DE69031665T2

DE69031665T2 - Nachweis von Nukleinsäuresequenzen unter Verwendung von Fluoreszenz-Polarisation

Info

Publication number: DE69031665T2
Application number: DE69031665T
Authority: DE
Inventors: Andrew John Garman; Robert Stanley Moore
Original assignee: Zeneca Ltd
Current assignee: Garman Andrew Ashton Chester Gb
Priority date: 1989-02-07
Filing date: 1990-02-02
Publication date: 1998-02-26
Anticipated expiration: 2010-02-03
Also published as: CA2009454C; JPH02295496A; CA2009454A1; NO900582D0; EP0382433A2; IE900442L; GB2228998A; GB9002536D0; ES2109226T3; AU4902590A; GB2228998B; EP0382433A3; ZA90912B; FI900602A0; IL93297A0; ATE159984T1; NO900582L; EP0382433B1; DE69031665D1; US6022686A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuresequenzen und insbesondere auf die Verwendung von fluoreszierend markierten Nukleinsäure Sonden.
Derzeit verfügbare Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuresequenzen beinhalten eine relativ große Anzahl von Schritten und sind umständlich durchzuführen. Einige der guteingeführten Verfahren sind z.B. in Hybridisation, von B. D. Hames und S. J. Higgins (Herausgeber) IRL Press 1985 und J. A. Matthews et al., Analytical Biochemistry, 169, 1988, 1 - 25 (Academic Press) beschrieben. Typischerweise wird die DNA, die zu untersuchen ist, denaturiert und an einen festen Träger, z.B. Nitrocellulose oder Nylon gebunden und dann mit einer Sondensequenz, die zu der Zielsequenz komplementär ist und eine Markierung, z.B. ³²p enthält, oder die eine Hälfte eines Affinitätspaars ist, z.B. Biotin, inkubiert. Nach Inkubation und Waschen der festen Phase wird dann unter Erhalt eines Signals durch Autoradiographie für 32p oder im Fall von Biotin typischerweise durch Zusatz eines Avidin-Enzym-Konjugats entwickelt, danach gewaschen und dann abgezogen. Es sind auch "Sandwich"-Analysenverfahren bekannt, in denen eine Einfang-Nukleinsäure-Sonde mit einer zu der Zielsequenz komplementären Sequenz an einen herkömmlichen festen Träger gebunden wird. Diese wird dann an der Zielsequenz hybridisieren gelassen. Danachwird eine markierte Sonde an einem anderen Teil der Zielsequenz hybridisieren gelassen und nach Waschschritten wird die Markierung in geeigneter Weise entwickelt. Alternativ wird das "Sandwich" in Lösung mit zwei Sonden, von denen eine die Markierung und die andere eine Hälfte eines Affinitätspaares enthält, gebildet. Nach Hybridisierung wird die Lösung dann mit der festen Phase, an welche die andere Hälfte des Affinitätspaares gebunden ist, in Kontakt gebracht. Danach finden ein Waschen und eine Signalentwicklung statt. Alle diese Verfahren und ihre Varianten erfordern zahlreiche Behandlungsschritte, Inkubationen, Waschvorgänge und dgl., was zu Verfahren führt, die sowohl umständlich wie zeitaufwendig sind.
K. Kleppe et al. offenbaren in J. Mol. Biol. (1971), 56, 341-361 ein Verfahren zur Amplifikation einer gewünschten DNA-Sequenz. Das Verfahren beinhaltet eine Denaturierung eines DNA-Doppelstrangs unter Bildung von Einzelsträgen. Der Denaturierungsschritt wird in Gegenwart eines ausreichend großen überschusses von zwei Nukleinsäure-Primern durchgeführt, welche bei Abkühlung an Bereichen, die zu der gewünschten DNA-Sequenz benachbart sind, hybridisieren. Auf diese Weise werden zwei Strukturen erhalten, von denen jede die volle Länge des angestrebten Stranges, der in geeigneter Weise mit Primer ergänzt ist, enthält. Es werden DNA- Polymerase und eine ausreichende Menge jedes erforderlichen Deoxynukleosidtriphosphats zugesetzt, wodurch zwei Moleküle des Originaldoppelstrangs erhalten werden. Der oben genannte Zyklus Denaturierung, "Primer annealing" und Verlängerung werden wiederholt, bis die geeignete Anzahl von Kopien der gewünschten DNA-Sequenz erreicht ist. Es wird betont, daß eine Einstellung der Primer-Konzentration erforderlich sein kann. Das obige Verfahren wird nun als die Polymerase-Kettenreaktion (PCR = polymerase cham reaction) bezeichnet, wie sie z.B. in der europäischen Patentanmeldung, Veröffentlichung Nr. 0 201 184 beschrieben ist. Verfahren zum Nachweis von amplifizierten Nukleinsäuresequenzen, z.B. von durch PCR erzeugten DNA-Sequenzen, sind die oben anaeführten. Alternativ können sie durch Gel- Elektrophorese analysiert werden, und das Vorliegen eines Bandes mit einem angegebenen Molekulargewicht wird als Beweis für das Vorliegen der Sequenz in der Original-DNA- Probe, wie sie durch die in der Amplifikationsreaktion verwendeten spezifischen Primer definiert ist, angenommen. Derartige Verfahren sind auch wieder relativ zeitaufwendig und umständlich.
Es ist daher wünschenswert, ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuresequenzen bereitzustellen, das mindestens einen Teil der oben genannten Probleme löst. Die vorliegende Erfindung basiert auf der Feststellung, daß eine Hybridisierung einer fluoreszierenden Nukleinsäure-Sonde an einer Ziel-Nukleinsäuresequenz, oder eine Extension eines fluoreszierenden Nukleinsäure-Primers zu einer verlängerten Kette durch Fluoreszenz-Polarisation nachgewiesen werden kann und daß unter Anwendung dieses Prinzips nützliche diagnostische Analysenverfahren gefunden werden können.
Fluoreszierende Markierungen wurden umfangreich auf dem Gebiet von Analysenverfahren für biologische Moleküle eingesetzt. Ein besonders nützliche Form einer Fluoreszenz- Analyse ist die, die die Anwendung der Fluoreszenz- Polarisation, wie sie von Dandliker und Feigen, Biochem. Biophys. Res. Comm. 5, 299-304 (1961) beschrieben ist, beinhaltet. In diesem Immunoassay wird ein fluoreszierend markiertes Analytenmolekül bereitgestellt, das mit dem Analytenmolekül um den spezifischen Antikörper konkurriert. Das Ausmaß einer Bindung an den Antikörper wird durch Messung der Fluoreszenz-Polarisation bestimmt, eine Größe, die für einen gegebenen Fluorophor unter gegebenen Bedingungen vom Volumen oder angenähert vom Molekulargewicht der Arten, an die der Fluoron gebunden ist, abhängt. Auf diese Weise ist das Verfahren fähig, zwischen an Antikörper gebundenem und freiem Fluoron zu unterscheiden. Kurz ausgedrückt, die Fluoreszenz-Polarisation einer Probe wird gemessen, indem die Probe mit polarisiertem Licht angeregt wird und die Polarisation des emittierten Lichts gemessen wird. Große, sich langsam bewegende Moleküle werden sich zwischen der Absorption und der Emission des Photons wenig bewegen und daher wird das emittierte Licht einen hohen Polarisationsgrad zeigen. Umgekehrt werden kleinere Moleküle einen geringer Polarisationsgrad zeigen (siehe Prinzipien der Fluorescence Spectroscopy, J. E. Lakowicz, 1983, Plenum). Ein grundsätzlicher Vorteil dieses Immunoassay-Typs ist der, daß er homogen ist, d.h. keine Trennungsschritte beinhaltet. Allerdings wurde die Immunoassay- Technik der Fluoreszenz-Polarisation auf Analyten mit niedrigem Molekulargewicht beschränkt, das sind Analyten mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 1 000, wie z.B. Arzneimittel und Hormone mit niedrigem Molekulargewicht wie z.B. Thyroxin. Entsprechende Analysen für Nukleinsäuresequenzen können nicht einfach entwickelt werden, da keine Antikörper bekannt sind, die einsträngige oder doppelsträngige Nukleinsäuren mit verwendbarer Sequenzspezifität erkennen.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist in der molekularbiologischen Forschung und in allen Bereichen der diagnostischen Medizin und anderer diagnostischer Wissenschaften, z.B. in der forensischen, landwirtschaftlichen, veterinärmedizinischen oder Nahrungsmittel-Wissenschaft anwendbar, wenn es notwendig ist, spezifische Nukleinsäuresequenzen nachzuweisen oder zu messen. Es ist insbesondere für den Nachweis von infektösen Mikroorganismen und auf den Nachweis von Punktmutationen, Gendeletionen und Umgruppierungen verwendbar, die zu verschiedenen vererbten Erkrankungen und Prädispositonen führen. Eine weitere Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß es zur Messung von Nukleinsäuren verwendet werden kann, die selbst als Teil eines Analysensignalsystems erzeugt werden, z.B. die RNA-Sequenz, die durch Qβ-Replikase erzeugt wird, was in Nucleic Acids Research, 14, 5591-5603, (1986) oder Biotechnology, Band 6, Seiten 1197-1202, (Oktober 1988) beschrieben ist. Eine besonders vorteilhafte Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt bei der Analyse von DNA-Sequenzen, die durch die Polymerase-Kettenreaktion (POR), die vorstehend beschrieben wurde, erzeugt werden. Weitere vorteilhafte Anwendungen des erfindungsgemäßen Verfahrens stehen in Beziehung zu den auf Transkription basierenden Nukleinsäure-Amplifikations/Nachweis-Systemen von Siska Diagnostics Inc., die in der PCT-Patentveröffentlichung WO 88/10315 beschrieben sind, und zu dem mit Ligase ablaufenden Amplifikationssystem von Biotechnica International (EP-320308).
Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, daß es in homogener Phase, z.B. in der Lösungsphase durchgeführt werden kann. Dies bedeutet, daß im allgemeinen nur eine einzige Zugabe eines Reagenzes, das eine oder mehrere Polynukleotid-Arten wie z.B. Polynukleotid-Sonden enthält, zu der DNA-Probe erforderlich ist, was zu einer Zeit- und Arbeitsersparnis führt. Im allgemeinen ist nur eine einzige Inkubation inbegriffen, und Trennungs-, Wasch und elektrophoretische Schritte werden vermieden.
