DE69937326T2

DE69937326T2 - Verfahren zur bestimmung eines substrates

Info

Publication number: DE69937326T2
Application number: DE69937326T
Authority: DE
Inventors: Shin Katano-shi Ikeda; Toshihiko Hirakata-shi Yoshioka; Shiro Hirakata-shi Nankai
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Corp
Priority date: 1998-04-02
Filing date: 1999-03-31
Publication date: 2008-07-17
Anticipated expiration: 2019-04-01
Also published as: DE69937326D1; US6340428B1; US6790327B2; US20020043471A1; CN1262739A; EP0987544A4; CN1122178C; EP0987544B1; EP0987544A1; WO1999051974A1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Ausführen eines schnellen Bestimmens eines Substrats mit hoher Messgenauigkeit in einer Probe auf vereinfachte Weise.
Stand der Technik
Als Verfahren zur quantitativen Analyse von Zuckern, wie etwa Saccharose und Glucose wurden Polarimetrie, Kolorimetrie, Reduktiometrie und Verfahren, die eine Vielzahl von Chromatographien verwenden, entwickelt. Alle diese Verfahren haben jedoch eine schlechte Messgenauigkeit aufgrund der schlechten Spezifität für Zucker. Unter diesen Verfahren ist Polarimetrie einfach zu handhaben, wird aber durch die Temperatur während des Vorgangs stark beeinflusst. Daher ist Polarimetrie kein geeignetes Verfahren, mit dem Laien die Bestimmung von Zuckern zu Hause oder anderswo auf vereinfachte Weise durchführen können.
Übrigens wurden in jüngster Zeit verschiedene Arten von Biosensoren entwickelt, die spezifische katalytische Wirkungen von Enzymen verwenden.
Im Folgenden wird ein Verfahren zur Glucosebestimmung als ein Beispiel des Verfahrens zur Substratbestimmung in einer Probenlösung beschrieben. Ein allgemein bekanntes elektrochemisches Verfahren zur Glucosebestimmung ist ein Verfahren, das Glucoseoxidase (EC1.1.3.4; nachfolgend zu GOD abgekürzt) und eine Sauerstoffelektrode oder eine Wasserstoffperoxidelektrode (zum Beispiel "Biosensor" ed. by Shuichi Suzuki, Kodansha) verwendet.
GOD oxidiert selektiv ein β-D-Glucosesubstrat zu D-Glucono-δ-lacton unter Verwendung von Sauerstoff als Elektronenmediator. Sauerstoff wird in Gegenwart von Sauerstoff im Verlauf der Oxidationsreaktion durch GOD zu Wasserstoffperoxid reduziert. Eine verringerte Menge wird mit der Sauerstoffelektrode gemessen, oder, andernfalls, wird eine erhöhte Menge an Wasserstoffperoxid mit der Wasserstoffperoxidelektrode gemessen. Die verringerte Menge an Sauerstoff oder die erhöhte Menge an Wasserstoffperoxid ist proportional zum Glucosegehalt in der Probenlösung, so dass Glucose basierend auf der verringerten Menge an Sauerstoff oder der erhöhten Menge an Wasserstoffperoxid bestimmt werden kann.
Wie aus dem Reaktionsprozess angenommen werden kann, hat dieses Verfahren den Nachteil, dass das Messergebnis stark durch die Sauerstoffkonzentration in der Probenlösung beeinflusst wird. Des Weiteren ist die Messung in Abwesenheit von Sauerstoff in der Probenlösung unmöglich.
Daher wurde ein neuartiger Typ von Glucosesensor entwickelt, der nicht Sauerstoff als Elektronenmediator verwendet, sondern eine organische Verbindung oder einen Metallkomplex, einschließlich Kaliumferricyanid, Ferrocenderivaten, Chinonderivaten usw. als Elektronenmediator verwendet. Dieser Sensortyp oxidiert eine reduzierte Form eines Elektronenmediators, der aus der Enzymreaktion auf der Elektrode resultiert, und bestimmt die Glucosekonzentration, die in der Probenlösung enthalten ist, basierend auf der Menge an Oxidationsstrom. Die Verwendung einer solchen organischen Verbindung oder eines Metallkomplexes als dem Elektronenmediator anstelle von Sauerstoff ermöglicht die Bildung einer Reaktionsschicht, während sie genau eine bekannte Menge an GOD trägt und irgend einen Elektronenmediator in einem stabilisierten Zustand. In diesem Fall, da die Reaktionsschicht in fast trockenem Zustand in das Elektrodensystem integriert werden kann, hat ein Typ eines Wegwerf-Glucosesensors, der auf dieser Technologie basiert, gegenwärtig viel Aufmerksamkeit auf sich gezogen.
Der Typ eines Wegwerf-Glucosesensors erleichtert das Messen der Glucosekonzentrationen mit einem Messgerät durch die einfache Einführung einer Probenlösung in den abnehmbaren Sensor, der mit dem Messgerät verbunden ist. Die Anwendung einer solchen Technik ist nicht nur auf die Glucosebestimmung beschränkt und kann auf die Bestimmung anderer Substrate ausgeweitet werden, die in der Probenlösung enthalten sind.
Das Messen unter Verwendung des Sensors, wie zuvor beschrieben, kann die Substratkonzentration, basierend auf einem fließenden Oxidationsstromwerts bestimmen, der aus der Oxidation einer reduzierten Form eines Elektronenmediators auf einer Arbeitselektrode resultiert. Wenn jedoch Blut, Fruchtsaft oder etwas vergleichbares als Probe verwendet wird, wird jede leicht oxidierbare Substanz, die in der Probenlösung enthalten ist, wie etwa Ascorbinsäure, Harnsäure usw. gleichzeitig auf der Arbeitselektrode zusammen mit dem Elektronenmediator in reduzierter Form oxidiert. Die Oxidationsreaktion einer solchen leicht oxidierbaren Substanz kann manchmal das Messergebnis beeinflussen.
Außerdem kann bei der Messung unter Verwendung des Sensors, wie oben erwähnt, eine Reaktion, die Wasserstoffperoxid unter Verwendung gelösten Sauerstoffs als einem Elektronenmediator produziert, gleichzeitig mit der Reduktion des getragenen Elektronenmediators auf der Reaktionsschicht ablaufen. Des Weiteren reoxidiert das durch die Reaktion produzierte Wasserstoffperoxid den Elektronenmediator in reduzierter Form. Dies kann möglicherweise aufgrund des gelösten Sauerstoffs einen negativen Fehler beim Messergebnis produzieren, wenn die Substratkonzentration basierend auf dem Oxidationsstrom des Elektronenmediators in reduzierter Form gemessen werden soll.
