PT1786908E

PT1786908E - Plantas com um aumento da actividade da enzima de fosforilação do amido r3 nos plastídeos

Info

Publication number: PT1786908E
Application number: PT05772662T
Authority: PT
Inventors: Claus Frohberg
Original assignee: Bayer Cropscience Ag
Priority date: 2004-08-18
Filing date: 2005-08-18
Publication date: 2010-04-29
Also published as: PL1786908T3; SI1786908T1; EP1786908A1; ATE459720T1; EP1786908B1; ES2340183T3; AR050299A1; WO2006018319A1; DK1786908T3

Description

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DESCRIÇÃO "PLANTAS COM UM AUMENTO DA ACTIVIDADE DA ENZIMA DE FOSFORILAÇÃO DO AMIDO R3 NOS PLASTÍDEOS" ;ãC ‘ do · imido em compa: r 3 n £ ío c« orn ciS >o se i v agem ou plantas de ti ipo g· eneticamente modifi .cad as. Além ação rt ;fere-se a co mpo siçõ es e célui as veaet ais e plantas. As !.S deste tipo s: Lnteti: zam um. ami i.do te f 8. ρ resente invenç ão refe re -se :ido r )elas cé lulas ve· geta is e A presente invenção refere-se a células vegetais e plantas que são geneticamente modificadas, conduzindo a codificação genética ao aumento da actividade de uma Proteína R3 de fosforii células veaetais de t plantas de acordo com a presente invenção, métodos para a produçião deste amido e produção dos derivados de amido deste amido modificado, bem como farinhas que contêm amidos de acordo com a presente invenção. Mais ainda, a presente invenção refere-se também a ácidos nucleicos codificadores de proteínas R3 de fosforilação de amidos e a vectores, células hospedeiras, células vegetais e plantas que incluem tais moléculas de ácido nucleico. Além disso, a presente invenção refere-se igualmente a proteínas R3 com uma actividade de fosforilação de amido. vez maior actualmente corno matéri as primas i g a ç á o b i o t e c η o 1 ó g i c a

Considerando a importância cada associada aos constituintes vegetais renováveis, uma das funções da inves 2 consiste em tentar adaptar estas matérias primas vegetais aos requisitos da indústria transformadora. De forma a tornar possível a utilização de matérias primas renováveis no maior número possível de campos de aplicação, é ta In riente nece ssár -j o chega: : § φ po: Lissacárido am ido 0 O Liner ite ur iíf on Τί β S f as nol; ui, no ei otanto, uma r ni s tu:c de moléculas que exib em. 3 polimer izaçc i 0 Θ rarr lifica ent . re si qua nto à s O U L õ S -S . Disti .ngue- "3Θ entre ci a muitas substâncias 53.s. ϋ polis sacando amido é constituído por unidades lar e diferentes >dem p. y -L. facilmente ilas de glucose, mas complexa de diferentes trenças relativamente ao lificação e, portanto, diferem is caracteristicas fisico-imiiose do amido, um polímero essencialmente nao ramificado constituído por unidades de glucose com ligações alfa-1,4-glicosídicas, e a amiiopectma do amido, um polímero ramificado, no aual as ramificações derivam da ocorrência de ligações adicionais alfa-16,-glicosidicas. Uma outra diferença essencial entre a amilose e a amilopectina reside no peso molecular. Enquanto a amilose possui, conforme a origem do amido, um peso molecular de 5χ105~106 Da, o da amiIopectina situa-se entre 10' e lu8 ua. As duas macromoléculas podem ser distinguidas pelo seu peso mole caracteristicas fisico-químicas, que tornadas visíveis pelas respectivas caracteristicas de ligação do iodo diferentes. A amilose tem sido, desde há muito, considerada como um polímero linear, constituído por monómeros de alfa-D-glucose com ligações alfa-1,4-giicosídicas. Em estudos mais recentes, concudo, for demonsurada a presença de pontos de ramificação alfa-1,6-glicosídico; 3 (Hizukuri e Takagi, Carbohydr. Res. 134, (1384),

Takeda et al., Carbohydr. Res. 132, (1384), 83-92).

As C 0 'JC Cl C t 0 . v- -j-- g C0 s funci Ο Π 0 is do amic lo, tal o orno, p or mp 1 o , a s o 1. ubil i da Ο Θ f O C :omportament O de retrog 1'- 0 d cl. Ç 0 O f capa cidade de li Cf 3. Ç 0 O da água, p 1Γ0 cteríst icas de maçã o de pel i .cr :1a, v isc osidade, pi :opr ieda :des de if ic 0 Ç cl O f est ab ilidade no c ic lo con gelaçã O cong Θ J. 0 Ç cl. O f Γ 0 S isl tência da gelific :aç I0O , dime nsáo da t í cu À. 3. do 3." mi do H ro Ca. s amido S Θ O LI t r db ca ra cteríst icas s d O afectadas pela proporção amilose/amilopectína, o peso molecular, o padrão da distribuição da cade. ia lateral, a concentração de roe s, o teor de lípidos e proteínas, O tamanho médi o de partícula do amido, tr íorf ologia d. a partícula de amido, etc. As característícas funcionais do amido são também afectadas pelo teor de fosfato, um componente do amido que não é um hidrato de carbono. Distingue-se, aqui, entre o fosfato com ligação covalente às moléculas de glucose sob a forma de monoésteres (posteriormente designados fosfato de amido) e fosfatos sob a forma de fosfolípidos associados ao amido. onteudo em fosfato de amido varia em função da var iedade da planta i. Assim, por exemplo, a lguns mutantes de arai do sintet i z ara iir ri amido com ui tí conteúdo maior de fosf a t o amido (ar rm.do ca :roso 0,002 % e milho com alto teor de ami 1 o s e 0,0) L3 %) , enquanto as espécies convencionais de milho apenas possuem vestígios de fosfato de amido. Encontram-se, igualmente, pequenas quantidades de fosfato de amido no trigo (0,001 %) enquanto que na aveia e sorgo não se detectou fosfato de amido. Do mesmo modo, encontra-se menos fosfato de amido em mutantes do arroz (amido ceroso 0,003 %) do que nas espécies convencionars de arroz 4 (0,013 %), Detectaram-se quantidades significativas de fosfato de amido em plantas sintetizadoras de amido bulbosas ou com raizes tuberosas, tal como por exemplo, a L cl p -1- '0 U 0 (0,00 8 % ), batata doce (0,011 %), araruta (0 ou bata ta (0, 0 8 9 %) . As percenl oagens acima indicadas concent ração de fosfato de arní do são baseadas em ca no peso seco do amido e foram determinadas por Jane 'j . H/ / — >0/) %), a ra r ut a { 0,0 21 %) 5 0. V 0. 0 (1996, Cereal Foods World 41 (11 0 fosfato de amido pode existir sob a forma, de monoésteres na posi ção C-2, C-3 ou C-6 dos monómeros de glucose polimerizados (Takeda e Hizukuri, 1971, Starch/Stãrke 23, 267-272), A distribuição do fosfato no amido sintetizado por plantas é normalmente diferenciada pelo facto de que aproximadamente 30 % a 40 % dos resíduos de fosfato têm \ ama ligação covalente na posição C- -3 e ap r o x i m a d a m e n t e 6 n r '0 a. 7 0 % dos resíduos fosfato têm uma 1 i g a ç ã. o c o v a 1 e n t e na posição C-6 das moléculas de glu cose (Blennow et al„, Int . J. o f Biologícal Macromolecules 27, 211-218), Blennow et al. (20 00, Carbonydrate Polymers a 1 í 163-174) determinou uma concentração de fosfato de amido ligada na posição C-6 das moléculas de glucose para vários amidos, tais como amido de batata (entre 7,8 e 33,5 nMol por mg de amido, conforme a espécie), amido de várias espécies de Curcuma (entre 1,8 e 63 nMol por mg), amido de tapioca (2,5 nMol por mg de amido), amido de arroz (1,0 nMol por mg d. e amido), amido de feijão m ungo (3 ,5 nMol por mg de amido) e amido de sorgo (0,9 nMol por mg de amido). Nenhum destes autores detectou a existência de fosfato de amido ligado na posição C-6 em amido de cevada e em amido de diferentes mutantes cerosos c le milho. Não se estabeleceu ainda qualque r ligação entre o genotipo de uma planta e a 5 5 concentração de fosfato de amido (Jane et al., 1995, Cereal Foods World 41 ( Ί 1 \ .1. _L / / 827-832) , Actualmente não é possível influenciar a concent. ração de fosfato de amido em plantas através de m •~\ }- /~\ ,Ό ,·'\ L- O O. lu s de produção de plantas.

Foi apenas descrita uma proteína que medeia a introdução de ligações covalentes de resíduos de fosfato em moléculas de glucose do amido. Esta proteína possui a actividade enzimática de uma alfa-glucano-água-diquinase (GWD, E.C. : 2.7.9.4) (Ritte et al,, 2002, PNAS 99, 7166- 7171), é frequentemente designada RI na literatura cientifica e está ligada aos grânulos de amido do amido de armazenagem em tubérculos de batata (Loberth et al., 1998, Nature Biotechnology 16, 473-477). Considerando que o amido de armazenamento é sintetizado em plastídeos (amiloplastos) e a proteína RI é ligada a estas partículas de amido, mas codi .f. .1. c a da P 0.1Γ áCu í-dos nuc lei C'* pi t sequ ênc .1.8. (j.0 am ino ác idos é f acu. para o pias í aico (t ransit ) (Lo: Biot ech nolo CP v 16, Ζί Ί 3 ~ · 4 7 7) • Na os m ;a.te r i a i s de pa .rt id; a a d -f a- de ader íosir ra ( ATP ) Θ ágr Ld são f osf ato de gli ucano { f o s: f at 0 mono t O s fato cie adenosi na. Em s fosf Ί— q do A TP Θ G ransJ Ler i do pa: f osf Ur -f~ ί"'' do ATP é tra ms fer: i dn pa

Localizados no núcleo, a

Na reacção catalisada por Rl, dut< sao convertiaos noí mansfere o resíduo beta-fosfato in vitro do ATP cara

po S1. çõe s C- 6 e C - "3 dei s moléci ulas de gl' ucose de alfa l-1, 4- gl uc ano s . A P l-S o P o rção de fosf a to C- 6 p -arr i fosf (ato n... Q que é ob ti da atra vés da reacçã G .Π vi tro co rre ;spond .e à proporç á o e exi ste no ami .GO 1. S 0.1 .ado a part . i r Q6 plan tas (Rit te 6t al »( 2002, PNAS 99, 71 66-71. ?D . O o j Q cerca de 7 0 O Ό dO 6 fosfato de amido presente no amido de batata se encontra na posição 0-6 e cerca de 30 % na posição 0-3 dos monómeros de glucose do amido, quer dizer que RI fosforila de preferência a posição C-6 das moléculas de glucose. Além disso, demonstrou-se com Rl, entre outros aspectos, que a utilização de amilopectina de milho permite a fosforilação Ri de alfa-1,4-glucanos, que não contêm ainda fosfato com ligação covalente (Ritte et al., 2002, PNAS 99, 7166-7171), isto é Rl é capaz de introduzir fosfato de novo em alfa-1,4-glucanos.

As sequências de ácidos nucleicos e sequências de aminoácidos correspondentes, codificadoras de uma proteína Rl encontram-se descritas a. partir de diferentes espécies, tal como a batata (WO 97 11188, GenBank Acc.: AY027522, Y09533), trigo (WO 00 77229, patente norte-americana n° 6, 462,256, GenBank. Ace: ΆΆΝ93923, GenBank. Ace: A.R236165), arroz (GenBank Ace: A.AR61445, GenBank Ace: AR40G814) , , milho (GenBank Ace: AAR61444, GenBank Ace: AR400813), soja (GenBank Ace: AAR61446, GenBank Ace: AR400815), limão (GenBank Acc.: AY094062) e Arabidopsis (GenBank Acc.: AF 312 0 2 7) .

Na W0 02 34923 descreve-se plantas do trigo com uma d. u L ividade acresc rida de uma proteína Rl em resultado d cl. sob r e e xpre s s ã o de um gene Rl da batata. Em. comparação com as plantas tipo sei vagem, nas quais não foi detectado qua Iquer fosfato de amido, estas plantas sintetizam um ami do com quantid aae s significativas de fosfato de amido na pos ição C-6 das m OléC: alas de glucose. Não foram descritas outras proteínas que catalisem uma reacção que introduz grupos de fosfato com ligação 7 covalente em amido, assim como en; i i ma s conheci .das que í nt.ro d uzam preferenci aimente grupos c le f osfato na posição C-3 e/ 'ou posição C-2 das moléculas d e g lucose do amido A parte do aumento do teor de fosfato de amido em plantas, também não existem vi .as para influenc iar especific amente a fosforilação do amido em plantas, de modificar a. distribuição do fosfato no amido sintetizado por plantas e/ou aumentar mais o teor de fosfato de amido. 0 objectivo da presente invenção consiste, assim, no fornecimento de mais possibilidades de geração de amidos modific ados com teor de fosfato acres eido i s/ou proporcionar células veaetai s e / ou plantas que si ntet :izam este amido modific ado, bem como métodos e me i o s P 3. IC 3 a geração destas plantas e/ou células vegetais.

Este objectivo é alcançado nas formas de utilização designadas nas reivindicações

Deste modo , a pre sente rnvenç ão refere-se a células ve geta is genet: Ícamente modif: Lcadas e olantas aenet icamente modificadas, en i que os plastídeos p: resentes em. tais células vegetais ou plantas incluem uma prote :ína R3 . A presente invenção refere-se iaualment Ί.Β a célu ilas vegetais e plantas aenet icamente m< sd.i ficadas, em que 0 s plastídeos presentes em tais célula s vegetai c; ou piar itas apresentam uma activrdade acrescida de, pel o menos, uma proteína R3 comparativamente aos pl . astideos pr '03Θ .Γ.Ι C 0 S em células vegetais do tipo selvagem que não foram geneticamente modificadas.

Um primeiro aspecto da presente invenção refere-se a células vegetais e plantas que são geneticamente modificadas, conduzindo a modificação genética à presença 8 de urna proteína R3 ou a um aumento da actividade de, pelo menos, uma proteína R3 nos plastídeos presentes nestas 8 oélulas vegetais ou plantas em comparaçã :om plast ídeoí presentes nas células vegetais de tipo selvagem ou plantas de tipo selvagem correspondentes que não foram geneticamente modificadas. A modificação genética pode ser tomar a forma de qualquer modificação genética conducente a um aumento da actividade de pelo menos uma proteína R3 nos plastídeos presentes em células vegetais geneticamente modificadas ou plantas geneticamente modificadas em comparação com as células vegetais do tipo selvagem e plantas do tipo selvagem correspondentes que não foram geneticamente modificadas.

No contexto da presente invenção, o termo "célula vegetais de tipo selvagem" significa que as células vegetais em questão foram utilizadas como material de partida para a produção das células vegetais de acordo com a invenção, isto é, a sua informação genética, independentemente da modificação genética introduzida, corresponde à de uma célula vegetal de acordo com a presente invenção.

No contexto da presente invenção, o termo "planta de tipo selvagem" significa que as plantas em questão foram utilizadas como material de partida para a produção das plantas de acordo com a invenção, isto é, a sua informação genética, independentement ,o da modificação genética introduzi da, corresponde à de uma planta de acordo com a presente invenção. No contexto da pr ese yo -j” íti i nven ç ã o, o te rmo "correspo ndente" significa que , er n comparação com vários 9 ,,h-wv- ,-,Q ob jectos eiTl Questão que são comparactos entre \J xõ j v- V-· m O / gv O ' J- si foram mantidos nas mesmas condições. No contexto da Ό1?iri sente i nvenÇo t e rm o "correspondentes", das c é 1 u 1 a s v ® 13 ^L·a *· ^ do t ipo selvagens e piam sei vagens, signlI1Ga que a s células vegetais ou são comparadas enure si í -oram produzidas em c cultura idênticas e têm uma idade (cultura) idêntica. no contexto do tiDo

No contexto da presente invenção, o termo "plastídeo" é entendido como organelos celulares que existem apenas nas células vegetars e os quais são circunciâO-aS por um α. loi camada e possuem o seu próprio sistema genético (plastoma, aparelho de transcrição e aparelho de trao.uçciO, . Gs p] .astídeos, os quais sao pre: invenção, são cromoplast o c ipecialmei ite preferidos os pi :ef erênci; a a m i 1 op 1 a s t o s. preferidos no contexto da presente e leucoplastos, senso .oroplastos e com particular

No âmbito da presente invenção, o termo "actividade acrescida de pelo menos uma proteína R3" significa um aumento da expressão de genes endógenos codificadores aas proteínas R3 e/ou um aumento da quantidade de proteína Ri nas células e/ou um aumento da actividade enzimática das proteínas R3 nas células, 0 aumento na expressão pode ser determinada, por exemplo por meio da medição da quantidade de transcrições codificadoras das proteínas R3, por exemplo, através da análise Northern blot ou por RT-PCR. Neste caso, um aumento significa ae preferência um aumento da quantidade de transcrições em comparação com as células correspondentes que não foram; geneticamente modificadas de pelo menos 50%, em particular pelo menos /0%, de preferência pelo menos » os 10 e com particular preferência pelo menos 100%. Um aumento na quantidade de transcrições codificadores da proteína R3 significa ígualmente que as plantas ou células vegetais que não possuem quantidade detectável de transcrições codificadores da proteína R3 incluem, após modificação genética de acordo com a invenção, quantidades detectáveis de transcrições codificadoras da proteína R3. 0 aument o da quantidade da protu 5ína R3, a qual implica uma activid ade acrescida G 6StciS proteínas 113. S Ο Θ ,J_ U .1.3 S vegetais em questão, pode ser det erminado, por exemplo, através de métodos imuno1 ógícos t al como a análise de Western blot , ELISA (ensaio imuno-en z irnát ico) ou RIA (radio imuno ensaio) Neste caso, um aumento significa de preferência um aumento da quantidade da proteína R3 em comparação com as células correspondentes que não foram geneticamente modificadas de pelo menos 50%, em particular >elo menos 70%, de preferência pelo menos 85% e com part ícular preferêr icía pelo menos 100%. Um aumento da quan tidade de uma proteína R3, s: Lgnifica também que as pi an tas ου células vegetais que não pos suem actividade de te Ο Τ' ~J fA j de uma proteína. R3 possuem uma quantid; ade detect ável de uma p roteína R3 após modificação genética de acordo com a presente invenção. Métodos para aumentar anticorpos que reagem específicamente a determinadas proteínas, isto é, que se ligam específicamente à citada proteína, são conhecidos dos especialistas (ver, por exemplo, Lottspeich e Zorbas (Eds.), 1998, Bioanalytik, Spektrum Akad. Verlag, Heidelberg, Berlin, ISBN 3-8274-0041-4). Estes anticorpos são aumentados comercialmente por algumas companhias (por exemplo, Eurogentec, Bélgica). 11

Pode detectar-se a localização de uma proteína R3 em plastídeos de plantas geneticamente modificadas através de fraccionamento sabcelular de células vegetais, onde se podem obter plastídeos intactos. Métodos para fraccionar compartimentos subcelulares são conhecidos dos especialistas e descritos na literatura, (ver, por exemplo, Heldt, 1996, "Pflanzenbiochemie", Spektrum Akad. Verl., ISBN 3-8274-0103-8; Plant Biochemrstry, 1997, Dey e

Harborne Ed., Academic Press, ISBN 0-12-214 67 4-3) O material de partida, que pode ser empregue para isolar plastídeos inclui partes de plantas (por exemplo, folhas) ou protoplastos. Se as partes de plantas forem empregues como material de partida, as células são fragmentadas primeiro pelas partes das plantas que são cortadas em pequenas secções e subsequentemente divididas num misturador. O homogenato celular daí resultante é subsequentemente sujeito a. centrifugação.

Um outro método para preparação de um homogenato celular que inclua plastídeos começa pela preparação de protoplastos que são subsequentemente fragmentados. Esta fragmentação ocorre pela suspensão d. o protoplasto que é compri mi do contra numa malha com uma dimensão de malha menor que o tamanho dos protoplastos. 0 homogenato celular dai re :su it ante e subsequ lentemente sujei'! to a centi :if ugação. O último método mencionado é particularmente apropriado para. a preparação do 1 íomogenato celular de plantas de cereais, cu j o hornogenat o incluí plastídeos intactos O homogenato celular pode ser purificado recorrendo a. centrifugação diferencial ou. centrifugação de densidade. 12

No caso de centrifugação diferenciai,- os homogenatos celulares são centrifugados num meio cuja densidade é inferior ao dos organelos celulares. A taxa de sedimentação dos organelos individuais depende principalmente do tamanho da partícula. Os organelos individuais são separados efectuando-se uma pluralidade de centrifugações, uma a seguir à outra, com uma velocidade crescente. Após cada centrifugação efectuada, os organelos em questão encontram-se s e d i meu ta do s.

No caso de centrifugação de equilíbrio, os organelos são separados de acordo com a densidade num meio de centrifugação que consiste em meios diferentes de várias densidades, as quais são colocadas umas em cima das outras. A densidade do meio individual diminui de baixo para cima. A centrifugação é realizada até que todas as partículas do homogenato celular terem alcançado a zona correspondente à sua dens ± cl. 3. cl Θ 1 5 desci rito o í s o: L amen .t o de amiu .oplastos Inta í~< Τ' o Q w V.- O ? j_ n £, er alia, para a bat ata (Wi schmann et aí L « ; 1999 , Pií mt PI oysiology 119, 455-46 2) , ml 11 ao (Eche veria et 198 0 h Pie int Pnysio.: L ogy 8 6, 7 8 í 5-792 ) Θ trigo Ί :et.low Θ r. al., 19 9: 3, PI bnf- J. J. 3 j. 8 c, rq o, „/ I -600) , ervi 1 h a (Smith 0"l 3.. '·- * r 1990 , Pia .nt a 1 80, 517-52 3) . 28 3 se de tu a minar 3 pureza. de uma prepaj -ação de organelos, podem medir-se determinadas enzimas de principais, as quais são específicas dos organelos em questão, em fracções individuais de organelos As enzimas principais para determinados organelos ou compartimentos subcelulares são conhecidas dos especialistas e mencionadas inter 31 3 em Strasburger, 19 9 9, "Lehrbuch der Bot ani k" [Manual de Botânica], 34a Edição, Spektrum Akad Ve r1., ISBN 3-82 74- 0779-6 A fracçã .o dos c ompar •timentos 13 13 qu R3 de bc :ei u 1 a res que 1 nc luern r-» U J. J .to à presença ou âCt .1. Esta análise pode ser métodos imunológicos ou p 1 a s t í de o s p o d e s e r a n a 1 i s a d a idade acrescida de uma proteína efectuada, por exemplo, através por detecção da actividade na fracção dos plastídeos.

No âmbito da presente invenção, o termo "proteína R3" pressupõe significar uma proteína que transfere um resíduo fosfato de um nucleosídeo trifosfato para amido.

As sequências de aminoácidos codificadoras das teínas R3 corr têm um domínio i o s f o -histidina. Os domínios fo-histidina Sao dPSrT1 t np por exemplo, por Ί lien-Shin et al. (200 1, Plant Ce11 13, 1907-1918), 0 dornín io f osf o--hist idína da protein R3 Arabidopsis thaliana apresentado em SEQ ID NO 5.

Comparativamente a uma proteína Rl, as proteínas R3 não têm peptídeo sinal plastídico nas sequências aminoácidas que as {naturalmente) codificam, isto é, as proteínas R3 codificadoras de ácidos nucleicos endogenos de plantas(ácidos nucleicos que ocorrem naturalmente no genoma da planta) estão localizadas fora dos plastídeos.

Dura nte a cataiise de um a rea cçao de íosrorilaçao U0 amido F dá lug 6. rr a urna proteír r a R3 fosforilada como produ lo intermeo Íiário, por meie ) do qual a ligado covalentemente um resíduo fosfat .o do ΆΤΡ a um am mo ácido da proteína R3. 0 produto inter nnedi ário resul . t a c la autofosforilação da proteína R3, isto é, a própria proteína R3 catalisa a reacção que conduz ao produto intermediário. A autofosforilação fosforila preferencialmente um resíduo de histidina da sequência de aminoácidos codificadora de uma proteína R3, com particular preferência um resíduo de 14 ai stidina que f aça parte de um domin .1. G ΐ G S I- 0 -hist id .i na (Tien-Shir i Yu et al., 2001 , Plant Ce11 13, 19 0 7 -1 318) .

Uma vez que, para além da Rl, não foram descritas enzimas que fosforilarn o amido, não foi possível identificar o aumento da concentração de fosfato de amido em plantas com a ajuda de outras enzimas. Esta operação só é possível através da utilização de uma proteína de acordo com a presente invenção ou uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção para modificação genética de nt as. Uma vez que, para alén i da Ri, não foram descritas imas que fosforilarn o amido, não foi possível identificar o aumento da concentração de fosfato de amido em plantas com a ajuda de outras enzimas.

No contexto da presente invenção, o termo "fosfato de amido" pressupõe grupos fosfato com ligação covalente as moléculas de glucose do amido. A actividade de uma proteína R3 pode ser identificada, por exemplo, por incul oação de uma proteína R 3 ir 2 vitro ut i lizando nu C λ. Θ G S .1. G Θ 0 t r i f o s f a t o s que incluem um resíduo de fosfato marcado (nucleosldeo trifosfato ma rcado).

Nucleosídeos trifosfato marcados radioactivamente são preferencialmente utilizados para este fim.

Resíduos de fosfato marcado que foram incorporados em amido por uma proteína R3, podem ser identificados, por exemplo, através da separação do amido marcado {} ?or exemplo, através da centrifugação, de p r ecipitação de etanol, filtração, métodos de cromatograf ia, etc) do resíduo da mistura reaccional e subsequente detecção do resíduo de fosfato marcado na fracção amido. Neste contexto, os resíduos de fosfato marcados ligados na 15 15 >ossxveis por exemp 1 o p or m ei o oact ividad e ex d-ste 1-j f- ?io de um cont a dor de m Mé todos Gera is I tem de uma p. rote: ína qu e para uma reacção de na fracção amido (por exem cintilações) . São abaixo d< 3, os método de detecção necessite de amido como fosforilação. As posições dos átomos de carbono (C---2, C-3 ou C-6) dos monómeros da glucose no amido,

preferencialmente fosforilados por uma proteína R3, podem ser determinados, por exemplo, pela análise dos amidos F que foram fosforilados por uma proteína tal como descrito em Ritte et al. (2002, PNAS 99, 7166-7171). Com este objectivo, um amido fosfori lado por uma proteína é hidrolisado utilizando um ácido e pósteriormente analisado por meio de cromatografia de permuta de aniões.

De preferência, o amido fosforilado por uma proteína R3 é analisado preferencialmente por meio de RMN 31-P ou 33P, de modo a estabelecer as posições dos átomos de carbono (C- 2, C-3 ou C-6) dos monornei :os de glucose no amido F que são fosíoriladas. Um método part icularmente pref er. ido de identificação < das posições dos á tomos C de uma molé cuia de glucose de um amido, que são fo sforiladas por uma reacção catalisada por uma proteína R3, é descrito mais à frente, em Métodos Gerais, ponto 4.

