DE69929323T2

DE69929323T2 - Kontrollierte abgabe der wachstumsfaktoren von heparin enthaltenden matrizen

Info

Publication number: DE69929323T2
Application number: DE69929323T
Authority: DE
Inventors: E. Shelly St. Louis SAKIYAMA-ELBERT; A. Jeffrey HUBBELL
Original assignee: Eidgenoessische Technische Hochschule Zurich ETHZ; Universitaet Zuerich
Current assignee: Eidgenoessische Technische Hochschule Zurich ETHZ; Universitaet Zuerich
Priority date: 1999-04-22
Filing date: 1999-04-22
Publication date: 2006-09-07
Anticipated expiration: 2019-04-23
Also published as: ES2255257T3; AU3438199A; CA2369579A1; DE69929323D1; JP2002542301A; ATE314863T1; MXPA01010567A; EP1178834B1; EP1178834A1; WO2000064481A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet dreidimensionaler Matrices, die pharmakologisch aktive Moleküle, insbesondere Wachstumsfaktoren, enthalten. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von Wachstumsfaktoren oder Proteinen in einer Matrix, die zur Förderung von Zell- und Gewebewachstum konstruiert ist. Die Erfindung betrifft außerdem die Verwendung von Wachstumsfaktoren mit geringer Heparin-Bindungsaffinität. Zusätzlich betrifft die Erfindung das Gebiet der Fertigungsgegenstände, die als implantierbare Vorrichtungen und Wundverbände brauchbar sind, da die Matrix der Erfindung dazu ausgelegt ist, in Verbindung mit solchen Vorrichtungen verwendet zu werden, um für eine verzögerte und kontrollierte Wachstumsfaktor-Freisetzung zu sorgen, wodurch die Wundheilung bei dem Patienten gefördert wird.
HINTERGRUND
Viele Wachstumsfaktoren werden für "Heparin-bindende" Wachstumsfaktoren gehalten. Familien mit einem oder mehreren Mitgliedern, die Heparin binden, umfassen Fibroblaten-Wachstumsfaktoren und knochenmorphogenetische Proteine (BMPs – bone morphogenetic proteins) (1, 2). Weitere Wachstumsfaktoren, die Heparin binden, umfassen den umformenden Wachstumsfaktor β1 (TGF – transforming growth factor β1 (TGF-β1)), Interleukin-8, Neurotrophin-6, den Gefäß-Endothelzellen-Wachstumsfaktor, den Heparin-bindenden epidermalen Wachstumsfaktor, den Hepatozyten-Wachstumsfaktor, den Bindegewebe-Wachstumsfaktor, Midkine und das Heparin-bindende wachstumsassoziierte Molekül (3 bis 11). Diese Faktoren haben das Potenzial, die Heilung bei vielen unterschiedlichen Gewebetypen einschließlich Gefäßsystem, Haut, Nerven und Leber zu fördern, gezeigt.
Vorrichtungen zur kontrollierten Zuführung auf der Basis der Heparin-Affinität dieser Wachstumsfaktoren wurden früher konstruiert (12 bis 14). Diese Arznei mittel-Zuführvorrichtungen wurden früher zur Zuführung von "Heparin-bindenden" Wachstumsfaktoren verwendet. Für solche "Heparin-bindenden" Wachstumsfaktoren werden typischerweise jene gehalten, die mit einer relativ hohen Affinität an Heparin binden, oft gekennzeichnet durch eine Elution aus Heparin-Affinitätssäuren bei NaCl-Konzentrationen gut oberhalb physiologischer Spiegel (> 140 mM). In derartigen Zuführsystemen wird die Heparin-Bindungsaffinität des Wachstumsfaktors üblicherweise verwendet, um die Wachstumsfaktoren an immobilisiertes Heparin irgendeiner Form zu sequestrieren. Beispielsweise haben Edelman et al. Heparin-konjugierte Sepharose-Perlen verwendet, um basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (basic fibroblast growth factor – bFGF) zu binden, und die Perlen dann mit Alginat verkapselt (12, 19). Diese Perlen dienen als Reservoirs, die bFGF langsam auf der Basis der Bindungs- und Dissoziationskonstanten von bFGF und Heparin freisetzen.
Die Zuführung "nicht-Heparin-bindender Wachstumsfaktoren" erforderte früher Freisetzungsverfahren zur Zuführung, die typischerweise auf einer diffusionskontrollierten Freisetzung der Faktoren aus porösen Materialien basierten (15 bis 18). Es bleibt ein Bedarf auf medizinischem Gebiet an einer Vorrichtung, die in der Lage ist, für die Freisetzung gering-Heparin-bindender Wachstumsfaktoren mit einer kontrollierten und vorhersehbaren Rate zu sorgen, um für eine effektive Freissetzung des Faktors über einen klinisch nützlichen Zeitraums während des Wundheilungsprozesses zu sorgen.
WO-A-99/54359 (Stand der Technik im Sinne von Art. 54(3) EPÜ) offenbart eine Matrix zur Reinigung von Proteinen durch Affinitätschromatografie, aufweisend ein Heparin-Sepharose-Gel mit einem Heparin mit geringer Affinität bindenden Protein (IGF-1) und einem Heprain mit hoher Affinität bindenden Protein (MBF-2), die daran gebunden sind. EP-A-0 838 219 und EP-A-0 732 105 offenbaren eine kontrolliert freigesetzte Formulierung, aufweisend einen Heparin mit geringer Affinität bindenden Wachstumsfaktor und Heparin oder ein Heparin-ähnliches Oligosaccharid, die in einer Collagenmatrix eingeschlossen sind. M.E.Nimni (1997) Biomaterials 18, 1201–1225, offenbart eine ähnliche Formulierung zur kontrollierten Freissetzung, die Heparin mit geringer Affinität bindende Wachstumsfaktoren aufweist, die in einer Hydrogelmatrix eingeschlossen sind. WO-A-92/09301 offenbart eine Formulierung zur Förderung der Wundheilung, die einen Heparin-bindenden Wachstumsfaktor, Heparin und Fibrinkleber aufweist. In keiner dieser Matrices ist Heparin (oder ein Heparin-ähnliches Polysaccharid oder Polymer) an ein Peptid gebunden, das wiederum kovalent an das Substrat gebunden ist und eine Heparin mit hoher Affinität bindende Domäne hat.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Allgemein und insgesamt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung nicht-Heparin-bindender Wachstumsfaktoren in Zuführtechniken, die Wachstumsfaktoren mit Heparin-Affinität einsetzen, durch Verwendung von Sequenzen mit geringer Heparin-Affinität, die in vielen Proteinen vorhanden sind. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben gefunden, dass die bestimmten Wachstumsfaktoren, die als Teil der Erfindung verwendet werden, eine basische Sequenz an einer Stelle in dem Protein, die in der natürlichen Konformation der Proteine frei zugänglich ist, besitzen. Dieser basische Bereich kann nur eine relativ geringe Heparin-Affinität besitzen.
"Geringe Heparin-Bindungsaffinität" eines Wachstumsfaktors oder eines Peptid-Fragments davon, wie sie in der Beschreibung der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist als irgendein Protein, Peptid oder Derivat oder Kombination davon definiert, die in der Lage ist, die biologische Aktivität eines Wachstumsfaktors zu zeigen und eine relativ geringe Bindungsaffinität zur Bindung von Heparin hat und aus einer Heparin-Affinitätssäule bei sub-physiologischen NaCl-Konzentrationen eluiert. Physiologische Gehalte an NaCl können als etwa 140 mM NaCl definiert werden. Daher kann hierin der Begriff "sub-physiologische" Gehalte an NaCl außerdem als von zwischen etwa 25 mM bis etwa 140 mM NaCl definiert werden. Obwohl Wachstumsfaktoren mit geringer Heparin-Bindungsaffinität aus Heparin-Affinitätssäulen bei sub-physiologischen NaCl-Konzentrationen eluieren, kann ihre geringe Affinität zu Heparin noch verwendet werden, um das Protein oder Peptid an eine Matrix, die Heparin oder eine Heparin-Bindungsstelle enthält, zu sequestrieren.