Nach einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweis einer Ziel-Nukleinsäuresequenz in einer Probe bereitgestellt, wobei das Verfahren ein Inkontaktbringen der Nukleinsäure-Probe mit einer fluoreszierenden Nukleotid-Sonde, die zur Hybridisierung mit der Ziel-Nukleinsäuresequenz geeignet ist, in homogener Lösung und Nachweisen des Vorliegens oder Fehlens einer derartigen Hybridisierung durch Fluoreszenz-Polarisation umfaßt.
Die Probe ist im allgemeinen biologischen Ursprungs und wird z.B. von Menschen, Pflanzen und/oder Tieren erhalten. Die Ziel-Nukleinsäure ist im allgemeinen eine prokaryotische und/oder eukaryotische Nukleinsäure oder eine Amplifikationsprodukt derselben. Gunstige Aspekte der vorliegenden Erfindung beinhalten den Nachweis von menschlichen oder tierischen DNA-Sequenzen wie z.B. menschlichen DNA-Sequenzen.
Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Polynukleotid-Sonden umfassen Polynukleotide von DNA, RNA oder irgendeine andere Sorte, die an Nukleinsäuresequenzen hybridisierbar ist. Es ist zu erkennen, daß solche Nukleinsäuresequenzen Basenanaloge wie auch die natürlich vorkommenden Basen Cytosin, Adenin, Guanin, Thymin und Uracil enthalten können. Solche Basenanalogen umfassen Hypoxanthin, 2,6-Diaminopurin und 8-Azaguanin. Die Sonden können doppelsträngig (ds) oder einsträngig (ss) vorliegen, sind aber vorzugsweise einsträngig. Sie können durch direkte Synthese, Verlängerungsreaktionen unter Mithilfe von Polymerase oder durch Klonen oder nach einem anderen vorteilhaften Verfahren hergestellt werden. Diese Nukleotid-Sonden sind fluoreszierend markiert, wie später beschrieben wird.
Der Ausdruck "Hybridisierung", wie er hier verwendet wird, beinhaltet eine Hybridisierung zwischen einer Polynukleotid-Sonde und einer gewünschten Zielsequenz, schließt aber eine Hybridisierung zwischen einer Polynukleotid-Sonde und nicht-gewünschten Nukleotidsequenzen aus. Geeignete Bedingungen für eine Hybridisierung sind dem Wissenschaftler mit normalen Wissen bekannt, siehe z.B. "Nucleic Acid Hybridisation", B. D. James und S. J. Higgins (Herausgeber), IRL Presse, Oxford, 1985. Im allgemeinen wird die fluoreszierende Sonde der Ziel-Nukleinsäure zugesetzt, so daß ein wesentlicher Hybridisierungsgrad in einem günstigen Zeitraum vor der Messung erzielt wird. Passende Temperaturen für eine Hybridisierung umfassen Umgebungstemperatur, typischerweise 20 bis 25ºC, wie auch andere Temperaturen unter dem Schmelzpunkt der Sonde und der Ziel-Nukleinsäure. Der pH des Reaktionspuffers ist im allgemein neutral oder mäßig alkalisch, z.B. pH 7,5 bis 9, und die lonenstärke ist so gewählt, daß die gewünschte Hybridisierung erfolgt, eine unerwünscht Hybridisierung mit anderen Sequenzen aber ausgeschlossen ist. Die Wirkung der oben erwähnten Variablen ist in der Literatur bekannt, beispielsweise aus "Nucleic Acid Hybridisation", B. D. James und S. J. Higgins (Herausgeber), IRL Press, Oxford, 1985.
Die Unterscheidungskraft der Sonde wird im allgemeinen durch 100%ige Homologie mit der Ziel-Nukleotidsequenz maximiert, allerdings ist dies nicht essentiell und es kann irgendein geeigneter Homologiegrad ausgewählt werden, wie z.B. 70 %, mindestens 80 % oder mindestens 90 %, vorzugsweise eine Homologie von mindestens 95 %, vorausgesetzt, daß nur die gewünschte Hybridisierung unter den angewendeten Hybridisierungsbedingungen erfolgen kann. Die Länge der Polynukleotid-Sonde wird von den Spezifizitätserfordernissen der ausgewählten Hybridisierung abhängen und wird auch entsprechend dem Molekulargewicht der Ziel-Nukleinsäure ausgewählt. Zum Nachweis z.B. von menschlichen genomischen DNA-Sequenzen unter Anwendung des obigen Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist eine Polynukleotid- Sonde mit mindestens 17 Basen zur Erreichung eines akzeptablen Spezifizitätslevel erforderlich (Wallace et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80, 278, 1983). Die Obergrenze für die Länge der Polynukleotid-Sonde wird durch die Bequemlichkeit einer Synthese bestimmt und beträgt im allgemeinen etwa 100 Basen. Normalerweise wird die Länge im Bereich zwischen 10 und 40 Basen liegen. Allerdings können Sequenzen, die z.B. durch die PCR-Reaktion amplifiziert worden sind, auch unter Verwendung kürzerer Polynukleotid-Sonden nachgewiesen werden, ohne daß die Selektivität verschlechtert wird. Eine menschliche Gen-Sequenz, die beispielsweise einmillionen-fach vervielfältigt wurde, kann z.B. unter Verwendung von Polynukleotid-Sonden mit einer Länge von 6 bis 20 Basen, z.B. 8 bis 15 Basen ohne Gefährdung der Selektivität nachgewiesen werden. Normalerweise können die obigen Bedingungen durch Polynukleotide, die weniger als 30 Basen lang sind, bevorzugter weniger als 20 Basen lang sind, erfüllt werden. Die Länge der Polynukleotid-Sonde wird passenderweise so ausgewählt, daß bei Bindung an die Zielsequenz eine meßbare Erhöhung des Molekulargewichts stattfindet. Im allgemeinen wird mindestens ein zweifacher Anstieg des Molekulargewichts ausgewählt, für maximale Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit ist allerdings ein größerer Anstieg wünschenswert.
Der Begriff Fluoreszenz-Polarisation umfaßt alle analytischen Verfahren, die eine Analyse der Polarisation von Licht, das aus dem in der Polynukleotid-Sonde enthaltenen Fluorophor emittiert wird, wenn er durch polarisiertes Licht angeregt wird, umfassen. Dies umfaßt insbesondere die Analyse des von dem Fluorophor emittierten Licht, wenn er durch linear polarisiertes Licht angeregt wird. Dies ist beispielsweise von M. E. Jolley in einer Abhandlung ausgeführt (J. Analytical Toxicology, 5, Seiten 236-240 (1981)).
Homogene Lösungen beinhalten irgendeine Lösung, die Gelöstes in der flüssigen Phase aufweist. Dies umfaßt auch Suspensionen mit feinen Suspensionen oder Kolloiden oder verwandte Gemische, die ausreichend transparent oder nicht streuend sind, um Messungen der Fluoreszenz-Polarisation möglich zu machen.
Die Konzentration der fluoreszierenden Sonde wird geeigneterweise so ausgewählt, daß sie geringer ist als die geringste erwartete Konzentration der Zielsequenz oder dieser annähernd gleich kommt; d.h., die Sonde wird gegenüber der Zielsequenz nicht in großem überschuß bereitgestellt. Dies ist wünschenswert, da eine nicht hybridisierte fluoreszierende Sonde weiter eine niedrige Polarisation liefern würde und es schwieriger würde, die höhere Polarisation des Hybrids nachzuweisen, insbesondere da die Polarisation von verschiedenen Species im Gemisch nicht zusätzlich ist und die beobachtete Polarisation durch die Species mit der niedrigsten Polarisation stärker beinflußt wird. In Analysen, in denen der Bereich der Konzentration der Ziel-Nukleinsäure-Probe nicht einfach vorhergesagt werden kann, wird so geschätzt, daß die Konzentration der verwendeten fluoreszierenden Sonde in wirksamer Weise die Empfindlichkeit der Analyse bestimmen wird. Wenn die Ziel-Nukleinsäuresequenz durch einen Amplifikationsschritt erzeugt wird, z.B. durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), wird die Amplifikation günstigerweise so durchgeführt, daß die Menge der amplifizierten Nukleinsäure, die erzeugt wird, im allgemeinen konstant ist; dann kann in einfacher Weise eine geeignete Konzentration der fluoreszierenden Sonde entweder durch Berechnung oder durch geeignete Reihenuntersuchung ausgewählt werden.
Wie oben festgestellt wurde, besteht eine besonders vorteilhafte Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens in der Analyse von DNA-Sequenzen, die durch Polymerase- Kettenreaktion (PCR) erzeugt wurden. Nach einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist daher die Ziel- Nukleinsäuresequenz ein Produkt einer Nukleinsäureproben- Amplifikation, z.B. der Amplifikation einer DNA-Probe.
Ein allgemeines Merkmal einer Nukleinsäure-Hybridisierung besteht darin, daß zur Trennung der Proben-Nukleinsäurestränge nach einer Denaturierung der Nukleinsäure-Probenstrang, der zu der interessierenden Proben-Nukleinsäuresequenz komplementär ist, mit der fluoreszierenden Sonde bei der Hybridisierung mit der interessierenden Sequenz konkurriert. Wenn die fluoreszierende Sonde durch den komplementären Strang ersetzt wird, kann keine Hybridisierung stattfinden oder sie läuft nur mit einem nicht annehmbaren Empfindlichkeitsgrad ab. Bei der Polymerase- Kettenreaktion (PCR) kann dieses Problem durch Berücksichtigung der folgenden Aspekte eliminiert oder zumindest gemildert werden.
Es wurde festgestellt, daß relativ kurze PCR-Produkte, günstigerweise die mit einer Länger von weniger als 100 Basenpaaren als Polynukleotide, die eine Ziel-Nukleotidsequenz enthalten, verwendet werden können. In solchen Fällen ist der Strang, der zu dem, der als Zielstrang ausgewählt wurde, komplementär ist, nicht merklich größer als die Sondensequenz und dadurch ist eine Konkurrenz verringert. Ein PCR-Produkt aus 80 Basenpaaren, das aus zwei 30-mer-Primern, die durch 20 Basenpaare voneinander beabstandet sind, gebildet wird, kann z.B. durch ein 16- mer, das zu einer der Sequenzen in dem zwischengeschalteten 20-Basenpaar-Bereich komplementär ist, nachgewiesen werden.
