DE60225185T2

DE60225185T2 - Wachstumsfaktor-modifizierte proteinmatrizes zur geweberekonstruktion (tissue engineering)

Info

Publication number: DE60225185T2
Application number: DE60225185T
Authority: DE
Inventors: Jeffrey A. Hubbell; Matthias Lutolf; Jason Schense; Anna Jen
Original assignee: Eidgenoessische Technische Hochschule Zurich ETHZ; Universitaet Zuerich
Current assignee: Eidgenoessische Technische Hochschule Zurich ETHZ; Universitaet Zuerich
Priority date: 2001-12-18
Filing date: 2002-12-18
Publication date: 2009-02-19
Anticipated expiration: 2022-12-19
Also published as: JP4560291B2; WO2003052091A1; DE60225185D1; JP2005517658A; AU2009201588B2; BRPI0215192B1; AU2009201588A1; JP2009102383A; MXPA04006021A; ATE386545T1; CA2470419A1; WO2003052091A8; AU2002358272A1; BR0215192A; AU2002358272B2; ES2301697T3; BRPI0215192B8

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft Fusionsproteine oder Fusionspeptide, die PTH und eine Aminosäuresequenz, die Bindungswechselwirkungen zu Matrices zulässt, enthalten, Matrices, die das Fusionspeptid aufweisen, ein Verfahren zur Herstellung derartiger Matrices, und ein das Fusionspeptid aufweisendes Kit. Die Fusionspeptide sind geeignet zur Verwendung bei der Wiederherstellung und Neubildung von Gewebe und bei der kontrollierten Freisetzung von PTH.
Hintergrund der Erfindung
Nebenschilddrüsenhormon (PTH – parathyroid hormone) ist ein Peptid mit 84 Aminosäuren, das von der Nebenschilddrüse hergestellt und abgesondert wird. Dieses Hormon spielt eine Hauptrolle bei der Kontrolle von Serum-Calciumspiegeln durch seine Wirkung auf verschiedene Gewebe, einschließlich Knochen. Studien am Menschen mit verschiedenen Formen von PTH haben eine aufbauende Wirkung auf Knochen gezeigt, was sie für die Behandlung von Osteoporose und verwandten Knochenerkrankungen interessant macht ( US-Patent Nr. 5 747 456 von Chorev, et al. und WO 00/10596 von Eli Lilly & Co.). Das Nebenschilddrüsenhormon wirkt auf Zellen durch Bindung an einen Zelloberflächenrezeptor. Dieser Rezeptor ist dafür bekannt, auf Osteoblasten gefunden zu werden, den Zellen, die für die Bildung von neuem Knochen verantwortlich sind.
Es wurde berichtet, dass die N-terminale Domäne von 34 Aminosäuren des menschlichen Hormons dem Hormon in voller Länge biologisch äquivalent ist. PTH 1-34 und seine Wirkungsweise wurde zuerst in dem US-Patent Nr. 4 086 196 beschrieben. Seither wurden Forschungen durchgeführt an PTH 1-34 und anderen verkürzten Versionen der natürlichen menschlichen PTH-Form, wie z. B. PTH 1-25, PTH 1-31 und PTH 1-38 (siehe z. B. Rixon RH, et al., J. Bone Miner. Res., 9(8): 1179–89 (Aug. 1994).
Der Mechanismus, durch den PTH die Umbildung von Knochen beeinflusst, ist kompliziert, was zu gegensätzlichen Ergebnissen führte, und danach war eine beträchtliche Anzahl von Studien zu dem genauen Mechanismus die Folge. Es wurde gezeigt, dass, wenn PTH systemisch in kontinuierlicher Weise verabreicht wird, die Knochendichte abnimmt. Im Gegensatz dazu wurde berichtet, dass, wenn dasselbe Molekül stoßweise verabreicht wird, die Knochendichte zunimmt (siehe z. B. WO 99/31137 von Eli Lilly & Co.). Dieser scheinbare Widerspruch kann erklärt werden durch den Mechanismus, durch den PTH die Knochenumbildung und danach den beobachtbaren Parameter der Knochendichte moduliert. Bei voll entwickeltem Knochen wurde für den PTH-Rezeptor lediglich gezeigt, dass er an der Oberfläche von Zellen der Osteoblasten-Linie vorhanden ist, aber nicht auf Osteoclasten. Die Rolle, die PTH bei der Knochenumbildung spielt, nimmt den Weg über die Osteoblasten im Gegensatz zu den Osteoclasten. Die Zellen an unterschiedlichen Stadien der Osteoblasten-Linie reagieren jedoch unterschiedlich, wenn sie an PTH binden. Daher können die dramatischen Unterschiede, die beobachtet werden, wenn das PTH unter Verwendung verschiedener Verfahren verabreicht wird, erklärt werden, indem man die unterschiedlichen Wirkungen versteht, die dasselbe Molekül auf die unterschiedlichen Zellen innerhalb der Osteoblasten-Linie ausübt.
Wenn PTH an eine mesenchymale Stammzelle bindet, wird die Zelle veranlasst, sich in einen Präosteoblasten zu differenzieren. So gibt es durch Zugabe von PTH zu dem System eine Erhöhung der Präosteoblasten-Population. Diese Präosteoblast-Zellen haben jedoch ebenso den PTH-Rezeptor, und die nachfolgende Bindung des PTH an den Rezeptor auf diesen Zellen führt zu einer unterschiedlichen Reaktion. Wenn PTH an den Präosteoblasten bindet, führt das zu zwei getrennten Folgen, die zu Knochenresorption führen. Erstens hemmt es die weitere Differenzierung der Präosteoblasten zu Osteoblasten. Zweitens steigert es die Absonderung von Interleukin 6 (IL-6) aus den Präosteoblasten. IL-6 hemmt sowohl die Präosteoblast-Differenzierung, wie es auch die Präosteoclast-Differenzierung zu Osteoclasten steigert. Diese doppelte Reaktion der Zellen innerhalb der Osteoblast-Linie ist es, was die komplexe Reaktion zwischen Knochenumbildung und PTH-Exposition schafft. Wenn PTH periodisch für kurze Zeitspannen dosiert wird, dann werden die mesenchymalen Stammzellen dazu veranlasst, zu Osteoblasten zu differenzieren. Die kurzen Dosierungsspannen verhindern dann, dass die neu gebildeten Präosteoblasten IL-6 produzieren, was die Aktivierung der Osteoblasten verhindert. Daher können diese neu gebildeten Präosteoblasten während der Dosierungsintervalle weiter zu Osteoblasten differenzieren, was zu Knochenbildung führt. Wenn jedoch eine konstante Dosis PTH angewendet wird, dann haben die Präosteoblasten die Gelegenheit, mit der IL-6-Produktion zu beginnen, wodurch sie die Osteoclasten aktivieren und sich selbst hemmen, was zu der entgegengesetzten Wirkung führt: Knochenresorption.
Zur Wiederherstellung oder Neubildung von Gewebe müssen Zellen in ein Wundbett wandern, proliferieren, Matrixkomponenten exprimieren oder extrazelluläre Matrix bilden, und eine endgültige Gewebeform bilden. Oft müssen viele Zeltpopulationen an dieser morphogenetischen Reaktion teilnehmen, wozu häufig Gefäßzellen und Nervenzellen gehören. Es wurde gezeigt, dass Matrices dies stark fördern, und in manchen Zellen wurde gefunden, dass sie essenziell sind, damit dies auftritt. Es wurden Schritte unternommen zur Entwicklung von Matrices aus natürlichen oder synthetischen Ursprüngen oder einer Mischung von beidem. Natürliche Matrices zum Einwachsen von Zellen unterliegen der Umbildung durch zelluläre Einflüsse, die alle auf Proteolyse basieren, z. B. durch Plasmin (das Fibrin abbaut) und Matrix-Metalloproteinasen (die Collagen, Elastin, etc. abbauen). Ein derartiger Abbau ist hochgradig lokalisiert und tritt nur bei direktem Kontakt mit der wandernden Zelle auf. Zusätzlich ist die Zuführung spezifischer Zell-Signalproteine wie Wachstumsfaktoren streng reguliert. Im natürlichen Modell werden keine makroporösen Matrices zum Einwachsen von Zellen verwendet, sondern vielmehr mikroporöse Matrices, die die Zellen abbauen können, lokal und bei Bedarf, wenn die Zellen in die Matrix wandern. Aufgrund von Bedenken bezüglich Immunogenität, kostspieliger Herstellung, begrenzter Verfügbarkeit, Chargenveränderlichkeit und Reinigung, wurden Matrices auf der Basis synthetischer Vorläufermoleküle, wie modifiziertem Polyethylenglykol, zur Gewebe-Neubildung in und/oder auf dem Körper entwickelt.
Es wurde zwar viel Arbeit für das Studium der systemischen Wirkungen von PTH aufgewendet, aber die Forschung hat die lokale oder topische Verabreichung von PTH nicht erforscht. Da PTH eine unmittelbare aufbauende Wirkung auf die Abstammungslinie der Osteoblastzellen hat, sollte es ein starkes Potential zur Heilung von Knochenschäden haben, zusätzlich zur Beeinflussung der Knochendichte, wenn es in einer Schadstelle passend angeboten wird. Sobald der Schaden mit Präosteoblasten ausgefüllt ist, können sich dann, wenn das PTH-Signal abgeschaltet ist, die neu gebildeten Präosteoblasten zu Osteoblasten differenzieren und mit der Umwandlung des Wundbetts beginnen, zuerst in Geflechtknochengewebe und dann in eine voll entwickelte Knochenstruktur.
Die vorliegende Erfindung beansprucht den Zeitrang der WO 03/040235 , und WO 03/040235 beansprucht den Zeitrang der USSN 60/337 783. WO 03/040235 stellt bezüglich Offenbarung, die in ihrem Prioritätsdokument USSN 60/337 783 enthalten ist, ein Dokument gemäß Artikel 54(3) und (4) EPÜ dar. USSN 60/337 783 offenbart den Aufbau und die Chemie synthetischer Biomaterialien. Insbesondere lehrt es den Reaktionsmechanismus zur Bildung eines synthetischen Biomaterials, die Art der Vorläuferkomponenten, den Aufbau der Matrix zur Optimierung des Verhältnisses von Einwachsen von Zellen in das Material gegenüber hydrolytischem Abbau des Materials. Als eine weitere Ausführungsform wird die Anbringung von Zelladhäsionspeptiden zur Erleichterung des Einwachsens von Zellen und die kovalente Anbringung des Wachstumsfaktors BMP (Bone Morphogenic Protein) offenbart.
US-A-5 171 670 offenbart ein Verfahren zur Herstellung großer Mengen an menschlichem Nebenschilddrüsenhormon 1-84 (hPTH 1-84) oder von Varianten davon in Bakterien unter Verwendung von DNA-Rekombinationstechniken. Das Dokument lehrt eine DNA, die für hPTH codiert, das wirkungsvoll in Bakterien exprimiert werden kann. Die Expression findet durch ein Fusionsverfahren statt. Das Fusionspeptid enthält das PTH oder Varianten davon, eine Spaltungsstelle und ein Leitpolypeptid. Das Leitpolypeptid hilft, das Peptid (PTH) zu exprimieren und in einer stabilen Form zu halten, z. B. beständig gegen intrazellulären Abbau, während der Bakterienexpression, wird aber nach der Expression abgespalten, um das natürliche PTH zu erhalten. Die bevorzugte Leitsequenz ist menschliches Wachstumshormon. Das Leitpeptid hat in dem Fusionspeptid keine Funktion, nachdem seine bakterielle Expression beendet ist, sondern wird nach seiner Expression abgespalten.
US-A-6 136 564 betrifft einen Prozess zur rekombinanten Produktion von Peptiden durch Expression von Fusionsproteinen mit Streptavidin und nachfolgende enzymatische Spaltung des Fusionsproteins. Das Dokument lehrt, dass die Expression von Peptiden/Proteinen in löslicher Form (in das Periplasma) mittels ei nes Fusionsverfahrens, nachfolgende Abspaltung des Leitpeptids und Freisetzung des gewünschten Peptids/Proteins in seiner natürlichen Form insofern nachteilig ist, als die löslichen Fusionsproteine in der Zelle oder während der Abscheidung und Verarbeitung durch Proteolyse abgebaut werden können. Zur Überwindung dieses Nachteils benutzt der Prozess von US-A-6 136 564 Streptavidin, was den Vorteil schafft, dass Streptavidin-Fusionsproteine sehr gut in Prokarioten exprimiert werden können und in der Form unlöslicher inaktiver Proteine isoliert werden können. Der Prozess kann zur Produktion von Nebenschilddrüsenhormon (PTH) und von Fragmenten davon verwendet werden. Streptavidin wird nach der Expression des Fusionsproteins abgespalten.
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, PTH in einer Form bereitzustellen, die an eine Matrix zur Wiederherstellung, Neubildung und Umbildung von Gewebe gebunden werden kann.
Es ist eine weitere Aufgabe, ein PTH in einer Form anzugeben, die zur topischen oder lokalen Verabreichung an einen Patienten zur Heilung von Knochenschäden geeignet ist.
Die Aufgabe wird erfüllt durch ein Fusionspeptid, aufweisend eine erste Domäne, die Nebenschilddrüsenhormon (PTH) aufweist, und eine zweite Domäne, die eine Substratdomäne aufweist, die so mit einem Fibrin-Matrixmaterial oder mit einem synthetischen Matrixmaterial kovalent vernetzbar ist, dass das Fusionspeptid durch die zweite Domäne an die Matrix gebunden werden kann.
Die Aufgabe wird auch gelöst durch die Matrix, die zum Wachsen von Zellen oder zum Einwachsen von Zellen geeignet ist, aufweisend das Fusionspeptid der Erfindung, wobei das Fusionspeptid kovalent an die Matrix gebunden ist.
Die Aufgabe wird außerdem gelöst durch das Verfahren zur Herstellung der Matrix, aufweisend ein Bereitstellen mindestens eines Matrixmaterials, das zur Bildung einer vernetzten Matrix in der Lage ist, wobei das Matrixmaterial ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus Proteinen und synthetischen Materialien besteht, Zugeben des Fusionspeptids gemäß der Erfindung zu dem Matrixmaterial, und Vernetzen des Matrixmaterials dergestalt, dass das Fusionspeptid durch die zweite Domäne an die Matrix gebunden wird.
Die Aufgabe wird auch gelöst durch ein Kit, das das Fusionspeptid gemäß der vorliegenden Erfindung aufweist.
Zusammenfassung der Erfindung
Fusionspeptide, die ein Nebenschilddrüsenhormon (PTH) in einer Domäne und eine Substratdomäne, die kovalent mit einer Matrix vernetzt werden kann, in einer anderen Domäne enthalten, und Matrices und Kits, die solche Fusionsproteine oder Fusionspeptide enthalten, werden hierin offenbart. Fusionsproteine binden kovalent an natürliche oder synthetische Materialien unter Bildung von Matrices, die zur Heilung von Knochenschäden verwendet werden können. Gewünschtenfalls werden alle Komponenten zur Bildung der Matrix einem Knochenschaden zugeführt, und die Matrix wird an der Anwendungsstelle gebildet. Das Fusionspeptid kann so in die Matrix inkorporiert werden, dass entweder das Fusionspeptid insgesamt oder nur die entsprechende PTH-Sequenz der ersten Domäne durch den Abbau der Matrix durch enzymatische und/oder hydrolytische Wirkung freigesetzt wird. Das Fusionspeptid kann auch eine abbaubare Bindung zwischen der ersten und der zweiten Domäne, die hydrolytische oder enzymatische Spaltungsstellen enthält, enthalten. Insbesondere enthält das Fusionspeptid PTH in einer Domäne, eine Substratdomäne, die kovalent mit einer Matrix vernetzt werden kann, in einer zweiten Domäne, und eine Abbaustelle zwischen der ersten und der zweiten Domäne. Bevorzugt ist das PTH menschliches PTH, obwohl auch PTH aus anderen Quellen, wie Rinder-PTH, geeignet sein kann. Das PTH kann PTH 1-84 (natürlich), PTH 1-38, PTH 1-34, PTH 1-31 oder PTH 1-25 oder irgendeine modifizierte Version oder Allel-Version von PTH sein, die Eigenschaften aufweisen, die den vorstehenden ähnlich sind, d. h. Knochenbildung. Die Abbaustelle erlaubt, dass die Zuführungsgeschwindigkeit an unterschiedlichen Orten in der Matrix in Abhängigkeit von der zellulären Aktivität an dem Ort und/oder innerhalb der Matrix variiert wird. Zusätzliche Vorteile umfassen die niedrigere Gesamtarzneimitteldosis in dem Zuführungssystem und die räumliche Regulierung der Freisetzung, was erlaubt, dass ein größerer Prozentsatz des Arzneimittels zur Zeit der größten Zellenaktivität freigesetzt wird.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Fluoreszenznachweis-Chromatogramm von durch Plasmin abgebauten, Peptid enthaltenden Fibringelen und freiem Peptid. Größenausschluss-Chromatografie eines abgebauten Fibringels mit dem eingebauten α₂ PI_1-7-ATIII_121-134-Peptid (-), mit demselben Peptid, dem abgebauten Fibringel, das eingebautes Peptid enthielt, frei zugesetzt (∙∙∙), und von freiem Peptid alleine (--), sind gezeigt. Der N-terminale Leucinrest war dansyliert (abgekürzt dL). Das freie Peptid eluierte bei längeren Zeiten, einem geringeren Molekulargewicht entsprechend, als es das während der Koagulierung in das Fibringel eingebaute Peptid tat, was eine kovalente Anheftung an abgebautem Fibrin und daher einen kovalenten Einbau durch die Wirkung der Faktor XIIIa-Aktivität zeigt.
2 ist eine grafische Darstellung des Einbaus von dLNQEQVSPLRGD (SEQ ID NO: 1) in Fibringele mit hinzugefügtem exogenem Faktor XIII. Wenn ein 1 U/ml zugesetzt wurde, stieg das Ausmaß des Einbaus dergestalt, dass mehr als 25 Mol Peptid/Mol Fibrinogen erzielt werden konnten.
3 ist eine grafische Darstellung des Einbaus des Zweidomänenpeptids dLN-QEQVSPLRGD (SEQ ID NO: 1) in unverdünnten Fibrinkleber. Es wurden drei getrennte Kits getestet, und in jedem Fall konnte ein hohes Ausmaß an Einbau beobachtet werden, das 25 Mol Peptid/Mol Fibrinogen erreichte. Die für einen maximalen Einbau erforderliche Konzentration an exogenem Peptid war mindestens 5 mM, möglicherweise aufgrund von Diffusionseinschränkungen innerhalb der hochgradig dichten Fibrinmatrix, die erzeugt wird. Das Ausmaß des Einbaus war sehr gleichmäßig, wobei jedes Kit ein ähnliches Einbauprofil ergab.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Hierin werden Produkte und Verfahren zur Wiederherstellung, Neubildung oder Umbildung von hartem Gewebe, insbesondere zum Knochenwachstum, unter Verwendung natürlicher und synthetischer Matrices, in die PTH freisetzbar eingebaut ist, beschrieben. Die natürlichen Matrices sind biologisch verträglich und biologisch abbaubar und können in vitro oder in vivo, zur Zeit der Implantation, gebildet werden. PTH kann in die Matrices eingebaut werden und seine volle biologi sche Aktivität beibehalten. PTH kann freisetzbar eingebaut werden unter Verwendung von Techniken, die eine Kontrolle darüber, wie und wann und in welchem Ausmaß das PTH freigesetzt wird, ermöglichen, so dass die Matrix direkt oder indirekt zur Wiederherstellung von Gewebe verwendet werden kann, wobei die Matrix als ein Vehikulum zur kontrollierten Freisetzung verwendet wird.
Definitionen
„Biomaterial", wie allgemein hierin verwendet, betrifft ein Material, das dazu gedacht ist, eine Schnittstelle mit biologischen Systemen zu bilden, um irgendein Gewebe, Organ oder eine Funktion des Körpers in Abhängigkeit von dem Material entweder dauerhaft oder zeitlich begrenzt zu untersuchen, zu behandeln, zu verstärken oder zu ersetzen. Die Begriffe „Biomaterial" und „Matrix" werden hierin synonym verwendet und bedeuten ein vernetztes polymeres Netzwerk, das in Abhängigkeit von der Art der Matrix mit Wasser gequollen, aber nicht in Wasser gelöst werden kann, d. h. ein Hydrogel bilden kann, das für eine gewisse Zeitdauer im Körper verbleibt, wobei es gewisse Stützfunktionen für traumatisiertes odergeschädigtes hartes Gewebe erfüllt.
„PTH-Fusionspeptid", wie allgemein hierin verwendet, bezeichnet ein Peptid, das mindestens eine erste und eine zweite Domäne enthält. Eine Domäne enthält ein PTH (natürliche oder verkürzte Formen, insbesondere PTH 1-34), und die andere Domäne enthält eine Substratdomäne zur Vernetzung mit einer Matrix. Eine enzymatische oder hydrolytische Abbaustelle kann ebenfalls zwischen der ersten und der zweiten Domäne vorhanden sein.