Beispielhaft und ohne jede Absicht, auf irgendeinen Wirkungsmechanismus beschränkt zu werden, kann die Erfindung als eine Matrix mit Wachstumsfaktor-Proteinen mit einem relativ hohen Anteil an Heparin-Bindungsstellen verwendend beschrieben werden. Ein Verhältnis von Heparin zu Wachstumsfaktor von mindestens 1:1 muss verwendet werden, aber je größer der Überschuss an Heparinstellen, desto langsamer die Freisetzung. Auf diese Weise können in erster Linie "nicht-Heparin-bindende" Wachstumsfaktoren oder Peptid-Fragmente davon mit relativ geringer Heparin-Bindungsaffinität an eine Heparin-dekorierte Matrix gebunden werden. Diese Matrices können dann als Reservoirs dienen, die den zuzuführenden Wachstumsfaktor oder -faktoren enthalten. Die Abspaltungskinetik von Proteinen, die Heparin mit geringer Affinität binden, ist relativ schnell, aber die hohe Anzahl an Bindungsstellen erlaubt eine erneute Bindung des Wachstumsfaktors, bevor er aus der Matrix herausdiffundieren kann. Eine Freisetzung kann durch Herausdiffundieren des Wachstumsfaktors aus der Matrix vor einer erneuten Bindung auftreten, oder sie kann auftreten, wenn der Wachstumsfaktor vor einer erneuten Bindung an eine Heparinstelle auf einen Zelloberflächenrezeptor trifft. Auf diese Weise kann die Freisetzung des Wachstumsfaktors oder eines bioaktiven Fragments davon aufrechterhalten werden und fortfahren, eine verbesserte Heilung zu fördern.
Allgemein und insgesamt beschreibt die vorliegende Erfindung in mindestens einem Aspekt eine speziell konstruierte Matrix, die für die Freisetzung von Wachstumsfaktoren oder bioaktiven Fragmenten davon sorgt. Der Wachstumsfaktor ist so definiert, dass er eine geringe Bindungsaffinität für Heparin hat. Die Matrix kann genauer so definiert werden, dass sie ein Substrat, das in der Lage ist, für eine Anbringung von Heparin, eines Heparin-ähnlichen Polysaccharids oder eines Heparin-ähnlichen Polymers zu sorgen, und einen Wachstumsfaktor oder ein Peptid-Fragment davon mit einer basischen Domäne, die Heparin mit geringer Affinität bindet, aufweist.
Die charakteristische Eigenschaft des Wachstumsfaktors oder des Peptid-Fragments davon als an Heparin mit geringer Affinität bindend kann außerdem beschrieben werden als ein Peptid/Protein, das aus einer Heparin-Affinitätssäule bei einer NaCl-Konzentration von etwa 25 mM bis etwa 140 mM eluiert.
Der Wachstumsfaktor oder das Peptid-Fragment davon mit "geringer Heparin-Bindungsaffinität" kann außerdem als eine Länge von etwa 8 bis 30 Aminosäureresten aufweisend definiert werden. Diese Sequenz von Aminosäureresten kann in einigen Ausführungsformen als mindestens zwei basische Aminosäurereste, ein Verhältnis von basischen zu sauren Aminosäureresten von mindestens zwei, und ein Verhältnis von hydrophoben Aminosäureresten zu basischen Aminosäureresten von mindestens 0,67 aufweisend definiert werden. Der Wachstumsfaktor oder das Fragment davon eluiert aus einer Heparin-Affinitätssäule bei weniger als 140 mM oder bei etwa 25 bis etwa 140 mM NaCl.
Für die Zwecke dieser Anmeldung können die basischen Aminosäuren als K (Lysin) oder R (Arginin) definiert werden. Die sauren Aminosäurereste können außerdem als D (Asparaginsäure) oder E (Glutaminsäure) definiert werden. Die hydrophoben Aminosäurereste können als A (Alanin), V (Valin), F (Phenylalanin), P (Prolin), M (Methionin), I (Isoleucin) oder L (Leucin) definiert werden. Für die Zwecke dieser Anmeldung wird an einer Disulfid-Brücke beteiligtes C (Cystein) ebenfalls als hydrophob betrachtet.
Beispielhaft umfasst der Wachstumsfaktor mit geringer Heparin-Bindungsaffinität oder ein Peptid-Fragment davon, wie in der Erfindung definiert, Neurturin, Persephin, IGF-1A, IGF-1β, EGF, NGFβ, NT-3, BDNF, NT-4, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 oder ein Peptid-Fragment von irgendeinem von diesen. Es können andere Wachstumsfaktoren gefunden werden, die ähnliche basische Domänen enthalten, die hier nicht aufgezählt sind. Die Matrix selbst kann auch irgendeines aus einer Vielfalt von Materialien aufweisen, wie Fibrin, Collagen, Hyaluronsäure oder ein synthetisches Polymer-Hydrogel. Beispielhaft kann das synthetische Polymer-Hydrogel ein Poly(ethylenglycol)hydrogel oder ein Derivat davon sein. Andere synthetische Polymer-Hydrogele außer den hier aufgezählten können verwendet werden.
Die Peptide der Erfindung, die Heparin mit hoher Affinität binden, haben eine charakteristische Aminosäure-Domäne, die aus einer Heparin-Affinitätssäule bei weniger als 140 mM NaCl nicht eluiert. Es gibt zwar viele mögliche Peptide, aber die Erfinder haben mehrere Peptidsequenzen im Besonderen identifiziert. Diese sind beispielhaft aufgeführt in den Aminosäure-Sequenzen, die in SEQ.ID.NO.:1, SEQ.ID.NO.:2, SEQ.ID.NO.:3, SEQ.ID.NO.:4 und SEQ.ID.NO.:5 identifiziert sind. Außer den hier speziell aufgezählten Sequenzen können viele andere Peptide verwendet werden.
Das Heparin oder die Heparin-ähnlichen Polysaccharide der Erfindung können außerdem, zumindest in einigen Ausführungsformen, als ein Molekulargewicht von mindestens 3000 Dalton aufweisend charakterisiert werden. Es ist beabsichtigt, dass Heparin oder ein Heparin-ähnliches Polysaccharid praktisch jeden Molekulargewichts von mindestens 3000 Dalton ohne irgendeine obere Molekulargewichtsbeschränkung bei der Ausführung der Erfindung verwendet werden könnte. Aus praktischen Gründen kann ein Molekulargewichts-Maximum von 10.000.000 in Betracht gezogen werden. Bei bestimmten Anwendungen kann das Heparin-ähnliche Polysaccharid außerdem als ein Polysaccharid mit einem Molekulargewicht von mindestens 3000 Dalton und mit mindestens einer negativen Ladung pro 2 Saccharidringen und nicht mehr als einer positiven Ladung pro 10 Saccharidringen definiert werden.
