Kontrolle der Assoziation einer Sonde mit einem Zielmolekül und einen wiedergewinnbaren Träger, Mittel zur Abtrennung des wiedergewinnbaren Trägers von einer Probenlösung und Mittel zur Freisetzung des Zielmoleküls aus dem wiedergewinnbaren Träger. Diese Hauptelemente können verschiedene Formen annehmen und werden nachstehend ausführlicher beschrieben.
Die Vorrichtung wird nachstehend zur Erläuterung in Anwendung auf die in den Fig. 2 und 3 beschriebenen Verfahren bezüglich eines Zielmoleküls, das ein Polynukleotid umfaßt, beschrieben. So wird in Station 1 eine klinische Probe mit Solubilisierungsmitteln, wie chaotropen Salzen, Enzymen und grenzflächenaktiven Mitteln in das Behältnis gegeben, um die zellulären Materialien aufzulösen und die Nukleinsäuren freizusetzen. Das Behältnis kann Rührvorrichtungen umfassen, um das Aufbrechen der Zellen zu erleichtern. Das Behältnis kann jeden Typ von Gefäß, Röhrchen, Küvette mit der Eignung, die Probe aufzunehmen, umfassen.
In einer für die automatisierte Analyse ausgelegten Vorrichtung umfaßt die in Fig. 7 dargestellte Apparatur bevorzugt Mittel zur Aufnahme einer Vielzahl von Behältnissen. Zu Erläuterungszwecken werden die die Probe enthaltenden Behältnisse nacheinander analysiert. So werden die Behältnisse an eine erste Station gebracht und dann an anschließende Stationen, an denen die verschiedenen Stufen des Assayverfahrens durchgeführt werden.
Die verschiedenen Stationen sind durch Beförderungsmittel verknüpft. Die Beförderungsmittel können rotierbare, drehbare Förderbänder oder dergleichen umfassen. Bei Anwendung in klinischen Krankenhausvorrichtungen können die Beförderungsmittel die manuelle Bewegung umfassen. So kann das Krankenhauspersonal eine Gewebsprobe einem Patienten entnehmen und die Probe in das Behältnis geben. Die Verarbeitung der Probe einschließlich des Aufbrechens der Gewebsprobe und das anfängliche Vermischen der Solubilisierungsmittel und der Reagentien würde am Bett begonnen werden und fortgesetzt werden, wenn das Behältnis an eine anschließende Station für die weitere Verarbeitung weitergeleitet wird. Die Bezugnahmen auf Stationen dienen der Erläuterung. Ein Fachmann erkennt, daß bestimmte Stationen oder Stufen kombiniert oder vertauscht werden können.
An der ersten Station werden die Probe und die Solubilisierungsmittel in ein Behältnis gegeben, in dem ein Rührelement die Probe und die Solubilisierungsmittel gründlich vermischt und die Nukleinsäuren aus den Zellmaterialien freisetzt. Beförderungsmittel bringen das Behältnis zu Station 2, wo dem Behältnis das Reagens zugesetzt wird.
Das Reagens umfaßt eine erste Polynukleotidsonde und eine zweite Polynukleotidsonde. Die erste und die zweite Sonde können einen Komplex mit den Ziel-Polynukleotiden bilden, in dem beide Sonden an wechselseitig ausschließliche Teile des Zielmoleküls gebunden sind. Die erste Sonde kann auch an einen wiedergewinnbaren Träger unter bindenden Bedingungen binden. Die zweite Polynukleotidsonde umfaßt eine nachweisbare Markereinheit. Das Reagens und die Probennukleinsäure werden durch ein Heizelement denaturiert und zu Station 3 weiterbefördert.
In Station 3 wird dem Behältnis ein erster Träger, der als offene Kreise dargestellt ist, zugesetzt. Der erste Träger wird in dem Probenmedium durch geeignete Mittel, einschließlich eines Rührelements, homogen dispergiert. Beispiele für geeignete Träger umfassen ohne Beschränkung Polystyrolkügelchen, Magnetkügelchen und andere teilchenförmige oder faserartige Substanzen. Wie erläutert umfaßt der erste Träger ein Magnetkügelchen mit Polynukleotid-Antiliganden aus Desoxythymidin (dT). Die erste Sonde umfaßt einen Schwanzteil aus Desoxyadenosin (dA) mit der Fähigkeit, an den ersten Träger unter bindenden oder hybridisierenden Bedingungen zu binden.
In Station 4 wird das Probenmedium unter Hybridisierungsbedingungen durch Abkühlen durch ein Kühlelement gebracht. Jedoch ist einem Fachmann bekannt, daß Mittel zur Veränderung der Salzkonzentration leicht anstelle der thermischen Kontrollen verwendet werden können. So bildet das Ziel-Polynukleotid einen Komplex mit der ersten und der zweiten Sonde. Ferner hybridisiert der homopolymere Desoxyadenosin- (dA)-Schwanzteil der ersten Sonde mit dem Desoxythymidin- (dT)-Homopolymeren des wiedergewinnbaren Trägers.
Das Behältnis wird von Station 4 zu Station 5 bewegt, an der der wiedergewinnbare Träger auf der Wand des Behältnisses durch Aktivieren eines Magnetelements immobilisiert wird. Wenn Polystyrolkügelchen statt Magnetkügelchen verwendet werden, wird das Polystyrolkügelchen durch Abfiltrieren oder Dichteunterschiede immobilisiert werden. Es wird dafür gesorgt, daß das Probenmedium den Hauptanteil der Fremd-DNA, RNA, der Solubilisierungsmittel, des Zellmaterials und der Verunreinigungen mit sich trägt. Der immobilisierte wiedergewinnbare Träger wird gewaschen, um Fremd-DNA, RNA, Solubilisierungsmittel, Zellmaterialien und Verunreinigungen weiter zu entfernen.
Obwohl erläutert wird, daß der wiedergewinnbare Träger auf der Wand des Reaktionsgefäßes immobilisiert ist, ist es ferner auch möglich, den wiedergewinnbaren Träger aus dem Reaktionsgefäß durch ein Magnetfeld zu entfernen und dafür zu sorgen, daß das erste Reaktionsgefäß Fremd-DNA, RNA, Solubilisierungsmittel und Zellmaterialien mit sich trägt, die unspezifisch an die Wände des Reaktionsgefäßes gebunden sein können.
Der wiedergewinnbare Träger wird in ein zweites Medium gegeben, entweder das gleiche Behältnis oder ein neues Behältnis. Das Behältnis, das den wiedergewinnbaren Träger in einem zweiten Medium enthält, wird zu Station 6 befördert.
In Station 6 wird das zweite Medium denaturierenden Bedingungen durch geeignete Mittel, einschließlich eines Heizelements, unterworfen. Das Denaturierungsverfahren setzt den Komplex aus Zielmolekül und erster und zweiter Sonde aus dem (dt)-Homopolymeren des wiedergewinnbaren Trägers frei. Der erste Träger, der möglicherweise Fremd-DNA, RNA, Verunreinigungen und Zellmaterial trägt, wird von dem zweiten Medium entfernt. Gegebenenfalls können Amplifikationsstufen auf das Zielmolekül, das nun im wesentlichen von Verunreinigungen, Zelltrümmern und Nicht-Ziel-Polynukleotiden frei ist, angewendet werden. Amplifikationsstufen können die Erzeugung eines Amplifikationsprodukts mit Enzymen, wie beispielsweise DNA-Polymerase, RNA-Polymerase, Transkriptasen oder Qβ-Replikase, umfassen. Wenn das Amplifikationsprodukt nicht das Zielmolekül ist, richtet sich die zweite Sonde gegen das Amplifikationsprodukt ebenso wie gegen eine dritte Einfangsonde, die die Stelle der ersten Sonde einnimmt. Ein Hintergrundträger wird dann in Kontakt mit dem zweiten Medium gebracht und zu Station 7 weitergeleitet.
In Station 7 bringt ein Kühlelement das zweite Medium auf Hybridisierungstemperaturen. Der Hintergrundträger umfaßt einen zweiten Antiliganden mit der Fähigkeit, spezifisch an einen von der zweiten Sonde getragenen Liganden zu binden. Beispielsweise kann ohne Beschränkung ein endständiges Nukleotid der zweiten Sonde so synthetisiert werden, daß es ein Riboderivat ist, das spezifisch an eine Borateinheit bindet, die auf dem zweiten Träger vorhanden ist. Die zweite Sonde, die an das Zielmolekül als Teil eines Sonde- Zielmolekül-Komplexes gebunden ist, bindet infolge sterischer Hinderungen nicht an das Borat, das auf dem dritten Träger vorhanden ist. Jedoch bindet die nichtgebundene zweite Sonde spezifisch an den Boratträger. Alternativ kann die zweite Sonde, ein Homopolymeres, wie Desoxycytosin (dC) umfassen, das an einen Desoxyguanin-(dG)-Homopolymer-Linker auf einen zweiten Träger bindet. Die Längen der Homopolymeren sind so eingestellt, daß solche Komplexe aus dem Zielmolekül der ersten und zweiten Sonden mit dem zweite Träger nicht stabil sind. Jedoch sind Komplexe aus der zweiten Sonde allein mit dem zweiten Träger innerhalb der Reaktionsparameter stabil. In der Tat kann das Einfangen des Hintergrunds, wobei der Hintergrundträger an eine nichtgebundene zweite Sonde gebunden wird, irreversibel sein.
Als nächstes wird das Behältnis, das das zweite Medium und den Hintergrundträger enthält, zu Station 8 weiterbefördert, bei der der Hintergrundträger, bei dem die zweiten Sondenstränge nicht an den Zielmolekül-Sonde-Komplex gebunden sind, von dem zweiten Medium abgetrennt wird. Die Abtrennung des Hintergrundträgers beseitigt unspezifisches Hintergrundrauschen von dem Medium.
Wie erläutert erfolgt das Einfangen des Hintergrunds auf Kügelchen. Jedoch ist einem Fachmann klar, daß die anfängliche Reinigung des Zielmolekül-erste und zweite Sonde-Komplexes aus der klinischen Probe die Gesamtheit oder fast die Gesamtheit der festen Zelltrümmer entfernt, wodurch das Einfangen des Hintergrunds auf Filter- oder Membranträgern, durch die das zweite Medium gespült werden kann, ermöglicht wird.
Von Station 8 wird das gereinigte Medium, das den Zielmolekül-Sonde-Komplex mit verringertem Hintergrund enthält, zu Station 9 weiterbefördert. In Station 9 wird ein dritter Träger, der als eine Membran oder ein Filter dargestellt ist, in Kontakt mit dem zweiten Medium gebracht, das durch ein Heizelement auf Hybridisierungstemperaturen gebracht wird. Der dritte Träger umfaßt erste Antiligandeneinheiten, die an die ersten Ligandeneinheiten der ersten Sonde binden oder, wenn ein Amplifikationsprodukt in den vorstehenden Stufen erzeugt wurde, an eine erste Ligandeneinheit einer dritten Sonde, die gegen das Amplifikationsprodukt gerichtet ist, binden. Wenn so die erste Ligandeneinheit der ersten Sonde ein Homopolymeres von Desoxyadenosin (dA) ist, kann der dritte Träger ein Homopolymeres von Desoxythymidin (dT) umfassen. Wie erläutert, umfaßt der dritte Träger Filter oder Membranen, durch die das zweite Medium gespült werden kann. Jedoch können Kügelchen oder Teilchen ebenfalls verwendet werden. Der dritte Träger dient dazu, den Zielmolekül-erste und zweite Sonde-Komplex weiter zu konzentrieren und erlaubt eine weitere Verminderung des Hintergrunds und störender Materialien, die nichtspezifisch an den dritten Träger binden. Es wird zu Station 10 weitergeleitet, an der der dritte Träger den Zielmolekül-erste und zweite Sonde-Komplex konzentriert, wodurch der Nachweis der Markereinheiten, die auf der zweiten Sonde vorhanden sind, ermöglicht wird.
Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden typischen Verfahrens- und Versuchsbeispielen näher erläutert, die Eigenschaften der bevorzugten Ausführungsform beispielhaft darstellen.

