ES2255257T3 - Liberacion controlada de factores de crecimiento a partir de matrices que contienen heparina. - Google Patents
Liberacion controlada de factores de crecimiento a partir de matrices que contienen heparina.Info
- Publication number
- ES2255257T3 ES2255257T3 ES99915970T ES99915970T ES2255257T3 ES 2255257 T3 ES2255257 T3 ES 2255257T3 ES 99915970 T ES99915970 T ES 99915970T ES 99915970 T ES99915970 T ES 99915970T ES 2255257 T3 ES2255257 T3 ES 2255257T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- heparin
- administration system
- peptide
- growth factor
- affinity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L15/00—Chemical aspects of, or use of materials for, bandages, dressings or absorbent pads
- A61L15/16—Bandages, dressings or absorbent pads for physiological fluids such as urine or blood, e.g. sanitary towels, tampons
- A61L15/42—Use of materials characterised by their function or physical properties
- A61L15/44—Medicaments
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
- A61K38/1841—Transforming growth factor [TGF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
- A61K47/6903—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being semi-solid, e.g. an ointment, a gel, a hydrogel or a solidifying gel
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L15/00—Chemical aspects of, or use of materials for, bandages, dressings or absorbent pads
- A61L15/16—Bandages, dressings or absorbent pads for physiological fluids such as urine or blood, e.g. sanitary towels, tampons
- A61L15/22—Bandages, dressings or absorbent pads for physiological fluids such as urine or blood, e.g. sanitary towels, tampons containing macromolecular materials
- A61L15/225—Mixtures of macromolecular compounds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
- A61L2300/20—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices containing or releasing organic materials
- A61L2300/252—Polypeptides, proteins, e.g. glycoproteins, lipoproteins, cytokines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
- A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
- A61L2300/412—Tissue-regenerating or healing or proliferative agents
- A61L2300/414—Growth factors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
- A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
- A61L2300/42—Anti-thrombotic agents, anticoagulants, anti-platelet agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
- A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
- A61L2300/45—Mixtures of two or more drugs, e.g. synergistic mixtures
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
- A61L2300/60—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a special physical form
- A61L2300/602—Type of release, e.g. controlled, sustained, slow
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Abstract
Un sistema de administración para un factor de crecimiento proteínico o fragmento peptídico del mismo, que comprende - un sustrato, - un péptido que está unido covalentemente al sustrato, y que tiene un dominio de unión que se une a heparina o a un polisacárido tipo heparina o a un polímero tipo heparina con afinidad alta, en el que afinidad alta se define porque eluye de una columna de afinidad por heparina a no menos de 140 mM de NaCl, - heparina o un polisacárido tipo heparina o un polímero tipo heparina unido a ese péptido, - un factor de crecimiento proteínico o fragmento peptídico del mismo que tiene un dominio que se une a dicha heparina o polisacárido tipo heparina o polímero tipo heparina con afinidad baja, en el que afinidad baja se define porque proporciona elusión de una columna de afinidad por heparina a una concentración de NaCl menor de aproximadamente 140 mM.
Description
Liberación controlada de factores de crecimiento
a partir de matrices que contienen heparina.
La presente invención se refiere al campo de las
matrices tridimensionales que contienen moléculas farmacológicamente
activas, en particular factores de crecimiento. La invención
también se refiere al uso de factores de crecimiento o proteínas en
una matriz diseñada para promover el crecimiento de células y
tejidos. La invención además se refiere al uso de factores de
crecimiento con afinidad baja de unión a heparina. Así mismo, la
invención se refiere al campo de artículos de fabricación útiles
como dispositivos implantables y apósitos para heridas ya que la
matriz de la invención está diseñada para usarse junto con tales
dispositivos para proporcionar liberación mantenida y controlada
del factor de crecimiento, promoviendo así la curación de heridas en
el paciente.
Muchos factores de crecimiento se piensa que son
factores de crecimiento "que se unen a heparina". Las familias
con uno o más miembros que se unen a heparina incluyen factores de
crecimiento de fibroblastos y proteínas morfogenéticas óseas (BMP)
(1, 2). Factores de crecimiento adicionales que se unen a heparina
incluyen factor de crecimiento transformante \beta1
(TGF-\beta1), interleuquina-8,
neurotrofina-6, factor de crecimiento de células
endoletiales vasculares, factor de crecimiento epidérmico que se une
a heparina, factor de crecimiento de hepatocitos, factor de
crecimiento de tejido conectivo, midquina, y molécula asociada de
crecimiento que se une a heparina (3-11). Estos
factores han demostrado el potencial de potenciar la cicatrización
de muchos tipos de tejidos diferentes incluidos el vascular, de la
piel, nervioso y hepático.
Anteriormente se han diseñado dispositivos de
administración controlada que se basan en la afinidad por heparina
de estos factores de crecimiento (12-14). Estos
dispositivos de administración de fármacos se han usado
anteriormente para administrar factores de crecimiento "que se
unen a heparina". Típicamente se considera que tales factores de
crecimiento que se unen a heparina son aquellos que se unen a
heparina con una afinidad relativamente alta, que a menudo se
caracteriza por la elución a partir de columnas de afinidad por
heparina a concentraciones de NaCl muy por encima de los niveles
fisiológicos (> 140 mM). En tales sistemas de administración,
habitualmente se usa la afinidad de unión a heparina del factor de
crecimiento para secuestrar los factores de crecimiento sobre
heparina inmovilizada de alguna manera. Por ejemplo, Edelman y cols.
han usado perlas de sefarosa conjugadas con heparina para unir un
factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF) y después
encapsular las perlas con alginato (12, 19). Estas perlas sirven de
reservorios que liberan bFGF lentamente basándose en las constantes
de unión y disociación de bFGF y heparina.
Para la administración de factores de crecimiento
"que no se unen a heparina" anteriormente han sido necesarios
procedimientos de liberación para la administración que típicamente
se basaban en la difusión y liberación controlada de los factores a
partir de materiales porosos (15-18). Sigue
existiendo una necesidad en la técnica médica de un dispositivo que
sea capaz de proporcionar la liberación de factores de crecimiento
que se unen a heparina con afinidad baja con una velocidad
controlada y predecible para proporcionar la liberación eficaz del
factor durante un periodo clínicamente útil durante el proceso de
curación de heridas.
El documento
WO-A-99/54359 (estado de la técnica
en el sentido del Art. 54 (3) de CPE) describe una matriz para
purificar proteínas mediante cromatografía por afinidad que
comprende un gel de sefarosa y heparina que tiene una proteína que
se une a heparina con afinidad baja (IGF-1) y una
proteína que se une a heparina con afinidad alta
(MBF-2) unidas al mismo. Los documentos
EP-A-0 838 219 y
EP-A-0 732 105 describen una
formulación de liberación controlada que comprende un factor de
crecimiento que se une a heparina con afinidad baja y heparina o un
oligosacárido tipo heparina atrapado en una matriz de colágeno. M.
E. Nimni (1997) Biomaterials 18, 1201-1225 describe
una formulación de liberación controlada similar que comprende
factores de crecimiento que se unen a heparina con afinidad baja
atrapado en una matriz de hidrogel. El documento
WO-A-92/09301 describe una
formulación para promover la cicatrización de heridas que comprende
un factor de crecimiento que se une a heparina, heparina y
pegamento de fibrina. En ninguna de estas matrices la heparina (o un
polisacárido o polímero tipo heparina) está unida a un péptido, que
a su vez está unido covalentemente al sustrato y tiene un dominio
que se une a heparina con afinidad
elevada.
elevada.
En un sentido general y global, la presente
invención se refiere al uso de factores de crecimiento que no se
unen a heparina en técnicas de administración que emplean factores
de crecimiento con afinidad por heparina utilizando secuencias con
afinidad baja por heparina presentes en muchas proteínas. Los
presentes inventores han encontrado que los factores de crecimiento
particulares que se emplean como parte de la invención poseen una
secuencia básica en un sito de la proteína que es accesible
libremente en la conformación nativa de la proteína. Esta región
básica puede poseer sólo una afinidad relativamente baja por
heparina.
Tal como se usa en la descripción de la presente
invención, "afinidad baja de unión a heparina" de un factor de
crecimiento o fragmento peptídico del mismo se define como cualquier
proteína, péptido, o derivado o combinación de los mismos, que es
capaz de demostrar la actividad biológica de un factor de
crecimiento, y que tiene una afinidad de unión relativamente baja
para unirse a heparina, y que eluye de la columna de afinidad por
heparina a concentraciones de NaCl por debajo de las fisiológicas.
Los niveles fisiológicos de NaCl pueden definirse como
aproximadamente 140 mM de NaCl. En el presente documento, la
expresión niveles de NaCl "por debajo de los fisiológicos",
por lo tanto, puede definirse además como entre aproximadamente 25
mM y aproximadamente 140 mM de NaCl. Aunque los factores de
crecimiento con afinidad baja de unión a heparina eluyen de las
columnas de afinidad por heparina a concentraciones de NaCl por
debajo de las fisiológicas, su afinidad baja por heparina puede
usarse todavía para secuestrar la proteína o péptido sobre una
matriz que contiene heparina o un sitio que se une a
heparina.
heparina.