Es wurde festgestellt, daß bestimmte Versionen von Nukleinsäure-Amplifikations-Verfahren, die fähig sind, im wesentlichen einsträngige Produkte zu erzeugen, wie z.B. die asymmetrische Polymerase-Kettenreaktion (PCR), wie sie z.B. von Gyllensten U. B. et al., P.N.A.S., 1988, 85, 7652 beschrieben wird, oder eine PCR, auf die Exonuklease- Behandlung folgt, wie sie z.B. von Higuchi R. G. et al., Nucl. Acids. Res., 1989, 17, 5865 beschrieben ist, hinsichtlich der oben genannten Verfahren günstig sind und die Beseitigung des oben genannten Problems unterstützen.
Das bevorzugte asymmetrische Verfahren beinhaltet die Durchführung der PCR-Reaktion mit einem ersten Primer im überschuß gegenüber einem zweiten Primer, der in einer geringeren als üblichen Konzentration, typischerweise 10 bis 100 nM vorliegt. Somit ist es möglich, einen Polynukleotid-Strang im Vergleich zu dem komplementären Strang im überschuß zu erzeugen, indem in den Amplifikationsreaktionen ungleiche Konzentrationen der zwei Primer verwendet werden. Eine 100 µl Standard-PCR-Reaktion, die 100 pmol eines ersten Primers und 2 pmol eines zweiten Primers in Kombination mit einer Ziel-Nukleotidsequenz verwendet, wird einen überschuß des Strangs produzieren, der durch den ersten Primer erzeugt wird, welcher unter Verwendung einer fluoreszierenden Sonde nachgewiesen werden kann, und zwar z.B. unter Verwendung des direkten Sondenverfahrens der vorliegenden Erfindung.
Die obigen Aspekte der vorliegenden Erfindung werden nachfolgend der Bequemlichkeit halber als das direkte Sondenverfahren bezeichnet.
Nach einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung stellen wir ein Verfahren zum Nachweis einer Ziel- Nukleinsäuresequenz in einer Probe bereit, wobei das ein Verfahren ein Konktaktbringen der Probe mit (i) einem komplementären Polynukleotid, das zu einer Hybridisierung an der Ziel-Nukleotidsequenz fähig ist, und (ii) einer fluoreszierenden Polynukleotid-Sonde, die zu einer Hybridisierung an dem selben Bereich im komplementären Polynukleotid fähig ist, in homogener Lösung und Nachweisen des Vorliegens oder Fehlens einer Hybridisierung der fluoreszierenden Polynukleotid-Sonde mit dem komplementären Polynukleotid durch Fluoreszenz-Polarisation umfaßt.
Nach diesem Aspekt konkurrieren die Ziel-Nukleinsäuresequenz und die fluoreszierende Sonde um den selben Bereich im komplementären Polynukleotid. Dieser Aspekt ist daher ein Verfahren der konkurrierenden Hybridisierung. Wie vorher erläutert wurde, werden die Nukleotidsequenzen und die Hybridisierungs-Bedingungen so ausgewählt, daß eine Hybridisierung mit nicht-gewünschten Nukleotidsequenzen ausgeschlossen ist.
Im allgemeinen wird das komplementäre Polynukleotid eine doppelsträngige oder einsträngige Nukleinsäure wie z.B. DNA oder RNA, vorzugsweise eine einsträngige Nukleinsäure, z.B. eine einsträngige DNA umfassen. Das komplementäre Polynukleotid ist vorzugsweise ein synthetisches Oligonukleotid. Günstige Längen für das komplementäre Polynukleotid umfassen mindestens 15 Basen und vorzugsweise mindestens 30 Basen.
Die Konzentrationen der Reagenzien sind so gewählt, daß bei Abwesenheit der interessierenden Ziel-Nukleinsäure in der Probe die fluoreszierende Sonde an das komplementäre Polynukleotid gebunden ist, wohingegen in Gegenwart der Ziel-Nukleinsäuresequenz die fluoreszierende Sonde verdrängt wird oder ungebunden bleibt. Da im letzteren Fall der Fluorophor an eine Species mit niedrigerem Molekulargewicht gebunden ist, wird ein niedrigerer Fluoreszenz- Polarisationswert beobachtet. Das Verfahren kann so geplant sein, daß die Affinität zwischen der fluoreszierenden Sonde und dem komplementären Polynukleotid geringer ist als die zwischen der interessierenden Ziel-Nukleinsäuresequenz und dem komplementären Polynukleotid. Diese Affinität kann durch eine vernüftige Auswahl der Länge der fluoreszierenden Sonde und des komplementären Polynukleotids eingestellt werden. Andererseits kann die Affinität zwischen der fluoreszierenden Sonde und dem komplementären Polynukleotid durch den Einbau von einem oder einer kleinen Anzahl von nicht zusammenpassenden Paaren oder die Verwendung natürlich nicht vorkommender Basenanalogen verringert werden. Die Auswahl einer passenden Länge und Sequenz für die fluoreszierende Sonde und das komplementäre Polynukleotid konnen in einfacher Weise von einem Wissenschaftler mit normalen Kenntnissen vorgenommen werden. Vorzugsweise wird die Länge des komplementären Polynukleotids größer sein als die der fluoreszierenden Sonde, wobei eine größere Veränderung im Molekulargewicht der Species, die an den Fluorophor gebunden ist und daher eine besser nachweisbare Veränderung bei der Polymerisation erhalten wird. Die Obergrenze für die Länge des komplementären Polynukleotids wird im allgemeinen von der Bequemlichkeit bestimmt, und ist beispielsweise im Fall von synthetischen Oligonukleotiden weniger als 100 Basen.
Die Reihenfolge und die Zeit des Reagenzzusates kann in der obigen konkurrierenden Hybridisierung durch den Wissenschaftler festgelegt werden. Im allgemeinen wird die fluoreszierende Sonde zuerst mit der Probe und anschließend mit dem komplementär Polynukleotid in Kontakt gebracht.
Die Ziel-Nukleinsäuresequenzen, die entsprechend den vorangehenden Aspekten der Erfindung analysiert werden sollen, sind dafür geeignet oder entsprechen bevorzugten Aspekten, die hier hinsichtlich des direkten Sondenverfahrens angegeben wurden.
Die obigen Merkmale der Erfindung werden der Einfachheit halber nachfolgend als Verfahren der konkurrierenden Hybridisierung bezeichnet.
Es wird betont, daß im Fall von doppelsträngigen Ziel- Nukleinsäuren sich die fluoreszierende Sonde an einen der DNA-Stränge der Probe binden kann, was zu einem hohen Polarisationswert führt und damit fälschlicherweise das Fehlen der interssierenden Nukleinsäuresequenz in der Probe vorgibt. Ein vorteilhafter Aspekt der erfindungsgemäßen Verfahren ist daher der Nachweis von im wesentlichen einsträngigen Nukleinsäuren, wie sie durch die verschiedenen Amplifikationsverfahren leicht hergestellt werden können, und von ihren Varianten, wie oben beschrieben wurde.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf den Einbau eines fluoreszierenden Nukleinsäure-Primers zu einer verlängerten Kette, worauf ein Nachweis des Vorliegens oder Fehlens der verlängerten Kette durch Fluoreszenz-Polarisation folgt.
Nach einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweis einer Ziel-Nukleinsäuresequenz in einer Probe bereitgestellt, das ein Inkontaktbringen der Nukleinsäure-Probe mit einem fluoreszierenden Polynukleotid-Primer, der zur Hybridisierung mit der Zielsequenz fähig ist, Unterwerfen eines gebildeten Hybrids einer Primer-Extension und Nachweisen des Vorliegens oder Fehlens eines mit Primer verlängerten Produktes durch fluoreszierend- Polarisation umfaßt.
Eine Primer-Extension wird im allgemeinen enzymatisch durchgeführt und es können sich beispielsweise eine Strangtrennung, ein Annealing eines weiteren Polynukleotid- Primer und eine enzymatische Extension anschließen. Das obige Verfahren kann so oft wie gewünscht wiederholt werden. Ein Verfahren, das die obigen Schritte umfaßt und beide Stränge unter Anwendung von zwei Primer kopiert, ist beispielsweise das Verfahren, das von K. Kleppe et al. in J. Mol. Biol. (1971), 56, 341-361 für die Amplifikation einer gewünschten DNA-Sequenz beschrieben ist und das in der europäischen Patentanmeldung, Veröffentlichungs-Nr. 0 201 184 als die Polymerase-Kettenreaktion beschrieben ist. Der Nachweis des Vorliegens oder Fehlens eines Einbaus des Primers unter Verwendung der Fluoreszenz-Polarisation kann in irgendeiner Stufe des oben ausgeführten Verfahrens, am günstigsten nach Beendigung des obigen Verfahrens durchgeführt werden. Es wird betont, daß der fluoreszierende Nukleinsäure-Primer so ausgewählt wird, daß ein Erkennen durch das verwendete Polymerase-Enzym in keiner Weise beeinträchtigt wird. Das obige Verfahren kann beispielsweise mit zwei fluoreszierenden Primern, oder günstiger mit einem fluoreszierenden Primer und einem nicht-fluoreszierendem Primer durchgeführt werden.
Günstige Bedingungen für die Durchführung der Polymerase- Kettenreaktion beinhalten die Verwendung von beispielsweise 1 ug oder weniger DNA-Probe, die geeigneterweise mit typischerweise 50 bis 150 µl Puffer mit einem pH von z.B. 7,2 bis 8,8, der typischerweise 1 mM Konzentrationen an dATP, dCTP, dGTF und dTTP enthält, vermischt ist. Es werden spezielle Primer-Oligonukleotide zugesetzt (1 nM-2 µM). Diese Primer sind typischerweise 15 bis 40 Nukleotide lang und ihre Sequenzen entsprechen den 5'-Enden beider Stränge. Das obige Gemisch wird durch Erhitzen gründlich denaturiert, typischerweise durch Erhitzen auf 90 bis 100, beispielsweise 100ºC für 1 bis 10 min. Beim Abkühlen auf unter 50ºC werden typischerweise 0,5 bis 5 Einheiten einer wärmestabilen Polymerase, z.B. die DNA-Polymerase von Thermus aquaticus, zugesetzt. Die Amplifikation wird durch eine Reihe von thermischen Zyklen erzielt, die typischerweise einen Denaturierungsschritt bei 85 bis 95ºC für 1/2 bis 3 min, einen optionalen Annealing-Schritt bei 40 bis 65ºC auch für eine 1/2 bis 3 min und einen Polymerase- Extensionsschritt bei 60 bis 80ºC für eine Zeit, die für die betreffende Sequenz optimiert wurde und die typischerweise zwischen 5 5 und 3 min liegt, umfassen. Diese Schritte werden in einer typischen Reaktion zwischen 15- und 50-, beispielsweise zwischen 15- und 40-mal wiederholt.