I. Verfahren

A. Materialien

Alle Reagentien waren analysenrein oder reiner. Unter dem Warenzeichen BIO-MAG verkaufte Magnetkügelchen, die funktionelle Aminogruppen enthielten, wurden von Advanced Magnetics, Inc. aus Cambridge, MA, bezogen.
In dem folgenden Beispiel wurden alle markierten Nukleotide von New England Nuclear erhalten. Das Enzym terminale Desoxynucleotidyltransferase (TDT) wurde von Life Sciences, Inc., St. Petersburg, Florida, bezogen. Das Oligonukleotid pdT&sub1;&sub0; wurde von Pharmacia PL Biochemicals bezogen.

B. Synthese von Sonden

Nachstehend werden typische Protokolle und Verfahren beschrieben. Unter Bezugnahme auf Fig. 8 wurden zwei Sonden entsprechend dem Sinnstrang des Enterotoxingens elt A1 von Escherichia coli gemäß der Konstruktionskarte, Fig. 8, von Spicer, E. K. und J. A. Noble, 1982, J. of Biological Chem. 257, 55716-55751 konstruiert.
Ein Satz Sonden wurde synthetisiert, der bei Position 483 der Gensequenz begann und sich 30 Nukleotide lang erstreckte. Nachstehend werden diese Sonde als A483-Sonde bezeichnet. Eine zweite Sonde wurde synthetisiert, die bei Position 532 der Gensequenz begann und sich 30 Nukleotide lang erstreckte, und sie wird nachstehend als die A532- Sonde bezeichnet. Eine dritte Sonde wurde synthetisiert, die bei Position 726 der Gensequenz begann und sich 39 Nukleotide lang erstreckte. Nachstehend wird sie als die A726-Sonde bezeichnet. Die spezifischen Basensequenzen (5' bis 3') sind in der nachstehenden Tabelle I angegeben:

Tabelle I

Sonde Sequenz
A483 AGA CCG GTA TTA CAG AAA TCT GAA TAT AGC
A532 AGA TTA GCA GGT TTC CCA CCG GAT CAC CAA
A726 GTC AGA GGT TGA CAT ATA TAA CAG AAT TCG GGG GGG GGG
Die Sonden wurden nach auf dem Fachgebiet verfügbaren Methoden synthetisiert. Das Zählsystem ist von der 768-Nukieotidsequenz, die von der Intelligenetics sequenzbank ECO ELT A1 verfügbar ist, übernommen.
Von den zehn G-Resten am 3'-Ende der Sonde A726 können drei Guaninbasen im Bereich des s'-Endes an drei komplementäre Cytosinbasen des tox-Gens binden. Abschnitte aus drei Cytosinen kommen häufig in DNA vor. Die zehn Guaninbasen bilden einen Liganden mit der Fähigkeit, an einen Poly-C-Antiliganden, der auf einem Träger, wie Oligo-dC-Cellulose, vorhanden ist, zu binden. Jedoch bilden die sieben Guaninbasen keine stabile Assoziation mit einem Träger bei 37ºC, insbesondere, wenn die Sonde an das Zielmolekül infolge sterischer Hinderung und der Größe des Zielmolekül-Sonde-Komplexes gebunden ist. Die Sonde A726 wurde durch willkürliche Addition von etwa drei Resten ³²P-dC und ³²P-dG an deren 3'-Ende mit terminaler Transferase modifiziert.
Einem Fachmann ist klar, daß andere Sonde entsprechend anderen Zielmolekülen leicht synthetisiert werden können.

C. Herstellung

Das Zielmolekül in Beispiel Nr. 1, 2 und 3 ist das Enterotoxin-Gen elt A1. Das Enterotoxin-Gen elt A1 ist Teil des Plasmids EWD-299, das von der Standford University erhalten wurde.
In Beispiel Nr. 1 wurden die enterotoxigenen Bakterien bis zur Log-Phase in Luria-Brühe gezüchtet. Die enterotoxigenen Bakterien wurden lysiert, und das Plasmid EWD-299 wurde isoliert.
Das Plasmid EWD-299 wurde weiter mit den Restriktionsenzymen Xba 1 und Hind III gespalten. Ein Fragment mit einer Länge von 475 Basen wurde als Zielmolekül verwendet und durch Elektroelution aus einem 1%igen Agarosegel gereinigt. Um die Wirksamkeit der Einfangsstufen zu verfolgen, wurde das Fragment am 5'-Ende mit ³²P-ATP mit dem Enzym Polynukleotidkinase nach den Angaben des Herstellers markiert.
In den Beispielen Nrn. 2 und 3 wurden die enterotoxigenen Bakterien und der nicht-enterotoxigene E. coli-Wildtyp JM83 separat bis zu der jeweiligen Log-Phase gezüchtet. Der E. coli-Wildtyp dient als Kontrolle. Getrennte Extrakte der enterotoxigenen Bakterien und der Wildtypbakterien wurden im wesentlichen durch Solubilisieren der Zellen in chaotropen Lösungen hergestellt. So wurden die Bakterienkulturen in Luria-Brühe mit festem Guanidiniumthiocyanat (GuSCN) bis zu einer Konzentration von 5M GuSCN, Tris-HCl bis zu einer Konzentration von 0,3M und EDTA (pH 7) bis zu einer Konzentration von 0,1M versetzt. Die chaotropen Bakterienlösungen wurden dann auf 100ºC 5 Minuten lang erhitzt und abgekühlt. Der so erhaltene Extrakt enterotoxigener Bakterien wurde stufenweise mit dem Extrakt nicht-enterotoxigener Wildtyp- Bakterien verdünnt. Die Konzentration der tox-Plasmide pro Zelle und die Zellzahl in den Extrakten wurden durch herkömmliche Techniken gemessen. Die ursprünglichen Extrakte, die in GuSCN solubilisiert waren, enthielten etwa 10&sup9; enterotoxigene E. coli pro ml und 100 Plasmide/Zelle.