A modo de ejemplo, y sin pretender en modo alguno
estar limitado a ningún mecanismo de acción particular, la
invención puede describirse porque emplea una matriz que tiene
proteínas de factores de crecimiento con una relación relativamente
alta de sitios que se unen a heparina. Debe usarse una relación de
al menos 1:1 entre heparina y factor de crecimiento, pero cuanto
mayor sea el exceso de sitios de heparina, más lenta será la
liberación. De este modo, principalmente pueden unirse factores de
crecimiento "que no se unen a heparina" o fragmentos
peptídicos de los mismos con una afinidad de unión a heparina
relativamente baja a una matriz decorada con heparina. Estas
matrices después pueden servir de reservorios que contienen el
factor o factores de crecimiento a administrar. La cinética de
disociación proteínas que se unen a heparina con afinidad baja es
relativamente rápida, pero el alto número de sitios de unión permite
que el factor de crecimiento vuelva a unirse antes de que pueda
difundirse al exterior de la matriz. La liberación puede producirse
mediante difusión del factor de crecimiento al exterior de la
matriz antes de que vuelva a unirse, o puede ocurrir si el factor
de crecimiento encuentra un receptor en la superficie celular antes
de volverse a unir a un sitio de heparina. De este modo, la
liberación del factor de crecimiento o fragmento bioactivo del mismo
puede ser sostenida y continuar favoreciendo una cicatrización
mejorada.
En un sentido general y global, la presente
invención describes en al menos un aspecto una matriz especialmente
diseñada que proporciona la liberación de factores de crecimiento o
fragmentos bioactivos del mismo. El factor de crecimiento está
definido porque tiene una afinidad baja de unión a heparina. La
matriz, de forma más particular, puede definirse porque comprende
un sustrato capaz de proporcionar la unión de heparina, un
polisacárido tipo heparina, o un polímero tipo heparina, y un
factor de crecimiento o fragmento peptídico del mismo que tiene un
dominio básico que se une a heparina con afinidad baja.
La característica del factor de crecimiento o
fragmento peptídico del mismo de unirse a heparina con afinidad
baja además puede describirse como un péptido/proteína que eluirá de
una columna de afinidad por heparina a una concentración de NaCl de
aproximadamente 25 mM a aproximadamente 140 mM.
El factor de crecimiento o fragmento peptídico
del mismo de "afinidad baja de unión a heparina" puede
definirse además porque comprende una longitud de aproximadamente 8
a 30 residuos aminoacídicos: Esta secuencia de residuos
aminoacídicos, en algunas realizaciones, puede definirse porque
comprende al menos 2 residuos aminoacídicos básicos, una relación
entre residuos aminoacídicos básicos y ácidos de al menos 2, y una
relación entre residuos aminoacídicos hidrófobos y residuos
aminoacídicos básicos de al menos 0,67. El factor de crecimiento o
fragmento del mismo eluye de una columna de afinidad por heparina a
menos de 140 mM o de aproximadamente 25 a aproximadamente 140 mM de
NaCl.
Para los fines de esta solicitud de patente los
aminoácidos básicos pueden definirse como K (lisina) o R (arginina).
Los residuos aminoacídicos ácidos además pueden definirse como O
(ácido aspártico) o E (ácido glutámico). Los residuos aminoacídicos
hidrófobos pueden definirse como A (alanina), V (valina), F
(fenilalanina), P (prolina), M (metionina), I (isoleucina), o L
(leucina). Para los fines de esta solicitud, las C (cisteína) que
están implicadas en un puente disulfuro se consideran también
hidrófobas.
A modo de ejemplo, el factor de crecimiento o un
fragmento peptídico del mismo de afinidad baja de unión a heparina
tal como se define en la invención comprende neunurina, persefina,
IGF-1A, IGF-1 p, EGF, NGF\beta,
NT-3, BDNF, NT-4,
TGF-\beta2, TGF-\beta3,
TGF-\beta4, o un fragmento peptídico de cualquiera
de estos. Pueden encontrarse otros factores de crecimiento que
contienen dominios básicos similares que no se enumeran en el
presente documento. La matriz en sí también puede comprender
cualquiera de una variedad de materiales, tales como fibrina,
colágeno, ácido hialurónico, o un hidrogel de polímero sintético. A
modo de ejemplo, el hidrogel de polímero sintético puede ser un
hidrogel de poli(etilenglicol) o un derivado del mismo.
Pueden usarse otros hidrogeles de polímeros sintéticos aparte de
los que se enumeran en el presente documento.
Los péptidos de la invención que se unen heparina
con afinidad alta tienen un dominio de aminoácidos característico
que no eluye de una columna de afinidad por heparina a menos de 140
mM de NaCl. Aunque existen muchos péptidos potenciales, los
inventores han identificado diversas secuencias peptídicas en
particular. Éstas se ejemplifican mediante las secuencias de
aminoácidos que se identifican en las SEQ ID. N.º: I, SEQ ID. N.º:
2: SEQ ID. N.º: 3; SEQ ID. N.º: 4; y SEQ ID. N.º: 5. Pueden usarse
muchos otros péptidos aparte de las secuencias que se enumeran
específicamente en el presente documento.
La heparina o los polisacáridos tipo heparina de
la invención además pueden caracterizarse, al menos en algunas
realizaciones, porque tienen un peso molecular de al menos 3.000
Daltons. Se contempla que virtualmente podría usarse heparina o
polisacárido tipo heparina de cualquier peso molecular en la
práctica de la invención de al menos 3.000 Daltons, sin ninguna
limitación por arriba del peso molecular. Con fines prácticos puede
considerarse un peso molecular máximo de 10,000.000. En
aplicaciones particulares, el polisacárido tipo heparina además
puede definirse como un polisacárido que tiene un peso molecular de
al menos 3.000 Daltons y que tiene al menos una carga negativa por
cada dos anillos de sacáridos y no más de una carga positiva por
cada diez anillos de sacáridos.
Ejemplos de polisacáridos tipo heparina incluyen
sulfato de dextrano, sulfato de condroitina, sulfato de heparina,
fucano, alginato o derivados de los mismos. Los presentes inventores
han encontrado que, en la práctica de la invención, pueden
emplearse preparaciones particulares de la matriz que incluyen una
relación molar particular entre heparina y factor de crecimiento,
tal como una relación molar de 1,. Además se ha encontrado que una
matriz de la invención que incluye una relación molar de péptidos
unidos covalentemente que tienen un dominio de unión que se une a
heparina con afinidad alta o un polisacárido tipo heparina de al
menos uno es, en algunas realizaciones de la matriz, una relación
preferida. Estos heparina y polisacáridos tipo heparina pueden estar
o unidos covalentemente al sustrato o inmovilizados mediante
interacciones no covalentes (es decir, unidos electroestáticamente).
Pueden diseñarse polímeros sintéticos que funcionen de una forma
tipo heparina.
El sustrato de la matriz tal como se define en la
presente invención puede comprender fibrina, colágeno, ácido
hialurónico, un gel de polímero sintético, una mezcla de los mismos,
o cualquier variedad de derivados sintéticos de los mismos, que
sean capaces de sustentar la unión de los tipos de péptidos que se
describen en el presente documento, y/o células.
La matriz y diversas realizaciones de la matriz
que se describen en el presente documento, proporcionan una
multitud de ventajas en particular cuando se emplean en zonas de
tejido donde se desea una respuesta de cicatrización de heridas. El
factor de crecimiento o fragmento peptídico del mismo que se
proporciona en la matriz es liberado mediante la degradación de un
componente de la matriz, mediante la disociación del factor de
crecimiento de la heparina o del polisacárido tipo heparina, o
mediante una combinación de estos mecanismos. De este modo, puede
lograrse una liberación más sostenida y controlada del factor de
crecimiento en la zona sitio en la que se implanta la matriz. La
presente invención proporciona procedimientos para proporcionar la
liberación controlada del factor de crecimiento en una zona de
herida que lo necesite. El factor de crecimiento para tales
aplicaciones puede incluir TGF-\beta3, que puede
ser útil en particular en la cicatrización de la dermis. La
invención proporciona diversos artículos de fabricación, tales como
un implante o derivación vascular, o sustitución de tejido que
incluye la matriz que se define en esta descripción. Tales artículos
en algunas realizaciones pueden definirse como composiciones
esterilizadas implantables. Los péptidos que se unen a heparina que
se usan en los presentes ejemplos poseen una afinidad alta por
heparina.
Además de usar matrices proteínicas como sustrato
del sistema de administración, pueden usarse otros tipos de
matrices. Pueden usarse hidrogeles de polímeros sintéticos, que
incluyen hidrogeles formados mediante reacciones de
fotopolimerización o adición de conjugados, como sustrato para el
dispositivo de administración. Este material sintético puede
contener dominios de adhesión celular, sustratos para la degradación
o hidrólisis enzimática, dominios de unión a heparina, o heparina
unida covalentemente. A través de la unión tanto covalente como no
covalente de heparina, tales matrices sintéticas pueden unirse a
proteínas de factores de crecimiento con afinidad baja de unión a
heparina y liberarlas de forma controlada. La liberación puede
producirse mediante degradación de componentes de la matriz o
disociación de las proteínas del factor de crecimiento con afinidad
baja de unión a heparina, igual que en las matrices proteínicas.
El sustrato para el sistema de administración
también puede incluir matrices de ácido hialurónico o derivados de
ácido hialurónico. Tales materiales se usan comúnmente y están
fácilmente disponibles. Puede usarse la adicción de heparina o
polisacáridos tipo heparina unidos covalentemente o no
covalentemente para proporcionar la administración controlada de
proteínas de factores de crecimiento con afinidad baja de unión a
heparina. La liberación puede producirse mediante la degradación de
componentes de la matriz o disociación de las proteínas de factores
de crecimiento con afinidad baja de unión a heparina, al igual que
las matrices de proteínas o polímeros sintéticos.