Beispiele für Heparin-ähnliches Polysaccharid umfassen Dextransulfat, Chondroitinsulfat, Heparinsulfat, Fucan, Alginat oder Derivate davon. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben gefunden, dass bestimmte Matrix-Präparate, die ein bestimmtes Molverhältnis von Heparin zu Wachstumsfaktor, wie ein Molverhältnis von 1, umfassen, bei der Durchführung der Erfindung verwendet werden können. Es wurde außerdem gefunden, dass eine Matrix der Erfindung, die ein Molverhältnis von kovalent gebundenem Peptid mit einer Bindungsdomäne, die Heparin mit hoher Affinität bindet, zu Heparin oder einem Heparinähnlichen Polysaccharid von mindestens 1 aufweist, in einigen Ausführungsformen der Matrix ein bevorzugtes Verhältnis ist. Diese Heparin- und Heparinähnlichen Polysaccharide können entweder kovalent an das Substrat gebunden werden oder über nicht-kovalente Wechselwirkungen immobilisiert (d.h. elektrostatisch gebunden) werden. Es können synthetische Polymere konstruiert werden, die in Heparin-ähnlicher Weise wirken.
Das Substrat der Matrix, wie es in der vorliegenden Erfindung definiert ist, kann Fibrin, Collagen, Hyaluronsäure, ein synthetisches Polymergel, ein Gemisch davon oder irgendeine Variante synthetischer Derivate davon, die in der Lage ist, die Anbringung der hier beschriebenen Arten von Peptiden, und/oder Zellen, zu unterstützen, aufweisen.
Die Matrix und verschiedene hierin beschriebene Ausführungsformen der Matrix schaffen eine Vielzahl von Vorteilen, insbesondere bei Verwendung an Gewebestellen, wo eine Wundheilungsreaktion erwünscht ist. Der Wachstumsfaktor oder das Peptid-Fragment davon, der (das) in der Matrix bereitgestellt wird, wird durch den Abbau einer Komponente der Matrix, durch die Abspaltung des Wachstumsfaktors von dem Heparin oder dem Heparin-ähnlichen Polysaccharid oder durch eine Kombination dieser Mechanismen freigesetzt. Auf diese Weise kann eine dauerhaftere und kontrolliertere Freisetzung von Wachstumsfaktor zu der Stelle hin, an der die Matrix implantiert ist, erreicht werden. Durch die vorliegende Erfindung werden Verfahren zur Schaffung der kontrollierten Freisetzung von Wachstumsfaktor an einer Wundstelle, an der er gebraucht wird, bereitgestellt. Der Wachstumsfaktor für derartige Anwendungen kann TGF-β3 umfassen, der bei der Hautheilung besonders nützlich sein kann. Die Erfindung stellt verschiedene Fertigungsgegenstände bereit, wie ein Gefäßtransplantat oder einen Shunt, oder einen Gewebeersatz, der die in dieser Offenbarung definierte Matrix aufweist. Derartige Gegenstände können in einigen Ausführungsformen als implantierbare sterilisierte Zusammensetzungen definiert werden. Das in den vorliegenden Beispielen verwendete Heparin-bindende Peptid besitzt eine hohe Heparin-Affinität.
Zusätzlich zur Verwendung von Protein-Matrices als die Substrate des Zuführsystems können andere Arten von Matrices verwendet werden. Synthetische Polymer-Hydrogele, einschließlich Hydrogelen, die durch Fotopolymerisation oder durch Konjugat-Additionsreaktionen gebildet wurden, können als das Substrat für die Zuführvorrichtung verwendet werden. Dieses synthetische Material kann Zellanhaftungsdomänen, Substrate für enzymatischen Abbau oder Hydrolyse, Heparin-bindende Domänen oder kovalent gebundenes Heparin enthalten. Derartige synthetische Matrices können durch entweder kovalente oder nicht-kovalente Anbringung von Heparin Wachstumsfaktor-Proteine mit geringer Heparin-Bindungsaffinität binden und sie in kontrollierter Weise freisetzen. Die Freisetzung kann genau wie in Protein-Matrices durch Abbau von Matrix-Komponenten oder durch Abspaltung der Wachstumsfaktor-Proteine mit geringer Heparin-Bindungsaffinität stattfinden.
Das Substrat für das Zuführsystem kann auch Matrices aus Hyaluronsäure oder Hyaluronsäure-Derivaten umfassen. Derartige Materialien werden allgemein verwendet und sind leicht verfügbar. Der Zusatz von kovalent oder nicht-kovalent gebundenem Heparin oder Heparin-ähnlichen Polysacchariden kann verwendet werden, um für eine kontrollierte Zuführung von Wachstumsfaktor-Proteinen mit geringer Heparin-Bindungsaffinität zu sorgen. Die Freisetzung kann genau wie in Proteinmatrices oder in synthetischen Polymermatrices durch den Abbau von Matrix-Komponenten oder durch die Abspaltung der Wachstumsfaktor-Proteine mit geringer Heparin-Bindungsaffinität stattfinden.
Zusätzlich zu Heparin haben andere Heparin-ähnliche Polymere eine ähnliche Bindungsaffinität für Heparin-bindende Proteine und Peptide. Derartige Heparinähnliche Polymere umfassen beispielsweise Dextransulfat, Chondroitinsulfat, Heparinsulfat, Fucan und Alginat (siehe Maaroufi, et al., 1997 (46) und Logeart, et al., (1997 (47)). Zusätzlich gibt es auch synthetische Heparin-ähnliche Polymere oder Polysaccharid-Derivate, die eine ähnliche Bindungsaffinität für Heparinbindende Proteine oder Peptide haben wie Heparin. Beispiele für Heparin-ähnliche Polysaccharid-Derivate umfassen Dextran-Derivate wie jene, die hergestellt wurden von Raucourt, et al., (1998) (48) und Bagheri-Yamand, et al., (1998) (49). Beispiele für Heparin-ähnliche synthetische Polymere umfassen jene von Silver, et al., (1992) (50). Für die Zwecke dieser Erfindung soll die Verwendung des Begriffs "Heparin" alle Heparin-ähnlichen Polymere und Polysaccharide einschließlich der oben beschriebenen umfassen.
(1) Drei-Buchstaben- und Ein-Buchstaben-Abkürzungen für Aminosäuren:
Auf die folgenden Sequenzen wird in der Beschreibung der vorliegenden Erfindung Bezug genommen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 Effekt von Matrix-gebundenem basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor auf das Neuriten-Streckungswachstum von Spinalwurzelganglien in dreidimensionalen Fibrin-Gelen. Die Ganglien wurden aus 8-tägigen Kükenembryos herauspräpariert und in vorgewaschene Fibrin-Gele gebracht. * bezeichnet p < 0,05 gegenüber unmodifiziertem Fibrin. Die löslichen Behandlungen enthalten bFGF, aber kein Heparin oder Heparin-bindendes Peptid. Diese Behandlungen zeigen keinen Unterschied zu unmodifiziertem Fibrin, was nahe legt, dass das verwendete Waschprotokoll ausreichend war, um ungebundenen Wachstumsfaktor zu entfernen. Die Ergebnisse legen auch nahe, dass Peptid, Heparin und Wachstumsfaktor allesamt notwendige Komponenten des Systems zur kontrollierten Freisetzung sind.
Balken 1, Fibrin; Balken 2, mit Peptid + Heparin; Balken 3, 0,1 μg/ml gebunden; Balken 4, 1,0 μg/ml gebunden; Balken 5, 1,0 μg/ml löslich; Balken 6, 5,0 μg/ml gebunden; Balken 7, 5,0 μg/ml gebunden; Balken 8, 1,0 μg/ml Kultur; Balken 9, VEGF 1,0 μg/ml; Balken 10, 1,0 μg/ml gebunden zu 50%, Peptid; Balken 11, 1 μg/ml + lösliches ATIII; Balken 12, 1 μg/ml + Heparin (kein Peptid). "Gebunden" bezieht sich auf Fibrin, mit Peptid und Heparin. "Löslich" bezieht sich auf Fibrin.
