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Hintergrund der Erfindung
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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft isolierte Polypeptide mit Lysophospholipase-Aktivität und isolierte Nukleinsäuresequenzen,
die die Polypeptide codieren. Die Erfindung betrifft auch Nukleinsäure-Konstrukte, Vektoren
und Wirtszellen, die die Nukleinsäuresequenzen umfassen, sowie
Verfahren zur Herstellung und Verwendung der Polypeptide.
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Beschreibung der verwandten
Technik
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Phospholipasen
sind Enzyme, die an der Hydrolyse von Phospholipiden teilnehmen,
die aus einer Glycerinhauptkette mit zwei Fettsäuren in einer äußeren (sn-1)
Position und der mittleren (sn-2) Position bestehen und mit Phosphorsäure in der
dritten Position verestert sind. Die Phosphorsäure kann wiederum mit einem Aminoalkohol
verestert sein.
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Es
können
mehrere Phospholipaseaktivitätstypen,
die die Fettsäureacyl-Gruppierungen
hydrolysieren, unterschieden werden. Die Phospholipase A1 und die
Phospholipase A2 katalysieren die Deacylierung einer Fettsäureacylgruppe
in der sn-1- bzw. sn-2-Position eines Diacylglycerophospholipids
unter Herstellung von Lysophospholipid. Lysophospholipase (von der
Nomenklatur-Komission der International Union of Biochemistry on
the Nomenclature and Classifikation of Enzymes {Enzyme Nomenclature,
Academic Press, New York, 1992} auch Phospholipase B genannt) katalysiert
die Hydrolyse der restlichen Fettsäureacylgruppe in einem Lysophospholipid.
Eine Phospholipase B, die die Deacylierung beider Fettsäuren aus
einem Diacylglycerophospholipid katalysiert und von Natur aus Lysophospholipase-Aktivität besitzt,
wurde aus Penicillium notatum beschrieben (Saito et al., 1991, Methods
in Enrymology 197:446–456).
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Pilzenzyme
mit Phospholipaseaktivität
wurden aus verschiedenen Quellen beschrieben, einschließlich Cryptococcus
neoformans (Chen et al., Infection and Immunity 65:405–411), Fusobacterium
necrophorum (Fifis et al., 1996, Veterinary Microbiology 49:219–233), Penicillium
notatum (auch bekannt als Penicillium chrysogenum; Kawasaki, 1975,
Journal of Biochemistry 77:1233–1244;
Masuda et al., 1991, European Journal of Biochemistry 202:783–787), Penicillium
cyclopium (Mustranta et al., 1995, Process Biochemistry 30:393–401), Saccharomyces
cerevisia (Ichimasa et al., 1985, Agric. Biol. Chem. 49:1083–1089; Paultauf
et al., 1994, Journal of Biological Chemistry 269:19725–19730),
Torulaspora delbrueckii (alter Name: Saccharomyces rosei, Kuwabara,
1988, Agric. Biol. Chem. 52:2451–2458; Watanabe et al., 1994,
FEMS Microbiological Letters 124:29–34), Schizosaccharomyces pombe
(Oishi et al., 1996, Biosci. Biotech. Biochem. 60:1087–1092),
Neurospora crassa (Chakravarti et al., 1981, Archives of Biochemistry
and Biophysics 206:393–402).
Aspergillus niger (Technical Bulletin, G-zymeTM G6999,
Enzyme Bio-Systems
Ltd.; Mustranta et al., 1995, supra), Corticium centrifugum (Uebara
et al., 1979, Agric. Biol. Chem. 43:517–525), Fusarium oxysporum (WO
98/26057) und Fusarium solani (Tsung-Che et al., 1968, Phytopathological
Notes 58:1437–38).
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Pilzphospholipase-Gene
wurden aus mehreren Quellen kloniert, einschließlich Penicillium notatum (Masuda
et al., 1991, supra), Torulaspora delbrueckii (Watanabe et al.,1994,
FEMS Microbiology Letters 124:29–34), Saccharomyces cerevisiae
(Lee et al., 1994, Journal of Biological Chemistry 269:19725–19730), Apergillus
(
JP 10155493 ), Neurospora
crassa (EMBL 042791) und Schizosaccharomyces pombe (EMBL 013857).
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Eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, verbesserte Polypeptide
mit Lysophospholipase-Aktivität
und Nukleinsäure,
die die Polypeptide codiert, bereitzustellen.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft isolierte Polypeptide mit Lysophospholipase-Aktivität, ausgewählt aus
der Gruppe, bestehend aus
- (a) einem Polypeptid
mit einer Aminosäuresequenz,
die eine mindestens 65%ige Identität mit den Aminosäuren 38
bis 654 der SEQ ID NO. 2 aufweist;
- (b) einer Allel-Variante von (a); und
- (c) einem Fragment von (a) oder (b), wobei das Fragment Lysophospholipase-Aktivität aufweist.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch isolierte Nukleinsäuresequenzen,
die die Polypeptide codieren und Nukleinsäurekonstrukte, Vektoren und
Wirtszellen, die die Nukleinsäuresequenzen
umfassen, sowie Verfahren zur Herstellung und Verwendung der Polypeptide.
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Kurze Beschreibung
der Figuren
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Die 1A, 1B und 1C zeigen
die cDNA-Sequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz einer Fusarium venenatum-Lysophospholipase
(SEQ ID NOS. 1 bzw. 2).
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2 zeigt
eine Restriktionskarte von pDM 181.
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3 zeigt
eine Restriktionskarte von pSheB 1.
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4 zeigt
eine Restriktionskarte von pRaMB54.
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5 zeigt
das pH-Aktivitätsprofil
einer Fusarium venenatum-Lysophospholipase.
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Die 6A, 6B und 6C zeigen
die cDNA-Sequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz einer Fusarium verticillioides-Lysophospholipase
(SEQ ID NOS. 15 bzw. 16).
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Ausführliche
Beschreibung der Erfindung Polypeptide mit Lysophospholipase-Aktivität
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Der
Begriff "Lysophospholipaseaktivität" ist hier als eine
Carboxylester-Hydrolyseaktivität
definiert, die die Deacylierung von einer oder beiden der Fettsäureacylgruppen
in der sn-1- und
sn-2-Position eines Diacylglycerophospholipids katalysiert. Für die Zwecke
der vorliegenden Erfindung wird die Phospholipaseaktivität durch
Inkubation der Lysophospholipase mit Lysolecithin (oder L-α-Lysophosphatidylcholin)
in Gegenwart von Calciumchlorid bei 37°C, pH 5 oder 7, für 10 min
und Messen der Freisetzung der Fettsäure unter Verwendung eines
beliebigen aus der Technik bekannten Verfahrens, wie der NEFA C-Testsatz
(Wako Chemicals, Richmond, VA), nach den Anweisungen des Herstellers
bestimmt. Eine Lysophospholipase-Aktivitätseinheit ist definiert als
1,0 μmol
freie Fettsäure,
die pro Minute bei 37°C,
pH 5,0 oder pH 7,0, produziert wird.
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Bei
einer ersten Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung isolierte Polypeptide mit einer
Aminosäuresequenz,
die einen Identitätsgrad
mit den Aminosäuren
38 bis 654 der SEQ ID NO. 2 von mindestens etwa 65%, vorzugsweise
von mindestens etwa 70%, stärker
bevorzugt von mindestens etwa 80% und noch stärker bevorzugt von mindestens
etwa 90%, besonders bevorzugt von mindestens etwa 95% und am meisten bevorzugt
von mindestens etwa 97% aufweist, die Lysophospholipase-Aktivität aufweisen
(hier "homologe
Polypeptide"). Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
besitzen die homologen Polypeptide eine Aminosäuresequenz, die sich um 5 Aminosäuren, vorzugsweise
um 4 Aminosäuren,
stärker
bevorzugt um 3 Aminosäuren, noch
stärker
bevorzugt um 2 Aminosäuren
und besonders bevorzugt um 1 Aminosäure von den Aminosäuren 38
bis 654 der SEQ ID NO. 2 oder von den Aminosäuren 17 bis 648 der SEQ ID
NO. 16 unterscheidet. Für
die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird der Identitätsgrad zwischen
zwei Aminosäuresequenzen
durch das Clustal-Verfahren (Higgins, 1989, CABIOS 5:151–153) unter
Verwendung der LASERGENETM MEGALIGNTM-Software (DNASTAR, Inc., Madison, WI)
mit einer Identitätstabelle
und den folgenden multiplen Anordnungsparametern bestimmt: Gap penalty
10 und gap length penalty 10. Die paarweisen Anordnungsparameter lauteten
Ktuple=1, gap penalty=3, windows=5 und diagonals=5.
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Vorzugsweise
umfassen die erfindungsgemäßen Polypeptide
die Aminosäuresequenz
der SEQ ID NO. 2 oder eine Allel-Variante davon; oder ein Fragment
davon mit Lysophospholipase-Aktivität. Bei einer stärker bevorzugten
Ausführungsform
umfasst das erfindungsgemäße Polypeptid
die Aminosäuresequenz
SEQ ID NO. 2. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
umfasst das erfindungsgemäße Polypeptid
die Aminosäuren
38 bis 654 der SEQ ID NO. 2, das das reife Polypeptid der SEQ ID
NO. 2 ist, oder eine Allel-Variante davon oder ein Fragment davon,
wobei das Fragment Lysophospholipase-Aktivität aufweist. Bei einer weiteren
bevorzugten Ausführungsform
umfasst das erfindungsgemäße Polypeptid
die Aminosäuren
38 bis 654 der SEQ ID NO. 2. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
besteht das erfindungsgemäße Polypeptid
aus der Aminosäuresequenz
der SEQ ID NO. 2 oder aus einer Allel-Variante davon oder einem
Fragment davon, wobei das Fragment Lysophospholipase-Aktivität aufweist.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besteht das erfindungsgemäße Polypeptid
aus der Aminosäuresequenz
der SEQ ID NO. 2. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
besteht das Polypeptid aus den Aminosäuren 38 bis 654 der SEQ ID
NO. 2 oder aus einer Allel-Variante davon oder aus einem Fragment
davon, wobei das Fragment Lysophospholipase-Aktivität aufweist.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besteht das Polypeptid aus
den Aminosäuren
38 bis 654 der SEQ ID NO. 2.
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Ein
Fragment der SEQ ID NO. 2 ist ein Polypeptid, bei dem eine oder
mehrere Aminosäuren
aus dem Amino- und/oder Carboxyl-Terminus dieser Aminosäuresequenz
deletiert wurden. Vorzugsweise enthält ein Fragment mindestens
500 Aminosäurereste,
stärker
bevorzugt mindestens 550 Aminosäurereste
und besonders bevorzugt mindestens 600 Aminosäurereste.
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Eine
Allel-Variante bezeichnet zwei oder mehrere beliebige alternative
Formen eines Gens, das den gleichen chromosomalen Lokus einnimmt.
Eine Allel-Variation entsteht natürlicherweise durch Mutation
und kann zu Polymorphismus innerhalb der Populationen führen. Genmutationen
können
still (keine Änderung
in dem codierten Polypeptid) sein oder können Polypeptide mit veränderten
Aminosäuresequenzen
codieren. Eine Allel-Variante
eines Polypeptids ist ein Polypeptid, das von einer Allel-Variante
eines Gens codiert wird.
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Die
Aminosäuresequenzen
der homologen Polypeptide können
sich von der Aminosäuresequenz
der SEQ ID NO. 2 oder dem reifen Polypeptid davon durch eine Insertion
oder Deletion von einer oder mehreren Aminosäureresten und/oder der Substitution
von einer oder mehreren Aminosäureresten
mit unterschiedlichen Aminosäureresten
unterscheiden. Vorzugsweise sind die Aminosäure-Änderungen geringfügig, d.h.
konservative Aminosäure-Substitutionen,
die die Faltung und/oder Aktivität
des Proteins nicht nennenswert beeinflussen; kleine Deletionen,
typischerweise von ein bis etwa 30 Aminosäuren; kleine Amino- oder Carboxyl-terminale
Extensionen, wie ein Amino-terminaler Methionin-Rest; ein kleines
Linkerpeptid von bis zu etwa 20 bis 25 Resten; oder eine kleine
Extension, die die Reinigung durch Änderung der Nettoladung oder
einer anderen Funktion, wie ein Polyhistidintrakt, ein Antigen-Epitop
oder eine Bindungsdomäne,
erleichtert.
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Beispiele
für konservative
Substitutionen liegen in der Gruppe der basischen Aminosäuren (Arginin, Lysin
und Histidin), der sauren Aminosäuren
(Glutaminsäure
und Asparaginsäure),
der polaren Aminosäuren (Glutamin
und Asparagin), der hydrophoben Aminosäuren (Leucin, Isoleucin und
Valin), der aromatischen Aminosäuren
(Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin), und der kurzen Aminosäuren (Glycin,
Alanin, Serin, Threonin und Methionin). Aminosäure-Substitutionen, die die
spezifische Aktivität
im Allgemeinen nicht ändern,
sind aus der Technik bekannt und beispielsweise von H. Neurath und
R.L. Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, New York beschrieben.
Die häufigsten
auftretenden Änderungen
sind Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn,
Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val,
Ala/Glu und Asp/Gly sowie diese umgekehrt.
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Die
Nukleinsäuresequenz
der SEQ ID NO. 1 oder SEQ ID NO. 15 oder eine Untersequenz davon
sowie die Aminosäuresequenz
der SEQ ID NO. 2 oder der SEQ ID NO. 16 oder ein Fragment davon
können
zur Konstruktion einer Nukleinsäuresonde
zur Identifizierung und Klonierung einer DNA, die Polypeptide mit
Lysophospholipase-Aktivität
codiert, aus Stämmen
von verschiedenen Gattungen oder Spezies nach aus der Technik bekannten
Verfahren verwendet werden. Insbesondere können solche Sonden zur Hybridisierung
mit der genomischen oder der cDNA der Gattung oder Spezies von Interesse
unter Befolgung von Standard-Southern Blot-Verfahren verwendet werden,
um das entsprechende Gen darin zu identifizieren und zu isolieren.
Solche Sonden können
beträchtlich
kürzer
sein als die Gesamtsequenz, sollten allerdings mindestens 15, vorzugsweise
mindestens 25 und stärker
bevorzugt mindestens 35 Nukleotide lang sein. Längere Sonden können ebenfalls
verwendet werden. Sowohl DNA- als auch RNA-Sonden können verwendet
werden. Typischerweise werden die Sonden zum Nachweis des entsprechenden
Gens markiert (beispielsweise mit 32P, 3H, 35S, Biotin,
oder Avidin).
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
ist die Nukleinsäuresonde
eine Nukleinsäuresequenz,
die das Polypeptid der SEQ ID NO. 2 oder eine Untersequenz davon
codiert. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäuresonde
die SEQ ID NO. 1. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
umfasst die Nukleinsäuresonde
die Nukleotide 214 bis 2061 der SEQ ID NO. 1, die ein reifes Polypeptid
mit Lysophospholipase-Aktivität
codiert. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäuresonde die
Nukleinsäuresequenz,
die in Plasmid pFB0346 enthalten ist, welches in Escherichia coli
NRRL B-30073 enthalten ist, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Polypeptid mit
Lysophospholipase-Aktivität
codiert. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäuresonde
die Nukleinsäuresequenz,
die die codierende Region des reifen Polypeptids codiert, die in
dem Plasmid pFB0346 enthalten ist, welches in Escherichia coli NRRL
B-30073 enthalten ist.
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Für lange
Sonden einer Länge
von mindestens 100 Nukleotiden wird das Trägermaterial schließlich jeweils
dreimal für
15 min unter Verwendung von 2 × SSC,
0,2% SDS, vorzugsweise bei mindestens 45°C (sehr niedrige Stringenz),
stärker
bevorzugt bei mindestens 50°C
(niedrige Stringenz), stärker
bevorzugt bei mindestens 55°C
(mittlere Stringenz), stärker
bevorzugt bei 60°C
(mittel hohe Stringenz), noch stärker
bevorzugt bei mindestens 65°C
(hohe Stringenz) und am stärksten
bevorzugt bei mindestens 70°C
(sehr hohe Stringenz) gewaschen.
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Für kurze
Sonden, die etwa 15 Nukleotide bis etwa 70 Nukleotide lang sind,
sind die Stringenz-Bedingungen definiert als Vorhybridisierung,
Hybridisierung und Waschen nach der Hybridisierung bei 5°C bis 10°C unterhalb
der berechneten Tm unter Verwendung der
Berechnung nach Bolton und McCarthy (1962, Proceedings of the National
Academy of Sciences USA 48:1390) in 0,9 M NaCl, 0,09 M Tris-HCl,
pH 7,6, 6 mM EDTA, 0,5% NP-40,
1X Denhardt-Lösung,
1 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM einbasiges Natriumphosphat, 0,1 mM ATP
und 0,2 mg Hefe-RNA pro ml unter Befolgung der Standard-Southern
Blot-Verfahren.
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Für kurze
Sonden, die etwa 15 Nukleotide bis etwa 70 Nukleotide lang sind,
wird das Trägermaterial einmal
in 6 × SCC
plus 0,1% SDS 15 min gewaschen und jeweils zweimal für 15 min
unter Verwendung von 6 × SSC
bei 5°C
bis 10°C
unterhalb der berechneten Tm gewaschen.
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Bei
einer dritten Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung Varianten des Polypeptids mit
einer Aminosäuresequenz
der SEQ ID NO. 2, umfassend eine Substitution, Deletion und/oder
Insertion von einer oder mehrerer Aminosäuren.
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Die
Aminosäuresequenzen
der Varianten-Polypeptide können
sich von der Aminosäuresequenz
der SEQ ID NO. 2 oder dem reifen Polypeptid davon durch eine Insertion
oder Deletion von einem oder mehreren Aminosäurerest(en) und/oder durch
die Substitution von einem oder mehreren Aminosäurerest(en) durch unterschiedliche
Aminosäurereste
unterscheiden. Vorzugsweise sind die Aminosäure-Änderungen geringfügig, d.h.
konservative Aminosäure-Substitutionen,
die die Faltung und/oder Aktivität
des Proteins nicht wesentlich beeinflussen; kleine Deletionen, typischerweise
von 1 bis etwa 30 Aminosäuren;
kleine Amino- oder Carboxyl-terminale Extensionen, wie ein Amino-terminaler
Methioninrest; ein kleines Linkerpeptid von bis zu etwa 20–25 Resten;
oder eine kleine Extension, die die Reinigung durch Veränderung
der Nettoladung oder einer weiteren Funktion, wie ein Polyhistidintrakt,
ein Antigenepitop oder eine Bindungsdomäne, erleichtert.
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Beispiele
für konservative
Substitutionen liegen innerhalb der Gruppe von basischen Aminosäuren (Arginin,
Lysin und Histidin), sauren Aminosäuren (Glutaminsäure und
Asparaginsäure),
polaren Aminosäuren (Glutamin
und Asparagin), hydrophoben Aminosäuren (Leucin, Isoleucin und
Valin), aromatischen Aminosäuren
(Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin), und kleinen Aminosäuren (Glycin,
Alanin, Serin, Threonin und Methionin). Aminosäure-Substitutionen, die im
Allgemeinen die spezifische Aktivität nicht ändern, sind aus der Technik
bekannt und beispielsweise beschrieben von H. Neurath und R.L. Hill,
1979, In, The Proteins, Academic Press, New York. Die am häufigsten
auftretenden Austausche sind Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly,
Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn,
Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu und Asp/Gly sowie diese umgekehrt.
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Die
erfindungsgemäßen Polypeptide
besitzen mindestens 20%, vorzugsweise mindestens 40%, stärker bevorzugt
mindestens 60%, noch stärker
bevorzugt mindestens 80%, noch stärker bevorzugt mindestens 90%
und besonders bevorzugt mindestens 100% der Lysophospholipase-Aktivität des reifen
Polypeptids der SEQ ID NO. 2.
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Ein
erfindungsgemäßes Polypeptid
kann aus Mikroorganismen einer beliebigen Gattung erhalten werden.