D. Synthese der Kügelchen

Die wiedergewinnbaren Träger wurden aus Magnetkügelchen hergestellt. Andere wiedergewinnbare Träger umfassen Teilchen, Fasern, Polystyrolkügelchen und andere Artikel, die physikalisch von einem Medium abgetrennt werden können. Magnetkügelchen wurden mit einem Addukt aus Desoxythymidin mit einer Länge von 10 Basen synthetisiert, und dann wurden die Kügelchen mit Sonden, die einen Desoxyadenosinschwanz hatten, in einer leicht umkehrbaren Weise assoziieren gelassen.
So wurden 100 ml Kügelchen mit funktionellen Amingruppen, wie BIO-MAG®-(M4100)-Kügelchen viermal mit 20 mM Natriumphosphat (pH 6,7) in vier 275 ml-T-Kolben gewaschen. Die Kügelchen wurden dann mit 1% Glutaraldehyd in 20 mM Natriumphosphat gewaschen. Dann wurden die Kügelchen in 100 ml 10%igem Glutaraldehyd in 20 mM Natriumphosphat (pH 6,7) drei Stunden lang bei Raumtemperatur umgesetzt. Die Kügelchen wurden dann extensiv mit 20 mM Natriumphosphat (pH 6,7) gewaschen und dann einmal mit 20 mM Phosphat (pH 7,6) gewaschen.
Getrennt davon wurde ein gereinigtes Ethylendiamin-(EDA)- Addukt von pdT&sub1;&sub0; (EDA-dT&sub1;&sub0;) gemäß Chu, B.C.F., G.M. Wahl und L. E. Orgel; Nucleic Acid Res. 11, 6513-6529 (1983) hergestellt, wobei auf diese Druckschrift hiermit Bezug genommen wird. Die Konzentration an EDA-dT&sub1;&sub0; wurde auf 1 OD/ml in 20 mM Phosphat (pH 7,6) eingestellt.
Das EDA-dT&sub1;&sub0; wurde mit den Magnetkügelchen vereinigt, wodurch EDA-dT&sub1;&sub0; mit den freien Aldehydgruppen der Kügelchen reagieren konnte. Das Gemisch aus EDA-dT&sub1;&sub0; und Kügelchen wurde in eine Vielzahl von 50 ml Polypropylenröhrchen aufgeteilt. Die das Reaktionsgemisch und die Kügelchen enthaltenden Röhrchen wurden in eine Zentrifuge gegeben und über Nacht bei Raumtemperatur zentrifugiert.
Dann wurden die Kügelchen fünfmal mit einer Waschlösung aus sterilem 20 mM Phosphat (pH 6,7) in großen 275 ml-T-Kolben gewaschen, um nicht-covalent gebundenes EDA-dT&sub1;&sub0; zu entfernen, und auf 200 ml mit der Waschlösung verdünnt.
Zur Lagerung können die Kügelchen monatelang in einem Puffer aus 20 mM Phosphat gehalten werden, der mit Natriumazid in einer Konzentration von 0,1% und SDS in einer Konzentration von 0,1% versetzt ist. Die Kügelchenpräparate werden lichtgeschützt bei 4ºC gelagert.
Die Kügelchen wurden dann in einem Puffer, der nachstehend als "Vorhybridisierungspuffer" bezeichnet wird, und aus 0,75M Natriumphosphat (pH 6,8), 0,5% Natriumlauroylsarcosin, 10 ug/ml E. coli-DNA, 0,5 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) (nukleasefrei) und 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) besteht, vorhybridisiert, um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren. Vor Einbringen der Sonden und der Kügelchen in die Verfahren zum Einfangen des Zielmoleküls wurden zwei Vorhybridisierungen der Kügelchen durchgeführt.
Das Vorhybridisierungsverfahren umfaßte das Einbringen der Kügelchen in 10 Volumina Vorhybridisierungspuffer.
Das erste Vorhybridisierungsverfahren wurde unter Rühren bei 60ºC durchgeführt. Das zweite Vorhybridisierungsverfahren wurde bei Raumtemperatur unter Verwirbeln durchgeführt. Eine 0,1%ige Isoamylalkohollösung wurde den Lösungen als Entschäumungsmittel zugesetzt.
Die Bindungskapazität der von dT&sub1;&sub0;-derivatisierten Kügelchen wurde nach dem folgenden Verfahren gemessen. In getrennten Gefäßen wurden dT&sub5;&sub0; und dA50 am 5'-Ende mit ³²P-dT bzw. ³²P-dA bis zu einer spezifischen Aktivität (Sa) von etwa 10&sup6; dpm/ug markiert. Dann wurde die Sa für eine bestimmte Menge an umgesetztem dT&sub5;&sub0; durch Trichloressigsäurefällung genau gemessen.
Dann wurden 5 ug ³²P-dA&sub5;&sub0; und 5 ug ³²P-dT&sub5;&sub0; mit im wesentlichem identischen Sas von 100.000 bis 200.000 dpm/mg separat den Reagenzgläsern, die den Vorhybridisierungspuffer enthielten, zugesetzt und auf ein Volumen von 1 ml gebracht.
Ein bekanntes Probenvolumen vorhybridisierter Kügelchen wurde in die vier Reagenzgläser gegeben. Zwei der vier Reagenzgläser erhalten jeweils 0,5 ml des ³²P-dA&sub5;&sub0;-Gemisches, und die verbleibenden zwei Reagenzgläser erhalten 0,5 ml des 32 P-dT&sub5;&sub0;-Gemisches. Alle vier Lösungen werden 5 Minuten lang Hybridisierungsbedingungen unterworfen. Die Kügelchen werden danach immobilisiert und gewaschen. Die Aktivitäten der Lösungen werden dann überwacht. Die gesamte Bindungskapazität C für eine Menge an Kügelchenpräparat, gemessen in Mikrogramm, ist nachstehend angegeben:
C = V(A - T)/X
In der vorstehenden Gleichung ist X die spezifische Aktivität von ³²P-dT&sub5;&sub0; in cpm/mg, V das Volumenverhältnis von Gesamtvolumen zu Probenvolumen, A die durchschnittliche Aktivität der in den ³²P-dA-Lösungen suspendierten Kügelchen in cpm, und T ist die durchschnittliche Aktivität der in den ³²P-dT-Lösungen suspendierten Kügelchen in cpm.
Einem Fachmann ist klar, daß andere Kügelchen, Teilchen, Fasern und dergleichen mit anderen Nukleotidkombinationen oder Homopolymeren formuliert werden können. Beispielsweise wurden poly-A-derivatisierte Kügelchen durch ersatzweise Verwendung (anstelle des gereinigten EDA-Addukts von dT&sub1;&sub0;) einer Lösung, die 100 mg poly A (MG> 100.OOO) in 50 ml 20 mM Natriumphosphat (pH 7, 6), enthält, hergestellt.

E. Verfahren zum Einfangen des Zielmoleküls

Die Kügelchenpräparate wurden verwendet, um die Ziel-Polynukleotide einzufangen. Nachstehend ist ein typisches Versuchsprotokoll zum Einfangen eines Zielmoleküls dargelegt, bei dem als Beispiele wiedergewinnbare Träger und reversibles Einfangen ohne Beschränkung verwendet wird, wobei das Verfahren unter Verwendung von A483 als erster Sonde und A532 als zweiter Sonde diskutiert wird. Die erste Sonde A483 wurde willkürlich am 3'-Ende mit ³²P-dCTP und ³²P-dGTP bis zu einer spezifischen Radioaktivität von etwa 1010 dpm/mg markiert. Die zweite Sonde, A532, wurde mit etwa 70 nicht-markierten dA-Resten durch das Enzym terminale Transferase endmarkiert.
Zuerst wurden 200 ug/ml markierte Sonde A483 und 400 ug/ml endständig markierte Sonde A532 mit variierenden Mengen eines hitzedenaturierten 475-meren Xba 1-Hind III-Restriktionsfragment des Enterotoxin-Gens bei 65ºC 15 Minuten lang in 1,4M Natriumchlorid vermischt.
Dann wurde das Einfangen des Zielmoleküls durch Inkontaktbringen des Mediums, das die Zielmolekül- und Sondeneinheiten enthielt, mit einem Aliquot an magnetischen dT&sub1;&sub0;-Kügelchen mit einer Bindungskapazität für dA&sub5;&sub0; von 3 ug/ml nach dem Vorhybridisierungsverfahren zur Verringerung der unspezifischen Bindung an das Magnetkügelchen initiiert. Das Magnetkügelchen und der Sonde-Zielmolekül-Komplex wurden in 0,1 ml Vorhybridisierungspuffer in 5 ml Polyethlyenröhrchen 2 bis 5 Minuten lang inkubiert.
Die Röhrchen wurden in eine magnetische Trennvorrichtung für Reagenzgläser von Corning gegeben. Die magnetische Trennvorrichtung für Reagenzgläser von Corning legt nach Aktivierung ein Magnetfeld durch die Polypropylenröhrchen an, das die Magnetkügelchen an den Innenwänden der Röhrchen immobilisiert. Während der Zeit, in der die Magnetkügelchen auf den seitenwänden der Polypropylenröhrchen immobilisiert sind, wurde das ursprüngliche Medium entfernt und verworfen.
In immobilisiertem Zustand wurden die Kügelchen dreimal mit 0,6 ml Vorhybridisierungspuffer, der Isoamylalkohol als Entschäumungsmittel enthielt, gewaschen. Nach der Zugabe des Vorhybridisierungspuffers wurden die Kügelchen durch Entnahme der Röhrchen aus dem Magnetfeld und heftigem Verwirbeln des Mediums resuspendiert.
Dann wurde das Magnetfeld erneut angelegt, um die Kügelchen zu immobilisieren, wobei der Vorhybridisierungspuffer entfernt und verworfen werden konnte. Der Zyklus Zugabe des Vorhybridisierungspuffers, Resuspendieren der Kügelchen, Immobilisieren der Kügelchen und Verwerfen des Vorhybridisierungspuffers wurde zweimal wiederholt. Die auf den Kügelchen gehaltenden Zielmolekül-Sonde-Komplexe sind für die weitere Verarbeitung einschließlich der zusätzlichen Stufen der Detektion, des Einfangs des Hintergrunds oder weiterer Einfangzyklen für das Zielmolekül verfügbar.
Ein bevorzugtes Einfangverfahren für das Zielmolekül umfaßt die Freisetzung des Zielmolekül-Sonde-Komplexes und das erneute Einfangen auf einem zweiten Träger. Bevorzugt unterscheidet sich der Träger chemisch von dem ersten Trägers.
Die Freisetzung des Zielmolekül-Sonde-Komplexes wird gemäß dem folgenden typischen Protokoll durchgeführt. Nach der Entfernung des letzten Vorhybridisierungspuffers wurde Vorhybridisierungspuffer dem die Kügelchen enthaltenden Röhrchen zugesetzt. Die Kügelchen wurden unter Rühren bei 60ºC 1 bis 2 Minuten lang inkubiert, um die Sonde-Zielmolekül- Komplexe von den Kügelchen freizusetzen. Die magnetische Trennvorrichtung wurde erneut bei einer Temperatur von 60ºC aktiviert, und das Eluat, das die freien Zielmolekül-Sonde- Komplexe enthält, wird dem Röhrchen entnommen. Das Eluat kann auf zusätzlichen wiedergewinnbaren Trägern eingefangen werden oder abschließend auf herkömmlichen Trägern eingefangen werden. Einem Fachmann ist klar, daß das Einfangen und Freisetzen des Zielmolekül-Sonde-Komplexes von wiedergewinnbaren Trägern, wie den Magnetkügelchen des vorliegenden Beispiels, so oft wie nötig wiederholt werden kann, um die Hybridisierung des Hintergrunds zu vermeiden.
Das abschließende Einfangen des Sonde-Zielmolekül-Komplexes wurde typischerweise auf Nitrocellulosefiltern oder Nylonmembranen, die nichtspezifisch gebundenes oder covalent gebundenes dT-3000 enthielten, durchgeführt. So wurden die Zielmolekül-Sonde-Komplexe, die auf den Magnetkügelchen vorhanden waren, von den Magnetkügelchen durch 2minütiges Erhitzen der Kügelchen auf 60ºC in Vorhybridisierungspuffer freigesetzt. Die Kügelchen wurden immobilisiert, und das Eluat wurde entnommen und durch ein 0,2 um Acrodisc ("Gelman") geleitet, um den magnetischen Abrieb zu entfernen. Der Nitrocellulosefilter, der dT-3000 enthielt, wählte den dA-Schwanz auf den unmarkierten Sonden aus, band ihn und fing ihn ein.
Die Verwendung eines chemisch unterschiedlichen festen Trägers für das abschließende Einfangen des Zielmolekül-Sonde- Komplexes vermeidet die Bindung der Hintergrundmoleküle, die eine hohe Affinität für die zuvor verwendeten Träger haben können. So ist es beispielsweise bei geringgradigen Verunreinigungen mit einer natürlichen hohen Affinität für einen speziellen Träger möglich, wiederholt an einen Träger zusammen mit den Sonde-Zielmolekül-Komplexen zu binden und zu eluieren. Solche geringgradigen Verunreinigungen können durch die wiederholte Verwendung eines wiedergewinnbaren Trägers der gleichen Zusammensetzung nicht so vollständig heraus verdünnt werden, wie durch deren Exposition gegenüber Trägern von sehr unterschiedlichen Zusammensetzungen. Geringgradige Verunreinigungen können auch durch Verwendung chemisch unterschiedlicher Mittel zur Freisetzung der Zielmolekül-Sonde-Komplexe aus Trägern und erneuten Einfang erniedrigt werden.