Además de heparina, otros polímeros tipo heparina
tienen una afinidad similar de unión a proteínas y péptidos que se
unen a heparina. Tales polímeros tipo heparina incluyen, por
ejemplo, sulfato de dextrano, sulfato de condroitina, sulfato de
heparina, fucano y alginato (Véase Maaroufi, y cols., 1997 (46) y
Logeart, y cols., (1997) (47). Así mismo, también existen polímeros
sintéticos tipo heparina o derivados de polisacáridos, que tienen
una afinidad similar de unión a proteínas o péptidos que se unen a
heparina. Ejemplos de derivados de polisacáridos tipo heparina
incluyen derivados de dextrano tales como los sintetizados por de
Raucourt, y cols., (1998) (48) y Bagheri-Yamand, y
cols., (1998) (49). Ejemplos de polímeros sintéticos tipo heparina
incluyen los de Silver, y cols., (1992) (50). Para los fines de esta
invención, el uso del término "heparina" se considera que
incluye todos los polímeros tipo heparina y polisacáridos que
incluyen los que se describen anteriormente.
| Abreviatura de 3 letras | Abreviatura de 1 letra | Nombre del aminoácido | |
| Ala | A | Alanina | |
| Arg | R | Arginina | |
| Asn | N | Asparragina | |
| Asp | D | Ácido aspártico | |
| Cys | C | Cisteína | |
| Glu | E | Ácido glutámico | |
| Gln | Q | Glutamina | |
| Gly | G | Glicina | |
| His | H | Histidina | |
| Ile | I | Isoleucina | |
| Leu | L | Leucina | |
| Lys | K | Lisina | |
| Met | M | Metionina | |
| Phe | F | Fenilalanina | |
| Pro | P | Prolina | |
| Ser | S | Serina | |
| Thr | T | Treonina | |
| Trp | W | Triptófano | |
| Tyr | Y | Tirosina | |
| Val | V | Valina |
\vskip1.000000\baselineskip
En la descripción de la presente invención se
hace referencia a las siguientes secuencias:
| SEQ ID N.º: 1 | Dominio ATIII | K(\betaA)FAKLAARLYRKA |
| SEQ ID N.º: 2 | Dominio PF4 | YKKIIKKL |
| SEQ ID N.º: 3 | Dominio NCAM | KHKGRDVILKKDVR |
| SEQ ID N.º: 4 | Dominio ATIII modificado | R(\betaA)FARLAARLYRRA |
| SEQ ID N.º: 5 | Dominio bFGF | KOPKRLYRSRKY |
| SEQ ID N.º: 6 | Dominio NGF básico | CVLSRKAVRRA |
| SEQ ID N.º: 7 | Dominio NT-3 básico | CALSRKIGRT |
| SEQ ID N.º: 8 | Dominio BDNF básico | CTLTIKRGR |
Fig.
1
Efecto de factor de crecimiento básico de
fibroblastos unido a la matriz sobre la extensión de las neuritas
de los ganglios de la raíz dorsal en geles tridimensionales de
fibrina. Se diseccionaron ganglios de embriones de pollo de 8 días
y se introdujeron en geles de fibrina lavados previamente. * denota
p<0,05 comparado con fibrina sin modificar. Los tratamientos
solubles contienen bFGF, pero no heparina ni péptido que se une a
heparina. Estos tratamientos no muestran diferencias comparados con
fibrina sin modificar lo que sugiere que el protocolo de lavado que
se usó fue suficiente para eliminar el factor de crecimiento no
unido. Los resultados también sugieren que péptido, heparina, y
factor de crecimiento son todos componentes necesarios del sistema
de liberación controlada.
Barra 1, fibrina; Barra 2, con Péptido +
heparina; Barra 3, 0,1, \mug/ml unido; Barra 4, 1,0 \mug/ml
unido; Barra 5, 1,0 \mug/ml soluble; Barra 6, 5,0 \mug/ml
unido; Barra 7, 5,0 \mug/ml unido; Barra 8, 1,0 \mug/ml
cultivo; Barra 9, VEGF 1,0 \mug/ml; Barra 10, 1,0 \mug/ml unido
a péptido al 50%; Barra 11, 1 \mug/ml + ATIII soluble; Barra 12,
1 \mug/ml + heparina (sin péptido). "Unido" se refiere a
fibrina, con Péptido y heparina. "Soluble" se refiere a
fibrina.
Fig.
2
Efecto de NGF-\beta,
NT-3 y BDNF unidos a la matriz sobre la extensión de
las neuritas de los ganglios de la raíz dorsal en geles
tridimensionales de fibrina. Se diseccionaron ganglios de embriones
de pollo de 8 días y se introdujeron en geles de fibrina lavados
previamente. * denota p<0,05 comparado con fibrina sin
modificar. Los tratamientos solubles contienen factor de
crecimiento, pero no heparina ni péptido que se une a heparina.
Estos tratamientos no muestran diferencias comparados con fibrina
sin modificar lo que sugiere que el protocolo de lavado que se usó
fue suficiente para eliminar el factor de crecimiento no unido.
Barra 1, fibrina; Barra 2, NGF unido a 0,1
\mug/ml; Barra 3, NGF soluble a 0,1 \mug/ml; Barra 4, BDNF
unido a 0,1 \mug/ml; Barra 5, BDNF soluble a 0,1, \mug/ml unido;
Barra 6, NT-3 unido a 1,0 \mug/ml; Barra 7,
NT-3 soluble a 0,1 \mug/ml unido. "Unido" se
refiere a fibrina, con Péptido y heparina. "Soluble" se refiere
a fibrina.
Fig.
3
Capacidad de NGF-\beta unido a
la matriz para promover la extensión de neuritas de los ganglios de
la raíz dorsal en geles tridimensionales de fibrina en función del
tiempo de lavado antes de la siembra de células. Se diseccionaron
ganglios de embriones de pollo de 8 días y se introdujeron en geles
de fibrina lavados previamente. * denota p<0,05 comparado con
fibrina sin modificar. Los tratamientos solubles contienen factor de
crecimiento, pero no heparina ni péptido que se une a heparina.
Este ensayo demuestra que NGF-\beta unido a la
matriz mantiene su actividad durante 4 días mientas el
NGF-\beta no unido no es activo 1 día después del
lavado.
- -\blacksquare - - fibrina;
- -\blacklozenge - - ngf unido (100 ng/ml);
- -\bullet - - ngf soluble (100 ng/ml)
La presente invención proporciona composiciones
útiles para promover la liberación controlada de factores de
crecimiento que se unen a heparina con afinidad baja que tienen un
dominio que se une a heparina con afinidad baja de aproximadamente
8 a aproximadamente 30 aminoácidos básicos de longitud.
Los siguientes ejemplos se incluyen para
demostrar realizaciones preferidas de la invención. Los expertos en
la técnica deberían apreciar que las técnicas que se describen en
los ejemplos siguientes representan técnicas descubiertas por el
inventor que funcionan bien en la práctica de la invención, y así
puede considerarse que constituyen modos preferidos para su
práctica.
La cromatografía de afinidad por heparina es un
procedimiento que se usa habitualmente para determinar la afinidad
relativa de proteínas que se unen a heparina. Si una proteína eluye
a concentraciones de NaCl cercanas o por debajo del nivel
fisiológico (aproximadamente 140 mM) no se considera que "se une a
heparina" para los fines de la descripción de la presente
invención. Esto es debido a que los factores de crecimiento se
disociarían rápidamente de la heparina in vivo.
La afinidad relativa de las proteínas por
heparina se determinó mediante cromatografía de afinidad por
heparina, usando una columna TSK-GEL
Heparin-5PW (7,5 mm x 7,5 mm de DI) (TosoHass,
Stuttgart, Alemania). Se inyectaron muestras de la proteína en Tris
20 mM, a pH 7,4, NaCl 0,05 M. La elución se realizó pasando un
gradiente de NaCl de 0,05 M a 2,0 M en el transcurso 30 minutos, y
la concentración de NaCl a la que se observaba la elución se
registraba como medición de la afinidad de unión a heparina de la
proteína. Se determinó la afinidad relativa de unión a heparina de
proteínas que no se había reseñado anteriormente en la bibliografía
que se unían a heparina y se comparó con proteínas tales como bFGF
y antitrombina III, que se sabe que se unen a heparina con fuerza.
Los resultados se muestran en la Tabla 1.
Los dos factores de crecimiento "que no se unen
a heparina", TGF-\beta2 y NGF\beta ambos
eluían a concentraciones de NaCl por debajo de las fisiológicas, lo
que sugiere que tienen una afinidad de unión a heparina
relativamente baja, y que se disociarán rápidamente de heparina en
condiciones fisiológicas. Las dos proteínas que se unen a heparina,
antitrombina III y bFGF, eluyen a concentraciones de NaCl que son
muy superiores a los niveles fisiológicos.
Otros también han usado heparina para aumentar la
actividad y prevenir la degradación de factores de crecimiento.
Schroeder y cols. (20) usaron heparina para aumentar la estabilidad
de TGF-\beta1 y prevenir la pérdida de actividad.