Für die
Zwecke der vorliegenden Erfindung soll der Begriff "erhalten aus", wie hier im Zusammenhang
mit einer gegebenen Quelle verwendet, bedeuten, dass das Polypeptid,
das von der Nukleinsäuresequenz
codiert wird, von der Quelle oder von einer Zelle produziert wird,
in die die Nukleinsäuresequenz
aus der Quelle inseriert wurde. Bei einer bevorzugten Ausführungsform
wird das Polypeptid extrazellulär
sekretiert.
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Ein
erfindungsgemäßes Polypeptid
kann ein bakterielles Polypeptid sein. Beispielsweise kann das Polypeptid
ein Gram-positives bakterielles Polypeptid sein, wie ein Bazillus-Polypeptid, z.B.
ein Bacillus alkalophilus-, Bacillus amyloliquefaciens-, Bacillus
brevis-, Bacillus circulans-, Bacillus coagulans-, Bacillus laurus-, Bacillus
lentus-, Bacillus licheniformis-, Bacillus megaterium-, Bacillus
stearothermophilus-, Bacillus subtilis-, oder ein Bacillus thuringiensis-Polypeptid;
oder ein Streptomyces-Polypeptid, z.B. ein Streptomyces lividans- oder
ein Streptomyces murinus-Polypeptid; oder ein Gramnegatives bakterielles
Polypeptid, z.B. ein E. coli- oder ein Pseudomonas sp.-Polypeptid.
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Ein
erfindungsgemäßes Polypeptid
kann ein Pilz-Polypeptid sein und stärker bevorzugt ein Hefe-Polypeptid
wie ein Candida-, Kluyveromyces-, Pichia-, Saccharomyces-, Schizosaccharomyces-
oder Yarrowia-Polypeptid; oder stärker bevorzugt ein Fadenpilz-Polypeptid, wie ein
Acremonium-, Aspergillus-, Aureobasidium-, Cryptococcus-, Filibasidium-,
Fusarium-, Humicola-, Magnaporthe-, Mucor-, Myceliophthora-, Neocallimastix-,
Neurospora-, Paecilomyces-, Penicallium-, Piromyces-, Schizophyllum-,
Talaromyces-, Thermoascus-, Thielavia-, Tolypocladium-, oder ein
Trichoderma-Polypeptid.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
ist das Polypeptid ein Saccharomyces carlsbergensis-, Saccharomyces
cerevisiae-, Saccharomyces diastaticus-, Saccharomyces douglasii-,
Saccharomyces kluyveri-, Saccharomyces norbensis-, oder ein Saccharomyces
oviformis-Polypeptid.
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Bei
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
ist das Polypeptid ein Aspergillus aculeatus-, Aspergillus awamori-,
Aspergillus foetidus-, Aspergillus japonicus-, Aspergillus nidulans-,
Aspergillus niger-, Aspergillus oryzae-, Humicola insolens-, Humicola
lanuginosa-, Mucor miehei-, Myceliophthora thermophila-, Neurospora
crassa-, Penicillium purpurogenum-, Trichoderma harzianum-, Trichoderma
koningii-, Trichoderma longibrachiatum-, Trichoderma reesei-, oder
ein Trichoderma viride-Polypeptid.
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Bei
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
ist das Polypeptid ein Fusarium bactridioides-, Fusarium cerealis-,
Fusarium crookwellense-, Fusarium culmorum-, Fusarium graminearum-,
Fusarium graminum-, Fusarium heterosporum-, Fusarium negundi-, Fusarium
oxysporum-, Fusarium reticulatum-, Fusarium roseum-, Fusarium sambucinum-,
Fusarium sarcochroum-, Fusarium sporotrichioides-, Fusarium sulphureum-,
Fusarium torulosum-, Fusarium trichothecioides-, Fusarium venenatum-,
oder ein Fusarium verticillioides-Polypeptid.
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Bei
einer stärker
bevorzugten Ausführungsform
ist die Fusarium venenatum-Zelle Fusarium venenatum A3/5, die ursprünglich als
Fusarium graminearum ATCC 20334 hinterlegt und neuerdings neu als
Fusarium venenatum von Yoder und Christianson, 1998, Fungal Genetics
and Biology 23:62–80
und O'Donnell et
al., 1998, Fungal Genetics and Biology 23:57–67 klassifiziert worden ist;
sowie taxonomische Äquivalente
von Fusarium venenatum, ohne Rücksicht
auf den Speziesnamen, unter dem sie derzeit bekannt sind. Bei einer
weiteren bevorzugten Ausführungsform
ist die Fusarium venenatum-Zelle eine morphologische Mutante von
Fusarium venenatum A3/5 oder Fusarium venenatum ATCC 20334, wie
in der WO 97/26330 offenbart.
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Bei
einer stärker
bevorzugten Ausführungsform
ist die Fusarium verticillioides-Zelle Fusarium verticillioides
CBS 650.96.
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Es
ist selbstverständlich,
dass für
die zuvor genannten Spezies die Erfindung sowohl den perfekten als
auch den nicht perfekten Zustand und weitere taxonomische Äquivalente,
z.B. Anamorphe, einschließt, ohne
Rücksicht
auf den Speziesnamen, unter dem sie bekannt sind. Die Fachleute
erkennen leicht die Identität von
entsprechenden Äquivalenten.
Beispielsweise werden taxonomische Äquivalente von Fusarium von
D.L. Hawksworth, P.M. Kirk, B.C. Sutton und D.N. Pegler (Herausgeber),
1995, In Ainsworth & Bisby's Dictionary of the
Fungi, Achte. Ausgabe, CAB International, University Press, Cambridge,
England, Seiten 173–174
definiert.
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Stämme dieser
Spezies sind für
die Öffentlichkeit
leicht aus einer Anzahl von Kultursammlungen erhältlich, wie die American Type
Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen
und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures
(CBS) und Agricultural Research Service Patent Culture Collection,
Northern Regional Research Center (NRRL).
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Außerdem können solche
Polypeptide aus anderen Quellen, einschließlich von Mikroorganismen,
die aus der Natur isoliert wurden (z.B. aus Boden, Kompost, Wasser,
etc.) unter Verwendung der oben erwähnten Sonden identifiziert
und erhalten werden. Techniken zur Isolierung von Mikroorganismen
aus natürlichen
Lebensräumen
sind aus der Technik gut bekannt. Anschließend kann die Nukleinsäuresequenz
durch einfaches Screening einer genomischen oder einer cDNA-Bibliothek
von anderen Mikroorganismen abgeleitet werden. Nachdem eine Nukleinsäuresequenz,
die ein Polypeptid codiert, mit der (den) Sonde(n) nachgewiesen
wurde, kann die Sequenz unter Anwendung von Techniken, die den Fachleuten
bekannt sind (siehe z.B. Sambrook et al., 1989, supra), isoliert
oder kloniert werden.
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Wie
hier definiert, ist ein "isoliertes" Polypeptid ein Polypeptid,
das im Wesentlichen frei von anderen nicht Lysophospholipase-Polypeptiden
ist, z.B. mindestens etwa 20% rein, vorzugsweise mindestens etwa 40%
rein, stärker
bevorzugt etwa 60% rein, noch stärker
bevorzugt etwa 80% rein, besonders bevorzugt etwa 90% rein und sogar
am meisten bevorzugt etwa 95% rein, wie durch SDS-PAGE bestimmt.
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Polypeptide,
die von erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen
codiert wurden, umfassen auch Fusionspolypeptide oder spaltbare
Fusionspolypeptide, bei denen ein weiteres Polypeptid an den N-Terminus oder
den C-Terminus des Polypeptids oder des Fragmentes davon gebunden
ist. Ein Fusionspolypeptid wird durch die Verbindung einer Nukleinsäuresequenz
(oder eines Teils davon), die ein anderes Polypeptid codiert, mit
einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz
(oder eines Teils davon) hergestellt. Techniken zur Herstellung
von Fusionspolypeptiden sind aus der Technik bekannt und umfassen
die Ligation der codierenden Sequenzen, die die Polypeptide codieren,
so dass sie im Raster sind und sich die Expression des fusionierten Polypeptids
unter der Kontrolle desselben (derselben) Promotors (Promotoren)
und derselben Terminationssequenz befindet.
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Nucleinsäuresequenzen
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch isolierte Nukleinsäuresequenzen,
die ein erfindungsgemäßes Polypeptid
codieren. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäuresequenz
in SEQ ID NO. 1 ausgeführt.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäuresequenz
in der SEQ ID NO. 15 ausgeführt.
Bei einer stärker
bevorzugten Ausführungsform
ist die Nukleinsäuresequenz
die Sequenz, die in dem Plasmid pFB0346 enthalten ist, das in Escherichia
coli NRRL B-30073 enthalten ist. Bei einer weiteren stärker bevorzugten
Ausführungsform
ist die Nukleinsäuresequenz
die Sequenz, die in Fusarium verticillioides CBS 650.96 enthalten
ist. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäuresequenz
die Sequenz, die das reife Polypeptid von SEQ ID NO. 1 codiert.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäuresequenz
die Region, die das reife Polypeptid von SEQ ID NO. 15 codiert.
Bei einer weiteren stärker
bevorzugten Ausführungsform
ist die Nukleinsäuresequenz
die Region, die das reife Polypeptid codiert, enthalten in Plasmid
pFB0346, enthalten in Escherichia coli NRRL B-30073. Bei einer weiteren
stärker bevorzugten
Ausführungsform
ist die Nukleinsäuresequenz
die Region, die das reife Polypeptid codiert, enthalten in Fusarium
verticillioides CBS 650.96. Die vorliegende Erfindung umfasst auch
Nukleinsäuresequenzen,
die ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO. 2 oder
SEQ ID NO. 15 oder das reife Polypeptid davon codieren, welches
sich von der SEQ ID NO. 1 bzw. der SEQ ID NO. 15 durch die Degenerierung des
genetischen Codes unterscheiden. Die vorliegende Erfindung betrifft
auch Teilsequenzen von SEQ ID NO. 1 oder SEQ ID NO. 15, die Fragmente
von SEQ ID NO. 2 bzw. SEQ ID NO. 17 codieren, die Lysophospholipase-Aktivität aufweisen.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch mutante Nukleinsäuresequenzen,
die mindestens eine Mutation in der das reife Polypeptid codierenden
Sequenz der SEQ ID NO. 1 umfassen, wobei die mutante Nukleinsäuresequenz
ein Polypeptid codiert, das aus den Aminosäuren 38 bis 654 der SEQ ID
NO. 2 besteht.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch mutante Nukleinsäuresequenzen,
die mindestens eine Mutation in der das reife Polypeptid codierenden
Sequenz der SEQ ID NO. 15 umfassen, wobei die mutante Nukleinsäuresequenz
ein Polypeptid codiert, das aus den Aminosäuren 17 bis 648 der SEQ ID
NO. 16 besteht.
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Die
zur Isolierung oder Klonierung einer Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid
codiert, angewandten Verfahren sind aus der Technik bekannt und
umfassen die Isolierung aus genomischer DNA, die Präparation
aus cDNA oder eine Kombination davon. Das Klonieren der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen aus
solcher genomischer DNA kann z.B. unter Verwendung der gut bekannten
Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder durch Antikörperscreening von Expressionsbibliotheken
durchgeführt
werden, um klonierte DNA-Fragmente zu ermitteln, die sich strukturelle
Merkmale teilen. Siehe z.B. Innis et al., 1990, PCR: A Guide to
Methods and Application, Academic Press, New York. Weitere Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren,
wie Ligase-Kettenreaktion (LCR), ligierte aktivierte Transkription
(LAT) und Amplifikation auf Nukleinsäuresequenz-Basis (NASBA) können verwendet
werden. Die Nukleinsäuresequenz
kann aus einem Stamm von Fusarium oder einem anderen oder verwandten
Organismus kloniert werden und kann somit beispielsweise eine allelische
Spezies oder eine Speziesvariante der Polypeptidcodierenden Region
der Nukleinsäuresequenz sein.
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Der
Begriff "isolierte
Nukleinsäuresequenz", wie hier verwendet,
bezieht sich auf eine Nukleinsäuresequenz,
die im Wesentlichen frei ist von anderen Nukleinsäuresequenzen,
z.B. mindestens etwa 20% rein, vorzugsweise mindestens etwa 40%
rein, stärker
bevorzugt mindestens etwa 60% rein, noch stärker bevorzugt etwa 80% rein
und besonders bevorzugt mindestens etwa 90% rein, wie durch Agarose-Elektrophorese
bestimmt. Beispielsweise kann eine isolierte Nukleinsäuresequenz
durch Standard-Klonierungsverfahren
erhalten werden, die in der Gentechnik zur Relokation der Nukleinsäuresequenz
von ihrer natürlichen
Lokation an eine unterschiedliche Stelle, wo sie reproduziert wird,
angewandt werden. Die Klonierungsverfahren können Exzision und Isolierung
eines gewünschten
Nukleinsäurefragmentes,
das die Nukleinsäuresequenz
einschließt,
die das Polypeptid codiert, Insertion eines Fragmentes in ein Vektormolekül und Einschleusen
des rekombinanten Vektors in eine Wirtszelle, wo mehrere Kopien
oder Klone der Nukleinsäuresequenz
repliziert werden, umfassen. Die Nukleinsäuresequenz kann genomischen
Ursprungs sein, aus cDNA, RNA stammen, halbsynthetischen, synthetischen
Ursprungs sein oder aus jeder Kombination davon stammen.
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Zur
Synthese von dem Polypeptid im Wesentlichen ähnlichen Polypeptiden können Modifikationen
einer Nukleinsäuresequenz,
die ein erfindungsgemäßes Polypeptid
codiert, notwendig sein. Der Begriff "im Wesentlichen ähnlich" zu dem Polypeptid bezieht sich auf
nicht natürlich
vorkommende Formen des Polypeptids. Diese Polypeptide können sich
gentechnisch von dem aus seiner nativen Quelle isolierten Polypeptids
unterscheiden, z.B. Varianten, die sich in der spezifischen Aktivität, Wärmestabilität, dem pH-Optimum
oder dergleichen unterscheiden. Die Sequenzvariante kann auf der
Grundlage der Nukleinsäuresequenz
konstruiert werden, die als Polypeptid-codierender Teil der SEQ
ID NO. 1 dargestellt wird, z.B. eine Teilsequenz davon, und/oder
durch Einbringen von Nukleotid-Substitutionen, die keine andere
Aminosäuresequenz
des Polypeptids entstehen lassen, als die, die von der Nukleinsäuresequenz
codiert wird, aber die der Kodon-Anwendung des
Wirtsorganismus entsprechen, der zur Produktion des Enzyms beabsichtigt
ist, oder durch Einbringen von Nukleotid-Substitutionen, die eine
verschiedene Aminosäuresequenz
entstehen lassen können.
Für eine
allgemeine Beschreibung von Nukleotid-Substitutionen siehe z.B.
Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2:95–107.
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Den
Fachleuten wird klar, dass solche Substitutionen außerhalb
der Regionen vorgenommen werden können, die für die Funktion des Moleküls kritisch
sind und immer noch ein aktives Polypeptid ergeben. Aminosäurereste,
die für
die Aktivität
des Polypeptids essentiell sind, das von der erfindungsgemäßen isolierten Nukleinsäuresequenz
codiert wird, und mit denen darum vorzugsweise keine Substitution
durchgeführt
wird, können
nach aus der Technik bekannten Verfahrensweisen identifiziert werden,
wie ortsgerichtete Mutagenese oder Alanin-Scanning-Mutagenese (siehe
z.B. Cunningham und Wells, 1989, Science 244:1081–1085).
Bei letzterer Technik werden Mutationen an jedem positiv geladenen
Rest im Molekül
eingebracht, und die resultierenden mutierten Moleküle werden
auf Lysophospholipase-Aktivität
getestet, um Aminosäurereste
zu identifizieren, die für
die Aktivität
des Moleküls
kritisch sind. Stellen einer Substrat-Enzym-Wechselwirkung können ebenfalls
durch Analyse der dreidimensionalen Struktur, wie durch solche Techniken,
wie kernmagnetische Resonanz-Analyse,
Kristallographie oder Photoaffinitätsmarkierung (siehe z.B. de
Vos et al., 1992, Science 255:306–312; Smith et al., 1992, Journal
of Molecular Biology 224:899–904;
Wlodaver et al., 1992, FEBS Letters 309:59–64 bestimmt werden.
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Nukleinsäurekonstrukte
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch Nukleinsäurekonstrukte, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz
umfassen, die mit einer oder mehreren Kontrollsequenzen operabel
verknüpft
ist, die die Expression der codierenden Sequenz in einer geeigneten
Wirtszelle unter Bedingungen steuern, die mit den Kontrollsequenzen
kompatibel sind. Die Expression wird so verstanden, dass jeder Schritt
eingeschlossen ist, der an der Produktion des Polypeptids beteiligt
ist, einschließlich,
jedoch nicht beschränkt
auf Transkription, posttranskriptionale Modifikation, Translation,
posttranslationale Modifikation und Sekretion.
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"Nukleinsäurekonstrukt" ist hier als Nukleinsäuremolekül definiert,
entweder einzel- oder doppelsträngig,
das aus einem natürlich
vorkommenden Gen isoliert wurde oder das modifiziert wurde, um Nukleinsäuresegmente
zu enthalten, die auf eine Weise kombiniert und nebeneinander angeordnet
werden, die sonst in der Natur nicht vorkommen würde. Der Begriff Nukleinsäurekonstrukt
ist synonym mit dem Begriff Expressionskassette, wenn das Nukleinsäurekonstrukt
sämtliche
Kontrollsequenzen enthält,
die zur Expression einer erfindungsgemäßen codierenden Sequenz erforderlich
sind. Der Begriff "codierende
Sequenz" ist hier
als ein Teil einer Nukleinsäuresequenz
definiert, die direkt die Aminosäuresequenz
ihres Proteinsprodukts spezifiziert. Die Grenzen der codierenden
Sequenz sind im Allgemeinen durch eine Ribosomen-Bindungsstelle
(Prokaryoten) oder durch das ATG-Startkodon (Eukaryoten), das unmittelbar
stromaufwärts
von dem offenen Leseraster am 5'-Ende
der mRNA angeordnet ist, und durch eine Transkriptions-Terminations-Sequenz,
die unmittelbar stromabwärts
von dem offenen Leseraster am 3'-Ende der mRNA angeordnet
ist, bestimmt. Eine codierende Sequenz kann DNA, cDNA und rekombinante
Nukleinsäuresequenzen
einschließen,
ist jedoch nicht darauf beschränkt.
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Eine
isolierte Nukleinsäuresequenz,
die ein erfindungsgemäßes Polypeptid
codiert, kann auf eine Vielzahl von Wegen manipuliert werden, um
die Expression des Polypeptids zu liefern. Eine Manipulation der
Nukleinsäuresequenz
vor ihrer Insertion in einen Vektor kann je nach Expressionsvektor
erwünscht
oder notwendig sein. Die Techniken zur Modifizierung von Nukleinsäuresequenzen
unter Verwendung von DNA-Rekombinationsverfahren
sind aus der Technik gut bekannt.
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Der
Begriff "Kontrollsequenzen" ist hier so definiert,
dass sämtliche
Komponenten eingeschlossen sind, die zur Expression eines erfindungsgemäßen Polypeptids
notwendig oder zweckmäßig sind.
Jede Kontrollsequenz kann für
die Nukleinsäuresequenz,
die das Polypeptid codiert, nativ oder fremdartig sein. Solche Kontrollsequenzen
umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf einen Leader, eine
Polyadenylierungssequenz, eine Propeptidsequenz, einen Promotor,
eine Signalpeptidsequenz und eine Transkriptions-Terminations-Sequenz. Zumindest umfassen
die Kontrollsequenzen einen Promotor und transkriptionale und translationale Stoppsignale.