F. Verfahren zum Einfangen des Hintergrunds

Verfahren zum Einfangen des Hintergrunds erlauben die selektive Verringerung des Hintergrundrauschens, was den Nachweis eines echten Signals, das die Anwesenheit des Zielmoleküls anzeigt, erlaubt. Der Einfang des Hintergrunds kann in einem Einsondensystem oder in Systemen, in denen mehr als zwei Sonden verwendet werden, durchgeführt werden. Beispielsweise umfaßt bei Verfahren zum Einfangen des Hintergrunds mit einer einzelnen Sonde die Sonde eine Markereinheit und einen Liganden. Die Sonde kann an ein Zielmolekül binden, und der Ligand kann eine stabile Bindung mit einem Träger nur bilden, wenn die Sonde nicht an das Zielmolekül gebunden ist.
Auf ähnliche Weise umfassen beispielsweise Verfahren zum Einfangen des Hintergrunds mit mehrfachen Sonden zusammen mit dem Einfang des Zielmoleküls zwei Sonden. Eine erste Sonde zum Einfangen des Zielmoleküls mit einem nichtmarkierten Liganden mit der Fähigkeit, an einen ersten Träger zu binden, wird verwendet, um das Zielmolekül einzufangen, und eine zweite Sonde zum Einfangen des Hintergrunds mit einer nachweisbaren Markereinheit umfaßt einen zweiten Liganden mit der Fähigkeit, an einen zweiten Träger für den Hintergrund zu binden. Das Einfangen des Hintergrunds ist eine wertvolle Ergänzung zum Einfangen des Zielmoleküls, um das Signal-Rausch-Verhältnis eines Assays zu erhöhen. Nachstehend wird ein typisches Protokoll zum Einfangen des Hintergrunds, bei dem als erste Sonde zum Einfangen des Zielmoleküls A532 und als zweite Sonde zum Einfangen des Hintergrunds A726 und als Zielmolekül das Enterotoxin-Gen elt A1 verwendet werden. Einem Fachmann ist klar, daß die zu Demonstrationszwecken verwendeten Sonden nur eine Auswahl sind. Andere Sonden können auch verwendet werden.
Die Sonde A532 wurde mit etwa 100 dA-Resten am Ende markiert, die reversibel an covalent mit dT&sub1;&sub0; verknüpfte Magnetkügelchen für den ersten Einfang des Zielmoleküls und an nichtspezifisch an Nitrocellulose gebundenes dT&sub3;&sub0;&sub0;&sub0; für den abschließenden Einfang des Zielmoleküls binden können. Die Sonde A726 wurde am Ende durch die willkürliche Addition von etwa drei ³²P-dC- und ³²P-dG-Resten an das 3'-Ende mit terminaler Transferase markiert. Die Sonde A726 kann an dC-Cellulose binden, wenn die Sonde nicht an das Zielmolekül hybridisiert ist.
Eine Lösung, die das Zielmolekül-erste und zweite Sonde Komplex und möglicherweise nichtgebundenen zweite Sonde- Komplex und möglicherweise nichtgebundene zweite Sonde enthält, wird mit dC-Cellulose vermischt, und die Temperatur des Gemisches wird bei 37ºC gehalten. Die Temperatur 37ºC ist höher als die Dissoziationstemperatur von dG&sub7; mit oligo-dC, was die Bindung des Zielmolekül-erste und zweite Sonde-Komplex an dC-Cellulose verhindert. Die Temperatur ist auch niedriger als die Dissoziationstemperatur von dG&sub1;&sub0; mit oligo-dC, wodurch die Bindung nichtgebundener zweiter Sonde mit einem dG-Schwanz an die dC-Cellulose gefördert wird. Zusätzlich ist der Zielmolekül-erste und - zweite Sonde-Komplex sterisch in einem größeren Ausmaß für Annäherung an den dC-Cellulose-Träger als nichtgebundene zweite Sonde gehindert. Die dC-Cellulose, die die zweite Sonde A726 enthält, wird durch Zentrifugation entfernt; jedoch ist einem Fachmann klar, daß andere Methoden wie Filtration ebenfalls verwendet werden können. Das verbleibende Eluat enthält die Zielmolekül-erste und zweite Sonde-Komplexe und eine verminderte Konzentration an nichtgebundener markierter zweiter Sonde A726.

G. Beispiele

Einem Fachmann ist klar, daß die typischen Protokolle für die Herstellung des wiedergewinnbaren Trägers, die Herstellung der Sonde, den Einfang des Zielmoleküls und den Einfang des Hintergrunds so modifiziert werden können, daß sie spezielle Bedürfnisse und Zwecke erfüllen. Die folgenden Beispiele beziehen sich auf die vorstehend dargelegten typischen Verfahren, außer anders angegeben.