Es ist bekannt, daß in herkömmlichen PCR-Reaktionen die Amplifikationsreaktion endet, bevor alle Primer verbraucht sind. Nach den oben angeführten Aspekten zur PCR gemäß der Erfindung würde es daher notwendig sein, das fluoreszierende Extensionsprodukt mit höherem Molekulargewicht in Gegenwart von fluoreszierenden Primern mit niedrigem Molekulargewicht, die normalerweise in bedeutendem überschuß vorliegen würden, nachzuweisen. Dies würde große Anforderungen an die Empfindlichkeit und Genauigkeit der Fluoreszenz-Polarisationsmessung stellen. Eine Lösung bestände darin, das fluoreszierende PCR-Produkt durch Chromatographie oder Elektrophorese abzutrennen; allerdings ist die zeitaufwendig und nicht vorteilhaft. Das bevorzugte Verfahren besteht darin, die PCR-Reaktion mit einem ersten nicht-fluoreszierenden Primer im Vergleich zu einem zweiten fluoreszierenden Primer in überschüssiger Menge durchzuführen, während der zweite Primer bei einer geringeren als der normalen Konzentration, typischerweise 10 bis 100 nM vorliegt. Auf diese Weise wird der gesamte oder das meiste des fluoreszierenden Primers verlängert und damit ergibt sich einer erhöhter Polarisationswert. Eine 100 µl Standard-PCR-Reaktion, die 100 pmol eines ersten Primers und 2 pmol eines zweiten fluoreszierenden Primers verwendet, wird praktisch einen vollständigen Einbau des fluoreszierenden Primers gewährleisten.
Vorteilhafterweise werden die Nachweisverfahren der vorliegenden Erfindung in Verbindung mit dem "Amplification Refractory Mutation System (ARMS), das von C.R. Newton et al. in Nucleic Acids Research, 1989, 17, 7, 2503-2516 beschrieben ist und in der europäischen Patentanmeldung, Veröffentlichungs-Nr. 332 435 (ICI) beansprucht ist, durchgeführt. Das Verfahren umfaßt (i) Inkontaktbringen einer Nukleinsäure-Probe mit einem diagnostischen Primer, der im wesentlichen zu einem diagnostischen Teil einer Zielbasensequenz komplementär ist, wodurch eine Extension des diagnostischen Teils unter geeigneten Bedingungen an einer Zielmatrize nur erreicht wird, wenn ein terminales Nukleotid des diagnostischen Primers entweder zu einem vermuteten Nukleotid-Variante oder einem entsprechenden normalen Nukleotid der Zielbasensequenz komplementär ist, und (ii) Nachweisen des Vorliegens oder Fehlens eines Extensionsproduktes. ARMS kann daher durchgeführt werden, indem entweder eine fluoreszierende Sonde (fluoreszierende Sonden) verwendet werden, um das Vorliegen oder Fehlen von Amplifikationsprodukten nach dem direkten Sondenverfahren der vorliegenden Erfindung nachzuweisen, oder indem ein geeigneter fluoreszierender Primer (geeignete fluoreszierende Primer) verwendet wird (werden) und das Vorliegen oder Fehlen einer Primer-Extension nachgewiesen wird, oder indem das vorher beschriebene Verfahren der konkurrierenden Hybridisierung angewendet wird.
Alle diagnostischen Verfahren der vorliegenden Erfindung können auch zum Nachweis von verschiedenen interessierenden Nukleinsäuresequenzen in einem einzigen Test eingesetzt werden. Dies wird durch die Verwendung von verschiedenen Fluorophoren erreicht, wobei jeder Fluorophor für das Vorliegen einer spezifischen Sequenz indikativ ist. Die Anzahl der Sequenzen, die in einem einzigen Test nachweisbar sind, ist im wesentlichen auf die Anzahl der geeigneten Fluorophore, die z.B. verschiedene spektrale Eigenschaften haben, speziell unterschiedliche Anregungsund/oder Emissions-Wellenlängen, und die in den Polynukleotid-Sonden identifiziert und enthalten sein können, limitiert.
Die verschiedenen interssierenden Nukleinsäuresequenzen sind z.B. Allele eines Gen-Lokus. Dies ist beim Nachweis von genetischen Erkrankungen, die z.B. durch Punktmutationen, Translokationen oder Deletionen verursacht wurden, von besonderer Bedeutung und wird im allgemeinen den Nachweis in einer DNA-Probe von einem Individiuum mit normalen und mutierten Allelen in einem einzigen Test gestatten.
Daher entsprechen nach einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung die Ziel-Nukleinsäuresequenzen Allelen eines Gen-Lokus, die für eine ererbte Krankheit, eine vererbte Störung oder Prädisposition indikativ sind.
Ein Nachweis des Vorliegens oder Fehlens der Ziel- Nukleinsäuresequenz wird geeigneterweise z.B. unter Verwendung des oben beschriebenen Amplification Refractory Mutation System durchgeführt. Alternativ wird eine Hybridisierung mit Allel-spezifischen fluoreszierenden Nukleinsäuresonden entsprechend dem direkten Sondenverfahren der vorliegenden Erfindung, üblicherweise nach einer Polymerase-Kettenreaktions-Amplifikation der Nukleinsäureprobe angewendet.
Da es normalerweise von Interesse ist, zu bestimmen, ob ein Patient für ein besonderes Allel eines Gen-Lokus homozygot oder heterozygot ist, wären normalerweise zwei derartige Bestimmungen unter Verwendung von für verschiedene Allele spezifische Sonden erforderlich. Bei der Diagnose von cystischer Fibrose beispielsweise unter Verwendung der Hauptmutation, der Phe 508-Deletion (Kerem et al., Science 1989, 245, 1073) würde der Test eine Bestimmung unter Verwendung einer Sonde, die an der normalen Sequenz hybridisiert, und auch eine Bestimmung mit einer Sonde, die an der Mutanten-Sequenz hybridisiert, umfassen. Die drei möglichen Ergebnisse würden daher folgende Resultate geben:
(wobei N und M Normal- und Mutantenallele darstellen und "+" einen erhöhten Polarisationswert anzeigt).
Der oben beschriebene diagnostische Test könnte zwei getrennte Tests beinhalten. Nach einem bevorzugten Merkmal der Erfindung wird der Test für zwei oder mehrere Ziel- Nukleinsäuresequenzen in einem einzigen Reaktionsbehälter durchgeführt. Dies wird erreicht, indem jede Allel-spezifische Nukleinsäure-Sonde mit einem unterschiedlichen Fluorophor markiert wird, die Sonden mit der Ziel-Nukleinsäure in Konktakt gebracht werden und die Fluoreszenz- Polarisation für jeden Fluorophor bestimmt wird, z.B. unter Verwendung einer Apparatur, die geeignet ist, notwendige Veränderungen bei der Anregungswellenlänge und der Wellenlänge, bei der das Licht gemssen wird, durchzuführen. Wahlweise kann, wenn die Nukleinsäure das Produkt einer Amplifikationsreaktion ist, eine Sonde eingesetzt werden, um zu prüfen, ob die Amplifikationsreaktion abgelaufen ist. In dem oben angegebenen CF-Diagnosebeispiel zeigt die Tabelle, daß sich ein allgemeines Versagen einer Amplifikationsreaktion eindeutig als geringe Polarisation bei beiden Sonden zeigen würde.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung werden in vorteilhafter Weise zum Nachweis des Vorhandenseins oder Fehlens einer oder mehrerer bakterieller oder viraler Ziel- Nukleinsäuresequenzen in einer Probe eingesetzt. Ein weiterer angenehmer Aspekt des beanspruchten Verfahrens ist der Nachweis von Nukleinsäuresequenzen in einem einzelnen Behälter, beispielsweise der Nachweis von DNA-Sequenzen aus zwei oder mehreren verschiedenen Bakterien- oder Virenstämmen.
In allen aufgeführten Merkmalen der vorliegenden Erfindung gibt es eine Veränderung im Molekulargewicht der Species, die an den Fluorophor gebunden ist, was durch Fluoreszenz- Polarisation nachgewiesen wird. Es ist wünschenswert, daß diese Veränderung so groß wie möglich ist, um die Nachweisverfahren empfindlich und robust zu machen und um eine Beeinträchtigung möglichst gering zu halten.
Eine DNA-Probe, die die Ziel-Nukleinsäuresequenz enthalten kann oder auch nicht und die in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann unter Anwendung von Standardverfahren, die auf dem Gebiet bekannt sind, vorbehandelt werden. Diese Behandlungen können Schritte beinhalten wie z.B. Erhitzen, Behandlung mit stark alkalischen Lösungen, Proteinase K, Detergentien, wenn diese geeignet sind. Im allgemeinen ist es wünschenswert, daß die DNA vor Zugabe der Sonde einsträngig gemacht wird, beispielsweise durch Erhitzen; allerdings wird dies vom Typ des Tests abhngen. Wahlweise kann es günstig sein, die DNA-Probe unter Verwendung von einem oder mehreren Restriktionsenzymen zu spalten.
Günstigerweise sind die Sonden und Primer, die erfindungsgemäß eingesetzt werden, synthetische Oligonukleotide. Derartige Oligonukleotide können in einfacher Weise nach Verfahren, die auf diesem Gebiet bekannt sind, synthetisiert werden (siehe z.B. Oligonudeotide Synthesis von M. J. Gait, IRL-Press); eine Reihe von chemischen Verbindungen zum Anbringen von Markierungen, in diesem Fall Fluorophorone an diese Oligonukleotide sind bekannt. Es gibt zwei Hauptbindungstypen. Der erste beinhaltet eine Befestigung entweder am 5'- oder dem 3'-Ende des Oligonukleotids, wobei eine geeignete Linker-Gruppe verwendet wird. Geeignete Linker sind Aminoalkyl-Gruppen, insbesondere Aminohexyl, die während der Oligonukleotid-Synthese einfach an dem 5'- Ende befestigt werden können, siehe z.B. Agrawal S. et al., Nucl Acids Res, 14, (1986), 6227- und WO-88/02004 (Applied Biosystems). Die Amino-Gruppe wird dann mit aktivierten Fluorophor-Derivaten wie zB. Foruoresceinisothiocyanat umgesetzt. Alternativ kann der Fluorophor an den Basenteilen befestigt werden. Die exozyklische Amino-Gruppe der Base Cytosin ist z.B. ein passender Befestigungspunkt; alternativ ist eine Reihe anderer Bindungen zu anderen Atomen an den Basenteilen möglich, siehe z.B. Ruth et al., DNA, 1985, 4, 93 und Letsinger, J. Am. Chem. Soc., 1981, 103, 7394. Derivate von Cytosin, die Aminoalkyl-Gruppen an der Ringamino-Gruppe befestigt enthalten, können unter Anwendung der Oligonukleotid-Synthese eingearbeitet werden und anschließend mit aktivierten Fluorophoren umgesetzt werden. Ein weiteres Verfahren ist die Anwendung von Basen- Analogen, die selbstfluoreszierend sind, z.B. wie dies bei H. Inoue et al., Nucleic Acids Research, 13, 7119 (1985) beschrieben ist. Obgleich es angenehm ist, ein Fluorophor pro Sonde zu befestigen, kann es unter Umständen dort, wo eine erhöhte Empfindlichkeit verlangt wird, günstig sein, mehr als ein Fluorophor pro Sonde zu befestigen. Das wesentliche Merkmal aller Befestigungsverfahren besteht darin, daß die Fähigkeit, mit der Ziel-Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren nicht merklich verschlechtert werden sollte und daß beim Verfahren der fluoreszierenden Primerverlfngerung die Primerfähigkeit des Primers nicht beeinträchtigt wird. In diesem letzteren Fall ist eine 3'-Befestigung des Fluorophor im allgemeinen ungeeignet.