A sequência de aminoácidos revelada na SEQ ID NO 2 codiflca a proteína R3 da A de aminoácidos revelada na SEQ ID NO p.t r;ot«=-na P.3 ae Arabidopsis thaliana, a sec :ia de gjtiinoacrdos revelada na SEQ ID NO 2 em fusão (traducional) c0m “Πι peptrdeo sinal plastídico, dando lugar a uma gequ^“'-J.a ae aminoácidos recombinante que codifica uma 16 proteína R3, a qual, para além da. sua sequência de ami no ácidos codificadora, tem um peptídeo sinal plast.ld.ico. mente i preferido pelo menos 90% e e s p e ciaime nt e do pelo menos 95% com a sequência e s p e c i f i c a da n a N° 2 ou SEQ ID N° 4 .

Numa outra concret i z ação da presente invenção, as sequências de aminoácidos codificadoras de proteínas R3 possuem uma identidade de pelo menos 60%, em particular de pelo menos 70%, de preferência de pelo menos 80% e particui

Numa outra concretização da presente invenão, a proteína R3 possui um domino fosfo-histidina (Tien-Shin Yu et al., 2001, Plant Ce 1.1 13, 1907-1918) . Sequências de aminoácidos codificadoras dai. proteína R3 que possui um domínio fosfo-histidina com pelo menos 85%, de preferência pelo menos 88%, com especial preferência pelo menos 91% e com particular preferência pelo menos 94% e com especial preferência pelo menos 97% de identidade com a sequência de aminoácidos do domínio fosfo-histidina da proteína R3 de Arabidopsis thaliana da SEQ ID RO 5.

Uma outra concretização da presente invenção refere-se a uma célula vegetal geneticamente modificada de acordo com a. invenção ou a uma piana geneticamente modificada de acordo com a invenção, em que a modificação genética, consiste na introdução de pelo menos uma molécula de ácido nucieico estranha no genoma da célula vegetal ou no genorna

Q.c'L

Neste contexto, o termo "modificação genética" significa a introdução de moléculas de ácido nucieico exógenas homólogas e/ou heterólogas no genoma de uma célula vegetal ou no genoma de uma planta, em que a dita 17 introdução destas moléculas conduz a um aumento da actividade de uma proteína R3. As células vegetais, de acordo c< om a invenção, ou as plantei; s f de acordo com a invenção, são modificadas no que se ref ere ; à sua informação genética pela introdução de uma molécu. 1 a de ácido nucleico GSt-ucí.0.ll 0 » A presença ou a expressão de uma molécula de ácido nucleico conduz a uma modificação fenotipica. Neste caso modificação "feno típica" significa oe preferencx a uma modificação mensuráve1 de uma ou mais fu tnções das cél . U .1 0. o *

Por exemplo, 0 S célr i í a s v egetais geneticament e modificadas, de acordo com a invenção e as plantas geneticamente modificadas de acori do com a inve nção exibem um aumento da actividade de uma proteína R3 devido à presença ou expressão da molécula de ácido nucleico introduzida.

No contexto da presente invenção, o termo "molécula de ácido nucleico estranha" pressupõe significar uma molécula que ou não ocorre naturalmente nas células vegetais de tipo selvagem ou não ocorre naturalmente na disposição espacial concreta em células vegetais de tipo selvagem ou que se encontra localizada no ponto no genoma da célula vegetal de tipo selvagem onde não ocorre naturalmente. De preferência, a molécula de ácido nucleico estranha é uma molécula recombinante que consiste em diferentes elementos, não ocorrendo esta combinação ou disposição espacial específica naturalmente em cé1u1as vegetais.

Em princípio, uma molécula de ácido nucleico estranha pode se r o-1 idiquer moiecuia ae aciao nucleico que provoque um a/urru jnt o o! a a c 11 v í o. a d e de uma proteína ϊ K3 na célula vegetai ou planta. No con texto da presente invenção, o termo "ger ioma" pressupõe significar a tc )talídade do matéria. 1 genético presente na célula vegetal. 0 18 especialista tem conhecimento que não apenas o núcleo, mas também outros compartimentos (por exemplo, plastídeos, mítoconciría) incluem material genético.

Numa outra, concretização, as células vegetais de acordo com a presente invenção e as plantas de acordo com a presente invenção compreendem a molécula de ácido nucleico estranha codificadora de uma proteína R3, preferencialmente uma proteína R3 Arabidopsis thaliana,

Noutra concretização, a molécula de ácido nucleico estranha codifica uma proteína R3 com a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID N° 2 ou na SEQ ID N° 4.

Existe um grande número de técnicas disponíveis para a int roduçã 0 de ADN na célula 1 nospedei r· vegí 51 al Est as t0 C i i .1 c a 8 .1. ncluen :i a tran sformação de célu las vege ;tai s com T- ADN , util i .zando Ag: cobac :terium tumefaciei is ou Ac jrob acteri um rhi z o cf ene S como meie de tra nsformac ção, a f’1- isão de pro toplas t u o f -1 · njec ação, electrop oração de ADN, in troduç ão ΟΘ a ί) N "p o r me i o de uma abordagem biolíst ica bem como outr Cl 1b pos síbilí Ó ades. A 1 jt i 11 .. zação d.a transfo rma.! ção ; por me i o de agrobacte r ia de cé lula s vegetai s tem sido obiect o de um estudo intensivo e foi devidamente descrita em EP 120516; Hoekema, IN: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij

Kanters B.V. Albl asserdam (1985), Chapter V b ra ley et a 1. Crit. Re ív. Plant Sei. 4, 1-4 6 e in An e t al c EMBO J. 4 '1 Q x S ) 277-287. Relativamente à transformação o.a bata ta ver, por exemplo, Rocna-Sosa et a 1., EMBO . T P U f ^ f ! } a ρ a i \ -L O .s } , 29 33) . A transformação de plantas monocotíledóneas por meio de vectores baseados na transformação de Agrobacterium foi igualmente descrita (Chan et al. , Plant Moí. Biol. 22, 19 (1993), 491-506; Hiei et al., Plant J. 6, (1994) 271-282;

Deng et al, Science in China 33, (1990), 28-34; Wilmink et al., Plant Cell Reports 11, (1992), 76-80; May CD c+ 1—1 Bio/Technology 13, (1995) , 486-492; Conner and Domisse, Int. J. Plant Sei. 153 (1992), 550- -555; Ritchie et al.

Transgenic Res. 2, (1993), 252-265). Um sistema alternativo a transformação de plantas monocotiledóneas consiste na transformação por meio da abordagem biolística (Wan and Lemaux, Plant Physiol. 104, (1994), 37-48; Vasil et al.,

Bio/Technology 11 (1993), 1553-1558; Ritala et al., Plant

Moí. Biol. 24, (1994), 317-325; Spencer et al., Theor.

Appl. Genet. 79, (1990), 625- 631 ), transformação de protoplastos, elec troooraçao < de célu dl ου O 3. .tl 01 ci, J. ITl t d ru[- P*s rmeab i 1 i z ada s Θ 3 introdução de ! ADN por me i o de f .1 b r a í 3 de vidro. Em particular, tem sido muitas vezes descrita na iiteratura a transformação de milho (cf. po WO95/06128, EP0513849, EP0465875, EP0292435; Fromm et al., Blotechnology 8, (1990) , 833- 844; Gordon-Kamm et al., piant. Ce 11 2, (1990), 603-618; Koziel et al., Biotechnology 11 (1993), 194-200; Moroc et al., Theor. Appl. Genet. 80, (1990), 721-726),

Esta transformação com êxito de outros tipos de cereal lGi também já descrita, por exemplo quanto à cevada (Wan ^Cid Lemaux, ver acima; Ritaia et al., ver acima; Krens et· a j-·, Nature 296, (1982) , /2-/4) e quanto ao tricro (Mehr» et al ·, Plant J. 5, (1994) , 285-297; Becker et al., 1994,

Plant. Journal 5, 299-307) . Todos os métodos apresentados âuLeriormente são adequados no âmbito da presente invpn^*o is células vegetais e pilam

Ent r e o u t r o s a s p e c t o s, ae

Gte foram geneticamente modificadas através da int-r0ducão uma proteína R3 podem ser distinguidas das células 20 vegetais de tipo selvagem e plantas de tipo selvagem respectivamente, na medida em que contêm uma molécula de ácido nucleico estranha que não ocorre naturalmente nas células vegetais de tipo selvagem ou plantas de tipo selvagem, ou na medida em que uma molécula destas se encontra presente integrada num ponto do genoma da célula vegetal de acordo com a invenção ou no genoma da planta de acordo com a invenção onde não ocorre nas células vegetais i n cl S plant as d<? 5 tipo se.' Ivagem, i st o é f ico d. if ere; nte. Além dis S 0 / cl 8· célul as O o m c í invenção e as plantas de acor do ;m í ser dist. ingui das das c élulas vegetais pia nta s de tipo selvagem respect r ivamen te me] nos uma cópi a da mol écul a de áci do de f o rma e stáve íl dentro do ser i genora ÍC1 f m .olécula a s í d e t. -i. ρ o n ucleico de acordo a 1 nvenção já ocorrem igem 0 LI lidb as células o.e acordo nucieico rntegrac possivelmente para além das cópias naturais desta molécula nas células vegetais de tipo selvagem ou plant selvagem. Se a(s) molécula(s) de ácido estranha(s), introduzidas nas células vegetais de acordo com a invenção ou nas plantas de acordo com é/são cópias adicionais das moléculas que já ocorrem naturalmente nas células vegetais de plantas de tipo selvagem respectivamente, então as célul vegetais de acordo com a invenção e as plantas com a invenção podem ser distinguidas das células vegetais de tipo ; relva Lgem ou das plantas de tipo sei V3.CÍ 01Tj respect ivam· ente, em part . i. cu 1 a r na medi l da e?r ; que esta. cópia adicional o u es tas cópi as a d icionais está/ estão e m ρ ontos do genoma c uide não ocor re (m) nas c é 11; ilas v egetais de tipo selvagem ou plantas de tipo selvagem. E s t e facto ρ Ο Ο Θ S Θ.ΤΓ verificado, por exemplo, com cl j U CÍ. cl Q Θ uma c n n 3. ± -i. S Θ Sou •thern 21 •0.2 o j~ . Alem disso, as ce lu lai í i:Vç,]^c ao e as plantas de acoí cl ···«::. guida s das células de Planta s de tipo selvagem r espe ΡΟ'Γ pelo menos uma. das seguintes características: Se uma

Tfi Q Ί J-6cula de ácido nucleico estranha que foi introduzida é he-te róloga no que se refere à célula vegetal ou planta o as células *a*^tas de acordo com ent r: ao as células vegetais de acordo com a invenção ou invenção tem transcrições das ecula s de a Cl do nuC.i.6i co introduz idas. Este facto pode ser ver i f cado, por exemplo ; ρΟΓ âiicl .lise Northern blo t ou Por P.T—P CR (Reve: tT 3 Θ Transe :ri ption Pol ymerase Cha in Reac tion ~ r 'eacçe i.o ern cadeia de poli _mera.se - transcriçã o rever S cl} · As C Θ J. u 1 .as veget ais de ac or do com a invenção e as pia 3 *11__cl 3 de acordo com a ir ivenção 'l que expr essam uma transcr ição ant isens e e/ou ARNi podem 3 er detect adas, por i exemplo com a j υ de s o n das de acido ni ucleico e specífi C cl S / com plement ares a o A .RN (qi le ocorre n aturalmente na cé vegetal) que codi fica ; a proteína. De prefe , T·'· & it r-‘ -rv • i. . Cv ; as cél U1 cL S vegetais de acordi 0 com a inv θ n ç cí o c o. o planta s de aco rdo c :om a inv ençí ão cont :.êr n uma orot ;eína «ue é codi fi cada por uma IRC décula de ácido rr ucleico introduzida. Este f acto pod e ser V erifiçado, por exe :mplo, por métodos imunológi cos, em parti cu lar pe; La análise h Jestern bl O » Se p molécula de á. C -1 do nucle ico exógen a que foi int roduz íd * e hor nóIoga no qu .e se refe re à célula vegeta 1 OU pia nta, tâO ci S células T. /egetais de acordo com a inve nção ou as plantas de a cor do c om a invenção podem ser diferenciadas das células vegetais de tipo selvagem ou plantas de tipo selvagem respectivamente, por exemplo, com base na expressão adicional das moléculas de ácido nucleico 22 estranhas introduzida. De preferência, as células vegetais de acordo com a invenção e as plantas de acordo com a invenção contêm transcrições das moléculas de ácido nucleico estranhas. Este aspecto pode ser detectado, por exemplo, por análise de Northern blot ou com ajuda da análise conhecida como PC'R cruantitativo.

Noutra concretização, as células vegetais de acordo com a invenção e as plantas de acordo com a invenção assumem a forma de, respectivamente, células vegetais transgénicas e plantas transgénicas. Numa outra concretização, a presente invenção refere-se a células vegetais de acordo com a invenção e plantas de acordo com a invenção, em que a molécula, de ácido nucleico estranha é seleccionada do grupo constituído por

a) moléculas de ácido nucleico que codificam uma proteína com a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID N° 2 o - - pp Q í-r O ca i i Cl ID N0 4; b) mc rlécuias de acido nucleico coam .. C- α id O .L ά S Cie uma proteína. que inc.lt ui a sequência de aminoâci .dos, codific a. d. a pela inserção no pl asmídeo pIRl.38-210 ou a inserção no plasmídeo P1R13 9 - 210 ; c) m oléculas de ácido nucleico que codificam uma proteína com pelo mer íos 60 % de identidade com a sequência de aminoá eidos esp >eci .ficada na SEQ ID ISf° 2 ou na SEQ ID N° 4; d) moléculas de ácido nucleico codificadoras de uma. proteína cuja sequência tem uma identidade de pelo menos 60% com a sequência de aminoácidos, codificada pela região codificadora da inserção no plasmídeo plR138-210 ou peia inserção no plasmídeo plR.139-210; 23 e) moléculas de ácido nucleico que incluem a. sequência de nucleótidos da SEQ ID N° 1 ou da SEQ ID Nc 3 ou uma sequência complementar; f) moléculas de ácido nucleic que compreendem a. sequência de nucleótidos ou a inserção presente no plasmídeo pIR138-21Q ou no plasmídeo pIR139-210; g) moléculas de ácido nucleico que têm uma identidade de pelo menos 60% com as sequências de ácido nucleico descritas em a) , b) , e) ou f) ; h') mo i .ecu las de ac ido nuci .eico que hibridam com pelo menos uma cadeia das moléculas de ácido nucleico descritas em a) , b) , Cl) t 0 ) ou f) sob con dições rei 3tringent.es; moléculas de ácido nucle i p cuja sequência de dos se desvia da sequência de moléculas de ác: Ldo mencionadas er n a) , b) , e) ou f) , em resultado da degenerescência do código genético e j) moléculas de ácid.o nucleico que constituem fragmentos, variantes alélicas e/ou derivados das moléculas de ácido nucleico descritas em a), b), c), d), e), f), g) , b) ου 1) , A sequência de aminoácidos da SEQ ID NO 2 codifica uma proteína R3 de Arabidopsis thaliana. As proteínas codificadas pelas diferentes variantes das moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção partilham certas caracteristicas. Estas podem incluir, por exemplo, actividade biológica, peso molecular, reactividade i munológ i ca, c o n f o rm ação e semelhantes e propriedades físicas tal como, por exempi o, o comportam ento de migração em electroforese em gel, c omp ortame n t o c r orna t. ográ f i c o, 24 coeficientes de sedimentação, solubilidade, propriedades espectroscópicas, estabilidade, nível óptimo de pH, temperatura óptima e semelhantes. o peso molecular da proteína R3 de Arabidopsis thaliana deduzida da sequência de aminoaciaos da SEQ ID NO 2 é de aproximadamente 131 kDa. 0 peso molecular de uma proteína de acordo com a invenção deduzido da sequência de aminoácidos codificadora encontra··· se, ssira, intervalo entre 120 kDa a 14o kDa, de referência entre 12 0 KDa e 140 kDa, com especial , r e ferênc r a entre 125 kDa e 140 kDa., particularmente referencial entre 130 kDa e 135 kDa. A sequência de .mi no ácidos da SEQ ID NO 2 qu e codifica uma proteína R3 de

Arabidopsis thaliana inclui um domínio fosfo-histidina. Por conseguinte, uma proteína. R3 de acordo com a invenção compreende preterencialmente um domínio fosfo-histidina que possui pelo menos 85%, de preferência pelo menos 88%, com especial preferência pelo menos 91% e com particular preferência pelo menos 95% de identidade com o domínio tosfo-histidina da biiiy i-JJ no A presente invenção ref nucleico que c o d i f i c am uma. enzimática de acordo com a roteína com a activida.de 'enção de uma proteína R3, possuindo a proteín a R3 codificada pelo menos 70%, de preferência pelo menos 80%, com especial preferência pelo menos 90% e com particular preferência pelo menos 95% de identidade com as sequências de aminoácidos reveladas na SEO ID NO 2.

Uma est. irpe Escherichia ccli compr eendendo o plasmídeo pIR138-210, compreendendo um cADN c o d i í i c a d. o r de uma proteín R3 de Arabidopsis thaliana, que está em fusão traducional com uma sequência de ácidos nucleicos 25 codificadora do peptídeo de sinal plastídeo do gene dul I de Gryza sa.ti.va. foi depositada na Deutsche Sa.mrrd.nng von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Alemanha, em conformidade com as disposições do Tratado de Budapest de 21 de Julho de 2004 com o número DSM 16587. A sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 4 pode ser derivada da região codificadora da sequência de cADN integrada no plasmídeo pIR138-210 e codifica uma proteína R3 de Arabidopsis thaliana, que possui um peptídeo de sinal plastídeo. Por conseguinte, a presente invenção refere-se a moléculas de ácido nucleico, codificadoras de uma proteína com a actividade enzimática de uma proteína R3, que compreende a sequência de aminoácidos codificada pela inserção no plasmídeo pIR138-210, possuindo a proteína codificada pelo menos 70%, de preferência pelo menos 80%, com especial preferência 90% e com particular preferência 95% de identidade com a sequência de aminoácidos que pode ser deduzida da inserção em pIR138-210. O plasmídeo pIR139-210, que compreende o cADN codificador cl.e uma protein R3 de Arabidopsis thaliana foi depositado junta da Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, 38124

Braunschweig, Alemanha, em conformidade com as disposições do Tratado de Budapest de 10 de Agosto de 2004, com o número DSM 16645. A sequência de aminoácidos apresentada na EQ ID N0 2 pode ser derivada da região codificadora . da equência de cADN integrada no plasmídeo pIR139-2i 0 e odifica uma protu sina R3 de Arabidopsis thaliana. Por conseguinte, a presente invenção refere-se também a moléculas de ácido nucleico, codificadoras de uma proteína 26 com a activ idade enzi mát i C cx Q 0 uma j pr Φ o í. n a R3, que O o TI >r.eende a sequência de amino á. C n. G O 3 cod: i.f ic :ada pela inse rção no plasmídeo pir: 139-210, poss ui indo a pcoii eína codi ficada p€ jlo menos 7 0%, de pref erênci a pel o m enos p C', Tá C·’ 70 f com especial prefe rénc r« i 90 % e con i parti p ular ' pr ef erê incia 95% de ident: idade com a sequência de ami noáci H O Q VwA *·_/ O O”51Θ pode ser deduzida da inserção 0T-Q pIR139- 210. Ά. sequênc ti a. de ácic lo n U C .1- 0 i C O da S c :q •i. Xj NO 1 θ uma sequ .ência de CADN que c ompr eende a . regiã o codifi ca dor a de uma proteína R3 de Arabí dops . -i c -*-b. -» "» J. (_· li CL _L lana.

Por conseguinte, a presente invenção refere-se também a moléculas de ácido nucleico que codificam uma proteína R3 e incluem a região codificadora das sequências de nucleótidos da SEQ ID N° 1 ou sequências complementares desta, moléculas de ácido nucleico, que incluem a região codificadora da sequência de nucleótidos da inserção contida no plasmídeo pIRl39-210 e moléculas de ácido nucleico que possuem uma identidade de pelo menos 70%, de preferência pelo menos 80%, particularmente preferido pelo menos 90% e especialmente preefrido pelo menos 95% com as moléc u las dí 5 ácido nucleido men cionadas. A Ui (D quência de ácido s nuc le icos da SEQ ID NO 3 0 uma seque * C le cADN que inclu _i_ 3 Ύ e g 1 ã o codificadora de uma prot .0 \ .na R3 de Arabi dopsi g thalian a, que está em fusão t radu C1 onal. com a se quê ncia de ácido nucleico c o d ificadora dO eptideo de sinal pias t í de o do gene dul I de (J2TYZS Sã ti Vã Δ "p2Γ0S0Γ! 1” ^ invenção refere-se também a moléculas de ácido nucleico eme coda. i. i cam umcí prouema P.3 e .incluem a reqiao c o d i ^:'· oadora das sequências de nucleótidos da SEQ ID N° 3 ou sequências complementares desta, moléculas de ácido nucleico, eme incluem a região codificadora da sequência de nucleótidos 27 a. i n S Θ .ΤΓ Ç 3.O C 01Ί "L 1. CÍ t3 η o plasmideo pIR138-210 e molécul . 0 O C’10 eido nu c1e i c o qu e po ssuem uma identidade de pelo menos D 0- W '0 ; de preferênc: La pelo mei aos 80%, particularmente refe rido pelo me no s 9U% e esp: •eciaimente preef rido pelo menos 95% com as moléculas de ácido nucleido mencionadas,

0 especialista pode isolar as sequências homólogas de outras espécies vegetais com auxilio da informação de sequência das moléculas de ácido nucieico de acordo com a invenção ou com auxilio de uma molécula de ácido nucieico de acordo com a invenção. Esta operação pode ser efectuada, por exemplo com a ajuda de métodos convencionais, tal como o exame de bibliotecas de cADN ou bibliotecas genómicas com sondas de hibridação adequadas. Os especialistas na técnica sabem que podem também ser isoladas sequências homólogas com a ajuda de oligonucleótidos (degenerados) e utilização de métodos à. base de PCR. 0 exame de bases de dados, talco mo as disponibilizadas, por exemplo, pela EMBL (http://www.ebi.ac.uk/Tools/index.htm) ou NCBI (National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nim.nih.gov/), pode também servir para identificar sequências homólogas que codificam, proteínas R3 .

Nestes exames, introduz-se uma ou várias sequências, realizando o que é conhecido por pesquisa. Esta. sequência de pesquisa é então compar ada por meio de programas inf ormât ícos estatísticos com sequências que estão contidas nas bases de dados selecciona das. Estas pes :quisas da base

de dados (por exemplo pesquisas blast e fasta) são conhecidas dos especialistas na técnica e podem ser efectuadas por vários fornecedores. Caso for efectuada uma pesquisa da base de dados, por exemplo junto da NCBI 28 (National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) , devem ser utilizadas as definições padrão que são especificadas para esta pesquisa comparativa especifica. Para comparações de sequências de proteínas (blastp), estas definições são as seguintes: Limit entrez = not activated; Filter = low compexity activated; Expect value ------ 10; word size ------ 3; Matrix ----= BLOS UM 6 2; Gap costs : Existence - 11, Exten sion “ 1 * Deve rã-o u t i 1 izar- se o: s segui ntes parâmet aros para a compar ação de sequ Θ n c i 3 s de ácido nucleico (bl .astn) : LI .mit entre η? zzz rd 'W +- activated; Filter low compexity activated; Expect value 10; word size - 11.