„Starkes Nucleophil", wie allgemein hierin verwendet, bezeichnet ein Molekül, das in der Lage ist, in einer eine polare Bindung bildenden Reaktion ein Elektronenpaar an ein Elektrophil abzugeben. Bevorzugt ist das starke Nucleophil nucleophiler als Wasser bei physiologischem pH. Beispiele für starke Nucleophile sind Thiole und Amine.
„Konjugierte ungesättigte Bindung", wie allgemein hierin verwendet, bezeichnet das Alternieren von Kohlenstoff-Kohlenstoff-, Kohlenstoff-Heteroatom- oder Heteroatom-Heteroatom-Mehrfachbindungen mit Einfachbindungen oder die Bin dung einer funktionellen Gruppe an ein Makromolekül wie ein synthetisches Polymer oder ein Protein. Solche Bindungen können Additionsreaktionen eingehen.
„Konjugierte ungesättigte Gruppe", wie allgemein hierin verwendet, bezeichnet ein Molekül oder einen Bereich eines Moleküls, das (der) ein Alternieren von Kohlenstoff-Kohlenstoff-, Kohlenstoff-Heteroatom- oder Heteroatom-Heteroatom-Mehrfachbindungen mit Einfachbindungen enthält, das (der) eine Mehrfachbindung hat, die Additionsreaktionen eingehen kann. Beispiele für konjugierte ungesättigte Gruppen umfassen, aber ohne darauf beschränkt zu sein, Vinylsulfone, Acrylate, Acrylamide, Chinone und Vinylpyridinium-Verbindungen, beispielsweise 2- oder 4-Vinylpyridinium, und Itaconate.
„Synthetische Vorläufermoleküle", wie allgemein hierin verwendet, bezeichnet Moleküle, die in der Natur nicht vorkommen.
„Natürlich vorkommende Vorläufer-Komponenten oder -Polymere", wie allgemein hierin verwendet, bezeichnet Moleküle, die in der Natur zu finden sind.
„Funktionalisieren", wie allgemein hierin verwendet, bezeichnet das Modifizieren eines Moleküls in einer Weise, die zur Anheftung einer funktionellen Gruppe oder Baueinheit führt. Beispielsweise kann ein Molekül durch die Einführung eines Moleküls, das das Molekül zu einem starken Nucleophil oder einer konjugierten Ungesättigtheit macht, funktionalisiert werden. Bevorzugt wird ein Molekül, beispielsweise PEG, funktionalisiert, um zu einem Thiol, Amin, Acrylat oder Chinon zu werden. Insbesondere Proteine können auch wirkungsvoll durch teilweise oder vollständige Reduktion von Disulfidbindungen zur Erzeugung freier Thiole funktionalisiert werden.
„Funktionalität", wie allgemein hierin verwendet, bezeichnet die Anzahl reaktiver Stellen an einem Molekül.
„Funktionalität der Verzweigungspunkte", wie allgemein hierin verwendet, bezeichnet die Anzahl von Armen, die sich ausgehend von einem Punkt in dem Molekül erstrecken.
"Adhäsionsstelle oder Zellen-Anheftungsstelle", wie allgemein hierin verwendet, bezeichnet eine Peptidsequenz, an die ein Molekül, beispielsweise ein adhäsionsfördernder Rezeptor an der Oberfläche einer Zelle, bindet. Beispiele für Adhäsionsstellen umfassen, aber ohne darauf beschränkt zu sein, die RGD-Sequenz von Fibronectin und die YIGSR (SEQ ID NO: 2)-Sequenz von Laminin. Bevorzugt werden Adhäsionsstellen in das Biomaterial eingebaut bzw. inkorporiert, indem eine Substratdomäne, die mit einer Matrix vernetzbar ist, einbezogen wird.
„Biologische Aktivität", wie allgemein hierin verwendet, bezeichnet funktionelle Ereignisse, die von einem Protein von Interesse vermittelt werden. In einigen Ausführungsformen umfasst dies Ereignisse, die durch Messen der Wechselwirkungen eines Polypeptids mit einem anderen Polypeptid untersucht werden. Sie umfasst auch die Untersuchung der Wirkung, die das Protein von Interesse auf Zellen-Wachstum, Differenzierung, Tod, Wanderung, Adhäsion, Wechselwirkungen mit anderen Proteinen, enzymatische Aktivität, Protein-Phosphorylierung oder Dephosphorylierung, Transkription oder Translation hat.
„Empfindliches biologisches Molekül", wie allgemein hierin verwendet, bezeichnet ein Molekül, das in einer Zelle oder in einem Körper zu finden ist, oder das als ein therapeutisches Mittel für eine Zelle oder einen Körper verwendet werden kann, das mit anderen Molekülen in seiner Anwesenheit reagieren kann. Beispiele für empfindliche biologische Moleküle umfassen, aber ohne darauf beschränkt zu sein, Peptide, Proteine, Nucleinsäuren und Arzneimittel. Biomaterialien können in Anwesenheit empfindlicher biologischer Materialien hergestellt werden, ohne die empfindlichen biologischen Materialien ungünstig zu beeinflussen.
„Neubilden", wie allgemein hierin verwendet, bedeutet Rückwachstum von einem Teil oder Allem von etwas wie hartem Gewebe, insbesondere Knochen.
„Multifunktionell", wie allgemein hierin verwendet, bezeichnet mehr als eine elektrophile und/oder nucleophile funktionelle Gruppe pro Molekül (d. h. Monomer, Oligomer und Polymer).
„Eigenselektive Reaktion", wie allgemein hierin verwendet, bedeutet, dass die erste Vorläuferkomponente einer Zusammensetzung viel schneller mit der zweiten Vorläuferkomponente der Zusammensetzung reagiert und umgekehrt, als mit an deren in einem Gemisch oder an der Reaktionsstelle vorhandenen Verbindungen. Wie hierin verwendet, bindet das Nucleophil bevorzugt an ein Elektrophil, und ein Elektrophil bindet bevorzugt an ein starkes Nucleophil, statt an andere biologische Verbindungen.
„Vernetzen", wie allgemein hierin verwendet, bedeutet die Bildung kovalenter Bindungen. Es kann jedoch auch die Bildung nicht-kovalenter Bindungen, wie ionischer Bindungen, oder Kombinationen kovalenter und nicht-kovalenter Bindungen, bezeichnen.
„Polymeres Netzwerk", wie allgemein hierin verwendet, bedeutet das Produkt eines Prozesses, bei dem im Wesentlichen alle Monomere, Oligomere oder Polymere mittels ihrer verfügbaren funktionellen Gruppen durch intermolekulare kovalente Bindungen gebunden werden, um zu einem riesigen Molekül zu führen.
„Physiologisch", wie allgemein hierin verwendet, bedeutet Bedingungen, wie sie in lebenden Wirbeltieren zu finden sind. Insbesondere bezeichnen physiologische Bedingungen die Bedingungen im menschlichen Körper, wie Temperatur, pH, etc. Physiologische Temperaturen bedeuten insbesondere einen Temperaturbereich von zwischen 35°C und 42°C, bevorzugt um 37°C.
„Vernetzungsdichte", wie allgemein hierin verwendet, bezeichnet das mittlere Molekulargewicht zwischen zwei Vernetzungen (M_c) der jeweiligen Moleküle.
„Äquivalentgewicht", wie allgemein hierin verwendet, bezeichnet mMol der funktionellen Gruppe/g Substanz.
„Quellen", wie allgemein hierin verwendet, bezeichnet die Zunahme an Volumen und Masse durch die Aufnahme von Wasser durch das Biomaterial. Die Begriffe „Wasseraufnahme" und „Quellen" werden überall in dieser Anmeldung synonym verwendet.
„Gleichgewichtszustand", wie allgemein hierin verwendet, ist der Zustand, in dem ein Hydrogel keiner Massenzunahme oder Massenverlust unterliegt, wenn es unter konstanten Bedingungen in Wasser aufbewahrt wird.
I. Matrices und PTH
A. Matrixmaterialien
Die Matrix wird gebildet, indem Vorläufermoleküle ionisch, kovalent oder durch Kombinationen davon zu einem polymeren Netzwerk vernetzt werden, oder indem ein oder mehrere polymere Materialien, d. h. Matrices, gequollen werden, um ein polymeres Netzwerk zu bilden, das genügend Zwischenräume zwischen den Polymeren hat, um ein Einwachsen oder ein Wandern von Zellen in die Matrix zu erlauben.
Bei einer Ausführungsform wird die Matrix aus Proteinen gebildet, bevorzugt aus Proteinen, die in dem Patienten, in den die Matrix implantiert werden soll, natürlicherweise vorhanden sind. Ein besonders bevorzugtes Matrixprotein ist Fibrin, obwohl aus anderen Proteinen wie Collagen und Gelatine hergestellte Matrices ebenfalls verwendet werden können. Polysaccharide und Glykoproteine können ebenfalls zur Bildung der Matrix verwendet werden. Es ist auch möglich, synthetische Polymere, die durch ionische oder kovalente Bindung vernetzbar sind, zu verwenden.
Fibrinmatrices
Fibrin ist ein natürliches Material, das für mehrere biomedizinische Anwendungen angezeigt wurde. Fibrin wurde in dem US-Patent Nr. 6 331 422 von Hubbell, et al. als ein Material für Matrices zum Einwachsen von Zellen beschrieben. Fibringele wurden wegen ihrer Fähigkeit, an viele Gewebe zu binden, und wegen ihrer natürlichen Rolle bei der Wundheilung als Dichtmittel verwendet. Einige spezielle Anwendungen umfassen die Verwendung als ein Dichtmittel zur Gefäßtransplantat-Befestigung, Herzklappen-Befestigung, Knochenpositionierung in Brüchen und Sehnenwiederherstellung (Sierra, D. H., Journal of Biomaterials Applications, 7: 309–352 (1993)). Zusätzlich wurden diese Gele als Arzneimittel-Zuführvorrichtungen und zur Nervenregenerierung verwendet (Williams, et al., Journal of Comparative Neurobiology, 264: 284–290 (1987)). Obwohl Fibrin einen festen Träger zur Neubildung von Gewebe und zum Einwachsen von Zellen liefert, gibt es wenige aktive Sequenzen in dem Monomer, die diese Prozesse direkt fördern.
Der Prozess, durch den Fibrinogen zu Fibrin polymerisiert wird, wurde ebenfalls charakterisiert. Zu Beginn spaltet eine Protease das dimere Fibrinogenmolekül an den zwei symmetrischen Stellen. Es gibt mehrere mögliche Proteasen, die Fibrinogen spalten können, wozu Thrombin, Reptilase und Protease III gehören, und jede schneidet das Protein an einer unterschiedlichen Stelle (Francis, et al., Blood Cells, 19: 29–307, 1993). Wenn das Fibrinogen gespalten ist, läuft ein Autopolymerisationsschritt ab, in dem die Fibrinogenmonomere zusammenkommen und ein nicht-kovalent vernetztes Polymergel bilden (Sierra, 1993). Dieser Selbst-Zusammenbau geschieht, weil nach dem Auftreten der Protease-Spaltung die Bindungsstellen exponiert werden. Wenn diese Bindungsstellen exponiert sind, können diejenigen im Zentrum des Moleküls an andere Stellen auf den Fibrinogenketten, die an den Enden der Peptidketten vorliegen, binden (Stryer, L. In Biochemistry, W. H. Freeman & Company, NY, 1975). Auf diese Weise wird ein Polymernetzwerk gebildet. Faktor XIIIa, eine von Faktor XIII durch Thrombinproteolyse aktivierte Transglutaminase, kann dann das Polymernetzwerk kovalent vernetzen. Es gibt andere Transglutaminasen, und sie können ebenfalls bei der kovalenten Vernetzung und Pfropfung an das Fibrinnetzwerk beteiligt sein.
Sobald ein vernetztes Fibringel gebildet ist, wird der nachfolgende Abbau streng kontrolliert. Eines der Schlüsselmoleküle bei der Kontrolle des Abbaus von Fibrin ist der α₂-Plasmin-Inhibitor (Aoki, N., Progress in Cardiovascular Disease, 21: 267–286, 1979). Dieses Molekül wirkt durch Vernetzung mit einer α-Kette von Fibrin durch die Wirkung von Faktor XIIIa (Sakata, et al., Journal of Clinical Investigation, 65: 290–297, 1980). Dadurch, dass er sich selbst an das Gel anheftet, kann an dem Gel eine hohe Konzentration an Inhibitor lokalisiert werden. Der Inhibitor wirkt dann durch Verhindern der Bindung von Plasminogen an Fibrin (Aoki, et al., Thrombosis and Haemostasis, 39: 22–31, 1978) und durch Inaktivieren von Plasmin (Aoki, 1979). Der α₂-Plasmin-Inhibitor enthält ein Glutaminsubstrat. Die genaue Sequenz wurde als NQEQVSPL (SEQ ID NO: 12) identifiziert, wobei das erste Glutamin die zur Vernetzung aktive Aminosäure ist.
Es wurde gezeigt, dass Zweidomänenpeptide, die eine Faktor XIIIa-Substratsequenz und eine biologisch aktive Peptidsequenz enthalten, in Fibringele ver netzt werden können, und dass dieses biologisch aktive Peptid in vitro seine zelluläre Aktivität behält (Schense, J. C., et al. (1999) Bioconj. Chem. 10: 75–81).
Synthetische Matrices
Vernetzungsreaktionen zur Bildung synthetischer Matrices zur Anwendung im Körper umfassen (i) radikalische Polymerisation zwischen zwei oder mehr Vorläufern, die ungesättigte Doppelbindungen enthalten, wie beschrieben in Hern, et al., J. Biomed. Mater. Res. 39: 266–276 (1998), (ii) nucleophile Substitutionsreaktion wie z. B. zwischen einem Vorläufer, der eine Amingruppe enthält, und einem Vorläufer, der eine Succinimidyl-Gruppe enthält, wie offenbart in dem US-Patent Nr. 5 874 500 von Rhee, et al., (iii) Kondensations- und Additionsreaktionen und (iv) Additionsreaktion vom Michael-Typ zwischen einem starken Nucleophil und einer konjugierten ungesättigten Gruppe oder Bindung (als ein starkes Elektrophil). Besonders bevorzugt ist die Reaktion zwischen einem Vorläufermolekül mit einer Thiol- oder Amin-Gruppe als die nucleophile Gruppe und Vorläufermolekülen, die Acrylat- oder Vinylsulfon-Gruppen als elektrophile Gruppen enthalten. Als die nucleophile Gruppe am meisten bevorzugt ist die Thiol-Gruppe. Additionsreaktionen vom Michael-Typ sind in WO 00/44808 von Hubbell, et al. beschrieben. Additionsreaktionen vom Micheal-Typ erlauben eine in situ-Vernetzung mindestens einer ersten und einer zweiten Vorläuferkomponente unter physiologischen Bedingungen in einer selbst-selektiven Weise, selbst in Anwesenheit von empfindlichen biologischen Materialien. Wenn eine der Vorläuferkomponenten eine Funktionalität von mindestens 2 hat, und mindestens eine der anderen Vorläuferkomponenten eine größere Funktionalität als 2 hat, reagiert das System selbst-selektiv unter Bildung eines vernetzten dreidimensionalen Biomaterials.
Bevorzugt sind die konjugierten ungesättigten Gruppen oder die konjugierten ungesättigten Bindungen Acrylate, Vinylsulfone, Methacrylate, Acrylamide, Methacrylamide, Acrylnitrile, Vinylsulfone, 2- oder 4-Vinylpyridinium, Maleimide oder Chinone.
Die nucleophilen Gruppen sind bevorzugt Thiol-Gruppen, Amino-Gruppen oder Hydroxyl-Gruppen. Thiol-Gruppen sind wesentlich reaktiver als nicht-protonierte Amin-Gruppen. Wie vorher angegeben, ist der pH wichtig bei dieser Überlegung: Das deprotonierte Thiol ist wesentlich reaktiver als das protonierte Thiol. Daher werden die Additionsreaktionen, an denen eine konjugierte Ungesättigtheit, wie ein Acrylat oder ein Chinon, beteiligt ist, mit einem Thiol, um die zwei Vorläuferkomponenten in eine Matrix umzuwandeln, oft am besten am schnellsten und selbst-selektiv bei einem pH von näherungsweise 8 durchgeführt. Bei einem pH von näherungsweise 8 sind die meisten der Thiole von Interesse deprotoniert (und daher reaktiver), und die meisten der Amine von Interesse sind noch protoniert (und daher weniger reaktiv). Wenn ein Thiol als das erste Vorläufermolekül verwendet wird, ist eine konjugierte Struktur, die in ihrer Reaktivität selektiv für das Thiol im Verhältnis zu Aminen ist, hochgradig wünschenswert.
Geeignete erste und zweite Vorläufermoleküle umfassen Proteine, Peptide, Poly-oxyalkylene, Poly(vinylalkohol), Poly(ethylen-co-vinylalkohol), Poly(acrylsäure), Polyethylen-co-acrylsäure), Poly(ethyloxazolin), Poly(vinylpyrrolidon), Poly(ethylen-co-vinylpyrrolidon), Poly(maleinsäure), Polyethylen-co-maleinsäure), Poly(acrylamid) und Poly(ethylenoxid)-co-poly(propylenoxid)-Blockcopolymere. Ein besonders bevorzugtes Vorläufermolekül ist Polyethylenglykol.
Polyethylenglykol (PEG) stellt einen gut geeigneten Aufbau-Baustein bereit. Man kann leicht lineare (was bedeutet: mit zwei Enden) oder verzweigte (was bedeutet: mehr als zwei Enden) PEGs käuflich erwerben oder synthetisieren und dann die PEG-Endgruppen funktionalisieren, um entweder ein starkes Nucleophil, wie ein Thiol, oder eine konjugierte Struktur, wie ein Acrylat oder ein Vinylsulfon, einzuführen. Wenn diese Komponenten in einer leicht basischen Umgebung entweder miteinander oder mit einer entsprechenden Komponente gemischt werden, wird durch Reaktion zwischen der ersten und der zweiten Vorläuferkomponente eine Matrix gebildet. Eine PEG-Komponente kann mit einer nicht-PEG-Komponente zur Reaktion gebracht werden, und das Molekulargewicht oder die Hydrophilie beider Komponenten kann kontrolliert werden, um die mechanischen Eigenschaften, die Permeabilität und den Wassergehalt des sich ergebenden Biomaterials zu manipulieren.
Diese Materialien sind allgemein brauchbar in medizinischen Implantaten, wie unten detaillierter beschrieben wird. Bei der Bildung von Matrices, insbesondere Matrices, die sich in vivo abbauen sollen, stellen Peptide einen sehr gut geeigneten Aufbau-Baustein dar. Es ist unkompliziert, Peptide zu synthetisieren, die zwei oder mehr Cystein-Reste enthalten, und diese Komponente kann dann leicht als die erste Vorläuferkomponente mit nucleophilen Gruppen dienen. Beispielsweise bildet ein Peptid mit zwei freien Cystein-Resten leicht eine Matrix, wenn es bei physiologischem oder leicht höherem pH (z. B. 8 bis 9) mit einem PEG-tri-vinylsulfon (einem PEG mit 3 Armen mit Vinylsulfonen an jedem seiner Arme) gemischt wird. Das Gelieren kann auch bei sogar höherem pH gut vorangehen, aber möglicherweise auf Kosten der Selbst-Selektivität. Wenn die zwei flüssigen Vorläuferkomponenten miteinander vermischt werden, reagieren sie über eine Dauer von einigen wenigen Minuten, um ein elastisches Gel zu bilden, das aus einem Netzwerk von PEG-Ketten, die die Knoten des Netzwerks ausmachen, mit den Peptiden als Verbindungsgliedern besteht. Die Peptide können als Proteasesubstrate gewählt werden, um das Netzwerk zu befähigen, von Zellen infiltriert und abgebaut zu werden, wie es in einem Netzwerk auf Proteinbasis, wie in einer Fibrinmatrix, geschieht. Bevorzugt sind die Sequenzen in den Domänen Substrate für Enzyme, die an der Zellwanderung beteiligt sind (z. B. wie Substrate für Enzyme wie Collagenase, Plasmin, Metalloproteinase (MMP) oder Elastase), obwohl geeignete Domänen nicht auf diese Sequenzen beschränkt sind. Eine besonders brauchbare Sequenz ist ein Substrat für das Enzym Plasmin (siehe Beispiele). Die Abbaueigenschaften der Gele können durch Verändern der Einzelheiten des Peptids, das als vernetzende Knoten dient, manipuliert werden. Man kann ein Gel herstellen, das durch Collagenase, aber nicht durch Plasmin, oder durch Plasmin, aber nicht durch Collagenase abbaubar ist. Außerdem ist es möglich, das Gel als Reaktion auf ein solches Enzym schneller oder langsamer abbauen zu lassen, einfach durch Verändern der Aminosäuresequenz, um die K_m oder k_cat, oder beide, der enzymatischen Reaktion zu verändern. Man kann auf diese Weise ein Biomaterial herstellen, das insofern biomimetisch ist, als es in der Lage ist, durch die normalen Umbildungseigenschaften von Zellen umgebildet zu werden. Beispielsweise zeigt eine derartige Studie Substratstellen für die wichtige Protease Plasmin. Das Gelieren bzw. Festwerden des PEG mit dem Peptid ist selbst-selektiv.