Die Kontrollsequenzen können
zum Zweck des Einbringens spezieller Restriktionsstellen, die die
Ligation der Kontrollsequenzen mit der codierenden Region der Nukleinsäuresequenz,
die ein Polypeptid codiert, erleichtern, mit Linkern ausgestattet
sein. Der Begriff "operabel
verknüpft" ist hier als eine
Konfiguration definiert, bei der eine Kontrollsequenz zweckmäßigerweise
an einer Position relativ zu der codierenden Sequenz der DNA-Sequenz angeordnet
ist, so dass die Kontrollsequenz die Expression eines Polypeptids
steuert.
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Die
Kontrollsequenz kann eine entsprechende Promotorsequenz, eine Nukleinsäuresequenz,
die von einer Wirtszelle zur Expression der Nukleinsäuresequenz
erkannt wird, sein. Die Promotorsequenz enthält transkriptionale Kontrollsequenzen,
die die Expression des Polypeptids vermitteln. Der Promotor kann
jede Nukleinsäuresequenz
sein, die eine transkriptionale Aktivität in der Wirtszelle der Wahl
zeigt, einschließlich
von mutierten Promotoren, verkürzten
Promotoren und Hybrid-Promotoren, und kann aus Genen erhalten werden, die
extrazelluläre
oder intrazelluläre
gegenüber
der Wirtszelle entweder homologe oder heterologe Polypeptide codieren.
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Beispiele
für geeignete
Promotoren zum Steuern der Transkription der erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte,
insbesondere in einer bakteriellen Wirtszelle, sind die Promotoren,
die erhalten werden aus dem E. coli-lac-Operon, dem Streptomyces
coelicolor-Agarosegen (dagA), dem Bacillus subtilis-Levansucrasegen
(sacB), dem Bacillus licheniformis-Alpha-Amylasegen (amyL), dem
Bacillus stearothermophilusmaltogenen Amylasegen (amyM), dem Bacillus
amyloliquefaciens-Alpha-Amylasegen (amyQ), dem Bacillus licheniformis-Penicillasegen
(penP), dem Bacillus subtilis xylA- und xylB-Genen und dem prokaryotischen
beta-Lactamase-Gen (Villa, Kamaroff et al., 1978, Proceedings of
the National Academy of Sciences USA 75:3727–3731), sowie der tac-Promotor (DeBoer
et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA
80:21–25).
Weitere Promotoren sind beschrieben in "Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American,
1980, 242:74–94;
und in Sambrook et al., 1989, supra.
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Beispiele
für geeignete
Promotoren zur Steuerung der Transkription der erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte
in einer Fadenpilz-Wirtszelle sind Promotoren, die aus den Genen
für Aspergillus
oryzae-TAKA-Amylase, Rhizomucor miehei-Asparaginsäureproteinase,
Aspergillus niger-neutrale alpha-Amylase, Aspergillus niger-säurestabile
alpha-Amylase, Aspergillus niger- oder Aspergillus awamori-Glucoamylase (glaA), Rhizomucor
miehei-Lipase, Aspergillus oryzae-alkalische Protease, Aspergillus
oryzae-Triosephosphatisomerase, Aspergillus nidulans-Acetamidase
und Fusarium oxysporum-trypsinartige Protease (WO 96/00787) erhalten
werden, sowie der NA2-tpi-Promotor (ein Hybrid der Promotoren aus
den Genen für
Aspergillus nigerneutrale alpha-Amylase und Aspergillus oryzae-Triosephosphatisomerase)
und mutierte Promotoren, verkürzte
Promotoren und Hybridpromotoren davon.
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In
einer Hefezelle werden geeignete Promotoren aus den Genen für Saccharomyces
cerevisiae-Enolase (ENO-1), Saccharomyces cerevisiae-Galactokinase
(GAL1), Saccharomyces cerevisiae-Alkoholdehydrogenase/Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase
(ADH2/GAP) und Saccharomyces cerevisiae-3-Phosphoglyceratkinase
erhalten. Weitere geeignete Promotoren für Hefewirtszellen sind von
Romanos et al., 1992, Yeast 8:423–488 beschrieben.
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Die
Kontrollsequenz kann auch eine geeignete Transkriptionsterminatorsequenz,
eine Sequenz, die von einer Wirtszelle zur Terminierung der Transkription
erkannt wird, sein. Die Terminatorsequenz ist mit dem 3'-Terminus der Nukleinsäuresequenz,
die das Polypeptid codiert, operabel verknüpft. Jede Terminatorsequenz,
die in der Wirtszelle der Wahl funktionell ist, kann erfindungsgemäß verwendet
werden.
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Bevorzugte
Terminationssequenzen für
Fadenpilz-Wirtszellen werden aus den Genen für Aspergillus oryzae-7AKA-Amylase,
Aspergillus niger-Glucoamylase, Aspergillus nidulans-Anthranilatsynthase,
Aspergillus niger-alpha-Glucosidase und Fusarium oxysporum-trypsinartige
Protease erhalten.
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Bevorzugte
Terminationssequenzen für
Hefewirtszellen werden aus den Genen für Saccharomyces cerevisiae-Enolase,
Saccharomyces cerevisiae-Cytochrome C (CYC1), und Saccharomyces
cerevisiae-Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase erhalten. Weitere
geeignete Terminationssequenzen für Hefewirtszellen sind bei
Romanos et al., 1992, supra beschrieben.
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Die
Kontrollsequenz kann auch eine geeignete Leadersequenz, eine nicht
translatierte Region einer mRNA, die für die Translation durch die
Wirtszelle wichtig ist, sein. Die Leadersequenz ist mit dem 5'-Terminus der Nukleinsäuresequenz,
die das Polypeptid codiert, operabel verknüpft. Jede Leadersequenz, die
in der Wirtszelle der Wahl funktionell ist, kann erfindungsgemäß verwendet
werden.
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Bevorzugte
Leadersequenzen für
Fadenpilz-Wirtszellen werden aus den Genen für Aspergillus oryzae-TAKA-Amylase
und für
Aspergillus nidulans-Triosephosphatisomerase erhalten.
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Geeignete
Leader für
Hefewirtszellen werden aus den Genen für Saccharomyces cerevisiae-Enolase (ENO-1),
Saccharomyces cerevisiae-3-Phosphoglyceratkinase, Saccharomyces
cerevisiae-alpha-Faktor und Saccharomyces cerevisiae-Alkoholdehydrogenase/Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase
(ADH2/GAP) erhalten.
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Die
Kontrollsequenz kann auch eine Polyadenylierungssequenz, eine Sequenz,
die mit dem 3'-Terminus
der Nukleinsäuresequenz
operabel verknüpft
ist und die bei Transkription von der Wirtszelle als Signal zur Addition
von Polyadenosinresten an transkribierte mRNA erkannt wird, sein.
Jede Polyadenylierungssequenz, die in der Wirtszelle der Wahl funktionell
ist, kann erfindungsgemäß verwendet
werden.
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Bevorzugte
Polyadenylierungssequenzen für
Fadenpilz-Wirtszellen werden aus den Genen für Aspergillus oryzae-TAKA-Amylase,
Aspergilus niger-Glucoamylase, Aspergillus nidulans-Anthranilatsynthase,
Fusarium oxysporum-trypsinartige Protease und Aspergillus niger-alpha-Glucosidase
erhalten.
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Geeignete
Polyadenylierungssequenzen für
Hefe-Wirtszellen sind von Guo und Sherman, 1995, Molecular Cellular
Biology 15:5983–5990
beschrieben.
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Die
Kontrollsequenz kann auch eine Signalpeptid-codierende Region sein,
die eine Aminosäuresequenz
codiert, die mit dem Aminoterminus eines Polypeptids verknüpft ist
und das codierte Polypeptid in Richtung des sekretorischen Weges
der Zelle lenkt. Das 5'-Ende der codierenden
Sequenz der Nukleinsäuresequenz
kann von Natur aus eine Signalpeptid-codierende Region enthalten,
die in dem Translations-Leseraster natürlicherweise mit der Sequenz
der codierenden Region verknüpft
ist, die das sezernierte Polypeptid codiert. Alternativ kann das
5'-Ende der codierenden
Sequenz eine Signalpeptid-codierende Region enthalten, die für die codierende
Sequenz fremdartig ist. Die fremdartige Signalpeptid-codierende
Region kann erforderlich sein, wo die codierende Sequenz nicht von
Natur aus eine Signalpeptid-codierende Region enthält. Alternativ
kann die fremdartige Signalpeptid-codierende Region einfach die
natürliche
Signalpeptidcodierende Region ersetzten, um die Sekretion des Polypeptids
zu verstärken.
Allerdings kann jede Signalpeptid-codierende Region, die das exprimierte
Polypeptid in Richtung des sekretorischen Weges einer Wirtszelle
der Wahl lenkt, erfindungsgemäß verwendet
werden.
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Wirksame
Signalpeptid-codierende Regionen für bakterielle Wirtszellen sind
die Signalpeptid-codierenden Regionen, die aus den Genen für Bacillus
NCIB 11837 maltogene Amylase, Bacillus stearothermophilus-alpha-Amylase,
Bacillus licheniformis-Subtilisin,
Bacillus licheniformis-Beta-Lactamase, Bacillus stearothermophilus-neutrale
Protease (nprT, nprS, nprM) und Bacillus subtilis prsA erhalten
werden. Weitere Signalpeptide sind von Simonen und Palva, 1993,
Microbiological Reviews 57:109–137
beschrieben.
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Wirksame
Signalpeptid-codierende Regionen für Fadenpilz-Wirtszellen sind
die Signalpeptid-codierenden Regionen, die aus den Genen für Aspergillus
oryzae-TAKA-Amylase,
Aspergillus niger-Neutralamylase, Aspergillus niger-Glucoamylase,
Rhizomucor miehei-Asparaginsäureproteinase,
Humicola insolens-Cellulase und Humicola lanuginosa-Lipase erhalten werden.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst die Signalpeptid-codierende Region die Nukleotide 100 bis
150 der SEQ ID NO. 1, die die Aminosäuren 1 bis 17 der SEQ ID NO.
2 codiert.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst die Signalpeptid-codierende Region die Nukleotide 1 bis
48 der SEQ ID NO. 15, die die Aminosäuren 1 bis 16 der SEQ ID NO.
16 codiert.
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Geeignete
Signalpeptide für
Hefe-Wirtszellen werden aus den Genen für den Saccharomyces cerevisiae-alpha-Faktor
und für
Saccharomyces cerevisiae-Invertase erhalten. Weitere geeignete Signalpeptid-codierende
Regionen sind von Romanos et al., 1992, supra beschrieben.
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Die
Kontrollsequenz kann auch eine Polypeptid-codierende Region sein,
die eine Aminosäuresequenz codiert,
die am Aminoterminus eines Polypeptids angeordnet ist. Das resultierende
Polypeptid ist als Proenzym oder Propolypeptid (oder als Zymogen
in einigen Fällen)
bekannt. Im Allgemeinen ist ein Propolypeptid inaktiv und kann durch
katalytische oder autokatalytische Abspaltung des Propeptids von
dem Propolypeptid in ein reifes aktives Polypeptid umgewandelt werden.
Die Propeptid-codierende Region kann aus den Genen für Bacillus
subtilis-alkalische Protease (aprE), Bacillus subtilis-neutrale
Protease (nprT), Saccharomyces cerevisiae-alpha-Faktor, Rhizomucor
miehei-Asparaginsäureproteinase
und Myceliophthora thermophila-Laccase (WO 95/33836) erhalten werden.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst die Propeptid-codierende Region die Nukleotide 151 bis 213
der SEQ ID NO. 1, die die Aminosäuren
18 bis 37 der SEQ ID NO. 2 codiert.
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Wo
am Aminoterminus eines Polypeptids sowohl Signalpeptid- als auch
Propeptidregionen vorhanden sind, ist die Propeptidregion neben
dem Aminoterminus eines Polypeptids angeordnet, und die Signalpeptidregion
ist neben dem Aminoterminus der Propeptidregion angeordnet.
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Es
kann auch wünschenswert
sein, regulatorische Sequenzen hinzuzufügen, die die Regulation der Expression
des Polypeptids relativ zu dem Wachstum der Wirtszelle ermöglicht.
Beispiele für
regulatorische Systeme sind diejenigen, die dazu führen, dass
die Expression des Gens als Reaktion auf ein chemisches oder physikalisches
Stimulans, einschließlich
der Gegenwart einer regulatorischen Verbindung, ein- oder ausgeschaltet
wird. Regulatorische Systeme in prokaryotischen Systemen umfassen
die lac-, tac-, und trp-Operatorsysteme. In Hefe kann das ADH2-System
oder das GAL1-System verwendet werden. In Fadenpilzen können der
TAKA-alpha-Amylasepromotor, der Aspergillus niger-Glucoamylasepromotor
und der Aspergillus oryzae-Glucoamylasepromotor als regulatorische
Sequenzen verwendet werden. Weitere Beispiele für regulatorische Sequenzen
sind diejenigen, die die Genamplifikation ermöglichen. In eukaryotischen
Systemen umfassen diese das Dihydrofolatreduktase-Gen, das in Gegenwart
von Methotrexat amplifiziert wird, und die Metallothionein-Gene,
die mit Schwermetallen amplifiziert werden. In diesen Fällen würde die
Nukleinsäuresequenz, die
das Polypeptid codiert, mit der regulatorischen Sequenz operabel
verknüpft
sein.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch Nukleinsäurekonstrukte zur Änderung
der Expression eines endogenen Gens, das ein erfindungsgemäßes Polypeptid
codiert. Die Konstrukte können
die minimale Anzahl von Komponenten enthalten, die zur Änderung
der Expression des endogenen Gens notwendig sind. Bei einer Ausführungsform
enthalten die Nukleinsäurekonstrukte
vorzugsweise (a) eine Targetsequenz, (b) eine regulatorische Sequenz,
(c) ein Exon und (d) eine Splice-Donor-Stelle. Beim Einbringen des
Nukleinsäurekonstrukts in
eine Zelle, inseriert sich das Konstrukt durch homologe Rekombination
in das zelluläre
Genom an der endogenen Genstelle. Die Targetsequenz lenkt die Integration
der Elemente (a)–(d)
so in das endogene Gen, dass die Elemente (b)–(d) mit dem endogenen Gen
operabel verknüpft
werden. Bei einer anderen Ausführungsform
enthalten die Nukleinsäurekonstrukte
(a) eine Targetsequenz, (b) eine regulatorische Sequenz, (c) ein
Exon, (d) eine Splice-Donorstelle, (e) ein Intron und (f) eine Splice-Akzeptorstelle,
wobei die Targetsequenz die Integration der Elemente (a)–(f) so
steuert, dass die Elemente (b)–(f)
mit dem endogenen Gen operabel verknüpft werden. Allerdings können die
Konstrukte zusätzliche
Komponenten, wie selektierbare Marker, enthalten.
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Bei
beiden Ausführungsformen
führt das
Einbringen dieser Komponenten zur Produktion einer neuen Transkriptionseinheit,
in der die Expression des endogenen Gens verändert ist. Zusammengefasst
ist die neue Transkriptionseinheit ein Fusionsprodukt aus den Sequenzen,
die durch die Targetkonstrukte und das endogene Gen eingebracht
wurden. Bei einer Ausführungsform,
bei der das endogene Gen verändert
ist, ist das Gen aktiviert. Bei dieser Ausführungsform wird die homologe
Rekombination zum Ersatz, zur Unterbrechung oder zur Behinderung
der regulatorischen Region verwendet, die normalerweise mit dem
endogenen Gen einer Elternzelle durch die Insertion einer regulatorischen
Sequenz assoziiert ist, die das Gen offensichtlich zur Expression
zu höheren
Niveaus veranlasst als in der entsprechenden Elternzelle. Weiterhin
kann das aktivierte Gen durch den Einschluss eines amplifizierbaren
selektierbaren Markergens in dem Konstrukt unter Anwendung von aus
der Technik gut bekannten Verfahren amplifiziert werden (siehe beispielsweise
US-Patentschrift Nr. 5,641,670). Bei einer weiteren Ausführungsform,
bei der das endogene Gen verändert
ist, ist die Expression des Gens reduziert.
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Die
Targetsequenz kann innerhalb des endogenen Gens, unmittelbar neben
dem Gen, innerhalb eines Gens stromaufwärts oder stromabwärts von
und mit Abstand von dem endogenen Gen vorhanden sein. Eine oder
mehrere Targetsequenzen können
verwendet werden. Beispielsweise verwendet ein zirkuläres Plasmid- oder
DNA-Fragment vorzugsweise eine einzige Targetsequenz, während ein
lineares Plasmid oder ein lineares DNA-Fragment vorzugsweise zwei
Targetsequenzen einsetzt.
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Die
regulatorische Sequenz des Konstrukts kann aus einem oder mehreren
Promotoren, Enhancern, Scaffold-Verknüpfungsregionen oder Matrix-Verknüpfungsstellen,
negativen regulatorischen Elementen, Transkriptionsbindungsstellen
oder aus Kombinationen dieser Sequenzen bestehen.
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Weiterhin
enthalten die Konstrukte ein oder mehrere Exons des endogenen Gens.
Ein Exon ist als DNA-Sequenz definiert, die in RNA kopiert wird
und in einem reifen mRNA-Molekül vorhanden
ist, derart, dass sich die Exonsequenz im Raster mit der codierenden
Region des endogenen Gens befindet. Gegebenenfalls kann das Exon
DNA enthalten, die eine oder mehrere Aminosäuren und/oder teilweise eine
Aminosäure
codiert. Alternativ enthält
das Exon DNA, die einer 5'-nicht
codierenden Region entspricht. Wo das exogene Exon oder die exogenen
Exons eine oder mehrere Aminosäuren
und/oder einen Teil einer Aminosäure
codieren, ist das Nukleinsäurekonstrukt
so aufgebaut, dass sich das Leseraster bei Transkription und beim
Splicen mit der codierenden Region des endogenen Gens im Raster
befindet, so dass der entsprechende Leserahmen des Teils der mRNA,
die sich von dem zweiten Exon ableitet, unverändert bleibt.
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Die
Splice-Donor-Stelle der Konstrukte steuert das Splicing von einem
Exon zu einem anderen Exon. Typischerweise liegt das erste Exon
5' zu dem zweiten
Exon, und die Splice-Donor-Stelle, die das erste Exon an seiner
3'-Seite überlappt
und flankiert, erkennt eine Splice-Akzeptor-Stelle, die das zweite
Exon an der 5'-Seite
des zweiten Exons flankiert. Eine Splice-Akzeptor-Stelle, sowie
eine Splice-Donor-Stelle ist eine Sequenz, die das Splicing von
einem Exon zu einem anderen Exon steuert. Durch Wirken in Verbindung
mit einer Splice-Donor-Stelle verwendet der Splicing-Apparat eine
Splice-Akzeptorstelle, um die Entfernung eines Introns herbeizuführen.
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Expressionsvektoren
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch rekombinante Expressionsvektoren,
die eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz,
einen Promotor und transkriptionale und translationale Stoppsignale
umfassen. Die verschiedenen Nukleinsäure- und Kontrollsequenzen,
die vorstehend beschrieben sind, können miteinander verknüpft werden,
um einen rekombinanten Expressionsvektor herzustellen, der eine
oder mehrere zweckmäßige Restriktionsstellen
einschließen
kann, um die Insertion oder Substitution der Nukleinsäuresequenz,
die das Polypeptid codiert, an solchen Stellen zu ermöglichen.
Alternativ kann die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz durch Insertion
der Nukleinsäuresequenz
oder eines Nukleinsäureskonstrukts,
das die Sequenz umfasst, in einen zur Expression geeigneten Vektor
exprimiert werden. Durch die Erzeugung des Expressionsvektors wird
die codierende Sequenz in dem Vektor so angeordnet, dass die codierende
Sequenz mit den entsprechenden Kontrollsequenzen zur Expression
operabel verknüpft
ist.
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Der
rekombinante Expressionvektor kann jeder beliebige Vektor sein (z.B.
ein Plasmid oder ein Virus), mit dem DNA-Rekombinationsverfahren
zweckmäßigerweise
durchgeführt
werden können
und der die Expression der Nukleinsäuresequenz zustande bringen
kann. Die Wahl des Vektors hängt
typischerweise von der Kompatibilität des Vektors mit der Wirtszelle
ab, in die der Vektor einzubringen ist. Die Vektoren können lineare oder
geschlossene zirkuläre
Plasmide sein.