0 0 O 3.0, O

Por exemplo, no caso de uma pesquisa da base aesre gênero, as sequências aescntas na presente invenção podem ser utilizadas como sequência de pesquisa, para identificar mais moléculas de ácido nucleico e/ou proteínas codificadoras de uma proteína R3. Com a. ajuda dos métodos descritos é ainda possível identificar e/ou isolar moléculas de ácido nucleico de acordo comi a invenção que hibridam com a sequência especificada na SEQ ID N° 1 e que codificam urna proteína R3, Para os objectivos da presente invenção, o termo "hibridação" significa hibridação nas condições de hibridação convencionais, de preferência em condições restrmgentes, exemplo, tal como descritas em

Sambrock et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3a edição (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.I.). ISBN: 0879695773, Ausubel et al., Snort Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons; 5a edição (2002), ISBN: 0471250929). Com particular preferência, "hibridação" significa hibridação nas seguintes condições: Tampão de hibridação: 2xSSC; 29

lOxsolução de Denhardt (Ficoll 400+PEG+BSA; proporção 1:1:1); 0,1% SDS; 5 mM EDTA; 50 mM Na2HP04; 250 pg/ml ADN

de esperma de arenque; 50 pg/ml tARN; ou 25 M tampão de fosfato de sódio pH 7,2; 1 mM EDTA; 7% SDS

Tampão de hibridação: T = 65° a 68°C

Temperatura de lavagem: Em princípio, as mol· hibridara com molécula de < 0, • 1% SDS = 65 s 5 68 °c:. ílas de áci do nucleico que do nu cl .eico de acordo com a de qua( Lquer espécie vegetal. /lS moléculas de ácido nucleico que hibridam com as moléculas de acordo com a invenção podem, por exemplo, ser ^soladas a partir de bibliotecas genómicas ou bibliotecas °-b cADKr. a identificação e isolamento de moléculas de ácido -eico deste tico podem ser efectuadas de acordo com a invenção, ou partes destas moléculas ou os complementos ^versos destas moléculas, por exemplo por meio de "b| 1- , i j-ori.aação de acordo com os métodos padrão (ver, por -^empio Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory '1<anuai, 3a eciição Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold :in9 Harbor, N.I. ISBN: 0879695773, Ausubel et al., Short J'Ot.ocoj.3 ín Molecular Biology, John Wiley & Sons 5a edição i2 η n - r ISBN: 0471250929) ou por amplificação por meio de '2 ie h ibridação que podem s e r 1. a s de ácido nucleico com te a sequência de nucleót: idos

Exemplos ÍJ'- i í i zadas si pãecisamente c "bicada na SEQ ID NO 1, ou partes destas sequências. Estes "*-ciginentoS utilizados como sondas de hibridação podem "a*nbem ser fragmentos sintéticos ou oligonucleótidos que f: '-tam produzidos utilizando técnicas de síntese 30 estaoeiecidas e cuja sequência corresponde essencialinente à de uma molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção. Assim que os genes que nibridam com as sequências co de acordo cora a invenção foram de 3. Cl Cl· nucl identifi cados e isolados, deve.] - ser sequenciados e as caracter ísticas das proteínas c o d i f ic adas po r esta. sequêncí a devera ser analisadas P a r a c o n f i r ma r s e é uma proteína R3. As comparações dc 5 bomoloGia ao nív ei da sequênci d. 0.0 çic ido nucleico o ^ G 0 cL Γίΐ ‘1 n O ci C -1- G o s e uma determin ação da actividade enzimática são rn étodos .1. S CÍO que uma ácido nucl eico cl -L tOO grau de S í-A ct 0 moléculas particularmente adequados para este fim. A actividade de uma proteína R3 pode ser determinada, por exemplo como anteriormente descrito em Métodos Gerais, Ponto 2. As moléculas que hibridam com as moléculas de ácido nucleico de acordo com a invenção incluem em particular fragmentos, derivados e variantes alélicas das moléculas de ácido nucleico de acordo com a invenção que codificam uma proteína R3 de plantas, em particular uma proteína R3 de plantas de Arabidopsis thaliana. No contexto da presente invenção, o termo "derivado" significa que as sequências destas moléculas divergem em uma ou posições das sequências das moléculas < descritas anteriormente e possuem ui identidade com estas sequências. Os desvios das moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente, pode ter ocorrido, por exemplo devido a eliminação, adição, substituição, inserção ou recombinação. ίο, o termo "identidade" i a. em O o V O -P comprime ;nto integi: :al) de pelo me ϊ n 0 S de p< elo mer > * ono, i C ·' d 0 υΌ ; de

No contexto da presente invençl significa uma identidade de sequênc da região codificadora (sequência 70%, em particular uma identidade 31 preferência maior que 85%, particularmente preferível maior que 90% e especialmente de pelo menos 95%. No contexto da presente invenção, o termo "identidade" pressupõe significar o número de aminoácidos/nucleótidos c o r re spo n de nt e (i de n t i da de) a o ut r a s pr ot e í n a s / á c i do s nucleicos expressos em. percentagem. De preferência, a identidade é determinada por comparação da SSQ ID NO 2, no caso de aminoácidos, ou SEQ ID NO 1, no caso de ácidos nucleicos, com outras proteínas/ácidos nucleicos, com ajuda de programas informáticos. Se as sequências que são comparadas entre si possuem comprimentos diferentes, a identidade deve ser determinada de forma a que o número de aminoácidos que têm a sequência mais curta em comum com a sequência mais longa determine o quociente de percentagem da identidade. De preferência, a identidade é determinada por meio do programa informático ClustalW, que é bem conhecido e disponível ao público (Thompson et al., Nucleic Acids Research 22 (1994), 4673-4680). ClustalW é disponibilizado ao público por Julie Thompson (Thompson@EMBL-Heidelberg.DE) e Toby Gibson (GíbsonOEMBL-Heidelberg.DE), European Molecular Biology Laboratory, Meyerhof strasse x, D 6911/ Heioelberg, Alemanha Igualmente, ClustalW pode ainda ser descarregado de vários sites na Internet, incluindo IGBMC (Institut de Génétique et de Biologie Móleculaire et Cellulaire, B.P.163, 67404

Illikirch Ceaex, France; ítp://ítp-igbmc,u-strasbg.fr/pub/) e o EBI (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/) bem como em todos os sítes na Internet espelhados do EBI (European Bioxnf orraatxcs insticute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, Reino Unido), Para determinar a identidade entre proteínas de acordo com. a invenção o 32 outras proteínas é preferida, a versão 1.8 do programa informático ClustalW. Devem ser definidos os seguintes parâmetros: KTUPLE=I , T0PDIAG=5, WIND0W=5, PAIRGAP=3, GAPOPEN=IO, GAPEXTEND=0.05, GAPDIST=8, MAXDIV=40, MATRIX=GONNET, ENDGAPS(OFF), NOPGAP, NOHGAP. Para determinar a identidade entre, por exemplo, sequência, de nucleótidos das moléculas de ácido nucleico de acordo com a invenção e a sequência de nucleótidos de outras moléculas a versão 1.8 definidos os PAIRGAP=5, TRANSITIONS: de ácido nucleico utiliza-se de preferência, do programa informático ClustalW. Devem ser seguintes parâmetros: KTUPLE=2, TOPDIAGS=4 DNAMATRIXMUB, GAPOPEN=IO, GAPEXT=5, MAXDIV=40, imponderado Além disso, identidade significa que existe equivalência funcional e/ou estrutural entre as moléculas de ácido nucleico em questão ou as proteínas codificadas por estas a s m o 1 é c i derivados variações

As moléculas de ácido nucleico que são homólogas las descritas anteriormente e que constituem destas moléculas assumem geralmente a forma de destas moléculas, que constituem modificações que executam a mesma função biológica. Podem assumir a forma de variações naturais, por exemplo, sequências de outras esoécies vegetais ou mutações, sendo possível que estas u tenham sido v a r i a ç o e e i >odem teticamente . As s π o iv. u -ΐ- s -l- y como mutações tenham ocorrido naturalmente introduzid.as Ρ^— muinqei:ese . Alem casso, aí assumir a forma de sequências geradas si variantes ad-élicas tanto podem ser variant

variantes P roduzidas sint .eticamente o por técn especial nucleico

Icas de ADN ,qe derivados aUe derivam recombinante. por exemplo, das moléculas u variantes produzidas Constituem uma forma as moléculas de ácido de ácido nucleico de 33 33 acordo com genético. invenção devido a degeneração do código

As proteínas codificadas pelos diferentes derivados das moléculas de acido nucleico de acordo com a. presente invenção partilham certas características, Estas podem incluir, por exemplo, actividade biológica, especificidade do substrato, peso molecular, reactividade imunológica, conformação e semelnantes e propriedades físicas tal como, por exemplo, o comportamento de migração em electroforese em gei, compomamento cromatograf ico, coeficientes de s e d i me n t a ção, solubilidade, propriedades espe ct r o s c ópi c a s, estabilidade, nível óptimo de pH, temperatura óptima e semelhantes. As propriedades preferidas de uma proteína R3 foram já pormenorizadas e aplicam-se analogamente neste caso.

As moléculas de ácido nucleico de acordo com a invenção podem ser quaisquer moléculas de ácido nucleico, em particular moléculas de ADN ou ARN, por exemplo cADN, ADN genómico, mARN, etc. Podem ser moléculas naturais ou moléculas produzidas por método de recombinação ou métodos de síntese química. Podem ser moléculas de cadeia simples contendo a cadeia codificadora ou não codificadora, como moléculas de cadeia dupla. A further embodiment of the present invention relates to plant cells according to the invention and plants according to the invention, the foreign nucleic acid molecule being selected from the group consisting of a) moléculas T-ADN que conduzem a um aumento da expressão dogene R3 devido à integração no genoma da planta (endereçamento de activação T-ADN); 34 b) moléculas de ADN que incluem transposões, que conduzem a um aumento da expressão do gene R3 (endereçamento de activação transposão)devido à integração no genoma da planta; c) moléculas de ADN que codificam uma proteína R3 e que estão ligadas a sequências reguladoras que garantem a transcrição em células vegetais e conduzem a um aumento numa actividade da proteína R3 na célula, d) moléculas de ácido nucleico introduzidas por meio de mutagénese in vivo e que conduzem a uma mutação ou uma inserção de uma sequência heteróloga em pelo menos um gene endógeno, codificador de uma proteína R3, em que a mutação ou inserção provoca um aumento da expressão de um gene codificador de uma proteína R3.

No contexto da presente invenção, podem também ser produzidas células vegetais de acordo com a invenção e plantas d< e acordo co m a invença ,o r ecorrendo à técnica conhecida por mutagén e se ( de inse: rção (a r t i g o de re s um o: Thorneyc.ro ft et al., : 2001, J o urna.'. 1. oí experimentai Botany 52 (361), 1593-1601). n O ontexto da presente invenção, a mutagénese de inserção pressupõe significar particularmente a inserção de transposões ou ADN dito de transferência (T- ou na p r o x i m i d a de de um gene codi ficador de 3, em resultado do que aumenta a actividade 1 R3 na célula e m questão. Neste co ntexto, os :>odem ambos ser a queles qu e ocorrem naturalmente na célula (transposões endógenos) e ainda os que não ocorrem, naturaimente na célula mencionada mas são introduzidos na célula por meio de métodos de recombinação, tal como transformação da célula, por exemplo (transposões 35 heterólo gos) 0 especi; a -L .1 s t a e s :tá fami. I iar: izado p om a modifica. ção da. expressão de genes por meie 3 de Ltauspo sões Encontra - S Θ uma sinops e da ut ilização de s- 3ΓdHSO osões endógeno s e heterólogos como fero camentas em 1 jiotecno 1 o g i n vegetal em Ramachandran e Sundaresan (2001, piant Physiology and Biochemistry 39, 234-252) . A mutagénese de inserção ΐ-ADN baseia-se no facto de certos segmentos (T~ ADN) de plasmideos Ti de Agroba cteri um poderem ser integradas no genoma de células vegetais. O ponto de

integração no cromossoma da planta não é de f .i i. n ido, mas pode ocorrer em qualquer lug ar. Se o T-ADN se íntec jrar numa parte do cr orno s s orna ou n a v i z i n h a n ç a de uma part< 0 dO cromossoma que constitui uma função genética, então este facto pode conduzir a um aumento da expressão genética e também a uma alteração na actividade de uma proteína codificada pelo gene em questão. Neste caso, as sequências inseridas no genoma (particulamente transposões ou T-ADN) distinguém-se devido ao facto de conterem sequências que conauzem a uma activação das sequências g e n e (" a c t i va t i n t aggi n g") .

reauJ >ra uin A.s células vegetais e plantas de acordo com a invenção podem ser produz: Idas por meio do método designado "activatin tagging" (ver , por exemp •lo, Walden et al. , Piant J. (1991), 281-288 ; Wa.' Lden et ai ., Piant Mol. Biol. 26 (-994), 1521-1528) . Este método baseia-se na activação de promotores endógenos por meio de sequências intensificadoras, tal como o intensificador do promotor '""S ARd do vírus do mosaico da couve-flor ou o intensificador da octopina

Nc contexto da :esente invenção, ;ermo dctlvation taqqing" pressupõe significar um fragmento ae T- 36 ADN que contém sequências intensificadoras e que conduz a um aumento da actividade de pelo menos uma proteína R3 por integração no genoma de uma célula vegetal.

No contexto da. presente invenção, o termo "act IVãt • 7 i t agging t. r a n s posa o " p r e s s up õ e s i g n i f i c a r um transpo S 3.0 que contém sequências intensificadoras e que conduz a um aumento da actividade de pelo menos um a proteína R3 por integração no genoma de uma célula vegetal. acordo com a estão I igad 8 S transcr .1. v CL -·_/ ΘΤΡ

Numa concretização adicional, moléculas de ADN de invenção, que codificam uma proteína R3 e que i sequências reguladoras que iniciam a transcrição em células vegetais (promotores) e conduzem a um aumento numa actividade da proteína R3 na célula. Neste contexto, as moléculas de ácido nucleico de acordo com a invenção estão presentes na orientação "sense" relativamente às sequências reguladoras. molécula io tecido, numa d etermmada et apa do .mento da pl; rnta ou num momento determinado po χ is externas. 0 promotor pode ser homologo οή >, ambos rela tivamente à planta e relativamente à de ácido nucleico. I ixempios de promot! 0 2Γ Θ S são o promot or do vírus ao mosaico da couve- flor

Para expressar moléculas de ácido nucleico que codificam uma proteína R3, estas moléculas estão ligadas preferencialmente a sequências de ADN reguladoras, que garantem a transcrição em células vegetais. Em particular, estas incluem promotores. Era geral, qualquer promotor que esta. activo em. células vegetais é elegível para expressão. Neste contexto, o promotor pode ser escolhido, de forma aue a expressão tem lugar de forma constitutiva ou apenas num determinadr 37 '’0S A RN e o promotor da ubiquitina cio milho para expressão constitutiva., o promoter patatina B33 (Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8 (1989), 23--29) para expressão especifica de tuberosas em batatas ou um promotor que apenas garante a expressão em tecidos com actividade de fotossintese, por exemplo f'' ro cromoior (Stockhc e t a. -i.

Pro(

Nat 1.

Acad. Sei. USA 84 (1387), 7943-7347; Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2445-2451) ou para a expressão especifica do endoesperma do promotor HMG do trigo, o promotor USP, o promotor faseolina, promotores dos genes da zeina do milho (Pe dersen et al., Ce 11 2 9 (( j ^ 2) , 1015-10 2 6; Quat roc: cio et al, , Plant Mol, B: Lol. 15 (19 α r, \ 3 \.j) f ! 31-93), r. iromotor glu telina (Le isy et al., PI ant Mol. Biol . 1 .4 (1990) , 41 0 w ? r7 Lj 1 1 eng et 81 * , Plant .J. 4 (1993), 35 '7___' / 3 b 6 ; Yoshih ara et d.J. . , , FEBS Let. t. 383 (1996), 213-218) ou O promotor Shr unke n-1 (Weir et al., EMBO J. 4 (1985), 13 r-j -1380) , í 1 o e ntan- to, podem tam bém ser utiliz ados prornol :or 0 3 que só são 8. C t.’ 1. y* os num momento du aterminado por influências externas (ver, exemplo WO 9307279). Os promotores que podem reve st ir-se interesse especifico s neste contexto podem ser promoto de proteínas d e choque t é rm: J- O vd f ci 8 quais são simples de induzir. Além disso, pocien i ser ut.il azados promotores Θ S p 0 C i f i C O S d 8 semente, tcli como o promotor US P de Vicia taba F que garante a Vi ci 3. t. 3.13 ί i e ou.tr as Biol * 22 ( 19 93), 6 i 3 9 — i 225 ( 19 91) , 459-46 7) . sequ ó r icía de termi naç ser util izada p ara t. r a n o C r i ç ã. o. A cau .da funç ãc ) na estabil j 7 2 u.tras plantas (Fiedler et al., Plant Mol. i; Baumlein et al,, Mol. Gen. Genet uma caucia a 38 e I eme

O ntos deste tipo na. literatura (cf. Gielen et al., EMBO (1989), 23-29) e podem ser trocados facultativamente.

Podem também estar presentes sequências intrão entre o promotor e a região codificadora. Estas sequências intrão podem conduzir à expressão estável e a uma expressão aumentada em plantas (Callis et al., 1987, Genes Devei. 1 , 1183-1200; Luehrsen, and Walbot, 1991 , Moí. Gen. Genet. 225, 81-93; Rethmeier, et al.,

Fiant

Journal. 12(4):895- 899; Rose and Beliakoff, 2000, Plant Physioi. 122 (2), 535-542; Vasil et ai., 1989, Plant Physioi. 91 , 1575-1579; XU et al., 2003, Science in China Series C vol. 46 No. 6, 561-569). As sequências intrão adequadas são, por exemplo, o primeiro intrão do gene shl do milho, o primeiro intrão do gene dei poliubiquit ina 1 de milho, o primeiro intrão do gene EPSPS do arroz ou um dos dois primeiros introes do gene P.AT1 da Arabidopsis. As sequências intrão adequadas sáo conhecidas do especialista e extensamente descritas na literatura. Além di; b S O , cí S C Θ i U 1 cl. S vegetais de acordo co m a invenção e plantas de acordo c o m a i n v e n ç ã o podem s e r geradas pelo método conhecido por ''activação in O -L L Lí , em que a modifi< caçáo genética que for introduzida ac arreta uma modificação das sequências reguladoras dos genes R3 endógenos, o que conduz a uma expressão intensi ficada dos genes R3. A activação de um gene R3 é ef ect uada preferi encialmente opr mutagénese "in vi vo" de um promotor ou de sequências intensificadoras de um ge ne : R3 endógeno. Neste contexto. um promotor ou uma sequência intensificadora, podem ser alterados através de mutagénese de forma a que a mutação produzida conduza a uma expressão acrescida de um gene R3 em células vegetais de acordo com a 39 invenção ου plantas de acordo com a invenção, em comparação com a expressão cie um P.3 em células vegetais de tipo selvagem ou plantas tipo selvagem. A mutação num promotor ou sequência intensificadora pode também conduzir à expressão de genes R3 em células vegetais de acordo com a invenção ou plantas de acordo com a invenção numa altura em que não seri am expressos em . células vegetais t ipo selvag ou plantas de tipo selva g em. No c o n u e xto da presen invenção, o termo "gene R3" pressupõe si .. gn i f Lear u. molécula, de ácido nucleico (cADN, DNA) qeu codifica uma proteína R3, de preferência uma proteína R3 de Arabidopsis thaliana.

Durante o processo conhecido por "mutagénese in vivo" introduz-se um oligonucleótido híbrido ARN/ADN ("quimeroplasto") em células vegetais por meio de transformação de células vegetais (Kipp, P. B. et al., sessão póster no "5th International Congress of Plant Molecular Biology", 21 a 27 Setembro de 1997, Singapore; R. A. Dixon aend C. J. Arntzen, relatório do encontro "Metabolic Engineering in Transgenic Plants", Keystone Symposia, Copper Mountain, Colo., USA, TIBTECH 15, (1997), 441-447; pedido de patente internacional WO 9515972; Kren

PNA.S & 1 ., Hepatology O ul ^ Ϊ (1997), 1462- -14 6 8 ; Cole-Strauss et F Science 273, 1996) , 138 6- ·: o o O, * - J. o o 3; Be et ham et al., 1999, p 96, 8'/74 -877 8) . Uma parte aos componentes do go; aucleótido ARN -ADN é homóloga de uma seauência de ácido nucleico de um gene R3 endógeno, mas, em comparação com a sequência de ácido nucleico de um gene R3 endógeno possui uma mutação ou contém uma região heteróloga que é cercada por regiões homólogas. Em resultado das regiões homólogas do oligonucleótido ARN-ADN e da molécula de ácido 40 40 nucleico endógena sujeitos a emparelhamento de seguido de recombinação homó.' Loga, a mutaçc í.o ou a região heteróloga contida no compon ente ADN do oligonucleótido ARN-ADN pod e ser transferida para o genoma de uma célula vegetal. Esi ca operação conduz a um aumento d a. actividade de uma ou mais do que uma proteína R3.

Todos esses métodos baseiam-se na introdução de uma molécula de ácido nucleico estranha no genoma de uma vélula vegetal ou planta e, por conseguinte, são basicamente adequados para a produção de células vegetais de acordo com a invenção e plantas de acordo com a invenção.

Numa concretização preferida da presente invenção, as moléculas de ácido nucleico estranhas de acordo com a invenção assumen a forma de moléculas de ácido nucleico recombinantes, estando as moléculas de ácido nucleico de acordo com a invenção, codificadoras de uma proteína R3 ligadas a um peptídeo de sinal de tal forma que a transcrição e tradução das molécuals de ácido nucleico recombinantes mencionadas dão origem a uma proteína que possui um peptídeo de sinal plastídeo. seguinte, a :ordo com a acordo com a forma de sendo a a de ácido de ácido fundida a A presente invenção refere-se aidna, por cons células vegetais geneticametne modificadas de ac invenção ou plantas geneticamente modificadas de a invenção, em que a molécula de ácido nucleic introduzida na célula vegetal ou planta assume uma molécula de ácido nucleico recombinante, molécula de ácido nucleico estranha uma moiécui nucleico recombinante em gu e uma sequência nucleico codificadora da proteína K J Θ S t cl sequenc de ácido nucleico saooras um >epf 41 de sinal plastídeo, de forma que a moléculade ácido nucleico recombinante codifi3ue nma. proteína R3 que possui um peptídeo de sinal plastídeo para além da sua sequência de aminoácidos codificadora.

No contexto da presente invenção, a expressão "molécula de ácido nucleico recombinante" subentende significar uma molécula de ácido nucleico que, para além das moléculas de ácido nucleico de acordo com a invenção, codificadoras de urna proteína R3, incluem sequências adicionais que não estão naturalmente presentes numa combinação em que estão presentes em ácidos rmcleicos recombinantes de acordo com a invenção, Neste contexto, a adição das sequências mencionadas podem ser quaisquer sequências, de preferência com a forma de sequências reguladoras (promotoras, sinais de terminação, intensificadoras), com particular preferência a forma de sequências reguladosa que estão activas em tecidos vegetai s, com particular preferência sequênci as reguladoras que estão activas no tecido de plantas armazenadoras de amido. Sequências adicionais preferidas s ã o a s se quê i ίο -Ί- a s que codifica sinal (sequ iéncias de s i nal) que, em resu traducional com sequêni J1 cl S codificadoras acarreta a transi O C 3. ç ã o das proteínas de .003 f ret i cu 1 o s O ^ r' kJ Cl O e spec i almente • o rq pp r-, J. _ yUV eis sequências inal ρ lastídeos. Os dos de produção de ;es de acordo com a iação ou molecular- invenção em compartimentos subcelulares (vacúolos, plastideos, mitocôndrias, n endoplasmáticos, parede celular). Sac importantes no contexto da presente inv de sinal que codificam peptídeos de s; especialistas na técnica conhecem rrn moléculas de ácido nucleico recombrn invenção e incluem métodos de recombinação ou molécula: 42 bioióaicos, t a 1 como, por: exemplo, a união de moléculas de ácido nucleíco por ligação, recombinação genética ou síntese ΟΘ JIOVO do ΠΊΟXqqu i 33 CÍ.0 ác ido nucleico ( ver, por exemplo Sambrok et al., Molecular Cloning, A La Lboratory Manual? u* edição (2001) Cold Spr ing Harbour La .boratory Press, < 3°ld Spring Harbour, N.Y. IS) BN: 0879695773, Ausubel ΘΓ. ci.1 * / uhort Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 5a edição (2002), ISBN: 0471250 929) .

No contexto da i presente invenção, o termo "peptí deo CÍ0 sinal plastideo" subentende significa r um peptídeo que acarretai a transi ocação de uma proteíi ia para o lúmen de piastídeos quando 1 o peptídeo de si Π 3. .1. -t cl. Z pci 11' L Θ da sequência de aminoácidos de uma proteína..

No que se refere à expressão em plantas das moléculas de ácido nucleico de acordo com a invenção, é possível, em princípio, que a proteína sintetizada possa estar localizada em qualquer compartimento da célula vegetal. Para conseguir a localização num compartimento específico, a região codificadora deve, se apropriado, estar ligada com sequências de ADN que garantem a localização no compartimento em questão. Estas sequências são conhecidas (ver, por exemplo, Braun, EMBO J. li (1992), 3219-3227;

Sonnewald, Plant J. 1 (1991 ), 95-106; Rocha-Sosa, EMBO J. 8 (1989), 23-29, Neuhaus and Rodgers, 1998, Plant Molecular Biology 38: 127-144). Neste caso, as sequências de sinal são ligadas à região codificadora da proteína de tal forma que as sequências de ácido nucleico fundidas do peptídeo de smal. e as cocií .rcadorcis θα. .;.oimu proteica, em caso de transcrição, uma estrutura de leitura aberta (fusão traducional). Deste modo, após a tradução do ARN formado pela transcrição das sequências de ácido nucleico fundidas, 43 43 tormada uma proteína que, p; :i r 3 além da reg i a o •ificadora da proteína, possui um peptí cie o de sinal. Em ncipio, qualquer sequê ncia de s í n cl i que garanta a OrtspSp de proteínas com cod .jr ^ ... ção nuclear em stideos pode ser util. izada come 3 sequência de si nai st. í dica. 0 especialista sabe como obter as sequências de b-^Fiâl piaslínicas. Deste modo, por exemplo, é possível miiiiar programas» informáticos (1999, Emanuelsson et al,, Protexn Science »/ 978-984) para analisar sequências o do cADN dc i proteína plastídica .doreductase (FNR) do espinafre prooea.cas coaif icaooras para detectar a. presença, de uma sequência de sinal piastidica. Os programas informáticos que executam estas análises estão ambos disponíveis no comercio e ao público na. internet. (por exemplo, http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/). Por exemplo, é possível utilizar a sequência cie sinal plastídica da íerredoxina do espinafre:NADP+ oxidoreductase (FNR). Este sinal inclui a região não traduzida 5' e a sequência do peptídeo transit cie flanco do cADN da proteír da ferredoxina:NADP+ oxidoreductase (FNR) c (nucleótidos -171 a +165; Jansen et al., Current Genetics 13 (1988), 517-522) . Além disso, é possível utilizar, por exemplo, o peptídeo transit da proteína cerosa do muilho mais os 34 primeiros aminoácidos cia proteína cerosa do milho madura (Klõsgen et al., Mol Gen Genet. 217 (1989), 155-161) como sequência de sinal plastídeo. Além disso, é também possível utilizar o peptídeo transit da proteína cerosa do roiihjo (ver acima) sem os 34 primeiros aminoácidos da proteína cerosa madura. A utilização das seguintes sequências de sinal plastídeo é também fazível: sequência de sinal da subunidade pequena da ribulose bifosfato carboxilase (Wolter et al., Proc. Natl. Acad. 44

Sei. EUA 85 (1988), 846-850; Nawrath et al., Proc. Natl.

Acad. Sei. EUA 91 (1994), 127 60--127 64); sequência de sinal de malato NADP desidrogenase (Gallardo et al., Planta 197 (1995), 324-332); sequêcia de sinal glutationa reductase :ia ou ma i s, de As seq " :Ó fl e '1 s de umas c 3. S0QrU ± r à s então podem ser (Creissen et al., Plant J. 8 (1995), 167-175), sequência de sinal de EPSPS (US 5,188,642). É preferível utilizar a. sequência de sinal do gene dul do arroz A molécula de ácido nucleico recombinante pode incluir preferência duas, sequências de sinal sinal podem estar presentes imediatametne um; outras, no sentido da transcrição o separadas umas das outras pelo que é conhecido como espaçador. As sequências de sinal plastídeas que incluem duas sequências de sinal encontram-se descritas, por exemplo, na EP 0508909 e EP 0924299, US 5,510,471).

Surpreendentemente, constatou-se que as células vegetais de acordo com a invenção e plantas de acordo com a. invenção sintetizam um amido modificado em comparação com amido das células vegetais de tipo selvagem ou plantas de tipo selvagem correspondentes que não foram geneticamente modificadas.

As células vegetai; ϋ cie acordo com a invenção e p>lantas G 0 3. C Ο .Γ G O C G ΤΪ1 a invenção sintet i z am um amido mo dlficado cujas caracter ' .1 s u i. c a s ±. I. S .1. .co-qu írr licas, em parti cu.] .ar cujo teor de fosfato de amido está modificado em comparação com o amido sintetizado em células vegetais de tipo selvagem ou plantas de tipo selvagem, sendo ruais adequado para ap .1 a c a ç õ θ s θ s ρ θ c .i .t. a c a s. A cresp"te invenção . inclui, ass im, células vegetais de ac ordo com a invenção e plantas de acordo com a invençã lO sintetizam um amido modificado em comparação com amido da; ϊ células v< egetais de tipo selva gem 45 ou plantas de tipo selvagem correspondentes que não foram geneticamente modificadas. No contexto da presente invenção, o termo "amido modificado" significa que o amido sofreu alterações das características fisico-químicas em comparação com amido não modificado, obtido de células vegetais de tipo selvagem ou plantas de tipo selvagem correspondente Noutra concretização da presente : i. nvençc ão, 3.3 C 0 1.0 J. .as vegetais de acordo com a invenção ou p iantas de acordo com a invenção sintetizam um amido cujo teor de fosfato de amido é aumentoado em comparação com o am ! i cio isolado 3 partir de células vegetais de tipo se‘. tipo selvagem correspondentes. [.vagem Ο Ό. plantas do

Foi descrita uma variedade de métodos para a determinação da quantidade de fosfato de amido. De preferência podem ser utilizados os métodos descritos por Ritte et al. {2000, Starch/Starke 52, 179-185) para a

determinação da quantidade de fosfato de amido. A quantidade de fosfato de amido é efectuada de preferência por meio de '5iP-NMR, utilizando os métodos descritos por Kasemusuwan e Jane (1996, Cereal Chemistry 73, 702-707). A invenção refere-se ainda a plantas geneticamente modificadas, compreendendo células vegetais de acordo com a invenção. Estas plantas podem ser geradas a partir de células vegetais de acordo com a invenção por regeneração.