Das oben erwähnte Verfahren legt häufig eine Spannung zwischen der Arbeitselektrode und einer Gegenelektrode an, um die Flüssig-flüssig-Grenzfläche zu detektieren, um nämlich das Heranführen der Probenlösung auf der Basis einer elektrischen Änderung zwischen den beiden Elektroden vor dem Anlegen einer Spannung zwischen der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode zu detektieren, um einen Ansprechstrom zu erhalten. Zu diesem Zeitpunkt kommt es manchmal vor, dass die Messung vor dem Heranführen ausreichender Mengen der Probenlösung zum Elektrodensystem beginnt, aufgrund der Veränderung im Widerstandswert zwischen der oben erwähnten Arbeitselektrode und der Gegenelektrode, was manchmal das Messergebnis beeinflussen kann. Die Induktion einer Veränderung bei der Bedingung einer Schnittstelle der Arbeitselektrode kann das Messergebnis ebenfalls beeinflussen.
Des Weiteren verwendet ein Messverfahren mit einem Zwei-Elektroden-System eine Gegenelektrode als Referenzelektrode. Dies verursacht eine Veränderung im Potential der Gegenelektrode als dem Standard in Verbindung mit der Oxidations-Reduktions-Reaktion an der Arbeitselektrode, was das Messergebnis ebenfalls beeinflusst.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Schwierigkeiten, wie oben beschrieben, zu beseitigen und ein Verfahren zur Bestimmung bereitzustellen, das eine genaue Messung der Substratkonzentration erleichtert, indem Einflüsse von leicht oxidierbaren Substanzen entfernt werden.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Substratbestimmung mit geringeren Abweichungen beim Ansprechen des Sensors bereitzustellen.
Offenbarung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration eines Substrats in einer Probenlösung unter Verwendung eines Biosensors, umfassend eine elektrisch isolierende Basisplatte, ein Elektrodensystem mit einer Arbeitselektrode, einer Gegenelektrode und einer dritten Elektrode, die als Störsubstanzdetektionselektrode verwendet wird, wobei jede an der oben erwähnten Basisplatte ausgebildet ist, und eine Reaktionsschicht, die mindestens eine Oxidoreduktase und einen Elektronenmediator enthält und auf dem Elektrodensystem unter Aussparung der dritten Elektrode gebildet ist, wobei der Elektronenmediator durch die generierenden Elektronen bei einer Reaktion zwischen dem in der Probenlösung enthaltenen Substrat und der Oxidoreduktase reduziert wird, um eine reduzierte Menge des Elektronenmediators elektrochemisch zu messen,
wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass es die folgenden Schritte umfasst:

(a) einen Schritt zum Anlegen einer Spannung zwischen der Gegenelektrode und der dritten Elektrode;
(b) einen Schritt zum Heranführen der Probenlösung an die Reaktionsschicht;
(c) einen Schritt zur Detektion einer elektrischen Änderung zwischen der Gegenelektrode und der dritten Elektrode in Folge des Heranführens der Probenlösung an die Reaktionsschicht;
(d) einen Schritt zum Messen eines Stroms, der zwischen der Gegenelektrode und der dritten Elektrode nach dem oben erwähnten Detektionsschritt (c) fließt;
(e) einen Schritt zum Entfernen der Spannung zwischen der Gegenelektrode und der dritten Elektrode nach dem oben erwähnten Messschritt (d);
(f) einen Schritt zum Anlegen einer Spannung zwischen der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode; und
(g) einen Schritt zum nachfolgenden Messen eines Stroms, der zwischen der Gegenelektrode und der Arbeitselektrode fließt.

Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Bestimmen der Konzentration eines Substrats in einer Probenlösung unter Verwendung eines Biosensors bereit, umfassend eine elektrisch isolierende Basisplatte, ein Elektrodensystem mit einer Arbeitselektrode, einer Gegenelektrode und einer dritten Elektrode, die als Störsubstanzdetektionselektrode verwendet wird, wobei jede an der oben erwähnten Basisplatte ausgebildet ist, eine Reaktionsschicht, die mindestens eine Oxidoreduktase und einen Elektronenmediator enthält und auf dem Elektrodensystem unter Aussparung der dritten Elektrode ausgebildet ist, und ein Abdeckelement, das einen Probenlösungszufuhrpfad bildet, um eine Probenlösung von einem Probenlösungszufuhreinlass in die oben erwähnte Reaktionsschicht auf der oben erwähnten Basisplatte einzuleiten, wobei die dritte Elektrode stromauf des Probenlösungszufuhrpfads ausgehend von der Reaktionsschicht angeordnet ist, wobei der Elektronenmediator durch die erzeugten Elektronen bei einer Reaktion zwischen dem in der Probenlösung enthaltenen Substrat und der Oxidoreduktase reduziert wird, um eine reduzierte Menge des Elektronenmediators elektrochemisch zu messen,
wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

Für das Verfahren zur Bestimmung gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer dritten Elektrode als Referenzelektrode bevorzugt. Es wird nämlich ebenfalls eine Spannung zwischen der Arbeitselektrode und der dritten Elektrode während des oben erwähnten Schritts (f) angelegt.
Wenn ein Biosensor verwendet wird, bei dem das Abdeckelement in die oben erwähnte Basisplatte integriert ist, ist es ebenfalls bevorzugt, eine Lecithin-tragende Schicht auf einer freiliegenden Wandfläche des Abdeckelements für den Probenlösungszufuhrpfad bereitzustellen.
Es ist bevorzugt, dass die oben erwähnte Reaktionsschicht des Weiteren ein hydrophiles Polymer enthält.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Draufsicht, die einen Glucosesensor gemäß einem Beispiel der vorliegenden Erfindung darstellt, bei der die Reaktionsschicht ausgespart wurde.
2 ist eine perspektivische Explosionsansicht, die einen Glucosesensor gemäß einem anderen Beispiel der vorliegenden Erfindung darstellt, bei der die Reaktionsschicht ausgespart wurde.
Beste Art, die Erfindung auszuführen
Es wird eine Struktur des Biosensors beschrieben, der in dem Verfahren zur Bestimmung gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
Zuerst wird ein erster Biosensortyp mittels 1 beschrieben.