Optional können biofunktionale Mittel in die Matrix inkorporiert bzw. eingebaut werden, um für eine chemische Bindung an andere Spezies (z. B. eine Gewebeoberfläche) zu sorgen. Proteasesubstrate in die Matrix inkorporiert zu haben, ist wichtig, wenn die Matrix aus PEG-vinylsulfon gebildet wird. Anders als Matrices, die durch die Reaktion von PEG-acrylaten und PEG-thiolen gebildet werden, enthalten Matrices, die aus PEG-vinylsulfonen und PEG-thiolen gebildet werden, kei ne hydrolytisch abbaubaren Bindungen. Daher erlaubt es das Inkorporieren von Proteasesubstraten, dass sich die Matrix im Körper abbaut.
Die synthetischen Matrices sind vorgehensmäßig einfach zu bilden. Es werden zwei flüssige Vorläufer gemischt; ein Vorläufer enthält ein Vorläufermolekül mit nucleophilen Gruppen, und das andere Vorläufermolekül enthält die elektrophilen Gruppen. Physiologische Kochsalzlösung kann als Lösungsmittel dienen. Durch die Reaktion wird minimale Wärme erzeugt. Daher kann das Gelieren in vivo oder in vitro, in direktem Kontakt mit Gewebe, ohne ungünstige Toxizität durchgeführt werden. Daher können andere Polymere als PEG, entweder telechel modifiziert oder an ihren Seitengruppen modifiziert, verwendet werden.
Für die meisten Heilungsindikationen ist die Geschwindigkeit des Einwachsens von Zellen oder der Wanderung von Zellen in die Matrix in Kombination mit einer angepassten Abbaugeschwindigkeit der Matrix kritisch für die Heilungsreaktion insgesamt. Das Potential von hydrolytisch nicht abbaubaren Matrices, von Zellen infiltriert zu werden, ist in erster Linie eine Funktion der Netzwerkdichte. Wenn der vorhandene Raum zwischen Verzweigungspunkten oder Knoten in Beziehung zur Größe der Zellen zu klein ist, oder wenn die Abbaugeschwindigkeit der Matrix, was zur Schaffung von mehr Raum in der Matrix führt, zu langsam ist, beobachtet man eine sehr begrenzte Heilungsreaktion. In der Natur zu findende Heilungsmatrices, wie z. B. Fibrinmatrices, die als eine Reaktion auf eine Verletzung im Körper gebildet werden, sind dafür bekannt, dass sie aus einem sehr lockeren Netzwerk bestehen, das sehr einfach von Zellen infiltriert werden kann. Die Infiltration wird durch Liganden zur Zellanhaftung, die ein integrierter Teil des Fibrin-Netzwerks sind, gefördert.
Aus synthetischen, hydrophilen Vorläufermolekülen, wie Polyethylenglykol, hergestellte Matrices quellen in wässriger Umgebung nach Bildung des polymeren Netzwerks. Um eine ausreichend kurze Gelierzeit (zwischen 3 bis 10 min bei einem pH von zwischen 7 und 8 und bei einer Temperatur in einem Bereich von 36 bis 38°C) und eine quantitative Reaktion während einer in situ-Bildung der Matrix im Körper zu erzielen, muss die Ausgangskonzentration der Vorläufermoleküle genügend hoch sein. Unter solchen Bedingungen würde nach der Netzwerkbildung kein Quellen stattfinden, und die erforderlichen Ausgangskonzentrationen würden zu Matrices führen, die für eine Zell-Infiltration zu dicht sind, wenn die Ma trix in wässriger Umgebung nicht abbaubar ist. So ist ein Quellen des polymeren Netzwerks wichtig, um den Raum zwischen den Verzweigungspunkten zu vergrößern und auszuweiten.
Unabhängig von der Ausgangskonzentration der Vorläufermoleküle quellen Hydrogele, die aus denselben synthetischen Vorläufermolekülen hergestellt sind, wie ein vierarmiges PEG-vinylsulfon und ein Peptid mit SH-Gruppen, im Gleichgewichtszustand zum selben Wassergehalt. Dies bedeutet, dass das Endvolumen des Hydrogels, wenn es seinen Gleichgewichtszustand erreicht, um so höher ist, je höher die Ausgangskonzentration der Vorläufermoleküle ist. Wenn der im Körper verfügbare Raum zu klein ist, um eine ausreichende Quellung zuzulassen, und insbesondere wenn die aus den Vorläuferkomponenten gebildeten Verknüpfungen nicht hydrolytisch abbaubar sind, verringert sich die Geschwindigkeit der Zell-Infiltration und die Heilungsreaktion. Folglich muss das Optimum zwischen zwei widersprüchlichen Erfordernissen für die Anwendung im Körper gefunden werden. Eine gute Zell-Infiltration und nachfolgende Heilungsreaktionen wurden mit einem dreidimensionalen polymeren Netzwerk beobachtet, das durch die Reaktion eines trifunktionellen verzweigten Polymers mit mindestens drei Armen, die hinsichtlich Molekulargewicht im Wesentlichen gleich waren, und eines zweiten Vorläufermoleküls, das mindestens ein difunktionelles Molekül war, gebildet wurde. Das Verhältnis des Äquivalentgewichts der funktionellen Gruppen des ersten und des zweiten Vorläufermoleküls ist zwischen 0,9 und 1,1. Das Molekulargewicht der Arme des ersten Vorläufermoleküls, das Molekulargewicht des zweiten Vorläufermoleküls und die Funktionalität der Verzweigungspunkte werden so gewählt, dass der Wassergehalt des sich ergebenden polymeren Netzwerks zwischen dem Gleichgewichts-Prozentsatz und 92 Gew.-% des Gesamtgewichts des polymeren Netzwerks nach Beendigung der Wasseraufnahme ist. Bevorzugt ist der Wassergehalt zwischen 93 und 95 Gew.-% des Gesamtgewichts des polymeren Netzwerks und des Wassers nach Beendigung der Wasseraufnahme. Die Beendigung der Wasseraufnahme kann entweder erreicht werden, wenn die Gleichgewichtskonzentration erreicht ist oder wenn der in dem Biomaterial verfügbare Raum keine weitere Volumenerhöhung zulässt. Es ist daher bevorzugt, die Ausgangskonzentrationen der Vorläuferkomponenten so zu wählen, dass sie so niedrig wie möglich sind. Dies trifft für alle quellbaren Matrices zu, aber insbesondere für jene Matrices, die einem zell-vermittelten Abbau unterliegen und keine hydro lytisch abbaubaren Verknüpfungen bzw. Bindungen in dem polymeren Netzwerk enthalten.
Die Ausgewogenheit zwischen Gelierzeit und niedriger Ausgangskonzentration insbesondere für hydrolytisch nicht abbaubare Gele sollte auf der Basis der Struktur der Vorläufermoleküle optimiert werden. Insbesondere das Molekulargewicht der Arme des ersten Vorläufermoleküls, das Molekulargewicht des zweiten Vorläufermoleküls und der Grad der Verzweigung, d. h. die Funktionalität der Verzweigungspunkte, müssen entsprechend eingestellt werden. Der tatsächliche Reaktionsmechanismus hat einen geringeren Einfluss auf dieses Zusammenspiel.
Ist das erste Vorläufermolekül ein dreiarmiges oder vierarmiges Polymer mit einer funktionellen Gruppe am Ende jedes Arms, und ist das zweite Vorläufermolekül ein lineares bifunktionelles Molekül, bevorzugt ein Peptid, das mindestens zwei Cystein-Gruppen enthält, dann werden das Molekulargewicht der Arme des ersten Vorläufermoleküls und das Molekulargewicht des zweiten Vorläufermoleküls bevorzugt so gewählt, dass die Verbindungen zwischen den Verzweigungspunkten nach der Bildung des Netzwerks ein Molekulargewicht in dem Bereich von zwischen 10 und 13 kD (unter der Bedingung, dass die Verbindungen linear, nicht verzweigt, sind), bevorzugt zwischen 11 und 12 kD, haben. Dies lässt eine Ausgangskonzentration der Summe des ersten und des zweiten Vorläufermoleküls in einem Bereich von zwischen 8 und 12 Gew.-%, bevorzugt zwischen 9 und 10 Gew.-%, des Gesamtgewichts des ersten und des zweiten Vorläufermoleküls in Lösung (vor der Netzwerkbildung) zu. In dem Fall, wenn der Verzweigungsgrad der ersten Vorläuferkomponente auf 8 erhöht wird und das zweite Vorläufermolekül noch ein lineares bifunktionelles Molekül ist, wird das Molekulargewicht der Verbindungen zwischen den Verzweigungspunkten bevorzugt auf ein Molekulargewicht von zwischen 18 und 24 kDa erhöht. In dem Fall, wenn der Verzweigungsgrad des zweiten Vorläufermoleküls von linear zu einer dreiarmigen oder vierarmigen Vorlauferkomponente erhöht wird, erhöht sich das Molekulargewicht, d. h. die Länge der Verbindungen, entsprechend. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Zusammensetzung gewählt, die als das erste Vorläufermolekül ein trifunktionelles dreiarmiges 15 kD-Polymer, d. h. jeder Arm hat ein Molekulargewicht von 5 kD, und als das zweite Vorläufermolekül ein bifunktionelles lineares Molekül eines Molekulargewichts in dem Bereich von zwischen 0,5 und 1,5 kD, noch bevorzugter um 1 kD, enthält. Bevorzugt ist die erste und die zweite Vorläuferkomponente ein Polyethylenglykol.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die erste Vorläuferkomponente als funktionelle Gruppen konjugierte ungesättigte Gruppen oder Bindungen, am meisten bevorzugt ein Acrylat oder ein Vinylsulfon, und die funktionellen Gruppen des zweiten Vorläufermoleküls umfassen eine nucleophile Gruppe, bevorzugt eine Thiol-Gruppe oder eine Amino-Gruppe. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das erste Vorläufermolekül ein vierarmiges Polymer von 20 kD (jeder Arm ein Molekulargewicht von 5 kDa) mit funktionellen Gruppen am Ende jedes Arms, und das zweite Vorläufermolekül ist ein bifunktionelles lineares Molekül eines Molekulargewichts in dem Bereich von zwischen 1 bis 3 kD, bevorzugt zwischen 1,5 und 2 kD. Bevorzugt ist das erste Vorläufermolekül ein Polyethylenglykol mit Vinylsulfon-Gruppen, und das zweite Vorläufermolekül ist ein Peptid mit Cystein-Gruppen. In beiden bevorzugten Ausführungsformen liegt die Ausgangskonzentration der Summe des ersten und des zweiten Vorläufermoleküls in dem Bereich von 8 bis 11 Gew.-%, bevorzugt zwischen 9 und 10 Gew.-%, des Gesamtgewichts des ersten und des zweiten Vorläufermoleküls und Wasser (vor Bildung des polymeren Netzwerks), bevorzugt zwischen 5 und 8 Gew.-%, um eine Gelierzeit von unter 10 min zu erzielen. Diese Zusammensetzungen haben eine Gelierzeit bei pH 8,0 und 37°C von etwa 3 bis 10 min nach dem Vermischen.
Wenn die Matrix hydrolytisch abbaubare Verknüpfungen enthält, die z. B. durch die bevorzugte Reaktion zwischen Acrylaten und Thiolen gebildet wurden, ist die Netzwerkdichte hinsichtlich Zelleninfiltration besonders wichtig zu Beginn, aber in wässriger Umgebung werden die Verknüpfungen hydrolysiert und das Netzwerk gelockert, um eine Zelleninfiltration zuzulassen. Mit einer Erhöhung des Gesamtverzweigungsgrads des polymeren Netzwerks muss das Molekulargewicht der Zwischenverbindungen, d. h. die Länge der Verbindungen, steigen.
B. Zellen-Anheftungsstellen
Zellen Wechselwirken mit ihrer Umgebung durch Protein-Protein-, Protein-Oligosaccharid- und Protein-Polysaccharid-Wechselwirkungen an der Zellenoberfläche.
Extrazelluläre Matrixproteine versorgen die Zelle mit einer Unmenge bioaktiver Signale. Dieses dichte Netzwerk ist zur Unterstützung der Zellen erforderlich, und von vielen Proteinen in der Matrix wurde gezeigt, dass sie die Adhäsion, Verteilung, Wanderung und Differenzierung von Zellen kontrollieren (Carey, Annual Review of Physiology, 53: 161–177, 1991). Zu einigen der spezifischen Proteine, von denen gezeigt wurde, dass sie besonders aktiv sind, gehören Laminin, Vitronectin, Fibronectin, Fibrin, Fibrinogen und Collagen (Lander, Journal of Trends in Neurological Science, 12: 189–195, 1989). Es wurden viele Studien zu Laminin durchgeführt, und es wurde gezeigt, dass Laminin eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung und Neubildung von Nerven in vivo und Nervenzellen in vitro (Williams, Neurochemical Research, 12: 851–869, 1987), sowie bei der Angiogenese spielt.
Einige der spezifischen Sequenzen, die direkt mit zellulären Rezeptoren Wechselwirken und entweder Adhäsion, Ausbreitung oder Signalübermittlung veranlassen, wurden identifiziert.
Von Laminin, einem großen Mehrdomänenprotein (Martin, Annual Review of Cellular Biology, 3: 57–85, 1987), wurde gezeigt, dass es aus drei Ketten mit mehreren Rezeptor-Bindungsdomänen besteht. Diese Rezeptor-Bindungsdomänen enthalten die YIGSR (SEQ ID NO: 2)-Sequenz der Laminin B1-Kette (Graf, et al., Cell, 48: 989–996, 1987; Kleinman, et al., Archives of Biochemistry and Biophysics, 272: 39–45, 1989; und Massia, et al., J. of Biol. Chem., 268: 8053–8059, 1993), LRGDN (SEQ ID NO: 3) der Laminin A-Kette (Ignatius, et al., J. of Cell Biology, 111: 709–720, 1990) und PDGSR (SEQ ID NO: 4) der Laminin B1-Kette (Kleinman, et al., 1989). Mehrere andere Erkennungssequenzen für Zellen wurden ebenfalls identifiziert. Dazu gehören IKVAV (SEQ ID NO: 5) der Laminin A-Kette (Tashiro, et al., J. of Biol. Chem., 264: 16174–16182, 1989) und die Sequenz RNIAEIIKDI (SEQ ID NO: 6) der Laminin B2-Kette (Liesi, et al., FEBS Letters, 244: 141–148, 1989). Die Rezeptoren, die an diese spezifischen Sequenzen binden, wurden ebenfalls oft identifiziert. Ein Unterset zellulärer Rezeptoren, von denen gezeigt wurde, dass sie für Vieles bei der Bindung verantwortlich sind, ist die Integrin-Superfamilie (Rouslahti, E., J. of Clin. Investigation, 87: 1–5, 1991). Integrine sind Protein-Heterodimere, die aus α- und β-Untereinheiten bestehen. Frühere Arbeit hat gezeigt, dass das Tripeptid RGD an mehrere β1- und β3-Integrine bindet (Hynes, R. O., Cell, 69: 1–25, 1992; Yamada, K. M., J. of Biol. Chem., 266: 12809–12812, 1991), dass IKVAV (SEQ ID NO: 5) an einen Rezeptor von 110 kDa bindet (Tashiro, et al., J. of Biol. Chem., 264: 16174–16182, 1989); Luckebill-Edds, et al., Cell Tissue Research, 279: 371–377, 1995), dass YIGSR (SEQ ID NO: 2) an einen Rezeptor von 67 kDa bindet (Graf, et al., 1987) und dass DGEA (SEQ ID NO: 7), eine Collagensequenz, an das α₂,β₁-Integrin bindet (Zutter & Santaro, Amer. J. of Pathology, 137: 113–120, 1990). Über den Rezeptor für die RNIAEIIKDI (SEQ ID NO: 6)-Sequenz wurde nicht berichtet.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden Peptidstellen zur Zellenadhäsion in die Matrix inkorporiert, nämlich Peptide, die an adhäsionsfördernde Rezeptoren an den Oberflächen von Zellen binden, in die Biomaterialien der vorliegenden Erfindung. Derartige adhäsionsfördernde Peptide können aus der oben beschriebenen Gruppe ausgewählt werden. Besonders bevorzugt sind die RGD-Sequenz von Fibronectin, die YIGSR (SEQ ID NO: 2)-Sequenz von Laminin. Das Inkorporieren von Zellen-Anheftungsstellen ist eine besonders bevorzugte Ausführungsform bei synthetischen Matrices, kann aber auch bei manchen der natürlichen Matrices beinhaltet sein. Das Inkorporieren kann, beispielsweise, einfach durch Mischen eines Cystein enthaltenden Zellen-Anheftungspeptids mit einem Vorläufermolekül, das die konjugierte ungesättigte Gruppe enthält, wie PEG-acrylat, PEG-acrylamid oder PEG-vinylsulfon, einige wenige Minuten vor dem Mischen mit dem Rest der Vorläuferkomponente, die die nucleophile Gruppe enthält, wie einer Thiol enthaltenden Vorläuferkomponente, durchgeführt werden. Wenn die Zellen-Anheftungsstelle kein Cystein enthält, kann sie chemisch so synthetisiert werden, dass sie eines enthält. Während dieses ersten Schritts wird das adhäsionsfördernde Peptid in ein Ende des Vorläufers, der mehrfach mit einer konjugierten Ungesättigtheit funktionalisiert ist, eingebaut; wenn das verbleibende Multithiol zu dem System zugegeben wird, bildet sich ein vernetztes Netzwerk. Eine andere wichtige Ausführung des Wegs, auf dem Netzwerke hier hergestellt werden, ist die Wirksamkeit des Inkorporierens von anhängenden bioaktiven Liganden wie Adhäsionssignalen. Dieser Schritt muss quantitativ sein, da beispielsweise ungebundene Liganden (z. B. Adhäsionsstellen) die Wechselwirkung von Zellen mit der Matrix hemmen könnten. Wie später beschrieben wird, wird die Derivatisierung des Vorläufers mit solchen Oligopeptid-Anhängen in einem ersten Schritt in großem stöchiometrischem Überschuss (Minimum: 40-fach) von mehrarmigen elektrophilen Vorläufern gegenüber Thiolen durchgeführt und ist daher definitiv quantitativ. Neben dem Verhindern einer unerwünschten Hemmung ist diese Ausführung biologisch sogar noch signifikanter: Das Zellenverhalten ist äußerst empfindlich gegenüber kleinen Veränderungen der Ligandendichten, und ein genaues Wissen über inkorporierte Liganden hilft, Zell-Matrix-Wechselwirkungen zu konstruieren und zu verstehen. Zusammengefasst, die Konzentration an Adhäsionsstellen, die kovalent in die Matrix gebunden sind, beeinflusst signifikant die Geschwindigkeit der Zelleninfiltration. Beispielsweise kann für ein gegebenes Hydrogel ein RGD-Konzentrationsbereich in die Matrix inkorporiert werden, der das Einwachsen von Zellen und die Zellenwanderung in einer optimalen Weise unterstützt. Der optimale Konzentrationsbereich von Adhäsionsstellen wie RGD liegt zwischen 0,04 und 0,05 mM, und noch bevorzugter 0,05 mM, insbesondere für eine Matrix mit einem Wassergehalt zwischen der Gleichgewichtskonzentration und 92 Gew.-% nach Beendigung der Wasseraufnahme.
Hervorragende Knochenheilungsergebnisse können erzielt werden, indem man die Geschwindigkeit der Zellenwanderung und die Geschwindigkeit des Matrix-Abbaus schnell hält. Was die Konstruktion der Matrix (insbesondere kovalent gebundenes PTH 1-34) betrifft, ergibt ein vierarmiges Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht von etwa 20.000 Da, vernetzt mit einer Protease-Abbaustelle GCRPQGIWGQDRC (SEQ ID NO: 8) und 0,050 mM GRGDSP (SEQ ID NO: 9) besonders gute Zellen-Einwachsergebnisse und eine besonders gute Heilung von Knochenschäden. Die Ausgangskonzentration von PEG und Peptid unter 10 Gew.-% des Gesamtgewichts der Moleküle und Wasser (vor dem Quellen). Diese Gele haben eine brauchbare Konsistenz und erlauben es den Osteoblasten und Vorläuferzellen, die Matrix leicht zu infiltrieren.
Das Matrixmaterial ist bevorzugt durch natürlich vorliegende Enzyme biologisch abbaubar. Die Abbaugeschwindigkeit kann durch den Grad der Vernetzung und durch die Einschließung von Protease-Inhibitoren in die Matrix manipuliert werden.
C. Vernetzbare Substratdomänen
Das PTH-Fusionspeptid kann durch die vernetzbare Substratdomäne des PTH-Fusionspeptids mit den Matrices vernetzt und kovalent an sie gebunden werden. Die Art der Substratdomäne hängt von der Natur der Matrix ab. Für das Inkorpo rieren bzw. den Einbau in Fibrinmatrices sind Transglutaminase-Substratdomänen besonders bevorzugt. Die Transglutaminase-Substratdomäne kann eine Faktor XIIIa-Substratdomäne sein. Diese Faktor XIIIa-Substratdomäne kann GAKDV (SEQ ID NO: 10), KKKK (SEQ ID NO: 11) oder NQEQVSPL (SEQ ID NO: 12) enthalten. Die Kopplung zwischen dem PTH und der Transglutaminase-Substratdomäne kann durch chemische Synthese durchgeführt werden.