Em princípio, ser plantas de monocotiledóneas plantas úteis, isto as plantas de acordo com a invenção podem malquer espécie vegetal, isto é tanto como dicotiledóneas. De preferência são é plantas que são cultivadas pelo homem 46 46 alimentares ou LCOS , em p; art ieul Ci.i. acorde j com a in venç ão o contexto da Ό JT p-> ç\ n te zenadoe iras de amid O " ;s que contêm um ami do milho, 3. ΪΓ L' 0 Z f t r i g O f bstat a ? S6QÚ fel j 6 0 para rins industriais mvençáo, o termo plantas ai significa todas as plantas com pa] armazenado, tal como, por exemp] centeio, aveia, cevada, mandioca mungo, ervilha, ou sorgo.

No contexto da presente invenção, o termo "batateira" ou "batata" significa, espécies vegetais do genoma Solanum, em particular espécies produtoras de tuberosas do género Solanum e especialmente Solanum tuberosum.

No contexto da presente invenção, o termo "planta do trigo" significa espécies vegetais do genoma Triticum ou plantas resultantes de hibridações com plantas do género Triticum, particularmente espécies vegetais do género Triticum que são utilizadas em agricultura, para fins comerciais ou plantas originárias de hibridações com plantas do género Triticum, com particular preferência Triticum aestivum.

No contexto da presente invenção, o termo "planta do milho" significa espécies vegetais do género Zea, em particular espécies vegetais do género Zea, que são utilizadas na agricultura para fins comerciais, com particular preferência, para Zea mais.

Noutra outra concretização, a presente invenção refere-se a planta armazenadoras de amido da família de acordo com a invenção, de preferência batateiras, com especial preferência plantas da família (sistemática) das poáceas. 47

Estas pian V— cí S i.ssamem especia 1 mente d.e plantas do m ilho ou trigo. A pres :ente invenção refere-se p r o p a g a ç a o das plantas de acordo c uma célula veqe tal da invenção. caso , o t ermo "r naterial de propagação" inclui os ntes da pl anta q ue são adeqi aados para a produção dênci a por meios vegetativos ou geradores. Os que são adequados à propagação de plantas são as estacas, culturas de calos, rizomas, tubérculos. Outro material de propagação inclui, por: exemplo, frutos, sementes, rebentos, protoplastos, culturas de células, etc. 0 material de propagação é de preferência tubérculos e com especial preferência grãos com endoesperma. Noutra concretização, a presente invenção refere-se a partes de plantas qu e podem ser colh idas de plantas de aco rdo com a invenção, t a 1 como frutos, raízes armazenadoras , raízes, flores, bo toes, rebentos ou ha: stes, de pref erência s< ementes, grão s ou tubércul os, em que estas par tes que p «odeia ser c o .1 hidas contêm células vegetais de acordo com a invenção. A presente invenção refere-se também a um método de geração de plantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção, em que a) uma célula vegetal é geneticamente modificada, conduzindo a modificação genética ao aumento da actividade de uma proteína R3 em comparação com as células vegetais de tipo selvagem correspondentes, que não foram geneticamente modificadas. b) uma planta é regenerada a partir de células vegetais da etapa a); 48 c) e, se apropriado, são produzidas mais plantas com ajuda das plantas de acordo com a etapa b).

Relativamente à modificação genética introduzida na célula vegetal de acordo com a etapa a) , esta poderá em princípio assumir a forma de qualquer tipo de modificação que conduza a um aumento da actividade de uma proteína R3. As plantas podem ser regeneradas de acordo com a etapa b) recorrendo a métodos conhecidos dos especialistas na técnica (por exemplo descrito em "Plant Ce11 Culture Protocols", 1999, ed. Por R. D. Hall, Humana Press, ISBN 0-89603-549-2). A geração de mais plantas de acordo com a etapa c) do método de acordo com a invenção pode ser efectuada, por exemplo, por meio de propagação vegetativa (por exemplo utilizando estacas, tubérculos ou por meio de cultura de calos e regeneração de plantas inteiras) ou por sexuada. Neste contexto, propagação sexuada ocorre preferencialmente em condições controladas, isto é plantas seleccionadas com características particulares são hibridadas e propagadas entre si. A selecção ocorre preferencialmente de modo a que outras piantas obtidas de acordo com a etapa c) incluam a modificação genética que foi introduzida na etapa a).

Numa concretização preferida do método de acordo com a invenção para a geração de uma planta geneticamente modificada, a modificação genética de uma célula vegetal na erapa a) conauz a um aumento da actividade de uma proteína R3 em plastídeos da célula vegetal mencionada, em comparaçao com plastídeos de células vegetais de tipo selvagem que não foram geneticamente modificadas correspondentes. 49

Noura concretização do método de acordo com a invenção, a modificação genética consiste na introdução no genorna da éli ila vegetal de uma mol écula de ácido nucle ico d e acordo ora a invenção ou UIT ia molécula de ác idO nucleico ecombi nantes de acordo com a invenção, condu zindo a presença da molécula de ácido nucleico estranha mencionada ou molécula de ácido nucleico recombinante mencionada a uma maior actividade de uma proteína R3 na célula.

Noutra concretização do método de acordo com a invenção, a modificação genética consiste na introduçãio de uma molécula de ácido nucleico estranha no genorna da célula vegetal, codificando a molécula cie ácido nucleico estranha uma proteína R3.

Noutra conc :retiz ação ao método de acordo com a invenção., a modi . X X C 3. Ç ão genética consiste na introdução de uma molécula i. de ácido nucleico estranha no genorna da célula vegetal sendo a molécula de ácido nucleico estranha uma molécula de ácido nucleico recombinante, em que uma seque ΡΊ p -j_ 0 ác ido nucleico C O 0. .1 d. d. U α ιλ O .L ά 3 cx p X. O teína R3 GSt ã fundida a uma segunda sequência de ácido nucleico codif icadoras de um peptideo de sinal plastídeo, de f o rma que a molécul ácido nuclei co recombinante codif :ÍQue ura a proteína R3 que possui um peptideo de sinal plastídeo para além da sua sequência de aminoácidos codificadora.

Noutra concretização, o método de acordo com a invenção é utilizado para a geração de uma planta geneticamente modificada de acordo com a invenção para a geração de plantas armazenadora de amido. 50

Noutra concretização, o mét odo de acordo com a invenção é utilizado para. gerar pia ntas da batata, do milho ou trigo de acor d o c o m a i n v e n ç ã o , Noutra concretização do método de acordo com a invenção, a molécula de ácido nucleico estranha e 'seleccionado do grupo constituído por a) moléculas de ácido nucleico que codificam uma proteína com a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID N° 2 ou na SEQ ID N° 4; b) moléculas de ácido nucleico codificadoras de uma proteína que inclui a sequência de aminoácidos, codificada pela inserção no plasmídeo pIR138-210 ou a inserção no plasmídeo pIR139-210; c) moléculas de ácido nucleico que codificam uma proteína com pelo menos 60 % de identidade com a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID N° 2 ou na SEQ ID N° 4; d) moléculas de ácido nucleico codificadoras de uma proteína cuja sequência tem uma identidade de pelo menos 60% com a sequência de aminoácidos, codificada pela inserção no plasmídeo pIR139-210; e) moléculas de ácido nucleico que incluem a sequência de nucleótidos da SEQ ID N° 1 ou da SEQ ID N° 3 ou uma sequência complementar; f) moléculas de ácido nucleic que compreendem a sequência de nucleótidos da inserção presente no plasmídeo pIR138-210 ou no plasmídeo pIR139-210; 51 g) moléculas de ácido nucleico que têm uma identidade de pelo menos 7 0% com as sequências de ácido nucleico descritas em a), b), e) ou f); h) moléculas de ácido nucleico que hibridam com pelo menos uma cadeia das moléculas de ácido nucleico descritas em a), b), d), e) ou f) sob condições restringentes; i) moléculas de ácido nucleic cuja sequência de nucleótidos se desvia da sequência de moléculas de ácido nucleico mencionadas em a) , b) , e) ou f) , em resultado da degenerescência do código genético e j) moléculas de ácido nucleico que constituem fragmentos, variantes alélicas e/ou derivados das moléculas de ácido nucleico descritas em a), b), c), d), e), f) , g) , h) ou i) .

No utra o o Ή r* γ' 'tizaç ciO ci ^ ) método de acordo com a .nvenç S 0 jf a mo lécul 3. de ácido nuc leico estra nhsL : 'sele cciona do do grupo con 8 t ituído por a) molé cu i. ci S T-AD1 g q ue conduzem a um aumento da xpres são do ge ne R 3 dev -L 0. Cd à integração no genoma da pia nta encier e ç ame n to de act i v. cl. Ç cl 0 T -ADN); b ) molé cu las de ADN q ue incluen ’Ί 1” reinsposões, que onduz em a um aume nto da expres is ao do gene R3 encier e ç ame n to de act iv ração t rransposão) o e V. Ído à integra çáo lo gen orna d.a P lant Cl ; c) moléc ul as d e ADN que c odificam uma p roteína R3 e que :stão ligadas i a seq uênc ia s regulad· oras > que garan t em i n i c i am) a tr 3. n 3 c rição em ce lulas veget ", a i. s e conduzem a um aumento numa actividade da proteína R3 na c :élula, 52 d) moléculas de ácido nucleico introduzidas por meio de mutagénese in vivo e que conduzem a uma mutação ou uma inserção de uma sequência heteróloga em pelo menos um gene endógeno R3, em que a mutação ou inserção provoca um aumento da expressão de um gene R3.

Noutra concretização do método de acordo com a invenção, a molécula de ácido nucleico de acordo comi a invenção é uma molécula de ácido nucleico recombinante, sendo a molécula de ácido nucleico estranha uma molécula de ácido nucleico recombinante, em que uma sequência de ácido nucleico codificadora da proteína R3 está fundida a sequências de ácido nucleico codificadoras de um peptídeo de sinal plastideo, de forma que a molécula de ácido nucleico recombinante codifique uma proteína R3 que possuí um peptídeo de sinal plastideo para além da sua sequência de aminoácidos codificadora.

Noutra concretização, a presente invenção refere-se a um método de acordo com a invenção, em que Cl |0 _L Cl nta geneticamente modi ficada sintetiza um amido que ó modificado em comparação coi a plantas de tipo sei V 3 Q Θ1TL que não foram geneticamente modificadas.

Noutra concretização do método de acordo com a presente invenção, as plantas de acordo com a invenção sintetizam um amido cujo teor de fosfato de amido é aumentado em comparação com o amido isolado a partir de células vegetais de tipo selvagem ou plantas de tipo selvagem correspondentes, A presente invenção refere-se ainda a plantas que podem ser obtidas por meio de métodos de acordo com a invenção. 53

Surpreendentemente constatou-se que o amido isolado a partir de células vegetais de acordo com a invenção e plantas de acordo com a invenção, possuidoras de uma actividade aumentada de uma proteína R3 nos plastídeos presentes, sintetizam um amido modificado. Em particular, a maior quantidade de fosfato de amido nos amidos de acordo com a invenção proporciona aos amidos características surpreendentes e vantajosas. Em resultado da maior quantidade de toslato de amroo, os amioos de acordo com a. invenção suportam uma maior quantidade de grupos com cargas que afectam significativamente as características funcionais do amido. 0 amido que suporta os grupos funcionais 3 carrega idos é indústria do papel, onde é papel. 0 papel re vestido particularmente aplicável na rtilizado para o revestimento do com moléculas carregadas, que possuí adicionalmente boas propriedades adesivas é particularmente adequado para a absroção de cores, tal como, tais como, tinta, tintas de impressão e outras. A presente invenção refere-se também a amidos modificados que são obtidos a partir de células vegetais de acordo com a invenção e plantas de acordo com a invenção, de material de propagação de acordo com a invenção ou de partes de plantas que se podem colher de acordo com a invenção. 2Γ Θ f θ 2Γ S--S€ s a de p -i- S- nta ateira, com d Θ 3. ΓΓ! ido d cl. part í cu lar

Noutra concretização, a presente invenção amido modificado de acordo com a invenção armazenadoras de amido, de preferência da bat especial preferência de plantas armazenadoras família (sistemática) das poáceas, com preferência das plantas do milho e do trigo. 54 A presente invenção refere-se ainda a um método de produção de um amido modificado, incluindo a. etapa de extracção do amido a partir de uma célula vegetal de acordo com a invenção e plantas de acordo com a invenção, de material de propagação de acordo com a invenção destas plantas e/ou de partes de plantas que se podem colher desta planta de acordo com a invenção, de preferência de partes armazenadoras de amido de acordo com a invenção, desta planta. De preferência, este método inclui ainda a etapa de colheita, das plantas cultivadas ou partes de plantas e/ou o material de propagação destas plantas antes da extração do amido e ainda, com particular preferência, a etapa de cultivo das plantas de acordo com a invenção antes da colheita.

Os método S 0-Θ extrac çâo do amido a pare ir de plantas Lv LI -Q "| ^ ‘ilit~. 3. 0 a rma z enador as do amido são conhecidos ci 0 S especis ?, À. i. S t 0 S na técná C 0 A Lérn disso, os métodos do extracção do amido a partir de diferentes plantas armazenadoras de amido por exemplo em Starch; Chemistry and

Tech no.lo gy (Editores: Whis tler, BeMi.1.1 er and P 0 0 c b 01.1 (1994), 2a edição, Academic Press Inc. Lo ndon Ltd; ISBN 0- 12-74627 0-8; ver por exemplo capitulo Xli , página 412 - 4 b 8 :

Maize and Sorghum Starches: Manufacture; por Watson; apítu lo XII, páaina 4 69-4 79: Tapioca, Arrowroot and Sago tarch es: Manufacture; por Corbishley e Miller; capítulo XIV, página 479-490: Potato starch: Manufacture and Uses; por Mitch; capítulo XV, página 491 a 506: Wheat starch: Manufacture, Modification and Uses; por Knight e Oson; e a ρ 11 u 1. ο XV r, pági na. 507 a 528: Rice starch: Manufacture nd. Uses; por Rohiner e Kl em; Ma.is 70 g tp pch * P c b .hoff et ai., ereal Chem. 7 3 (19 96), 54-57, a extracção do amido de 55 milho a urna escala, industrial é geralmente efectuada pelo processo designado "moagem por via húmida"). Os dispositivos vulgarmente utilizados em processos de extracção de amido a partir de material vegetal são separadores, decantadores, hidrociclones, pulverizadores de secagem e secadores de leito fluidizado.

No contexto da presente invenção, o termo "partes armazenadoras de amido" significa as partes das plantas onde se armazena amido como depósito de sobrevivência, por longos períodos, em contraste com o amido transitório da folha. As partes de plantas armazenadoras de amido preferidas são, por exemplo, tubérculos, raizes armazenadoras e grãos, são particularmente preferidos os grãos contendo um endosperma, em especial são particularmente preferidos os grãos que contêm um endoesperma de plantas do milho ou do trigo, 0 amido modificado obído por um método de acordo com a invenção, para a produção de amido modificado é também um assunto da presente invenção.

Noutra concretização da presente invenção, os amidos modificados de acordo com a invenção são amidos nativos.

No contexto da presente invenção o termo "amido nativo" significa que o amido é isolado de plantas de acordo com a invenção, plantas que se podem colher de acordo com a invenção, partes armazenadoras de amido de acordo com a invenção ou material de propagação vegetal de acordo com a invenção por meio de métodos conhecidos dos especialistas na técnica. Outro assunto objecto da presente invenção reside na utilização de células vegetais de acordo com a 56 invenção e plantas de acordo corri a invenção para a produção de amido modificado. vd 0 amido j 300em ser qu irní ca, enzimátic de r ivados são pa: apl reações 5 no se< a.mi dos de acordo o, i i 'K kU VA IwA stâncic i de part do que os amidos c

Um especialista na técnica sabe que as características do amido podem ser alteradas por meio de derivação térmica, ção de amido s der: Lvados vez que têm umteoi : mais avos de Vi do a um maior ou mecânica, por exemplo. Os amidos .cularmente adequados para diferentes 3r alimentar e/ou não alimentar. Os m a invenção são mais adequados como la para a produção de an mencionais, uma vez que i uncionais reactivos dev; teor de fosfato de amido.

Por conseguinte, a presente invenção refere-se também à produção de um amido derivado, em que se deriva posteriormetne amido modificado de acordo com a invenção.

No contecto da presente invenção, o termo "amido derivado" pressupõe significar um amido modificado de acordo com a invenção, cujas características foram alteradas depois de isolamento das células vegetais por meio de métodos químicos, enzimáticos, térmicos ou mecânicos.

Noutra concretização da presente invenção, o amido derivado de acordo com a invenção é um amido que foi submetido a tratamento térmico e/ou ácido.

Noutra concretização, os amidos derivados são éteres de amido, em particular alquil éter de amido, éteres 0-alílicos, éteres hidroxialquílicos, éteres 0-carboximetílicos, éteres de amido contendo azoto, éteres de amido contendo fosfato ou éteres de amido contendo enxofre. 57

Noutra concretização, os amidos derivados são amidos reticulados.

Noutra concretização, os amidos derivados são polímeros de enxerto de amidos. Noutra concretização, os amidos derivados são amidos oxidados. derivados são ésteres de amido que foram â c .1 d o s o r g ânicos . C o m fato, nitrato, sulfato,

Noutra concretização, os amidos de amido, em particular ésteres introduzidos no amido utilizando particular preferência estes são fos xantato, acetato ou citrato de amido

Os amidos derivados de acordo com a. invenção são adequados para diferentes aplicações na indústria farmacêutica e no s« setor alimentar 0 / C j U i ião alírr lentar. Os métodos de produção de ; amidos deri vados Q0 3CO; d o e invenção são conheci dos c los especial .. Ϊ. S t 3. S na. té cr: lica e são adequadamente descritos na literatura geral. Encontra-se um

resumo da produção c le amidos derivados, por exemplo em "Corri, Che rmistry and Technology" (1987, e ds. Watson und Ramstad, c apitulo 16, 4 7 3- 4 9 3) . 0 am i.do der .1V 3. d O O 0.1. G O por um método de acordo com a invenção, para a produção de amido deri vado e tamb· ém um assunto da prese nte invenção A utilização de amidos derivados de acordo com a invenção para a produção de amido derivado é também um assunto da. presente invenção.

As partes armazenadoras de amido de plantas são frequentemente transformadas em farinhas. Os exemplos de partes de plantas a partir das quais são processadas as farinhas, por exemplo, tubérculos da batateira e grãos de plantas cerealíferas. Para produzir farinhas a partir das plantas cerealíferas, moi-se e peneira-se os grãos que 58 58 ontêm endosperma destas plantas. 0 amido é o principal :ompone nte do endc isperma.. No caso dor itras plantas que não :ontêm endosperma, tendo antes outras partes que armazenam .mi do, tal como tubéc ulos ou ra ízes, a farinha é requeri temente produz ida por meio da fragmentação, secagem e depois moagem dos órgãos de armazenamento era questão. 0 amido do endosperma ou o amido contido em partes de armazenamento de amido de plantas é um importante constituinte da farinha que é produzida a partir das partes da planta em questão. As características das farinhas são, assim, também afectadas pelo amido presente na farinha em questão. As cérulas vegetais de acordo com a invenção e plantas de acordo com a invenção sintetizam um amido modificado em comparação com amido das células vegetais de tipo selvagem ou plantas de tipo selvagem correspondentes que não foram geneticamente modificadas. As farinhas ρ r o o u z .1 o a s a p a r t i. r u e cr e .1 u 1. a s α e o e r a r s u e a c o r. ο ο c ο m a invenção, plantas de acordo com a invenção, material de propagação de acordo com a invenção ou de partes de plantas que se podem colher de acordo com a invenção têm, por conseguinte, c a. r acteríst i c a. s pela mistura de com característi características modificadas. As das farinhas podem também ser afectadas amido com farinhas ou mistura de farinhas cas diferentes.

Por conseguinte, apresente invenção refere-se ainda a farinhas que contêm um amido de acordo com a invenção. A presente invenção refere-se também a farinhas que são processadas a partir de células vegetais de acordo com a invenção, plantas de acordo com a invenção, partes de plantas armazenadoras de amido de acordo com a invenção de material de propagação de acordo com a invenção ou de 59 partes de plantas que se podem colher d.e acordo com a invenção. Partes armazenadoras de amido preferidas de plantas de acordo com a invenção são tubérculos, raízes armazenadoras e um grão que contenha endosperma. Preferencialmente, os tubérculos são tubérculos da batateira e os grãos são grãos de plantas da família, (sistemática) das poáceas, com particular preferência os gr 0 O s são origin ários das p 0 0. ntas do mil] No cont da p rese: nte invenção, s 1 gnifica UI Ti pó obt id· o da mo agem de par ne cess á 2Γ i 0 r as p a r t e s 0.0 8 pia ntas são se< e redu zida s e/ou penei L' 0 d cl. S d epois da mo; Em res ultado do am iido com um teor de das plantas do milho ou trigo. t e r m o " f a r i n h a " presente, as farinhas de acordo com a invenção distinguem-se particularmente pela sua maior capacidade de ligação de água. Este facto é desejado, por exemplo, para várias aplicações no processamento de farinhas na indústria alimentar, em particular a produção de produtos de p 3. Γ1.1 T- .1. C cl. Ç 0 G * A presente invenção refere-se ainda ao método de produção de farinhas, incluindo a etapa de moagem de células vegetais de acordo com a invenção, plantas de acordo com a invenção, partes de plantas de acordo com a. invenção, partes de plantas armazenadoras de amido de acordo com a invenção, de material de propagação de acordo com a invenção ou material que se pode colher de acordo com a invenção.

As farinhas podem ser produzidas por meio de moagem de partes armazenadoras de amido, de acordo com a invenção. 0 especialista na técnica sabe como produzir farinhas. De 60 preferência,, um método de produção de farinhas inclui ainda a etapa, de colheita das plantas cultivadas ou partes de plantas e/ou o material de propagação ou as partes armazenadoras de amido destas plantas antes da moagem e com particular preferência a etapa de cultivo das plantas de acordo com a invenção antes da. colheita.

No contexto da presente invenção, o termo "partes de plantas" deve pressupor significar todas as partes de uma planta., que representa uma planta completa como constituintes na sua totalidade. Partes de plantas são, por exemplo, rebentos, folhas, rizomas, raizes, beterraba, tubérculo, vagens, sementes ou grãos.

Numa outra concretização da presente invenção, o método de produção de farinhas inclui o processamento de plantas acordo COJH a invenção, par tes de plantas armazenado ei 8 amido de acordo com a. invenção, de material de pagação de acordo com a invenção ou de material de acordo com a invenção que se pode colher antes da moagem. Neste contexto, o processamento pode ser, por exemplo um tratamento térmico e/ou secagem, O tratamento térmico seguido de uma secagem do material tratado termicamente é utilizado, por exemplo, para a produção de farinhas a partir de raizes armazenadoras ou tubérculos, tal como, por exemplo tubérculos de batata, antes do que tem lugar a moagem. Plantas de acordo com a presente invenção, partes de plantas armazenadoras de amido de acordo com a invenção, de material de propagação de acordo com a invenção ou de material de acordo com a invenção que se pode colher antes da moagem constitui igualmente um proc.es sarnento para. os fins da pr esente invenção. A rem< oçãc ' de tec ido vegetal, tal como, por exemplo, as espatas do Q L cl C j f antes da moagem 61 representa também ura processamento antes da moagem em termos da presente invenção.

Uma outra concretização da presente invenção inclui o métof :1o de prodi ação de farinhas 3. ρ o s a moagem ί,Ίθ u.1 n produto do p rocesso de moenda. Por exí smplo, o raateri . a 1 mc sido oode ser peneirado após a moagem, por exemplo pcl2T0 produzir t ipo: s diferente :s de farinhas. neticair O r* (!) modificada: 3 para a i ob‘jec 11V0 ( la ρ. resente 1 nvenção mei o s, tal corr io, por exemplo geraçãc 3 de célu las v e < çetaís de antas c ie acc ;rdo com a in venção, modifd .. C α G 0 em compar aç ão com Ivagem raodif I. C 0 G 3.S ou p da ntas de A presente invenção refere-se ainda à utilização de células vegetais de acordo com a invenção e plantas de acordo com a invenção moléculas de ADN, para a tipo selvagem gue não foram geneticamente modificadas

Assim, a presente invenção refere-se também a moléculas de ácido nucleico codificadoras de uma proteína com a actividade enzimática de uma proteína R3, seleccionadas do grupo constituído por a) moléculas de ácido nucleico que codificam uma proteína com a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID N° 2 ou na SEQ ID N° 4; b) moléculas de ácido nucleico codificadoras de uma proteína que inclui a sequência de aminoácidos, codificada pela inserção no plasmídeo pIR138-210 ou a inserção no plasmídeo plR139-210; 62 c) moléculas de ácido nucleico que codificam uma proteína com pelo menos 60 % de identidade com a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID N° 2 ou na SEQ ID N° 4; d) moléculas de ácido nucleico codificadoras de uma proteína cuja sequência tem uma identidade de pelo menos 60% com a sequência de aminoácidos, codificada pela inserção no plasmídeo pIR139-210; e) moléculas de ácido nucleico que incluem a sequência de nucleótidos da SEQ ID N° 1 ou da SEQ ID N° 3 ou uma sequência complementar; f) moléculas de ácido nucleic que compreendem a sequência de nucleótidos da inserção presente no plasmídeo pIR138-210 ou no plasmídeo pIR139-210; g) moléculas de ácido nucleico que têm uma identidade de pelo menos 7 0% com as sequências de ácido nucleico descritas em a), b), e) ou f); h) moléculas de ácido nucleico que hibridam com pelo menos uma cadeia das moléculas de ácido nucleico descritas em a), b), e) ou f) sob condições restringentes; i) moléculas de ácido nucleic cuja sequência de nucleótidos se desvia da sequência de moléculas de ácido nucleico mencionadas em a), b) , e) ou f) , em resultado da degenerescência do código genético e j) moléculas de ácido nucleico que constituem fragmentos, variantes alélicas e/ou derivados das moléculas de ácido nucleico descritas em a), b), c), d) , e), f) , g) , h) ou i) . As moléculas de ácido nucleico de acordo com a 63 invenção podem ser derivadas, em principio, de qualquer planta, de preferência de Ãrabidopsis thaliana. A presente invenção rerere-se ainda a moléculas de ácioo nu cie.i.co com peio menos 2i, de preferência ma. is de 50 e preferivelmente mais de 200 nucleótidos de comprimento, moléculas de acido nucleico essas que hibridam especificamente com pelo menos uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção. No presente contexto, hioriaar especit ícainente significa que estas moléculas huoriaam com moléculas de acido nucleico que codificam uma proteína de acordo com a invenção mas não com moléculas de ácioo nucleico que cooiiicam outras proteínas. Em particuiar, a invenção refere-se às moléculas de ácido nucieico que hibridam com transcrições de moléculas de ácio.0 nucieico o'e acordo com a invenção e, por conseguinte, podem impedir a tradução destas últimas. Estas moléculas de ácido nucleico que hibridam especificamente com moléculas de ácido nucleico de acordo com a invenção podem ser, por exemplo, componentes de vons ruições antisense e n s e, c o n s t r u ç o e s ARNi, construções de co-supressão ou ribossomas ou podern ser utilizadas como iniciadores para a amplificação por me ío 0

PCR u invenção r ef er e-se ainda a moléculas de ácido nucled ,.co recombi * í cX ntes compreendend o uma raolécu 1 a de ácido nuciei -co de acordo com a invenção. Δ presente in venç ao refere-se p ref erivelmi ente a uma molécula de ácido nucleico em que está fundida uma sequencia de ácido nucleico codificadora de uma proteína R3 às sequências de ácido nucleico que codificam um peptídeo ae sinal plastídeo, de forma que a molécula de ácido 64 nucleico recombinante codifica uma proteína R3 que, para além da respectiva sequência de aminoácidos codificadora, compreende um peptídeo de sinal plastídeo.