Bei diesem Sensor werden eine Gegenelektrode 6, eine Arbeitselektrode 7 und eine dritte Elektrode 8 auf einer isolierenden Basisplatte 1 ausgebildet, die aus Polyethylenterephthalat hergestellt ist, zusammen mit den jeweiligen Zuführungen 2, 3 und 4, die mit diesen elektrisch verbunden sind. Eine Kohlenstoffschicht 9, die ausgebildet wird, um die Erzeugung einer Reaktionsschicht zu erleich tern, wirkt nicht als Elektrode. Eine runde Reaktionsschicht (nicht gezeigt), die eine Oxidoreductase und einen Elektronenmediator enthält, wird an der Gegenelektrode 6, der Arbeitselektrode 7 und der Kohlenstoffschicht 9 unter Aussparung der dritten Elektrode 8 ausgebildet. In der Figur steht die Ziffer 5 für eine isolierende Schicht.
Dann wird ein zweiter Biosensortyp mittels 2 beschrieben.
Dieser Sensor ist eine Kombination der Basisplatte 1 in 1 mit einem Abdeckelement, umfassend eine Abdeckung 10 und einen Abstandshalter 11. Sie sind miteinander in einer Lagebeziehung verbunden, wie durch die Strichpunktlinie in 2 gezeigt, um einen Sensor auszubilden.
Ein Schlitz 12 zur Ausbildung des Probenlösungszufuhrpfads ist auf dem Abstandshalter 11 ausgebildet, und eine Lüftungsöffnung 13 ist auf der Abdeckung 10 ausgebildet. Das Laminieren der Abdeckung 11 auf die Basisplatte 1 über den Abstandshalter 11, um sie miteinander zu verbinden, führt zur Bildung eines Hohlraums, der als Probenlösungszufuhrpfad am Schlitz 12 auf dem Abstandshalter 11 durch die Basisplatte 1, den Abstandshalter 11 und die Abdeckung 10 dient. Eine Endkante dieses Hohlraums kommuniziert mit der Lüftungsöffnung 13.
Bei diesem Biosensor liegt die Arbeitselektrode 7 an einer Position näher an einem Probenlösungszufuhreinlass 12a (der einer offenen Kante des Schlitzes 12 entspricht) als die halbmondförmige Gegenelektrode 6, und die dritte Elektrode 8 liegt an einer Position, die noch näher an dem Probenlösungszufuhreinlass 12a ist, als die Arbeitselektrode 7. Jede dieser Elektroden 6, 7 und 8 ist hinsichtlich des oben erwähnten Hohlraums freiliegend.
Beim Messen der Substratkonzentration unter Verwendung des oben erwähnten Biosensors, wird ein Endabschnitt des Sensors, an dem die Zuführungen 2, 3 und 4 bereitgestellt sind, zuerst auf ein Messgerät gesetzt, gefolgt vom Anlegen eines vorbestimmten Potentials auf die dritte Elektrode 8, bezogen auf die Gegenelektrode 6. Wenn das Potential angelegt wird, wird eine Probenlösung, die zum Beispiel Ascorbinsäure als Störsubstanz enthält, auf die Reaktionsschicht getropft, um die Reaktionsschicht in der Probenlösung aufzulösen.
Beim Heranführen der Probenlösung beginnt ein Flüssigkeitszufuhrdetektionssystem zu arbeiten, das auf einer elektrischen Änderung zwischen der Gegenelektrode 6 und der dritten Elektrode 8 des Elektrodensystems basiert, welches seinerseits einen Messtimer startet. Zu diesem Zeitpunkt wird das Potential weiterhin zwischen der Gegenelektrode 6 und der dritten Elektrode 8 angelegt, und es wird ein Stromwert zwischen der Gegenelektrode 6 und der dritten Elektrode 8 gemessen, wenn eine bestimmte Zeit nach der Detektion des Heranführens der Probenlösung vergangen ist. Da auf der Reaktionsschicht die dritte Elektrode 8 ausgespart ist, dauert es eine kurze Zeit, bis der Elektronenmediator in reduzierter Form, der aus der Enzymreaktion resultiert, die Nähe der dritten Elektrode 8 erreicht. Daher muss der oben erwähnte Stromwert von der Oxidationsreaktion der Ascorbinsäure abgeleitet sein, die als Störsubstanz enthalten ist.
Dann wird die Spannung zwischen der Gegenelektrode 6 und der dritten Elektrode 8 entfernt.
Nachfolgend wird ein Potential zum Oxidieren des oben erwähnten Elektronenmediators in reduzierter Form auf die Arbeitselektrode 7, bezogen auf die Gegenelektrode 6, angelegt, um einen Stromwert zwischen der Gegenelektrode 6 und der Arbeitselektrode 7 zu messen. Dieser Strom ist von den Oxidationsreaktionen des Elektronenmediators in reduzierter Form und der bereits vorhandenen Störsubstanz Ascorbinsäure abgeleitet. Anders ausgedrückt erzeugt die Ascorbinsäure einen positiven Fehler im Messergebnis. Der oben erwähnte Stromwert zwischen der Gegenelektrode 6 und der dritten Elektrode 8 spiegelt im Wesentlichen nur die Ascorbinsäurekonzentration wieder, so dass die Korrektur des Messergebnisses auf der Basis dieses Stromwerts jeden Einfluss der Ascorbinsäure entfernt, wodurch eine genaue Substratkonzentration bestimmt werden kann.
Der zweite Sensortyp detektiert das Heranführen der Probenlösung zwischen der Gegenelektrode 6 und der dritten Elektrode 8, so dass der gesamte freiliegende Bereich der Arbeitselektrode 7 mit Sicherheit mit der Probenlösung gefüllt ist. Folglich kann das Heranführen der Probenlösung zuverlässiger bestimmt werden.
Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung mittels der Beispiele spezifischer beschrieben.
Beispiel 1
Es wird ein Verfahren zur Glucosebestimmung beschrieben. Die in 1 gezeigte Basisplatte wurde als Basisplatte eines Glucosesensors verwendet. Der Glucosesensor wurde wie folgt erzeugt.
Eine Silberpaste wurde auf die isolierende Basisplatte 1, die aus Polyethylenterephthalat hergestellt wurde, unter Verwendung von Siebdruck gedruckt, um die jeweiligen Zuführungen 2, 3 und 4 auszubilden. Dann wurde des Weiteren eine leitende Kohlenstoffpaste, die einen Harzträger enthält, auf die Basisplatte 1 gedruckt, um die Gegenelektrode 6, die Arbeitselektrode 7, die dritte Elektrode 8 und die Kohlenstoffschicht 9 auszubilden. Die Gegenelektrode 6, die Arbeitselektrode 7 und die dritte Elektrode 8 sind elektrisch mit den Zuführungen 2, 3 bzw. 4 verbunden.