Die Transglutaminase-Substratdomäne kann ein Substrat für eine andere Transglutaminase als Faktor XIIIa sein. Die am meisten bevorzugte Faktor XIIIa-Substratdomäne hat eine Aminosäuresequenz NQEQVSPL (SEQ ID NO: 12)(hierin als „TG" bezeichnet). Andere Proteine, die Transglutaminase erkennt, wie Fibronectin, könnten an das Transglutaminase-Substratpeptid gekoppelt werden. Tabelle 1: Transglutaminase-Substratdomänen

SEQ ID NO: 13	YRGDTIGEGQQHHLGG (SEQ ID NO: 13) Ein Peptid mit Glutamin an der Transglutaminase-Kopplungsstelle in der Kette von Fibrinogenketten
SEQ ID NO: 14	GAKDV (SEQ ID NO: 14) Ein Peptid, das die Lysin-Kopplungsstelle in der Kette von Fibrinogen nachahmt
SEQ ID NO: 11	KKKK (SEQ ID NO: 11) Ein Peptid mit einem Polylysin an einer beliebigen Kopplungsstelle
SEQ ID NO: 12	NQEQVSPL (SEQ ID NO: 12) ein Peptid, das die Vernetzungsstelle im α2-Plasmininhibitor (abgekürzt TG) nachahmt