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Der
Vektor kann ein autonom replizierender Vektor sein, d.h. ein Vektor,
der als extrachromosomale Einheit existiert, dessen Replikation
unabhängig
von der chromosomalen Replikation ist, z.B. ein Plasmid, ein extrachromosomales
Element, ein Minichromosom oder ein künstliches Chromosom. Der Vektor
kann ein beliebiges Mittel zur Sicherstellung der Selbstreplikation
enthalten. Alternativ kann der Vektor ein Vektor sein, der beim
Einbringen in die Wirtszelle in das Genom integriert und zusammen
mit dem (den) Chromosom(en), in die er integriert worden ist, repliziert
wird. Außerdem
können
ein einziger Vektor oder Plasmid oder zwei oder mehrere Vektoren
oder Plasmide, die zusammen die in das Genom der Wirtszelle einzubringende
Gesamt-DNA enthalten, oder ein Transposon verwendet werden.
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Die
erfindungsgemäßen Vektoren
enthalten vorzugsweise einen oder mehrere selektierbare Marker, die
die leichte Selektion von transformierten Zellen ermöglichen.
Ein selektierbarer Marker ist ein Gen, dessen Produkt biozide oder
virale Resistenz, Resistenz gegenüber Schwermetallen, Prototrophie
gegenüber
Auxotrophen und dergleichen bereitstellt. Beispiele für bakterielle
selektierbare Marker sind die dal-Gene von Bacillus subtilis oder
Bacillus licheniformis oder Marker, die Antibiotikum-Resistenz,
wie Ampicillin-, Kanamycin-, Chloramphenicol- oder Tetracylin-Resistenz, übertragen.
Geeignete Marker für
Hefe-Wirtszellen sind ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 und URA3.
Selektierbare Marker zur Verwendung in einer Fadenpilz-Wirtszelle
umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf amdS (Acetamidase),
argB (Ornithincarbamoyltransferase), bar (Phosphinothricinacetyltransferase),
hph (Hygromycinphosphotransferase), niaD (Nitratreductase), pyrG (Orotidin-5'-phosphatdecarboxylase), sC (Sulfatadenyltransferase)
und trpC (Anthranilatsynthase) sowie Äquivalente davon. Bevorzugt
zur Verwendung in einer Aspergillus-Zelle sind die amdS- und pyrG-Gene
von Aspergillus nidulans oder Aspergillus oryzae und das bar-Gen
von Streptomyces hygroscopicus.
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Vorzugsweise
enthalten die erfindungsgemäßen Vektoren
ein Element (Elemente), welches die stabile Integration des Vektors
in das Wirtszellengenom oder die autonome Replikation des Vektors
in der Zelle unabhängig
von dem Genom der Zelle gestattet.
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Zur
Integration in das Wirtszellengenom kann der Vektor auf die Nukleinsäuresequenz,
die das Polypeptid codiert oder jedes andere beliebige Element des
Vektors zur stabilen Integration des Vektors in das Genom durch
homologe oder nicht homologe Rekombination zurückgreifen. Alternativ kann
der Vektor zusätzliche
Nukleinsäuresequenzen
zum Lenken der Integration durch homologe Rekombination in das Genom
der Wirtszelle enthalten. Die zusätzlichen Nukleinsäuresequenzen
befähigen
den Vektor, in das Wirtszellengenom an einer exakten Stelle (an
exakten Stellen) in dem (den) Chromosomen) integriert zu werden.
Zur Erhöhung der
Wahrscheinlichkeit der Integration an einer bestimmten Stelle sollten
die Integrationselemente vorzugsweise eine ausreichende Anzahl von
Nukleinsäuren,
wie 100 bis 10000 Basenpaare, vorzugsweise 400 bis 10000 Basenpaare
und besonders bevorzugt 800 bis 10000 Basenpaare enthalten, die
mit der entsprechenden Targetsequenz stark homolog sind, um die
Wahrscheinlichkeit einer homologen Rekombination zu erhöhen. Die Integrationselemente
können
eine beliebige Sequenz sein, die mit der Targetsequenz in dem Genom
der Wirtszelle homolog ist. Außerdem
können
die Integrationselemente nicht codierende oder codierende Nukleinsäuresequenzen
sein. Andererseits kann der Vektor in das Genom der Wirtszelle durch
nichthomologe Rekombination integriert werden.
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Zur
autonomen Replikation kann der Vektor außerdem einen Replikationsursprung
umfassen, der den Vektor zur autonomen Replikation in der in Frage
kommenden Wirtszelle befähigt.
Beispiele für
bakterielle Replikationsursprünge
sind Replikationsursprünge
von Plasmiden pBR322, pUC19, pACYC177, und pACYC184, die die Replikation
in E. coli gestatten und pUB110, pE194, pTA1060, und pAMß1, die
die Replikation in Bacillus gestatten. Beispiele für Replikationsursprünge zur
Verwendung in einer Hefewirtszelle sind die zwei Micron-Replikationsursprünge, ARS1,
ARS4, die Kombination von ARS1 und CEN3 und die Kombination von ARS4
und CEN6. Der Replikationsursprung kann ein Ursprung mit einer Mutation
sein, die sein Temperaturempfindliches Funktionieren in der Wirtszelle
veranlasst (siehe z.B. Ehrlich, 1978, Proceedings of the National Academy
of Sciences USA 75:1433).
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In
die Wirtszelle kann mehr als eine Kopie einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz
inseriert werden, um die Produktion des Genprodukts zu erhöhen. Eine
Erhöhung
der Kopienzahl der Nukleinsäuresequenz
kann durch Integrieren von mindestens einer zusätzlichen Kopie der Sequenz
in das Wirtszellengenom oder durch Einschließen eines amplifizierbaren
selektierbaren Markergens mit der Nukleinsäursequenz erhalten werden,
wobei Zellen, die amplifizierte Kopien des selektierbaren Markergens,
und dadurch zusätzliche Kopien
der Nukleinsäuresequenz,
enthalten, durch Kultivieren der Zellen in Gegenwart des entsprechenden selektierbaren
Mittels selektiert werden können.
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Die
Verfahrensweisen, die zur Ligation der vorstehend beschriebenen
Elemente angewandt werden, um die erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektoren
zu konstruieren, sind dem Fachmann gut bekannt (siehe z.B. Sambrook
et al., 1989, supra).
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Wirtszellen
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft auch rekombinante Wirtszellen, die
eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz
umfassen, die zweckmäßigerweise
bei der rekombinanten Produktion der Polypeptide verwendet werden.
Ein Vektor, der eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz umfasst, wird in
eine Wirtszelle eingebracht, so dass der Vektor als chromosomaler
Integrand oder als selbst replizierender extrachromosomaler Vektor
gehalten wird, wie zuvor beschrieben. Der Begriff "Wirtszelle" umfasst jeden Abkömmling einer Elternzelle,
der auf Grund von während
der Replikation auftretenden Mutationen nicht mit der Elternzelle
identisch ist. Die Wahl einer Wirtszelle hängt zu einem großen Ausmaß von dem
Gen, das das Polypeptid codiert, und von seiner Quelle ab.
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Die
Wirtszelle kann ein einzelliger Mikroorganismus sein, z.B. ein Prokaryot,
oder ein nicht einzelliger Mikroorganismus, z.B. ein Eukaryot, sein.
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Geeignete
einzellige Zellen sind Bakterienzellen, wie Gram-positive Bakterien,
einschließlich
jedoch nicht begrenzt auf eine Bacillus-Zelle, z.B. Bacillus alkalophilus,
Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans,
Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus
lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermiphilus,
Bacillus subtilis und Bacillus thuringiensis; oder eine Streptomyces-Zelle,
z.B. Streptomyces lividans und Streptomyces murinus oder Gramnegative
Bakterien, wie E. coli und Pseudomonas sp. Bei einer bevorzugten
Ausführungsform
ist die bakterielle Wirtszelle eine Bacillus lentus-, Bacillus licheniformis-,
Bacillus stearothermophilus-, oder eine Bacillus subtilis-Zelle.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Bacillus-Zelle
ein alkalophiler Bacillus.
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Das
Einbringen eines Vektors in eine bakterielle Wirtszelle kann beispielsweise
durch Protoplastentransformation (siehe z.B. Chang und Cohen, 1979,
Molecular General Genetics 168:111–115) unter Verwendung kompetenter
Zellen (siehe, z.B. Young und Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology
81:823–829,
oder Dubnau und Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Baology
56:209–221),
Elektroporation (siehe, z.B. Shigekawa und Dower, 1988, Biotechniques
6:742–751)
oder Konjugation (siehe, z.B. Kohler und Thorne, 1987, Journal of
Bacteriology 169:5771–5278)
durchgeführt
werden.
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Die
Wirtszelle kann ein Eukaryot, wie eine Säuger-, Insekten-, Pflanzen-
oder eine Pilzzelle, sein.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
ist die Wirtszelle eine Pilzzelle. "Pilze", wie hier verwendet, umfassen die Phyla
Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota und Zygomycota (wie definiert
von Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, B. Ausgabe,
1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK) sowie
die Oomycota (wie zitiert bei Hawksworth et al., 1995, supra, Seite
171) und sämtliche
mitosporischen Pilze (Hawksworth et al., 1995, supra).
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Bei
einer stärker
bevorzugten Ausführungsform
ist die Pilz-Wirtszelle eine Hefezelle. "Hefe",
wie hier verwendet, umfasst ascosporogene Hefe (Endomycetales),
basidiosporogene Hefe, und Hefe, die den Fungi Imperfecti (Blastomyceten)
angehört.
Da sich die Hefe-Klassifizierung künftig ändern kann, soll für die Zwecke dieser
Erfindung Hefe definiert sein, wie beschrieben in Biology and Activities
of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M. und Davenport, R.R., Hrsg.,
Soc. App. Bacteriol. Symposioum Series No. 9, 1980).
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Bei
einer noch stärker
bevorzugten Ausführungsform
ist die Hefe-Wirtszelle eine Candida-, Hansenula-, Kluyveromyces-,
Pichia-, Saccharomyces-, Schizosaccharomyces- oder Yarrowia-Zelle.
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Bei
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
ist die Hefe-Wirtszelle eine Saccharomyces carlsbergensis-, Saccharomyces
cerevisiae-, Saccharomyces diastaticus-, Saccharomyces douglasii-,
Saccharomyces kluyveri-, Saccharomyces norbensis- oder Saccharomyces
oviformis-Zelle. Bei einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform
ist die Hefe-Wirtszelle eine Kluyveromyces lactis-Zelle. Bei einer
weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Hefe-Wirtszelle
eine Yarrowia lipolytica-Zelle.
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Bei
einer weiteren stärker
bevorzugten Ausführungsform
ist die Pilz-Wirtszelle eine Fadenpilzzelle. "Fadenpilze" umfassen sämtliche Fadenformen der Unterabteilung
Eumycota und Oomycota (wie definiert von Hawksworth et al., 1995,
supra). Die Fadenpilze sind im Allgemeinen durch eine Myzelwand
gekennzeichnet, die aus Chitin, Cellulose, Glucan, Chitosan, Mannan
und anderen komplexen Polysacchariden besteht. Das vegetative Wachstum
erfolgt durch Hyphen-Verlängerung,
und der Kohlenstoff-Katabolismus
ist obligatorisch aerob. Im Gegensatz dazu erfolgt das vegetative
Wachstum bei Hefen, wie Saccharomyces cerevisiaed, durch Knospung
eines einzelligen Thallus, und der Kohlenstoff-Katabolismus kann
fermentativ sein.
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Bei
einer noch stärker
bevorzugten Ausführungsform
ist die Fadenpilz-Wirtszelle eine Zelle einer Spezies von Acremonium,
Aspergillus, Fusarium, Humicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora,
Penicillium, Thielavia, Tolypocladium oder Trichoderma, ist jedoch
nicht darauf beschränkt.
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Bei
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
ist die Fadenpilz-Wirtszelle eine Aspergillus awamori-, Aspergillus
foetidus-, Aspergillus japonicus-, Aspergillus nidulans-, Aspergillus
niger- oder Aspergillus oryzae-Zelle. Bei einer weiteren besonders
bevorzugten Ausführungsform
ist die Fadenpilz-Wirtszelle eine Fusarium bactridioides-, Fusarium
cerealis-, Fusarium crookwellense-, Fusarium culmorum-, Fusarium
graminearum-, Fusarium gramium-, Fusarium heterosporum-, Fusarium
negundi-, Fusarium oxysporum-, Fusarium reticulatum-, Fusarium roseum-,
Fusarium sambucinum-Fusarium
sarcochroum-, Fusarium sporotrichoides-, Fusarium sulphureum-, Fusarium
torulosum-, Fusarium trichothecioides-, Fusarium venenatum- oder
eine Fusarium verticillioides-Zelle. Bei noch einer besonders bevorzugten
Ausführungsform
ist die Fadenpilz-Elternzelle eine Fusarium venenatum (Nirenberg
sp. nov.)-Zelle. Bei einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform
ist die Fadenpilz-Wirtszelle eine Humicola insolens-, Humicola lanuginosa-,
Mucor miehei-, Myceliophthora thermophila-, Neurospora crassa-,
Penicillium purpurogenum-, Thielavia terrestris-, Trichoderma harzianum-,
Trichoderma koningii-, Trichoderma Iongibrachiatum-, Trichoderma
reesei-, oder eine Trichoderma viride-Zelle.
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Pilzzellen
können
durch ein Verfahren transformiert werden, das die Protoplastenbildung,
die Transformation der Protoplasten und die Regenerierung der Zellwand
auf eine an sich bekannte Weise umfasst. Geeignete Verfahrensweisen
zur Transformation von Aspergillus-Wirtszellen sind in
EP 238 023 und bei Yelton et al., 1984,
Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81:1470–1474 beschrieben.
Geeignete Verfahren zur Transformation von Fusarium-Spezies sind
bei Malardier et al., 1989, Gene 78:147–156, und in WO 96/00787 beschrieben.
Hefe kann unter Anwendung der von Becker und Guarante in Abelson,
J.N. und Simon, M.I., Hrsg., Guide to Yeast Genetics and Molecular
Biology, Methods in Enzymology, Bd. 194, Seiten 182–187, Academic
Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology
153:163; und Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy
of Sciences USA 75:1920 beschriebenen Verfahrensweisen transformiert
werden.
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Herstellungsverfahren
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung eines
erfindungsgemäßen Polypeptids
umfassend (a) Kultivieren eines Stamms, der in seiner Wildtypform
in der Lage ist, das Polypeptid zu produzieren, einen Überstand
zu produzieren, der das Polypeptid umfasst; und (b) Gewinnen des
Polypeptids. Vorzugsweise ist der Stamm aus der Gattung Fusarium
und stärker
bevorzugt Fusarium venenatum oder Fusarium verticillioides.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung eines
erfindungsgemäßen Polypeptids
umfassend (a) Kultivieren einer Wirtszelle unter Bedingungen, die
zur Produktion des Polypeptids förderlich
sind und (b) Gewinnen des Polypeptids.
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung eines
erfindungsgemäßen Polypeptids
umfassend (a) Kultivieren einer Wirtszelle unter Bedingungen, die
der Produktion des Polypeptids förderlich
sind, wobei die Wirtszelle eine mutierte Nukleinsäuresequenz
mit mindestens einer Mutation in der das reife Polypeptid codierenden
Region der SEQ ID NO. 1 oder der SEQ ID NO. 15 umfasst, wobei die
mutante Nukleinsäuresequenz
ein Polypeptid codiert, das aus den Aminosäuren 38 bis 654 der SEQ ID
NO. 2 bzw. den Aminosäuren
17 bis 648 der SEQ ID NO. 16 besteht und (b) Gewinnen des Polypeptids.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft außerdem Verfahren zur Herstellung
eines erfindungsgemäßen Polypeptids
umfassend (a) Kultivieren einer homolog rekombinanten Zelle, die,
darin eingebracht, eine neue Transkriptionseinheit aufweist, umfassend
eine regulatorische Sequenz, ein Exon und/oder eine Splice-Donor-Stelle,
die mit einem zweiten Exon einer endogenen Nukleinsäuresequenz,
die das Polypeptid codiert, operabel verknüpft ist, unter Bedingungen,
die der Produktion des Polypeptids förderlich sind, und (b) Gewinnen
des Polypeptids. Die Verfahren beruhen auf der Verwendung der Gen-Aktivierungstechnik
beispielsweise wie in der US-Patentschrift Nr. 5,641,670 beschrieben.
-
Bei
den erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren
werden die Zellen in einem Nährmedium,
das zur Produktion des Polypeptids geeignet ist, unter Anwendung
von aus der Technik bekannten Verfahren kultiviert. Beispielsweise
kann die Zelle durch Schüttelkolbenkultivierung
und durch Fermentation in kleinem oder großem Maßstab (einschließlich kontinuierliche,
Batch-, Fed-Batch- oder Festzustands-Fermentationen) im Labor oder
in Industriefermentern, durchgeführt
in einem geeigneten Medium und unter Bedingungen, die es erlauben,
dass das Polypeptid exprimiert und/oder isoliert wird, kultiviert
werden. Die Kultivierung erfolgt in einem geeigneten Nährmedium,
das Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze umfasst,
unter Anwendung von aus der Technik bekannten Verfahren. Geeignete
Medien sind von kommerziellen Lieferfirmen verfügbar oder können nach veröffentlichten
Zusammensetzungen hergestellt werden (z.B. in den Katalogen der
American Type Culture Collection). Wenn das Polypeptid in das Nährmedium
sezerniert wird, kann das Polypeptid direkt aus dem Medium gewonnen
werden. Wenn das Polypeptid nicht sezerniert wird, kann es aus den
Zell-Lysaten gewonnen werden.
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Die
Polypeptide können
unter Anwendung von aus der Technik bekannten Verfahren, die für die Polypeptide
spezifisch sind, nachgewiesen werden. Die Nachweisverfahren können die
Verwendung spezifischer Antikörper,
die Bildung eines Enzymprodukts oder das Verschwinden eines Enzymsubstrats
umfassen. Beispielsweise kann ein Enzymtest zur Bestimmung der Aktivität des Polypeptids,
wie hier beschrieben, eingesetzt werden.
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Das
resultierende Polypeptid kann durch aus der Technik bekannte Verfahren
gewonnen werden. Beispielsweise kann das Polypeptid aus dem Nährmedium
durch herkömmliche
Verfahrensweisen, einschließlich, jedoch
nicht darauf begrenzt, Zentrifugation, Filtration, Extraktion, Sprühtrocknen,
Eindampfen oder Präzipitation
gewonnen werden.
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Die
erfindungsgemäßen Polypeptide
können
durch eine Vielzahl von aus der Technik bekannten Verfahrensweisen
gereinigt werden, einschließlich,
jedoch nicht begrenzt auf Chromatographie (z.B. Ionenaustauschchromatographie,
Affinitätschromatographie,
hydrophobe Chromatographie, Chromatofokussierung und Größenausschlußchromatographie),
elektrophoretische Verfahrensweisen (z.B. präparative isoelektrische Fokussierung),
differentielle Löslichkeit
(z.B. Ammoniumsulfatfällung),
SDS-PAGE oder Extraktion (siehe z.B. Protein Purification, J.-C.
Janson und Lars Ryden, Hrsg., VCH Publishers, New York, 1989).
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Entfernung
oder Reduktion von Lysophospholipase-Aktivität
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung einer
mutanten Zelle einer Elternzelle, welche das Unterbrechen oder Deletieren
einer Nukleinsäuresequenz,
die das Polypeptid oder eine Kontrollsequenz davon codiert, umfasst,
was zu der mutanten Zelle führt,
die beim Kultivieren unter denselben Bedingungen weniger Polypeptid
produziert als die Elternzelle.