2 Effekt von Matrix-gebundenem NGF-β, NT-3 und BDNF auf das Neuriten-Streckungswachstum von Spinalwurzelganglien in dreidimensionalen Fibrin-Gelen. Die Ganglien wurden aus 8-tägigen Kükenembryos herauspräpariert und in vorgewaschene Fibrin-Gele gebracht. * bezeichnet p < 0,05 gegenüber unmodifiziertem Fibrin. Die löslichen Behandlungen enthalten Wachstumsfaktor, aber kein Heparin oder Heparin-bindendes Peptid. Diese Behandlungen zeigen keinen Unterschied zu unmodifiziertem Fibrin, was nahe legt, dass das verwendete Waschprotokoll ausreichend war, um ungebundenen Wachstumsfaktor zu entfernen.
Balken 1, Fibrin; Balken 2, NGF gebunden bei 0,1 μg/ml; Balken 3, NGF löslich bei 0,1 μg/ml; Balken 4, BDNF gebunden bei 0,1 μg/ml; Balken 5, BDNF löslich bei 0,1 μg/ml gebunden; Balken 6, NT-3 gebunden bei 1,0 μg/ml; Balken 7, NT-3 löslich bei 0,1 μg/ml gebunden. "Gebunden" bezieht sich auf Fibrin, mit Peptid und Heparin. "Löslich" bezieht sich auf Fibrin.
3 Fähigkeit von Matrix-gebundenem NGF-β, das Neuriten-Streckungswachstum von Spinalwurzelganglien in dreidimensionalen Fibrin-Gelen zu fördern, als eine Funktion der Waschzeit vor dem Besatz mit Zellen. Die Ganglien wurden aus 8-tägigen Kükenembryos herauspräpariert und in vorgewaschene Fibrin-Gele gebracht. * bezeichnet p < 0,05 gegenüber unmodifiziertem Fibrin. Die löslichen Behandlungen enthalten Wachstumsfaktor, aber kein Heparin oder Heparinbindendes Peptid. Diese Versuch zeigt, dass der Matrix-gebundene NGF-β seine Aktivität 4 Tage lang beibehält, während der ungebundene NGF-β nach einem Tag Waschen nicht aktiv ist.
–∎– Fibrin; –♦– ngf gebunden (100 ng/ml); –•– ngf löslich (100 ng/ml)
GENAUE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen bereit, die nützlich sind zur Förderung der kontrollierten Freisetzung von Wachstumsfaktoren mit geringer Heparin-Bindungsaffinität, die eine gering Heparin-bindende Domäne einer Länge von etwa 8 bis etwa 30 basischen Aminosäuren haben.
Die folgenden Beispiele sind enthalten, um bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung zu zeigen. Es sollte von Fachleuten gewürdigt werden, dass die in den Beispielen, die folgen, offenbarten Techniken Techniken darstellen, von denen von dem Erfinder entdeckt wurde, dass sie bei der Durchführung der Erfindung gut funktionieren, und die daher als bevorzugte Arten für ihre Durchführung betrachtet werden können.
BEISPIEL 1 - HEPARIN-AFFINITÄTSCHROMATOGRAFIE VON HEPARIN-BINDENDEN UND MIT GERINGER AFFINITÄT HEPARIN-BINDENDEN WACHSTUMSFAKTOREN
Heparin-Affinitätschromatografie ist ein Verfahren, das allgemein zur Bestimmung der relativen Affinität von Heparin-bindenden Proteinen verwendet wird. Wenn ein Protein bei NaCl-Konzentrationen nahe oder unterhalb des physiologischen Gehalts (näherungsweise 140 mM) eluiert, ist es für die Zwecke der Beschreibung der vorliegenden Erfindung nicht als "Heparin-bindend" zu betrachten. Das liegt daran, dass die Wachstumsfaktoren in vivo sich schnell von Heparin abspalten würden.
Die relative Affinität für Heparin von Proteinen wurde durch Heparin-Affinitätschromatografie bestimmt, wobei eine TSK-GEL Heparin-5PW (7,5 cm × 7,5 mm ID)-Säule (TosoHass, Stuttgart, Deutschland) verwendet wurde. Proben des Proteins wurden in 20 mM Tris, pH 7,4, 0,05 M NaCl, injiziert. Die Elution wurde ausgeführt, indem man einen NaCl-Gradienten von 0,05 M bis 2,0 M im Laufe von 30 min durchlaufen ließ, und die NaCl-Konzentration, bei der die Elution beobachtet wurde, wurde als ein Maß für die Heparin-Bindungsaffinität des Proteins genommen. Die relative Heparin-Bindungsaffinität von Proteinen, von denen in der Literatur bisher nicht berichtet wurde, dass sie Heparin-bindend seien, wurde bestimmt und mit Proteinen wie bFGF und Antithrombin III, von denen bekannt ist, dass sie stark Heparin-bindend sind, verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Die zwei "nicht-Heparin-bindenden" Wachstumsfaktoren, TGF-β2 und NGFβ, eluierten beide bei sub-physiologischen NaCl-Konzentrationen, was nahe legt, dass sie eine relativ geringe Heparin-Bindungsaffinität haben und unter physiologischen Bedingungen schnell von Heparin abspalten werden. Die zwei Heparin-bindenden Proteine, Antithrombin III und bFGF, eluieren bei NaCl-Konzentrationen, die viel größer als physiologische Gehalte sind.
Andere haben ebenfalls Heparin verwendet, um die Aktivität von Wachstumsfaktoren zu erhöhen und ihren Abbau zu verhindern. Schroeder et al. (20) verwendeten Heparin, um die Stabilität von TGF-β1 zu erhöhen und einen Aktivitätsverlust zu verhindern. Sie haben auch Heparin an Collagen angebracht und den Heparin-TGF-β1-Komplex in Collagen-Gelen verwendet, um zu zeigen, dass derartige Systeme auf Heparin-Basis die Wachstumsfaktor-Aktivität in vivo durch kontrollierte Freisetzung verbessern können (21). TGF-β1 ist dafür bekannt, dass er eine starke Heparin-Bindungsaffinität besitzt. Derartige Freisetzungssysteme auf Heparin-Basis wurden jedoch bisher nicht mit Wachstumsfaktoren getestet, von denen man der Meinung ist, dass sie eine geringe Heparin-Bindungsaffinität haben (jene, die durch eine Elution aus Heparin-Affinitätssäulen bei subphysiologischen NaCl-Konzentrationen gekennzeichnet sind).
Die Analyse der Primärsequenz von Proteinen durch die Erfinder der vorliegenden Erfindung, einschließlich Wachstumsfaktoren, hat offenbart, dass die Primärsequenz Bereiche enthalten kann, die von basischer Natur sind, und dass die basischen Reste im Allgemeinen von hydrophoben Resten flankiert werden. Diese Sequenzen sind im Allgemeinen von ähnlicher Art wie die Heparinbindende Konsensus-Sequenz XBBXBX (worin X ein hydropathischer Rest ist und B ein basischer Rest ist), wobei die Heparin-bindende Konsensus-Sequenz von Cardin und Weintraub beschrieben wurde (22). Die genaue Sequenz der basischen Bereiche variiert jedoch von Protein zu Protein. Für viele Proteine ist auch die dreidimensionale Struktur verfügbar, was die Ortung zu bestimmender basischer Bereiche erlaubt. Damit basische Bereiche zur Sequestrierung eines Proteins brauchbar sind, müssen sie an der Oberfläche des Proteins liegen. Häufig wird beobachtet, dass derartige Bereiche im Amino- oder Carboxy-Ende des Proteins vorkommen.