Für das Inkorporieren von PTH in eine aus synthetischen Vorläuferkomponenten gebildete Matrix muss das PTH-Fusionspeptid oder irgendein anderes zu inkorporierendes Peptid mit mindestens einer zusätzlichen Cystein-Gruppe(-SH), bevorzugt am N-Ende von PTH, als die vernetzbare Substratdomäne synthetisiert werden. Das Cystein kann entweder direkt oder durch eine Linkersequenz bzw. Verbindungssequenz an das PTH gebunden werden. Die Linkersequenz kann zusätzlich eine enzymatisch abbaubare Aminosäuresequenz enthalten, so dass das PTH durch Enzyme in im Wesentlichen der natürlichen Form von der Matrix abgespalten werden kann. Die freie Cystein-Gruppe reagiert mit der konjugierten ungesättigten Gruppe der Vorläuferkomponente in einer Additionsreaktion vom Michael-Typ. In dem Fall von PTH 1-34 wird die Bindung an eine synthetische Matrix für PTH 1-34 möglich gemacht durch Anheften einer zusätzlichen Aminosäuresequenz, die mindestens ein Cystein enthält, an das N-Ende von PTH 1-34. Die Thiol-Gruppe des Cysteins kann mit einer konjugierten ungesättigten Bindung an dem synthetischen Polymer reagieren, um eine kovalente Bindung zu bilden. In Möglichkeit (a) wird nur ein Cystein an das Peptid angeheftet, in Möglichkeit (b) wird eine enzymatisch abbaubare, insbesondere eine von Plasmin abbaubare, Sequenz als ein Linker zwischen dem Cystein und dem Peptid angebracht. Die Sequenz GYKNR (SEQ ID NO: 15) zwischen der ersten Domäne und der zweiten Domäne, dem Cystein, macht die Bindung durch Plasmin abbaubar.
So können die PTH-Fusionspeptide weiter modifiziert werden, dass sie eine abbaubare Stelle zwischen der Anheftungsstelle, d. h. der zweiten Domäne (d. h. der Faktor XIIIa-Substratdomäne oder dem Cystein) und dem PTH, d. h. der ersten Domäne, enthalten. Diese Stellen können entweder durch unspezifische Hydrolyse abbaubar sein (d. h. eine Esterbindung), oder sie können Substrate für einen spezifischen enzymatischen (entweder proteolytischen oder Polysaccharid abbauenden) Abbau sein. Diese abbaubaren Stellen erlauben das Konstruieren einer spezifischeren Freisetzung von PTH aus Matrices wie Fibringelen. Beispielsweise erlaubt der Abbau auf der Basis von enzymatischer Aktivität, dass die Freisetzung von PTH durch einen zellulären Prozess anstatt durch Diffusion des Faktors durch das Gel kontrolliert wird. Die abbaubare Stelle oder Bindung wird durch Enzyme gespalten, die aus Zellen, die in die Matrix eingedrungen sind, freigesetzt werden.
Die Abbaustellen erlauben, dass das PTH mit wenig oder ohne Modifizierung der primären Peptidsequenz freigesetzt wird, was zu einer höheren Aktivität des Faktors führen kann. Außerdem erlauben sie, dass die Freisetzung des Faktors durch zellenspezifische Prozesse, wie lokalisierte Proteolyse, statt durch Diffusion aus irgendwelchen porösen Materialien kontrolliert wird. Dies erlaubt, dass Faktoren in demselben Material in Abhängigkeit von der örtlichen Anordnung der Zellen in dem Material mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten freigesetzt werden. Dies verringert auch die Menge an insgesamt erforderlichem PTH, da seine Freisetzung durch zelluläre Prozesse kontrolliert wird. Die Erhaltung von PTH und seine biologische Verfügbarkeit sind charakteristische Vorteile der Ausnutzung der zellenspezifischen proteolytischen Aktivität gegenüber der Verwendung von diffusionskontrollierten Freisetzungsvorrichtungen. Bei einer möglichen Erklärung für die starke Heilung eines Knochenschadens mit PTH, das kovalent an eine Matrix gebunden ist, wird es als wichtig betrachtet, dass das PTH über einen längeren Zeitraum (d. h. nicht nur eine einzige gepulste Dosis), aber nicht in kontinuierlicher Weise, örtlich verabreicht wird. Dies wird durch einen langsamen Abbau durch entweder enzymatische Spaltung oder hydrolytische Spaltung der Matrix erreicht. Auf diese Weise wird das Molekül dann durch einen scheinbar gepulsten Effekt, der über einen Dauerzeitraum auftritt, zugeführt. Wenn eine Vorläuferzelle die Matrix infiltriert, trifft sie auf ein PTH-Molekül und kann in einen Präosteoblasten differenzieren. Wenn jedoch die bestimmte Zelle nicht fortfährt, gebundenes PTH aus der Matrix zu befreien, wird sie sich effektiv in einen Osteoblasten umwandeln und mit der Produktion von Knochenmatrix beginnen. Schließlich sind die therapeutischen Wirkungen des Peptids örtlich auf den Schadensbereich begrenzt und werden danach vergrößert.