-
Zweckmäßigerweise
kann die Konstruktion von Stämmen
mit reduzierter Lysophospholipase-Aktivität durch Modifikation oder Aktivierung
einer Nukleinsäuresequenz,
die zur Expression des Polypeptids mit Lysophospholipase-Aktivität in der
Zelle notwendig ist, erreicht werden. Die zu modifizierende oder
zu inaktivierende Nukleinsäuresequenz
kann beispielsweise eine Nukleinsäuresequenz, die das Polypeptid
codiert oder einen Teil davon sein, der zum Aufweisen von Phospholipaseaktivität essentiell
ist, oder die Nukleinsäuresequenz
kann eine regulatorische Funktion aufweisen, die zur Expression
des Polypeptids aus der codierenden Sequenz der Nukleinsäuresequenz
erforderlich ist. Ein Beispiel für
eine solche regulatorische oder Kontrollsequenz kann eine Promotorsequenz
oder ein funktioneller Teil davon, d.h. ein Teil, der ausreicht,
um die Expression des Polypeptids zu beeinflussen, sein. Weitere
Kontrollsequenzen zur möglichen
Modifikation sind vorstehend beschrieben.
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Die
Modifikation oder Inaktivierung der Nukleinsäuresequenz kann durchgeführt werden,
indem mit der Zelle eine Mutagenese durchgeführt wird und auf Zellen selektiert
oder gescreent wird, in denen die Fähigkeit, Lysophospholipase
zu produzieren, herabgesetzt wurde. Die Mutagenese, die spezifisch
oder zufällig sein
kann, kann beispielsweise unter Verwendung eines geeigneten physikalischen
oder chemischen mutagenisierenden Mittels, durch Verwendung eines
geeigneten Oligonukleotids oder durch Durchführen einer PCR-generierten Mutagenese
mit der DNA-Sequenz durchgeführt
werden. Außerdem
kann die Mutagenese durch Anwendung jeder Kombination dieser mutagenisierenden
Mittel durchgeführt
werden.
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Beispiele
für ein
physikalisches oder chemisches mutagenisierendes Mittel, das für den vorliegenden Zweck
geeignet ist, umfassen Ultraviolett (UV)-Bestrahlung, Hydroxylamin,
N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin
(MNNG), O-Methylhydroxylamin, Nitrosesäure, Ethylmethansulfonat (M),
Natriumbisulfit, Ameisensäure und
Nukleotid-Analoge.
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Werden
solche Mittel verwendet, wird die Mutagenese typischerweise durch
Inkubieren der zu mutagenisierenden Zelle in Gegenwart des mutagenisierenden
Mittels der Wahl unter geeigneten Bedingungen und Selektieren auf
Zellen, die herabgesetzte Phospholipaseaktivität oder -produktion aufweisen,
durchgeführt.
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Die
Modifikation oder Inaktivierung der Produktion eines erfindungsgemäßen Polypeptids
kann durch Einführen,
Substitution oder Entfernung von einem oder mehreren Nukleotiden
in die Nukleinsäuresequenz, die
das Polypeptid codiert, oder eines regulatorischen Elementes, das
zur Transkription oder Translation davon erforderlich ist, erreicht
werden. Beispielsweise können
Nukleotide inseriert oder entfernt werden, so dass sich der Einbau
eines Stoppkodons, die Entfernung des Startkodons oder eine Änderung
des offenen Leserasters ergibt. Eine solche Modifikation oder Inaktivierung
kann durch ortsgerichtete Mutagenese oder PCR-generierte Mutagenese
nach aus der Technik bekannten Verfahren durchgeführt werden.
Obwohl im Prinzip die Modifikation in vivo durchgeführt werden
kann, d.h. direkt in der Zelle, die die zu modifizierende Nukleinsäuresequenz
exprimiert, ist es bevorzugt, dass die Modifikation in vitro durchgeführt wird,
wie nachstehend beispielhaft erläutert.
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Ein
Beispiel für
einen zweckmäßigen Weg
zur Eliminierung oder Herabsetzung der Produktion durch eine Wirtszelle
der Wahl besteht in dem Gen-Ersatz oder der Gen-Unterbrechnung. Bei dem Gen-Unterbrechnungsverfahren
wird eine Nukleinsäuresequenz,
die dem endogenen Gen oder Genfragment von Interesse entspricht,
in vitro mutagenisiert, um eine fehlerhafte Nukleinsäuresequenz
zu produzieren, die anschließend in
die Wirtszelle transformiert wird, um ein fehlerhaftes Gen zu produzieren.
Durch eine homologe Rekombination ersetzt die fehlerhafte Nukleinsäuresequenz
das endogene Gen oder das endogene Genfragment. Es kann wünschenswert
sein, dass das fehlerhafte Gen oder Genfragment auch einen Marker
codiert, der zur Selektion von Transformanten verwendet werden kann,
in denen das Gen, das das Polypeptid codiert, modifiziert oder zerstört worden
ist.
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Alternativ
kann die Modifikation oder Inaktivierung der Nukleinsäuresequenz
durch etablierte Anti-Sense-Techniken unter Verwendung einer Nukleinsäuresequenz
durchgeführt
werden, die zu der Sequenz, die das Polypeptid codiert, komplementär ist. Insbesondere
kann die Produktion des Polypeptids durch eine Zelle reduziert oder
ausgeschaltet werden, indem eine Nukleotidsequenz eingebracht wird,
die zu der Nukleinsäuresequenz
komplementär
ist, die das Polypeptid codiert, welches in der Zelle transkribiert
werden kann und in der Lage ist, zu der in der Zelle produzierten
mRNA zu hybridisieren. Somit wird unter den Bedingungen, unter denen
sich die komplementäre
Anti-Sense-Nukleotidsequenz zu der Polypeptid-mRNA hybridisieren
lässt,
die Menge an translatiertem Polypeptid reduziert oder beseitigt.
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Es
ist bevorzugt, dass die zu modifizierende Zelle gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren
mikrobiellen Ursprungs ist, beispielsweise ein Pilzstamm, der zur
Produktion von gewünschten
Proteinprodukten, die für
die Zelle entweder homolog oder heterolog sind, geeignet ist.
-
Nach
diesem Aspekt der Erfindung ist die Entfernung von mindestens 60%,
vorzugsweise von mindestens 75%, stärker bevorzugt von mindestens
85%, noch stärker
bevorzugt von mindestens 95% und am stärksten bevorzugt von mindestens
99% der Lysophospholipase-Aktivität möglich. Durch die Anwendung
dieses Verfahrens kann eine vollständige Entfernung der Lysophospholipase-Aktivität erreicht
werden.
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Die
kombinierte pH- und -Temperatur-Behandlung wird vorzugsweise bei
einem pH im Bereich von 6,5 bis 8,0 und bei einer Temperatur im
Bereich von 45 bis 70°C
für einen
ausreichenden Zeitraum durchgeführt, um
den gewünschten
Effekt zu erzielen, wobei typischerweise 30 bis 60 min ausreichen.
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Die
zur Kultivierung und Reinigung des Produkts von Interesse angewandten
Verfahren können
durch aus der Technik bekannte Verfahren durchgeführt werden.
-
Die
erfindungsgemäßen Verfahren
zur Herstellung eines im Wesentlichen Lysophospholipase-freien Produkts
sind von besonderem Interesse bei der Produktion von eukaryotischen
Polypeptiden, insbesondere Pilzproteinen, wie Enzymen. Das Enzym
kann z.B. aus einem amylolytischen Enzym, lipolytischen Enzym, proteolytischem
Enzym, zellulytischen Enzym, Oxidoreduktase oder einem Pflanzenzellwand-abbauenden Enzym
ausgewählt
werden. Beispiele für
solche Enzyme umfassen Aminopeptidase, Amylase, Amyloglucosidase,
Carbohydrase, Carboxypeptidase, Catalase, Cellulase, Chitinase,
Cutinase, Cyclodextringlycosyltransferase, Deoxyribonuclease, Esterase,
Galactosidase, beta-Galactosidase, Glucoamylase, Glucoseoxidase, Glucosidase,
Haloperoxidase, Hemicellulase, Invertase, Isomerase, Laccase, Ligase,
Lipase, Lyase, Mannosidase, Oxidase, pectinolytisches Enzym, Peroxidase,
Phytase, Phenoloxidase, Polyphenoloxidase, proteolytisches Enzym,
Ribonuclease, Transferase, Transglutaminase oder Xylanase. Die Lysophospholipase-Mangelzellen
können
auch zur Expression heterologer Proteine von pharmazeutischem Interesse,
wie Hormone, Wachstumsfaktoren, Rezeptoren und dergleichen, eingesetzt
werden.
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Es
ist selbstverständlich,
dass der Begriff "eukaryotische
Polypeptide" nicht
nur native Polypeptide, sondern auch diejenigen Polypeptide einschließt, z.B.
Enzyme, die durch Aminosäure-Substitutionen,
-Deletionen oder -Additionen oder andere derartige Modifikationen
zur Verstärkung
der Aktivität,
Wärmestabilität, pH-Toleranz
und dergleichen beitragen.
-
Anwendungen
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Verwendung der
Polypeptide mit Lysophospholipase-Aktivität.
-
Die
erfindungsgemäßen Polypeptide
können
bei jeder Anwendung eingesetzt werden, wobei die Hydrolyse der Fettsäure Acylgruppe(n)
eines Phospholipids oder Lysophospholipids, wie Lecithin oder Lysolecithin,
erwünscht
ist. Vorzugsweise werden die erfindungsgemäßen Polypeptide bei einem pH,
der für
die Aktivität
optimal ist, eingesetzt.
-
Ein
erfindungsgemäßes Polypeptid
mit Lysophospholipase-Aktivität
kann zur Degummierung einer wässrigen
Kohlehydratlösung
oder zur Aufschlämmung
zur Verbesserung ihrer Filtrierbarkeit, insbesondere eines Stärkehydrolysats,
insbesondere eines Weizenstärke-Hydrolysats,
welches schwer zu filtrieren ist und trübe Filtrate ergibt, eingesetzt
werden. Die Behandlung kann unter Anwendung von aus der Technik
gut bekannten Verfahren durchgeführt
werden. Siehe beispielsweise
EP
219,269 und
EP 808,903 .
-
Ein
erfindungsgemäßes Polypeptid
mit Lysophospholipase-Aktivität
kann bei einem Verfahren zur Reduzierung des Phospholipid-Gehalts
in einem Speiseöl
durch Behandeln der Öls
mit dem Polypeptid eingesetzt werden, um einen Großteil des
Phospholipids zu hydrolysieren und um eine wässrige Phase, die das hydrolysierte
Phospholipid enthält,
von dem Öl
abzutrennen. Ein solches Verfahren ist auf die Reinigung eines Speiseöls anwendbar,
welches Phospholipid enthält,
z.B. Pflanzenöl,
wie Sojaöl,
Rapssamenöl
und Sonnenblumenöl.
-
Vor
der Lysophospholipase-Behandlung wird das Öl vorzugsweise zur Entfernung
von Schleim (Mucilage) z.B. durch Nassraffinieren, vorbehandelt.
Typischerweise enthält
das Öl
zu Beginn der Behandlung mit der Lysophospholipase 50 bis 250 ppm
Phosphor als Phospholipid, und die Behandlung kann den Phosphorwert
auf unter 5 bis 10 ppm reduzieren.
-
Die
Lysophospholipase-Behandlung wird durch Dispergieren einer wässrigen
Lösung
der Lysophospholipase, vorzugsweise als Tröpfchen mit einem mittleren
Durchmesser unter 10 μm,
durchgeführt.
Die Menge an Wasser beträgt
in Relation zu dem Öl
vorzugsweise 0,5 bis 5 Gew.-%. Ein Emulgator kann gegebenenfalls
zugesetzt werden. Mechanisches Rühren
kann angewandt werden, um die Emulsion zu erhalten.
-
Die
Lysophospholipase-Behandlung kann bei einem pH im Bereich von etwa
1,5 bis etwa 5,0 durchgeführt
werden. Der Prozess-pH kann in dem Bereich von etwa 3,5 bis etwa
5 liegen, um die Enzym-Leistung zu maximieren, oder es kann ein
pH im Bereich von etwa 1,5 bis etwa 3 (z.B. 2–3) angewandt werden, um die alkalische
Hydrolyse der Triglyceride zu unterdrücken (Verseifung). Der pH kann
durch Zugabe von Citronensäure,
eines Citratpuffers oder von Chlorwasserstoffsäure eingestellt werden.
-
Eine
geeignete Temperatur beträgt
vorzugsweise 30 bis 70°C
(insbesondere 30 bis 45°C,
z.B. 35–40°C). Die Reaktionsdauer
beträgt
typischerweise 1–12
h (z.B. 2–6
h). Eine geeignete Enzymdosis beträgt in der Regel 0,1 bis 10
mg pro Liter (z.B. 0,5 bis 5 mg pro Liter).
-
Die
Lysophospholipase-Behandlung kann chargenweise, z.B. in einem Tank
unter Rühren,
oder kontinuierlich, z.B. in einer Serie von Rührtankreaktoren, durchgeführt werden.
-
Auf
die Lysophospholipase-Behandlung folgt die Abtrennung einer wässrigen
Phase und einer Ölphase.
Die Abtrennung kann durch herkömmliche
Mittel, z.B. Zentrifugation, durchgeführt werden. Die wässrige Phase
enthält
Lysophospholipase, und das Enzym kann zur Verbesserung der Wirtschaftlichkeit
des Verfahrens wieder verwendet werden.
-
Die
Behandlung kann unter Anwendung eines der aus der Technik bekannten
Verfahren durchgeführt werden.
Siehe beispielsweise US-Patentschrift Nr. 5,264,367,
EP 654,527 , JP-A 2-153997.
-
Ein
erfindungsgemäßes Polypeptid
mit Lysophospholipase-Aktivität
kann bei der Herstellung von Teig, Brot oder Kuchen verwendet werden.
Die Lysophospholipase wird den Zutaten eines Teigs zugesetzt, welcher geknetet
und gebacken wird, um das Brot unter Verwendung von aus der Technik
gut bekannten Verfahren herzustellen. Siehe beispielsweise US-Patentschrift
Nr. 4,567,046,
EP 426,211 ,
JP-A-60-78529, JP-A 62-111629
und JP-A 63-258528.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung eines
Teigs oder eines Backprodukts, umfassend die Einarbeitung in den
Teig einer wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Polypeptids, welches eine
oder mehrere Eigenschaften des Teigs oder des gebackenen Produkts,
das aus dem Teig erhalten wird, relativ zu einem Teig oder zu einem
Backprodukt, in den das Polypeptid nicht eingearbeitet ist, verbessert.
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Der
Begriff "Einarbeiten
in den Teig" ist
hier als eine Zugabe des Polypeptids mit Lysophospholipase-Aktivität zu dem
Teig aus einer beliebigen Zutat, aus der der Teig hergestellt wird,
und/oder aus einem Gemisch von Teigzutaten, aus denen der Teig hergestellt
wird, definiert. Mit anderen Worten kann die Lysophospholipase in
jedem Schritt der Teigherstellung zugesetzt werden und kann in einem,
zwei oder mehreren Schritten zugesetzt werden. Die Lysophospholipase
wird den Zutaten eines Teigs zugesetzt, der verknetet und gebacken
wird, um das Backprodukt unter Anwendung von aus der Technik gut
bekannten Verfahren herzustellen. Siehe beispielsweise US-Patentschrift Nr.
4,567,046,
EP 426,211 ,
JP-A 60-78529, JP-A 62-111629 und JP-A 63-258528.
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Der
Begriff "wirksame
Menge" wird hier
als eine Menge des Polypeptids mit Lysophospholipase-Aktivität definiert,
die ausreicht, um eine messbare Wirkung auf mindestens eine Eigenschaft
von Interesse des Teigs und/oder des Backprodukts bereitzustellen.
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Der
Begriff "verbesserte
Eigenschaft" ist
hier als jede Eigenschaft eines Teigs und/oder eines aus dem Teig
erhaltenen Produkts, insbesondere eines Backprodukts definiert,
welches durch die Einwirkung der Lysophospholipase-Aktivität relativ
zu einem Teig oder einem Produkt, in den das Polypeptid mit Lysophospholipase-Aktivität nicht
eingearbeitet ist, verbessert ist. Die verbesserte Eigenschaft kann
erhöhte
Festigkeit des Teigs, erhöhte
Elastizität
des Teigs, erhöhte
Stabilität
des Teigs, verminderte Klebrigkeit des Teigs, verbesserte Dehnbarkeit
des Teigs, verbesserte maschinelle Bearbeitbarkeit des Teigs, erhöhtes Volumen
des gebackenen Produkts, verbesserte Krustenstruktur des Backprodukts,
verbesserte Weichheit des gebackenen Produkts, verbessertes Aroma
des gebackenen Produkts und/oder verbesserter Schutz gegen Austrocknen
des Backprodukts einschließen,
ist jedoch aber nicht darauf beschränkt.
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Die
verbesserte Eigenschaft kann durch Vergleich eines Teigs und/oder
eines gebackenen Produkts, das mit und ohne Zugabe eines Polypeptids
mit der erfindungsgemäßen Lysophospholipase-Aktivität nach den erfindungsgemäßen Verfahren
hergestellt worden ist, bestimmt werden. Techniken, die zur Bestimmung
der Verbesserungen, die durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren
erreicht werden, eingesetzt werden können, sind nachstehend in den
Beispielen beschrieben. Die organoleptischen Qualitäten können unter
Anwendung von gut in der Backindustrie etablierten Verfahrensweisen
bewertet werden und können
beispielsweise die Verwendung eines Panels von geübten Geschmackstestern
einschließen.
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Der
Begriff "erhöhte Festigkeit
des Teigs" ist hier
als die Eigenschaft eines Teigs definiert, welcher im Allgemeinen
mehr elastische Eigenschaften aufweist und/oder mehr Arbeitseinsatz
zum Formen in der Form und zum Formen erfordert.
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Der
Begriff "erhöhte Elastizität des Teigs" ist hier als die
Eigenschaft eines Teigs definiert, der eine stärkere Neigung aufweist, seine
ursprüngliche
Form wieder zu gewinnen, nachdem er einer bestimmten physikalischen
Belastung ausgesetzt wurde.
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Der
Begriff "erhöhte Stabilität des Teigs" ist hier als die
Eigenschaft eines Teigs definiert, der gegenüber einem mechanischen Missbrauch
weniger anfällig
ist und somit besser seine Form und sein Volumen beibehält.
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Der
Begriff "verminderte
Klebrigkeit des Teigs" ist
hier als die Eigenschaft eines Teigs definiert, der eine geringere
Neigung zur Haftung an Oberflächen
aufweist, z.B. in der Teigherstellungsmaschine, und entweder empirisch
durch den Bäckereifachmann
bewertet oder durch die Verwendung eines Konsistenzanalysators (z.B.
TAXT2), wie aus der Technik bekannt, gemessen wird.
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Der
Begriff "verbesserte
Dehnbarkeit des Teigs" ist
hier als die Eigenschaft eines Teigs definiert, der ohne zu reißen erhöhter Belastung
oder einem verstärkten
Strecken ausgesetzt werden kann.
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Der
Begriff "verbesserte
maschinelle Bearbeitbarkeit des Teigs" ist hier als die Eigenschaft eines
Teigs definiert, der im Allgemeinen weniger klebrig und/oder fester
und/oder elastischer ist.
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Der
Begriff "erhöhtes Volumen
des Backprodukts" wird
als spezielles Volumen eines gegebenen Laib Brotes (Volumen/Gewicht),
typischerweise bestimmt durch das traditionelle Rapssamen-Verdrängungsverfahren,
gemessen.
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Der
Begriff "verbesserte
Krustenstruktur des gebackenen Produkts" ist hier als die Eigenschaft eines gebackenen
Produkts mit feineren und/oder dünneren
Zellwänden
in der Kruste und/oder mit einer gleichmäßigeren/homogeneren Verteilung der Zellen in der
Kruste definiert und wird in der Regel durch den testenden Bäckereifachmann
empirisch bewertet.