Tabelle 1: NaCl-Konzentration, die zum Eluieren von Proteinen aus einer Heparin-Affinitätssäule erforderlich ist.
BEISPIEL 2 -IN-VITRO-MODELL FÜR DIE BIOAKTIVITÄT – NEURITEN-STRECKUNGSWACHSTUM
Das vorliegende Beispiel wird angegeben, um das Modell zur Untersuchung der In-vitro-Bioaktivität von hierin beschriebenen Materialien zu beschreiben.
Ein dreidimensionales Fibrin-Gel-in-vitro-Modell zur Untersuchung des Neuriten-Streckungswachstums. Fibrinogen wurde in Wasser gelöst und bei pH 7,4 24 h lang in Tris-gepufferte Kochsalzlösung (tris-buffered saline, TBS) dialysiert. Die Konzentration an Fibrinogen wurde durch Messen der Extinktion bei 280 nm bestimmt. Es wurden Fibrin-Gele hergestellt, die eine Endkonzentration von 3,5 mg/ml Fibrinogen, 2,5 mM Ca⁺⁺ und 2 NIH Einheiten/ml Thrombin in TBS enthielten. Das Polymerisationsgemisch wurde 60 min lang bei 37°C, 95% relativer Feuchtigkeit und 5% CO₂ inkubiert.
Nach der Polymerisation wurde zu jeder Vertiefung 1 ml TBS zugegeben. Die Gele wurden im Laufe von 24 h 5 Mal gewaschen, wobei die ersten 4 Waschlösungen aus TBS bestanden und die letzte Lösung aus modifiziertem neuralem Basalmedium bestand. Spinalwurzelganglien (dorsal root ganglia, DRGs) wurden aus 8-tägigen Kükenembryos herauspräpariert und in Hanks-gepufferte Salzlösung gebracht. Die Ganglien wurden ins Innere von Fibrin-Gelen gebracht (eines pro Vertiefung), und die Gele wurden 60 min lang bei 37°C, 95% relativer Feuchtigkeit und 5% CO₂ inkubiert. Nach 60 min wurde zu jeder Vertiefung 1 ml modifiziertes neurales Basalmedium zugegeben. Die Medien wurden nach 24 h ausgetauscht. Nach 24 und 48 h wurden Hellfeldbilder der Ganglien gemacht. Die Bilder wurden analysiert, um die mittlere Länge des Neuriten-Streckungswachstums zu bestimmen, das als die Fläche eines Rings zwischen dem DRG-Körper und dem äußeren Halo wachsender Neuriten berechnet wurde, wie von Herbert et al. (1996) (23) gezeigt. Das Neuriten-Streckungswachstum für jedes Experiment wurde mittels des mittleren Neuriten-Streckungswachstums durch unmodifizierte Fibrin-Gele aus demselben Experiment und zum selben Zeitpunkt normiert. Die Ergebnisse sind in 1, Balken 1, gezeigt. Diese Studie demonstriert die Nützlichkeit der Erfindung als ein Zellen-Träger und Wachstumsmaterial, das das Neuriten-Streckungswachstum in drei Dimensionen steigert. Dies wird auch demonstriert für die Nützlichkeit, die die Erfindung unter in vivo vorgefundenen Bedingungen zur Förderung des Zellenwachstums und des Neuriten-Streckungswachstums haben würde.
BEISPIEL 3 – FREISETZUNG VON BIOAKTIVEN NEUROTROPHINEN AUS EINEM ZUFÜHRSYSTEM AUF HEPARIN-BASIS
Ein Beispiel für einen Wachstumsfaktor, der nicht als ein Heparin-bindender Wachstumsfaktor betrachtet wird, der aber eine basische Sequenz enthält, ist der Nervenwachstumsfaktor β (nerve growth factor β, NGF β). Dieser Wachstumsfaktor wird als nicht-Heparin-bindend betrachtet und wurde sogar bei der Heparin-Bindungsanalyse als eine negative Kontrolle für ein Heparin-bindendes Protein verwendet (siehe Lee and Lander (1991) (24)). NGF enthält jedoch eine basische Domäne an seiner C-terminalen Aminosäure-Position (230 bis 241 von menschlichem NGF beta), die aus den folgenden Resten besteht: CVLSRKAVRRA (SEQ ID NO: 6). Ähnliche basische Domänen sind zu finden in den Carboxy-Enden von Neurotrophin-3 (NT-3, CALSRKIGRT, 248 bis 257 von menschlichem NT-3, SEQ ID NO: 7) und von aus Gehirn stammendem neurotrophischem Faktor (CTLTIKRGR, 238 bis 247 von menschlichem BDNF, SEQ ID NO: 8).
Das vorliegende Beispiel demonstriert, dass NGFβ, NT-3 und BDNF in dauerhafter Weise aus Heparin-enthaltenden Fibrin-Matrices, die nicht-kovalent immobilisiertes Heparin enthalten, zugeführt werden können. Dieses System besteht aus kovalent immobilisierten Heparin-bindenden Peptiden, die durch den Faktor XIIIa mit der Fibrin-Matrix vernetzt sind (siehe Schense and Hubbell (1999) (25)), und Heparin, das nicht-kovalent an diesen Heparin-bindenden Peptiden angebracht ist. Von diesen Materialien wurde von dem Erfinder der vorliegenden Erfindung gezeigt, dass sie Heparin-bindende Wachstumsfaktoren, wie basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor, effektiv zuführen. Mit diesem System wird ein Zwei-Domänen-Peptid so synthetisiert, dass es in einer Domäne eine Heparin-bindende Sequenz, und in der anderen Domäne ein Substrat für das Koagulations-Enzym Faktor XIIIa aufweist (Schense and Hubbell (1999) (25)). Dieses Enzym bindet während der Koagulation die Substrat-Domäne des Zwei-Domänen-Peptids kovalent an das Fibrin-Netzwerk, wodurch es auch die Heparinbindende Domäne des Zwei-Domänen-Peptids an dem Fibrin-Netzwerk immobilisiert. Heparin ist ebenfalls in dem Koagulations-Gemisch enthalten, und das Heparin wird dadurch durch Bindung an das immobilisierte Peptid an dem Fibrin-Netzwerk immobilisiert.
Das Freisetzungssystem wurde zuerst mit Wachstumsfaktoren, die eine starke Heparin-Bindungsaffinität zeigen, charakterisiert. Die Ergebnisse dieser Studien sind in 1 gezeigt. Balken 1 zeigt das Neuriten-Streckungswachstum durch unmodifizierte Fibrin-Gele. Balken 2 zeigt, dass das Freisetzungssystem, das aus Heparin und eingebautem Heparin-bindendem Peptid besteht, das Neuriten-Streckungswachstum ohne den Zusatz von Wachstumsfaktor nicht fördert. Die Balken 3, 4 und 6 zeigen den Dosis-Wirkungs-Effekt von Matrix-gebundenem bFGF, der das Neuriten-Streckungswachstum um bis zu 100% steigert (Balken 6). Die Balken 5 und 7 zeigen, dass bFGF, wenn er während der Polymerisierung des Fibrin-Gels in Abwesenheit des Freisetzungssystems zugegeben wird, das Neuriten-Streckungswachstum nicht steigert, wahrscheinlich weil er zu schnell aus dem Fibrin heraus diffundiert. Balken 8 zeigt, dass die Anwesenheit von bFGF in den Kulturmedien das Neuriten-Streckungswachstum ähnlich demjenigen von Matrixgebundenem bFGF in derselben Konzentration fördert. Balken 9 zeigt, dass VEGF das Neuriten-Streckungswachstum nicht steigert, was demonstriert, dass der gebundene Wachstumsfaktor auch in Nervenmodellen Bioaktivität zur Förderung des Neuriten-Streckungswachstums zeigen muss. Balken 10 zeigt, dass die Freisetzung von Wachstumsfaktor nicht signifikant beeinflusst wird, wenn die Menge an Heparin-Bindungsstellen um 50% verringert wird. Diese Abweichung stützt die Behauptung, dass ein hoher Überschuss an Wachstumsfaktor-Bindungsstellen vorhanden ist. Balken 11 zeigt, dass das Peptid, wenn es mit der Matrix vernetzt wird, ein funktionsfähiges Zuführsystem auf Heparin-Basis darstellt. Balken 12 demonstriert, dass Heparin und bFGF ohne das immobilisierte Heparin-bindende Peptid kein funktionsfähiges Zuführsystem darstellen, und dass Heparin und immobilisiertes Peptid die Langzeit-Freisetzung von Wachstumsfaktor steigern und in Gang halten. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass das Zuführsystem zur Langzeit-Freisetzung eines Heparin-bindenden Wachstumsfaktors in aktiver Form in der Lage ist.