Die Enzyme, die für einen proteolytischen Abbau verwendet werden könnten, sind zahlreich. Proteolytisch abbaubare Stellen könnten Substrate für Collagenase, Plasmin, Elastase, Stromelysin oder Plasminogen-Aktivatoren umfassen. Beispielhafte Substrate sind unten aufgelistet. P1–P5 bezeichnen Aminosäuren 1 bis 5 Positionen in Richtung auf das Amino-Ende des Proteins von der Stelle, wo die Proteolyse auftritt. P1' bis P4' bezeichnen Aminosäuren 1 bis 4 Positionen in Richtung auf das Carboxy-Ende des Proteins von der Stelle, wo die Proteolyse auftritt. Tabelle 2: Proben-Substratsequenzen für Protease

Protease	P	P4	P3	P2	P1	P1'	P2'	P3'	P4'	Literatur
Plasmin			L	I	K	M	K	P		Takagi and Doolittle, (1975) Bloc hem. 14: 5149–5156
Plasmin			N	F	K	S	Q	L		Takagi and Doolittle, 1975
Stromelysin	Ac	G	P	L	A	L	T	A	L	Smith et al., (1995). J. Biol. Chen. 270: 6440–6449
Stromelysin		Ac	P	F	E	L	R	A	NH₂	Smith et al., 1995
Elastase			Z-	A	A	F	A	NH₂		Besson et (6) al., 199 Analvtical Biochemis try 237: 216–223.
Collagenase		G	P	L	G	I	A	G	P	Netzel-Amett et al., (1991) J. Biol. Chem. 266: 6747–6755
t-PA	P	H	Y	G	R	S	G	G		Coombs et al., 1998 J. Biol. Chem. 273: 4323–4328
u-PA	P	G	S	G	R	S	A	S	G	Coombs et al., 1998