También han unido heparina a colágeno y han empleado el complejo de
heparina y TGF-\beta1 en geles de colágeno para
mostrar que tales sistemas con base de heparina pueden aumentar la
actividad de los factores de crecimiento in vivo mediante la
liberación controlada (21). Se ha demostrado que
TGF-\beta1 posee una fuerte afinidad de unión a
heparina. Sin embargo, tales sistemas basados en la liberación de
heparina no han sido analizados anteriormente con factores de
crecimiento, que se considera que presentan una afinidad baja de
unión a heparina (aquellos caracterizados por la elución de columnas
de afinidad por heparina a concentraciones de NaCl por debajo de las
fisiológicas).
El análisis de la secuencia primaria de proteínas
por los presentes inventores, incluyendo factores de crecimiento,
ha revelado que la secuencia primaria puede contener regiones que
son de naturaleza básica y además los residuos básicos están
habitualmente flanqueados por residuos hidrófobos. Estas secuencias
generalmente son de naturaleza similar al consenso XBBXBX de unión
a heparina (donde X es un residuo hidropático y B es un residuo
básico) el consenso de unión a heparina fue descrito por Cardin y
Weintraub (22). Sin embargo, la secuencia exacta de las regiones
básicas varía de una proteína a otra. También está disponible la
estructura tridimensional de muchas proteínas, lo que permite
determinar la localización de las regiones básicas.
Para que las regiones básicas sean útiles para
secuestrar una proteína, deben estar localizadas sobre la superficie
de la proteína. Con frecuencia, se observa que tales regiones
aparecen en el extremo amino o carboxi de la proteína.
\vskip1.000000\baselineskip
| Proteína | [NaCl] necesaria para eluir el péptido |
| bFGF | 2,0 M |
| antitrombina III | 1,58 M |
| TGF-\beta2 | 0,05 M |
| NGF\beta | 0,05 M |
El presente ejemplo se proporciona para describir
el modelo para ensayar la bioactividad in vitro de los
materiales que se describen en el presente documento.
Un modelo in vitro de gel tridimensional
de fibrina para ensayar la extensión de las neuritas. Se disolvió
fibrinógeno en agua y se dializó en solución salina tamponada con
Tris (TBS) a pH 7,4 durante 24 horas. La concentración de
fibrinógeno se determinó midiendo la absorbancia a 280 nm. Se
prepararon geles de fibrina que contenían una concentración final
de 3,5 mg/ml de fibrinógeno, Ca^{++} 2,5 mM, y 2 unidades NIH/ml
de trombina en TBS. La mezcla de polimerización se incubó durante
60 minutos a 37ºC, humedad relativa del 95%, y CO_{2} al 5%.
Tras la polimerización, se añadió 1 ml de TBS a
cada pocillo. Los geles se lavaron 5 veces en 24 horas, donde las 4
primeras soluciones de lavado consistían en TBS y la última solución
consistía en medio basal neuronal modificado. Se diseccionaron
ganglios de la raíz dorsal (DRG) de embriones de pollo de 8 días y
se introdujeron en solución salina tamponada con solución de Hanks.
Los ganglios se introdujeron en los geles de fibrina (uno por
pocillo) y los geles se incubaron durante 60 minutos a 37ºC, humedad
relativa del 95%, y CO_{2} al 5%. Después de 60 minutos, se
añadió 1 ml de medio basal neuronal modificado a cada pocillo. El
medio se cambió a las 24 horas. Se obtuvieron imágenes en campo
brillante de los ganglios a las 24 y 48 horas. Se analizaron las
imágenes para determinar la longitud media de la extensión de las
neuritas, que se calculó que era el área de un anillo entre el
cuerpo del DRG y el halo exterior de las neuritas que se extendían,
tal como mostraron Herbert y cols. (1996) (23). La extensión de
neuritas para cada experimento se normalizó con respecto a la
extensión media de las neuritas en geles de fibrina no modificada
del mismo experimento y tiempo. Los resultados se muestran en la
Figura 1. Barra 1. Este estudio demuestra la utilidad de la
invención como material de soporte y de crecimiento celulares que
potenciará la extensión de las neuritas en tres dimensiones. Esto
demuestra también la utilidad que la invención tendría para
promover el crecimiento celular y la extensión de neuritas en
condiciones que se encuentran in vivo.
Un ejemplo de un factor de crecimiento que no se
considera un factor de crecimiento que se une a heparina, pero que
contiene una secuencia básica es el factor de crecimiento factor de
crecimiento nervioso \beta (NGF\beta). Este factor de
crecimiento se considera que no se une a heparina e incluso se ha
usado como control negativo para una proteína que se une a heparina
en análisis de unión a heparina (Véase Lee y Lander (1991) (24)).
Sin embargo, NGF contiene un dominio básico en la posición de
aminoácido desde el extremo C (230-241 de NGF beta
humano) que consiste en los siguientes residuos: CVLSRKAVRRA (SEQ ID
N.º: 6). Pueden encontrarse dominios básicos similares en los
extremos carboxi de neurotrofina-3
(NT-3, CALSRKIGRT, 248-257 de
NT-3 humano, SEQ ID N.º: 7) y factor neurotrófico
derivado de cerebro (CTLTIKRGR, 238-247 de BDNF
humano, SEQ ID N.º: 8).
El presente ejemplo demuestra que NGF\beta,
NT-3 y BDNF pueden administrarse de forma sostenida
a partir de matrices de fibrina que contienen heparina inmovilizada
de forma no covalente. Este sistema consiste en péptidos que se
unen a heparina inmovilizados covalentemente formando puentes
transversales con la matriz de fibrina mediante el factor XIIIa
(Véase Schense y Hubbell (1999) (25)) y heparina, que está unida de
forma no covalente a estos péptidos que se unen a heparina. El
presente inventor ha demostrado que estos materiales administran,
de forma eficaz, factores de crecimiento que se unen a heparina, tal
como factor de crecimiento básico de fibroblastos.
Con este sistema, se sintetiza un péptido de dos
dominios que comprende una secuencia que se une a heparina en un
dominio y un sustrato para el factor enzimático de coagulación XIIIa
en el otro dominio (Schense y Hubbell, (1999) (25)). Esta enzima
une covalentemente el dominio de sustrato del péptido de dos
dominios al entramado de fibrina durante la coagulación,
inmovilizando también así el dominio que se une a heparina del
péptido de dos dominios al entramado de fibrina. La heparina
también está incluida en la mezcla de coagulación, y así la
heparina se inmoviliza en el entramado de fibrina uniéndose al
péptido inmovilizado.
El sistema de liberación se caracterizó primero
con factores de crecimiento que demuestran una afinidad fuerte de
unión a heparina. Los resultados de estos estudios se muestran en la
Figura 1. La barra 1 muestra la extensión de neuritas a través de
geles de fibrina no modificados. La barra 2 muestra que el sistema
de liberación, que consiste en heparina y péptido que se une a
heparina incorporado, no promueve la extensión de neuritas sin la
adición de factor de crecimiento. Las barras 3, 4 y 6 muestran el
efecto de la respuesta en función de la dosis de bFGF unido a la
matriz, que potencia la extensión de neuritas hasta en un 100%
(barra 6). Las barras 5 y 7 muestran que cuando se añade bFGF
durante la polimerización del gel de fibrina en ausencia del
sistema de liberación, no potencia la extensión de neuritas,
presumiblemente porque se difunde fuera de la fibrina demasiado
rápido. La barra 8 muestra que la presencia de bFGF en el medio de
cultivo promueve la extensión de neuritas de forma similar a la de
bFGF unido a la matriz a la misma concentración. La barra 9 muestra
que VEGF no potencia la extensión de neuritas, lo que demuestra que
el factor de crecimiento unido también debe mostrar bioactividad en
modelos neuronales para promover extensión de neuritas. La barra 10
muestra que cuando la cantidad de sitios que se unen a heparina se
disminuye en un 50%, la liberación de factor de crecimiento no se
ve afectada de forma significativa. Esta desviación apoya el
argumento de que hay presente que un exceso elevado de sitios de
unión de factor de crecimiento. La barra 11 muestra que cuando el
péptido está formando puentes transversales con la matriz,
constituirá un sistema de administración con base de heparina
funcional. La barra 12 demuestra que la heparina y bFGF sin el
péptido que se une a heparina inmovilizado no constituyen un
sistema de administración funcional y que la heparina y el péptido
inmovilizado potenciarán y mantendrán la liberación sostenida de
factor de crecimiento. Estos resultados demuestran que el sistema de
administración es capaz de una liberación sostenida de un factor de
crecimiento que se une a heparina en una forma activa.
La capacidad de las matrices de fibrina que
contienen heparina de administrar factores de crecimiento que se
unen a heparina con afinidad baja se ha analizado usando
NGF-\beta, NT-3 y BDNF, todos
miembros de la familia de las neurotrofinas. Se prepararon geles de
fibrina tal como se describe en el Ejemplo 2, a excepción de la
adición de péptido, heparina y neurotrofina que se describen a
continuación. Se prepararon geles de fibrina que contenían una
concentración final de 3,5 mg/ml de fibrinógeno, 2,5 mM de
Ca^{++}, 2 unidades de NIH/ml de trombina, péptido 0,25 mM,
heparina 0,125 mM, y 0,1 \mug/ml de la neurotrofina a analizar.