Dann wurde eine isolierende Paste auf die Basisplatte 1 gedruckt, um die isolierende Schicht 5 auszubilden. Die isolierende Schicht 5 bedeckt jeweils einen Rand der Gegenelektrode 6, der Arbeitselektrode 7, der dritten Elektrode 8 und der Kohlenstoffschicht 9, wodurch jeweils der freiliegende Bereich der Gegenelektrode 6, der Arbeitselektrode 7, der dritten Elektrode 8 und der Kohlenstoffschicht 9 konstant gehalten wird. Die isolierende Schicht 5 bedeckt die Zuführungen 2, 3 und 4 teilweise.
Dann wurde eine wässrige Lösung aus Carboxymethylcellulose (nachfolgend zu CMC abgekürzt) auf die Gegenelektrode 6, die Arbeitselektrode 7 und die Kohlenstoffschicht 9 unter Aussparung der dritten Elektrode 8 getropft und getrocknet, um eine CMC-Schicht auszubilden. Das Auftropfen einer wässrigen Lösung, die GOD als Enzym und Kaliumferricyanid als Elektronenmediator enthält, auf die CMC-Schicht, löst einmal die CMC-Schicht, die aus einem hydrophilen Polymer besteht, das durch den nachfolgenden Trocknungsvorgang zu einer Reaktionsschicht ausgebildet wird, wobei CMC mit dem Enzym und dem anderen Bestandteil gemischt wird. Die Abwesenheit von Rühren usw. führt jedoch zu einem unvollständigen Vermischen der beiden, wodurch die Fläche des Elektrodensystems nur mit CMC bedeckt wird. Anders ausgedrückt, weil kein Kontakt des Enzyms und des Elektronenmediators mit der Fläche des Elektrodensystems erfolgt, kann die Adsorption von Protein auf die Fläche des Elektrodensystems verhindert werden.
Um die Glucosekonzentrationen unter Verwendung dieses Sensors zu messen, wurde ein Endabschnitt des Sensors, an dem die Zuführungen 2, 3 und 4 bereitgestellt sind, zuerst auf ein Messgerät gesetzt und ein Potential von 500 mV wurde auf die dritte Elektrode 8, bezogen auf die Gegenelektrode 6, angelegt. Während das Potential weiterhin angelegt wurde, wurde eine wässrige Glucoselösung, die Ascorbinsäure als Störsubstanz enthielt, als Probenlösung mit 30 μl auf die Reaktionsschicht getropft. Die Reaktionsschicht auf dem Elektrodensystem löste sich in der aufgetropften Probenlösung auf.
Beim Heranführen der Probenlösung begann ein Flüssigkeitszufuhrdetektionssystem zu arbeiten, das auf einer elektrischen Änderung zwischen der Gegenelektrode 6 und der dritten Elektrode 8 des Elektrodensystems basiert. Dieses startete einen Messtimer. Zu diesem Zeitpunkt wird das Potential weiterhin zwischen der Gegenelektrode 6 und der dritten Elektrode 8 angelegt, und nach Ablauf einer bestimmten Zeit nach der Detektion des Heranführens der Probenlösung wurde ein Strom zwischen der Gegenelektrode 6 und der dritten Elektrode 8 gemessen. Der Strom wurde aus der Oxidationsreaktion der Ascorbinsäure, die als Störsubstanz enthalten war, abgeleitet, und hatte eine proportionale Beziehung zu deren Konzentration. Nach dem Messen des Stroms zwischen der Gegenelektrode 6 und der dritten Elektrode 8 wurde die Spannung zwischen den beiden Elektroden entfernt.
Wie oben erwähnt wurde die Reaktionsschicht nicht auf der dritten Elektrode 8 angeordnet. Daher dauert es eine kurze Zeit bis zur Ankunft von Ferrocyanidionen, die aus der Enzymreaktion resultieren, in der Nähe der dritten Elektrode 8. Der Stromwert zwischen der Gegenelektrode 6 und der dritten Elektrode 8 während eines Intervalls bis zur Ankunft der Ferrocyanidionen spiegelt nämlich im Wesentlichen nur die Ascorbinsäurekonzentration.
Des Weiteren wurden 25 Sekunden nach der Detektion der Probenlösung 500 mV auf die Arbeitselektrode 7, bezogen auf die Gegenelektrode 6, angelegt, und nach 5 Sekunden wurde ein Stromwert zwischen der Gegenelektrode 6 und der Arbeitselektrode 7 gemessen.
Die Reaktion von Ferricyanidionen, Glucose und GOD in der Lösung oxidiert schließlich Glucose zu Gluconolacton und reduziert die Ferricyanidionen zu Ferrocyanidionen. Die Konzentration an Ferrocyanidionen ist proportional zur Glucosekonzentration. Ein Strom zwischen der Gegenelektrode 6 und der Arbeitselektrode 7 wird nach 30 Sekunden Detektion der Probenlösung von den Oxidationsreaktionen der Ferrocyanidionen und der bereits vorhandenen Ascorbinsäure abgeleitet. Dies bedeutet, dass Ascorbinsäure einen positiven Fehler im Messergebnis erzeugt. Wie jedoch zuvor beschrieben, spiegelt der Stromwert zwischen der Gegenelektrode 6 und der dritten Elektrode 8 im Wesentlichen nur die Ascorbinsäurekonzentration. Daher kann die Korrektur des Messergebnisses, basierend auf diesem Ergebnis, alle Effekte der Ascorbinsäure entfernen, wodurch die Bestimmung der genauen Glucosekonzentration ermöglicht wird.
Beispiel 2
Die Elektroden 6, 7, 8 und die Kohlenstoffschicht 9 wurden auf der Basisplatte 1 auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 ausgebildet. Dann wurde eine wässrige CMC-Lösung auf die Gegenelektrode 6, die Arbeitselektrode 7 und die Kohlenstoffschicht 9 getropft, wobei die dritte Elektrode 8 ausgespart wurde, und getrocknet, um die CMC-Schicht auszubilden, auf die des Weiteren eine wässrige Lösung, die GOD als Enzym und Kaliumferricyanid als Elektronenmediator enthält, aufgetropft und getrocknet wurde, um die Reaktionsschicht auszubilden.
Dann wurde, um des Weiteren das Heranführen der Probenlösung zur Reaktionsschicht zu vereinfachen, eine organische Lösemittel-Lecithinlösung, wie zum Beispiel eine Toluenlösung, vom Probenlösungszufuhreinlass zur Reaktionsschicht verteilt und getrocknet, um eine Lecithinschicht auf der Reaktionsschicht auszubilden. Dann wurden die Abdeckung 10 und der Abstandshalter 11 mit der Basisplatte 1 in einer Lagebeziehung verbunden, wie durch die Strichpunktlinie in 2 gezeigt, um einen Glucosesensor auszubilden.