Beispiel 1

Einfangen des Zielmoleküls und Assay unter Verwendung von Magnetkügelchen

Ein Assay zum Einfangen eines Zielmoleküls wurde mit zwei Sonden und einem Magnetkügelchen als wiedergewinnbarem Träger durchgeführt. Das Zielmolekül umfaßte das Xba 1-Hind III-Fragment des Enterotoxin-Gens elt A1. Eine erste Sonde umfaßte eine 30-mere Oligonukleotidsonde A532, die einen Schwanz aus 130 nichtmarkierten dA-Resten mit der Fähigkeit, an dT&sub1;&sub0;-Reste eines Magnetkügelchens als Träger zu binden, hatte. Eine zweite Sonde umfaßte eine 30-mere Oligonukleotidsonde A483 mit der Fähigkeit, an die gleichen 20 Zielnukleotide stromabwärts der Hybridisierungsstelle der ersten Sonde zu binden. Die zweite Sonde wurde durch Anfügen eines Schwanzes an das 30-mere Oligonukleotid mit ³²P- dCTP und ³²P-dGTP bis zu einer spezifischen Radioaktivität von 10 0 DPM/Mikrogramm markiert.
Die mit einem Schwanz versehene erste Sonde und die markierte zweite Sonde wurden 15 Minuten lang bei 65ºC in 1,4M Natriumchlorid mit verschiedenen Mengen an hitzedenaturierten 475-meren Restriktionsfragmenten des tox-Gens inkubiert. Als nichtspezifische Kontrolle zur Bindung des Hintergrunds wurden die mit einem Schwanz versehene erste Sonde und die markierte zweite Sonde in identischen Lösungen in Abwesenheit jedes Zielmoleküls inkubiert. Als Kontrollen für die spezifische Bindung wurden zwei zusätzliche Reaktionsgemische gebildet. Ein Reaktionsgemisch umfaßte die mit einem Schwanz versehene erste Sonde und die nichtmarkierte zweite Sonde, die mit 4 Mikrogramm denaturierter E. coli-DNA inkubiert wurden, und ein zweites Reaktionsgemisch der mit einem Schwanz versehenen ersten Sonde und der markierten zweiten Sonde wurden in 10 Mikrogramm denaturierter menschlicher DNA in identischen Reaktionsgemischen ohne jede Ziel-DNA inkubiert.
Nach einer 15minütigen Hybridisierungsspanne wurden die Proben 5 Minuten lang mit dT-derivatisierten Magnetkügelchen in 0,7 ml 0,75molaren Phosphatpuffers (pH 6,8) inkubiert. Die Kügelchen wurden magnetisch immobilisiert und ausgiebig gewaschen, wie vorstehend beschrieben. Der Zielmolekül-Sonde-Komplex wurde von den Kügelchen bei 60ºC in 0,6 ml 0,20molarem Phosphatpuffer (pH 6,8) eluiert. Der erste Satz Kügelchen wurde von dem Eluat und dem Zielmolekül- Sonde-Komplex abgetrennt. Eine zweite Gruppe von Magnetkügelchen wurde dem Eluat zugesetzt und unter bindende Bedingungen gebracht, um den Komplex aus Zielmolekül und Sonde erneut einzufangen. Der zweite Satz an Kügelchen wurde gewaschen, und das Zielmolekül wurde erneut von den Kügelchen eluiert, und die Kügelchen wurden von dem Eluat abgetrennt.
Ein dritter Satz an Kügelchen wurde dem Eluat, das den Zielmolekül-Sonde-Komplex enthielt, zugesetzt und unter bindende Bedingungen gegeben, um den Einfang des Zielmolekül-Sonde-Komplexes durch die Kügelchen nochmals zu erlauben. Die Kügelchen wurden dann ausgiebig gewaschen, und das Zielmolekül eluierte von den Kügelchen wie vorstehend beschrieben. Die Kügelchen wurden dann von dem Eluat abgetrennt, und das Eluat wurde durch dT&sub3;&sub0;&sub0;&sub0;-Nylon in zwei Quadratmillimeter große Vertiefungen geleitet, wobei der Zielmolekül-Sonde-Komplex eingefangen wurde.
Die dT&sub3;&sub0;&sub0;&sub0;-Nylonmembran wurde hergestellt, indem 2 ug dT&sub3;&sub0;&sub0;&sub0; covalent an Nylon unter Verwendung einer "hybrislot-Vorrichtung" (Betlesda Research Laboratory) gebunden wurden. Kurz, dT&sub3;&sub0;&sub0;&sub0; (Life Sciences) wurde direkt auf eine Nylonmembran, wie Gene-ScreenTm (New England Nuclear) in einem salzfreien Trispuffer aufgetüpfelt. Die Membran wurde 10 Minuten lang bei Raumtemperatur getrocknet und dann unter einer Infrarotlampe weitere 10 Minuten lang getrocknet, bevor sie weitere 10 Minuten lang auf Raumtemperatur zurückgekühlt wurde. Die die Nylonmembran enthaltende Filtervorrichtung wurde auf einem UV-Transillumininator (Fotodyne) invertiert und zwei Minuten lang UV-Licht bei 40uW/cm² exponiert, um dT&sub3;&sub0;&sub0;&sub0; an den Filter zu vernetzen.
Die dT&sub3;&sub0;&sub0;&sub0;-Membran wurde durch aufeinanderfolgendes Durchleiten der folgenden Lösungen durch die Membran vorhybridisiert.
(1) 1% SDS
(2) 0,5 mg/m BSA in 0,5% SDS; und schließlich
(3) Vorhybridisierungspuffer.
Das dT&sub3;&sub0;&sub0;&sub0;-Nylon, das möglicherweise den Zielmolekül-Sonde- Komplex enthielt, wurde mit 0,2M Natriumphosphat und 5 mM EDTA gewaschen. Der Nylonträger wurde über Nacht autoradiographisch auf das Vorhandensein der ³²P-Markereinheiten der zweiten Sonde überwacht. Nach der Autoradiographie wurden die Banden aus dem Filter herausgeschnitten und in einer Basenszintillationsflüssigkeit ausgezählt. Die Counts betrugen 2100 und 1400 Counts pro Minute in der Lösung, die drei Femtomol (10&supmin;¹&sup5; mol) eines Restriktionsfragments, das das tox-Gen enthielt, enthielt. Proben, die 30 attomol (10&supmin;¹&sup8; mol) des Restriktionsfragments, das das tox-Genprodukt enthielt, enthielten, ergaben eine Countzahl von 62 Count pro Minute.
Eine dritte Probe, die keine DNA enthielt, erzeugte 7 Counts pro Minute. Eine vierte Probe, die 10 Mikrogramm hitzedenaturierte menschliche DNA enthielt, erzeugte 0 Counts pro Minute. Eine fünfte Lösung, die 4 Mikrogramm hitzedenaturierte E. coli-DNA enthielt, erzeugte 7 Counts pro Minute. Die absolute Empfindlichkeit des Protokolls wurde zu 10&supmin;¹&sup8; mol tox-Gen abgeschätzt. Die gesamte Effizienz der Wiedergewinnung des markierten Zielmolekül-Sonde- Komplexes wurde auf 1 bis 2% des Inputs geschätzt. Der Assay zeigte eine gute Spezifität. Es liegt nicht mehr markierte Sonde in den Proben, die menschliche DNA oder E. coli-DNA enthalten, vor als in der Probe, die überhaupt keine DNA enthält. Die Wiederholung des Versuchsprotokolls ergab eine Gesamteffizienz des Einfangens des Zielmoleküls von fast 5%. Das Verfahren erniedrigt den Hintergrund von einem anfänglichen Gehalt von 1011 Molekülen der markierten nichthybridisierten Sonden auf etwa 10&sup4; mol. Die Verringerung des Hintergrunds bietet eine 7 log Verbesserung, die mehr als adäquat die Verringerung und Effizienz des Einfangs kompensiert.

Beispiel 2

Das vorliegende Beispiel betrifft den Einfang eines Zielmoleküls unter Einfang des Hintergrunds. Der Einfang des Zielmoleküls und des Hintergrunds wurde unter Verwendung einer nichtmarkierten ersten Sonde zum Einfangen des Zielmoleküls A532, wie bei dem Einfang des Zielmoleküls beschrieben, und einer zweiten markierten Sonde zum Einfang des Hintergrunds A726 durchgeführt.
Zuerst wurden 160 ng/ml dA-markierter A532 und 40 ng/ml ³²P-markierte Sonde A726 zu einem Sondengemisch vereinigt. Das Sondengemisch wurde mit 5 ul Bakterienextrakt, der verschiedene Mengen der enterotoxigenen Gene enthielt, versetzt. Das Extrakt-Sondengemisch wurde 15 Minuten lang bei 22ºC inkubiert.
Nach einer 15minütigen Hybridisierungsspanne wurden die Proben mit 10 Volumina Vorhybridisierungspuffer verdünnt, 5 Minuten lang mit dT-derivatisierten Magnetkügelchen in 0,7 ml 0,75M Phosphatpuffer (pH 6,8) inkubiert, um den Einfang des Zielmoleküls zu bewirken. Die Kügelchen wurden magnetisch immobilisiert und ausgiebig gewaschen. Der Zielmolekül-erste und zweite Sonde-Komplex wurde von dem ersten Träger, wie vorstehend beschrieben, eluiert, und der erste feste Träger wurde entfernt.
Dann wurde das Eluat, das den Zielmolekül-erste und zweite Sonde-Komplex und möglicherweise nichtgebundene zweite Sonde enthielt, mit dC-Cellulose vermischt, und die Temperatur des Gemisches wurde bei 37ºC gehalten. Die Temperatur 37ºC ist höher als die Dissoziationstemperatur von dG&sub7; mit oligo-dC, wodurch die Bindung des Zielmolekül-erste und zweite Sonde-Komplexes an dC-Cellulose verhindert wird. Die Temperatur wurde auch unter der Dissoziationstemperatur von dG&sub1;&sub0; mit oligo-dC gehalten, um die Bindung der nichtgebundenen zweiten Sonde mit einem dG&sub1;&sub0;-Schwanz an die dC-Cellulose zu verhindern. Der Zielmolekül-erste und zweite Sonde- Komplex ist sterisch in einem größeren Ausmaß beim Annähern an den dC-Celluloseträger gehindert als nichtgebundene zweite Sonde. dC-Cellulose wurde durch Zentrifugation entfernt, jedoch ist einem Fachmann klar, daß andere Methoden wie Filtration ebenfalls verwendet werden können.
Das verbleibende Eluat wurde durch ein 0,2 um "Acrodisc" (Gelman) geleitet, um magnetischen und Celluloseabrieb zu entfernen. Dann wurde das Eluat durch Nitrocellulosefilter, die dT3000 enthielten, bei 22ºC geleitet. Die Nitrocellulose bewirkte den abschließenden Einfang des Zielmoleküls.
Tabelle 2 zeigt nachstehend die Anwendung des Einfangs des Hintergrunds. Tabelle 2 Stufe Signal Rauschen Erster Versuch Vor dem Einfangen des Zielmoleküls (unbekannt) Nach dem Einfangen des Zielmoleküls Nach dem Einfangen des Hintergrunds Nach der Filtration Zweiter Versuch Nach dem Einfangen des Hintergrunds (die Filtrationsstufe wurde nicht durchgeführt)
Die Entfernung des Rauschens auf weniger als 1 cpm erlaubt die Detektion sehr kleiner Mengen eines Zielmoleküls in einer Probe. Nur 10&supmin;¹&sup8; mol Zielmolekül wurden detektiert, was im Bereich liegt, der für klinische Anwendungen notwendig ist.
Eine Runde des Einfangens des Zielmoleküls entfernte etwa 3 log Hintergrund. Eine Runde des Einfangens des Hintergrunds entfernte 1 log Hintergrund, der noch nicht durch den ersten Einfang des Zielmoleküls entfernt worden war. Das abschließende Einfangen des Zielmoleküls durch Filtration (eine zweite Runde des Einfangens des Zielmoleküls) entfernte 2 log Hintergrund, der durch keine der beiden ersten Stufen entfernt worden war. Verfahren zum Einfangen des Zielmoleküls und des Hintergrunds arbeiten unabhängig voneinander, wodurch die Hintergründe um etwa 6 log in diesem Beispiel vermindert werden. Das Einfangen des Hintergrunds scheint nach Anwendung nach einem ersten Einfangen des Zielmoleküls besser zu funktionieren. Offensichtlich ist das Einfangen des Hintergrunds empfindlicher gegenüber Verunreinigungen in der Probe als das Einfangen des Zielmoleküls.
Die Kombination des Einfangens des Hintergrunds nach den Verfahren zum Einfangen des Zielmoleküls bietet einen größeren Nutzen als jedes Verfahren bei alleiniger Anwendung.
Obwohl die vorstehenden Beispiele sich auf radioaktive Markereinheiten beziehen, wird erwartet, daß das erfindungsgemäße Verfahren seinen größten Einfluß auf Assayverfahren hat, bei denen nicht-radioaktive Markereinheiten verwendet werden. Insbesondere ist die vorliegende Erfindung auflumineszierende Markereinheiten einschließlich fluoreszierender und chemilumineszierender Mittel anwendbar. Geeignete fluoreszierende Marker umfassen beispielsweise ohne Beschränkung Fluorescein, Pyren, Acridin, Sulforhodamin, Eosin, Erythrosin und Derivate davon. Geeignete chemilumineszierende Mittel umfassen beispielsweise ohne Beschränkung Mikroperoxidase, Luminol, Isoluminol, Glucoseoxidase, Acridiniumester und Derivate davon.