En los demás respectos, el ensayo se realizó tal como se describe en
el Ejemplo 2. Los resultados se muestran en Figura 2. El grupo de
fibrina representa el comportamiento de la fibrina normal y fue el
conjunto de datos de control con el que se normalizó la extensión
de las neuritas. Estos ganglios se cultivaron en presencia de 20
ng/ml de NGF. Todos los otros tratamientos no contenían factores de
crecimiento en el medio. Para cada una de las tres neurotrofinas
analizadas, la extensión de las neuritas fue potenciada únicamente
cuando el sistema de administración con base de heparina de péptido
y heparina estaba presente y unido a la matriz (barras de
"unido"). La adición de neurotrofina sola (barras de
"soluble") sin péptido ni heparina no potenció la extensión de
neuritas presumiblemente porque el factor se difundía fuera de la
fibrina demasiado rápido. Los materiales que se muestran en la
Figura 2 difieren de los de la Figura 1 porque en la Figura 2 se
liberaron factores de crecimiento con "afinidad baja de unión a
heparina", mientras que los factores que se liberaron en la
Figura 1 se consideran que se unen a heparina con fuerza. Esta
distinción se demuestra claramente en el Ejemplo 1, en el que el
factor de crecimiento que se une a heparina (bFGF) eluyó de la
heparina por encima de concentraciones fisiológicas de NaCl,
mientras que los factores de crecimiento que se unen a heparina con
afinidad baja y los que no se unen (NGF-\beta, y
TGF-\beta2) eluyeron por debajo de las
concentraciones fisiológicas de NaCl. En ambos casos, los sistemas
de administración con base de heparina fueron capaces de
administrar factores de crecimiento bioactivos de forma controlada.
Esto demuestra, sorprendentemente, que los factores de crecimiento
que no se unen a heparina pueden ser liberados de forma sostenida
por matrices que contienen heparina.
Para determinar durante cuanto tiempo podría
mantenerse la liberación de factores de crecimiento con afinidad
baja, se lavaron geles que contenían NGF-\beta
durante periodos de tiempo largos antes de sembrar las células. En
cada caso, los geles se lavaron abundantemente con TBS. Los
resultados se muestran en la Figura 3. La bioactividad del factor
de crecimiento presente después de 4 días es la misma que 1 día
después del lavado. Una semana después del lavado, disminuye la
bioactividad del factor de crecimiento liberado.
Estos resultados demuestran que
NGF-\beta, NT-3 y BDNF están
siendo secuestrados por heparina y que el aumento del crecimiento
comparado con la fibrina sin modificar es debido al factor de
crecimiento unido a la matriz, en lugar de al factor de crecimiento
libre. Esto demuestra que tales materiales con base de heparina
pueden usarse para secuestrar proteínas con afinidad baja de unión
a heparina, que contienen regiones básicas expuestas. En esta
matriz de fibrina tridimensional, la heparina se inmovilizó a
aproximadamente 380 \mug/ml. Este material demostró liberación de
NGF durante aproximadamente una semana. Hay situaciones en las que
sería útil la liberación durante sólo un día. Así, una cantidad
útil de heparina inmovilizada sería al menos 95 \mug/ml, donde
cantidades mayores provocan la liberación sostenida durante periodos
más largos.
Los resultados que se muestran en el presente
documento demuestran que "factores de crecimiento que no se unen
a heparina", tales como NGF\beta, BDNF y NT-3,
pueden ser liberados de forma controlada mediante sistemas de
administración de fármacos con base de heparina basándose en su
afinidad baja por heparina. Estas proteínas pueden ser secuestradas
en materiales tridimensionales que contienen heparina inmovilizada
basándose en los dominios básicos que se encuentran en las
proteínas. Además, los factores de crecimiento liberados por estos
sistemas mantienen la bioactividad en modelos in vitro tal
como se muestra anteriormente. Esto demuestra que podrían liberarse
otras proteínas de factores de crecimiento con afinidad baja de
unión a heparina que contuvieran tipos similares de dominios
básicos mediante sistemas de administración con base de heparina de
forma similar.
La estrategia para el análisis de las secuencias
que se describe anteriormente puede aplicarse así mismo a factores
de crecimiento de otras familias. En la Tabla 2 se muestra una lista
de factores de crecimiento y sus secuencias, que muestra dominios
que pueden tener una afinidad baja de unión a heparina y podrían ser
liberados por sistemas de administración con base de heparina tal
como los que se describen anteriormente. Estos factores incluyen
algunos miembros de la familia de TGF-\beta, en
concreto TGF-\beta2,
TGF-\beta3, y TGF-\beta4.
TGF-\beta2, TGF-\beta3, y
TGF-\beta4 son miembros de una familia, que
contiene un factor de crecimiento que se une a heparina con
afinidad fuerte, TGF-\beta1. Sin embargo, se ha
reseñado en la bibliografía que otros miembros de la familia de
TGF-\beta presentan una afinidad de unión a
heparina menor, tal como TGF-\beta3 (Véase Lyon y
cols. (1997) (26)). Se ha demostrado que
TGF-\beta1 se une a heparina a una potencia
iónica fisiológica, es decir a NaCl 140 mM.
TGF-\beta3 carece de una carga clave y se ha
demostrado que "no se une a heparina", en condiciones
fisiológicas. La cromatografía de afinidad por heparina de
TGF-\beta3 llevada a cabo por los presentes
inventores demuestra que también posee afinidad baja de unión a
heparina en condiciones fisiológicas. El dominio básico en cada uno
de estos factores de crecimiento, que podría interactuar
potencialmente con heparina, está subrayado en la lista de
secuencias que se proporciona en la Tabla 2.
Algunos miembros de una familia de factores de
crecimiento pueden unirse a heparina, mientras que otros no, tal
como demuestra la familia de TGF-\beta. A pesar de
la afinidad baja de unión a heparina de tales factores de
crecimiento "que no se unen a heparina", todavía pueden ser
liberados de forma controlada mediante sistemas de administración
con base de heparina si contienen un dominio básico y el número de
sitios que se unen a heparina presentes en el sistema está en un
exceso relativamente mayor que la cantidad de factor de crecimiento
a unir.
Otras familias de factores de crecimiento también
contienen factores de crecimiento que no se reseña en la
bibliografía que se unan a heparina, pero que contienen dominios
básicos (Se muestran en la Tabla 2).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
Tabla 2: Secuencias de proteínas de factores de crecimiento con
afinidad baja y alta de unión a heparina.\cr
\begin{minipage}[t]{160mm}Los dominios básicos de las proteínas
de factores de crecimiento con afinidad baja de unión a heparina
están subrayados y los residuos aminoacídicos básicos (K o R) se
muestran en negrita.\end{minipage} \cr
\begin{minipage}[t]{160mm} El análisis de la estructura
primaria de las proteínas de los factores de crecimiento, tales como
los que se muestran en la Tabla 2, puede usarse para identificar
los dominios
básicos.\end{minipage} \cr}
\vskip1.000000\baselineskip
Al analizar las secuencias de la familia de
TGF\beta y de la familia de neurotrofinas, una persona de
experiencia en la técnica puede observar un patrón en los dominios
básicos subrayados en la Tabla 2. A partir de este patrón que se
observa en los dominios básicos de las proteínas con afinidad baja
de unión a heparina, se desarrolló una fórmula aproximada para
identificar dominios básicos similares en otras proteínas. La
fórmula define un dominio básico que tiene una longitud de
aproximadamente 8 a 30 residuos aminoacídicos, que comprende al
menos 2 residuos aminoacídicos básicos, con una relación entre los
residuos aminoacídicos básicos y ácidos de al menos 2, y una
relación con los residuos aminoacídicos hidrófobos de al menos 0,67.
La estructura secundaria y terciaria de la proteína también influye
en la afinidad de unión a heparina de un dominio básico en una
proteína o un péptido y, por esta razón, la fórmula es aproximada.
Por lo tanto, es necesario realizar una cromatografía de afinidad
por heparina o alguna otra técnica experimental para determinar la
afinidad relativa por heparina de una proteína o péptido. El
término "proteína con afinidad baja de unión a heparina" se
refiere únicamente a aquellas proteínas o péptidos que eluyen de la
cromatografía de afinidad por heparina a una concentración de NaCl
menor de aproximadamente 140 mM. La fórmula para el análisis de las
secuencias que se describe anteriormente se aplicó a la lista
factores de crecimiento que se encuentra en la Tabla 2 y se usó para
identificar dominios básicos que potencialmente podrían unirse a
heparina o a polímeros tipo heparina.
Una proteína con afinidad baja de unión a
heparina debería disociarse rápidamente de la heparina en
condiciones fisiológicas. Sin embargo, sorprendentemente los
resultados que se muestran en la Fig. 3 demuestran que tales
proteínas de factores de crecimiento con afinidad baja de unión a
heparina pueden ser liberadas de forma controlada por sistemas de
administración con base de heparina. Este resultado novedoso sugiere
que otros factores de crecimiento que contienen dominios que
cumplen los requisitos de la fórmula que se describe anteriormente
pueden ser liberados también de forma controlada por sistemas de
administración con base de heparina. Ejemplos de tales factores de
crecimiento se muestran en la lista de secuencias de la Tabla 2, y
los dominios básicos de estos factores de crecimiento están
subrayados.
Dos miembros de la familia de GDNF, en concreto
neurturina y persefina, contienen ambos dominios básicos. En la
bibliografía se reseña que GDNF se une a heparina, pero no hay
reseñas hasta la fecha de la afinidad por heparina de otros
miembros de la familia de GDNF (27). Neurturina y persefina,
basándose en el análisis que se presenta anteriormente, parecerían
tener una afinidad de unión a heparina suficiente para poder ser
liberadas mediante los procedimientos y materiales de esta
invención.