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Der
Begriff "verbesserte
Weichheit des gebackenen Produkts" ist das Gegenteil von "Festigkeit" und ist hier als
die Eigenschaft eines gebackenen Produkts definiert, das leichter
komprimiert wird und entweder durch den testenden Bäckereifachmann
empirisch bewertet oder durch die Verwendung eines Texturanalysators
(z.B. TAXT2), wie aus der Technik bekannt, gemessen wird.
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Der
Begriff "verbessertes
Aroma des gebackenen Produkts" wird
durch ein geübtes
Testpanel bewertet.
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Der
Begriff "verbesserter
Schutz vor Austrocknung des gebackenen Produkts" ist hier als die Eigenschaften eines
gebackenen Produkts definiert, welches eine herabgesetzte Geschwindigkeit
der Verschlechterung der Qualitätsparameter,
z.B. Weichheit und/oder Elastizität, während der Aufbewahrung aufweist.
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Der
Begriff "Teig" ist hier als ein
Gemisch von Mehl und anderen Zutaten, die zum Kneten oder Ausrollen
fest genug sind, definiert. Der Teig kann frisch, gefroren, vorher
freigelegt oder vorgebacken sein. Die Herstellung von gefrorenem
Teig ist von Kulp und Lorenz in Frozen and Refrigerated Doughs and
Batters beschrieben.
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Der
Begriff "gebackenes
Produkt" ist hier
als ein beliebiges Produkt definiert, das aus einem Teig hergestellt
wird, entweder mit einem weichen oder einem knusprigen Charakter.
Beispiele für
gebackene Produkte, gleich ob vom weißen, hellen oder dunklen Typ,
die zweckmäßigerweise
durch die vorliegende Erfindung hergestellt werden können, sind
Brot (insbesondere Weißbrot,
Vollkornbrot oder Roggenbrot), typischerweise in Form von Laiben
oder Rollen, Brot vom französischen
Baguette-Typ, Pasta, Pitabrot, Tortillas, Tacos, Kuchen, Pfannkuchen,
Biskuits, Kekse, Tortenboden, gedämpftes Brot und Knäckebrot
und dergleichen.
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Das
Polypeptid mit Lysophospholipase-Aktivität und/oder zusätzliche
Enzyme, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren zu verwenden
sind, können
in jeder Form vorliegen, die für
die in Frage kommende Verwendung geeignet ist, z.B. in Form eines
trockenen Pulvers, eines agglomerierten Pulvers oder eines Granulats,
insbesondere eines nicht staubenden Granulats, einer Flüssigkeit,
insbesondere einer stabilisierten Flüssigkeit oder eines geschützten Enzyms.
Granulate und agglomerierte Pulver können durch herkömmliche
Verfahren hergestellt werden, z.B. durch Sprühen der Lysophospholipase auf
einen Träger in
einem Flüssigbettgranulator.
Der Träger
kann aus teilchenförmigen
Kernen mit einer geeigneten Teilchengröße bestehen. Der Träger kann
löslich
oder unlöslich
sein, z.B. ein Salz (wie NaCl oder Natriumsulfat), Zucker (wie Saccharose oder
Lactose), Zuckeralkohol (wie Sorbit), Stärke, Reis, Maisschrot oder
Soja. Die Lysophospholipase und/oder zusätzliche Enzyme können in
langsam freisetzenden Formulierungen enthalten sein. Verfahren zur Herstellung
von langsam freisetzenden Formulierungen sind aus der Technik gut
bekannt. Flüssige
Enzymzubereitungen können
beispielsweise durch Zugabe von nahrungsmittelverträglichen
Stabilisatoren, wie Zucker, Zuckeralkohol oder einem anderen Polyol
und/oder Milchsäure
oder einer anderen organischen Säure
nach den entwickelten Verfahren stabilisiert werden.
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Zum
Einschluss in Vorgemische oder Mehl ist es zweckmäßig, dass
das Polypeptid mit Lysophospholipase-Aktivität in Form eines trockenen Produkts,
z.B. eines nicht staubenden Granulats vorliegt, wohingegen es zum
Einschluss zusammen mit einer Flüssigkeit
zweckmäßigerweise
in einer flüssigen
Form vorliegt.
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Auch
eine oder mehrere zusätzliche
Enzyme können
in den Teig eingearbeitet werden. Das zusätzliche Enzym kann ein Enzym
beliebigen Ursprungs sein, einschließlich von aus Säugern und
Pflanzen stammend und vorzugsweise mikrobiellen (Bakterien, Hefe
oder Pilze) Ursprungs, und kann durch Verfahren, die herkömmlicherweise
in der Technik verwendet werden, erhalten werden.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
kann das zusätzliche
Enzym eine Amylase (wie eine alpha-Amylase, die zur Bereitstellung
von Zuckern, die durch Hefe fermentierbar sind und das Austrocknen
verzögern,
geeignet ist) oder beta-Amylase, Cyclodextrin, Glucotransferase,
Peptidase, insbesondere eine Exopeptidase (zur Geschmacksverstärkung geeignet),
Transglutaminase, Lipase (zur Modifikation der in dem Teig vorhandenen
Lipide oder der Teigbestandteile, so dass der Teig weich wird),
Phospholipase (geeignet zur Modifikation von Lipasen, die in dem
Teig oder den Teigbestandteilen vorhanden sind, so dass der Teig
weich wird und zur Verbesserung der Gasretention in dem Teig), Cellulase,
Hemicellulase, insbesondere eine Pentosanase, wie Xylanase (die
zur partiellen Hydrolyse von Pentosanen geeignet ist, die die Dehnbarkeit
des Teigs erhöhen),
Protease (die zur Gluten-Verminderung insbesondere bei Verwendung
von Hartweizenmehl geeignet ist), Proteindisulfidisomerase, z.B.
eine Proteindisulfidisomerase, wie offenbart in WO 95/00636, Glycosyltransferase,
Peroxidase (die zur Verbesserung der Teigkonsistenz geeignet ist),
Laccase oder Oxidase, z.B. eine Aldoseoxidase, Glucoseoxidase, Pyranoseoxidase,
Lipoxygenase oder L-Aminosäureoxidase
(die zur Verbesserung der Teigkonsistenz geeignet ist) sein.
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Wenn
nach den erfindungsgemäßen Verfahren
ein oder mehrere zusätzliche
Enzym-Aktivitäten zuzusetzen
sind, können
diese Aktivitäten
getrennt oder zusammen mit dem Polypeptid mit Lysophospholipase-Aktivtät, gegebenenfalls
als Zutaten) der Brotverbessernden und/oder Teig-verbessernden Zusammensetzung zugesetzt
werden. Die anderen Enzym-Aktivitäten können eines der vorstehend beschriebenen
Enzyme sein und können
nach den etablierten Backpraktiken dosiert werden.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung eines
gebackenen Produkts, umfassend das Backen eines Teigs, der durch
ein erfindungsgemäßes Verfahren
erhalten wird, um ein gebackenes Produkt herzustellen. Das Backen
des Teigs zur Herstellung eines gebackenen Produkts kann unter Anwendung
von aus der Technik bekannten Verfahren durchgeführt werden.
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Die
vorliegende Erfindung wird weiterhin durch die folgenden Beispiele
beschrieben, die nicht als Einschränkung des Umfangs der Erfindung
gedacht sein sollen.
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Beispiele
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Die
als Puffer und als Substrate verwendeten Chemikalien waren handelsübliche Produkte
von mindestens p.a. Reinheit.
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Medien und
Lösungen
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COVE-Spurenmetalllösung, bestehend
pro 1 aus 0,04 g NaB4O2·10H2O, 0,4 g CuSO4·5H2O, 1,2 g FeSO4·7H2O, 0,7 g MnSO4·H2O, 0,8 g Na2MoO·2H2O und 10 g ZnSO4·7H2O.
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50X
COVE-Salzlösung,
bestehend pro 1 aus 26 g KCl, 26 g MgSO4·7H2O, 76 g KH2PO4 und 50 ml COVE-Spurenrmetallen.
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COVE-Medium,
bestehend pro 1 aus 342,3 g Saccharose, 20 ml 50X COVE-Salzlösung, 10
ml 1 M Acetamid, 10 ml 1,5 M CsCi2 und 25
g Noble Agar.
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50X
Vogels-Medium, bestehend pro 1 aus 150 g Natriumcitrat, 250 g KH2PO4, 10 g MgSO4·7H2O, 10 g CaCl2·2H2O, 2,5 ml Biotin-Stammlösung und 5,0 ml Spurenmetalllösung.
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Spurenmetalllösung, bestehend
pro 1 aus 14,3 g ZnSOa·7H2O, 2,5 g CuSO4·5H2O, 0,5 g NiC12,
13,8 g FeSO4, 8,5 g MnSO4,
und 3,0 g Citronensäure.
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COVE-Topagarose,
bestehend pro 1 aus 20 ml 50X COVE-Salzen, 0,8 M Saccharose, 1,5
M Cäsiumchlorid,
1,0 M Acetamid und 10 g niedrig schmelzende Agarose, pH eingestellt
auf 6,0.
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RA-Sporulationsmedium,
bestehend pro 1 aus 50 g Succinsäure,
12,1 g NaNO3, 1 g Glucose, 20 ml 50X Vogels-Medium
und 0,5 ml einer 10 mg/ml NaMoO4-Stammlösung, pH
6,0.
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YEPG-Medium,
bestehend pro 1 aus 10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton und 20 g Glucose.
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STC,
bestehend aus 0,8 M Sorbit, 25 mM Tris pH 8,25 mM CaCl2.
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SPTC,
bestehend aus 40% PEG 4000, 0,8 M Sorbit, 25 mM Tris pH 8,25 mM
CaCl2.
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M400Da-Medium,
bestehend pro 1 aus 50 g Maltodextrin, 2 g MgSO4·7H2O, 2 g KH2PO4, 4 g Citronensäure, 8 g Hefeextrakt, 2 g Harnstoff
und 1 ml COVE-Spurenmetalllösung.
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10X
basale Salze Gew./Aminosäure
bestehend pro 1 aus 66, 8 g Hefe-Stickstoffase Gew./der Aminosäure (Diffco),
100 g Succinsäure
und 60 g NaOH.
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SC
Ura-glc-Medium bestehend pro 1 aus 100 ml 20% Glucose, 100 ml 10X
basalen Salzen Gew./der Aminosäure,
25 ml 20% (Gew./Vol.) Casaminosäure,
4 ml 5% Treonin, 10 ml 1% Tryptophan und 20 g Agar Noble.
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SC
Ura-gal-Medium, bestehend pro Liter aus 100 ml 20% Galactose, 100
ml 10X basalen Salzen Gew./der Aminosäure, 25 ml 20% (Gew./Vol.)
Casaminosäure,
4 ml 5% Treonin, 10 ml 1% Tryptophan und 20 g Noble Agar.
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YPD-Medium,
bestehend pro Liter aus 10 g Hefeextrakt, 20 g Bactopepton und 100
ml 20% Glucose.
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1X
Te/LiAC, bestehend pro 10 ml aus 1 ml 10X TE (100 mM Tris und 10
mM EDTA bei pH??), 1 ml 1 M Lithiumacetat und 8 ml Milli-Q-Wasser.
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PEG/LiAc-Lösung, bestehend
aus 50 ml 40% PEG und 1 ml 5 M Lithiumacetat.
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Die
Testplatten zum Nachweis der Lysophospholipase-Aktivität bestanden
pro 1 aus 5 g L-alpha-Phosphatidylcholin 95%, 2,5 g Cholinsäure, 50
ml 1 M Tris-HCl pH 8,0 Puffer, 100 ml 100 mM CaCl2,
15 ml 2% Brilliant-Grün
und 20 g Agar Noble. Die Lösung
wurde in 50-ml-Aliquoten auf Falcon 1058-Platten gegossen.
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STET-Lösung bestehend
aus 8% Saccharose, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM EDTA und 5% Triton X-100.
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Beispiel 1: Fermentation
und Myzel-Gewebe
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Fusarium
venenatum CC1–3,
eine morphologische Mutante des Fusarium-Stamms ATCC 20334 (bliebe
et al., 1991, Mycol. Research 95:1284–1288), wurde in einem 2-1-Fermenter
im Labormaßstab
unter Anwendung eines diskontinuierlichen Fermentationsschemas mit
NUTRIOSETM (Roquette Freres, S.A., Beinheim,
Frankreich) als Kohlenstoffquelle und Hefeextrakt gezüchtet. In
der Nährlösung wurde
Ammoniumphosphat bereitgestellt. Der pH wurde bei 6 bis 6,5 gehalten,
und die Temperatur wurde mit positiv gelöstem Sauerstoff bei 30°C gehalten.
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Myzelproben
wurden 2, 4, 6, und 8 Tage nach dem Animpfen geerntet und schnell
in flüssigem
Stickstoff eingefroren. Die Proben wurden bei -80°C gelagert,
bis sie zur RNA-Extraktion
aufgebrochen wurden.
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Beispiel 2: Erstellung
einer cDNA-Bibliothek
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Die
zelluläre
Gesamt-RNA wurde aus den in Beispiel 1 beschriebenen Mycelproben
nach dem Verfahren von Timberlake und Barnard (1981, Cell 26:29–37) extrahiert,
und die RNA-Proben wurden durch Northern-Hybridisierung nach Blotten
aus 1% Formaldehyd-Agarose-Gelen
analysiert (Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology,
Elsevier Science Publishing Co., Inc., New York). aus der Gesamt-RNA
wurden mit einem mRNA-SeparatorkitTM (Clontech
Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) nach den Anweisungen des Herstellers
polyadenylierte mRNA-Fraktionen isoliert. Doppelsträngige cDNA
wurde unter Verwendung von etwa 5 μg poly(A)+mRNA nach dem Verfahren
von Gubler und Hoffman (1983, Gene 25:263–269), außer dass ein NotI-(dT)18-Primer
(Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ) zum Start der ersten Strangsynthese
verwendet wurde, synthetisiert. Die cDNA wurde mit Mungobohnen-Nuclease
(Boehringer Mannheim Corporation, Indianapolis, IN) behandelt, und
die Enden wurden mit T4-DNA-Polymerase
(New Englang Biolabs, Beverly, MA) abgestumpft.
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Die
cDNA wurde mit NotI verdaut, durch Agarose-Gel-Elektrophorese (0,7–4,5 kb)
Größen-selektiert und
mit pZErO-2.1 (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) ligiert, was
mit NotI plus EcoRV gespalten und mit alkalischer Kälberdarmphosphatase
(Boehringer Mannheim Corporation, Indianapolis, IN) dephosphoryliert wurde.
Das Ligationsgemisch wurde zur Transformation von kompetenten E.
coli TOP10-Zellen (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) verwendet.
Die Transformanten wurden auf 2YT-Agarplatten selektiert (Miller, 1992,
A Short Course in Bacterial Genetics. A Laboratory Manual and Handbook
for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Press,
Cold Spring Harbor, New York), welche Kanamycin in einer Endkonzentration
von 50 μg/ml
enthielten.
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Zwei
unabhängige
direktionale cDNA-Bibliotheken wurden unter Verwendung des Plasmid-Klonierungsvektors
pZErO-2.1 konstruiert. Bibliothek A wurde unter Verwendung von mRNA
aus Myzel hergestellt, das nach vier Tagen geerntet wurde, und die
Bibliothek B wurde mit mRNA genau nach sechs Tagen konstruiert.
Keine der cDNA- Bibliotheken
wurde amplifiziert, um einen repräsentativen "Schnappschuss" der Genexpressionsprofile in den Zellen
zu überprüfen. Stattdessen
wurden die Bibliotheken ausplattiert, titriert, und durch DNA-Sequenzierung
wurden jeweils unabhängige
Klone analysiert.
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Bibliothek
A (4 Tage alte Zellen) bestand aus etwa 7,5 × 104 unabhängigen Klonen,
und Bibliothek B (6 Tage alte Zellen) bestand aus etwa 1,2 × 105 Klonen. Miniprep-DNA wurde aus 40 Kolonien
in jeder Bibliothek isoliert und auf die Gegenwart und Größe von cDNA-Inserts überprüft. Bei
dieser Analyse enthielten 39 von 40 Kolonien (97,5%) aus Bibliothek
A Inserts mit Größen im Bereich
von 600 bis 2200 bp (Mittelwert = 1050 bp). Ebenso besaßen 29 von
40 Kolonien (97,5%), die aus der Bibliothek B herausgegriffen wurden,
Inserts mit Größen im Bereich
von 800 bis 3600 bp (Mittelwert = 1380 bp).
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Beispiel 3: Templatherstellung
und Nukleotidsequenzierung
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Aus
jeder in Beispiel 2 beschriebenen cDNA-Bibliothek wurden 1192 tranformante
Kolonien direkt aus den Transformationsplatten in 96-well-Mikrotiterplatten übergeführt, die
200 μl 2YT-Medium
(Miller, 1992, supra) mit 50 μg/ml
Kanamycin enthielten. Die Platten wurden bei 37°C ohne Schütteln über Nacht inkubiert. Nach der
Inkubation wurden jeder Vertiefung 100 μl 50%iges steriles Glycerin
zugesetzt. Die Transformanten wurden in zweiten 96-well-Mikrokulturplatten
mit tiefen Vertiefungen (Advanced Genetic Technologies Corporation,
Gaithersburg, MD), die 1 ml Magnificent BrothTM (MacConnell
Research, San Diego, CA) enthielten, angereichert mit 50 μg Kanamycin
pro ml in jeder Vertiefung, repliziert. Die ersten Mikrotiterplatten
wurden bei -80°C tiefgefroren
gelagert. Die zweiten Platten mit den tiefen Vertiefungen wurden
bei 37°C über Nacht
unter kräftigem
Rühren
(300 U/min) auf einem Rotationsschüttler inkubiert. Um Verschütten und
Kreuzverunreinigung zu verhindern und um eine ausreichende Belüftung zu
ermöglichen,
wurde jede zweite Kulturplatte mit einem Polypropylenkissen (Advanced
Genetic Technolgies Corporation, Gaithersburg, MD) und einem Mikrotiterplatten-Kunststoffdeckel
abgedeckt.
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Die
DNA wurde unter Anwendung eines 96-well-Miniprepkit-Protokolls von
Acvanced Genetic Technologies Corporation (Gaithersburg, MD), wie
modifiziert von Utterback et al (1995,Genome Sci. Technol. 1:1–8), aus
jeder Vertiefung isoliert. Die Single-Pass-DNA-Sequenzierung erfolgte mit einem
Perkin-Eimer Applied Biosystems Sequenzierer XL Modell 377 (Perkin-Eimer
Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) unter Anwendung der Farbstoff-Terminator-Chemie
(Giesecke et al., 1992, Journal of Virology Methods 38:47–60) und
des reversen lac-Sequenzierungsprimers.
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Beispiel 4: Analyse der
DNA-Sequenzdaten
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Die
Nukleotidsequenzdaten wurden sorgfältig auf Qualität geprüft und Proben
mit unpassenden Zwischenräumen
oder unklaren Niveaus über
2% wurden verworfen oder wiederholt.
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Die
Vektorsequenzen wurden manuell unter Zuhilfenahme der FACTURATM-Software (Perkin-Elmer Applied Biosystems,
Inc., Foster City, CA) zugeschnitten. Zusätzlich wurden die Sequenzen
am Ende einer jeden Probe abgeschnitten, wenn sich die Anzahl an
zweideutigen Basenabfolgen erhöhte.
Sämtliche
Sequenzen wurden miteinander verglichen, um die Multiplizität unter
Verwendung der AutoAssemblerTM-Software (Perkin-Elmer
Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) zu bestimmen. Schließlich wurden
alle Sequenzen in drei Rastern translatiert und gegen eine nicht
redundante Datenbasis (NRDB) unter Verwendung der GeneAssistTM-Software (Perkin-Elmer Applied Biosystems,
Inc., Foster City, CA) mit einem modifizierten Smith-Waterman-Algorithmus
unter Verwendung der BLOSUM 62-Matrix mit einer Schwellenwertbewertung
von 70 abgesucht. Das NRDB wurde von Genpept, Swiss-Prot und PIR-Datenbasen
zusammengebaut.