Alternativ können die fluoreszierenden Sonden und Primer, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden, und insbesondere die fluoreszierenden Sonden durch eine mit Polymerase vermittelte Verlängerungsreaktion unter Verwendung eines Nukleinsäureabschnitts als Matrize, von dem bekannt ist, daß er die gewünschte Hybridisierung für die Ziel-Nukleinsäure aufweist, oder seines komplementären Strangs hergestellt werden. Der Fluorophor kann entweder durch Verwendung eines Primers, der mit einem Fluorophor, günstigerweise am 5'-Ende markiert wurde, oder durch die Einarbeitung von fluoreszierenden Nukleotid-Analogen oder von Nukleotiden, an denen ein Fluorophor befestigt worden ist, z.B. an die exocyclische Amino-Gruppe von Cytosin oder die 5-Position von Uridin und zwar so, daß die gewünschte Hybridisierung anschließend nicht beeinträchtigt wird, eingeführt werden.
Ein Fluorophor zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren kann günstigerweise unter Beachtung der folgenden Richtlinien ausgewählt werden:
a. Er hat eine ausreichend hohe Quantenausbeute und ein ausreichend hohes Absorptionsvermögen, um die gewünschte Empfindlichkeit für den Test bereitzustellen.
b. Er hat ein relativ niedriges Molekulargewicht, vorzugsweise weniger als 5 000, bevorzugter weniger als 1 000.
c. Er hat eine Fluoreszenzdauer, die den Rotationszeiten der in dem Test verwendeten Moleküle vergleichbar ist. Dieser Aspekt ist ausführlicher in M. E. Jolley, J. Analyt., Toxicol. 5, 236-240 (1981) diskutiert.
d. Im Hinblick auf die Polymerase-Kettenreaktion muß er wärmestabil sein.
e. Er sollte vorzugsweise kein starker Intercalator sein, da dieser bewirkt, daß die Sonde sich nicht-spezifisch an Nicht-Ziel-DNA in der Probe bindet und irrtümlicherweise hohe Polarisationswerte liefert.
Die obigen Richtlinien betreffen einen weiten Bereich von Fluorophoren wie z.B. Fluorescein, Rhodamin, Tetramethylrhodamin, Sulforhodamin 101, Pyren und Dansyl, günstigerweise Fluorescein und Rhoadmin wie z.B. Fluorescein.
Solche Fluorohore können in vorteilhafter Weise durch Verwendung beispielsweise von Isothiocyanat-Derivaten, Succinimidylestern oder Sulfonylhalogenid-Derivaten z.B. an eine Amino-Gruppe gebunden werden, oder sie können unter Verwendung von beispielsweise Maleinimid-Derivaten an Thiol-derivatisierte Polynukleotide gebunden werden. Es sind auch andere reaktive Derivate von Fluorophoren bekannt, wie sie z.B. im Katalog von Molecular Probes, Inc. dargestellt sind.
Ein Test kann eine einzelne Polarisationsbestimmung beinhalten, die vorgenommen wird, nachdem die Hybridisierungen des Tests komplett sind. Um mögliche künstliche Einflüsse zu eliminieren, ist es dagegen vorteilhaft, auch die Polarisation der fluoreszierenden Sonde oder des Primers vor dem Test zu bestimmen und auf diese Weise eine Veränderung der Polarisation zu messen. Diese kann mit einem Polarisations-Fluorometer, typischerweise einem Fluorometer mit Polarisationselementen wie Filtern, Prismen oder Flüssigkristallen, die im Weg des Emissionslichts und im Weg des Anregungslichts angeordnet sind, und zwar beispielsweise nach den Verfahren, die von Jolley, J. Analyt. Toxicol. 5, 236-2490 (1981) beschrieben sind, gemessen werden. Es ist wesentlich, daß dabei die Messung des horizontal und vertikal polarisierten Lichts, das gemessen wird, wenn die Probe entweder mit horizontal (H) oder vertikal (V) polarisiertem Licht bestrahlt wird, beinhaltet ist. Der Polarisationswert für eine mit vertikalem Licht betrahlte Probe wird wie folgt angegeben:
wobei 11 parallele Folarisatoren bezeichnet und 1 senkrechte Polarisatoren bezeichnet. Diese kann zur Ausschaltung des Instrumentenfehlers korrigiert werden, indem
wobei
verwendet werden, wobei 11 ein Emissions-Polarisator parallel zu der Vertikalen bezeichnet und 1 einen Emissions-Polarisator senkrecht zu der Vertikalen bezeichnet.
In der Praxis kann bei kontrollierten Tests die Veränderung der Polarisation so sein, daß ausgenommen bei Replikaten, nur zwei oder sogar ein Meßwert erforderlich ist, um das Vorliegen der Nukleinsäuresequenz anzuzeigen.
Die Bestimmung kann in einer großen Vielzahl von Fluorometern, die mit polarisierenden Elementen ausgestattet sind, durchgeführt werden. Solche Fluorometer können entweder im "L"-Format sein, wobei das emittierte Licht im Winkel von 90º zum Anregungsstrahl gemessen wird, oder sie können im "T"-Format sein, wo es sowohl bei 90 als auch bei 270º gemessen wird. Diese letztgenannte Orientierung gilt für feste Polarisationselemente, so daß die vertikalen und horizontalen Komponenten gleichzeitig analysiert werden können. Zur Verbesserung der Empfindlichkeit können Laserlichtquellen, z.B. ein Argonionen-Laser verwendet werden. Um die Messung von verschiedenen Fluorophoren zu gestatten, kann Vorsorge getroffen sein, um die Anregungsund/oder Emissionswellenlängen zu verändern, entweder durch Verwendung von Gittern, Filtern oder umschaltenden Lichtquellen.
Es soll betont werden, daß Streulicht in hohem Maße polarisiert ist und daß bei niedrigen Konzentrationen an fluoreszierenden Polynukleotiden Sorgfalt walten gelassen werden soll, um zu gewährleisten, daß dies keine bedeutende Störung darstellt. In solchen Fällen kann die Wirkung von Streulicht auf ein Minimum reduziert werden, indem Proben Vorbehandlungsverfahren zur Entfernung von Staub, Partikeln und Licht unterzogen werden und indem geeignete experimentelle Kontrollen angewendet werden.
Es soll betont werden, daß die Tests der vorliegenden Erfindung unter Bezugnahme auf eine Standardkurve, die unter Verwendung von Lösungen der Ziel-Nukleinsäure mit bekannten Konzentrationen erstellt werden, quantitativ gestaltet werden können.
Das Polarisations-Fluormeter kann Teil einer zweckbestimmten Testapparatur mit automatischen oder halbautomatischen Vorrichtungen zur Behandlung der Flüssigkeit und/oder der Packung sein. Der Analysensatz der vorliegenden Erfindung beinhaltet Reagenzien und/oder Packungen, die in einer automatischen oder halbautomatischen Testapparatur laufen können. Eine derartige Apparatur kann für die anfängliche Amplifikation der Proben-Nukleinsäure wie z.B. der DNA-Probe, beispielsweise durch die PCR-Technik sorgen und kann dementsprechend einen kontrollierten Heizblock und/oder eine automatisierte Flüssigkeitsbeförderung enthalten.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung eines Analysesatzes in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung, wie es oben definiert ist. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung eines Analysensatzes in dem erfindungsgemäßen Verfahren, wie es oben definiert ist. Der Analysensatz umfaßt eine gepufferte Lösung einer fluoreszierten Nukleinsäure-Sonde (von fluoreszierend markierten Nukleinsäure-Sonden) und und/oder einen Primer (mehrere Primer), wobei diese Lösung in einer geeigneten Verpackung zusammen mit Instruktionen zur Hybridisierung der Sonde(n) und/oder dem Primer (den Primern) an eine Ziel-Nukleinsäuresequenz in einer Probe im homogener Lösung und Instruktionen zum anschließenden Nachweis einer Hybridisierung durch Fluoreszenz-Polarisation bereitgestellt wird.
Die gepufferte Lösung erlaubt es, daß die Hybridisierungsreaktion mit der erforderlichen Kinetik, Affinität und Spezifität stattfindet. Derartige Bedingungen werden von der Testtemperatur abhängen und können geeigneterweise durch Experimentieren bestimmt werden.
Die Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele und Figuren erläutert, allerdings nicht auf diese limitiert, wobei
Figur 1 ein Diagramm der Fluoreszenz-Polarisation eines 64-mer (T) und eines 8-mer (P) gegen das Verhältnis Stellen der Zielsequenz:Sondenmoleküle zeigt;
Figur 2 die Wirkung der Temperatur auf die Analyse eines PCR-Produktes unter Verwendung einer fluoreszierenden Sonde zeigt. Das PCR-Produkt wurde unter Verwendung der Oligonukleotide 4 und 5 als Primer hergestellt;
Figur 3 die Wirkung der Salzkonzentration auf Analyse eines PCR-Produktes unter Verwendung der Oligonukleotide 4 und 5 als Primer und einer nicht verwandten Sequenz unter Verwendung einer eine fluoreszierenden Sonde zeigt.