IGF-1A e IGF-1B
son miembros de la familia de factor de crecimiento insulinoide.
Aunque existen trabajos extensos sobre proteínas que se unen a
factor de crecimiento insulinoide que se unen a heparina, no existe
documentación en la bibliografía sobre la unión a heparina de
IGF-1A o IGF-1B. Ambas proteínas
contienen los dominios básicos que se muestran en la Tabla 2.
Basándose en el análisis que se presenta anteriormente, parecerían
tener una afinidad de unión a heparina suficiente para poder ser
liberadas mediante los procedimientos y materiales de esta
invención.
EGF es otro factor de crecimiento, que contiene
un dominio básico, que se muestra en Tabla 2, pero que no se reseña
en la bibliografía que se una a heparina. De hecho, la existencia de
un factor de crecimiento relacionado al que se denomina
específicamente factor de crecimiento tipo EGF que se une a heparina
sugiere que EGF no posee una afinidad alta por heparina. La
bibliografía sugiere que EGF no se une a heparina basándose en el
análisis de la secuencia (45). Basándose en el análisis que se
presenta anteriormente, a los presentes inventores les parece que
tiene una afinidad de unión a heparina suficiente para poder ser
liberado mediante los procedimientos y materiales de esta
invención.
A pesar de los dominios básicos que se encuentran
en cada una de estas proteínas, su afinidad de unión a heparina
todavía es débil y se caracteriza por la elución de columnas de
afinidad por heparina por debajo de concentraciones fisiológicas de
NaCl (es decir, factores de crecimiento que eluyen entre
aproximadamente 25 mM y 140 mM de NaCl). Por ejemplo, se realizó
una cromatografía de afinidad por heparina para
NGF-\beta y TGF-\beta2. En
ambos casos se encontró que las proteínas eluían a 50 mM de NaCl a
pH 7,4 después de varios volúmenes de columna de tampón, que está
muy por debajo de la concentración de NaCl fisiológica. Sin embargo,
los estudios in vitro demuestran que los sistemas de
liberación con base de heparina pueden usarse todavía para liberar
NGF-\beta de forma controlada, a pesar de su
afinidad relativamente baja de unión a heparina.
Todos los factores de crecimiento que se
describen en el ejemplo contienen dominios básicos, pero carecen de
reseñas en la bibliografía respecto a la afinidad de unión a
heparina. Sin embargo, basándose en la comparación de las
secuencias y los resultados que se han demostrado con otros factores
de crecimiento que no se unen a heparina de la familia de las
neurotrofinas, debería ser posible una liberación mantenida a partir
de sistemas con base de heparina virtualmente con cualquier factor
de crecimiento que tenga un dominio básico que tenga las
características de los dominios básicos que se describen
anteriormente.
1. Presta, M., Satuto. M.,
Isacchi, A., Caccia, P., Pozzi. A.,
Gualandris, A., Rusnati, M., Bergonzoni. L., y
Sarmientos, P. (1992) Biochem Biophys Res
Commun 185: 1098-1107.
2. Reddi, A. (1998) Nature
Biotechnology 16: 247-252.
3. McCaffrey, T., Falcone, D., y
Du, B. (1992) J Cell Physiol 152:
430-440.
4. Spillmann, D., Witt, D., y
Lindahl, U. (1998) J Biol Chem 273:
15487-15493.
5. Götz, R., Köster, R.,
Winkler, C., Raulf. F., Lottspeich, F.,
Schartl, M., y Thoenen, H. (1994) Nature
372: 266-269.
6. Tessler, S., Rockwell, P.,
Hicklin, D., Cohen, T., Levi, B., Witte,
L., Lemischka, I., y Neufeld, G. (1994). J
BioI Chem 269: 12456-12461.
7. Kiguchi, K., Beltran, L.,
Rupp, T., y DiGiovanni, J. (1998) Mol
Carcinog 22: 73-83.
8. Kinosaki, M., Yamagucki, K.,
Murakami. A., Ueda, M., Morinaga, T., y
Higashio, K. (1998) Biochim Biophys Acta 1384:
93-102.
9. Steffen, C.,
Ball-Mirth, D., Harding, P.,
Bhattacharyya, N., Pillai, S., y Brigstock. D.
(1998) Growth factors 15: 199-213.
10. Kaneda, N., Talukder, A.,
Nishiyama, H., Koizumi, S., y Muramatsu, T.
(1996) J Biochem (Tokyo) 119: 1150- 1156.
11. Nolo, R., Kaksonen, M., y
Rauvala, H. (1996). Eur J Neurosci 8:
1658-1665.
12. Edelman, E., Mathiowitz, E.,
Langer, R., y Klagsbrun, M. (1991)
Biomaterials 12: 612-626.
13. DeBlois, C., Cote, M.-F., y
Doillon, C. (1994) Biomaterials 15:
665-672.
14. Downs, E., Robertson, N.,
Riss, T., y Plunkett, M. (1992) J Cell
Physiol 152: 422-429.
15. Houle, J. y Johnson, J.
(1989) Neurosci Lett 103: 17-23.
16. Camarata, P., Suryanarayanan,
R., Turner, D., Parker, R., y Ebner, T.
(1992) Neurosurgery 30: 313-319.
17. Powell, E., Sobarzo, M., y
Saltzman. W. (1990) Brain Res 515:
309-311.
18. Maysinger, D., Jalenjak, I., y
Cuello, A. (1992) Neurosci Lett 140:
71-74.
19. Edelman, E, Langer, R.,
Klagsbum, M., y Mathiowitz, E (1992)
Controlled Delivery Systems Containing Heparin and Growth
Factors, MIT: EE. UU.
20. Schroeder, J., Bentz. H., y
Estridge, T. (1997) Affinity bound collagen
matrices for the administration of biologically active agents,
Collagen Corporation: EE. UU.
21. Schroeder-Tefft, J.,
Bentz, H., y Estridge, T. (1997) J
Controlled Release 49: 291-298.
22. Cardin, A. y Weintraub, H.
(1989) Atherosclerosis 9: 21-32.
23. Herbert, C., Bittner, G., y
Hubbell, J. (1996) J Comp Neurol 365:
380-391.
24. Lee, M. y Lander, A.
(1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:
2768-2772.
25. Schense, J. y Hubbell, J.
(1999) Bioconjug Chem 10: 75-81.
26. Lyon, M., Rushton, G., y
Gallagher, J. (1997) J Biol Chem 272:
1800-18006.
27. Lin, L.-F.H., Zhang, T.,
Collins, F., y Armes, L (1994) J
Neurochem 63: 758-768.
28. Besson, C. Saulnier J.,
Wallach, J. (1996) Analytical Biochemistry 237:
216-223.
29. Coombs G., Bergstrom R.,
Madison E., y Corey, D. (1998) The Journal
of Biological Chemisty 237: 4323-4328.
30. Götz, R., Köster, R.,
Winkler, C., Raulf, F., Lottspeich, F.,
Shartl, M., y Thoenen, H. (1994) Nature
372: 266-269.
31. Hata, A., Ridinger, D.,
Sutherland, S., Emi, M., Shuhua, Z.,
Myers, R., Ren, K., Cheng, T., Inoue,
I., Wilson, D., Iverius, P., y Lalouel. J.
(1993) The Journal of Biological Chemistry 268:
8847-8457.
32. Haugen, P., McCarthy, J.,
Roche, K., Furcht, L., y Letoumeau, P.
(1992) The Journal of Neuroscience Junio
2034-2042.
33. Kallapur, S. y Akeson, R.
(1992) Journal of Neuroscience Research 33:
538-548.
34. Kaneda, N., Talukder, A.,
Nishiyama, H., Koizumi, S., y Muramatsu, T.
(1996) J. Biochem 119: 1150-1156.
35. Kiguchi, K., Beltran, L.,
Rupp, T., y DiGiovanni, J. (1998) Molecular
Carcinogenesis 22: 73-83.
36. Kinosaki, M., Yamaguchi, K.,
Murakami, A., Ueda, M., Morinaga, T.,
Higashio, K. (1998) Biochimica et Biophysica
Acta 1384: 93-102.
37. McCaffrey, T., Falcone, D., y
Du, B. (1992) Journal of Celular Physiology
152: 430-440.
38. Netzel-Arnett, S.,
Fields, G., Birkedal-Hansen, H., y Van
Wart, H. (1991) The Journal of Biological
Chemistry 266: 6747-6755.
39. Nolo, R., Kaksonen. M. y
Rauvala. H. (1996) European Journal of
Neuroscience 8: 1658-1665.
40. Smith, M., Shi, L. y
Navre, M. (1995) The Journal of Biological
Chemistry 270: 6440-6449.
41. Spillmann, D., Witt, D., y
Lindahl, U. (1998) The Journal of Biological
Chemistry 273: 15487-15493.
42. Steffen, C.,
Ball-Mirth, D., Harding, P.,
Bhattacharyya, N., Pillai, S., y Brigstock, D.
(1998) Growth Factors 15:
199-213.
43. Presta, y cols. (1992)
Biochemical and Biophysical Research Communications, 185:
1098-11 07 (1992).
44. Zucker, M. y Katz, I.,
(1991) Society for Experimental Biology and Medicine:
693-702.