Beispiel 3

Das folgende Beispiel betrifft nicht-radioaktive Markereinheiten und mehrfache Runden des Einfangens eines Zielmoleküls aus damit versetzten biologischen Medien. Die versetzten biologischen Medien ähneln Proben, die klinisch in medizinischem Bereich erhalten werden.
Zellextrakte aus enterotoxigenem E. coli und Wildtyp E. coli wurden, wie vorstehend beschrieben, hergestellt. Um die Empfindlichkeit der Detektion von tox-Genen in einer einer klinischen Umgebung analogen Umgebung zu messen, wurde der die toxigenen Bakterien enthaltende Extrakt mit dem den Wildtyp E. coli enthaltenden Extrakt, wie vorstehend beschrieben, verdünnt.
Die folgenden Materialien wurden von anonymen Spendern erhalten: menschliche Stuhlprobe, Kuhmilch, menschlicher Speichel, menschlicher Schleim, menschliches Vollblut, menschliches Serum, menschlicher Urin und menschlicher Samen. Die Proben vom klinischen Typ wurden über eine Zeitspanne von 10 Minuten solubilisiert. Die Stuhlprobe wurde infolge ihrer festen Natur in einer Lösung aus 5M GuSCN, 0,3M Tris- HCl (pH 7,4), 0,1M EDTAT (pH 7), 1% β-Mercaptoethanol solubilisiert. Nach der Solubilisation wurden Aliquote der Probe hergestellt, und jedes Aliquot wurde mit einer bekannten Menge entweder an toxigenem E. coli oder Wildtyp E. coli versetzt. Das Gemisch wurde dann einer Rohfiltration (Biorad Econocolumn) unterworfen und 5 Minuten lang auf 100ºC erhitzt.
Der Rest der Proben war von flüssigerer Natur und wurde anders als der Stuhl gehandhabt. Die flüssigen Proben wurden mit festem GuSCN versetzt, wobei die Endkonzentration auf 5M eingestellt wurde. Das feste GuSCN enthielt auch ausreichend Tris-HCl, EDTA und β-Mercaptoethanol, um die Endkonzentrationen wie in den Stuhlproben einzustellen. Dann wurden Aliquote der Proben entnommen, und jedes Aliquot wurde mit einer bekannten Menge an toxigenen E. coli oder Wildtyp E. coli versetzt. Das Gemisch wurde einer Rohfiltration (Biorad Econocolumn) unterworfen und 5 Minuten lang auf 100ºC erhitzt.
Die Herstellung der Sonden in Beispiel 3 unterscheidet sich von den vorstehenden Beispielen. Eine erste Einfangsonde wurde mit dem Plasmid pBR322 erzeugt. Das Plasmid wurde mit Hha I und Hae III gespalten, und die Plasmidfragmente wurden mit einem Schwanz aus etwa 100 dA-Resten mit terminaler Transferase versehen. Das Zielplasmid besaß eine ausgedehnte Homologie mit pBR322 (Spicer und Noble, J. Biol. 257 : 5716-21). So wurden erste Einfangsonden aus Mehrfachfragmenten beider Stränge des Plasmids pBR322 in relativ großen Mengen erzeugt.
Eine zweite Markersonde wurde zur spezifischen Kombination mit dem Zielmolekül-Enterotoxingen veranlaßt. Die zweite Markersonde wurde aus einem EcoRI-Hind III-Restriktionsfragment eines in dem Bakteriophagen M13mp18 clonierten elt-A1-Gen erzeugt. E. coli HB101 wurde mit dem Bakteriophagen infiziert und bis zur Midlog-Phase gezüchtet. E. coli wurde geerntet, und der Bakteriophage wurde isoliert. Der Bakteriophage wurde mit biotinyliertem dCTP (Enzo Biochemicals) nick-translatiert, wobei ein Nick-Translations- Stammkit, der von Bethesda Research Laboratories erhältlich ist, verwendet wurde. Etwa 5% der Nukleotide wurden durch Biotinyl-Nukleotide ersetzt, wodurch eine mit Biotin markierte zweite Sonde gebildet wurde.
Ein Sondengemisch wurde durch Vereinigen von 8 ug/ml der zweiten M13-tox-Sonde mit 4 ug/ml der ersten mit einem dA- Schwanz versehenden Sonde in 20 mM Tris-HCl (pH 7,4) und 2 mM EDTA hergestellt. Das Sondengemisch wurde 10 Minuten lang auf 100ºC erhitzt, um die Sonden zu denaturieren.
Ein Volumen des Sondengemisches wurde mit einem Probenvolumen der Verdünnungsreihe gemischt, wodurch ein Hybridisierungsgemisch gebildet wurde. Das Hybridisierungsgemisch wurde 15 Minuten lang unter Hybridisierungsbedingungen bei 57ºC gehalten. Die Hybridisierungsgemische wurden anschließend mit 10 Volumina Blockierungspuffer (0,75M Natriumphosphat, pH 6,8, 0,5% Natriumlaurylsarcosin, 10 mg/ml E. coli-DNA, 0,5 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA-nukleasefrei) und 5 mM EDTA) verdünnt. Die Hybridisierungsgemische wurden mit dT&sub1;&sub0;-derivatisierten Magnetkügelchen, die wie vorstehend beschrieben hergestellt worden waren, versetzt. Die Hybridisierungsbedingungen wurden etwa 1 Minute lang bei 22ºC gehalten. Die Kügelchen wurden dann von dem Hybridisierungsgemisch durch magnetische Immobilisation der Kügelchen abgetrennt. Die Kügelchen wurden zweimal während eines 15minütigen Zeitintervalls gewaschen, um die Verunreinigungen in der biologischen Probe und nichthybridisierte, mit Biotin markierte, zweite Sonde zu entfernen.
Dann wurde in einer Zeitspanne von etwa 1 Minute der erste und zweite Sonde-Zielmolekül-Komplex von den Magnetkügelchen bei 65ºC in Blockierungspuffer eluiert. Das Eluat und die ersten Kügelchen wurden abgetrennt.
In einer Zeitspanne von etwa 7 Minuten wurde der erste und zweite Sonde-Zielmolekül-Komplex freisetzbar an einen zweiten Satz von Kügelchen gebunden und erneut freigesetzt. Ein zweiter Satz an dT&sub1;&sub0;-derivatisierten Kügelchen wurde dann dem Eluat zugesetzt, und die Hybridisierungsbedingungen wurden für etwa 1 Minute bei 22ºC beibehalten. Die Kügelchen wurden dann gewaschen und in Blockierungspuffer resuspendiert. Das die Kügelchen blockierende Puffergemisch wurde dann auf 65ºC gebracht, um den erste und zweite Sonde-Zielmolekül-Komplex freizusetzen.
Über eine Zeitspanne von 5 Minuten wurde das abschließende Einfangen des erste und zweite Sonde-Zielmolekül-Komplexes auf Nitrocellulose durchgeführt. Das Eluat aus den zweiten Kügelchen wurde durch ein Gelman Acrodisc (0,2 u) filtriert. Das Eluat, das den erste und zweite Sonde-Zielmolekül-Komplex enthielt, wurde dann durch ein dT&sub3;&sub0;&sub0;&sub0;-Nitrocellulosefilter (mit Blockierungspuffer vorhybridisiert) bei 22ºC geleitet.
In einer Zeitspanne von etwa 30 Minuten wurde der Filter weiter verarbeitet, um die Biotinmarker der zweiten Sonde zu detektieren. Die bei der Detektion verwendeten Pufferzusammensetzungen sind in der nachstehenden Tabelle 3 angegeben.