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Beispiel 5: Identifizierung
des Lysophospholipase-cDNA-Klons
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Die
putativen Lysophospholipase-Klone wurden durch Teil-Sequenzierung
von zufälligen
cDNA-Klonen unter Verwendung eines Applied Biosystems automatischen
DNA-Sequenzierers
Modell 377 XL nach den Anweisungen des Herstellers und durch den
Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenz mit der Aminosäuresequenz
von Penicillium notatum-Lysphospholipase (Swissprot Zugangsnummer
P39457), wie in Beispiel 4 beschrieben, identifiziert. Unter mehreren
auf diese Weise gefundenen Klonen wurde von einem auf der Grundlage
seiner Anordnung mit der Penicillium notatum-Lysophospholipase-Aminosäuresequenz
und der Gegenwart eines möglichen
Signalpeptids, das unter Verwendung des Signal-P-Computerprogramms
(Nielsen, et al., 1997, Protein Engineering 10:1–6) entdeckt wurde, angenommen,
dass er die volle Länge
besitzt. Dieser als E. coli FB0346 bezeichnete Klon, der pFB0346
enthielt, wurde für
die Nukleotidsequenzanalyse und für Expressionsstudien ausgewählt.
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Beispiel 6: Nukleotidsequenzierung
und Charakterisierung der Fusarium venenatum-Lysophospholipase-cDNA
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Die
DNA-Sequenzierung wurde mit einem automatischen Applied Biosystems
DNA-Sequenzierer,
Modell 377 XL, unter Verwendung der Farbstoff-Terminationssequenzchemie durchgeführt. Zusammenhängende Sequenzen
wurden unter Verwendung einer Transposon-Insertionsstrategie (Primer
Island Transposition Kit, Perkin-Elmer/Applied Biosystems, Inc.,
Foster City, CA) generiert. Der Lysophospholipase-Klon aus E. coli FB0346
wurde mit einer durchschnittlichen Redundanz von 6, 9 sequenziert.
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Der
Lysophospholipase-Klon codierte ein offenes Leseraster von 1962
bp, welches ein Polypeptid von 654 Aminosäuren codiert. Die Nukleotidsequenz
(SEQ ID NO. 1) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO. 2) sind
in den 1A, 1B, und 1C gezeigt.
Unter Verwendung des SignalP-Programms (Nielsen et al., 1997, Protein
Engineering 10:1–6)
wurde ein Signalpeptid von 17 Resten vorhergesagt, und die N-terminale Analyse
des sekretierten Proteins zeigte die Gegenwart einer Pro-Region
von 20 Aminosäuren
an (siehe Beispiel 11), was daher ein vorhergesagtes Molekulargewicht
von ungefähr
67 kDa für
die sekretierte Lysophospholipase anzeigt. Somit besteht die reife
Lysophospholipase aus 617 Aminosäuren.
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Eine
Vergleichsanordnung der Lysophospholipase-Sequenzen wurde unter
Verwendung des Clustal-Verfahrens (Higgins, 1989, CABIOS 5:151–153) unter
Verwendung der LASERGENETM MEGALIGNTM-Software (DNASTAR, Inc., Madison, WI)
mit einer Identitätstabelle
und den folgenden multiplen Anordnungsparametern durchgeführt: Gap-Penalty 10 und Gap-Längen-Penalty
10. Die paarweise angeordneten Parameter waren Ktuple=1, Gap-Penalty=3,
Windows=5 und Diagonals=5.
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Die
Vergleichsanordnung zeigte, dass sich die Fusarium venenatum-Lysophospholipase
Identitätsregionen
mit Lysophospholipase-Proteinen von Neurospora crassa zu 59% (TREMBL
O42791), Penicillium notatum zu 52% (Swissprot P39457), Saccharomyces
cerevisiae zu 44% (Swissprot P39105) und Schizosaccharomyces pombe
zu 39% (TREMBL O13857) teilte. Die Identitäten sind zwischen den Regionen
am größten, die
wahrscheinlich für
katalytische und/oder strukturelle Rollen des Enzyms wichtig sind.
Es existieren 19 potentielle N-verknüpfte Glycosylierungsstellen
(Asn-X-Ser/Thr) innerhalb der Fusarium venenatum-Lysophospholipase,
und 11 von diesen sind in Neurospora crassa-Lysophospholipase konserviert,
wohingegen 10 in Penicillium notatum-Lysophospholipase konserviert sind.
Die Anordnung zeigt auch die Gegenwart von 8 Cys-Resten, deren Positionen unter Fusarium
venenatum-, Neurospora crassa-, Penicillium notatum-, Saccharomyces
pombe- und Saccharomyces cerevisiae-Lysophospholipasen strikt konserviert
sind.
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Beispiel 7: Konstruktion
von pDM181
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Das
Plasmid pDM 181 wurde unter Anwendung der Splice-overlap-Extensionstechnik
unter Fusion des 1,2 kb Fusarium oxysporum-Trypsin-Promotors (SP387)
mit dem 1,1 kb Fusarium oxysporum-Trypsin-Terminator (SP387) hergestellt.
Ein Polylinker, der Swal-, KpnI- und Pacl-Restriktionsstellen enthielt,
wurde zwischen Promotor und Terminator als Teil der PCR-Überlappungsstrategie
inseriert. Am 5'-Ende
des Promotors wurde eine XhoI-Stelle zugefügt, und die native EcoRI-Stelle
wurde erhalten. Am 3'-Ende
des Terminators wurden durch die PCR-Reaktion EcoRI-, HindIII- und
NsiI-Stellen eingebracht.
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Ein
PCR-Fragment, das -1208 bis -1 des Fusarium oxysporum-Trypsin-Promotors
plus einen 25-Basenpaar-Polylinker enthält, wurde aus dem Plasmid pJRoy20
generiert (Royer et al., 1995, Biotechnology 13:1479–1483),
wobei die folgenden Primer verwendet wurden: Primer
1 (sense):
Primer
2 (antisense):
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Die
100-μl-PCR-Reaktion
enthielt 1X Pwo-Puffer (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN),
jeweils 200 μM
von dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 10 ng pJRoy20 und 5 Einheiten von
Pwo-DNA-Polymerase (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Die
angewandten PCR-Bedingungen waren 3 min bei 95°C und anschließend 25 Zyklen
für jeweils
30 s bei 95°C,
1 min bei 50°C
und 1 min bei 72°C.
Der letzte Extensionszyklus war bei 72°C für 5 min.
-
Unter
Anwendung der gleichen PCR-Bedingungen wurde ein zweites PCR-Fragment,
enthaltend die Basenpaare -5 bis -1 des Fusarium oxysporum-Trypsin-Promotors,
einen 25-Basenpaar-Polylinker und 1060 Basenpaare der 3'-untranslatierten
Region des Fusarium oxysporum-Trypsin-Gens (Terminatorregion), aus dem
Plasmid pJRoy20 generiert, wobei die folgenden Primer verwendet
wurden: Primer
3 (sense):
Primer
4 (antisense):
-
Das
letzte 2,3 kb PCR-Überlapp-Fragment,
das -1208 bis -1 des Fusarium oxysporum-Trypsin-Promotors, den 25 Basenpaar-Polylinker
und 1060 Basenpaare des Fusarium oxysporum-Trypsin-Terminators enthielt,
wurde unter Verwendung von 0,2 μl
der ersten PCR (Promotor)-Reaktion und 3 μl der zweiten (Terminator)-Reaktion
als Templat und von Primer 1 und 4 erhalten. Die angewandten PCR-Bedingungen
waren 3 min bei 95°C
und anschließend
3 Zyklen jeweils 30 s bei 95°C,
1 min bei 62°C
und 3 min bei 72°C.
Der letzte Extensionszyklus war 5 min bei 72°C. Pwo-DNA-Polymerase wurde
ebenfalls für
diese Reaktion verwendet.
-
Das
resultierende 2,3 kb Fragment, das den Trypsin-Promotor, den Polylinker
und den Trypsin-Terminator enthielt, wurde mit EcoRI verdaut und
in den EcoRI-verdauten Vektor pMT1612 ligiert, der das bar-Gen (WO
97/26330) enthielt, um pDM181 zu erzeugen (2).
-
Beispiel 8: Konstruktion
des Plasmids pSheB1
-
Der
Fusarium venenatum-Expressionsvektor pSheB1 (3) wurde
durch Modifikation von pDM181 generiert. Die Modifikationen umfassten
(a) die Entfernung von zwei NcoI-Stellen
innerhalb der pDM181-Sequenz und (b) Restauration des natürlichen
Translationsstartes des Fusarium oxysporum-Trypsin-Promotors (Rekonstruktion
einer NcoI-Stelle am ATG-Startkodon).
-
Die
Entfernung von zwei NcoI-Stellen innerhalb der pDM181-Sequenz wurde
unter Verwendung des QuikChangeTM ortsgerichteten
Mutagenese-Testsatzes (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA)
nach der Anweisung des Herstellers mit den folgenden Paaren von
Mutagenese-Primern durchgeführt:
5'-dCAGTGAATTGGCCTCGATGGCCGCGGCCGCGAATT-3' plus (SEQ ID NO.
7
5'-dAATTCGCGGCCGCGGCCATCGAGGCCAATTCACTG-3' (SEQ ID NO. 8)
5'-dCACGAAGGAAAGACGATGGCTTTCACGGTGTCTG-3' plus (SEQ ID NO.
9)
5'-dCAGACACCGTGAAAGCCATCGTCTTTCCTTCGTG-3' (SEQ ID NO. 10)
-
Die
Restauration des natürlichen
Translationsstartes des Fusarium oxysporum-Trypsin-Promotors wurde auch
unter Verwendung des Stratagene QuikChangeTM ortsgerichteten
Mutagenese-Testsatzes in Verbindung mit den folgenden Paaren von
Mutagenese-Primern erreicht:
5'-dCTATCTCTTCACCATGGTACCTTAATTAAATACCTTGTTGGAAGCG-3' plus (SEQ ID NO.
11)
5'-dCGCTTCCAACAAGGTATTTAATTAAGGTACCATGGTGAAGAGATAG-3' (SEQ ID NO. 12)
-
Alle
ortsgerichteten Änderungen
wurden durch DNA-Sequenzanalyse der entsprechenden Vektorregionen
bestätigt.
-
Beispiel 9: Konstruktion
des Expressionsvektors pRaMB54
-
Der
Lysophospholipase-Expressionsvektor pRaMB54 wurde, wie in 4 gezeigt,
konstruiert. Die Lysophospholipase-codierende Region wurde aus dem
Klon FB0346 unter Verwendung des folgenden Paars von Primern:
5'-dGGCACATGTTGGGCCCTCTCGTCTTTACT-3' (vorwärts) (SEQ
ID NO. 13) und
5'-dGACTTAATTAATTTACGAAATAGCCAAGAATAAAGC-3' (rückwärts) (SEQ
ID NO. 14)
amplifiziert. Der Vorwärtsprimer führt eine BspLU11I-Restriktionsstelle
am Startkodon ein und der Rückwärtsprimer
führt eine
PacI-Stelle nach dem Stopkodon ein.
-
Die
Amplifikationsreaktion (100 μl)
enthielt die folgenden Komponenten: 0,8 μg von Klon-FB0346-cDNA, 40 pmol
des Vorwärtsprimers,
40 pmol des Rückwärtsprimers,
jeweils 200 μM
von dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 1X Pwo-DNA-Polymerasepuffer und 2,5
Einheiten von Pwo-DNA-Polymerase. Die Reaktionen wurden in einem
Perkin-Eimer Thermal Cycler Modell 480, programmiert auf 30 Zyklen,
jeweils 3 min bei 95°C,
2 min bei 58°C
und 2 min bei 72°C,
inkubiert. Die Reaktionsprodukte wurden auf einem 1,5%igen Agarosegel
(Eastman Kodak, Rochester, NY) isoliert, wobei eine 2 kb Produktbande
aus dem Gel ausgeschnitten und unter Verwendung von Qiaex II (Qiagen,
Chatsworth, CA) nach den Anweisungen des Herstellers gereinigt wurde.
-
Das
amplifizierte Lysophospholipase-Segment wurde mit BspLU11I und PacI
verdaut, durch Agarose-Gel-Elektrophorese unter Anwendung von Standardverfahren
(Sambrook et al., 1989, supra) gereinigt und mit dem Vektor pSheB1
ligiert, der zuvor mit NcoI und PacI gespalten wurde (Anmerkung:
BspLU11I und NcoI generieren kompatible kohäsive Enden). Das resultierende
Expressionsplasmid wurde als pRaMB54 bezeichnet.
-
Beispiel 10: Expression
von Lysophospholipase-cDNA in Fusarium venenatum
-
Sporen
von Fusarium venenatum CC1–3
(MLY-3) wurden durch Animpfen eines Kolbens, der 500 ml RA-Sporulationsmedium
mit 10 Pfropfen aus einer 1X Vogel-Medium-Platte (2,5% Noble Agar),
angereichert mit 2,5% Glucose und 2,5 mM Natriumnitrat, enthielt,
und Inkubieren bei 28°C,
150 U/min 2–3
Tage lang, erzeugt. Die Sporen wurden über Miracloth (Calbiochem,
San Diego, CA) geerntet und 20 min bei 7000 U/min in einer Sorvall
RC-5B-Zentrifuge (E.I. DuPont De Nemours and Co., Wilmington, DE)
zentrifugiert. Die pelletierten Sporen wurden zweimal mit sterilem
destilliertem Wasser gewaschen, in einem kleinen Volumen von Wasser
resuspendiert und sodann unter Verwendung eines Hämocytometers
gezählt.
-
Protoplasten
wurden durch Animpfen von 100 ml YEPG-Medium mit 4X 107 Sporen
von Fusarium venenatum CC1–3
und 16 h Inkubieren bei 24°C
und 150 U/min hergestellt. Die Kultur wurde 7 min bei 3500 U/min
in einer Sorvall RT 6000D-Zentrifuge (E.I. DuPont De Nemours and
Co., Wilmington, DE) zentrifugiert. Die Pellets wurden zweimal mit
30 ml 1 M MgSO4 gewaschen und in 15 ml 5
mg/ml NOVOZYME 234TM (Charge PPM 4356, Novo
Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dänemark)
in 1 M MgSO4 resuspendiert. Die Kulturen
wurden bei 24°C
und 150 U/min inkubiert, bis sich Protoplasten bildeten. Dem Protoplastenverdau
wurde ein Volumen von 35 ml 2 M Sorbit zugesetzt, und das Gemisch
wurde bei 2500 U/min 10 min zentrifugiert. Das Pellet wurde resuspendiert,
zweimal mit STC gewaschen und bei 2000 U/min 10 min zentrifugiert,
um die Protoplasten zu pelletieren. Die Protoplasten wurden mit
einem Hämocytometer
gezählt
und in einer 8:2:0,1-Lösung
von STC:SPTC:DMSO bis auf eine Endkonzentration von 1,25 × 107 Protoplasten/ml resuspendiert. Die Protoplasten
wurden nach Einfrieren mit kontrollierter Geschwindigkeit in einem
Nalgene-Cryo-1°C-Gefrierbehälter (VWR
Scientific, Inc., San Francisco, CA) bei -80°C aufbewahrt.
-
Die
eingefrorenen Protoplasten von Fusarium venenatum CC1–3 wurden
auf Eis aufgetaut. 5 μg
von pRaMB54, beschrieben in Beispiel 9, und 5 μl Heparin (5 mg pro ml STC)
wurden in einem sterilen 50-ml-Polypropylenröhrchen vorgelegt. 100 μl Protoplasten wurden
zugesetzt, vorsichtig gemischt und 30 min auf Eis inkubiert. 1 ml
SPTC wurde zugesetzt und bei Raumtemperatur 20 min inkubiert. Nach
Zugabe von 25 ml 40°C COVE-Top-Agarose
wurde das Gemisch auf eine leere 150-mm-Durchmesser-Platte gegossen
und über Nacht
bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden zusätzliche
25 ml der 40°C-COVE-Top-Agarose, enthaltend
10 mg BASTATM pro ml, auf die Platte gegossen
und bei Raumtemperatur bis zu 14 Tage inkubiert. Der Wirkstoff in
dem Herbizid BASTATM ist Phosphinotricin.
BASTATM wurde von AgrEvo (Hoechst Schering, Rodovre,
Dänemark)
erhalten und wurde vor der Verwendung zweimal mit Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1)
und einmal mit Chloroform:Isoamylalkohol (24:1) extrahiert.
-
15
Transformanten wurden direkt von den Selektionsplatten (COVE underlay
mit COVE-BASTATM overlay) in 125 ml Schüttelkolben, die 25 ml M400Da-Medium,
angereichert mit 1 mM CaCl2 und 100 μg/ml Ampicillin
(zur Verhinderung von bakterieller Verunreinigung) enthielten, übergeführt und
7 Tage bei 28°C,
200 U/min auf einem Plattformschüttler
inkubiert. Der nicht transformierte Empfängerstamm wurde ebenfalls als negative
Kontrolle eingeschlossen.
-
Von
den Kolben wurden nach 5 Tagen Proben genommen. Die Zellen wurden
durch Zentrifugation entfernt, und 10 μl einer jeden Überstandsprobe
wurde mit einem gleichen Volumen SDS-PAGE-Probepuffer (Novex Experimental
Technology, San Diego, CA) 5 min auf 95°C erhitzt. Die denaturierten
Proteine im Überstand wurden
auf einem 10–20%
Gradienten-Gel (Novex Experimental Technology, San Diego, CA) aufgetrennt
und mit Coomassieblau angefärbt.
-
Die
Lysophospholipase-Aktivität
in den Kulturüberständen wurde
ebenfalls unter Verwendung von Eigelb-Lysolecithin als Substrat
mit einem NEFA C-Testsatz (Wako Chemicals, Richmond, VA) gemessen.
Speziell wurde eine 10-μl-Probe
des Überstandes
zu 160 μl
von 20 mM MOPS pH 7,0 Puffer und 30 μl Stammlösung von 5 mg Lysolecithin pro
ml 100 mM NaCl gegeben und 20 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden 20 μl der Reaktion
zu 200 μl
Reagens A (Wako Chemicals, Richmond, VA) zugesetzt und 10 min bei
37°C inkubiert.
Schließlich
wurden 400 μl
Reagens B (Wako Chemicals, Richmond, VA) zugesetzt, und die Lösung wurde
weitere 10 min bei 37°C
inkubiert. Die Extinktion bei 550 nm wurde durch Überführen von
200 μl der Endlösung in
eine 96-well-Platte
und Messen der Extinktion mit einem SpectraMax Modell 340 (Molecular
Dynamics, Sunnyvale, CA) relativ zu einer Standardkurve, die mit
Oleinsäure
als Standard erstellt wurde, gemessen.
-
Die
in Tabelle 1 gezeigten Ergebnisse beweisen eindeutig die Gegenwart
einer erhöhten
Lysophospholipase-Aktivität
in diesen Proben. Die SDS-PAGE-Analyse zeigte, dass die Lysophospholipase-produzierenden
Transformanten ein prominentes Polypeptid mit einem scheinbaren
Molekulargewicht von ungefähr 116
kDa sekretieren. Die Diskrepanz zwischen dem vorhergesagten Molekulargewicht
von reifer Lysophospholipase (etwa 69 kDa) gegenüber demjenigen, welches durch
SDS-PAGE festgestellt wurde, legt nahe, dass das Protein schwer
glycosyliert ist. Wie zuvor angemerkt, existieren 19 potentielle
Stellen für
die N-verknüpfte Glycosylierung
innerhalb der abgeleiteten Aminosäuresequenz von Fusarium venenatum-Lysophospholipase. Tabelle
1. Lysophospholipase-Aktivität,
die in den Kulturüberständen aus
Fusarium venenatum/pRaMB54-Transformanten vorhanden ist
- ✝ Die
Aktivität
gibt die Hydrolysegeschwindigkeit von Eigelb-Lysolecithin bei pH
7 und 37°C
wieder, gemessen in Mikromol Produkt pro min pro ml relativ zu der
Aktivität
des höchsten
Produzenten, RamB54.01, die auf 1,00 normiert ist. N.D., nicht nachgewiesen.