45. Higashiyama S., Abraham J. A.,
Miller J., Fiddes, J. C., y Kiagsbrun, M.
(1991) Science 251 (4996): 936-9.
46. Maaroufi, R. M., Jozefowicz,
M., Tapon-Bretaudiere J., Jozefonwicz,
J., Fischer, A. M., Biomaterials 1997, 18:
359-366.
47. Logeart. D.,
Prrgent-Richard, S., Jozefonwicz, J.,
Letourneur, D., Eur J Cell Biol 1997, 74:
376-384.
48. de Raucourt, E., Maural, S.,
Chaubet. F., Maiga-Revel, O.,
Jozefonwicz. M., Fischer, A. M., J. Biomed Mater
Res 1998, 41: 49-57.
49. Bagheri-Yamand, R.,
Kourbali, Y., Mabilat, C., Morere, J. F.,
Martin, A., Lu, H., Soria, C.,
Jozefonwicz, J., Crepin. M., Br. J. Cancer
1998, 78: 111-118.
50. Silver, J. H., Hart, A. P.,
Williams, E. C., Cooper S. L., Charet, S.,
Labarre, D., Jozetowicz, M., Biomaterials
1992, 13: 339-344.
51. Patente de Estados Unidos n.º 5.830.700
Irani. Meher.
Claims (22)
1. Un sistema de administración para un factor
de crecimiento proteínico o fragmento peptídico del mismo, que
comprende
- un sustrato,
- un péptido que está unido covalentemente al
sustrato, y que tiene un dominio de unión que se une a heparina o a
un polisacárido tipo heparina o a un polímero tipo heparina con
afinidad alta, en el que afinidad alta se define porque eluye de
una columna de afinidad por heparina a no menos de 140 mM de
NaCl,
- heparina o un polisacárido tipo heparina o un
polímero tipo heparina unido a ese péptido,
- un factor de crecimiento proteínico o fragmento
peptídico del mismo que tiene un dominio que se une a dicha
heparina o polisacárido tipo heparina o polímero tipo heparina con
afinidad baja, en el que afinidad baja se define porque proporciona
elusión de una columna de afinidad por heparina a una concentración
de NaCl menor de aproximadamente 140 mM.
2. El sistema de administración de la
reivindicación 1, en el que el factor de crecimiento proteínico o
fragmento peptídico del mismo se define porque eluye de una columna
de afinidad por heparina a una concentración de NaCl de
aproximadamente 25 mM a aproximadamente 140 mM.
3. El sistema de administración de la
reivindicación 1 ó 2, en el que el dominio del factor de crecimiento
proteínico o fragmento peptídico del mismo se define además porque
comprende una longitud de aproximadamente 8 a 30 residuos
aminoacídicos que comprenden al menos 2 residuos aminoacídicos
básicos, una relación entre residuos aminoacídicos básicos y ácidos
de al menos 2, y una relación entre residuos aminoacídicos
hidrófobos y residuos aminoacídicos básicos de al menos 0,67.
4. El sistema de administración de la
reivindicación 3, en el que los residuos aminoacídicos básicos son
K o R.
5. El sistema de administración de la
reivindicación 3 ó 4, en el que los residuos aminoacídicos ácidos
se definen además como D o E.
6. El sistema de administración de una
cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en el que los residuos
aminoacídicos hidrófobos se definen además como A, V, F, P, M, I, o
L o C cuando C está implicado en un enlace disulfuro.
7. El sistema de administración de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el factor de
crecimiento proteínico o fragmento peptídico del mismo es
neurturina, persefina, IGF-1A,
IGF-1\beta, EGF, NGF\beta,
NT-3, BDNF, NT-4,
TGF-\beta2, TGF-\beta3, o
TGF-\beta4.
8. El sistema de administración de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el sustrato
comprende al menos uno de fibrina, colágeno, ácido hialurónico,
derivados de ácido hialurónico, e hidrogeles de polímeros
sintéticos.
9. El sistema de administración de la
reivindicación 8, en el que el sustrato es fibrina.
10. El sistema de administración de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la heparina o
polisacárido tipo heparina o polímero tipo heparina está unido de
forma no covalente al péptido que se une a heparina o a un
polisacárido tipo heparina o a un polímero tipo heparina con
afinidad alta.
11. El sistema de administración de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el péptido que
se une a heparina o a un polisacárido tipo heparina o a un polímero
tipo heparina con afinidad alta además se define porque comprende
SEQ ID N.º: 1, SEQ ID N.º: 2, SEQ ID N.º: 3, SEQ ID N.º: 4, o SEQ ID
N.º: 5.
12. El sistema de administración de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la heparina o
el polisacárido tipo heparina o el polímero tipo heparina tiene un
peso molecular entre aproximadamente 3000 y 10.000.000 Daltons.
13. El sistema de administración de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el polisacárido
tipo heparina tiene un peso molecular entre aproximadamente 3000 y
10.000.000 Daltons, y tiene al menos una carga negativa por cada 2
anillos de sacáridos y no más de una carga positiva por cada 10
anillos de sacáridos.
14. El sistema de administración de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el polímero
tipo heparina es sulfato de dextrano, sulfato de condroitina,
sulfato de heparina, fucano, alginato o un derivado del mismo.
15. El sistema de administración de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que la relación
molar entre la heparina o el polisacárido tipo heparina o el
polímero tipo heparina y el factor de crecimiento proteínico o
fragmento peptídico del mismo es al menos 1.
16. El sistema de administración de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que la relación
molar entre un péptido unido covalentemente que se une a heparina o
a un polisacárido tipo heparina o a un polímero tipo heparina con
afinidad alta por la heparina o por el polisacárido tipo heparina o
por el polímero tipo heparina es al menos 1.
17. Un artículo de fabricación que comprende un
sistema de administración para un factor de crecimiento proteínico
o un fragmento peptídico del mismo de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 16, en el que el sustrato es capaz de
sustentar la adhesión celular.
18. El artículo de fabricación de la
reivindicación 17 que es un injerto vascular.
19. El artículo de fabricación de la
reivindicación 17 que es un artículo para el tratamiento de heridas
dérmicas.
20. El artículo de fabricación de la
reivindicación 17 que es una composición esterilizada
implantable.
21. Uso de un péptido que es capaz de unirse
covalentemente a un sustrato y que tiene un dominio de unión que se
une a heparina o a un polisacárido tipo heparina o a un polímero
tipo heparina con afinidad alta, en el que afinidad alta se define
porque eluye de una columna de afinidad por heparina a no menos de
140 mM de NaCl, para la fabricación de un sistema de administración
de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.
22. El uso de la reivindicación 21, en el que el
factor de crecimiento proteínico o factor peptídico comprendido en
el sistema de administración es liberado por la disociación del
factor de crecimiento proteínico o factor peptídico del mismo de la
heparina o del polisacárido tipo heparina o del polímero tipo
heparina.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/IB1999/000800 WO2000064481A1 (en) | 1999-04-22 | 1999-04-22 | Controlled release of growth factors from heparin containing matrices |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2255257T3 true ES2255257T3 (es) | 2006-06-16 |
Family
ID=11004855
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES99915970T Expired - Lifetime ES2255257T3 (es) | 1999-04-22 | 1999-04-22 | Liberacion controlada de factores de crecimiento a partir de matrices que contienen heparina. |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1178834B1 (es) |
| JP (1) | JP2002542301A (es) |
| AT (1) | ATE314863T1 (es) |
| AU (1) | AU3438199A (es) |
| CA (1) | CA2369579A1 (es) |
| DE (1) | DE69929323T2 (es) |
| ES (1) | ES2255257T3 (es) |
| MX (1) | MXPA01010567A (es) |
| WO (1) | WO2000064481A1 (es) |
Families Citing this family (33)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8106001B2 (en) * | 1996-08-27 | 2012-01-31 | University Of South Florida | Diagnostic markers of human female infertility |
| US7601685B2 (en) | 1998-08-27 | 2009-10-13 | Eidgenossische Technische Hochschule Zurich | Growth factor modified protein matrices for tissue engineering |
| US6894022B1 (en) | 1998-08-27 | 2005-05-17 | Eidgenossische Technische Hochschule Zurich | Growth factor modified protein matrices for tissue engineering |
| DE60042795D1 (de) * | 2000-05-01 | 2009-10-01 | Eth Zuerich | Matrizen aus modifizierten wachstumfaktoren zum gewebeaufbau |
| CA2681952A1 (en) | 2001-04-25 | 2002-10-31 | Eidgenoessische Technische Hochschule Zurich | Drug delivery matrices to enhance wound healing |
| AU2002365162A1 (en) | 2001-11-14 | 2003-07-09 | Northwestern University | Self-assembly and mineralization of peptide-amphiphile nanofibers |