Die Fähigkeit Heparin-enthaltender Fibrin-Matrices, gering Heparin-bindende Wachstumsfaktoren zuzuführen, wurde unter Verwendung von NGF-β, NT-3 und BDNF, alles Mitglieder der Neurotrophin-Familie, getestet. Fibrin-Gele wurden hergestellt, wie in Beispiel 2 beschrieben, mit Ausnahme der Zugabe von Peptid, Heparin und Neurotrophin, wie unten beschrieben. Es wurden Fibrin-Gele hergestellt, die eine Endkonzentration von 3,5 mg/ml Fibrinogen, 2,5 mM Ca⁺⁺, 2 NIH Einheiten/ml Thrombin, 0,25 mM Peptid, 0,125 mM Heparin und 0,1 μg/ml des zu testenden Neurotrophins enthielten. Ansonsten wurde der Versuch durchgeführt wie in Beispiel 2 beschrieben. Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt. Die Fibrin-Gruppe steht für das Verhalten von normalem Fibrin und war der Kontroll-Datensatz, auf den das Neuriten-Streckungswachstum normiert wurde. Diese Ganglien wurden in Anwesenheit von 20 ng/ml NGF kultiviert. Alle anderen Behandlungen enthielten keine Wachstumsfaktoren in den Medien. Für jedes der drei getesteten Neurotrophine wurde das Neuriten-Streckungswachstum nur gesteigert, wenn das Zuführsystem auf Heparin-Basis aus Peptid und Heparin anwesend und an die Matrix gebunden war ("gebundene" Balken). Die Zugabe von Neurotrophin alleine ("lösliche" Balken) ohne Peptid oder Heparin steigerte das Neuriten-Streckungswachstum nicht, wahrscheinlich weil der Faktor zu schnell aus dem Fibrin heraus diffundierte. Die in 2 gezeigten Materialien unterscheiden sich von denen in 1 insofern, als in 2 Wachstumsfaktoren mit "geringer Heparin-Bindungsaffinität" freigesetzt wurden, während die in 1 freigesetzten Faktoren als stark Heparin-bindend betrachtet werden. Dieser Unterschied wird in Beispiel 1, in dem der Heparin-bindende Wachstumsfaktor (bFGF) oberhalb physiologischer NaCl-Konzentrationen aus Heparin eluierte, während die gering und nicht-Heparin-bindenden Wachstumsfaktoren (NGF-β und TGF-β2) bei subphysiologischen NaCl-Konzentrationen eluierten, klar demonstriert. In beiden Fällen waren die Zuführsysteme auf Heparin-Basis in der Lage, bioaktive Wachstumsfaktoren in kontrollierter Weise zuzuführen. Dies demonstriert überraschenderweise, dass nicht-Heparin-bindende Wachstumsfaktoren aus Heparinenthaltenden Matrices in verzögerter Weise freigesetzt werden können.
Um zu bestimmen, wie lange die Freisetzung von Wachstumsfaktoren geringer Affinität verzögert werden kann, wurden NGF-β enthaltende Gele vor dem Besatz mit Zellen für längere Zeitspannen gewaschen. In jedem Fall wurden die Gele sorgfältig mit TBS gewaschen. Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt. Die Bioaktivität des nach 4 Tagen vorliegenden Wachstumsfaktors ist dieselbe wie nach einem Tag Waschen. Nach einer Woche Waschen ist die Bioaktivität des freigesetzten Wachstumsfaktors verringert.
Diese Ergebnisse demonstrieren, das NGF-β, NT-3 und BDNF durch Heparin sequestriert werden und dass die Steigerung des Auswachsens gegenüber unmodifiziertem Fibrin an Matrix-gebundenem Wachstumsfaktor anstatt an freiem Wachstumsfaktor liegt. Dies demonstriert, dass solche Materialien auf Heparin-Basis verwendet werden können, um Proteine mit geringer Heparin-Bindungsaffinität, die exponierte basische Bereiche enthalten, zu sequestrieren. In dieser dreidimensionalen Fibrin-Matrix wurde Heparin mit näherungsweise 380 μg/ml immobilisiert. Dieses Material zeigte eine NGF-Freisetzung über näherungsweise eine Woche. Es gibt Situationen, in denen eine Freisetzung für nur einen Tag therapeutisch nützlich wäre. Daher wäre eine nützliche Menge an immobilisiertem Heparin mindestens 95 μg/ml, wobei höhere Mengen zu einer über längere Zeitspannen verzögerten Freisetzung führen.
Die hier gezeigten Ergebnisse demonstrieren, dass "nicht-Heparin-bindende Wachstumsfaktoren", wie NGF-β, BDNF und NT-3, aus Arzneimittel-Zuführsystemen auf Heparin-Basis auf der Basis ihrer geringen Affinität für Heparin in einer kontrollierten Weise freigesetzt werden können. Diese Proteine können auf der Basis basischer Domänen, die in den Proteinen zu finden sind, in dreidimensionalen Materialien, die immobilisiertes Heparin enthalten, sequestriert werden. Außerdem behalten die aus diesen Systemen freigesetzten Wachstumsfaktoren in in-vitro-Modellen die Bioaktivität, wie oben gezeigt. Dies demonstriert, dass andere Wachstumsfaktor-Proteine mit geringer Heparin-Bindungsaffinität, die ähnliche Arten basischer Domänen enthalten, in einer ähnlichen Weise aus Zuführsystemen auf Heparin-Basis freigesetzt werden könnten.
BEISPIEL 4 – MITGLIEDER DER TGF-β-FAMILIE
Der oben beschriebene Weg der Sequenz-Analyse kann ebenso auf Wachstumsfaktoren von anderen Familien angewendet werden. Eine Liste von Wachstumsfaktoren und ihrer Sequenzen ist in Tabelle 2 gezeigt, die Domänen zeigt, die geringe Heparin-Bindungsaffinität haben mögen und aus Zuführsystemen auf Heparin-Basis, wie den oben beschriebenen, freigesetzt werden könnten. Diese Faktoren umfassen einige Mitglieder der TGF-β-Familie, nämlich TGF-β2, TGF-β3 und TGF-β4. TGF-β2, TGF-β3 und TGF-β4 sind Mitglieder einer Familie, die einen stark Heparin-bindenden Wachstumsfaktor, TGF-β1, enthält. Von anderen Mitgliedern der TGF-β-Familie wurde jedoch in der Literatur berichtet, dass sie eine geringere Heparin-Bindungsaffinität haben, wie TGF-β3 (siehe Lyon et al. (1997) (26)). Von TGF-β1 wurde gezeigt, dass er bei physiologischer Ionenstärke, d.h. bei 140 mM NaCl, Heparin-bindend ist. TGF-β3 mangelt es an einer Schlüsselladung, und von ihm wurde demonstriert, dass er bei physiologischen Bedingungen "nicht-Heparin-bindend" ist. Heparin-Affinitätschromatografie an TGF-β 2 durch die Erfinder der vorliegenden Erfindung demonstriert, dass er auch unter physiologischen Bedingungen eine geringe Heparin-Bindungsaffinität besitzt. Die basische Domäne in jedem dieser Wachstumsfaktoren, die möglicherweise mit Heparin wechselwirken könnte, ist in der in Tabelle 2 angegebenen Liste von Sequenzen unterstrichen.