Der Sensor wurde auf ein Messgerät gesetzt und es wurde ein Potential von 500 mV auf die dritte Elektrode 8, bezogen auf die Gegenelektrode 6, angelegt. Während das Potential weiterhin angelegt wurde, wurde eine wässrige Glucoselösung, die Ascorbinsäure als Störsubstanz enthielt, als Probenlösung mit 3 μl durch den Probenlösungszufuhreinlass 12a zugeführt. Die Probenlösung erreichte den Lufteinlass 13, indem es den Probenlösungszufuhrpfad passierte, und löste die Reaktionsschicht auf dem Elektrodensystem auf.
Beim Heranführen der Probenlösung begann ein Flüssigkeitszufuhrdetektionssystem zu arbeiten, das auf einer elektrischen Änderung zwischen der Gegenelektrode 6 und der dritten Elektrode 8 des Elektrodensystems basiert. Dieses startete einen Messtimer. Zu diesem Zeitpunkt wird das Potential weiterhin zwischen der Gegenelektrode 6 und der dritten Elektrode 8 angelegt, und nach Ablauf einer bestimmten Zeit nach der Detektion des Heranführens der Probenlösung wurde ein Strom zwischen der Gegenelektrode 6 und der dritten Elektrode 8 gemessen. Der Strom wurde aus der Oxidationsreaktion der Ascorbinsäure, die als Störsubstanz enthalten war, abgeleitet, und hatte eine proportionale Beziehung zu deren Konzentration. Nach dem Messen des Stroms zwischen der Gegenelektrode 6 und der dritten Elektrode 8 wurde die Spannung zwischen den beiden Elektroden entfernt.
Wie oben erwähnt wurde die Reaktionsschicht nicht auf der dritten Elektrode 8 angeordnet. Daher dauert es eine kurze Zeit bis zur Ankunft von Ferrocyanidionen, die aus der Enzymreaktion resultieren, in der Nähe der dritten Elektrode 8. Der Stromwert zwischen der Gegenelektrode 6 und der dritten Elektrode 8 während eines Intervalls bis zur Ankunft der Ferrocyanidionen spiegelt nämlich im Wesentlichen nur die Ascorbinsäurekonzentration.
Des Weiteren wurden 25 Sekunden nach der Detektion der Probenlösung 500 mV auf die Arbeitselektrode 7, bezogen auf die Gegenelektrode 6, angelegt, und nach 5 Sekunden wurde ein Stromwert zwischen der Gegenelektrode 6 und der Arbeitselektrode 7 gemessen.
Die Reaktion von Ferricyanidionen, Glucose und GOD in der Lösung oxidiert schließlich Glucose zu Gluconolacton und reduziert die Ferricyanidionen zu Ferrocyanidionen. Die Konzentration an Ferrocyanidionen ist proportional zur Glucosekonzentration. Ein Strom zwischen der Gegenelektrode 6 und der Arbeitselektrode 7 wird nach 30 Sekunden Detektion der Probenlösung von den Oxidationsreaktionen der Ferrocyanidionen und der bereits vorhandenen Ascorbinsäure abgeleitet. Dies bedeutet, dass Ascorbinsäure einen positiven Fehler im Messergebnis erzeugt. Wie jedoch zuvor beschrieben, spiegelt der Stromwert zwischen der Gegenelektrode 6 und der dritten Elektrode 8 im Wesentlichen nur die Ascorbinsäurekonzentration. Daher kann die Korrektur des Messergebnisses, basierend auf diesem Ergebnis, alle Effekte der Ascorbinsäure entfernen, wodurch die Bestimmung der genauen Glucosekonzentration ermöglicht wird.
Im vorliegenden Beispiel wird aufgrund der Detektion des Heranführens der Probenlösung zwischen der Gegenelektrode 6 und der dritten Elektrode 8, der gesamte freiliegende Abschnitt der Arbeitselektrode 7 mit Sicherheit mit der Probenlösung gefüllt. Dies ermöglicht eine noch zuverlässigere Bestimmung des Heranführens der Probenlösung.
Beispiel 3
Ein Glucosesensor wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 2 erzeugt.
Der Sensor wurde auf ein Messgerät gesetzt und es wurde ein Potential von 500 mV auf die dritte Elektrode 8, bezogen auf die Gegenelektrode 6, angelegt. Während das Potential weiterhin angelegt wurde, wurde eine wässrige Glucoselösung, die Ascorbinsäure als Störsubstanz enthielt, als Probenlösung mit 3 μl durch den Probenlösungszufuhreinlass 12a zugeführt. Die Probenlösung erreichte den Lufteinlass 13, indem es den Probenlösungszufuhrpfad passierte, und löste die Reaktionsschicht auf dem Elektrodensystem auf.
Beim Heranführen der Probenlösung begann ein Flüssigkeitszufuhrdetektionssystem zu arbeiten, das auf einer elektrischen Änderung zwischen der Gegenelektrode 6 und der dritten Elektrode 8 des Elektrodensystems basiert, welches dann einen Messtimer startete. Zu diesem Zeitpunkt wird das Potential weiterhin zwischen der Gegenelektrode 6 und der dritten Elektrode 8 angelegt, und nach Ablauf einer bestimmten Zeit nach der Detektion des Heranführens der Probenlösung wurde ein Strom zwischen der Gegenelektrode 6 und der dritten Elektrode 8 gemessen. Der Strom wurde aus der Oxidationsreaktion der Ascorbinsäure, die als Störsubstanz enthalten war, abgeleitet, und hatte eine proportionale Beziehung zu deren Konzentration. Nach dem Messen des Stroms zwischen der Gegenelektrode 6 und der dritten Elektrode 8 wurde die Spannung zwischen den beiden Elektroden entfernt.
Wie oben erwähnt wurde die Reaktionsschicht nicht auf der dritten Elektrode 8 angeordnet. Daher dauert es eine kurze Zeit bis zur Ankunft von Ferrocyanidionen, die aus der Enzymreaktion resultieren, in der Nähe der dritten Elektrode 8. Der Stromwert zwischen der Gegenelektrode 6 und der dritten Elektrode 8 während eines Intervalls bis zur Ankunft der Ferrocyanidionen spiegelt nämlich im Wesentlichen nur die Ascorbinsäurekonzentration.