Tabelle 3

Detektionspuffer

Nr. des Puffers Zusammensetzung
1 1M NaCl, 0,1M Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM MgCl&sub2;, 0,1% Tween-20®
1a Nr. 1 mit 5 mg/ml BSA, 10 4g/ml E. coli-DNA
2 Nr. 1 mit 5% BSA, 0,5% Tween-20®
3 0,1M NaCI, 0,1M Tris-HCI (pH 9,5), 50 mM MgCl&sub2;
Als erstes wurde der Filter, der den erste und zweite Sonde-Zielmolekül-Komplex trug, etwa 5 Minuten lang in Detektionspuffer Nr. 2 inkubiert. Dann wurde der Filter 5 Minuten lang in einer 1 : 200 Verdünnung von Streptavidin-alkalische Phosphatase (Bethesda Research Laboratories) in Detektionspuffer Nr. 1a inkubiert. Danach wurde der Filter dreimal in 1 Minute in Detektionspuffer Nr. 1 gewaschen und dann zweimal in 1 Minute in Detektionspuffer Nr. 3 gewaschen.
Dann wurden 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP) und Nitroblue-Tetrazolium (NBT) (Kierkegaard und Perry) zwölfmal in Detektionspuffer Nr. 3 verdünnt und durch ein 0,2 um Acrodisc filtriert. Die verdünnte BCIP- und NBT-Lösung wurde dem Filter zugesetzt, und die Farbe wurde 15 Minuten lang bei 37ºC entwickeln gelassen.
Dann wurde der Filter in 50 mM Tris-HCl (pH 7,4) und 10 mM EDTA eine Minute lang inkubiert, um die Reaktion zu stoppen. Die Empfindlichkeit wurde visuell auf dem Filter oder durch densitometrisches Scanning auf CS 930 (Shimadzu Scientific) bestimmt.
Die Stufen des genannten Verfahrens sind nachstehend in Tabelle 4 dargestellt. Tabelle 4 Verstrichene Zeit Nr. der Stufe Benötigte Zeit (min) Gesamtzeit 1. Verdünnen der biologischen Probe; Denaturieren der DNA 2. Zugabe von markierten und nichtmarkierten Sonden; Hybridisierung in Lösung bei 57ºC 3. Einfang des Sonde-Zielmolekül-Komplexes auf Magnetkügelchen 4. Waschen der Magnetkügelchen, um Verunreinigungen in der biologischen Probe zu entfernen und Hybridisierung der Hintergründe 5. Elution des Sonde-Zielmolekül-Komplexes 6. Wiederholen der Stufen 3-5 an einem zweiten Satz von Kügelchen (ausgenommen die Abkürzung der Waschungen) 7. Binden des Sonde-Zielmolekül-Komplexes an dT&sub3;&sub0;&sub0;&sub0;-Nitrocellulose 8. Inkubieren des Filter in Blockierungspuffer 9. Binden von Streptavidin-alkalische Phosphatase 10. Waschen 11. Zugabe von Farbstoffen, um das Enzym nachzuweisen 12. Löschen der Reaktion
Obwohl die Tabelle 4 ein Beispiel gibt, bei dem die verstrichene Zeit über einer Stunde liegt, kann das Verfahren modifiziert werden und kann in kürzeren Zeiten durchgeführt werden. Assays mit nichtradioaktiven Sonden vergleichbarer Empfindlichkeit können 12 Stunden bis mehrere Tage benötigen und benötigen eine ausgedehnte Probenvorbereitung.
Die Empfindlichkeit des vorliegenden Assays ist in der nachstehenden Tabelle 5 angegeben. Tabelle 5 Höhe der Empfindlichkeit Biologische Probe Konzentration in dem Hybridisierunggemisch Anzahl der Bakterien Bakterienextrakt allein menschlicher Stuhl Kuhmilch menschlicher Speichel menschlicher Urin menschlicher Samen menschliches Blut menschliches Serum menschlicher Schleim 2,5% (Gew./Vol.)
Ferner können die erfindungsgemäßen Verfahren modifiziert werden, um die Empfindlichkeiten zu verbessern. Beispielsweise erzeugt eine Kombination aus thermischer Elution und chemischer Elution in mehrfachen Einfang-Freigabezyklen ein Signal-Rausch-Verhältnis, das fünfmal besser ist als bei Einzelelutionsformen, entweder mehrfache thermische Elutionen allein oder mehrfache chemische Elutionen allein.
Die Anwendung des gleichen Freisetzungs- oder Elutionsverfahren neigt dazu, den gleichen Hintergrund von dem Träger freizusetzen. Jedoch neigt die Anwendung verschiedener Freisetzungsbedingungen dazu, den Hintergrund auf dem Träger zurückzubehalten, der sonst eluiert werden würde. Es ist unwahrscheinlich, daß sich der Hintergrund identisch wie ein Zielmolekül unter den beiden physikalisch oder chemisch unterschiedlichen Bedingungen verhält.
Eine typische chemische Elution der Zielmolekül-Sonde-Komplexe von Magnetkügelchen umfaßt das Inkontaktbringen der Kügelchen mit 3M GuSCN für eine Minute bei Raumtemperatur. Beispiele für thermische Elutionen wurden vorstehend beschrieben.
Die Fähigkeit Bakterien nachzuweisen würde auch durch Richten der Sonden gegen ribosomale RNA-Sequenzen verbessert werden. Ribosomale RNA-Sequenzen sind in einer 1000fachen Erhöhung in einem Zielmolekül pro Zelle, verglichen mit genomischer DNA und klinisch signifikanter Plasmid-DNA, vorhanden.
Die Empfindlichkeit der vorstehenden Methoden zum Einfang von DNA oder RNA-Zielmolekülen kann durch Amplifikation der eingefangenen Nukleinsäuren verstärkt werden. Dies kann durch nichtspezifische Replikation unter Verwendung von Standardenzymen (Polymerasen und/oder Transkriptasen) erzielt werden. Nach der Replikation kann die amplifizierte Nukleinsäure wie vorstehend mit der Einfangsonde, der Reportersonde und den Einfangkügelchen umgesetzt werden, um die amplifizierten Sequenzen zu reinigen und anschließend zu detektieren.
Zusätzlich können, wenn die Amplifikation nach der Reinigung der Ziel-Nukleinsäure, wie vorstehend beschrieben, verwendet wird, die amplifizierten Nukleinsäuren gemäß anderen herkömmlichen Methoden detektiert werden, bei denen keine Einfangsonde, Reportersonde und Einfangkügelchen, wie vorstehend beschrieben, verwendet werden, d. h. die Detektion kann in Lösung oder auf einem Träger, wie bei Standard-Detektionstechniken durchgeführt werden.
Die Amplifikation der Ziel-Nukleinsäuresequenzen kann unspezifische Enzyme oder Primer (d. h. Enzyme oder Primer, die die Replikation von praktisch allen Nukleinsäuresequenzen verursacht) durchgeführt werden, weil sie auf die Reinigung folgt. Obwohl jeder Hintergrund, Nicht-Zielmoleküle, Nukleinsäuren zusammen mit dem Zielmolekül repliziert werden, ist dies kein Problem, weil der Hauptanteil der Hintergrund-Nukleinsäuren im Verlauf des Einfangverfahrens entfernt wurde. So werden keine speziell maßgeschneiderten Primer für jeden Test benötigt, und die gleichen Standard- Amplifikationsreagentien können unabhängig von den Zielmolekülen verwendet werden.
Nachstehend sind Beispiele des Verfahrens angegeben.

Beispiel 4

Das folgende Beispiel erläutert die Verwendung von RNA-Polymerase, um Ziel-DNA zu amplifizieren, die durch ein Verfahren eingefangen wurde, das eine Variation des vorstehend diskutierten Einfangverfahrens ist.
Bezugnehmend auf Fig. 4 wird die Ziel-DNA einer Probe zuerst durch Anwendung von Scherkräften oder eine begrenzte Spaltung durch eine Nuklease gemäß Standardmethoden verkleinert. Eine mit einem recA-Protein beschichtete Einfangsonde wird dann der gespaltenen Ziel-DNA (Proc. Natl. Acid. Sci. USA (1986) 83 : 9591) zugesetzt. Die mit dem recA-Protein beschichtete Sonde enthält eine Nukleinsäuresequenz (a), die einer ersten Zielsequenz (a¹) der Ziel-DNA homolog ist, sowie eine homopolymere Sequenz, die einer Nukleinsäuresequenz auf einem Einfangkügelchen homolog ist. Dieses Einfangkügelchen wird dann dem Gemisch zugesetzt, um die Ziel-Nukleinsäure zu isolieren und zu reinigen, wie vorstehend beschrieben.
Die eingefangene DNA wird durch Behandlung des Gemisches mit E. coli-RNA-Polymerase, der die Sigma-Untereinheit fehlt, d. h. das Core-Enzym, amplifiziert. E. coli-RNA-Polymerase wird von R. Burgess in RNA Polymerase, Cold Spring harbor press, Seiten 69-100, beschrieben und kann von New England Biolabs, Beverly, MA, bezogen werden. Die Sigma-Untereinheit wird nach dem in J. Biol. Chem. (1969) 244 : 2168 und Nature (1969) =221=:43 beschriebenen Verfahren entfernt. Andere Phagen- oder bakterielle RNA-Polymerasen, denen die Transkriptionsspezifität fehlt, können ebenfalls verwendet werden. Das Core-Enzym wird zusammen mit Nukleotidtriphosphaten und einem Transkriptionspuffer mit niedrigem Salzgehalt, wie in Eur. J. Biochem. (1976) 65 : 387 und Eur. J. Biochem (1977) 74, 1107 beschrieben, zugesetzt.
Eine geeignete Nukleotidtriphosphat/ Transkriptionspufferlösung besitzt die folgende Zusammensetzung:
0 bis 50 mM NaCl oder KCl
25 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,9
10 mM MgCl&sub2;
0,1 mM EDTA
0,1 mM Dithiothreit
0,5 mg/ml BSA
0,15 mM UTP, GTP, CTP, ATP
Die so erhaltene nichtspezifische Transkription der Ziel- DNA erzeugt viele RNA-Transkripte der Ziel-DNA, die dann unter Verwendung einer Einfangsonde, die eine Sequenz (b¹), die einer Sequenz (b) der RNA-Transkripte homolog ist, enthält, eingefangen werden. Eine Reportersonde, die eine Sequenz (c¹), die einer anderen Sequenz (c) des RNA-Transkripts homolog ist, enthält, wird dann zur Detektion verwendet.