Einige Mitglieder einer Wachstumsfaktor-Familie können Heparin-bindend sein, während es andere nicht sind, wie durch die TGF-β-Familie demonstriert wird. Trotz der geringen Heparin-Bindungsaffinität solcher "nicht-Heparin-bindenden" Wachstumsfaktoren können sie doch aus Zuführsystemen auf Heparin-Basis in einer kontrollierten Weise freigesetzt werden, wenn sie eine basische Domäne enthalten und die Anzahl der in dem System vorhandenen Heparin-Bindungsstellen in einem relativ größeren Überschuss zur Menge an zu bindendem Wachstumsfaktor ist.
BEISPIEL 5 – ANDERE "NICHT-HEPARIN-BINDENDE" WACHSTUMSFAKTOREN, DIE BASISCHE DOMÄNEN ENTHALTEN
Andere Familien von Wachstumsfaktoren enthalten ebenfalls Wachstumsfaktoren, die in der Literatur nicht als Heparin-bindend beschrieben werden, die aber basische Domänen (in Tabelle 2 gezeigt) enthalten.
Tabelle 2: WACHSTUMGSFAKTOR-SEQUENZEN
Tabelle 2: Sequenzen von Wachstumsfaktor-Proteinen mit geringer und hoher Heparin-Bindungsaffinität.
Basische Domänen von Wachstumsfaktor-Proteinen mit geringer Heparin-Bindungsaffinität sind unterstrichen, und basische Aminosäure-Reste (K oder R) sind fett gedruckt gezeigt.
Die Analyse des Primärproteins von Wachstumsfaktoren, wie den in Tabelle 2 gezeigten, kann zur Identifizierung basischer Domänen verwendet werden.
Durch Analysieren der Sequenzen der TGF-β-Familie und der Neurotrophin-Familie können Fachleute in den in Tabelle 2 unterstrichenen basischen Domänen ein Muster beobachten. Aus diesem Muster, das in den basischen Domänen von Proteinen geringer Heparin-Bindungsaffinität beobachtet wurde, wurde eine angenäherte Formel entwickelt, um ähnliche basische Domänen in anderen Proteinen zu identifizieren. Die Formel definiert, dass eine basische Domäne eine Länge von etwa 8 bis 30 Aminosäure-Resten hat, wobei sie mindestens zwei basische Aminosäure-Reste aufweist, mit einem Verhältnis von basischen zu sauren Aminosäure-Resten von mindestens 2 und einem Anteil an hydrophoben Aminosäure-Resten von mindestens 0,67. Die sekundäre und tertiäre Proteinstruktur beeinflusst ebenfalls die Heparin-Bindungsaffinität einer basischen Domäne in einem Protein oder Peptid, und aus diesem Grund ist die Formel angenähert. Daher ist es notwendig, eine Heparin-Affinitätschromatografie oder irgendeine andere experimentelle Technik durchzuführen, um die relative Heparin-Affinität eines Proteins oder Peptids zu bestimmen. Der Begriff "Protein mit geringer Heparin-Bindungsaffinität" bezieht sich nur auf jene Proteine oder Peptide, die aus einer Heparin-Affinitätschromatografie bei einer NaCl-Konzentration von weniger als etwa 140 mM eluieren. Die oben beschriebene Formel zu Sequenz-Analyse wurde auf die Liste der in Tabelle 2 zu findenden Wachstumsfaktoren angewendet und verwendet, um basische Domänen zu identifizieren, die möglicherweise an Heparin oder Heparin-ähnliche Polymere binden könnten.
Ein Protein mit geringer Heparin-Bindungsaffinität sollte sich unter physiologischen Bedingungen schnell von Heparin abspalten. Überraschenderweise demonstrieren jedoch die in 3 gezeigten Ergebnisse, dass derartige Wachstumsfaktor-Proteine mit geringer Heparin-Bindungsaffinität aus Zuführsystemen auf Heparin-Basis in einer kontrollierten Weise freigesetzt werden können. Dieses neue Ergebnis legt nahe, dass andere Wachstumsfaktoren, die Domänen enthalten, die die Erfordernisse der oben beschriebenen Formel erfüllen, ebenfalls aus Zuführsystemen auf Heparin-Basis in einer kontrollierten Weise freigesetzt werden können. Beispiele für solche Wachstumsfaktoren sind in der Sequenz-Liste in Tabelle 2 gezeigt, und die basischen Domänen dieser Wachstumsfaktoren sind unterstrichen.
Zwei Mitglieder der GDNF-Familie, nämliche Neurturin und Persephin, enthalten beide basische Domänen. Von GDNF wird in der Literatur berichtet, dass es He parin-bindend ist, aber bisher gab es keine Berichte zur Heparin-Affinität anderer Mitglieder der GDNF-Familie (27). Auf der Basis der oben vorgelegten Analyse scheint es, dass Neurturin und Persephin ausreichende Heparin-Bindungsaffinität haben, um durch die Verfahren und Materialien dieser Erfindung freisetzbar zu sein.
IGF-1A und IGF-1B sind Mitglieder der Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor-Familie. Obwohl es umfangreiche Berichte über Insulin-ähnliche Wachstumsfaktor-Bindungsproteine, die an Heparin binden, gibt, gibt es in der Literatur keine Dokumentation über an Heparin bindenden IGF-1A oder IGF-1B. Diese beiden Proteine enthalten basische Domänen, gezeigt in Tabelle 2. Auf der Basis der oben vorgelegten Analyse scheint es, dass sie ausreichende Heparin-Bindungsaffinität haben, um durch die Verfahren und Materialien dieser Erfindung freisetzbar zu sein.
EGF ist ein anderer Wachstumsfaktor, der eine basische Domäne, in Tabelle 2 gezeigt, enthält, der aber in der Literatur nicht als Heparin-bindend beschrieben wird. Tatsächlich legt die Existenz eines verwandten Wachstumsfaktors, der speziell als ein Heparin-bindender EGF-ähnlicher Wachstumsfaktor bezeichnet wird, nahe, dass EGF keine hohe Heparin-Affinität besitzt. Die Literatur legt nahe, dass auf der Basis der Sequenz-Analyse EGF nicht Heparin-bindend ist (45). Auf der Basis der oben vorgelegten Analyse scheint er den Erfindern der vorliegenden Erfindung ausreichende Heparin-Bindungsaffinität zu haben, um durch die Verfahren und Materialien dieser Erfindung freisetzbar zu sein.