Uma outra concretização de moléculas de ácido nucleico recombinantes de acordo com a invenção é constituída por vectores, em particular plasmídeos, cosmídeos, vírus, bacteriófagos e outros vectores comums em engenharia genética que contêm as moléculas de ácido nucleico de acordo com a invenção descritos anteriormente. Noutra concretização, as moléculas de ácido nucleico de acordo com a invenção, contidas nos vectores são ligadas com sequências reguladoras que iniciam a expressão em células procariotas ou eucariotas. Em simultâneo, o termo "expressão" pode significar transcrição tal como transcrição e tradução. Neste caso, as moléculas de ácido nucleico de acordo com a invenção podem estar presentes na orientação sense e/ou antisense em relação às sequências reguladoras.

As sequências reguladoras para expressão em organismos procariotas, por exemplo E.coli e em organismos eucariotas são extensamente descritas na literatura, em particular aquelas para expressão em levedura, tal como Saccharomyces cerevisiae, por exemplo. Encontra-se um resumo dos diferentes sistemas de expressão para proteínas em diferentes organismos hospedeiros, por exemplo em Methods in Enzymology 153 (1987), 383516 e em Bitter et al. (Methods in Enzymology 153 (1987), 516-544).

Um outro assunto da presente invenção é uma célula hospedeira, em particular uma célula procariota ou eucariota que é geneticamente modificada com uma molécula 65 65 de ácido nuc 1 θ .1 c 0 de ac o rd. Q cor n a invenção e /ou com um vec tor de aco rdo c om a i. n ven ça ri v'· f V-) yr> como célu 1. a. s ο θ ir .1. v 3. d a s de células hos; P' sdeii :as d .es te ti po e συ i .o q, ntêm a mo d ificação g enét i ca dí U Pi cor do co m a invenção. A s c e 1. \j. J. a s ho s pede: L. 1Γ cl s p od Θ1TL ser bactérias (por exemplo "transformado" invenção são E.coli, bactérias do género Agrobacterium em partícula Agroba cterium tumef adens ou Agrobacterium rhizogenes) o células fúngicas (por exemplo levedura, em particular S cerevi siae, Agaricus, in particular Agaricus bisperus Aspergillus, Trichoderma) bem como células vegetais o animais. No presente contexto, o termo significa que as células de acordo com geneticamente modificadas com uma molécula de ácid.o nucleíco de acordo com a Invenção na medida em que contêm pelo menos uma molécula de ácido nucleíco de acordo com a presente invenção para além do seu genoma natural. Esta molécula de ácido nucleíco de acordo com a invenção pode encontrar-se presente livremente na célula, facultativamente como molécula aut o-replicante, ou pode estar integrada de forma estável no genoma da célula hospedeira. As células hospedeiras são preferencialmente microorganismos. Para os fins do presente pedido de patente, estas são encaradas como significando todas as bactérias e todos os protistas (por exemplo, fungos, em particular leveduras e algas) como definido, por exemplo, em Schlegel "Aligemeine Mikrobiologie" (Georg Thieme Verlag (1985), 1-2) .

As células hospedeiras de acordo com a invenção são preferivelmente células vegetais. Em princípio, estas podem ser células vegetais de qualquer espécie vegetal desejada, isto é tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas. De 66 66 s a o olantas que preferência são plantas utexs, isto cultivadas pelo homem para fins alimentares ou técnicos, en particular industriais. A presente invenção reiere-^ preferência a células vegetais e plantas P^a armazenadoras de amido (milho, arroz, tn9°, , aveia, cevada, mandioca, ervilha ou sorgo), de \ batateira, de preferência batata, sagú, feijão m^ng^, referencia células vegetais ^-a céluals vegetais de plantas da família (sistemática) das poáceas, senão preferidas células vegetais de plantas do inilno ou do tr.!.go. A -p·. +- íTi n 0 espec i a1mente A presente invenção refere-se também a composrv-^- uma molécula de cl (J _L 0.0 nu de; Lco de acordo com a inv« ença o, uma molécula de á ciclo nuc^ l tu e Ό recom binant e de aco rdo com a inve nção ou um vect' or d.0 acordo com 3 inven ção s âo pref eridas as com posiç ões de acordo com a presente in1 xenç ão cont endo uma mol écula de ác ido nuc leico Q0 acor do com a invenção, uma molécula de ácido nucleico recombinan.Le de acordo com a. invenção ou um vector de acordo com a invenção e uma célula hospedeira. A célula hospedeira assume preferivelmente a forma de uma célula vegetal, com especial preferência a forma, de uma célula de planta do milho ou de trigo. Nestas composições, a molécula de ácido nucleico recombinante de acordo com a invenção existe fora da célula hospedeira, isto é está localizada fora da parte interior da célula hospedeira que está envolvida pela membrana citoplasmática.

Um outro aspecto das composições de acordo com a invenção refere-se a composições que podem ser utilizadas para gerar células hospedeiras de acordo com a invenção, de preferência para a geração de células vegetais de acordo com a invenção. Este aspecto tem preferivelmente a forma de 67 uma composição contendo uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção, uma molécula de ácido nucleico recombinante de acordo com a invenção ou um vector de acordo com a invenção e um veiculo biolistico que é adequado para a introdução de uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção numa célula hospedeira. Os veículos biolísticos preferidos são partículas de énio, o uro ou materiais sintéticos. Uma οια tra t. r z ti. ç a o de c omp o s1ç õ e s de acordo com a prese nte ão refer e- se a composições contendo uma molécula de nucleico de acordo com a i nvenção, uma molécula de nucleico recombinante de ac< Drdo com a in .vençâo ou um invencao vector de acordo com a invenção e urna célula evgetal e um meie de cu 1 u.cα sintético. Para. arem das moléculas de árido nucleico de acordo com a invenção, as células vegetais e o mero de cultura sintético, estas composições compreende preferivelmente também polietilenoglicol (PEG) . Nest-as composiçoes, a molécula de ácido nucleico recombinante de a c- cl o com a invençeG existe fora da cri i1 ί r, . Ί . r c_-Lua vegetal, isto e esta localizada fora da parte interior da célula vegetal 3 na técnica conhecem xnei0s de cultura que sao adequados para a lltU3 vegetais, que são adeq· Existem também 1 (— ζΊ Uí u. ...... Cd o entes disponívej p no que está envolvida pela membrana citoplasmática. Os especialista sintéticos meios de comércio Biochemie B.V., transformação de célula descritos na literatura eu.ltUr;! s i rvv-· u

especializado (por exemplo DUCHEFA Bélgica).

Oma outra concretização das composic invenção refere-se ident3 :ar tposiçoes c omp o s i ções qu e sã o s ácidos nucleicos de acordo de acordo com a utilizadas para com a invenção. 68 Para além de uma molécula de ác ucleico áe acordo com a

acordo cora a invenção ou um vector de acordo com a invenção

de ácido nucleico, em particular moléculas ae ácido nucleico de origem vegetal que podem estar presentes sob a. forma de ADISí genómico, mARN ou clones rio que e conhecido como bibliotecas de ADN. São oreferidas as bibliotecas de

invenção, as moléculas de ácido nucleico recombinantes de acordo com a invenção ou vectores de acordo com a invenção

Um outro assunto objecto da presente invenção consiste em proteínas seleccionada do grupo constituído por a) proteínas que compreendem a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID N° 2 ou na SEQ ID N° 4; b) proteínas que estão codificadas na região codificadora do ADN inserido no plasmídeo pIRl38-210 ou no plasmídeo pIR139-210 ou c) proteínas com pelo menos 60 % de identidade com a sequência de aminoácidos das proteínas citadas em a) ou b). A presente invenção refere-se ainda a uma proteína de acordo com a invenção com um peso molecular entre 120 kDa a. 145 kDa, de preferência entre 120 kDa e 140 kDa, com especial preferência entre 125 kDa e 140 kDa, particularmente preferencial entre 130 kDa e 135 kDa, derivada da sequência de aminoácidos. 69 dm a outra concretização cia. presente invenção retere-se a uma proteína de acordo com a invenção que tem um domínio iObf 0·..|η O -}— -1 1 > ^ ii-t5 l laina . d o u t r a c o n c r e t i z a ç a O, a presente i nvençao refere-se a proteínas com actividade de fosforilação do amido, em que a iJJ-,JL6ina codificada tem pelo menos 70%, de pref erência pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90% e t oom especial preferência pelo menos 95% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO 2 OU SEQ ID NO 4 ou com a sequência de aminoácido de uma proteína F.3, cod ificada pela inserção no plasmídeo PIR138-210 ou pela inserção no piasirádeo PIRI39-210.

Uma outra concretização da presente invenção refere-se a uma proteína de acordo com a invenção em que a sequência de aminoácidos que codifica a proteína tem um domínio fosfo-histidina. Preferivelmente, a proteína de acordo com a invenção possui ura domínio fosfo-histidina que possui pelo menos 85%, de preferência pelo menos 88%, com especial preferência pelo menos 91% e corn particular preferência pelo menos 94% e com especial preferência pelo menos 97% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO 5.

Uma concretização preferida do processo de acordo com a invenção refere-se a proteínas recombinantes que compreendem uma sequência de aminoácidos codificadora da proteína R3, que está fundida às sequências de aminoácidos que codificam um peptídeo de sinal plastídeo. "proteína que, para s de uma equências

No contexto da presente invenção, o termo recombinante" subentente significar uma proteína « além das sequências de aminoácidos codificadora proteína R3 de acordo com a invenção, compreende s 70 de aminoácidos adicionais, era que a combinação das sequências de aminoácidos codificadoras da. proteína P.3 e das sequências de aminoácidos adicionais mencionadas não existe naturalmente na combinação era que existe nas proteínas recombinantes de acordo com a invenção. Neste contexto, as sequências de aminoácidos adicionais mencionadas podem ser quaisquer sequências de aminoácidos. Preferivelmente assumem a forma de secmências de aminoácidos que codificam peptídeos de sinal que, em resultado da fusão traducional com sequências de aminoácidos codificadoras da proteí na R3, accirreta a t r a n s 1 o c a ç ã o das proteínas em Q Ll 0 S L- 3- O para compartimentos subcelulares (vácuolos, pl ci. £.> t. .1. deos, mi .tocôndrias, núcleos, retículos endoplasmáticos, parede celular). São especialmente importantes no contexto da presente invenção as sequências de aminoácidos que codificam peptídeos de sinal plastídeos. Os métodos para a geração de proteínas recombinantes de acordo com. a invenção são conhecidos do especialista e incluem métodos recombinantes, tal como, tais como a transcrição e tradução de moléculas de ácido nucieico recombinantes que codificam proteínas recombinantes.

As fontes de sequências de aminoácidos que codificam .na ulastiaeos á foram mencionacu peptídeos cie anteriormente no contexto do termo "molécui nucieico recombinante". Noutra concretização adicional cia presente invenção refere-se a uma proteína de acordo com a invenção, sendo a proteína, derivada da planta Arabidopsis. aciao 71 Noutrs proteínas que são codificadas por moléculas de ácido ηιαο^θισο o.e acordo cora a invenção. Descrição das sequências SEQ ID . oequência ae acido nucleico contendo a região codificadora da proteína R3 de Arabidopsis thaliana. A sequencia é inserida no plasmídeo plR139- 210. SEQ ID NO 2: Sequência de aminoácidos codificadora da ptu ^onci.eL.a.2açaof a invenção refere-se também a otema .R. \3 de

Arabidopsis thaliana. Esta sequencia pode ser derivada da sequencia de ácido nucleico apresentada na SEQ ID NO 1. SEQ ID NO 3: aequencia de ácido nucleico compreendendo a região ^.ocL.... j.'._ador a da. proteína R3 Arabidopsis t ha li a na. em fusão traducional com a sequência de sinal codificadora do pepL-íutiG ae sinal para plastídeo do gene dul I de Oryza 6ativa. Esta sequência é inserida no plasmídeo plR138-210. SEQ ID NO 4: Sequência de aminoácidos codificadora da Pi.OL.eina ae iusão que consiste na sequência de- amínoá-Cidos codificadora da proteína R3 de Arabidopsis thaliana e a sequência de aminoácidos codificadora do peptídeo de sinal para plastídeo do gene dil I (TrEMBL Ace. No.: Q621D6) de Oryza sativa. Esta sequência pode ser derivada da sequência de ácido nucleico apresentada na SEQ ID NO 3. SEQ id NO 5: Sequência de aminoácidos do domínio fosfo-histidina que está. presente na sequência de aminoácidos codificadora da proteína R3 de Arabidopsis thaliana. de dados 0 teor de todas as publicações mencionadas e sequências citadas por números de acesso a base de dados são incorporados na descrição por referência. Métodos gerais 72 0 texto seguinte irá descrever métodos que podem ser aplicados na implementação dos métodos de acordo com a invenção. Estes métodos constituem concretizações í c a s da pre sente invençã o, n tas não limitam cL e inv enç á o ; a. es; ses métodos. 0 0 s ρ c ’ i óâ .1. i s t', 3. na sabe Q"> 1 a i nvenç ãO pode s ;er ir nplementada da mes sma 30r me A. v_- da m icdif ica ção dos 5 mét odo s descritos e· ' '·_/ Li uicão de part es ir rdi .viduais 3 dos mé todos por part :es t i v a s dos métodos. Expr ess. ão rgC OIT •bi nante de um. a proteína de lação do amidc 3 identificada a) Geração de um vector de expressão bacteriana contendo um cADN que codifica uma proteína de fosforilação do amido. 0 cADN codificador de uma proteína de fosforilação do amido pode ser amplificada por meio de uma reacção em cadeia de polimerase (PCR), por exemplo, utilizando mARN ou poli-A-plus-mARN de tecidos vegetais como modelo. Com este fim, utiliza-se primeiro uma tran s c ri ase reversa p; rra a gí sraçã o de uma 0 ti G 6 Ϊ 1 ti cia CADN F que e co mp .1 ementar : de un Ί. mARN, que codifica uma pr oteina de f ors f o ri la ção do amido , ant e s de a ca de 1 cl ’ de CADN em ques t ã 0 r amp 11 rrcada por me ;iio d e polime] rase de 3 ADN. Os dito s M} til '·' corr tendo substâi icias , enzima s e i nstruç õ e s para re al izaçrão de re ;acções PCR estão dist >on íveis η o comé rc io ( por exemplo S uperScr ípt.™ One-Step RT- PCR Syst em, Inví tr O Q , Prod No . : 109 2 8 - 0 3 4) . 0 cADí· J que foi amp 1 if ic a d o e que COdlf. íca uma prot reina de fosf or ilação do amid O P Od« e subsequente mente S Θ C o i O" a cio num V ector Q0 expr Θ S s ã. bacteri ana, por exe ;mplo pDESTTKl' 7 (I nv itroge n) pDEST™17 contém o promotor T7, que é utilizado para iniciar a transcrição da T7-ARN-polimerase. Além disso, o vector de 73 73 expressão pDEST™] n a d i r e c ç ã o 5' partida (ATG) e etiqueta His cox codificam cada .7 contém uma sequência, de Shine-Dalgarno do promotor T7 seguida de um codão de por uma etiqueta designada His. Esta isiste em seis codões consecutivos, que um o aminoácido histidina e estão localizados na estrutura de leitura aberta do codão de partida mencionado. Um cADN codificador de uma proteína de í o s f o ri1ação do arai do é cionado em p DESTTH17 de forma a gerar uma fu s ã o d e t r a du c i on a1 entre os codões para. o codão de partida, 3. Θ t a. Cf U. 0"C 3. His e o cADN codific 3 d.O T. de uma proteína de fosforilação de amido. Após a transcrição, iniciada no promotor Ϊ7 e subsequente tradução, obtém-se uma proteína de fosforilação do amido que contém arainoácidos adicionais, contendo a etiqueta His no respectivo terminal N. No entanto, outros vectores que são adequados para a expressão em microrganismos podem também ser utilizados para a expressão de uma proteína de fosforilação do amido. Os vectores de expressar e estirpes de expressão equivalentes são conhecidos dos especialistas e existem igualmente no mercado combinações adequadas. b) Geração de clones de expressão em Escherichia Coli

Em primeiro lugar, transforma-se uma estirpe de E.coli apropriada, de transformação competente, que codifica em termos cromossomais uma polimerase T7-ARN, com o plasmídeo de expressão produzido como se descreve na etapa a) e a estirpe é depois incubada de um dia para o outro a 30° C em meio nutriente de cultura solidificado com agar. As estirpes de expressão adequadas são, por exemplo, estirpes BL21 (Invitrogen Prod. No.: C6010-03, que codificam em termos cromossomais uma polimerase T7-ARN sob o controlo de um promotor induzíve 74 bacterianas, que constituem o resultado da etapa de transformação, podem ser analisadas por métodos conhecidos dos especialistas para detectar a presença do plasmídeo de expressão desejado que compreende cADN, que codifica a proteína de fosforilação do amido. Obtêm-se assim os de expressão. c) Expressão de uma proteína de fosforilação do amido em Escherichia Coli

Primeiro é preparada uma pré-cultura. Com este objectivo, inocula-se um clone de expressão obtido de acordo com a etapa b) em 30 ml de Terrific Broth (meio TB) contendo um antibiótico, para a selecção em presença do plasmídeo de expressão e a cultura é incubada de um dia parai o outro i° C, com agitação (2b0 rpm) . É depois produzida uma cultura principal para a expressão de uma proteína de fosforilação do amido. Com este obiectivo -j -,j f balões de Erlenmeyer de 1 litro, contendo cada um 300 ml

meio TB, pré-aquecido a 30° C um antibiótic ° 'Parai selecção da presença do plasmídeo de expressão s~,0 inoculados, cada um com 10 ml de um pré-cultura apropriada • o ( 2 b 0 rpm) at é se ating íir um c omp r rme n t o de onda de ,8. 3 0 f f Q 1' -j -j +· il i zado urn 5xpr essar uma p rot ei na de em que a expressão da uma fosforilação do amido, plasmídeo es: proteína de fosforilação do amido é iniciada por meio de Um sistema induzível (por exemplo, o vector de expresç^ pDESTT™17 em estirpes BL21 de E. coli, induzível por rp^.· * Λ. o de IPTG), o indutor em questão (por exemolo TPTGi - cs na adicionado quando é atingido um OD600 de cerca de 0, rultura principa ipòs d -t ( são do indutor cnalt -*ΐ'ει 75 principal é incubada a 30° c, com agitação (250 rpm)., até ser atingido um ODe0o de cerca de 1,8. Seguidametne, a cultura principal é depois arrefecida durante 30 minutos em gelo antes de as células da cultura principal são então separadas do meio de cultura por centrifugação (10 minutos a 4.OOOxg e 4 °C). 2. Purificação de uma Proteína de Fosforilaçao do Amido a) Fragmentação de células que expressam uma proteína de fosforilaçao do amido

As células obtidas após centrifugação na etapa c) , Ponto 1 dos Métodos Gerais, são ressuspensas em tampão de lise, adicionando-se aproximadamente 4 ml de tampão de lise a aproximadamente 1 g de células. As células ress suspe nsas são então in cubadas > d" urante 3 0 m inutos em gelo ante; 3 de serem f ragme: ntadas CO; m ajude i de uma sonda ulti :as sónica (Baude lín Sor loplus UW 2070, Baudi elín electronic, Ber lin, defini ções: ciclo f. V, f Π A O / \J ~5 f 1 m inuto) com refi :i ger ação contín ua por meio de gelo. Μ ^ n e c e s s á r i o c u 1 d < ado para garant i r qu e 3. SUS] pensão de CélU. las não aquece c ieiaas iado duram e o tra itament· 0 u itrassónico. A suspensão obt ;ida após o tra' Lamento ultra ssó nico é cem srifuaada (12 m irmtos a 20000 xg, 4o C) e ' o s obrev aadante obtido após a centri T. ΊΊ Cf 3. Ç ã O é f i . It r ado ut i 1 i Z c indo um filtro com uma dimens ão de p oro de 4 5 pm. b) Purificação da proteína de fosforilaçao do amido

Se a proteína de fosforilaçao do amido, expressa em células de E.coli for uma proteína de fusão com uma etiqueta His, a purificação pode ocorrer com ajuda de iões de níquel, aos quais a etiqueta His se liga com maior afinidade. Com este fim, 25 ml do filtrado obtido na etapa 76 d) é tratado com 1 ml de suspensão de Ni-agarose (Qiagen, Prod. No.: 30210) e a mistura é incubada durante 1 hora em gelo.

Seguidamente, a mistura de suspensão de Ni-agarose e filtrado é seguidamente passada por uma coluna de polistireno (Pierce, Prod. No.: 29920). Elimina-se o produto que passou pela coluna. A coluna é lavada primeiro por meio da aplicação de 8 ml de tampão de lise, sendo o p.7 iuto que passou pela a coluna novamente posto de 1<

. A proteína de fosforilação do amido é depois eluida por aplicação fraccionada na coluna de duas porções de 1 ml de tampão EI cada, seguido de uma porção de 1 ml de tampão E2 e depois cinco porções de 1 ml de coluna E3 cada. O produto que passou obtido durante a aplicação da fracção individual dos tampões de eluição em questão (tampões EI, S2 e E3) é recolhido em fracções separadas As a i. iquotas dest a s fracções são P osteriormente a n alisadas por meio de electroforese em gel de acrilamida SDS desnaturante, seguida de coloração com azul de Coomassie. As fracções que contêm a proteína de fosforilação do amido em quantidade suficiente e com pureza satisfatória são combinadas e concentradas a 4° c, com ajuda de filtração pressurizada. A filtração pressurizada pode ser efectuada, por exemplo com ajuda de um Amicon cell (Amicon Ultrafiitration Cell, Model 8010, Prod. No. : 5121) utilizando uma membrana DiafIo PM30 (Millipore, Prod. No. : 1.3212) a 4° C, No entanto, podem também ser empregues outros métodos conhecidos dos especialistas para a etapa de concentração. c) Composição dos Tampões Utilizados

HEPKS

Tampão de lise: bO mM 77 30 0 ϊτιΜ NaC.Ι- ΙΟ mM Imiclazole pH 8,0 (ajuste corri NaOH) 1 mg/'ml Lisosima (adicionar imediatamente antes de utilizar o tampão) M de comprimido por 10 ml de inibidores de protea.se completamente isentos de EDTA (produto Roche No. : 1873580) (adicionar imediatamente antes de utilizar o tampão)

Tampão de eluição EI: 50 mM HEPES 300 mM NaCl 75 mM Imidazole pH 8,0 (ajuste com NaOH)

Tampão de eluição Ξ2: 50 mM HEPES 300 mM NaCl 75 mM imidazole pH 8,0 (ajuste com NaOH)

Tampão de eluição E3: 50 tnM HEPES 300 mM NaCl 250 mM Imidazole pH 8,0 (ajuste com NaOH) 3. Método de detecção da actividade fosforiladora do amido de uma proteína a) Incubação de proteínas com amido e/ou amido não fosforilado

Para detectar se uma proteína possui uma actividade de fosforilação do amido, as proteínas de ensaio podem ser 78 incubadas cotn amido 6 com tri .tos.iat.os de nucleósido marcados i.ad.j.oacuivainente. Cora este obiectivo rspão de f osfori lação. tíTi a adição de Si CS até so/volume). Os gr ânulos 1 Ί '·> γ> c; • J. l l .. 1 sao s eparacl os por 0 l avados uma vez com atro vezes c om 9 0 0 μΐ de .o 2 i rM cada , Cada et ao a aproximadamente 5 mg ae arai ao era conjunto cora a proteína de ensaio (0,01 a 5,0 por mg de amido empregue) são incubados cora agitação à temperatura ambiente durante 10 minutos até 30 minutos em 50 0 yi de Seguidamente, a reacção é parada atingir uma concentração de 2% (peso/volume) de amido presentes na mistura reaceional centrifugação (1 minuto, 13000 xg) 900 μΐ de uma solução SDS a 2% e que uma solução trifosfato de nucleósido 2 raM era lava igem é efectu a da durante 15 t Tiinutos 0. temperati ara ienti e, c om agita çáo Após ca* da etapa d Θ L 0. V 3. o e m; os nulo s de amido s ão separados do tampão de lavagem em stão por centrifu igaç ão (1 min, 1 J . 0 0 0 xo 5 · Durante i araa experiência para detectar a actividade de fosforilação do amido de uma proteína, outras misturas reaccionais, que não contêm a proteína ou contêm a proteína inactivada, mas que de resto sao tratadas da mesma forma que as preparaçõe reaccionais de scritas, devem ser aaicionalmente processada para assumirem o gu e é conhecido c o m o c o nt r olo. b) Determinação da quantidade de resíduos fosfato incorporados no amido em resultado da actividade enzimática

Os grânulos de amido obtidos na etapa a) podem ser analisados quanto à presença de resíduos de fosfato com marcação radioactiva. Com este objectivo, questão é re-suspenso em 10 0 μ.1 de a g: ~i a c a. d. a 3 ml de cocktail de c intilaçao em cada caso Ready Sa fe3*1, BECKMANK Couiter) e se guidamente o amido em 79 79 ajuda de um contador Multi-Purpose Scintil de cintilações (por exemplo, jl»S 6500 .ation Counter, BECKMANN COULTER™). d) Composição dos Tampões Utilizados

Tampão de fosforilação: 50 mM HEPES-KOH, pH 7,5

1 mH ΞΒΤΑ 6 mM MgCl2 0,01 a 0,5 mM ATP 0,2 a 2 pCi por ml 33P-ATP aleatorizado 4, Identificação das posições átomo C das moléculas de glucose de um alfa-1,4-glucano, no qual são introduzidos resíduos fosfato por uma proteína de fosforilação do amido.