Beispiel 5

In diesem Beispiel werden sowohl die nichtspezifische Replikation der Ziel-DNA als auch die Transkription dieser DNA verwendet, um die eingefangene Ziel-DNA zu amplifizieren.
Unter Bezugnahme auf Fig. 5 wird denaturierte Proben-DNA wie vorstehend beschrieben eingefangen, und das Enzym DNA- Polymerase (beispielsweise Klenow-Fragment; Dur. J. Biochem., (1974) 45 : 623 , erhältlich von New England Biolabs), willkürliche oligohexamere Primer (d. h. Primer, die so hergestellt wurden, daß sie willkürlich ausgewählte Basen an jeder Nukleotidposition in dem Hexameren enthalten) und Desoxynukleotidtriphosphate werden in geeigneten Puffer zugesetzt und verursachen die Replikation der Ziel-DNA, wodurch zusätzliche doppelsträngige DNA gebildet wird. Geeignete oligohexamere Primer sind unter der Katalognummer 27-2166 von Pharmacia, Inc. Piscotaway, NJ, erhältlich. Eine geeignete Desoxynukleotidtriphosphat/Pufferlösung besitzt die folgende Zusammensetzung:
66 mM Glycin-NaOH-Puffer, pH 9,2
6 mM MgCl&sub2;
1 mM 2-Mercaptoethanol
30 mM jeweils dCTP, dGTP, dTTP, dATP
Weil die Primer zufällig sind, binden einige einfach aus statistischen Gründen an die Probensequenzen und verursachen deren Replikation, unabhängig davon, wie diese Sequenzen sind. (Alternativ kann die doppelsträngige DNA durch eine Synthese, ausgehend von der Einfangsonde a.) gebildet werden.) Dann wird eine RNA-Polymerase ohne die Sigma-Untereinheit zusammen mit Nukleotidtriphosphaten und einem Transkriptionspuffer niedriger Salzkonzentration zugesetzt. Die Transkription von der Ziel-DNA (deren Zahl erhöht wurde) erzeugt viele RNA-Kopien dieser DNA. Die RNA-Transkripte werden dann eingefangen und wie in Beispiel 4 detektiert.

Beispiel 6

In diesem Beispiel wird die Ziel-DNA unter Verwendung von DNA-Polymerase repliziert.
Unter Bezugnahme auf Fig. 6 wird eine Proben-DNA, wie in den Beispielen 4 und 5 beschrieben, denaturiert, verkleinert und eingefangen. Die DNA-Polymerase, beispielsweise das Klenow-Fragment und die Desoxynukleotidtriphosphate, werden in einem geeigneten Puffer mit willkürlichen hexameren Oligonukleotiden zugesetzt, um eine nichtspezifische Synthese doppelsträngiger DNA zu bewirken. Das in vitro synthetisierte DNA-Produkt wird dann durch Hitzebehandlung (z. B. 100ºC für drei Minuten) oder eine äquivalente Behandlung einzelsträngig gemacht, und zusätzliche DNA-Polymerase wird dann zugesetzt, um die durch Hitzebehandlung inaktiv gemachte DNA-Polymerase zu ersetzen. Dann wird die in vitro-DNA-Replikation ablaufen gelassen. Die Hitzebehandlung und die Polmerisationsreaktionen werden etwa zehnmal wiederholt, um eine etwa 1000fache Zunahme des Gehalts der Ziel-DNA zu erzeugen. Die replizierte DNA wird in vitro unter Verwendung von Hitze oder Alkali denaturiert und dann wie vorstehend beschrieben eingefangen und detektiert.

Beispiel 7

In diesem Beispiel wird von Ziel-DNA transkribierte rRNA oder RNA unter Verwendung einer Einfangsonde, wie vorstehend beschrieben, gereinigt. Das Hybridduplex wird dann denaturiert, und einzelsträngige Nukleinsäuren werden dann nichtspezifisch unter Verwendung von Qβ-Replikase (Methods in Enzymology (1979) 60 : 628) repliziert. Diese Replikase replizierte sowohl Messenger-RNA als auch ribosomale RNA nichtspezifisch unter den von Blumental, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 : 2601, 1908, beschriebenen Bedingungen. Weil das Replikationsprodukt eine Matrize für das Enzym ist, wird die RNA exponentiell repliziert.

Claims

1. Verfahren zur Amplifikation eines möglicherweise in einer Probe mit Nicht-Zielpolynukleotiden vorhandenen Zielpolynukleotidmoleküls, umfassend die Stufen:

a) Inkontaktbringen der möglicherweise das Zielmolekül enthaltenden Probe mit einem ersten Träger und einer ersten Sonde mit der Fähigkeit, spezifisch mit dem Zielmolekül unter bindenden Bedingungen zu assoziieren, und weiterhin mit der Fähigkeit, mit dem ersten Träger unter bindenden Bedingungen zu assoziieren;

b) Abtrennen des ersten Trägers von der verbleibenden Probe unter Bildung eines Entfernungsprodukts, das bei Vorliegen des Zielmoleküls das Zielmolekül umfaßt;

c) Amplifikation des Entfernungsprodukts, wobei bei Vorliegen des Zielmoleküls ein Amplifikationsprodukt gebildet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verfahren weiterhin die Stufe der Bestimmung des Vorliegens des Amplifikationsprodukts umfaßt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Stufe der Bestimmung des Vorliegens des Amplifikationsprodukts das Inkontaktbringen des Amplifikationsprodukts mit einer zweiten Sonde mit einer Markereinheit umfaßt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verfahren weiterhin die Stufe des Inkontaktbringens des Amplifikationsprodukts mit einem zweiten Träger mit der Fähigkeit, spezifisch mit dem Amplifikationsprodukt unter bindenden Bedingungen zu assoziieren, umfaßt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der erste Träger einen wiedergewinnbaren Träger umfaßt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die erste Sonde zuvor an den ersten Träger gebunden worden ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die erste Sonde einen Liganden mit der Fähigkeit, an einen mit dem ersten Träger assoziierten Antiliganden zu binden, umfaßt.

8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die erste Sonde mit recA-Protein beschichtet ist.

9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Amplifikationsstufe die Behandlung des Zielmoleküls mit einer Polymerase umfaßt.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Polymerase RNA- Polymerase, Qβ-Replikase, Transkriptase oder DNA-Polymerase ist.

11. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Zielmolekül eine DNA ist, und vor der Stufe der Behandlung des Zielmoleküls mit der Polymerase das Zielmolekül zur Replikation dadurch veranlaßt wird, daß man das Zielmolekül mit einer DNA-Polymerase und einem nichtspezifischen Oligonukleotidprimer behandelt.

12. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Zielmolekül mRNA ist.

13. Kit zum Einfangen und Amplifizieren eines Zielpolynukleotids, das in einem Probenmedium enthalten ist, das möglicherweise das Zielmolekül mit Nicht-Zielpolynukleotiden enthält, umfassend:

a) eine erste Sonde mit der Fähigkeit, an einen Träger und das Zielmolekül unter bindenden Bedingungen zu binden;

b) einen Träger mit der Fähigkeit, eine im wesentlichen homogene Dispersion in einem Probenmedium zu bilden, und mit der Fähigkeit, daraus unter Bildung eines Entfernungsprodukts, das bei Vorliegen des Zielmoleküls in der Probe das Zielmolekül umfaßt, abgetrennt zu werden; und

c) Amplifikationsreagentien, die der Anwendung auf das Entfernungsprodukt angepaßt sind.

14. Kit nach Anspruch 13, wobei der Träger mindestens ein Kügelchen umfaßt.

15. Kit nach Anspruch 14, wobei das Kügelchen mit einem Magnetfeld wechselwirken kann.

16. Vorrichtung zur Durchführung von Assays auf Zielpolynukleotide gemäß dem Verfahren nach Anspruch 1, umfassend:

eine Reaktionskammer, die der Aufnahme von Zielpolynukleotiden und Nicht-Zielpolynukleotiden in einem Probenmedium angepaßt ist, und einen Träger mit der Fähigkeit zur im wesentlichen homogenen Dispersion in dem Probenmedium und der Fähigkeit zur Bildung eines Komplexes mit dem Zielmolekül;

Mittel zur Abtrennung des Trägers von dem Probenmedium unter Bildung eines Entfernungsprodukts, das bei Vorliegen des Zielmoleküls in dem Medium das Zielmolekül umfaßt, wobei das Entfernungsprodukt im wesentlichen frei von Nicht-Zielpolynukleotiden ist;

Mittel zur Amplifikation des Zielmoleküls als Teil eines Entfernungsprodukts unter Bildung eines Amplifikationsprodukts; und

Mittel zum Nachweis des Amplifikationsprodukts.