Des Weiteren wurden 25 Sekunden nach der Detektion der Probenlösung 500 mV auf die Arbeitselektrode 7, bezogen auf die dritte Elektrode 8, angelegt, und nach 5 Sekunden wurde ein Stromwert zwischen der Gegenelektrode 6 und der Arbeitselektrode 7 gemessen.
Die Reaktion von Ferricyanidionen, Glucose und GOD in der Lösung oxidiert schließlich Glucose zu Gluconolacton und reduziert die Ferricyanidionen zu Ferrocyanidionen. Die Konzentration an Ferrocyanidionen ist proportional zur Glucosekonzentration. Ein Strom zwischen der Gegenelektrode 6 und der Arbeitselektrode 7 wird nach 30 Sekunden Detektion der Probenlösung von den Oxidationsreaktionen der Ferrocyanidionen und der bereits vorhandenen Ascorbinsäure abgeleitet. Dies bedeutet, dass Ascorbinsäure einen positiven Fehler im Messergebnis erzeugt. Wie jedoch zuvor beschrieben, spiegelt der Stromwert zwischen der Gegenelektrode 6 und der dritten Elektrode 8 im Wesentlichen nur die Ascorbinsäurekonzentration. Daher kann die Korrektur des Messergebnisses, basierend auf diesem Ergebnis, alle Effekte der Ascorbinsäure entfernen, wodurch die Bestimmung der genauen Glucosekonzentration ermöglicht wird.
Die zusätzliche Messung eines Potentials der dritten Elektrode 8 während des Anlegens des Potentials auf die Arbeitselektrode 7, bezogen auf eine Silber/Silberchloridelektrode bewies fast keine Potentialänderung der dritten Elektrode 8, obwohl eine Oxidationsreaktion an der Arbeitselektrode 7 stattfand. Abweichungen beim Ansprechen des Sensors wurden im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren, die Flüssigflüssig-Grenzflächen basierend auf einer Änderung des Widerstands zwischen der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode detektieren, ebenfalls verringert.
Beispiel 4
Auf die gleiche Weise wie in Beispiel 2 wurde die Reaktionsschicht auf der Gegenelektrode 6, der Arbeitselektrode 7 und der Kohlenstoffschicht 9 ausgebildet, wobei die dritte Elektrode 8 ausgespart wurde.
Dann wurde eine organische Lösemittel-Lecithinlösung, wie zum Beispiel eine Toluenlösung, auf einer Rille, die auf dem Abdeckelement zum Ausbilden des Probenlösungszufuhrpfads ausgebildet wurde, verteilt und getrocknet, um dadurch die Lecithinschicht auszubilden, mit dem Ziel, das Heranführen der Probenlösung zur Reaktionsschicht noch weiter zu vereinfachen. Dann wurden die Abdeckung 10 und der Abstandshalter 11 mit der Basisplatte 1 in einer Lagebeziehung verbunden, wie durch die Strichpunktlinie in 2 gezeigt, was einen Glucosesensor ergab.
Die Positionierung der Lecithinschicht von der Reaktionsschicht über die dritte Elektrode 8 kann manchmal die Abweichungen der Ansprechmerkmale des Sensors aufgrund einer Änderung der Fläche der dritten Elektrode durch die Lecithinschicht erhöhen. Die Positionierung der Lecithinschicht auf die Abdeckelementseite, wie oben gezeigt, führte zu einer Verringerung solcher Abweichungen, und die Ansprechmerkmale wurden verbessert.
Beispiel 5
Ein Glucosesensor wurde auf gänzlich gleiche Weise erzeugt wie in Beispiel 2, abgesehen von der Aussparung der CMC-Schicht von der Reaktionsschicht.
Und das Ergebnis der auf die gleiche Weise wie in Beispiel 2 durchgeführten Messung zeigte ein Abhängigkeit von den Ascorbinsäure- und Glucosekonzentrationen, trotz der erhöhten Abweichungen beim Ansprechen des Sensors, verglichen mit dem Fall, bei dem die CMC-Schicht enthalten war.
Beispiel 6
Ein Glucosesensor wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 4 erzeugt.
Der Sensor wurde auf ein Messgerät gesetzt und es wurde ein Potential von –1.300 mV auf die dritte Elektrode 8, bezogen auf die Gegenelektrode 6, angelegt. Während das Potential weiterhin angelegt wurde, wurde eine luftgesättigte wässrige Glucoselösung mit 3 μl als Probenlösung durch den Probenlösungszufuhreinlass 12a zugeführt. Die Probenlösung erreichte den Lufteinlass 13, indem es den Probenlösungszufuhrpfad passierte, und löste die Reaktionsschicht auf dem Elektrodensystem auf.
Beim Heranführen der Probenlösung begann ein Flüssigkeitszufuhrdetektionssystem zu arbeiten, das auf einer elektrischen Änderung zwischen der Gegenelektrode 6 und der dritten Elektrode 8 des Elektrodensystems basiert, welches einen Messtimer startete. Zu diesem Zeitpunkt wird das Potential weiterhin zwischen der Gegenelektrode 6 und der dritten Elektrode 8 angelegt, und nach Ablauf einer bestimmten Zeit nach der Detektion des Heranführens der Probenlösung wurde ein Strom zwischen der Gegenelektrode 6 und der dritten Elektrode 8 gemessen. Der Strom wurde aus der Reduktionsreaktion des gelösten Sauerstoffs abgeleitet.
Wenn eine Glucoselösung, die mit Argon entgast wurde, zugeführt wurde, verringerte sich der Reduktionsstrom drastisch. Nach dem Messen des Stroms zwischen der Gegenelektrode 6 und der dritten Elektrode 8 wurde die Spannung zwischen den beiden Elektroden entfernt.
Wie oben erwähnt wurde die Reaktionsschicht nicht auf der dritten Elektrode 8 angeordnet. Daher dauert es eine kurze Zeit bis zur Ankunft von Ferrocyanidionen in der Reaktionsschicht in der Nähe der dritten Elektrode 8. Der Stromwert zwischen der Gegenelektrode 6 und der dritten Elektrode 8 während eines Intervalls bis zur Ankunft der Ferricyanidionen spiegelt nämlich im Wesentlichen nur die Konzentration an gelöstem Sauerstoff.
Des Weiteren wurden 25 Sekunden nach der Detektion der Probenlösung 500 mV auf die Arbeitselektrode 7, bezogen auf die dritte Elektrode 8, angelegt, und nach 5 Sekunden wurde ein Stromwert zwischen der Gegenelektrode 6 und der Arbeitselektrode 7 gemessen.