Materialien und Methoden:

Akürzungen:

Es werden die folgenden Abkürzungen verwendet:
SMCC Succinimidyl-4-(N-maleinimidmethyl)cyclohexan-1- carboxylat
Tris Tris (hydroxymethyl) aminomethan
BSA Rinderserumalbimin
PBS Puffer 0,13 M NaCl, 5,4 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 1,6 mM KH&sub2;PO&sub4;, pH 7,3
SSC 20x SSC ist 3 M NaCl, 0,3 M Trinatriumcitrat
DMF Dimethylformamid
FITC Fluoreszenzeinisothiocyanat

1. Oligonukleotid-Synthese

Die folgenden Oligodeoxyribonukleotide wurden mit einer DNA-Syntheseapparatur (Applied Biosystems 3808) synthetisiert, wobei nach den vom Hersteller empfohlenen Protokolle gearbeitet wurde. Nach Entfernung der Schutzgruppen in konzentriertem Ammoniak wurden die Oligonukleotide in einem Konzentrator (Savant Speedvac) zur Trockne eingedampft und in 1,0 ml Wasser wieder aufgelöst. Oligonukleotid 1
Basen 7552-7559 des menschlichen Antitrypsin-Gens. Oligonukleotid 2
Synthetisches 64-mer, das 8 Repetiereinheiten als Ergänzung zu Oligonukleotid 1 enthält. Oligonukleotid 3
Ein nicht verwandtes 65-mer. Oligonukleotid 4
PCR-Primer: Basen 7627-7656 des menschlichen α&sub1;- Antitryps in-Gen. Oligonukleotid 5
PCR-Primer: Basen, die zu 7677-7706 des menschlichen α&sub1;- Antitrypsin-Gens komplementär sind. Oligonukleotid 6
Basen 7659-7674 des menschlichen α&sub1;-Antitrypsin-Gens. Oligonukleotid 7
PCR-Primer: Basen 7440-7469 des menschlichen α&sub1;- Antitryps in-Gens. Oligonukleotid 8
PCR-Primer: Basen, die zu 7770-7799 des menschlichen α&sub1;- Antitrypsin-Gens komplementär sind. Oligonukleotid 9
97-mer-Ziel-Oligonukleotid, Basen, die zu 7643-7739 des menschlichen α&sub1;-Antitrypsin-Gens komplementär sind. Oligonukleotid 10
90-mer-Ziel-Oligonukleotid, das zu den Basen 725-824 des Pilin-E-Gens von Neisseria gonorrhoeae komplementär ist. Oligonukleotid 11
Basen 767-782 des Pilin-E-Gens von Neisseria gonorrhoeae. Oligonukleotid 12
Basen 7643-7657 des α&sub1;-Antitrypsin-Gens. Oligonukleotid 13
Basen 7676-7690 des α&sub1;-Antitrypsin-Gens. Oligonukleotid 14
Basen des 7692-7706 α&sub1;-Antitrypsin-Gens. Oligonukleotid 15
komplementär zu Oligonukleotid 13.
In der obigen Tabelle sind die Basen in dem menschlich α-1- Antitrypsin-Gen so, wie sie von Long G. L. et al, Biochemistry, 1984, 23, 4828-4837 verwendet wurden. Die Buchstaben A G C und T beziehen sich auf die Basen Adenin, Guanin, Cytosin bzw. Thymin, wohingegen der Buchstabe L sich auf die Aminolinker-Gruppe:
bezieht, die aus dem folgenden Reagens
durch Reaktion an einer 5'-terminalen Hydroxyl-Gruppe mit der automatischen Synthese-Apparatur erhalten wird, wobei im wesentlichen das selbe Protokoll wie für eine Addidtion der Nukleotid-Elemente verwendet wird. Die schützende Trifluoracetyl-Gruppe wird im empfohlenen Entfernungsschritt für die Schutzgruppe mit konzentriertem Ammoniak entfernt.

2. Fluoresceinylierung der 5'(Aminohexylphosphoryl)- Oligonukleotide (FL-Oligos)

Verfahren A:

Ca. 30 nmol 5'(Aminohexylphosphoryl)-Oligonukleotid wurden mit Wasser auf 0,2 ml verdünnt und an einer NAP-10- Sephadex -G-25 M Gel-Filtrationssäule (Pharmacia), die mit 0,5 % Triethylamin äquilibriert war, entsalzt, wobei 0,7 ml entsalztes Produkt erhalten wurden. Zu diesem wurde eine Lösung von 4 mg/ml Fluoresceinisothiocyanat (Isomer 1, Sigma, 0,3 ml) in Methanol gegeben, dann wurde die Reaktion 1 h lang in einem Wasserbad bei 55ºC ablaufen gelassen. Die Lösung wurde danach durch Zusatz von 20 ul 1 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan, pH 7,5, neutralisiert und auf eine Sephadex G25M PD-10-Säule (Pharmacia), die mit 10 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan 1 mM EDTA, pH 8,0, äquilibriert war, gegeben. Das entsalzte Produkt, 1,6 ml, wurde dann in einem Konzentrator (Savant Spedvac) auf ein Volumen von ca. 0,4 ml konzentriert. Eine Reinigung wurde durch reverse phase HPLC an einer Waters C18 Mikro-Bondapak-Säule unter Verwendung einer LKB HPLC-Vorrichtung mit einem Extinktionsdetektor, der auf 495 nm eingestellt war, durchgeführt. Die Säule wurde mit Eluent A, 0,1 M Triethylammoniumacetat, pH 7,0, mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 1,0 ml/min äquilibriert und nach dem Auftragen der Probe wurde ein linearer Gradient von 0 bis 60 % Eluent B, 100 % Acetonitril, über 60 min angewendet. Fraktionen, die durch Fluorescein eine Extinktion bei 495 nm zeigten, wurden gesammelt und durch Spektroskopie analysiert. Aus der optischen Dichte bei 260 nm und 495 nm wurde ein Fluorescein-Gehalt von ca. 0,7 bis 0,8 mol/mol DNA errechnet.

Verfahren B:

Zu einem Amino-derivatisierten Oligonukleotid in Wasser (120 ul) wurde 1 M Natriumcarbonat/Bicarbonat-Puffer pH 9,0, (60 ul) und anschließend eine 1%ige Lösung von FITC in trockenem DMF (20 ul) gegeben. Die Reaktion wurde bei Umgebungstemperatur (25ºC) 3 h lang im Dunkeln ablaufen gelassen, wonach das ganze an einer NAP-5-Gel-Filtrationssäule (Pharmacia), die mit PBS äquilibriert war, entsalzt wurde, wobei die ausgeschlossene Fraktion (0,8 ml) genommen wurde. Diese wurde anschließend durch HPLC gereinigt, und zwar im wesentlichen so, wie es oben beschrieben wurde, allerdings mit 80 % Acetonitril/Wasser als Puffer B und einem 45 min Gradienten.

3. Polymerase-Kettenreaktion

Die Reaktionen wurden in autoklavierten Mikrozentrifugenröhrchen (Alpha Laboratories) mit einem Volumen von 0,5 ml durchgeführt, wobei die Röhrchen folgendes enthielten:
0,025 bis 1 ug menschliche genomische DNA
10 ul 100 mM Tris HCl, 500 mM KCl, 15 mM MgCl&sub2;, 0,1 % Gelatine (G/V) pH 8,3
6 µl d NTPs (3,33 mM dATP, 3,33 mM DCTP, 3,33 mM dGTP, 3,33 mM dTTP)
100 mol 3'-Primer
2 oder mehr pmol 5'-Primer
Wasser bis 100 ul (Millipore Reagent Grade Water System)
Diese Röhrchen wurden 5 min zum Sieden erhitzt, um die genomische DNA zu denaturieren, und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. In jedes Röhrchen wurden 2 Einheiten Thermus aquaticus DNA-Polymerase (New England Biolabs oder Cetus) gegeben; dann wurde das ganze jeweils mit 50 µl leichtem Mineralöl (Sigma) überdeckt.
Es wurde eine DNA-Amplifikation durchgeführt, wobei die Polymerase-Kettenreaktion an einem intelligenten Techne- Heizblock oder einem thermischen DNA-Cycler, Cetus Perkin- Elmer unter den folgenden Bedingungen (wenn nicht anders angegeben) durchgeführt wurde:
Segment 1 Temperatur 91ºC Zeit 2 min
Segment 2 Temperatur 60ºC Zeit 3 min
Segment 3 Temperatur 72ºC Zeit 2 min
Durchläufe = 36
Amplifikationen, auf die in den Beispielen 6 bis 9 Bezug genommen wird, verwendeten:
Segment 1 Temperatur 94ºC Zeit 2 min
Segment 2 Temperatur 60ºC Zeit 2 min
Segment 3 Temperatur 70ºC Zeit 0,5 min
Durchläufe = 45

4. Polarisationsmessungen

Diese wurden mit einem Perkin Elmer LS-5B Fluorometer vorgenommen, das mit dem Polarisationszubehör des Herstellers ausgestattet war und Polarisationsfilter bereitstellte, die auf 0 º oder 90 º eingestellt werden konnten und im Weg des Anregungslichts und des Emissionslichts angeordnet waren. Die verwendeten Wellenlängeneinstellungen waren:
Die Fluoreszenz der Probe, die sich in einer Hughes und einer Hughes-Einweg-Kuvette befand, und etwa 2,0 ml war, oder die Fluoreszenz einer Probe in einem Perkin-Elmer 5200.4339 (Beispiele 6 bis 9) mit 0,55 ml wurden mit den Filtern gemessen, die in vier Kombinationen eingestellt wurden:
Der Korrekturfaktor G wurde wie folgt berechnet:
der Polarisationswert wurde wie folgt errechnet:
Alle angegebenen Werte sind das Mittel von mindestens zwei Wiederholungen. Alle Messungen wurden, wenn nicht anders angegeben, bei Raumtemperatur vorgenommen.

5. Markierung von Oliponukleotiden mit Rhodamin

Diese wurde unter Anwendung des Fluoresceinylierungsvorgangs von Abschnitt 2. (Verfahren B) allerdings unter Verwendung von 1 % Rhodamin B-Isothiocyanat (Sigma) anstelle von Fluoresceinisothiocyanat durchgeführt.