As posições átomo C das moléculas de glucose de um alfa-1,4-glucano que são fosforiladas por uma proteína, podem ser detectadas submetendo os glucanos obtidos, que foram fosforilados in vitro, por meio de uma proteína específica, a hidrólise, subsequente separação dos monómeros de glucose obtidos após a hidrólise, seguido de medição do fosfato incorporado por uma proteína apropriada em certas fracções das moléculas de glucose. a) Hidrólise Total dos alfa-l-glucanos

Suspensões aquosas contendo alfa-1,4-glucanos são centrifugadas, os pellets sedimentados são depois re-suspenso em HCL 0,7 M (Baker, nível analítico) e incubadas durante 2 horas a 95 °C, com agitação. Quando completa a incu ba çáo, as amostras são ra pidamente arrefecidas cent ri fugadas (por exemplo minutos 10000 xg). sobr 0 D adante o! >tido é transfe :rid( d para um reactor novo neut ra lizado c om a adição de NaOH 2 1 5 (Baker nív< 80 analítico), Se restar um pellet, este é re-suspenso em 100 μΐ de água e a quantidade de fosfato mar CSQO ρ .TΘS θ Πt Θ Θ determinada para controlo. O sobrenadante neutralizado é depois centrifugado através de um filtro de 10 kDa. Medindo uma aliquota do filtrado obtido, é determinada a quantidade de fosfato marcado no filtrado, por exemplo, com ajuda de um contador de cintilações. b) Fraccionamento dos hidrolisados e determinação das posições do átomo C fosforilado.

Os filtrados hidrolíticos neutralizados, obtidos na etapa a) (aproximadamente 3000 cpm quando é utilizado ATP com marcação radioactiva) podem ser separados com ajuda de, por exemplo, cromatografia de permuta de aniões de alta pressão (HPAE). Para que o filtrado neutraliz ado atinja o vo1ume desejado cara HPAE pode s e r di1u ído c O TU H 2 O' * Ά..·. ém disso, adicionam -se glucose-6-fosfato (cerca de 0,15 M) Cl· glucose 3 - f o s f at o (cerca de 0,3 mM) a cada f iltraido em questão para cc rntrolo interno. Pode ser e: secutada u ma separaç âo por me ; i o de HPAE, por exemplo com ajuda de um si sterna Dionex DX 600 Bio Lc , utilizando uma colu na CarboPa c PA 100 (com pré-coluna apropriada) e um detect O -L· amp e r o mé t r i c ο ρ i jlsante (ED 50) . Antes da injecção da amostra, a coluna é enxaguada primeiro durante 10 minutos com 99% de eluente C e 1% de eluente D. Seguidamente, injecta-se 600 μΐ do volume da amostra em cada caso. A amostra é eluida nas condições seguintes:

Caudal: 1 ml por minuto

Gradiente: Gradiente linear de 0 minutos a 30 minutos Eluente C: Eluente D: 81 minutos 99% 1% 30 minutos itos

Passagem terminada

Os produtos da hidró. 1 ise eli J .1 cl o s d a. c o. Luna são recolhidos em. fracções indi v riduai s d e 1 ml cada. : Dado que, em cada caso, foram adie ionacl os g 1 u c o s e - 3 - f o s fato não marcado (Ritte et al. 2002, PNAS 99, 7166-7171) e glucose- β-fosfato não marcado (Sigma f P r o d.. I \j o . ; G '7 8 79 ) á « amostras injectadas cios produtos da hidrólise como padrões internos, as fracções que contêm glucose--3--f osf ato ou glucose-6-fosfato podem ser determinadas por meio de detecção amperométrica pulsante. Medindo a quantidade de fosfatos marcados nas fracções individuais e comparando depois com as fracções que contêm glucose3-f osf ato ou glucose-6-fosfato, é possível determinar as fracções em que o glucose-6-fosfato marcado ou o glucose-3-fosfato marcado está presente. A quantidade de fosfato marcado na. fracção em questão é determinada. Agora é possível determinar a posição do átomo C que é preferencialmente fosforilado por uma enzima de fosforilação alfa-1,4 -gluc ano com base nas prop orções das quantidades, medidas para fosfato marcado, QP r jlucose -3-fosfato em compara ç ã o com glucose-6-fosfato nos hidroiisados individuais. c) Tampões utilizados

Eluente C: 100 mM NaOH Eluente D: 100 mM NaOH 5 0 0 ítíM acetato de sód 82 5, Transformação de plantas do arroz

Plantas do arroz foram transformadas de acordo com os métodos descritos por Hiei et al. (1994, Plant Journal 6 (2), 271-282) . 6. Det‘ ermi nação do Teor de Fosfat ; Q de Amido a) Del, ermi nação do Teor de Fosfat . O C-6 ‘ S'' c -P) NO anu -dO, as posições C2 , C3 e C6 das unidades de glucos e po dem ser fosforil aaae >. Pari l de te srmins Lr o teor dei Cb-F n o a.m ido, hidrolisa-se 50 mg de 3. mi do ' em 5 00 μΐ de HC1 0,7 M dura nte 4 horas a 95 °C. Em seguida , as misturas são

centrifugadas durante 10 minutos a 15.500 g e os sobrenadantes são removidos. 7 μΐ dos sobrenadantes são misturados com 193 μΐ de tampão de imidazole (100 MM de imidazole, pH 7,4; 5 mM MgC.1.2, 1 mM SDTA e 0,4 mM NAD) . A im. Depois de medição é efectuada no fotómetro estabelecer uma absorção de base, a reacção enzirnática foi iniciada por meio de adição de 2 unidades de glucose-6-fosfato desidrogenase (de Leuconostoc mesenteroides ,

Boehringer Mannneim). A alteração na absorção é directamente proporcional à concentração do teor de G-β-Ρ do amido. b) Determinação do Teor de Fosfato Total A determinação do teor de fosfato total é efectuada de acordo com o método de Ames (Methods in Enzymology VIII, (1966), 115-118).

Ap roxin ladament e 50 mg dez ami do são misturados com 30 i jl oe s o 1 Ό. ç à 0 de nit: rato de rnag nés iio eta nóiica e a mistura 0 inc ine rada durante trê s horas 5 0 0 ° C em forno d e mufla. 0 res ídu o é t zrataido com 300 μΐ de ácido clorídrico a 0,5 M ►•ti 83 di irant .e 3 0 min a 60° τρν vv -· . uepu i s, per faz-se uma. ί Θ 3. 11. qu ota até 300 μΐ de 3 ácido c 1 o r 1 ( Irico a 0,5 M, . - S 0 à mistura de 100 μΐ de ácido ase: Srbico a 10% e de mo li .bdato de amónio r\ λ o Cl U f “4 ^ t> em 2 M de ácido o e inci uba-se durante 20 minutos a 4 5 o n V- * c) Determinação do Teor de Fosfato C-6 e fosfato C-3

Para a determinação do teor de fosfato que está ligado na posição C-6 e na posição C-3 das moléculas de glucose de um alfa-l-glucano, os glucanos em questão podem ser sujeitos a uma hidrólise total e depois separados por meio de HPAE. As quantidades de glucose6-fosfato e glucoseS- to sf d t-· '·_/ podem ε ;er dete rmii sadas po r integr ação ias ár pi co ind ividuais , obtide is d epois dai separaçã o co m HPEA. Com 9. c c rapar ação da; 3 ú ΪΓ Θ 3. S pxc o obt ida de gluc· ose- 6-: fosfat o e 9 -L- u c o se 3-fosfat o em an io st r. a. s ο e s c onhecida; 3 co m as ár ^ P Q pi co que são o.bt idas con i qu antidade; 5 conheci da s de glucc ise- b — f 0 sf at o e gli ucose-3- f os: fato, H .o pois da separ ação com HP EA , é possive 2l detes :min ar a 11 .ant idade de g iucose l-O- f η s í ato e gluc :ose.3-f! .1. C ít.O r i 3 8 amostra; S Θ m ariáli se.

Exemplos 1. Informação sobre os vectores e plasmídeos Geração do vector de expressão ME5/6 0 pGSV71 é um derivado do plasmideo pGSV7, que provém do vector intermédio pGSVl. 0 pGSV71 é um derivado do pGSC1700, cuja construção foi descrita por Cornelissen and Vanderwiele (Nucleic Acid Research 17, (1989), 19-25). 0 pGSVl foi obtido a partir do pGSC1700 por eliminação do gene resistente à carbenicilina e eliminação das sequências do T-DNA da região TL-DNA do plasmideo pTiB6S3. 0 pGSV7 contém a origem da replicação do plasmideo pBR322 (Bolívar 84 et al., Gene 2, (1977), 95-113), assim como a origem da replicação do plasmídeo pVSI Pseudomonas (Itoh et al., Plasmid 11, (1984), 206). O pGSV7 contém também o gene marcador seleccionável aadA, a partir de transposões Tnl331 de Klebsiella pneumoniae, que oferece resistência contra os antibióticos spectinomicina e estreptomicina (Tolmasky, Plasmid 244 (3), (1990), 218-226; Tolmasky e Crosa, Plasmid 29(1), (1993), 31-40). O plasmídeo pGSV71 foi obtido pela clonagem de um gene bar quimérico entre as regiões limite de pGSV7 . 0 gene bar quimé rico c ’ΟΠΤΓ.ξ^ΤΠ Θ. se quênc ia promotora do vírus ; mosaico O. a. couve -flor para inic: iar a transcrição (0 deli et al., 1 ^ cL L12 re 31 3, (1 985) , 180) ,·*\ S U gene bar do St rept om yces hygx "O SC opicus (Thoi npson et a. 1.. , 1 987, EMBO J. 6, 2519- --2523) e regiã ^ O f ... O .j -não t radu zida O O Cf Θ Π Θ d 3. S 2. ntetas e nopalí: Piei dO T- •ADN de ρΊ ' i T 3 7 para terminar a r_ r· anscri Ç ã Ο Θ cl po: Liaden ilaçâc ). 0 gene bar confere uma to lerânc ia contre 1 O herb i C 2. O ci ' gluf o sinete í-amór iio. 0 T-ADN co ntém a sequêncí ci dí d flan co d.i.T reito do TL ,-ADN do plasmídeo pTiB6S3 (Gielen et al., EMBO J. 3 , (1984), 835-846) na posição 198-222. Uma sequência poliligante encontra-se localizada entre os nucleótidos 223-249. Os nucleótidos 250-1634 contêm a região promotora p35S3 d o vírus mosaico da couve-flor (Odell et al., c.f. acima). A sequência codificadora do gene da resistência à fosfinotricina de Streptomyces hygroscopicus (bar) (Thompson et al. 1987, O · JL. · 3C ima) é disposta a ent re os nucl eótido s 1635-2186. Os dois Cí odões terminais 5 no terminal 51 do gene de t ipo selv age: m bar foram sub st ítu idos pelos codões > ATG e GAC. Uma sequ 0 T1 ia p oliligante e i * c. :ontra-se localr zada entre os nuci 6Ót iduS 2187-2205 . 0 fragmento Taql de 260 bp do terminal 3' nao traduzido do gene da sintase nopalina 85 (3'nos) do t-ADN do plasmídeo pTiT37 (Depicker et al., J. Moí. Appl. Genet. 1, (1982), 561-573) está localizado entre os nucleótidos 2206 e 2465. Os nucleótidos 2466-2519 contêm uma sequência poliligante. A sequência do flanco esquerdo do PTÍB6S3 TL-ADN (Gielen et al,, EMBO J. 3, (1984), 835-846) enmcontra-se localizado na posição 2520-2544. O vector pGSV71 foi depois cortado com a enzima Psti e embotado. 0 promotor B33 e a cassete ocs foram depois excisados do vector pB33-Kan sob a forma de um fragmento EcoRI-HindIII, tornado embotado por preenchimento das extremidades e inserido no vector pGSV7i, que tinha sido cortado com Psti e embotado. O vector resultante (Me4/6) foi utilizado como vector de partida para a construção de ME5/6. Introduziu-se um ο I i .gonucieótido o o n tendo locais de c1ivagem EcoRI, PacI, Spel, Srfl, Spel, No t: I, PacI e EcoRI no local de cl ivagern Psti ; lo vector ΜΞ4 / 0 f localizado erre r e o promotor B( 33 e o eTemer ito ocs, dupin í-can do o local de cl ivagem Psti. 0 V 0 C t_. 01' de expressão resultante foi designado I4E5/6

Geraçao do vector de expressão pML80

Então, o fragmento Bamhl de ME5-6 foi trocado por um produto PCR que tinha sido prolongado em alguns sítios de clivage, mas que de resto era idêntico, dando origem ao plasmídeo pULl-17. O promotor B33, presente no pUKLl-17, foi excisado utilizando as enzimas de restrição HindiII e Psti e o vector foi embotado e religado, dando origem ao vector pMLl8-56. Este vector foi aberto com Muni e Psti e foi inserido um MCS (local de clonagem múltiplo) com extremidades adesivas adequadas e que tinha sido sintetizado por dois oligonucleótidos emparelhados (GAG CTC CTA GGC TCG AGT TAA CAC TAG TAA GCT TAA TTA AGA TAT CAT TTA CA and AAT TGT AAA TGA TAT CTT AAT TAA GCT TAC TAG TGT TAA 86 CTC GAG CCT AGG AGC TCT GCA) . 0 plasmídeo resultante pMr'72-129 foi cortado com a enzima de restrição BamHl, a saliência dos locais de clivagem foram preenchidas com ajuda de polimerase Klenow e as extremidades embotadas resultantes foram ligadas. Esta operação deu origem a. um local de clivagem de restrição Cia I. 0 plasmídeo resultante foi designado pIR91-123. 0 promotor ubiquitina designado pML 80-123. Geração do (MobiTec, Prod. Mo.: pMCS5) foi iHI e foi religado. 0 plasmídeo do milho foi excisado de pML8-52 por digestão de restrição com as enzimas Sal I e Not I e embotado e o fragmento resultante foi clonado no plasmídeo Eco RV-cut plR91-123. 0 plasmídeo resultante fo resultante foi designado pML4-52. 0 terminador nos do gene nopalina sintetase de Agrobacterium tumefaciens (Depicker et al., J. Moí. Appl. Genet. 1, (1982), 561-573), que tinha sido amplificado com ajuda dos oligonucleótidos PML9 (ACT TCT GCA GCG GCC GCG ATC GTT CAA ACA TTT GGC AAT AAA GTT TC) e PML10 (TCT AAG CTT GGC GCC GCT AGC AGA TCT GAT CTA GTA ACA TAG ATG ACA CC) foi clonado neste vector e nos locais de clivagem de restrição Pst I e Hind III. 0 plasmídeo resultante foi designado pML4-nos. Um fragmento Pst I de 1986 pares básicos de comprimento que contém o promotor do gene da poliubiquitina a partir do milho (Genbank Ace: 9446 4, Cbristensen i et al., 1992, P i β Π t Mo I. Biol .. 18 : 6 7 5- 689) 0 o primeir o ii rtrão do m ias mo oene < que ic i. libei si do t ru n cad o por digestão com Cia I e rei ígação foi clonado no vect 0 L· mencionado . 0 p^lasmídeo r* esu Itante foi designado pML 8 -52 * . Isolamento Cl 3. S sequências c odi ficadoí Γ 3 S C ia proteí na R3 d e A rabidopsis thal lana 87 87 de Arabidopsis meio de RT-PCR no irARN isolado is thaliana com A se quê n c.i. a codificadora da proteína R3 thahana foi isolada por amplificação, por de varias sequências sobrepostas, a começar a partir de folhas de plantas de Arabidoos. aproximadamente três semanas de idade (ecotipo C24) e subsequente clonagem sequencial dos fragmentos amplificados. Foram utilizados os seguintes iniciadores:

Nome Sequência F1 AAGCTGCCATGGCAACCTCTAAATC R2 AAAACTCGAGCTTAAACTTGGGGTCTAGCTTGGA

R4 C T CAGAGCCAT T GGAGCAC T CA F4

CATTGCAAACAAAAGCGGTCCTTG

Com este objectivo, foi sintetizada uma estirpe de cADN por meio da transcripta.se inversa. Revert Aid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas Prod. No: EP0451), que foi então amplificada com polimerase de ADN (Platinam Taq DNA Polymerase High Fidelity; Invitrogen Procl No.: 11304). Um fraamento de ADN com aprox. 3,2 k.b foi amplificado com 300 nq de um ARN poii-A-plus, com ajuda dos iniciadores F1 e R4 nas seguintes condições de reacção: Síntese da primeira cadeia: Foram utilizadas as condições e tampão especificados peio fabricante. A mistura reaccional para a síntese da primeira cadeia continha ainda a. s s e q u i n t e s s ub s t a n c ι a s : 30 0 ng

0,5 uM ARN poli-A-plus

Iniciador k2 adicionou-se 5x

Juntou-se água. à mistura reaccional até atingir um voluem de 12 μΐ, incubou-se durante 5 minutos a 7 0 °C e depois arrefeceu-se em gelo. Seguidamente, 88 t..ampcio de reácçao 3. 1), imbidor t <lNi 3 81 e { -í μ 1) Θ ITl. 1. S L U ΊΓ cl d.NTP (2 ul de 10 mM) e incubou-se 3. mistura ir e 3 c ^ ^ ο e ^ i durante 5 minutos a 37 °C. Após a adição da transcriptase inversa (1 μΐ) , teve lugar a síntese de cADN durante 60 minutos a 42 °C, antes de a reacção ser parada por meio de aquecimento durante 5 minutos a 70 °C.

Condições de amplilicação do fragmento R3 de 3,2 kb por meio de PCR: 2 pL da mistura reaccional da síntese da primeira cadeia

6 uM Iniciador F1 6 μΜ Iniciador R4 4 mM Mistura d.NTP 3 mM MgS04 Ix tampão de reacção 1,25 unidades de Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity

Condições de reacção:

Etapa 1 9 5 °C 2 min Etapa 2 9 5 CC 45 seg Etapa 3 61, 7 °C 45 seg Etapa 4 68 °C 3 min 30 seg + 1 seg/ciclo Repetir 35 vez : e s a part -ir da etapa 2 Depois 4 °C - Depois de s irada. a mistura reaccional PCR por. TBE-gei de ag rarose 3 0,8 %, o fragmento obi 89 89 sado uti.' mina cirúrgica e o ADM foi ado por π íeio de kit de extraeção gel (Quiagen; Prod. 28704) . S e gu i dame nt e, o fragmento c gue tinha sido

No , isolado foi cortado com as endonueleases de restrição Nco I e Eco RI e clonado no vector de clonagem pMCS5 (MobiTec, Prod. Mo.: pMCS5) que tinha sido cortado com as mesmas endonueleases de restrição. 0 plasmídeo resultante foi designado pRS79-191. A análise da sequência do produto PCR pRS79-191, que tinha sido clonado no plasmídeo pRS79-191, revelou que o fragmento continha uma inserção que resultou na interrupção da sequência de codificação. A comparação correspondente com a sequência correspondente da base de dados MCBI e uma análise da sequência inserida sugeriu que a inserção poderia ser um intrão que não tinha sido excisado. Dado que não havia a certeza de se poder sujeitar este intrão putativo a splicing em plantas transgénicas, as etapas de clonagem seguintes envolveram uma troca nesta região por uma sequência "isenta de inserções", restaurando-se assim a estrutura de leitura contínua da proteína R3 de Ara.

UOMO ±O thaliana. comp1ementar sequèn de ;odif icaçao da em falta proteína R3 de Ãrabidopsis thaliana, a região da sequenexa de codificação anteriormente mencionada foi amplificada nas condições de reacção pormenorizadas mais adiante, a começar em 300 ng de ARN poli-A-plus, com ajuda dos iniciadores F4 e R2: O cADN fio sintetizado como anteriormente descrito, exceptuando ter-se utilizado um oligo dT (parte do kit RT) em vez cie urn iniciador R2. A amplificação foi efectuada nas seguintes condições: 90 2 uL da. mistura reaccional da síntese da. primeira, cade í a 3 μΜ Iniciador F4 3 uM Iniciador R2 4 mM Mistura dN ΪΡ 2 mM MgSCq Ix tampão de reacção 1,25 unidad.es de Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity

Condições de reacção:

Etapa I 95 O O 2 min Etapa r. 95 o O 31 j seg Etapa 3 61 o O 1 min Etapa 4 68 o O 1 min 45 sec Repetir 4 0 ve z es a par tir da etapa

Depoi s 4 °C Depois de s eparada a mistura PCR por meio de um TBE-gel de agarose a 0 , 8 %, o fragmento de 1,7 kb resu iltante foi excisado d. o ge 1 e o ADN foi is o lado por meio de kit. de extracção gel (Quiagen; Prod. No, : 28 / 0 4} , Depois d. o t r a t ame n t. o com as endonucleases d .e restrição Xho T ísí Qn,o T -L. χ-" ·— f o plasmídeo for clonado no plasmídeo pRS79-191, que tinha sido cortado com as mesmas endonucleases de restrição. O plasmídeo resultante foi designado pRS8Q-227. 3, Sequências de fusão traducionais que codificam uma proteína R3 com sequências que codificam um peptídeo de sinal plastídeo 91

Primeiro, a sequência codificadora do peptídeo de sinal plastideo de Oryza sativa (variedade M202) gene dull-1 foi amplificada por meio de PCR utilizando um clone de cADN (pRS55-132) como modelo, utilizando os iniciadores SP-Mac fwd (5' -CGA TAT CTG CAG GTT TTG GCA ATG GAG AT-3 ' ) e SP-Mac-rev (5'-CTT CGA ACA ATT CTG CTT CCA G-3') e foi clonada no vector pCR 2.1 (Invitrogen. Prod. No.: K2000-01). 0 plasrnídeo resultante foi designado plC328-215. 0 clone de cADN pRS55-132 foi isolado por meio de hibridação de uma biblioteca de cADN fágica, com uma sonda radioactiva que compreende as sequências codificadoras de uma proteína de milho dul I (EMBL Accession: TQ1265; Plant Cell 10; 399-412 (1998)). Utilizando o plasrnídeo plC328-215 como modelo, amplificou-se o peptídeo de sinal plastideo do gene dul I de Oryza sativa foi amplificado com ajuda dos iniciadores Os_dul-l_SP-Pac (5'-GAC CTT AAT TAA GGT TTT GGC AAT GGA GAT G-3') e Os_dul-l_SP_Asu (5'-GCC AGG TTT CGA ACA ATT CTG CTT CGA-3'). 0 iniciador 5' (Os_dul-l_SP-Pac) incluía um local de clivagem de restrição Pac I e o iniciador 3' (Os_dul-l_SP_Asu) incluía um local de clivagem de restrição Bst BI. A amplificação foi efectuada nas seguintes condições: 10 ng plC328-215 0,2 μΜ Iniciador OS_dull_SP-Pac 0,2 μΜ Iniciador Os_dull_SP-Asu

0,4 rriM Mistura dNTP 3 mM MgSO«

Ix tampão de reacção 1,25 unidades de Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity 92

Condi çõ Θ S Ο Θ .1 aeacç 0. 0 * Etapa 1 95 °C 4 min Etapa 2 95 °C 3 0 seg Etapa 3 6 0 CC 3 0 seg Etapa 4 68 °c 2 0 seg Repetir 40 vezes a partir da etapa 2 Depois 4 °C Depois da dig estãc 3 com o fragmento PCI \ resultante com endonucl eases de n cstrição Pac I e Bst BI, o fragment o PCR foi clonado no vector pMCSS (MobiTec, Prod.. No.: pMCS5) que tinha sido cortado com as mesmas endonucleases de restrição. 0 plasmídeo resultante foi designado pAH41-227. Seguidamente, a sequência que codifica a proteína R3 de Arabidops i s thaliana foi amplificada por meio de PCR, utilizando o palsmídeo pRS80-191 como modelo e os iniciadores At_R3_Asu (5'-AAT TGT TCG AAA CCT GGC AAC CTC TAA ATC CC-3' ) e R2 (c.f. acima) . A sequência do iniciador 5? foi se) Leccionada c ie foririi a a que o codão de parti ("j 0 da seqi T 0 r-j <--< Ί 0 que codifica a proteína R3, não es :tá presei it e na. sequência amplificad a por meio de PCR, tendo s ido introduzid o um lo cal de clivagem de restri ção Bst BI . A seqi. lência R2 do ini . c i ado r 3' compra eendia um loc; al de cl i\ /agem d e restrição Xho I. A amplificação foi efectuada nas seguintes condições: 20 ng pRS80-227

3 μΜ Iniciador At_R3_Asu 3 uM Iniciador R2 4 mM Mistura dKTP 93 3 rriM MgSO* ix tampão de reacção 1,25 unidades cie Platinam Taq DNA Polymerase High Fidelity

Condições de reacção Etapa 1 95° C 2 min Etapa 2 9 5 0 C 5 0 seg Etapa 3 60° C 5 0 seg Etapa 4 68° C 4 min

Repetir 40 vezes a partir da etapa 2

Depois 4 °C O produto PCR resultante foi cortado com as endonucleases Bst BI e Xho I e clonado no plasmídeo pAH41-227 que tinha sido cortado com Bst BI e Sal I, o que deu origem ao plasmídeo AH42-227. Deste modo, foi obtida uma sequência em que o peptídeo de sinal plastídeo do gene dul I de Oryza sativa e a região codificadora da proteína R3 de Arabidopsis thaliana foram uma estrutura de leitura aberta partilhada, de forma que, depois da transcrição e tradução, obtém-se uma proteína R3 fundida traducionalmente que possui um peptídeo de sinal plastídeo. 4. Geração do vector de expressão vegetal pAH43-227 A sequência codificadora da proteína R3 de Arabidopsis thaliana, que foi fundida à sequência codificadora do peptídeo de sinal plastídeo do gene dul I de Oryza sativa foi excisada do plasmídeo pAH42-227 com ajuda das endonucleases de restrição Pac I e Avr II e clonada no 94 plasmídeo pML80-123 que tinha sido cortado com as mesmas nucleases de restrição. 5. Geração do vector de expressão vegetal plR138-210, na qual foram removidas sequências não codificadoras da região codificadora da proteína R3 0 fragmento que está presente na região codificadora da proteína R3 Arabidopsis thaliana e que compreende sequências não codificadoras foi removido do plasmídeo PAH43-227. Com este objectivo, uma sequência parcial da região codificadora da proteína R3 de Arabidopsis thaliana foi amplificada por meio de RT-PCR, a começar no mARN isolado a partir de folhas de plantas de Arabidopsis thaliana com aproximadamente três semanas de idade (ecotipo C24) .