Trotz der in jedem dieser Proteine gefundenen basischen Domänen ist ihre Heparin-Bindungsaffinität noch schwach und durch eine Elution aus Heparin-Affinitätssäulen bei sub-physiologischen NaCl-Konzentrationen gekennzeichnet (d.h. Wachstumsfaktoren, die zwischen etwa 25 mM und 140 mM NaCl eluieren). Beispielsweise wurde für NGF-β und TGF-β2 eine Heparin-Affinitätschromatografie durchgeführt. In beiden Fällen wurde gefunden, dass die Proteine nach mehreren Säulenvolumina Puffer bei pH 7,4 bei 50 mM NaCl eluierten, was gut unterhalb der physiologischen NaCl-Konzentration ist. In-vitro-Studien demonstrieren jedoch, dass Freisetzungssysteme auf Heparin-Basis noch verwendet werden können, um NGF-β in einer kontrollierten Weise freizusetzen, trotz seiner relativ geringen Neparin-Bindungsaffinität.
Alle Wachstumsfaktoren, die in dem Beispiel beschrieben wurden, enthalten basische Domänen, aber es gibt keinerlei Literaturberichte zur Heparin-Bindungsaffinität. Jedoch sollte auf der Basis des Vergleichs der Sequenzen und der Ergebnisse, die mit anderen nicht-Heparin-bindenden Wachstumsfaktoren der Neurotrophin-Familie demonstriert wurden, mit praktisch jedem Wachstumsfaktor mit einer basischen Domäne, die die oben beschriebenen Eigenschaften basischer Domänen hat, eine Langzeit-Freisetzung aus Systemen auf Heparin-Basis möglich sein.
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Claims

Zuführsystem für einen Protein-Wachstumsfaktor oder ein Peptid-Fragment davon, aufweisend – ein Substrat, – ein Peptid, das kovalent an das Substrat gebunden ist, und das eine Bindungsdomäne hat, die Heparin oder ein Heparin-ähnliches Polysaccharid oder ein Heparin-ähnliches Polymer mit hoher Affinität bindet, wobei hohe Affinität definiert ist als bei nicht weniger als 140 mM NaCl aus einer Heparin-Affinitätssäule eluierend, – Heparin oder ein Heparin-ähnliches Polysaccharid oder ein Heparin-ähnliches Polymer, das an das Peptid gebunden ist, – einen Protein-Wachstumsfaktor oder ein Peptid-Fragment davon mit einer Domäne, die das Heparin oder das Heparin-ähnliche Polysaccharid oder das Heparin-ähnliche Polymer mit geringer Affinität bindet, wobei geringe Affinität definiert ist als für Eluieren aus einer Heparin-Affinitätssäule bei einer NaCl-Konzentration von weniger als etwa 140 mM sorgend.
Zuführsystem nach Anspruch 1, bei dem der Protein-Wachstumsfaktor oder das Peptid-Fragment davon definiert ist als aus einer Heparin-Affinitätssäule bei einer NaCl-Konzentration von etwa 25 mM bis etwa 140 mM eluierend.
Zuführsystem nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die Domäne des Protein-Wachstumsfaktors oder des Peptid-Fragments davon außerdem definiert ist als eine Länge von etwa 8 bis 30 Aminosäureresten aufweisend, die mindestens zwei basische Aminosäurereste, ein Verhältnis von basischen zu sauren Aminosäureresten von mindestens 2, und ein Verhältnis von hydrophoben Aminosäureresten zu basischen Aminosäureresten von mindestens 0,67 aufweisen.
Zuführsystem nach Anspruch 3, bei dem die basischen Aminosäurereste K oder R sind.
Zuführsystem nach Anspruch 3 oder 4, bei dem die sauren Aminosäurereste außerdem als D oder E definiert sind.
Zuführsystem nach einem der Ansprüche 3 bis 5, bei dem die hydrophoben Aminosäurereste außerdem definiert sind als A, V, F, P, M, I, oder als L oder C, wenn C an einer Disulfid-Bindung beteiligt ist.
Zuführsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem der Protein-Wachstumsfaktor oder das Peptid-Fragment davon Neurturin, Persephin, IGF-1A, IGF-1β, EGF, NGFβ, NT-3, BDNF, NT-4, TGF-β2, TGF-β3 oder TGF-β4 ist.
Zuführsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem das Substrat mindestens eine der Komponenten Fibrin, Collagen, Hyaluronsäure, Hyaluronsäure-Derivate und synthetische Polymer-Hydrogele aufweist.
Zuführsystem nach Anspruch 8, bei dem das Substrat Fibrin ist.
Zuführsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei dem das Heparin oder das Heparin-ähnliche Polysaccharid oder das Heparin-ähnliche Polymer nicht-kovalent an dem Peptid, das Heparin oder ein Heparin-ähnliches Polysaccharid oder ein Heparin-ähnliches Polymer mit hoher Affinität bindet, angebracht ist.
Zuführsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 10, bei dem das Peptid, das Heparin oder ein Heparin-ähnliches Polysaccharid oder ein Heparin-ähnliches Polymer mit hoher Affinität bindet, außerdem definiert ist als SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 oder SEQ ID NO:5 aufweisend.
Zuführsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 11, bei dem das Heparin oder das Heparin-ähnliche Polysaccharid oder das Heparin-ähnliche Polymer ein Molekulargewicht zwischen etwa 3.000 und 10.000.000 Dalton hat.
Zuführsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 12, bei dem das Heparinähnliche Polysaccharid ein Molekulargewicht zwischen etwa 3.000 und 10.000.000 Dalton hat und mindestens eine negative Ladung pro 2 Saccharidringen und nicht mehr als eine positive Ladung pro 10 Saccharidringen hat.
Zuführsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 13, bei dem das Heparinähnliche Polymer Dextransulfat, Chondroitinsulfat, Heparansulfat, Fucan, Alginat oder ein Derivat davon ist.
Zuführsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 14, bei dem das Molverhältnis von Heparin oder Heparin-ähnlichem Polysaccharid oder Heparin-ähnlichem Polymer zu Protein-Wachstumsfaktor oder Peptid-Fragment davon mindestens 1 beträgt.
Zuführsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 15, bei dem das Molverhältnis von kovalent angebrachtem Peptid, das Heparin oder ein Heparin-ähnliches Polysaccharid oder ein Heparin-ähnliches Polymer mit hoher Affinität bindet, zu Heparin oder Heparin-ähnlichem Polysaccharid oder Heparin-ähnlichem Polymer mindestens 1 beträgt.
Fertigungsgegenstand, aufweisend ein Zuführsystem für einen Protein-Wachstumsfaktor oder ein Peptid-Fragment davon nach einem der Ansprüche 1 bis 16, bei dem das Substrat in der Lage ist, eine Zellanhaftung zu unterstützen.
Fertigungsgegenstand nach Anspruch 17, der ein Gefäßtransplantat ist.
Fertigungsgegenstand nach Anspruch 17, der ein Gegenstand zur Behandlung von Hautwunden ist.
Fertigungsgegenstand nach Anspruch 17, der eine implantierbare sterilisierte Zusammensetzung ist.
Verwendung eines Peptids, das in der Lage ist, kovalent an ein Substrat zu binden, und das eine Bindungsdomäne hat, die Heparin oder ein Heparinähnliches Polysaccharid oder ein Heparin-ähnliches Polymer mit hoher Affinität bindet, wobei hohe Affinität definiert ist als aus einer Heparin-Affinitätssäule bei nicht weniger als 140 mM NaCl eluierend, zur Herstellung eines Zuführsystems nach einem der Ansprüche 1 bis 16.
Verwendung nach Anspruch 21, wobei der in dem Zuführsystem enthaltene Protein-Wachstumsfaktor oder Peptid-Faktor durch Abspaltung des Protein-Wachstumsfaktors oder Peptid-Faktors davon von dem Heparin oder Heparin-ähnlichem Polysaccharid oder Heparin-ähnlichem Polymer freigesetzt wird.