6. Synthese eine BSA-Oliaonukleotid 13-Konjugats:

6.1. Herstellung von mit Maleinimid derivatisiertem BSA

Zu einer Lösung von BSA (Sigma, 10 mg/ml in 100 ul PBS/100 ul Wasser) wurden 0,1 M Triethanolamin HCL, 1 mM MgCl&sub2;, 1 mM ZnSO&sub4;, pH 7,4, (0,6 ml) und anschließend 12 ul einer frisch hergestellten Lösung von SMCC (Pierce) in trockenem DMF (6,7 mg/ml) gegeben, dann wurde das Reaktionsgemisch 30 min lang bei 25ºC inkubiert. Das Produkt wurde dann gereinigt, indem es durch eine NAP 25- Entsalzungssäule (Pharmacia) geschickt wurde, welche mit BSA (Boehringer, Qualität für die Molekularbiologie) grundiert worden war und mit PBS eingestellt war. Das Produkt wurde in 1,6 ml gesammelt und es wurde ein Teil zur Analyse entnommen. Die Protein-Konzentration wurde durch OD bei 280 nm (unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 0,62 für 1 mg/ml) bestimmt, wohingegen die Maleinimid- Konzentration wie folgt bestimmt wurde: 0,15 ml Probe wurden mit 10 ul 1 mM Mercaptoethanol 30 min bei 37ºC im Vergleich zu Duplikatkontrollen mit 0,15 ml Puffer allein umgesetzt. Die Reaktionen wurden dann mit 1,2 ml PBS verdünnt, in einem Spektralphotometer bei 412 nm auf Null eingestellt und es wurden 25 ul 1 mM 5,5'-Dithiobis(2- nitro-benzoesäure) zugesetzt. Restliche Thiol-Konzentrationen wurden unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 14 150 gemessen; die Differenz zwischen der Probe und der Kontrolle ergab die Maleinimid-Konzentration und so konnte der Substitutionsgrad errechnet werden. Es wurde festgestellt, daß dieser Wert 1,7 mol Maleinimid pro Mol Protein war.

6.2 Reaktion des 5'-Amino-derivatisieren Oligonukleotids mit 2-Iminothiolan und anschließende Konjugation mit BSA

Zu einer wäßrigen Lösung (0,2 ml) des Amino-derivatisierten Oligonukleotids (1/5 einer nominalen 1 µmol-Synthese) wurde eine frisch hergestellte Lösung (0,3 ml) von 2-Iminothiolan (5 mg/ml) in 0,2 M Natriumbicarbonat-Pupffer, pH 9,0, gegeben und die Reaktion 30 min lang bei 37ºC inkubiert. Das Produkt wurde dann isoliert, indem das Gemisch durch eine NAP 25-Entsalzungssäule (Pharmacia), die mit PBS äquilibriert war, geleitet wurde und das Produkt in 1,6 ml gesammelt wurde. Dies wurde dann unmittelbar zu dem BSA, das wie oben beschrieben hergestellt worden war, gegeben. Die beiden Komponenten wurden anschließend über Nacht bei 4ºC reagieren gelassen.
Die Reaktionslösung wurde dann unter Verwendung eines gegenüber BSA neutralen Mikrokonzentrator (Amicon) auf ca. 0,5 ml konzentriert und auf eine Säule (ca. 45 ml) aus Biogel P-100F (Biorad), die äquilibriert war, gegeben; es wurde mit 50 mM Tris-Puffer, pH 7,5, bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 0,14 ml/min eluiert. Die eluierten Peaks wurden durch UV-Extinktion bei 260 nm nachgewiesen, und Uv-Spektren der Fraktionen, die den ersten Peak bildeten und das Konjugat enthielten, wurden bestimmt. Fraktionen, mit einer Extinktion sowohl bei 260 wie auch bei 280 nm wurden gesammelt. Spätere Fraktionen, die erhöhte Extinktionen bei 280 nm zeigten, vermutlich durch freies BSA, wurden ausgeschlossen.

Beispiel 1

Hybridisierung eines fluoresceinylierten 8-mer an ein synthetisch 64-mer Ziel-Oligonukleotid

Eine 10&supmin;&sup7; M Lösung (2,0 ml) von FL-Oligo 1 wurde in 10 mM Tris 1 mM EDTA, pH 8,0, (2,0 ml) und 3 M NaCl, 0,34 M Trinatriumcitrat (0,3 ml) hergestellt; es wurde der Polarisationswert bestimmt. In die Küvette wurden dann aufeinanderfolgend Aliquots einer 10&supmin;&sup4; M, 10&supmin;&sup5; M oder 10&supmin;&sup6; M Lösung der 64-mer Zielsequenz, Oligo 2, in 10 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan, 1 mM EDTA, pH 8,0, - wie unten in der Tabelle dargestellt ist - gegeben, und nach jeder Zugabe wurde der Polarisationswert bestimmt. Diese Daten sind unten aufgelistet und werden in Figur 1 dargestellt; sie zeigen, daß das Vorliegen der Zielsequenz einen Anstieg des Polarisationswertes erzeugt.
Die Spezifität der Interaktion wurde unter Verwendung eines nicht verwandten Oligonukleotids, Oligo 3, als Zielsequenz untersucht. Eine 10&supmin;&sup7; M Lösung von FL-Oligo 1 wurde in 10 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan, 1 mM EDTA, pH 8,0, (2,0 ml) und 3 M NaCl, 0,3 M Trinatriumcitat (0,1 ml) hergestellt und es wurde der Polarisationswert bestimmt. In die Küvette wurde dann Oligo 2 bis zu einer Konzentration von 5 x 10&supmin;&sup7; M gegeben; dann wurde der Polarisationswert bestimmt. Dies wurde unter Verwendung von Oligo 3 in derselben Konzentration wiederholt. Die erhaltenen Resultate waren:
Der mit der Sonde und der nicht verwandten Nukleotidsequenz erhaltene Wert unterschied sich nur unbedeutend von dem, der mit der Sonde allein erhalten wurde, was die Spezifität bewies.

Beispiel 2

Nachweis eines PCR-Produktes

Die Polymerase-Kettenreaktion wurde wie oben beschrieben durchgeführt, wobei als 5'-Primer 100 pmol Oligo 4 und als 3'-Primer 100 pmol Oligo 5 verwendet wurden.
Es wurde die Fluoreszenz-Polarisation von 5,1 pmol FL-Oligo 6 in 2 ml 10 mM Tris HCl, 50 mM Kaliumchlorid, 1,5 mM Magnesiumchlorid, 0,01 % Gelatine (G/V), pH 8,3, gemessen. Das PCR-Produkt (100 µl) wurde 5 min gekocht und dann 5 min in Eis abgekühlt. Dieses wurde zu der Sonde in der Küvette gegeben, vermischt und nach 10 min wurde die Fluoreszenz- Polarisation erneut gemessen.
Das Vorliegen des PCR-Produktes bewirkte einen merklichen Anstieg des Polarisationswertes.

Beispiel 3

Nachweis eines einsträngigen PCR-Produktes

Die Polymerase-Kettenreaktion wurde wie beschrieben durchgeführt. Der 5'-Primer war 2 pmol Oligo 7, der 3'- Primer war 100 pmol Oligonukleotid 8. Es wurden 40 Durchgänge gemacht.
Es wurde die Fluoreszenz-Polarisation von 5,1 pmol FL- Oligo 6 in 2 ml 10 mM Tris HCl, 50 mM Kaliumchlorid, 1,5 mM Magnesiumchlorid, 0,01 % Gelatine, pH 8,3, gemessen. Das PCR-Produkt (100 ul) wurde in die Kuvette gegeben, das ganze gemischt. Die Fluoreszenz-Polarisation wurde nach 10 min bei Raumtemperatur gemessen.
Das Vorliegen des PCR-Produktes bewirkte einen merklichen Anstieg des Polarisationswertes.

Beispiel 4

Nachweis eines einsträngigen PCR-Produktes

Die Polymerase-Kettenreaktion wurde wie beschrieben durchgeführt. Der 5'-Primer war 2 pmol Oligo 4, der 3'- Primer war 100 pmol Oligonukleotid 5.
Die Fluoreszenz-Polarisation von 5,1 pmol FL-Oligo 6 in 2 ml 10 mM Tris HCl, 50 mM Kaliumchlorid, 1,5 mM Magnesiumchlorid, 0,01 % Gelatine, pH 8,3, wurde gemessen. In die Küvette wurde das PCR-Produkt (100 ul) gegeben und das ganze vermischt. Die Fluoreszenz-Polarisation wurde nach 10 min bei Raumtemperatur gemessen.

Beispiel 5

Nachweis eines Extensionsproduktes

Die Polymerase-Kettenreaktion wurde wie vorstehend beschrieben durchgeführt, allerdings mit dem folgenden Ablauf:
Segment 1 Temperatur 94ºC Zeit 2 min
Segment 2 Temperatur 55ºC Zeit 1,5 min
Segment 3 Temperatur 72ºC Zeit 1 min
Der 5'-Primer war 2 pmol fluoresceinyliertes Oligonukleotid 6. Der 3'-Primer war 100 pmol Oligonukleotid 5.
Es wurde die Fluoreszenz-Polymerisation von 5,1 pmol FL- Oligo 6 in 2 ml 10 mM Tris HCl, 50 mM Kaliumchlorid, 1,5 mM Magnesiumchlorid, 0,01 % Gelatine, pH 8,3, gemessen.
In entsprechender Weise wurde die Fluoreszenz-Polarisation von 100 ul PCR-Produkt in 2 ml 10 mM Tris HCl, 50 mM Kaliumchlorid, 1,5 mM Magnesiumchlorid, o,di % Gelatine, pH 8,3, bestimmt.
Eine Einarbeitung des Primers in das PCR-Produkt produzierte eine Erhöhung des Polarisationswertes.

Beispiel 6

Gleichzeitiger Nachweis von zwei Seguenzen unter Verwendung von verschiedenen Fluorophoren

Zwei getrennte synthetische Zielsequenzen A (Oligo 9, ein 97-mer) und B (Oligo 10, ein 90-mer) wurden beide getrennt und zusammen nachgewiesen, wobei ein mit Fluorescein markiertes Oligo F (FL-Oligo 13), das zu einem Teil zur Zielsequenz A komplementär war, und ein mit Rhodamin markiertes Oligo R (RH-Oligo 11), das zu einem Teil der Zielsequenz B komplementär war, verwendet wurden.
Die Polarisation der gemischten Sonden F und R (4 pmol jeweils) wurde in 0,45 M NaCl, 0,05 M Trinatriumcitrat, 10 mm Tris(hydroxymethyl)aminomethan pH 8,0 (0,55 ml) in Gegenwart und Abwesenheit der Ziels equenzen A und/oder B gemessen.
Es ist erkennbar, daß bei Gegenwart der Zielsequenz A die entsprechende Sonde F einen Anstieg in der Polarisation zeigt und in ähnlicher Weise die Polarisation von R in Gegenwart der Zielsequenz B erhöht ist. Beide Sonden zeigten erhöhte Polarisationswerte, wenn die beiden Zielsequenzen zusammen vorlagen. Dies zeigt, daß das Vorliegen oder Fehlen von zwei verschiedenen DNA-Sequenzen in der selben Küvette unabhängig gemessen werden kann.