| US7247609B2 (en) | 2001-12-18 | 2007-07-24 | Universitat Zurich | Growth factor modified protein matrices for tissue engineering |
| US7371719B2 (en) | 2002-02-15 | 2008-05-13 | Northwestern University | Self-assembly of peptide-amphiphile nanofibers under physiological conditions |
| US7981862B2 (en) | 2003-08-19 | 2011-07-19 | Biosurface Engineering Technologies, Inc. | Composition comprising BMP-2 amplifier/co-activator for enhancement of osteogenesis |
| AU2003262760A1 (en) | 2002-08-21 | 2004-03-11 | Northwestern University | Charged peptide-amphiphile solutions and self-assembled peptide nanofiber networks formed therefrom |
| US7554021B2 (en) | 2002-11-12 | 2009-06-30 | Northwestern University | Composition and method for self-assembly and mineralization of peptide amphiphiles |
| AU2003298647A1 (en) | 2002-11-14 | 2004-06-15 | Claussen, Randal, C. | Synthesis and self-assembly of abc triblock bola peptide |
| JP4837553B2 (ja) | 2003-02-11 | 2011-12-14 | ノースウエスタン ユニバーシティ | ナノ結晶表面被膜の方法及び材料ならびにその上へのペプチド両親媒性物質ナノ繊維の付着物 |
| AU2004297211A1 (en) | 2003-12-05 | 2005-06-23 | Northwestern University | Branched peptide amphiphiles, related epitope compounds and self assembled structures thereof |
| AU2004296181A1 (en) | 2003-12-05 | 2005-06-23 | Northwestern University | Self-assembling peptide amphiphiles and related methods for growth factor delivery |
| US7671012B2 (en) | 2004-02-10 | 2010-03-02 | Biosurface Engineering Technologies, Inc. | Formulations and methods for delivery of growth factor analogs |
| CA2555583A1 (en) | 2004-02-20 | 2005-09-09 | Biosurface Engineering Technologies, Inc. | Positive modulator of bone morphogenic protein-2 |
| WO2006073711A2 (en) | 2005-01-06 | 2006-07-13 | Kuros Biosurgery Ag | Use of a matrix comprising a contrast agent in soft tissues |
| US8575101B2 (en) | 2005-01-06 | 2013-11-05 | Kuros Biosurgery Ag | Supplemented matrices for the repair of bone fractures |
| NZ560649A (en) | 2005-03-04 | 2011-03-31 | Univ Northwestern | Angiogenic heparin binding peptide amphiphiles, peptide amphiphiles, self-assembled composition and related methods of use |
| US7517856B2 (en) * | 2005-10-11 | 2009-04-14 | Ben-Gurion University Of The Negev Research And Development Authority | Bioconjugates comprising sulfated polysaccharides and their uses |
| US20080181879A1 (en) * | 2007-01-18 | 2008-07-31 | Baxter International Inc. | Fibrin gel for controlled release of tgf-beta and uses thereof |
| PL2136850T3 (pl) | 2007-04-13 | 2012-07-31 | Kuros Biosurgery Ag | Polimeryczny uszczelniacz tkankowy |
| US8076295B2 (en) | 2007-04-17 | 2011-12-13 | Nanotope, Inc. | Peptide amphiphiles having improved solubility and methods of using same |
| JP2012512812A (ja) | 2007-12-28 | 2012-06-07 | クロス・バイオサージェリー・アクチェンゲゼルシャフト | フィブリンフォームに組込まれたｐｄｇｆ融合タンパク質 |
| KR100971271B1 (ko) * | 2008-04-28 | 2010-07-20 | 한양대학교 산학협력단 | 헤파린이 결합된 피브린젤, 그 제조방법 및 키트 |
| AU2010236584A1 (en) | 2009-04-13 | 2011-11-10 | Northwestern University | Novel peptide-based scaffolds for cartilage regeneration and methods for their use |
| EP2686027B1 (en) | 2011-03-16 | 2021-05-05 | Kuros Biosurgery AG | Pharmaceutical formulation for use in spinal fusion |
| WO2013124855A1 (en) | 2012-02-21 | 2013-08-29 | Ben-Gurion University Of The Negev Research And Development Authority | Hydrogel system comprising spatially separated bioactive polypeptides |
| EP2946011B1 (en) * | 2013-01-17 | 2019-04-17 | The Regents of The University of California | Growth factor sequestering and presenting hydrogels |
| EP3080246A4 (en) | 2013-12-11 | 2017-05-24 | The Regents of The University of California | Compositions and methods for producing and administering brown adipocytes |
| CN109069875B (zh) | 2016-01-07 | 2021-12-24 | 位于本-古里安大学之内盖夫技术与应用有限公司 | 产生免疫耐受反应的组合物和方法 |
| CN118649290A (zh) * | 2024-08-14 | 2024-09-17 | 南开大学 | 一种用于牙周骨缺损再生的纳米纤维膜支架及其制备方法 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1294546C (en) * | 1986-04-23 | 1992-01-21 | John S. Sundsmo | Wound healing composition containing collagen |
| IL90683A0 (en) * | 1988-06-27 | 1990-01-18 | Yissum Res Dev Co | Osteogenic growth factors derived from regenerating bone marrow |
| US4925677A (en) * | 1988-08-31 | 1990-05-15 | Theratech, Inc. | Biodegradable hydrogel matrices for the controlled release of pharmacologically active agents |
| US5654267A (en) * | 1988-12-20 | 1997-08-05 | La Jolla Cancer Research Center | Cooperative combinations of ligands contained within a matrix |
| EP0564502B1 (en) * | 1990-11-27 | 2002-01-30 | The American National Red Cross | Tissue sealant and growth factor containing compositions that promote accelerated wound healing |
| GB9101183D0 (en) * | 1991-01-18 | 1991-02-27 | Univ London | Depot formulations |
| US5693341A (en) * | 1995-03-16 | 1997-12-02 | Collagen Corporation | Affinity bound collagen matrices for the delivery of biologically active agents |
| CA2217134A1 (en) * | 1996-10-09 | 1998-04-09 | Sumitomo Pharmaceuticals Co., Ltd. | Sustained release formulation |
| GB9722604D0 (en) * | 1997-10-28 | 1997-12-24 | Cancer Res Campaign Tech | Heparin-binding growth factor derivatives |
| AUPP298498A0 (en) * | 1998-04-17 | 1998-05-07 | Gropep Pty Ltd | Matrix binding factor |
| EP1107791B8 (en) * | 1998-09-04 | 2007-11-07 | Scios Inc. | Hydrogel compositions for the controlled release administration of growth factors |
| DE19841698A1 (de) * | 1998-09-11 | 2000-03-16 | Curative Technologies Gmbh | Wachstumsfaktor-enthaltende Zusammensetzung zur Heilung von Gewebeschäden |
-
1999
- 1999-04-22 ES ES99915970T patent/ES2255257T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-22 CA CA002369579A patent/CA2369579A1/en not_active Abandoned
- 1999-04-22 JP JP2000613471A patent/JP2002542301A/ja active Pending
- 1999-04-22 MX MXPA01010567A patent/MXPA01010567A/es active IP Right Grant
- 1999-04-22 WO PCT/IB1999/000800 patent/WO2000064481A1/en active IP Right Grant
- 1999-04-22 DE DE69929323T patent/DE69929323T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-22 AT AT99915970T patent/ATE314863T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-04-22 AU AU34381/99A patent/AU3438199A/en not_active Abandoned
- 1999-04-22 EP EP99915970A patent/EP1178834B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU3438199A (en) | 2000-11-10 |
| CA2369579A1 (en) | 2000-11-02 |
| DE69929323D1 (de) | 2006-03-30 |
| JP2002542301A (ja) | 2002-12-10 |
| ATE314863T1 (de) | 2006-02-15 |
| MXPA01010567A (es) | 2005-04-29 |
| EP1178834B1 (en) | 2006-01-04 |
| EP1178834A1 (en) | 2002-02-13 |
| WO2000064481A1 (en) | 2000-11-02 |
| DE69929323T2 (de) | 2006-09-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2255257T3 (es) | Liberacion controlada de factores de crecimiento a partir de matrices que contienen heparina. | |
| US6723344B2 (en) | Controlled release of non heparin-binding growth factors from heparin-containing matrices | |
| US20230190864A1 (en) | Purified amphiphilic peptide compositions and uses thereof | |
| Yan et al. | Synthetic design of growth factor sequestering extracellular matrix mimetic hydrogel for promoting in vivo bone formation | |
| Sakiyama-Elbert et al. | Controlled release of nerve growth factor from a heparin-containing fibrin-based cell ingrowth matrix | |
| Rajabi et al. | Keratinous materials: Structures and functions in biomedical applications | |
| Jeon et al. | Affinity-based growth factor delivery using biodegradable, photocrosslinked heparin-alginate hydrogels | |
| Watarai et al. | TGFβ functionalized starPEG-heparin hydrogels modulate human dermal fibroblast growth and differentiation | |
| US5661127A (en) | Peptide compositions with growth factor-like activity | |
| EP1961411A1 (en) | A controlled release composition | |
| US20140079753A1 (en) | Bmp binding peptides | |
| ES2247423T5 (es) | Método de producción de un dispositivo recubierto homogéneamente que tiene propiedades osteoinductoras y osteoconductoras | |
| ES2270453T3 (es) | Composiciones de peptidos con actividad similar a la de los factores de crecimiento. | |
| KR100971271B1 (ko) | 헤파린이 결합된 피브린젤, 그 제조방법 및 키트 | |
| US20050282747A1 (en) | Methods and compositions for wound healing | |
| WO2012158169A1 (en) | Methods and compositions for tissue repair | |
| AU2012376780A1 (en) | System and method for multiphasic release of growth factors | |
| ES2705602T3 (es) | Composiciones de péptidos anfifílicos purificadas y usos de las mismas | |
| BUDIRAHARJO | Potential Applications of Chitosan-Based Hydrogels in Regenerative Medicine | |
| Yang | Versatility and biocompatibility of amphiphilic diblock copolypeptide hydrogels in the central nervous system |