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform könnte eine Oligoesterdomäne zwischen die erste und die zweite Domäne eingefügt werden. Dies könnte unter Verwendung eines Oligoesters wie Oligomeren von Milchsäure durchgeführt werden.
Ein Substrat für nicht-enzymatischen Abbau kann aus irgendeiner Verknüpfung bzw. Bindung bestehen, die einer Hydrolyse durch einen säurekatalysierten oder basenkatalysierten Mechanismus unterliegt. Diese Substrate können Oligoester wie Oligomere von Milchsäure oder Glykolsäure umfassen. Die Geschwindigkeit des Abbaus dieser Materialien kann durch die Wahl des Oligomers kontrolliert werden.
D. PTH
Der Begriff „PTH", wie hierin verwendet, umfasst die menschliche Sequenz von PTH 1-84 und alle verkürzten, modifizierten und Allel-Versionen von PTH, die Knochenbildungseigenschaften aufweisen, wenn sie kovalent an biologisch abbaubare, natürliche oder synthetische Matrices gebunden werden. Bevorzugte verkürzte Versionen von PTH sind PTH 1-38, PTH 1-34, PTH 1-31 oder PTH 1-25. Am meisten bevorzugt ist PTH 1-34. Bevorzugt ist das PTH menschliches PTH, obwohl PTH aus anderen Quellen, wie Rinder-PTH, geeignet sein kann.
Verfahren zum Inkorporieren und/oder zur Freisetzung biologisch aktiver Faktoren
In einer bevorzugten Ausführungsform zum Inkorporieren eines PTH in die Matrix enthält die Matrix Fibrin, das aus Fibrinogen gebildet wird, eine Calciumquelle und Thrombin, und das PTH-Fusionspeptid wird während der Koagulierung in das Fibrin inkorporiert. Das PTH-Fusionspeptid ist als Fusionspeptid, das zwei Domänen, eine erste und eine zweite, enthält, konstruiert, wobei eine Domäne, die zweite, ein Substrat für ein Vernetzungsenzym wie Faktor XIIIa ist. Faktor XIIIa ist eine Transglutaminase, die während der Koagulierung aktiv ist. Dieses Enzym, das in der Natur aus Faktor XIIIa durch Spaltung durch Thrombin gebildet wird, wirkt dahingehend, Fibrinketten über Amidbindungen, die zwischen Glutamin-Seitenketten und Lysin-Seitenketten gebildet werden, aneinander zu binden. Das Enzym wirkt auch dahingehend, während der Koagulierung andere Peptide an Fibrin zu binden, z. B. die Zellen-Anheftungsstellen, vorausgesetzt, sie enthalten ebenfalls einen Faktor XIIIa. Speziell wurde für die Sequenz NQEQVSP (SEQ ID NO: 16) gezeigt, dass sie als ein wirkungsvolles Substrat für Faktor XIIIa wirkt. Wie hierin vorstehend beschrieben, ist sie entweder direkt an das PTH gebunden, oder sie kann eine Abbaustelle zwischen dem PTH (erste Domäne) und der NQEQVSP (SEQ ID NO: 16)-Sequenz (zweite Domäne) enthalten. Auf diese Weise kann das PTH-Fusionspeptid via ein Faktor XIIIa-Substrat während der Koagulierung in Fibrin eingebaut werden.
Konstruktion von Fusionsproteinen zum Inkorporieren
Das PTH-Fusionspeptid, das eine erste Domäne, die das PTH enthält, eine zweite Domäne, die eine Substratdomäne für ein vernetzendes Enzym enthält, und gewünschtenfalls eine Abbaustelle zwischen der ersten und der zweiten Domäne enthält, kann unter Verwendung unterschiedlicher Schemata in die Fibringele inkorporiert werden. Bevorzugt enthält die zweite Domäne eine Transglutaminase-Substratdomäne, und noch bevorzugter enthält sie eine Faktor XIIIa-Substratdomäne. Am meisten bevorzugt enthält die Faktor XIIIa-Substratdomäne NQEQVSP (SEQ ID NO: 16). Wenn dieses PTH-Fusionspeptid während der Polymerisierung des Fibrinogens vorhanden ist, d. h. während der Bildung der Fibrinmatrix, wird es direkt in die Matrix eingebaut.
Die Abbaustelle zwischen der ersten und der zweiten Domäne des PTH-Fusionspeptids kann eine enzymatische Abbaustelle sein, wie vorher beschrieben. Bevorzugt ist die Abbaustelle durch ein Enzym spaltbar, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Plasmin und Matrix-Metalloproteinase besteht. Durch sorgfältige Wahl von K_m und k_cat dieser enzymatischen Abbaustelle kann der Abbau kontrolliert werden, dass er entweder vor oder nach der Proteinmatrix stattfindet und/oder durch Verwendung ähnlicher oder unähnlicher Enzyme zum Abbau der Matrix, wobei die Anbringung der Abbaustelle für jede Art von Protein und Anwendung zugeschnitten wird. Dieses PTH-Fusionspeptid konnte direkt in die Fibrinmatrix hinein vernetzt werden, wie oben beschrieben. Das Inkorporieren einer enzymatischen Abbaustelle verändert jedoch die Freisetzung des PTH während der Proteolyse. Wenn die von Zellen stammenden Proteasen das komplexierte Fusionspeptid erreichen, können sie das durch Engineering erhaltene Protein an der neu gebildeten Abbaustelle spalten. Die sich ergebenden Abbauprodukte würden das freigesetzte PTH enthalten, das nun nahezu frei von irgendwelchen durch Engineering erhaltenen Fusionssequenzen wäre, sowie irgendwelches abgebautes Fibrin enthalten.
II. Verwendungsverfahren
Die Matrices können zur Wiederherstellung, Neubildung oder Umbildung von Geweben und/oder zur Freisetzung von PTH, vor oder zur Zeit der Implantation, verwendet werden. In manchen Fällen ist es wünschenswert, die Vernetzung an der Stelle der Verabfolgung auszulösen, um die Matrix an das Gewebe an der Implantationsstelle anzupassen. In anderen Fällen ist es gut passend, die Matrix vor der Implantation herzustellen.
Zellen können ebenfalls vor oder zur Zeit der Implantation, oder sogar nach der Implantation, entweder bei oder nach der Vernetzung des Polymers zur Bildung der Matrix, zu der Matrix zugegeben werden. Dies kann zusätzlich zu oder anstelle der Vernetzung der Matrix geschehen, um Zwischenräume zu erzeugen, die dazu ausgelegt sind, eine Zellen-Proliferation oder ein Einwachsen von Zellen zu fördern.
Obwohl es in den meisten Fällen wünschenswert sein wird, die Matrix zur Förderung des Zellenwachstums oder der Proliferation zu implantieren, werden die biologisch aktiven Faktoren in manchen Fällen dafür verwendet werden, die Geschwindigkeit der Zellproliferation zu hemmen. Eine spezifische Anwendung ist, die Bildung von Verwachsungen nach einem chirurgischen Eingriff zu hemmen.
III. Anwendungsverfahren
In der bevorzugten Ausführungsform wird das Material in situ in oder auf dem Körper geliert. In einer anderen Ausführungsform kann die Matrix außerhalb des Körpers gebildet werden und dann in der vorgeformten Gestalt angewendet werden. Das Matrixmaterial kann aus synthetischen oder natürlichen Vorläuferkomponenten hergestellt werden. Unabhängig von der Art der verwendeten Vorläuferkompo nente sollten die Vorläuferkomponenten vor der Anbringung des Gemisches am Körper getrennt sein, um eine Vereinigung oder einen Kontakt miteinander unter Bedingungen, die eine Polymerisation oder ein Gelieren der Komponenten zulassen, zu verhindern. Um einen Kontakt vor der Verabreichung zu verhindern, kann ein Kit verwendet werden, das die Zusammensetzungen voneinander trennt. Beim Vermischen unter Bedingungen, die eine Polymerisation zulassen, bilden die Zusammensetzungen ein durch einen biologisch aktiven Faktor ergänztes, dreidimensionales Netzwerk. Abhängig von den Vorläuferkomponenten und ihren Konzentrationen kann das Gelieren praktisch augenblicklich nach dem Vermischen eintreten. Ein derartiges schnelles Gelieren macht ein Einspritzen, d. h. ein Quetschen des gelierten Materials durch die Injektionsnadel, nahezu unmöglich.
In einer Ausführungsform wird die Matrix aus Fibrinogen gebildet. Fibrinogen geliert über eine Kaskade verschiedener Reaktionen unter Bildung einer Matrix, wenn es bei geeigneter Temperatur und geeignetem pH in Kontakt mit Thrombin und eine Calciumquelle gebracht wird. Die drei Komponenten, Fibrinogen, Thrombin und die Calciumquelle, sollten getrennt aufbewahrt werden. Solange jedoch mindestens eine der drei Komponenten getrennt gehalten wird, können die beiden anderen Komponenten vor der Verabreichung vereinigt werden.
In einer ersten Ausführungsform wird Fibrinogen in einer Pufferlösung (die zusätzlich Aprotinin zur Erhöhung der Stabilität enthalten kann) bei physiologischem pH (in einem Bereich von pH 6,5 bis 8,0, bevorzugt von pH 7,0 bis 7,5) gelöst und getrennt von einer Lösung von Thrombin in einem Calciumchlorid-Puffer (z. B. Konzentrationsbereich von 40 bis 50 mM) aufbewahrt. Die Pufferlösung für das Fibrinogen kann eine Histidin-Pufferlösung mit einer bevorzugten Konzentration von 50 mM, die zusätzlich NaCl in einer bevorzugten Konzentration von 150 mM enthält, oder eine IRIS-Puffer-Salzlösung (bevorzugt mit einer Konzentration von 33 mM) sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Kit, das ein Fusionsprotein, Fibrinogen, Thrombin und eine Calciumquelle enthält, bereitgestellt. Gewünschtenfalls kann das Kit ein vernetzendes Enzym, wie Faktor XIIIa, enthalten. Das Fusionsprotein enthält einen biologisch aktiven Faktor, eine Substratdomäne für ein vernetzendes Enzym und eine Abbaustelle zwischen der Substratdomäne und dem biologisch aktiven Faktor. Das Fusionsprotein kann entweder in der Fibrinogenlö sung oder in der Thrombinlösung vorliegen. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Fibrinogenlösung das Fusionsprotein.
Die Lösungen werden bevorzugt mittels einer Zweiwege-Spritzenvorrichtung gemischt, in der das Mischen durch Quetschen der Inhalte von beiden Spritzen durch eine Mischkammer und/oder Nadel und/oder einen statischen Mischer geschieht.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden sowohl Fibrinogen als auch Thrombin getrennt in gefriergetrockneter Form aufbewahrt. Jedes der zwei kann das Fusionsprotein enthalten. Vor der Verwendung wird der Tris- oder Histidin-Puffer zu dem Fibrinogen zugegeben, wobei der Puffer zusätzlich Aprotinin enthalten kann. Das gefriergetrocknete Thrombin wird in der Calciumchlorid-Lösung gelöst. Danach werden die Fibrinogen- und die Thrombin-Lösung in getrennte Behälter/Ampullen/Spritzenkörper gebracht und mittels einer Zweiwege-Verbindungsvorrichtung, wie einer Zweiwege-Spritze, gemischt. Gewünschtenfalls sind die Behälter/Ampullen/Spritzenkörper zweigeteilt, so dass sie zwei Räume haben, die durch einen einstellbaren Trenneinsatz, der senkrecht zur Spritzenkörperwand ist, getrennt werden. Einer der Räume enthält das gefriergetrocknete Fibrinogen oder Thrombin, während der andere Raum eine geeignete Pufferlösung enthält. Wenn der Kolben nach unten gepresst wird, bewegt sich der Trenneinsatz und setzt den Puffer in den Fibrinogenraum hinein frei, um das Fibrinogen zu lösen. Wenn sowohl das Fibrinogen als auch das Thrombin gelöst sind, werden beide zweigeteilten Spritzenkörper an einer Zweiwege-Verbindungsvorrichtung befestigt, und die Inhalte werden vermischt, indem sie durch die Injektionsnadel, die an der Verbindungsvorrichtung befestigt ist, gepresst werden. Gewünschtenfalls enthält die Verbindungsvorrichtung einen statischen Mischer zur Verbesserung des Mischens der Inhalte.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Fibrinogen vor dem Vermischen 8-fach verdünnt und das Thrombin 20-fach verdünnt. Dieses Verhältnis führt zu einer Gelierzeit von näherungsweise 1 min.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird die Matrix aus synthetischen Vorläuferkomponenten, die in der Lage sind, eine Michael-Additionsreaktion einzugehen, gebildet. Da die nucleophile Vorläuferkomponente (das Multithiol) nur bei basischem pH mit der Multiakzeptor-Komponente (der konjugierten ungesättigten Gruppe) reagiert, sind die drei Komponenten, die vor dem Mischen getrennt aufbewahrt werden müssen: die Base, die nucleophile Komponente und die Multiakzeptor-Komponente. Sowohl die Multiakzeptor- als auch die Multithiol-Komponente werden als Lösungen in Puffern aufbewahrt. Beide Zusammensetzungen können die Zellen-Anheftungsstelle und zusätzlich das biologisch aktive Molekül enthalten. So kann die erste Zusammensetzung des Systems beispielsweise die Lösung der nucleophilen Komponente enthalten, und die zweite Zusammensetzung des Systems kann die Lösung der Multiakzeptor-Komponente enthalten. Jede oder beide der zwei Zusammensetzungen kann (können) die Base enthalten. In einer anderen Ausführungsform können der Multiakzeptor und das Multithiol als Lösung in der ersten Zusammensetzung enthalten sein, und die zweite Zusammensetzung kann die Base enthalten. Das Verbinden und Mischen geschieht in derselben Weise wie vorher für Fibrinogen beschrieben. Der zweigeteilte Spritzenkörper ist gleichermaßen geeignet für die synthetischen Vorläuferkomponenten. Anstelle von Fibrinogen und Thrombin werden die Multiakzeptor- und die Multithiol-Komponente in pulverisierter Form in einem der Räume aufbewahrt, und der andere Raum enthält den basischen Puffer.
Die folgenden Beispiele sind enthalten, um bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung aufzuzeigen. Die Zusammensetzungen und Verfahren wurden zwar anhand von bevorzugten Ausführungsformen beschrieben, aber für Fachleute auf dem Gebiet wird es offensichtlich sein, dass die Zusammensetzung, die Verfahren und die Schritte oder die Abfolge von Schritten des hierin beschriebenen Verfahrens variiert werden können, ohne von dem Konzept, Geist und Umfang der Erfindung abzuweichen.
Beispiel 1: Matrices, die kovalent gebundenes TGPTH enthalten
Synthese von TGPTH
Das PTH-Peptid mit den monomeren Einheiten 1-34 (PTH 1-34-mer), das die gleiche Aktivität wie das gesamte Protein zeigt, und Proteine dieser Länge können durch Standard-Peptidsyntheseverfahren im festen Zustand synthetisiert werden.
Alle Peptide wurden auf einem Festharz unter Verwendung einer automatisierten Peptid-Syntheseeinrichtung unter Verwendung von Standard-9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-Chemie synthetisiert. Die Peptide wurden durch C18-Chromatografie gereinigt und unter Verwendung von Umkehrphasenchromatografie mittels HPLC, zur Bestimmung der Reinheit, sowie Massenspektroskopie (MAIDI) zur Identifizierung des Molekulargewichts jedes Produkts analysiert. Unter Verwendung dieses Verfahrens wurde das folgende Peptid (hierin als „TGPTH" bezeichnet) synthetisiert:
NH₃-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Ser-Pro-Leu-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-COOH (SEQ ID NO: 17)
In vivo-Ergebnisse
Die Aktivität von TGPTH zur Verbesserung der Knochenbildung wurde in einer TISSUCOL^®-Matrix in einem Bohrloch-Schaden an Schafen getestet. Löcher mit 8 mm von 12 mm Tiefe wurden im proximalen und distalen Femur und Numerus von Schafen erzeugt. Diese Löcher wurden mit einem in situ polymerisierenden Fibringel gefüllt. Die Defekte bzw. Schäden wurden leer gelassen, mit TISSUCOL^® gefüllt, oder es wurde vor der Polymerisierung TGPTH zu TISSUCOL^®-Fibrin zu 400 μg/ml zugegeben. In jedem Beispiel, in dem TISSUCOL^® verwendet wurde, wurde es ausgehend von der verfügbaren Standardkonzentration 4-fach verdünnt, was zu einer Fibrinogen-Konzentration von 12,5 mg/ml führte.
Die Defekte wurden 8 Wochen lang heilen lassen. Nach dieser Heilungsperiode wurden die Tiere geopfert, und die Knochenproben wurden entfernt und durch Mikrocomputertomografie (μCT) analysiert. Dann wurde der Prozentsatz des Defektvolumens, der mit calcifiziertem Knochengewebe gefüllt war, bestimmt. Wenn die Defekte leer gelassen wurden, gab es keine Bildung von calcifiziertem Gewebe im Inneren der Fibrinmatrix. Wenn nur ein Fibringel zugegeben wurde, gab es ebenfalls praktisch keine Knochenheilung. Mit dem Zusatz von 400 mg/ml TGPTH jedoch stieg der Grad der Heilung dramatisch, wobei der Defekt zu 35% mit calcifiziertem Knochen gefüllt war.
BEISPIEL 2: Heilungsreaktion mit an eine Fibrinmatrix gebundenem, modifiziertem PTH 1-34
Materialien
Die modifizierte Version von PTH 1-34, die in eine Fibrinmatrix eingebaut werden kann, wurde dann hinsichtlich Heilungsreaktion in einem Schädeldefekt kritischer Größe an Ratten getestet.
Ein Fibringel wurde hergestellt aus Fibrinkleber-Vorläuferkomponenten des TISSUCOL^®-Kits (Baxter AG, CH-8604 Volketswil/ZH). Das Fibrinogen wurde in steriler 0,03 M Tris-gepufferter Lösung (TBS, pH 7,4) verdünnt, um eine Lösung von näherungsweise 8 mg/ml zu bilden, und das Thrombin wurde in steriler 50 mM CaCl₂. Lösung verdünnt, um eine Lösung von 2 U/ml zu bilden. Die Endkonzentration von Fibrinogen war 1:8 ursprüngliche TISSUCOL^®-Formulierung (etwa 100 mg/ml) und 1:160 ursprüngliche TISSUCOL^®-Thrombin-Konzentration (etwa 500 IE/ml). Eine vorbestimmte Menge an TG-pl-PTH_1-34, oder TGPTH_1-34 wurde dann zu dem Thrombin zugegeben und gemischt, um eine homogene Konzentration zu bilden.
Zur Bildung des Fibringels wurden die verdünnten Vorläufer zusammengemischt, indem das Fibrinogen in das das Thrombin enthaltende Röhrchen gespritzt wurde. Im Falle des Bohrungsdefekts beim Schaf (wie unten beschrieben) wurde dieses Gemisch dann sofort in einen Bohrungsdefekt, erzeugt in Schaf-Spongiosa, eingespritzt, wo sich innerhalb von 1 bis 5 min ein Fibringel bildete. In der ersten Reihe von Tierversuchen wurde die Wirksamkeit eines Fusionsproteins, das PTH 1-34 als den biologisch aktiven Faktor enthielt (NQEQVSPLYKNRSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF, SEQ ID NO: 18) bei der Heilung der Corticalis in einem Kleintiermodell getestet. Die Sequenz YKNR (SEQ ID NO: 19) macht die Bindung plasminabbaubar („TG-pl-PTH_1-34"). Das TG-pl-PTH_1-34 wurde durch chemische Synthese hergestellt. Die Reinigung wurde durch Umkehrphasen-HPLC (C18-Säule) unter Verwendung von TFA als das Gegenion durchgeführt, was zu einem Endprodukt führte, das ein TFA-Salz war. Die Reinheit des TG-pl-PTH_1-34 wurde zu 95% bestimmt.
Die Heilungsreaktion wurde sowohl bei kurzen (3 Wochen) als auch bei langen Heilungszeiten (7 Wochen) untersucht, um zu bestimmen, ob eine Verbesserung der Heilung beobachtet werden konnte.
Schädeldefekt kritischer Größe bei Ratten
Ratten wurden anästhesiert, und der Schädelknochen wurde exponiert. Die Knochenhaut an der Außenoberfläche des Schädels wurde zurückgezogen, so dass sie beim Heilungsprozess keine Rolle spielen würde, und es wurde ein einziger runder Defekt von 8 mm erzeugt. Diese Defektgröße wurde gewählt, weil vorher bestimmt worden war, dass Defekte von 8 mm oder größer nicht spontan von selbst heilen und Defekte von kritischer Größe sind. Der Defekt wurde dann mit einer vorgeformten Fibrinmatrix versehen, und das Tier wurde 3 und 7 Wochen lang heilen lassen. Der Defektbereich wurde dann explantiert und mittels Radiologie sowie Histologie analysiert.
Ergebnisse
Wenn TG-pl-PTH_1-34 zum Zeitpunkt von 3 Wochen studiert wurde, war der Grad der Heilung sehr ähnlich demjenigen, der mit einer Fibrinmatrix alleine beobachtet wurde. Der Zeitpunkt von 3 Wochen wurde als ein früher Zeitpunkt gewählt, da andere wirkungsvolle Morphogene, wozu rhBMP-2 gehört, nach 3 Wochen eine starke Heilungswirkung zeigten. Im Gegensatz dazu war die Heilungswirkung zu diesem frühen Zeitpunkt für TG-pl-PTH_1-34 nicht beobachtbar. Wenn jedoch der längere Zeitpunkt (7 Wochen) analysiert wurde, wurde eine mäßige dosisabhängige Verbesserung bei der Heilung des Schädeldefekts kritischer Größe bei Ratten beim Zusatz von modifiziertem PTH_1-34 zu Fibrinmatrices beobachtet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Wenn die hohe Dosis an modifiziertem PTH_1-34 verwendet wurde, erhöhte sich die Heilungsreaktion um 65%. Tabelle 3: Heilungsreakation beim Ratten-Schädeldefekt mit modifiziertem PTH