Beispiel 7

Nachweis eines PCR-Produktes unter Verwendung von drei mit Fluorescein markierten Oligonukleotiden

Menschliche DNA (25 ng) wurde durch PCR (45 Durchgänge) unter Verwendung von Oligo 7 (1 pmol) und Oligo 8 (100 pmol) als Primer amplifiziert. Drei Röhrchen wurden kombiniert und die DNA mit Phenol (Sevag-Lösung, 100 ul) behandelt, verwirbelt, und 2 min bei 13 000 Upm zentrifugiert. Nach Entfernen der Phenol-Schicht wurde die Lösung 3-mal mit Ether extrahiert. Es wurde 3 M Natriumacetat (38,5 ul) und anschließend Ethanol (1 ml) zugesetzt. Nach 15-minütigem Kühlen auf -70ºC gefriergetrocknet und die Pellets 3x SSC, 50 InM Tris(hydroxymethyl)aminomethan, pH 8,0 (500 µl) wieder aufgelöst.
Es wurden fluoresceinylierte Oligos 12, 13 und 14 (jeweils 3 pmol) zu 3x SSC, 50 mM Tris, pH 8,0 (0,550 ml) gegeben und die Fluoreszenz-Polarisation sowohl getrennt wie als gemischt bestimmt. Die Messung wurde dann in Gegenwart des obigen PCR-Produktes (500 ul) nach 30-minütiger Inkubation bei 50ºC und Abkühlen auf Raumtemperatur wiederholt. Ergebnisse:
* Beide Polarisationsfilter sind vertikal abgefluchtet (Einheiten sind willkürlich)
Es ist zu erkennen, daß der Gemisch der drei Sonden in Gegenwart einer Zielsequenz einer hohe Polarisation ergibt. Die höheren Fluoreszenzwerte, die mit Sondengemischen erhalten werden, erlauben eine hzhere Genauigkeit und höhere Robustnis bei den Werten und/oder erlauben geringere Sonden-Konzentrationen, die benutzt werden, bei gleichzeitiger Verbesserung der Empfindlichkeit.

Beispiel 8

Verstärkung des Polarisationsanstiegs bei Hybridisierung unter Verwenduna einer mit Rinderserumalbumin (BSA) konjugierten Sonde

Mit Fluroescein markiertes Oligo 14 (3 pmol) wurden zu 3x SSC, 50 mM Tris, pH 8,0, (0,5 ml) in Gegenwart und in Abwesenheit von 8 pmol synthetischer Zielsequenz Oliog 9 gegeben, und dann der Polarisationswert bestimmt. Zu dem ganzen wurde dann BSA-Oligo 13-Konjugat (27 pmol) gegeben und nach einer 10-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wurde erneut die Polarisation gemessen.
Es ist zu erkennen, daß das Vorliegen des komplementären BSA-Oligo-Konjugat den Anstieg der Polarisation, der durch die Hybridisierung der mit Fluorophor markierten Sonde an die Zielsequenz verursacht wurde, merklich verstärkt.

Beispiel 9

Test auf ein Ziel-Oligonukleotid durch Konkurrenz mit einer homologen Sonde um einen komdlementären DNA-Strang

Das mit BSA konjugierte Oligonukleotid 13 (7 pmol) wurde mit verschiedenen Konzentrationen an synthetischem Ziel- Oligo 9 in 0,45 M NaCl, 0,05 M Trinatriumcitrat, 10 mM Tris, pH 8,0 (0,55 ml) vermischt und es wurde das fluoreszierend markierte Oligo 15 (3 pmol), das zu dem BSA-Oligo- Konjugat komplementär ist, zugesetzt.
Es kann gesehen werden, daß die steigenden Konzentrationen an Zielsequenz eine fortschreitende Abnahme der Fluoreszenz-Polarisation bewirken und daß dieser Test daher zur Bestimmung der Konzentration einer Ziel-DNA in der Probe verwendet werden kann.

Beispiel 10

Nachweis eines PCR-Produktes mit einer fluoreszierenden Sonde: Temderatureffekt

Drei Küvetten, die a) 1 x SSC (2 ml), b) 1 x SSC (2 ml), das FL-Oligo 6 (5,1 pmol) enthielt, und c) 1 x SSC (2 ml), das FL-Oligo 6 (5,1 pmol) und das komplementäre asymmetrische PCR-Produkt (ca. 7 pmol), das unter den Standart-PCR-Bedingungen durch Primer unter Verwendung von Oligo 7 (2 pmol) und Oligo 5 (100 pmol) als Primer hergestellt worden war, enthielt, enthielten, wurden in eine thermostatgesteuerte Zellhalterung des Fluorometers gestellt. In Küvette a) wurde ein Wärmefühler angeordnet.
Die Fluoreszenz-Polarisation der Küvetten b) und c) wurde bei Raumtemperatur (22ºC) bestimmt, und die Temperatur des Wassers, das durch die Zellhalterung zirkulierte, wurde schrittweise erhöht, um so einen Bereich von Probentemperaturen zu erreichen. An jedem Punkt wurde die Temperatur für 5 min konstant gehalten und die Polarisation dann bestimmt.

Resultate

Die Resultate sind in Figur 2 aufgetragen. Für die Sonde allein gibt es die allgemein erwartete Abnahme der Polarisation aufgrund der erhöhten Bewegung bei Temperaturanstieg. Die höhere Polarisation des Hybrids wird bis ca. 50ºC aufrecht erhalten, wo, vermutlich aufgrund des Schmelzens des Hybrids, die Polarisation zu der der freien Sonde zurückkehrt

Beispiel 11

Nachweis eines PCR-Produktes unter Verwendung einer fluoreszierenden Sonde: Effekt der Salzkonzentration

Es wurden drei Küvetten aufgestellt, die in Wasser (2 ml) folgenden Komponenten enthielten: a) 5,1 pmol FL-Oligo 6, b) 5,1 pmol FL-Oligo 6 und ca. 6 pmol des in Beispiel 10 verwendeten komplementären PCR-Produktes und c) 5,1 pmol FL-Oligo 6 und ein großer überschuß (1,4 nmol) nichtverwandtes 50-mer Oligonukleotid. Die Salzkonzentration wurde durch Zusatz von 20 x SSC-Aliquots erhöht, wobei ein Konzentrationsbereich bis zu einer Endkonzentration von 5 x SSC erreicht wurde; nach jeder Zugabe wurde die Fluoreszenz-Polarisation gemessen.

Resultate

Die Resultate sind in Figur 3 dargestellt. Es gibt einen gesamten Anstieg der Polarisation mit der Salzkonzentration, zumindest teilweise durch die erhöhte Viskosität des Lösungsmittels Oberhalb von 0,5 x SSC wurde eine klare Verstärkung der Polarisation aufgrund der Sondenbindung an die Ziel-DNA offensichtlich, wobei diese Verstärkung in der Küvette, die einen großen überschuß einer Nicht-Ziel- Sequenz enthält, nicht auftritt.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis einer Ziel-Nukleinsäuresequenz in einer Probe, wobei das Verfahren ein Inkontaktbringen der Nukleinsäure-Probe mit einer fluoreszierenden Nukleotid-Sonde, die zur Hybridisierung mit der Ziel-Nukleinsäuresequenz geeignet ist, in homogener Lösung und Nachweisen des Vorliegens oder Fehlens einer derartigen Hybridisierung durch Fluoreszenz-Polarisation umfaßt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, das die Verwendung von zwei oder mehr fluoreszierend markierten Sonden, die an benachbarten Bereichen der Ziel-Nukleinsäuresequenz hybridisieren, umfaßt.

3. Verfahren zum Nachweis einer Ziel-Nukleinsäuresequenz in einer Probe, wobei das Verfahren ein Inkontaktbringen der Probe mit (i) einem komplementären Polynukleotid, das zu einer Hybridisierung an der Ziel-Nukleinsäuresequenz geeignet ist und (ii) einer fluoreszierenden Polynukleotidsonde, die zu einer Hybridisierung an demselben Bereich im komplementären Polynukleotid fähig ist, in homogener Lösung und Nachweisen des Vorliegens oder Fehlens einer Hybridisierung der fluoreszierenden Polynukleotid- Sonde mit dem komplementären Polynukleotid durch Fluoreszenz-Polarisation umfaßt.

4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Ziel-Nukleinsäuresequenz ein Produkt einer Amplifikation einer Proben-Nukleinsäure ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Ziel-Nukleinsäuresequenz, die durch Amplifikation einer Proben- Nukleinsäuresequenz erhalten wird, im wesentlichen eine einsträngige DNA ist.

6. Verfahren zum Nachweis einer Ziel-Nukleinsäuresequenz in einer Probe, das ein Inkontaktbringen einer Nukleinsäureprobe mit einem fluoreszierenden Polynukleotid-Primer, der zu einer Hybridisierung mit der Zielsequenz geeignet ist, Unterwerfen eines gebildeten Hybrids einer Primer-Extension und Nachweisen des Vorliegens oder Fehlens eines mit Primer verlängerten Produktes durch Fluoreszenz-Polarisation, umfaßt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, das eine Polymerase- Kettenreaktion anwendet und wobei ein erster fluoreszierender Polynukleotid-Primer in geringerer Konzentration als ein zweiter Polynukleotid-Primer eingesetzt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der zweite Primer in 10- bis 100-fachem überschuß vorliegt.

9. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Probe eine biologische Probe ist.

10. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Ziel-Nukleinsäuresequenz ein Allel eines Gen-Lokus ist, der für eine vererbte Krankheit, Störung oder Prädisposition induzierend ist.

11. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, das als quantitative Analyse der Ziel-Nukleinsäuresequenz durchgeführt wird.

12. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei mehr als eine Ziel-Nukleinsäuresequenz unter Verwendung von Nukleotiden mit verschiedenen Fluorophoren analysiert wird.

13. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Fluorophor Fluorescein oder Rhodamin ist.

14. Verwendung eines Analysensatzes (assay kit), der eine gepufferte Lösung einer fluoreszierend markierten Nukleinsäure-Sonde (von fluoreszierend markierten Nukleinsäure-Sonden) und/oder einen Primer (mehrere Primer) enthält, in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei diese Lösung in einer geeigneten Verpackung zusammen mit Instruktionen zur Hybridisierung der Sonde(n) und/oder dem Primer (den Primern) mit einer Ziel-Nukleinsäuresequenz in einer Probe in homogener Lösung und mit Instruktionen zum anschließenden Nachweis einer Hybridisierung durch Fluoreszenz-Polarisation bereitgestellt wird.