ΐΓ ζ·\ V~ 0O rn utill .zados os s eguint.es inic .1. clCÍO -C. β S * Nome Seque :l'icia F1 AAGCT 'GCCATGGCAA CCTCTAAAT c R5 CCAAGATATTTTGCAGTAGGCTGT A s íntese da primt S ]. Γ 3. CclCK d ί S foi efectu ;ada. como anterior mente descrito (exemplo, por ito 2) . 0 fragmento desejado foi an ipli ficado nas segui ntes condições: 2 uL da m istura reaccional da síntese da primeira cadeia 0, 3 uM Iniciador F1 0,3 μΜ Iniciador Rb 0, 4 : mM Mistura dN TP raM MgSCq 95

Ix tampão de reacção 1,25 unidades de Platinum Taq DMA Polymerase High Pude1ity

Condições de reacção

Etapa 1 95° C 2 min Etapa 2 95° C 1 min Etapa o 61° C 1 min Etapa 4 GO C 2 min 20 sec Repetir 40 vezes a partir da etapa 2 Depois l °C Uma ve z que a inserção pres< ente no; 191, pRS80-227, AH42-227 e ΆΗ43-227 (intrão putativo) possui um local de clivagem de restrição Ssp J, a sequência parcial da região codificadora da proteína R3 de Arabiciopsis thaliana, que foi amplicicada por meio de PCR, for primeiro digerida, com a endonuclease de restrição Ssp I e os fragmentos por digerir (sem inserção) foram depois purificados por meio de um gel de agarose. Em seguida, o fragmento purificado foi cortado com as endonucleases de restrição Bam Hl e Spe I e trocado pelo fragmento correspondente Bam Hl/Spe I (compreendendo, entre outras, as sequências não codificadoras) do plasmídeo pAH43- 227. 0 plasmídeo resultante foi designado R138-210. 6. Geração do vector de expressão vegetal pIR139-210, no qual a sequência de codificação da proteína R3 não possui qualquer peptídeo de sinal plastídeo

Utilizando o plasmídeo pIR 138-210 como modelo, amplificoui-se uma sequência parcial codificadora da região 96 5" da pr '0 tei na R 0 O0 J±.l?ci.Q.Í. C/C :>psi. .i. ^ .... 7 * J· -:· F por ρίρ 1. o de : PCR com a j u d .o. do s i n iciadores li G.38- - tt1 ]_ (5 * — AAT TAA c:t T 7\ ST Ί T 7\ T}v TCC 7\ T Q CA ACC TCT AAA TCC CAI CAA T- 3 ' ) e I RI 3 8- R 2 (5'- AAT TAC Τ' 1G ! GAT CCC GCA ACT CAA GCA TCA CTA CAT ΑΪ O’ :a- - 3 ! ) . 0 iniciador 5' (IR138-F1) incluia um local de clivagem de restrição Pac I e a sequência para o codão de partida, original da proteína R3. 0 iniciador 3' (IR138-R2) compreendia um local de reconhecimento da endonuclease de restrição BamHI. A amplificação foi efectuada nas seguintes condições: 50 ng plasmídeo IR138-210 0,5 μΜ Iniciador IR138-F1 0,5 μΜ Iniciador I R138-R2 2 mM MgS04

0,3 mM Mistura dNTP 1 x tampão de reacção 1,5 unidades de Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity

Condiç ões de : ceac ção Etapa 3 95 °C 2 min Etapa o Zi 94 °C 3 0 seg Etapa 3 6 0 °C 2 0 seg Etapa Λ 68 cc 2 0 seg Repeti r 30 V Θ! zes a part ;ir da et; .apa 2 Depois 4 ° o u· 0 íraqment : o c le 2 4 7 bp ampli f i cado foi cortado com as nuclea s e s cie rest ri ção c a c ± Θ Bam Hl e foi substituído 97 97 pelo fra gmeiifo cac ±/Bα(n η 1 ? que es tá p resente no plasmídeo P1R138-2 J. U Θ CJ0.0 compreende o peptídec ) de si: ia! plastídeo do gene dull 1 de Orvza sativa e pairte da sequência 0' que codr ríca a proteír ici R3 de Arabidopsis t ha liana . 0 plasmídeo resultante foi designado plR139-210. A sequência codificadora da proteina R3 de Arabidopsis thaliana inclui o codão de partida que originalmente é do cADN, em contraste com a sequência que compreende no plasmídeo P1R138-210 e AH43- 227. 7. Transformação de plantas do arroz

Plantas do arroz (variedade M202) foram transformadas com o plasmideo plRI 38-210 ou com o plasmídeo plR139-201 por meio de agrobactérias (compreendendo o plasmídeo plR138-210 ou plR239-210) utilizando o método descrito por Hiei et al. (1994, Plant Journal 6(2), 271-282). arroz transaénícas

Análise de plant a) Plantas do arros que foram transformadas com o plasmídeo pIR138-210 e que expressaram uma proteína R3 de Arabidopsis thaliana em fusão com um peptídeo de sinal plastídeo. Foi utilizada análise RT-PCR quantitativa para a identificação de plantas com expressão de mARN codificador da proteína R3 de Arabidopsis thaliana. As plantas que, em comparação com as plantas de tipo selvagem correspondente, compreende uma quantidade detestável de mARN codificador da p 0 0 0 -t Γ1 cl. R3 de Arabidopsis t 1Γ1 cl .1- .11 <3 Ώ cl foram cu.lt e s t u f a , 0 s CJ 11' 3.0 S CÍ.0 8 S 3 S p .1. cl Γ.Ι tas for am colh: idos ísotado d esí ?es grãos maduros revelou um t e o r ma: em fosfat Q que estava ligado covale ntemente δ. 0 questão, em c o mp a r a ç ã o c o m o amido rsolado dO S Plantas d: ti i* ipo selvagem corre spondent :es. de 98 b) Plantas do arroz que foram transformadas com o plasmídeo pIR139-210 e expressam uma proteína R3 de Arabidopsis thaliana

Utilizando a análise quantitativa RT-PCR, foi possível identificar as plantas que expressam o mARN codificador da proteína R3 de Arabidopsis thaliana. As plantas que, em comparação com as plantas de tipo selvagem correspondente, compreende uma quantidade detectável de mARN codificador da proteína R3 de Arabidopsis thaliana foram cultivadas em plantas foram colhidos, . 0 amido maouros não revelou um teor elevado em f 'osfato qi xe e s t a v a. significativamente mai; ligado covalentemente ao amido em questão, em comparação com o amido isolado dos grãos de plantas de tipo selvagem correspondentes.

<110> Bayer CropScience GmbH <120> Plantas com um aumento da actividade de uma enzima de fosforilação do amido nos plastídeos

<130> BCS 04-5008-PCT <150> EP 04090316 <151> 2001-08-18 <150> US 60/602,454 <151> 2004-08-18 <160> 4 <170> Patentln version 3.1 <210> 1 <211> 3837 99

<212> ADN <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 atggcaacct ctaaatccca acaattccag ctaattgaag ggatggagct tcagatcacc 60 gtcactggat tgccgaatgg gagcagtgta agagctgagt ttcacctgaa gaactgcact 120 cgcgcatgga ttcttcattg gggttgtatt taccaaggaa ataaccattg gtatatccca 180 tctgaacatt cctcgaagca aggtgcattg cagactacct ttgtgaagag tggggatgca 240 tatgtagtga tçcttgagtt gcgggatcca agggtacgcg caattgaatt tgttttgaaa 300 gatggtagcc ataacaggtg gttgagacag cataatggaa acttccgtgt tgagattccc 360 tggaatgatc tccatgctca tcatcggata ccgaagactc tgatagaaag aagagcacat 420 aagatatggg accggaaggg acgaccacaa agctctgcac gtgaacaaca gatagactat 480 gacaatgcag taagagagct ccacgccgag ctcgctagag gaatatcttt agacgaactt 540 caggctaact ctacagtacc agtggagaaa gaagtaacca gtgagccaca tcacacaatg 600 atccaatcat atcgccggag gcatgatgtt cagaaatggt tacagaaata tacggaacca 660 100 atcaacagaa gtggaagtgt gaaaagttca gcccttgcag aactctccaa gagatctgtg 720 ggccaagaaa atctagtttc acagaaaagc tttcatgtca gaaactacga gatcacggtc 780 ctccaaaggg atgttaaggg agattgtcgc ttatggattg ccacgaacat ggcaggtcca 840 acagttctcc attggggagt cgcaaagtca tctgcaggag agtggttgat accaccacct 900 gacgtgttac ctgagaaatc aaaatttgtt cacggagcat gtcaaacaca atttaccgat 960 atgtcgagca gagaacactc ttatcagttt attgatataa atttaaaacg aggtggtttt 1020 gttgatatcc aatttgtaat atggtcggga ggctactggg tgaacaataa cgaagccaac 1080 ttcgttgtaa acctgaagtc agcagacagt accagtggta agcttgacgt ggatgaaaag 1140 tatgttctca aatggttact tgatgaaata tctgagcgag agaaagaggc tgagagatca 1200 ttgatgcaca ggttcaacat tgcaacagag ttgaccgagc gttgtaagga tgaaggagaa 1260 ggtggatgta ttggtataat ggtgtggatg agattcatgg ccaccagaca tctcacctgg 1320 aataagaact ataacgtgaa acctcgggaa attagtgaag cactagaaag attcaccaat 1380 ttgatggaga aaatatattt gcagcaacca aataagagag aaattgtgag actaactatg 1440. gcacttgtgg gtcgtggagg tcaaggtgat gttgggcaga gaatccgtga caaaatcctt 1S00 gttattcaga gacátaacca ctgcaaatcc ggcatgatgg aagagtggca ccaaaagttg 1560 cacaacaaca gtagcgcaga tgatgtgata atttgtgagg ctctcttgaa ctatgtgaga 1620 tctgacttca ggatcgatgc atactggcaa acactacaga ccaatggtct cacaaaagaa 1680 aggcttgcaa gttatgaccg ccccatagta tcagagcctc gtttcagaag tgattctaaa 1740. gaaggactca tccgtgacct tacaatgtac ttgaaaacat taaaggcagt tcattcaggt 1800 gcagaccttg agtctgctat tgatacgttc ctttctccat ctaagggtca tcatgtcttt 1860 gctgtcaatg gtttatcacc aaaattgcag gatctactga atttagttaa gaggcttgtt 1920 cgcgaagaga acactgagcc cctaatagag aagttagttg atgctcgcat tcagttacac 1980 cctgcactac gagcacctcg cacgagggca aaagatttac tatttttgga cattgcgttg 2040 gagtcatgtt ttaaaacaac aatagagaag agactcatct ctttaaactt caataaccca 2100 ccggaaatta tatatgtcat ctgcgtggtg cttgagaatc tgtgcttatc tatagttaac 2160 aatgaagaaa tcatattctg tacaaaggat tggtaccgtg tcagcgaggc ttacagacct 2220 catgatgttc agtgggcatt gcaaacaaaa gcggtccttg accgtttaca actagtactt 2280 gctgatagat gtcagcatta ttttaraafa atacagcçta ctacaaaata trttnntraa 2340 ctgttacgtg ttgacaagca tgggattgat gttttcactg aagaggttat aagagcaggg 2400 ccaggagccg ttttatcaac tcttgtaaac agatttgatc cttctctaag gaaaatcgcg 2460 aatttaggct gttggcaggt tatcagcctg gctgatgcat atgggtttgt ggtttgtgtg 2520 aatgagttaa ttgttgttca gaacaaattc tactcgaagc caactgtaat tattgcaagt 2580 aaagtcacag gagaagagga gatccctgct ggtgttgtag ccgtgctgac tcctagtatg 2640 attgatgtct tgtctcatgt atctattaga gcaagaaaca gçaagatatg ctttgctaca 2700 101 tgcttcgatc agaatgttct cagcaatctg aagtcgaagg aaggaagagc aatatctatt 2760 catacaaagt ctactggttt agttatcagt gatggcaaca actctggtgt ctctgttcgt 2820 catattttta tttcctctgt tccacgggga gtgatctcta aggggaagaa gttttgtggc 2880 cactatgtga tttcatctaa ggaattcaca gatgaaaggg ttggctcaaa atcatacaat 2940 ataaaatttc tacgtgaaag agttccatca tggatcaaga tacctacctc agctgctctt 3000 ccattcggaa catttgagaa tatactctca gatgattcca ataaggatgt agcacgcagg 3060 atttctgtcc ttaaagattc tcttaacaga ggagacctga caaaacttaa gtccattcaa 3120 gaagctatct tacaaatgag tgctccaatg gctctgagaa atgaactgat cacaaaattg 3180 agaagtgaaa gaatgcctta tcttggtgat gaatcaggct ggaaccgctc ctgggtggca 3240 attaagaagg tctgggcttc aaagtggaac gagagagctt atgtcagttg caaaaaaaat 3300 aagcttgatc atgatgcggt ctgcatggct gtgctgattc aagaagtcat ttgtggcgat 3360 tatgctttcg tcattcacac aaacaatccg gtctctggtg actcttcaga aatatacaca 3420 gagattgtga agggtttggg agagaccttg gttggagcat atccaggacg agcaatgagc 3480 ttcatcacca agaaaacaaa cctcaagtct ccaaccgtga tcagttaccc aagtaagagg 3540 ataggtctgt attctaaacc ctcaatcata ttcagatcag attcaaacaa cgaggatctc 3600 gaaggcaacg caggcgttgg actttacgac agtgtgataa tggatgaagc agaggaagta 3660 gtggtggatt actcaaggga gccactaata atggacaaat cctttcgagt gcgtctattc 3720 tcagcgattg cagaagctgg aaatgtgata gagtcaatct atggttgtcc tcaagacatt 3780 gaággtgttg tcaaaggtgg acatatctac atcgtccaag ctagacccca agtttaa 3837

<210> 2 <211> 3987 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <230> Sequência contendo a região codificadora da sequência de sinal plastídeo do gene dul-I de Oryza sativa fundido ao cADN codificador do gene R3 de Arabidopsis thal lana. 102 <22 0> <221> CDS <222> (1) . . (3984) <223> <22 0> sequência codificadora da sequência artificial <221> sig_peptide <222> (D · · (147) <223> sequência codificadora do peptideo de sinal plastídeo <22 0> do gene dul I de Oryza sativa <221> mat_peptide <222> (154) . . () <223> sequência codificadora do peptideo maturo do gene R3 (GWD-3' I de Arabidopsis thaliana sem a metionina do codão de partida natural <400> 2 103 atg gag atg gct ctc cgg cct caa age ctt cta tgc cct cgg age agg 48. Met Glu Met Ala Leu Arg Pro Gin ser Leu Leu cys Pro Arg ser Arg -50 -45 -40 ctg aag gtc gtç ate cgg cca gçt age agt gçc age ggt ggt ggc ctc 96 Leu Lys vai vai lie Arg Pro Ala ser ser Ala ser Gly Gly Gly Leu -35 -30 -25 -20 gcg cag tat ttc tta atg acc agg aga tat act gga age aga att gtt 144 Ala Gin Tyr Phe Leu. Met Thr Arg Arg Tyr Thr Gly Ser Arg ile Val -15 -10 -5 cga aac ctg gca acc tet aaa tcc caa caa ttc cag cta att gaa ggg 192 Arg Asn Leu Ala Thr Ser Lys ser Gin Gin. Phe Gin Leu ile Glu Gly -1 1 5 10 acg gag ctt cag ate acc gtç act gga ttg ccg aat ggg age agt gta 240 Met Glu Leu Gin ile Thr val Thr Gly Leu Pro Asn Gly Ser Ser Val 15 20 25 aga flçt gag ttt cac ctg aag aac tgc act ege gca tgg att ctt cat 288 Arg Ala Glu Phe His Leu Lys Asn Cys Thr Arg Ala Trp Ile Leu His 30 35 40 45 • tgg Trp ggt Gly tgt cys att ile tac Tyr 50 caa Gin gga Gly aat Asn aac Asn cat His 55 tgg Trp tat Tyr ate ile cca Pro tet ser 60 gaa Glu 336 cat His tcc Ser tcg Ser aag Lys caa Gin ggt Gly gca Ala ttg Leu cag Gin act Thr acc Thr ttt Phe 0 aag Lys agt ser ggg Gly 384 65 70 75 gat gca tat gta gtg ate ctt gçg ttg cgg gat cca agg gta ege gca 432 Asp Ala Tyr vai val ile Leu Glu Leu Arg Asp Pro Arg val Arg Ala 80 85 90 att gaa ttt Qtt ttg aaa gat ggt age cat aac agg tgg ttg aga cag 480 lie Glu Phe val Leu Lys Asp Gly ser His Asn Arg Trp Leu Arg Gin 95 100 105 cat aat gga aac ttc cgt gtt gag att ccc tgg aat gat ctc cat gct 528 His Asn Gly Asn Phe Arg val Glu He Pro Trp Asn Asp Leu His Ala 110 115 120 125 cat cat cgg ata ccg aag act ctg ata gaa aga aga gca cat aag ata 576 His His Arg He Pro Lys Thr Leu ile Glu Arg Arg Ala His Lys Ile 130 135 140 tgg gac cgg aag gga cga cca caa age tet gca cgt gaa caa cag ata 624 Trp Asp Arg Lys Gly Arg Pro Gin Ser Ser Ala Arg Glu Gin Gin Ile 104 14S 150 155 gac tat gac aat gca gta aga g?g ctc cac gçc gag ctc gçt aga gga 672 Asp Tyr Asp Asn Ala vai Arg Glu Leu HiS Ala Glu Leu Ala Arg Gly 160 165 170 ata tct tta gac gaa ctt cag gçt aac tct aca gta cca gta gag aaa 720 ile ser Leu ASp Glu Leu Gin Ala Asn Ser Thr Val Pro val Glu Lys 175 180 185 gaa gta acc agt gag cca cat cac aca atg ate caa tca tat ege cgg 768 GlU vai Thr ser Glu Pro His His Thr Met He Gin Ser Tyr Arg Arg 190 195 200 205 agg cat gat gtt cag aaa tgg tta cag aaa tat acg gaa cca ate aac 816 Arg His Asp Vai Gin Lys Trp Leu Gin Lys Tyr Thr Glu Pro lie Asn 210 215 . 220 aga agt gga agt gtg aaa agt tca gçc ctt gca gaa ctc tcc aag aga 864 Arg ser Gly ser vai Lys ser ser Ala Leu Ala Glu Leu ser Lys Arg 225 230 235 tct gtg ggc caa gaa aat cta gtt tca cag aaa age ttt cat gtç aga 912 ser vai Gly 240 Gin Glu Asn Leu vai 245 Ser Gin Lys Ser Phe 250 His val Arg aac tac gag ate acg gtc ctc caa agg gat gtt aag gga gat tgt ege 960 Asn & GlU lie Thr vai Leu 260 Gin Arg Asp vai Lys 265 Gly Asp cys Arg tta tgg att gee acg aac atg gca ggt cca aca gtt ctc cat tgg gga 1008 Leu Trp il e Ala Thr Asn Met Ala Gly Pro Thr val Leu His Trp Gly 270 275 280 285 gtç gca aag tca tct gca gga gag tgg ttg ata cca cca cct gac gtg 1056 vai Ala Lys ser ser Ala Gly Glu Trp Leu ile Pro Pro pro Asp val 290 295 300 tta cct gag aaa tca aaa ttt gtt cac gga gca tgt caa aca caa ttt 1104* Leu Pro GlU Lys ser Lys Phe Vai His Gly Ala cys Gin Thr Gin Phe 305 310 315 acc gat atg teg age aga gaa cac tct tat cag ttt att gat ata aat 1152 Thr Asp Met Ser Ser Arg Glu His Ser Tyr Gin phe ile Asp lie Asn 320 325 330 tta aaa cga ggt ggt ttt gtt ggt ate caa ttt gta ata tgg teg gga 1200 Leu Arg Gly Gly Phe vai 340 Giy He Gin Phe val 345 ile Trp ser Gly gac & tac Tyr tgg Trp aac Asn aat Asn 355 aac Asn gga Gly gee Ala aac Asn ttc Phe 360 gtt val gta val aac Asn ctg Leu aag Lys 365 1248 tca gca gac agt acc agt ggt aag ctt gac gta gat gaa aag tat gtt 1296 ser Ala Asp Ser Thr 370 Ser Gly Lys Leu 3$ Val Asp Glu Lys Tyr 380 val ctc aaa tgg tta ctt gat gaa ata tct gag cga gag aaa gag gçt gag 1344 Leu Lys Trp Leu Leu Asp Glu lie Ser GlU Arg Glu Lys Glu Ala Glu 385 390 395 aga tca ttg atg cac agg ttc aac att gca aca gag ttg acc gag cgt 1392 Arg ser Leu Met His Arg Phe Asn lie Ala Thr Glu Leu Thr Glu Arg 400 405 410 tgt cys aag Lys gat Asp gaa Glu gga Gly gaa Glu ggt Gly gga Gly tgt cys att Xle gat Gly ata Ile atg Met «a tgg Trp atg Met 1440 415 420 425 1488. 105 1488. 105 aga ttc atg gcc acc Arg Phe Met Ala Thr 430 . aaa cct cgg gaa Lys Pro Arg Glu aga cat ctc acc tgg aat aag aac tat aac gtg Arg Hls Leu Thr Trp Asn Lys Asn Tyr Asn vai 435 440 445 att agt gaa gca cta gaa aga ttc acc aat ttg atg ile ser Glu Ala Leu Glu Arg phe Thr Asn Leu Met 450 455 460 gag aaa ata tat ttg cag caa cca aat aag aga gaa att gtg aga cta Glu Lys He Tyr Leu Gln Glh PrO Asn Lys Arg Glu zle vai Arg Leu 465 470’ 475 aet ata aca ctt gtg ggt cgt gga ggt caa agt aat gtt aag cag aga Thr Met Ãla Leu vai Gly Arg Giy Gly Gin Gly Asp vai Gly Gin Arg 480 485. 490

gat gat gtg ata . att; tgt gag gct ctc ttg aac tat gtg aga tct gac

Asp Asp vai lie ilt Cys GluAlaLçuLeu Asn Tyr vai Arg Ser Asp SZO 1 535 540 ttc' abg ate qai qcâ tac tgf eas. aca cta. cag acc aat ggt ctc aca Phé Allg lle:/j|£ALdTyr·'trp; Leu Gin. Thr Asn Gijj Leu Thr aaa gaa agg ctt gca agt tat gac cgC ccc ata gta tea gag. cct cgt

Lys Glu Arg Leu Ala ser Tyr Asp Arg pro lie vai ser Glu Pro Arg 560 . 565 570 ttc aga agt gat tct aaa gaa gga ctc ate cgt gac ctt aça atg tac

Phe Ar| Ser Asp Ser Lys .Glúj Gly Leu lie Arg A|j3 Leu Thr Met Tyr ttg aaa aca tta aag gca gtt; cat tea ggt gca gac ctt gag tct gct

Leu Lys Thr Leu Lys Ala vai Hls ser Gly Ala.ASp Leu elu ser Ala 590 595 600 605' att gat acg ttc ctt tct cca tct aag ggt cat cat gtc ttt gct gtc ile Asp Thr Phe Leu ser pro ser Lys Gly Hls His vai Phe Ala vai 610 615 620 aat ggt tta tea cca aaa ttg cag gat cta ctg aat tta gtt aag agg

Asn Gly Leu Ser Pro Lys Leu Gin Asp Leu Leu Asn Leu Vai Lys Arg 7 625 630 635 ctt gtt ege gaa gag aàc act gag ccc cta ata gag aag tta gtt gat

Leu vai Arg Glu Glu Asn Thr Glu Pro Leu lie Glu Lys Leu Vai Asp 640 645 650 gct ege att cag tta cac cct gca cta cga gca cct ege acg agg gca

Ala Arg lie Gin Leu His pro Ala Leu Arg Ala Pro Arg Thr Arg Ala 655 660 665 aaa gat tta cta ttt ttg gac att gcg ttg gag tea tgt ttt aaa aca

Lys Asp Leu Leu Phe Leu Asp ile Ala Leu Glu Ser cys Phe Lys Thr 670 675 680 685 aca ata gag aag aga ctc ate tct tta aac ttc aat aac cca ceg gaa