Die Reaktion von Ferricyanidionen, Glucose und GOD in der Lösung oxidiert schließlich Glucose zu Gluconolacton und die Reduktion von Ferricyanidionen zu Ferrocyanidionen findet mit dieser Oxidationsreaktion statt.
Wenn andererseits gleichzeitig eine Reaktion als Konkurrenzreaktion abläuft, bei der gelöster Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid reduziert wird, wenn die Glucose zu Gluconolacton reduziert wird, aufgrund der Wirkung des gelösten Sauerstoff in der Probenlösung als Elektronenmediator. Das durch diese Reaktion generierte Wasserstoffperoxid reoxidiert Ferrocyanidionen zu Ferricyanidionen. Wenn daher die Glucosekonzentration basierend auf einem Oxidationsstrom des Ferrocyanidions gemessen werden soll, kann solch ein gelöster Sauerstoff einen negativen Fehler im Messergebnis erzeugen.
Wie jedoch zuvor erwähnt, spiegelt der Stromwert zwischen der Gegenelektrode 6 und der dritten Elektrode 8 im Wesentlichen nur die Konzentration an gelöstem Sauerstoff. Daher kann die Korrektur des Messergebnisses, basierend auf diesem Ergebnis, alle Effekte des gelösten Sauerstoffs entfernen, wodurch die Bestimmung der genauen Glucosekonzentration ermöglicht wird.
Beispiel 7
Ein Glucosesensor wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 4 erzeugt.
Der Sensor wurde auf ein Messgerät gesetzt und es wurde ein Potential von 500 mV auf die dritte Elektrode 8, bezogen auf die Gegenelektrode 6, angelegt. Während das Potential weiterhin angelegt wurde, wurde eine wässrige Glucoselösung, die Ascorbinsäure als Störsubstanz enthielt, als Probenlösung mit 3 μl durch den Probenlösungszufuhreinlass 12a zugeführt. Die Probenlösung erreichte den Lufteinlass 13, indem es den Probenlösungszufuhrpfad passierte, und löste die Reaktionsschicht auf dem Elektrodensystem auf.
Beim Heranführen der Probenlösung begann ein Flüssigkeitszufuhrdetektionssystem zu arbeiten, das auf einer elektrischen Änderung zwischen der Gegenelektrode 6 und der dritten Elektrode 8 des Elektrodensystems basiert, welches einen Messtimer startete. Zu diesem Zeitpunkt wird das Potential weiter zwischen der Gegenelektrode 6 und der dritten Elektrode 8 angelegt. Zwei Sekunden nach der Detektion des Heranführens der Probenlösung wurde das Potential, das an die dritte Elektrode 8 angelegt werden soll, auf –1.300 mV geändert. Der Strom zwischen der Gegenelektrode 6 und der dritten Elektrode 8 wurde zu zwei Zeitpunkten unmittelbar vor und 3 Sekunden nach der Potentialänderung auf –1.300 mV gemessen. Der Strom unmittelbar vor der Potentialänderung hängt im Wesentlichen von der Ascorbinsäurekonzentration ab. Andererseits hängt der Strom 3 Sekunden nach der Potentialänderung auf –1.300 mV im Wesentlichen von der Konzentration an gelöstem Sauerstoff in der Probenlösung ab.
Nach dem Messen des Stroms zwischen der Gegenelektrode 6 und der dritten Elektrode 8 nach 2 und 5 Sekunden des Heranführens der Probenlösung wurde die Spannung zwischen den beiden Elektroden entfernt.
Fünfundzwanzig Sekunden nach der Detektion der Probenlösung wurden des Weiteren 500 mV auf die Arbeitselektrode 7, bezogen auf die dritte Elektrode 8, angelegt, und nach 5 Sekunden wurde der Strom zwischen der Gegenelektrode 6 und der Arbeitselektrode 7 gemessen.
Wie oben beschrieben, spiegelt der Stromwert zwischen der Gegenelektrode 6 und der dritten Elektrode 8 im Wesentlichen die Konzentrationen an Ascorbinsäure gelöstem Sauerstoff. Daher können die Konzentrationen dieser beiden Substanzen basierend auf diesem Stromwert bestimmt werden. Daher kann die Korrektur des Messergebnisses, basierend auf diesem Ergebnis, alle Effekte der Ascorbinsäure und des gelösten Sauerstoffs entfernen, wodurch die Bestimmung der genauen Glucosekonzentration ermöglicht wird.
Wenngleich in den vorgenannten Beispielen das Potential, das auf die dritte Elektrode 8 anzulegen ist, um das Heranführen der Probenlösung abzutasten, um Ascorbinsäure oder gelösten Sauerstoff zu detektieren, 500 mV oder –1.300 mV betrug, ist die vorliegende Erfindung nicht auf diese Potentialwerte beschränkt. Überdies ist, wenngleich ein Potential von 500 mV auf die Arbeitselektrode 7 angelegt wurde, um einen Ansprechstrom zu erhalten, die vorliegende Erfindung nicht auf diesen Potentialwert beschränkt, und es kann jedes Potential verwendet werden, wenn es den Elektronenmediator in reduzierter Form oxidieren kann, der aus einer Reaktionsserie resultiert. Der Zeitpunkt zum Messen des Stromwerts ist ebenfalls nicht auf jene beschränkt, die in den vorgenannten Beispielen verwendet wurden.
Wenngleich in den vorgenannten Beispielen Carboxymethylcellulose als hydrophiles Polymer verwendet wurde, kann eine Vielzahl von hydrophilen Polymeren verwendet werden, um die hydrophile Polymerschicht auszubilden. Beispielhafte hydrophile Polymere beinhalten Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Methylcellulose, Ethylcellulose, Ethylhydroxyethylcellulose, Carboxymethylethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol, Polyaminosäure, wie etwa Polylysin, Polystyrolsulfonat, Gelatine und deren Derivate, Polyacrylsäure und deren Salze, Polymethacrylsäure und deren Salze, Stärke und deren Derivate, und Maleinsäureanhydrid- oder Maleatpolymer. Darunter sind Carboxymethylcellulose, Hydroxyethylcellulose und Hydroxypropylcellulose bevorzugt.
Die Oxidoreductase die in der Reaktionsschicht enthalten sein muss, wird abhängig von dem Substrat ausgewählt, das in der Probenlösung enthalten ist. Beispielhafte Oxidoreductasen beinhalten Fructosedehydrogenase, Glucoseoxidase, Alkoholoxidase, Lactatoxidase, Cholesteroloxidase, Xenthinoxidase und Aminosäureoxidase.