-
Beispiel 11: Reinigung
von rekombinanter Fusarium venenatum-Lysophospholipase
-
Fusarium
venenatum/pRaMB54 wurde, wie in Beispiel 10 beschrieben, 4 Tage
in zwei 500-ml-Schüttelkolben,
die 100 ml M400Da-Medium enthielten, kultiviert. Die 4 Tage alten
Vollkulturnährmedien
wurden über
Miracloth und anschließend über ein
0,45-μm-Spritzenfilter (Whatman,
Inc., Fairfield, NJ) filtriert, um ein Probenvolumen von etwa 150
ml zu ergeben. Anschließend
wurden dem filtrierten Nährmedium
25 mM PMSF in 75% Ethanol/25% Methanol bis auf eine Endkonzentration
von 0,5 mM zugesetzt. Anschließend
wurde die Probe mit Wasser und 20 mM Natriumphosphat pH 7 verdünnt, um
einen pH von 7,45 und eine Leitfähigkeit von
2,3 mS zu erreichen.
-
Q-Sepharose
Big Beads (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ) wurde in einer
XK-26-Säule mit
einem Volumen von ungefähr
80 ml Harz präpariert.
Die Säule
wurde mit 500 ml 20 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,0 voräquilibriert.
Anschließend
wurde die Probe geladen und sodann mit 20 mM Natriumphosphat pH
7,0 gewaschen, bis eine Grundlinie erreicht war. Ein 600-ml-Gradient
wurde von 0 bis 0,35 M NaCl mit einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml/min
120 min laufen gelassen. Fraktionen von 12,5 ml wurden gesammelt
und unter Verwendung von Lauroyllysophosphatidylcholin (Sigma Chemical
Co., St. Louis, MO) als Substrat bei einer Konzentration von 1,2
mg/ml unter Anwendung des gleichen Verfahrens, das in Beispiel 10
beschrieben ist, getestet. Die Freisetzung von Laurinsäure wurde
unter Verwendung eines NEFA C-Testsatzes gemessen. Die aktiven Fraktionen
wurden vereinigt, den vereinigten Fraktionen wurde (NH4)2SO4 zugesetzt, um
eine Konzentration von 2,2 M zu erreichen, und der pH wurde unter
Verwendung von 1 M NaOH aus 7,0 eingestellt.
-
Anschließend wurden
die vereinigten Fraktionen auf eine Phenylsuperose-16/10-Säule (Pharmacia Biotech,
Inc., Piscataway, NJ), gewaschen mit 100 ml 50 mM Natriumphosphat
pH 7,0, und voräquilibriert
mit 200 ml 2,2 M (NH4)2SO4 in 50 mM Natriumphosphat pH 7,0, geladen.
Anschließend
wurde die Säule
mit 2,2 M (NH4)2SO4 in 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,0 gewaschen,
bis eine Grundlinie erreicht war. Sodann wurde ein 200-ml-Gradient
von 2,2 M (NH4)2SO4 in 50 mM Natriumphosphat pH 7,0 bis 50
mM Natriumphosphat pH 7,0, der kein (NH4)2SO4 enthielt, bei
einer Fließgeschwindigkeit
von 2 ml/min 100 min laufen gelassen. Fraktionen von 4 ml wurden
gesammelt und unter Anwendung des gleichen Verfahrens, das oben
beschrieben ist, getestet. Die aktiven Fraktionen wurden auch durch
SDS-PAGE analysiert, was zeigte, dass die Lysophospholipase 90–95% rein
war.
-
Beispiel 12: Proteinsequenzierung
und Aminosäureanalyse
von rekombinanter Fusarium venenatum-Lysophospholipase
-
Die
N-terminale Sequenzierung einer halb aufgereinigten Lysophospholipase,
die wie in Beispiel 11 beschrieben erhalten wurde, und einer ungereinigten
Lysophospholipase, die aus einem Nährmedium (5 Tage), hergestellt
wie in Beispiel 10 beschrieben, isoliert wurde, wurde auf einem
Applied Biosystems 476A Proteinsequenzierer (Perkin Elmer/Applied
Biosystems Division, Foster City, CA) mit angeschlossener HPLC und Flüssigphasen-Trifluoressigsäure (TFA)-Abgabe
durchgeführt.
Mit den Lysophospholipase-Präparationen
wurde eine SDS-PAGE unter Verwendung von 8- bis 16%igen Novex-Trisglycin-SDS-PAGE-Gelen
unter reduzierenden Bedingungen in Gegenwart von 1 mM PMSF durchgeführt. Die
Gele wurden 2 h auf PVDG-Membranen (Novex, San Diego, CA) bei 25
Volt in 10 mM CAPS pH 11,0 Puffer umgeblottet. Die PVDF-Membranen
wurden in 0,1% Coomassie-Blau R 250 in 40% Methanol/1% Essigsäure angefärbt und
die festgestellten Banden ausgeschnitten. Die ausgeschnittenen Banden
wurden aus einer Blotpatrone unter Anwendung von Sequenzierungsreagentien
(Perkin Elmer/Applied Biosystems Division, Foster City, CA) sequenziert.
Der Nachweis von Phenylthiohydantoinaminosäuren wurde durch online-HPLC
unter Verwendung von Puffer A, enthaltend 3,5% Tetrahydrofuran in
Wasser mit 18 ml des Premix-Konzentrats (Perkin Elmer/Applied Biosystems
Division, Foster City, CA), enthaltend Essigsäure, Natriumacetat und Natriumhexasulfonat,
und Puffer B, enthaltend Acetonitril, durchgeführt. Die Daten wurden gesammelt
und auf einem Macintosh IIsi unter Einsatz der Applied Biosystems
610 Data Analysis-Software ausgewertet.
-
Die
SDS-PAGE der gereinigten Lysophospholipase ergab Hauptbanden bei
ungefähr
130 kDa und 90 kDa und Nebenbanden bei ungefähr 45, 40 und 35 kDa. Die Molekulargewichte
wurden auf zuvor gefärbte
Multi-Mark SDS-Page-Marker bezogen, die nicht die exakten MW-Bestimmungen
wiedergeben. Die N-terminale Sequenzierung der ausgeschnittenen
Banden erzeugte die folgenden Sequenzen.
- Lauf Nr. AB0909 – 130-kDa-Bandensequenz:
ALPDSPSGGY (SEQ ID NO. 2)
- Lauf Nr. AB0910 – 90-kDa-Bandensequenz:
NTAKYWDDIKDTVDEKADGW (SEQ ID NO. 2) (internes Peptid, auf Leucin
folgend)
- Lauf Nr. AB0912 – 45-kDa-Bandensequenz:
ALPDSPSGGYA (SEQ ID NO. 2)
- Lauf Nr. AB0913 – 40-kDa-Bandensequenz:
ALPDSPSGGYAPKV(SEQ ID NO. 2)
- Lauf Nr. AB0915 – 35-kDa-Bandensequenz:
ALPD(S)P?GGYAP (SEQ ID NO. 2).
-
Die
SDS-PAGE der ungereinigten Lysophospholipase ergab, bezogen auf
Novex Mark 12-SDS-Page-Marker,
eine Hauptbande bei 116 kDa. Die N-terminale Sequenzierung der ausgeschnittenen
116 kDa-Bande erzeugte die folgende Sequenz:
- Lauf Nr. AB0917 – 116-kDa-Bandensequenz:
ALPDSPSGGYAPKVVD?P (SEQ ID NO. 2)(?=Cys, welches ohne Modifizierung
im Edman-Abbau nicht nachgewiesen wird). Der N-Terminus schien offenbar
mit einem 20 Aminosäure-Propeptid
verarbeitet zu werden. Die Spaltung erfolgte nach einem Arginin.
-
Die
gesamten Ergebnisse sind wie folgt zusammengefasst:
Signalsequenz:
MLGPLVFTLWLTSSAIA (SEQ ID NO. 2)
Propeptid: APDDAGLVAAPAIGKSLSIR
(SEQ ID NO. 2)
N-Terminus: ALPDSPSGGYAPKVVDCP (SEQ ID NO. 2)
-
Beispiel 13: Charakterisierung
von rekombinanter Fusarium venenatum-Lysophospholipase
-
Die,
wie in Beispiel 11 beschrieben, gereinigte Lysophospholipase wurde
unter Verwendung von Lysolecithin, Dilauroyl-L-phosphatodylcholin
und Lecithin als Substrate getestet. Der Test wurde wie folgt durchgeführt: Die
Lysophospholipase-Aktivität
in den Kulturüberständen wurde
auch unter Verwendung von Eigelb-Lysolecithin als Substrat mit einem
NEFA C-Testkit (Wako Chemicals, Richmond, VA) gemessen. Insbesondere
wurde eine 10-μl-Probe
des Überstands
zu 160 μl
20 mM MOPS pH 7,0 Puffer und 30 μl
einer Stammlösung
von 4 mg Lysolecithin, 5 mg Dilauroyl-L-phosphotidylcholin (dispergiert
durch Ultraschall) oder 5 mg Lecithin (dispergiert durch Ultraschall)
pro ml 100 mM NaCl zugesetzt und 20 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden
20 μl der
Reaktion zu 200 μl
Wako Chemicals Reagens A zugesetzt und 10 min bei 37°C inkubiert.
Schließlich
wurden 400 μl
Wako Chemicals Reagens B zugesetzt und die Lösung für weitere 10 min bei 37°C inkubiert.
Die Extinktion bei 550 mM wurde durch Überführen von 200 μl der Endlösung in
eine 96-well-Platte und Messen der Extinktion mit einem SpectraMax
Modell 340 relativ zu einer mit Oleinsäure als Standard erstellten
Standardkurve gemessen. Mit L-Phosphatidylcholin und Lecithin als
Substrat wurde keine signifikante Aktivität festgestellt.
-
Das
pH-Optimum der Lysophospholipase wurde wie folgt bestimmt: Lösungen von
0,125 M Glycinacetat-MES-Phosphat wurden bei pH 2, 3, 4, 5, 6, 7
und 8 hergestellt. Ein 50-μl-Volumen einer 16
mg/ml-Lösung von
Lysophosphatidylcholin, Lauroyl in 100 mM NaCl wurde bei den verschiedenen
pH-Werten zu 445 μl
der Pufferlösung
zugesetzt, worauf 5 μl
der Enzymlösung
folgten. Nach 5 min Inkubation wurden zum Stoppen der Reaktion 1
ml 5% TCA und anschließend
1,5 ml Hexan und 0,5 ml Ethanol zugesetzt. Die Lösung wurde verwirbelt, und
500 μl der
Hexanschicht wurden entnommen und in ein konisches Röhrchen gegeben.
Das Hexan wurde unter Stickstoff verdampft, und die Fettsäuren wurden
unter Verwendung von Methyl 8 Reagens (Pierce, Rockville, IL) verestert.
Die resultierenden Proben wurden durch Gaschromatographie unter
Verwendung einer DB WAX-Säule
(Länge
30 m, LD. 0,32 mm, Film 0,5 μm)
(J&W Scientific,
Folsom, CA) und eines Temperaturgradienten von 100 bis 200°C bei 4°C pro min,
gefolgt von 200 bis 270°C
bei 35°C
pro min analysiert. Der Nachweis erfolgte durch Flammenionisation.
-
Ein
körniges
Fettsäuremethylestergemisch
(Supelco, Inc., Bellefonte, PA) wurde zum Bestimmen der Retentionszeit
für Lauroylfettsäuremethylester
und auch zur Quantifizierung der Fettsäurepeaks verwendet.
-
Die
Ergebnisse sind in 5 gezeigt. Bei pH 2 und 8 wurde
keine Hydrolyse des Substrats nachgewiesen. Das pH-Optimum wurde
als ca. 4–6
bestimmt.
-
Beispiel 14: Konstruktion
der Fusarium verticillioides-Lysophospholipase-cDNA-Bibliothek
-
Myzelien
von Fusarium verticillioides wurden ebenso hergestellt, wie in Beispiel
1 beschrieben. Poly A+-mRNA wurde aus den
Myzelien von Fusarium verticillioides isoliert, und die cDNA wurde
aus der Poly A+-mRNA mit BstXI- und NotI-Linkern
entsprechend synthetisiert, wie in Beispiel 2 beschrieben. Die cDNA
wurde nach den Anweisungen des Herstellers in den Hefeexpressionsvektor
pYES 2,0 (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) kloniert.
-
Beispiel 15: Tranformation
von Saccharomyces cerevisiae mit der Fusarium verticillioides-Lysophospholipase-cDNA-Bibliothek
-
Kompetente
Zellen von Saccharomyces cerevisiae YNG318 wurden unter Anwendung
des folgenden Verfahrens hergestellt. Saccharomyces cerevisiae YNG318
wurde in 20 ml YPD-Medium über
Nacht bei 30°C wachsen
gelassen. Eine ausreichende Impfkultur wurde in 300 ml YPD-Medium übergeführt und
3 h bei 30°C bei
230–250
U/min kultiviert, bis die OD600 = 0,2–0,3 betrug.
Anschließend
wurden die Zellen durch Zentrifugation bei 5000 U/min für 5 min
bei 20°C
geerntet. Das Pellet wurde in 50 ml sterilem Wasser suspendiert,
und die Suspension wurde wiederum zentrifugiert. Anschließend wurde
das Pellet in 1,5 ml 1X TE/LiAc suspendiert, und Glycerin wurde
bis auf eine Endkonzentration von 15% zugesetzt. Die kompetenten
Zellen wurden bei -80°C
bis zur Verwendung gelagert.
-
Die
Transformation von Saccharomyces cerevisiae YNG318 wurde mit der
in Beispiel 14 beschriebenen Fusarium verticillioides-cDNA-Bibliothek
unter Anwendung des folgenden Verfahrens durchgeführt. Ein 100-μl-Volumen
kompetenter Zellen wurde auf Eis aufgetaut und in ein steriles Röhrchen übergeführt, das
10 μl Carrier-DNA
(Hefemarker Carrier-DNA;
Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) enthielt. 1 μg Plasmid-DNA
aus Beispiel 14 wurde dem Röhrchen
zugesetzt, und das Röhrchen
wurde vorsichtig gemischt.
-
Anschließend wurden
dem Röhrchen
0,6 ml sterile PEG/LiAc-Lösung
zugesetzt. Das Röhrchen
wurde unter Schütteln
bei 200 U/min 30 min bei 30°C
inkubiert und sodann 15 min bei 42°C Wärmeschock-behandelt. Nach dem
Wärmeschock
wurde das Röhrchen
auf Eis gebracht und sodann 5 s zentrifugiert. Der Überstand wurde
entfernt, und das Pellet wurde in 1,5 ml YPD gelöst. Die Zellen wurden bei 30°C unter Schütteln bei
200 U/min 45 min inkubiert. Die Transformanten wurden auf sterilisierte
Cellulose-Acetat-Filter ausgestrichen, auf SC Ura-glc-Platten übergeführt und
1 Tag bei 30°C
inkubiert. Die Celluloseacetatfilter wurden auf sterilisiertes Hybond-N+-Filter übergeführt, auf
SC Uragal-Platten angeordnet und 3 Tage bei 30°C inkubiert.
-
Insgesamt
wurden 89000 Hefe-Transformanten erhalten und unter Anwendung des
folgenden Verfahrens auf die Expression der Lysophospholipase-Aktivität gescreent.
Hybond-N+-Filter wurden auf Testplatten angeordnet und über Nacht
bei 30°C
inkubiert. Eine Transformante, die p87YES enthielt, zeigte auf der
Testplatte eine Lysophospholipase-Aktivität als einen grünen Halo.
-
p87YES
wurde aus der Hefe-Transformante unter Anwendung des folgenden Verfahrens
gewonnen. Die Hefe-Transformante wurde bei 30°C in 1,5 ml YPD-Medium über Nacht
wachsen gelassen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet,
und das Pellet wurde in 100 μl
STET resuspendiert. Eine Menge von 0,2 g 0,45-mn-Glasperlen wurde
zugesetzt, und sie wurden 5 min mit einem Vortex-Verwirbler vermischt.
Weitere 100 μl
STET wurden zugesetzt, und das Röhrchen
wurde 3 min gekocht. Ein 100-μl-Volumen
des Überstands wurde
in ein frisches Röhrchen übergeführt, und
die Plasmid-DNA wurde mit Ethanol ausgefällt. E. coli HB101 wurde unter
Anwendung von Standardverfahren mit der ausgefällten Plasmid-DNA transformiert.
p87YES wurde aus einer der E. coli-Transformanten isoliert und seguenziert,
um die Nukleotidsequenz des Fusarium verticilloides-Lysophospholipase-Gens
zu bestimmen.
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Beispiel 16: Nukleotid-Sequenzierung
und Charakterisierung der Fusarium verticillioides-Lysophospholipase-cDNA
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Die
DNA-Sequenzierung von p87YES wurde mit einem automatisierten ABI
PRISM 320 Genetic Analyzer DNA Sequencer unter Verwendung des Dye
Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit nach den Anweisungen
des Herstellers durchgeführt.
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Der
Lysophospholipase-Klon codierte ein offenes Leseraster von 1944
bp, der ein Polypeptid von 648 Aminosäuren codierte. Die Nucleotidsequenz
(SEQ ID NO. 15) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO. 16)
sind in den 6A, 6B und 6C gezeigt.
Unter Verwendung des SignalP-Programms (Nielsen et al., 1997, supra)
wurde ein Signalpeptid von 16 Resten vorhergesagt. Somit besteht
die reife Lysophospholipase aus 632 Aminosäuren.
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Ein
Vergleichsanordnung von Lysophospholipase-Sequenzen wurde unter
Verwendung des Clustal-Verfahrens (Higgins, 1989, CABIOS 5:151–153) unter
Einsatz der LASERGENETM MEGALIGNTM-Software (DNASTAR, Inc., Madison, WI)
mit einer Identitätstabelle
und den folgenden multiplen Anordnungsparametern vorgenommen: Gap
penalty 10 und Gap Längen-penalty
10. Die paarweisen Anordnungsparameter waren Ktuple=1, gap penalty=3,
windows=5 und diagonals=5.
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Die
Vergleichsanordnung zeigte, dass sich Fusarium verticillioides-Lysophospholipase
die Identitätsregionen
mit den Phospholipase-Proteinen Neurospora crassa zu 55,4% (042791),
Penicillium notatum zu 49,3% (Swissprot P39457), Saccharomyces cerevisiae
zu 37,0% (EMBL L23089) und Torulaspora delbrueckii zu 38,3% (EMBL
D32134) teilt. Die Identitäten
sind zwischen den Regionen am größten, die
wahrscheinlich für
die katalytischen und/oder strukturellen Rollen des Enzyms von Bedeutung
sind.
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Hinterlegung
der biologischen Materialien
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Die
folgenden biologischen Materialien wurden im Sinne des Budapester
Vertrags mit der Agricultural Research Service Patent Culture Collection,
Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria,
Illinois, 61604 und dem Centaalbureau voor Schimmelcultures, Oosterstraat
1, P.O. Bos 273, 3740 AG Baarn, Niederlande, hinterlegt, und ihnen
wurden die folgenden Zugangsnummern gegeben:
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Die
hier beschriebene und beanspruchte Erfindung soll im Umfang nicht
durch die hier offenbarten speziellen Ausführungsformen eingeschränkt sein,
da diese Ausführungsformen
als Erläuterungen
der verschiedenen Aspekte der Erfindung beabsichtigt sind. Alle
entsprechenden Ausführungsformen
sollen im Umfang dieser Erfindung liegen. In der Tat werden den
Fachleuten aus der vorhergehenden Beschreibung, zusätzlich zu
den hier gezeigten und beschriebenen, verschiedene Modifikationen
der Erfindung klar. Solche Modifikationen sollen ebenfalls in den
Umfang der beigefügten
Ansprüche
fallen. Im Konfliktfall kontrolliert die vorliegende Offenbarung
einschließlich
der Definitionen.
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Es
sind hier verschiedene Druckschriften zitiert, deren Offenbarungen
durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit eingeschlossen sind. SEQUENZLISTUNG