Thr ile Glu Lys Arg. Leu lie Ser Leu Asn Phe Asn Asn Pro pro Glu 690 695 700 1536 1584 163? 1680 1728 1776 1824 1872 1920 1968 2016, 2064 2112 2160' 2208 2256 106 att ata tat gtc ate tgc gtg gtg ctt g^g aat ctg tgc tta tet ata 2304 ile ile Tyr val ile Cys vai val Leu Glu Asn Leu cys Leu Ser He 705 710 715 gtt aac aat gaa gaa ate ata ttc tgt aca aag gat tgg tac cgt gtc 2352 vai Asn Asn Glu GlU Ile ile phe cys Thr Lys Asp Trp Tyr Arg Val 720 72S 730 age gag gct tac aga cct cat gat gtt cag tgg gea ttg caa aca aaa 2400 Ser Glu Ala Tyr Arg Pro His Asp val Gin Trp Ala Leu Gin Thr Lys 735 740 745 gcg gtc ctt gac cgt tta caa cta ata ctt act gat aga tgt cag cat 2448 Ala vai Leu Asp Arg Leu Gin Leu Val Leu Ãla Asp Arg cys Gin His 750 755 760 765 tat ttt aca ata ata cag cct act aca aaa tat ctt ggt caa ctg tta 2496 Tyr phe Thr ile ile 770 Gin Pro Thr Thr μ Tyr Leu Gly Gin Leu 780 Leu cgt gtt gac aag cat 999 att gat gtt ttc act gaa gag gtt ata aga 2544. Arg vai Asp to His GTy ile Asp val 790 Phe Thr Glu Glu val 795 Ile Arg gea 999 cca gaa gee 9« tta tea act ctt gta aac aga ttt gat cct 2592 Ala Gly Pro 800 Gly Ala Val Leu Ser 805 Thr Leu Val Asn Arg 810 phe Asp pro tet cta agg aaa ate gcg aat tta ggc tgt tgg cag gtt ate age ctg 2640 Ser Léu Arg Lys Ile Ala Asn Leu Gly Cys Trp Gin Val ile Ser Leu 815 820 825 gct gat gça tat 999 ttt gtg gtt tgt gtg aat gag tta att gtt gtt 2688 Ala Asp Ala Tyr Gly Phe vai val cys val Asn Glu Leu Ile Val val 830 835 840 845 cag aac aaa ttc tac teg aag cca act gta att att gça agt aaa gtc 2736 Gin Asn Lys Phe Tyr 850 Ser Lys Pro Thr Val 855 Ile ile Ala Ser. Lys 860 val . aca gga gaa gag gag ate cct gçt ggt gtt gta gee gtg ctg act cct 2784 Thr Gly Glu Glu Glu Ile Pro Ala íiTw ^»j val val Ala vai Leu Thr Pro 865 870 875 • agt atg att gat gtc ttg tet cat gta tet att aga gça aga aac age 2832 ser Met Ile Asp val Leu Ser His val Ser ile Arg Ala Arg Asn ser 880 885 890 aag ata tgc ttt gct aca tgc ttc gat cag aat gtt ctc age aat ctg 2880 Lys ile cys Phe Ala Thr Cys Phe Asp Gin Asn val Leu ser Asn Leu 895 900 905 aag teg aag gaa gga aga gea ata tet att cat aca aag tet act ggt 2928 Lys 910 ser Lys gIu Gly 33 Ala He ser ile His 920 Thr Lys ser Thr Gly 925 • tta gtt ate agt gat ggc aac aac tet ggt gtc tet gtt cgt cat att 2976 Leu Val ile ser Asp Gly Asn Asn ser Gly val ser val Arg HIS ile 930 935 940 ttt att tcc tet gtt cca cgg gga gtg ate tet aag 999 aag aag ttt 3024 Phe lie Ser ser val pro Arg Gly val ile ser Lys Gly Lys Lys Phe 945 950 955 tgt 99c cac tat gtg att tea tet aag gaa ttc aca gat gaa agg gtt 3072 cys Gly His Tyr val ile Ser Ser Lys Glu phe Thr Asp Glu Arg val 960 965 970 ggc tea aàa tea tac aat ata aaa ttt cta cgt gaa aga gtt cca tea 3120 107 Gly ser Lys ser Tyr asn He Lys Phe Leu Arg Glu Arg vai pro ser 975 980 985 tgg ate aag Trg ile Lys ata cct acc ile Pro Thr 995 tea gct gct ctt cca ttc gga aca ttt gag ser Ala Ala Leu pro Phe Giy Thr Phe Glu 1000 1005 aat ata Asn xle ctc Leu tea gat ser Asp 1010 gat Asp tcc ser aat Asn aag Lys gat Asp 1015 gta val gea Ala ege Arg agg Arg att Ile 1020 tet gtc ser vai ctt Leu aaa gat Lys ASp 1025 tet ser ctt Leu aac Asn aga Arg gaa Gly 1030 gac Asp ctg Leu aca Thr aaa Lys Ctt Leu 1035 aag tcc Lys Ser att ile caa gaa Gin Glu 1040 gçt Ala ate ile tta Leu caa Gin atg Met 1045 agt ser gçt Ala cca' pro atg Met gct Ala 1050 ctg aga Leu Arg aat Asn gaa ctg Glu Leu 1055 ate ile aca Thr aaa Lys ttg Leu aga Arg 1060 agt ser gaa Glu aga Arg atg Met cct pro 1065 tat ctt Tyr Leu ggt Gly gat gaa Asp Glu 1070 tea Ser ggc Gly tgg Trp aac Asn ege Arg 1075 tcc Ser tgg Trp ST gea Ala att ile 1080 aag aag Lys Lys gtc Vai tgg gct Trp Ala '1085 tea ser aag Lys tgg Trp aac Asn gag Glu 1090 aga Arg K tat Tyr gtc val agt Ser 1095 tgc aaa Cys Lys aaa Lys aat aag Asn Lys 1100 ctt Leu gat Asp cat His gat Asp gçg Ala 1105 gtc val tgc cys atg Met gct Ala ST mo ctg att Léu zle caa Gin gaa gtc Glu Vai U15 att Ile tgt cys ggc Gly gat Asp tat Tyr 1120 gçt Ala ttc Phe gtc val att Ile cac His 1125 aca aac Thr Asn aat Asn ccg gtc Pro Val 1130 tet Ser ggt Gly gac Asp tet Ser tea ser 1135 gaa Glu ata ile tac Tyr aca Thr gag Glu 1140 att gtg 11 e Vai aag Lys ggt ttg Gly Leu 1145 gga Gly gag Glu acc Thr ttg Leu gtt val 1150 gga Gly gea Ala tat Tyr cca Pro gga Gly 1155 cga gea Arg Ala atg Met age ttc Ser Phe 1160 ate ile acc Thr aag Lys aaa Lys aca Thr 1165 aac Asn ctc Leu aag Lys tet Ser cca Pro 1170 acc gtg Thr vai ate Ile agt tac Ser Tyr 1175 cca Pro agt Ser aag Lys agg Arg ata ile 1180 ggt Gly ctg Leu tat Tyr tet ser aaa Lys 1185 ccc tea pro ser ate He ata ttc Ile Phe 1190 aga Arg tea gat ser Asp tea Ser aac Asn 1195 aac Asn gag Glu gat Asp ctc Leu gaa Glu 1200 ggc aac Gly Asn gea Ala ggc gtt Gly Val 1205 gga Gly ctt tac Leu Tyr gac Asp agt. Ser 1210 gta Val ata Ile atg Met gat Asp gaa Glu 1215 gea gag Ala Glu gaa Glu gta gtg Val val 1220 gtg Val gat tac Asp Tyr tea ser agg Arg 1225 ggg Glu cca pro cta Leu ata He atg Met 1230 gac aaa A5p Lys tcc ser ttt cga Phe Arg gtg val cgt cta Arg Leu ttc Phe tea ser gçg Ala att Ile gea Ala gaa Glu gçt Ala 3168 3213 3258 3303 3348 3393 3438 3483 3528 3573. 3618 3663 3708 3753 3798 3843 3888 108 gga aat gtg Gly Asn val jt gtt gtc Gly Val Val caa gtt taa Gin Val 1235 1240 1245 ata gag tca ate tat ggt tgt cct caa gac att gaa 3933 ile Glu ser ile Tyr Gly Cys Pro Gin Asp ile Glu 1250 1255 1260 aaa ggt gga cat ate tac ate gtc caa gct aga ccc 3978 Lys Gly Gly His Ile Tyr Ile Val Gin Ala Arg Pro 1265 1270 1275 3987

<210> 3 <211> 1328 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <230> Sequência contendo a região codificadora da sequência de sinal plastideo do gene dul-I de Oryza sativa fundido ao cADN codificador do gene R3 de Arabidopsis thaliana <400> 3 109

Met Glu Met Ala Leu Arg Pro Gin ser Leu Leu cys Pro Arg ser Arg -50 -45 -40

Leu Lys vai vai ile Arg Pro Ala ser ser Ala ser Gly Gly. Gly Leu -35 -30 -25 -20

Ala Gin Tyr Phe Leu Met Thr Arg Arg Tyr Thr Gly ser Arg Ile vai -15 -10 -5

Arg Asn Leu Ala Thr ser Lys ser Gin Gin Phe Gin Leu He Glu Gly -11 5 10

Met Glu Leu Gin Ile Thr Vai Thr Gly Leu Pro Asn Gly Ser ser vai 15 20 25

Arg Ala Glu Phe His Leu Lys Asn Cys Thr Arg Ala Trp Ile Leu His 30 35 40 45

Trp Gly cys Ile Tyr Gin Gly Asn Asn His Trp Tyr ile Pro ser Glu 50 55 60

His ser ser Lys Gin Gly Ala Leu Gin Thr Thr Phe vai Lys Ser Gly 65 70 75

Asp Ala Tyr vai vai ile Leu Glu Leu Arg Asp Pro Arg vai Arg Ala 80 -85 90 110 lie Glu Phe val Leu Lys Asp Gly ser His Asn Arg Trp Leu Arg Gin 95 100 105 H1S 110 Asn Gly Asn Phe ííi val Glu ile pro Trp 120 Asn Asp Leu His Ala 125 HÍS HÍS Arg ile Pro Lys Thr Leu ile Glu Arg Arg Ala His Lys Ile 130 135 140 Trp ASp Arg Lys Gly Arg Pro Gin ser ser Ala Arg Glu Gin Gin lie 145 150 155 Asp Tyr Asp Asn Ala val Arg Glu Leu HÍ5 Ala Glu Leu Ala Arg Gly 160 165 170 ile ser Leu Asp Glu Leu Gin Ala Asn ser Thr val pro val Glu Lys 175 180 185 Glu val Thr Ser Glu pro His His Thr Met ile Gin Ser Tyr Arg Arg 190 195 200 205 Arg His Asp Val Gin Lys Trp Leu Gin Lys Tyr Thr Glu Pro ile Asn 210 215 220 Arg Ser Gly Ser Val Lys Ser Ser Ala Leu Ala Glu Leu Ser Lys Arg 225 230 235 Ser val Gly Gin Glu Asn Leu val Ser Gin Lys ser Phe His val Arg 240 245 250 Asn Tyr Glu lie Thr Val Leu Gin Arg Asp val Lys Gly ASP cys Arg 255 260 265 Leu Trp ile Ala Thr Asn Met Ala Gly pro Thr val Leu HÍS Trp Gly 270 275 280 285 val Ala Lys ser Ser 290 Ala Gly Glu Trp Leu 295 Ile Pro Pro Pro Asp 300 Val Leu Pro Glu Lys Ser Lys Phe val His Gly Ala cys Gin Thr Gin Phe 305 310 315 Thr ASp Met ser Ser Arg Glu His Ser Tyr Gin Phe Ile ASP ile Asn 320 325 330 Leu Lys Arg Gly Gly Phe val Gly ile Gin Phe val Ile Trp ser Gly 335 340 345 Gly Tyr Trp val Asn Asn Asn Gly Ala Asn Phe Val Val Asn Leu Lys 350 355 360 365 Ser Ala Asp Ser Thr Ser Gly Lys Leu Asp val Asp Glu Lys Tyr Val 111 370 375 380

Leu Lys Trp Leu Leu Asp Glulle Ser Glu Arg Glu Lys Glu Ala Glu . 385 390 395.

Arg ser Leu Met Hls Arg,Phe asa zle Ala Thr Glu Leu Thr Glu Arg 400 405 410 cys Lys Asp Glu Gly Glu Gly Gly cys lie Gly ile Met vai Trp Met 415 420 425

Arg phe Met Ala Tlir Arg Hls Leu Thr Trp Asn Lys Asn Tyr Asn vai' 430 435 440 445

Lys Pro Arg Glu ilé-ser G1u Ala LeU Glu Arg Phe Tlir Asn Leu Met 45(7 455 460

Glu Lys lie Tyr Leu Gin Gin Pro Asn Lys Arg Glu He vai Arg Leu 465 470 475

Thr Met Ala Leu Vai; Gly Arg Glft Gly Gin Gly Asp vai Gly Gin Arg 480 48? 4S0 . élu xie Leu Vai ile ArgAspGlú iWlèUVj^ XleGlnArg Hls Asn Hls cys Lys ser

Gly Met Met Glu Glu Trg Hls Gin Lys Leu Hls Asn Asn ser ser Ala

SIS 520 525

Asp Asp Vai ilè ile cys Glu Ala Lèu Leu asií Tyr vai Arg ser Asp 530 535 540 pne Arg ile Asg Ala Tyr Trp Gin Thr Leu Gin Thr Asn Gly Leu Thr 550 Vã

Lys Glii Arg Leu Ala ser iyr Asp Arg pro ile Vai Ser Glu Pro Arg 565 570 phe Arg ser Asp Ser Lys Glu Gly Leu ile Arg Asg Leu Thr Met Tyr

Leu Lys Thr Leu Lys Ala vai Hls ser Gly Ala Asp Leu Glu ser Ala 590 595 600 605.

He Asp Thr Phe Leu Ser Pro ser Lys Gly His Hls vai Phe Ala vai 610 615 620

Asn Gly Leu ser pro·Lys Leu Gin Asp Leu Leu Asn Leu vai Lys Arg . 625' · 630 635 645

Leu Vai Arg Glu Glu Asn. Thr Glu Pro Leu ile Glu L^s Leu Vai Ásp 112

Ala Arg Ile Gin Leu His pro Ala Leu Arg Ala pro Arg Thr Arg Ala 6SS 660 665 Asp Leu Leu Phe Leu 675 ASP ile Ala Leu Glu 680 Ser Cys Phe Lys Thr 685 Thr He Glu Lys Arg 690 Leu ile ser Leu Asn 695 Phe Asn Asn Pro Pro 700 Glu Ile He Tyr val Ile cys val val Leu Glu Asn Leu Cys Leu ser Ile 705 710 715 Vai Asn Asn Glu Glu He ile Phe cys Thr Lys Asp Trp Tyr Arg val 720 725 730 Ser GlU Ala Tyr Arg Pro His Asp Val Gin Trp Ala Leu Gin Thr Lys 735 740 745 Ala val Leu Asp Arg Leu Gin Leu val Leu Ala Asp Arg cys Gin HiS 750 755 760 765 Tyr phe Thr Ile Ile Gin Pro Thr Thr Lys Tyr Leu Gly Gin Leu Leu 770 775 780 Arg val Asp Lys His Gly lie Asp val Phe Thr Glu Glu Val He Arg 785 790 795 Ala Gly pro Gly Ala val Leu ser Thr Leu val Asn Arg Phe Asp Pro 800 805 810 Ser Leu Arg Lys ile Ala Asn Leu Gly Cys Trp Gin val ile Ser Leu 815 820 825 Ala Asp Ala Tyr Gly Phe Val val cys Val Asn Glu Leu ile val val 830 835 840 845 Gin Asn Lys Phe Tyr ser Lys Pro Thr val ile ile Ala ser Lys val 850 855 860 Thr Gly Glu Glu 865 Glu Ile Pro Ala Gly 870 Val Val Ala val Leu 875 Thr Pro ser Met Ile ASp Val Leu ser His val ser He Arg Ala Arg Asn ser 880 885 890 Lys Ile Cys phe Ala Thr Cys Phe Asp Gin Asn val Leu Ser Asn Leu 895 900 905 Lys Ser Lys Glu Gly Arg Ala Ile Ser Ile His Thr Lys ser Thr Gly 910 915 920 925 113

Leu vai ile ser Asp Gly Asn Asn ser Gly vai Ser vai Arg His ile 930 935 940

Phe Ile Ser Ser vai Pro Arg Gly vai lie Ser Lys Gly Lys Lys Phe 945 950 955

Cys Gly His Tyr vai ile Ser Ser Lys Glu Phe Thr Asp Glu Arg Vai 960 965 970

Gly Ser Lys ser Tyr Asn ile Lys Phe Leu Arg Glu Arg vai Pro Ser 975 980 985

Trp ile Lys Ile pro Thr Ser Ala Ala Leu Pro Phe Gly Thr Phe Glu 990 995 1000 1005

Asn Ile Leu ser Asp Asp ser Asn Lys Asp vai Ala Arg Arg He 1010 1015 1020

Ser Vai Leu Lys Asp Ser Leu Asn Arg Gly Asp Leu Thr Lys Leu 1025 1030 1035

Lys ser ile Gin Glu Ala ile Leu Gin Met Ser Ala pro Met Ala 1040 1045 1050

Leu Arg Asn Glu Leu ile Thr Lys Leu Arg Ser Glu Arg Met Pro 1055 1060 1065

Tyr Leu Gly Asp Glu ser Gly Trp Asn Arg ser Trp vai Ala ile 1070 1075 1080

Lys Lys val Trp Ala ser Lys Trp Asn Glu Arg Ala Tyr vai ser 1085 1090 1095

Cys Lys Lys Asn Lys Leu Asp His Asp Ala Val Cys Met Ala Val 1100 1105 1110

Leu ile Gin Glu val ile Cys Gly Asp Tyr Ala Phe val Ile His 1115 1120 1125

Thr Asn Asn pro val ser Gly Asp Ser ser Glu Ile Tyr Thr Glu 1130 1135 1140 ile val Lys Gly Leu Gly Glu Thr Leu val Gly Ala Tyr pro Gly 1145 1150 1155

Arg Ala Met Ser Phe Ile Thr Lys Lys Thr Asn Leu Lys Ser pro 1160 1165 1170

Thr val Ile ser Tyr pro Ser Lys Arg Ile Gly Leu Tyr ser Lys 1175 1180 1185 114

Pro Ser 11 e ile Phe .Arg ser Asp Ser Asn Asn Glu Asp Leu Glu 1190 1195 1200 Gly Asn Ala Gly vai Gly Leu Tyr Asp Ser vai lie Met Asp Glu 1205 1210 1215 Ala Glu Glu vai vai vai Asp Tyr ser Arg Glu Pro Leu Ile Met 1220 1225 1230 Asp »-ys ser Phe Ara " 3 vai Arg Leu Phe ser Ala He Ala Glu Ala 1235 1240 1245 Gly Asn vai ile Glu ser lie Tyr Gly cys pro Gin Asp He GlU 1250 1255 1260 Gly vai vai Lys Gly Gly His lie Tyr Ile vai Gin Ala Arg pro 1265 1270 1275

Gin vai

<210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 4 ile Asp vai Leu ser His vai Ser lie Ara Ala Arg 1 5 10 115

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista das referências citadas pelo requerente serve apenas de interesse ao leitor. Não faz parte do documento da patente europeia. Apesar da compilação cuidadosa das referências, os erros ou as omissões não podem ser excluídos e o IEP rejeita toda a responsabilidade a este respeito.

Documentos de patente citados na descrição: WO 9711188 A [0010] WO 0077229 A [0010] US 6462256 B [0010] WO 0234923 A [0011] EP 120516 A [ 0054] WO 950612 A [ 0055] EP 0513849 A [0055] EP 0465875 A [ 0055] EP 0292435 A [ 0055] WO 9307279 A [0082] WO 9515972 A [0087] US 5188642 A [0093] EP 0508909 A [ 0093] EP 0924299 A [ 0093] US 5510471 A [0093] EP 0409031 6 A .[0231] 116 US 60602454 B[0231]

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Lisboa, 23/04/2010

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Célula vegetal geneticamente modificada, em que os plastideos presentes na dita célula vegetal incluem uma proteína que transfere um resíduo fosfato de um nucleosídeo trifosfato para o amido, em que a modificação genética consiste na introdução da molécula de ácido nucleico exógena no genoma da célula vegetal, onde a molécula de ácido nucleico exógena é seleccionada a partir do grupo constituído por a) moléculas de ácido nucleico que codificam uma proteína com a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID N° 3; b) moléculas de ácido nucleico que codificam uma proteína que inclui a sequência de aminoácidos, codificada pela inserção no plasmídeo DSM 16587 ou pela inserção no plasmídeo DSM 16645; c) moléculas de ácido nucleico que codificam uma proteína cuja sequência tem pelo menos 60 % de identidade com a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID N° 3; d) moléculas de ácido nucleico que codificam uma proteína cuja sequência tem uma identidade de pelo menos 60% com a sequência de aminoácidos codificada pela inserção no plasmídeo DSM 16587 ou pela inserção no plasmídeo DSM 16645; e) moléculas de ácido nucleico que incluem a sequência nucleotídica especificada na SEQ ID N° 1 ou na SEQ ID N° 2 ou uma sequência complementar; 2 f) moléculas de ácido nucleic que compreendem a sequência nucleotídica da inserção presente no plasmideo DSM 16587 ou no plasmideo DSM 16587; g) moléculas de ácido nucleico que têm uma identidade de pelo menos 60% com as sequências de ácido nucleico descritas em a), b), e) ou f); h) moléculas de ácido nucleico que hibridam com pelo menos uma cadeia das moléculas de ácido nucleico descritas em a), b), e) ou f) , sob condições restringentes; i) moléculas de ácido nucleico cuja sequência nucleotídica se desvia da sequência de moléculas de ácido nucleico mencionadas em a), b), e) ou f) , em resultado da degenerescência do código genético e j) moléculas de ácido nucleico que constituem fragmentos, variantes alélicas e/ou derivados das moléculas de ácido nucleico descritas em a), b) , c), d) , e), f), g), h) ou i) e em que a molécula de ácido nucleico exógena é uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo sequências adicionais que não se encontram naturalmente presentes numa combinação em que se encontram presentes nos ácidos nucleicos recombinantes, nos quais a molécula de ácido nucleico codificadora da proteína que transfere um resíduo fosfato a partir de um nucleosídeo trifosfato para o amido está fundida às sequências de ácido nucleico que codificam um peptídeo de sinal para o plastídeo, de forma a que a molécula de ácido nucleico recombinante codifica uma proteína que transfere um resíduo fosfato a partir de um nucleosíodeo trifosfato para o amido e que possui uma 3 sequência de sinal para o plastídeo para além da sua sequência de aminoácidos.

2. Célula vegetal de acordo com a reivindicação 1 que sintetiza um amido modificado em comparação com as células vegetais de tipo selvagem não modificadas geneticamente, em que o amido modificado inclui um teor de fosfato de amido aumentado e/ou uma distribuição de fosfato modificada.

3. Planta que inclui células vegetais geneticamente modificadas de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2.

4. Planta de acordo com a reivindicação 3 que é uma planta armazenadora de amido.

5. Material de propagação de uma planta de acordo com a reivindicação 3 ou 4, compreendendo uma célula vegetal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2.

6. Parte que pode ser colhida de uma planta de acordo com a reivindicação 3 ou 4, compreendendo uma célula vegetal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2.

7. Método de geração de uma planta geneticamente modificada em que a) uma célula vegetal é transformada, conduzindo a transformação a um aumento da actividade de pelo menos uma proteína que codifica uma proteína que 4 transfere um resíduo fosfato a partir de um nucleosídeo trifosfato para o amido em comparação com células vegetais correspondentes não modificadas geneticamente, de tipo selvagem, e que consiste na introdução de uma molécula de ácido nucleico exógena codificadora de uma proteína que transfere um resíduo fosfato a partir de um nucleosídeo trifosfato para o amido seleccionada a partir do grupo constituído por I i) moléculas de ácido nucleico que codificam uma proteína com a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID N° 3; ii) moléculas de ácido nucleico que codificam uma proteína que inclui a sequência de aminoácidos, codificada pela inserção em DSM 16587 ou pela inserção em DSM 16645; iii) moléculas de ácido nucleico que codificam uma proteína cuja sequência de aminoácidos tem pelo menos 60 % de identidade com a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID N° 3; iv) moléculas de ácido nucleico que codificam uma proteína cuja sequência tem uma identidade de pelo menos 60% com a sequência de aminoácidos, codificada pela inserção no plasmídeo DSM 16587 ou pela inserção no plasmídeo DSM 16645; v) moléculas de ácido nucleico que incluem a sequência nucleotídica especificada na SEQ ID N° 1 ou na SEQ ID N° 2 ou uma sequência complementar; 5 vi) moléculas de ácido nucleic que compreendem a sequência nucleotidica da inserção presente no plasmideo DSM 16587 ou no plasmideo DSM 16645; vii) moléculas de ácido nucleico que têm uma identidade de pelo menos 70% com as sequências de ácido nucleico descritas em i), ii), v) ou vi); viii) moléculas de ácido nucleico que hibridam com pelo menos uma cadeia das moléculas de ácido nucleico descritas em i) , ii) , v) ou vi) sob condições restringentes; iix) moléculas de ácido nucleico cuja sequência nucleotidica se desvia da sequência de moléculas de ácido nucleico mencionadas em i) , ii) , v) ou vi), em resultado da degenerescência do código genético e ix) moléculas de ácido nucleico que constituem fragmentos, variantes alélicas e/ou derivados das moléculas de ácido nucleico descritas em i) , ii), iii), iv), v), vi), vii), viii) ou iix), no genoma da célula vegetal, em que a dita molécula de ácido nucleico exógena é uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo sequências adicionais que não se encontram naturalmente presentes numa combinação em que se encontram presentes nos ácidos nucleicos recombinantes, nos quais a molécula de ácido nucleico codificadora da proteína que transfere um resíduo fosfato a partir de um nucleosídeo trifosfato para o amido está fundida às sequências de ácido nucleico que codificam um peptídeo de sinal para o plastídeo, de forma a que a molécula de ácido nucleico recombinante codifica uma proteína que transfere um resíduo 6 fosfato a partir de um nucleosíodeo trifosfato para o amido e que possui uma sequência de sinal para o plastideo para além da sua sequência de aminoácidos, b) uma planta é regenerada a partir de células vegetais da etapa a) e c) se apropriado, são produzidas mais plantas com ajuda das plantas de acordo com a etapa b).

8. Método de produção de amido modificado, compreendendo a etapa de extração do amido a partir de uma célula vegetal de acordo com o reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 ou 2 ou de extração do amido de uma planta de acordo com o reivindicado na reivindicação 3 ou 4.

9. Método de produção de um amido modificado, compreendendo a etapa de extração do amido de partes de planta que podem ser colhidas de acordo com o reivindicado na reivindicação 6.

10. Método de produção de farinhas compreendendo a etapa de moagem de partes de plantas de acordo com o reivindicado na reivindicação 3 ou 4 ou de material de propagação de acordo com o reivindicado na reivindicação 5 ou material que pode ser colhido de acordo com o reivindicado na reivindicação 6.

11. Utilização de uma célula vegetal geneticamente modificada de acordo com o reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 ou 2 ou de uma planta de acordo 7 com o reivindicado na reivindicação 3 ou 4 para a produção de uma farinha.

12. Molécula de ácido nucleico codificadora de uma proteína com a actividade enzimática de uma proteína que transfere um resíduo fosfato a partir de um nucleosídeo trifosfato para amido seleccionada a partir do grupo constituído por a) molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína com a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID N° 3 b) molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína cuja sequência de aminoácidos tem pelo menos 60 % de identidade com a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID N° 3; c) molécula de ácido nucleico que inclui a sequência nucleotídica especificada na SEQ ID N° 1 ou na SEQ ID N° 2 ou uma sequência complementar destas sequências; d) molécula de ácido nucleico que tem uma identidade de pelo menos 70% com as sequências de ácido nucleico descritas em a) ou c); e) molécula de ácido nucleico que híbrida com pelo menos uma cadeia da molécula de ácido nucleico descrita em a) ou c) sob condições restringentes; f) molécula de ácido nucleic cuja sequência nucleotídica se desvia da sequência de moléculas de ácido nucleico mencionadas em a) ou c) , em resultado da degenerescência do código genético e 8 g) molécula de ácido nucleico que constitui um fragmento, variante alélica e/ou derivado das moléculas de ácido nucleico descritas em a), b) , c) , d) , e) ou f) , e em que a molécula de ácido nucleico mencionada é uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo sequências adicionais que não se encontram naturalmente presentes numa combinação em que se encontram presentes no ácido nucleico recombinante, em que a molécula de ácido nucleico codificadora da proteína que transfere um resíduo fosfato a partir de um nucleosídeo trifosfato para o amido está fundida às sequências de ácido nucleico que codificam um peptídeo de sinal para o plastídeo.

13. Vector compreendendo uma molécula de ácido nucleico de acordo com o reivindicado na reivindicação 12.

14. Vector de acordo com a reivindicação 13, em que a molécula de ácido nucleico está ligada a sequências reguladoras que iniciam a transcrição em células procariotas e eucariotas.

15. Célula hospedeira que compreende uma molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 12 ou um vector de acordo com a reivindicação 13 ou 14.

16. Composição compreendendo uma molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 12 ou um vector de acordo com a reivindicação 13 ou 14. 9

17. Utilização de uma composição de acordo com a reivindicação 16 para a identificação de células vegetais, em comparação com células vegetais de tipo selvagem, não modificadas geneticamente, que revela um aumento na actividade de uma proteína que transfere um resíduo fosfato a partir de nucleosídeo trifosfato para o amido.

18. Proteína com actividade de fosforilação do amido seleccionada a partir do grupo constituído por a) uma proteína que inclui uma sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID N° 3, b) uma proteína com pelo menos 60 % de identidade com a sequência de aminoácidos das proteínas citadas em a) fundida às sequências de aminoácidos que codificam um peptídeo de sinal para o plastídeo.

19. Proteína recombinante que inclui sequências de aminoácidos codificadoras de uma proteína de acordo com a reivindicação 18, fundida às sequências de aminoácidos que codificam um peptídeo de sinal para o plastídeo.

20. Proteína de acordo com a reivindicação 18 ou 19 que possui um domínio fosfo-histidina. Lisboa 23/04/2010