Als Elektronenmediator können Kaliumferricyanid, p-Benzochinon, Phenazinmethosulfat, Methylenblau und Ferrocenderivat beispielhaft genannt werden. Diese Elektronenmediatoren können allein oder in einer Kombination aus zwei oder mehreren verwendet werden.
Die oben beispielhaft erwähnten Enzyme und Elektronenmediatoren können in der Probenlösung aufgelöst werden, oder es kann verhindert werden, dass sie sich in der Probenlösung auflösen, indem die Reaktionsschicht auf die Basisplatte fixiert wird, und so weiter. Wenn das Enzym und der Elektronenmediator fixiert werden sollen, enthält die Reaktionsschicht bevorzugt das hydrophile Polymer.
In den oben genannten Beispielen wurden spezifische Elektrodensysteme gezeigt, aber die vorliegende Erfindung ist im Hinblick auf die Form der Elektrode und die Lage der Elektroden und Zuführungen nicht auf diese Elektrodensysteme beschränkt.
Wenngleich in den oben genannten Beispielen Kohlenstoff als Material für die dritte Elektrode verwendet wurde, ist die vorliegende Erfindung nicht auf eine Kohlenstoffelektrode beschränkt, und es können auch Elektroden verwendet werden, die aus anderem leitenden Material hergestellt sind, oder eine Silber/Silverchloridelektrode.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Wie oben diskutiert ermöglicht die vorliegende Erfindung die Substratbestimmung mit hoher Zuverlässigkeit.

Claims

Verfahren zur Bestimmung der Konzentration eines Substrats in einer Probenlösung unter Verwendung eines Biosensors, umfassend eine elektrisch isolierende Basisplatte, ein Elektrodensystem mit einer Arbeitselektrode, einer Gegenelektrode und einer dritten Elektrode, die als Störsubstanzdetektionselektrode verwendet wird, wobei jede an der Basisplatte ausgebildet ist, und eine Reaktionsschicht, die mindestens eine Oxidoreduktase und einen Elektronenmediator enthält und auf dem Elektrodensystem unter Aussparung der dritten Elektrode gebildet ist, wobei der Elektronenmediator durch die erzeugten Elektronen bei einer Reaktion zwischen dem in der Probenlösung enthaltenen Substrat und der Oxidoreduktase reduziert wird, um eine reduzierte Menge des Elektronenmediators elektrochemisch zu messen, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass es umfasst: (a) einen Schritt zum Anlegen einer Spannung zwischen der Gegenelektrode und der dritten Elektrode; (b) einen Schritt zum Heranführen der Probenlösung an die Reaktionsschicht; (c) einen Schritt zur Detektion einer elektrischen Änderung zwischen der Gegenelektrode und der dritten Elektrode in Folge des Heranführens der Probenlösung an die Reaktionsschicht; (d) einen Schritt zum Messen eines Stroms, der zwischen der Gegenelektrode und der dritten Elektrode nach dem Detektionsschritt (c) fließt; (e) einen Schritt zum Entfernen der Spannung zwischen der Gegenelektrode und der dritten Elektrode nach dem Messschritt (d); (f) einen Schritt zum Anlegen einer Spannung zwischen der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode; und (g) einen Schritt zum nachfolgenden Messen eines Stroms, der zwischen der Gegenelektrode und der Arbeitselektrode fließt.
Verfahren zum Bestimmen eines Substrats nach Anspruch 1, wobei der Schritt (f) auch eine Spannung zwischen der Arbeitselektrode und der dritten Elektrode anlegt.
Verfahren zum Bestimmen der Konzentration eines Substrats in einer Probenlösung unter Verwendung eines Biosensors, umfassend eine elektrisch isolierende Basisplatte, ein Elektrodensystem mit einer Arbeitselektrode, einer Gegenelektrode und einer dritten Elektrode, die als Störsubstanzdetektionselektrode verwendet wird, wobei jede an der Basisplatte ausgebildet ist, eine Reaktionsschicht, die mindestens eine Oxidoreduktase und einen Elektronenmediator enthält und an dem Elektrodensystem unter Aussparung der dritten Elektrode ausgebildet ist, und ein Abdeckelement, das einen Probenlösungszufuhrpfad bildet, um eine Probenlösung von einem Probenlösungszufuhreinlass in die Reaktionsschicht auf der Basisplatte einzuleiten, wobei die dritte Elektrode stromauf des Probenlösungszufuhrpfads ausgehend von der Reaktionsschicht angeordnet ist, wobei der Elektronenmediator durch die erzeugten Elektronen bei einer Reaktion zwischen den in der Probenlösung enthaltenen Substrat und der Oxidoreduktase reduziert wird, um eine reduzierte Menge des Elektronenmediators elektrochemisch zu messen, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass es umfasst: (a) einen Schritt zum Anlegen einer Spannung zwischen der Gegenelektrode und der dritten Elektrode; (b) einen Schritt zum Zuführen der Probenlösung zu der Reaktionsschicht; (c) einen Schritt zum Detektieren einer elektrischen Änderung zwischen der Gegenelektrode und der dritten Elektrode in Folge des Zuführens der Probenlösung zu der Reaktionsschicht; (d) einen Schritt zum Messen eines Stroms, der zwischen der Gegenelektrode und der dritten Elektrode nach dem Detektionsschritt (c) fließt; (e) einen Schritt zum Entfernen der Spannung zwischen der Gegenelektrode und der dritten Elektrode nach dem Messschritt (d); (f) einen Schritt zum Anlegen einer Spannung zwischen der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode; und (g) einen Schritt zum nachfolgenden Messen eines Stroms, der zwischen der Gegenelektrode und der Arbeitselektrode fließt.
Verfahren zum Bestimmen eines Substrats nach Anspruch 3, wobei der Schritt (f) auch eine Spannung zwischen der Arbeitselektrode und der dritten Elektrode anlegt.
Verfahren zum Bestimmen eines Substrats nach Anspruch 3, wobei ein Biosensor verwendet wird, der mit einer im Wesentlichen aus Lecithin bestehenden Schicht auf einer freiliegenden Fläche des Probenlösungszufuhrpfads angeordnet ist.
Verfahren zum Bestimmen eines Substrats nach Anspruch 1, wobei ein Biosensor verwendet wird, der des Weiteren ein hydrophiles Polymer in der Reaktionsschicht enthält.
Verfahren zum Bestimmen eines Substrats nach Anspruch 3, wobei ein Biosensor verwendet wird, der des Weiteren ein hydrophiles Polymer in der Reaktionsschicht enthält.