Probe Dosis (μg/ml) Zeit (Tage) Heilung (% Defekt gefüllt mit Knochen)

Fibrin 0 63 38

TG-pl-PTH_1-34 10 63 43

TG-pl-PTH_1-34 200 63 50

TG-pl-PTH_1-34 500 63 62
Diese Ergebnisse demonstrieren, dass PTH_1-34, wenn es in eine Fibrinmatrix eingebaut ist, eine gewisse Aktivität behält, wie durch die mäßige Steigerung der Knochenbildung angezeigt wird.
Knochen-Bohrungsdefekt bei Schafen
TG-pl-PTH_1-34 wurde ebenso an einem Langknochen-Defektmodell getestet, um die Wirkung dieses Hormons auf die Heilung von Knochen zu testen. Bei dem Schaf-Bohrungsdefekt-Modell wurden zylindrische Bohrungsdefekte von 8 mm, die näherungsweise 15 mm tief waren, sowohl in dem proximalen als auch dem distalen Bereich der Femur- und Numerus-Knochen angebracht. Da der Defekt in der Epiphyse der langen Knochen angebracht wurde, wurde der Defekt von trabekulärem Knochen mit einer dünnen Schicht von cortikalem Knochen am Rand des Defekts umgeben. Diese Defekte wurden dann mit einem in situ polymerisierenden Fibrin (etwa 750 μl), das verschiedene Dosen an TG-pl-PTH_1-34 oder TGPTH_1-34 enthielt, gefüllt. Die Tiere wurden 8 Wochen lang heilen lassen und wurden dann geopfert. Der Defekt wurde mit μCT und Histologie analysiert.
Für diese Reihe von Versuchen wurden drei Arten von Zusammensetzungen getestet. Zuerst wurde TG-pl-PTH_1-34 über einen großen Konzentrationsbereich getestet. Zweitens wurde ein anderes modifiziertes PTH_1-34, TGPTH_1-34(NQEQVSPLSVSEIQLMHNLGKHLN SMERVEWLRKKLQDVHNF; SEQ ID NO: 17), verwendet, das nur eine Transglutaminase-Sequenz am Amino-Ende, ohne eine Abbaustelle, hatte. So konnte TGPTH_1-34 nur durch Abbau der Fibrinmatrix selbst freigesetzt werden. TGPTH_1-34 wurde ähnlich wie TG-pl-PTH_1-34 hergestellt und gereinigt. Die Reinheit wurde zu 95% bestimmt. TGPTH_1-34 wurde bei mehreren Konzentrationen, die den Konzentrationen von TG-pl-PTH_1-34 gleich waren, getestet, um die Wirksamkeit zu vergleichen. Schließlich wurden Matrices in Anwesenheit von granularem Material, entweder mit TGPTH_1-34 oder mit TG-pl-PTH_1-34, hergestellt. Das granulare Material war ein Standard-Tricalciumphosphat/Hydroxyapatit-Gemisch, das während des Gelierens in die Matrix eingebettet wurde. Die Wirkung der Zugabe dieser Granalien auf die Wirksamkeit von TGPTH_1-34 wurde untersucht. Als eine Kontrolle wurde unmodifiziertes Fibrin getestet.
Ergebnisse
Wenn eines der beiden modifizierten PTH_1-34-Moleküle in Defekte der langen Knochen gebracht wurde, wurde eine signifikante Verbesserung der Heilungsreaktion gegenüber der Verwendung von Fibrinmatrices (Kontrolle) alleine beobachtet. Die Verwendung von Fibrin alleine führte zu wenig Heilung, wobei nur 20% des ursprünglichen Defekts mit neu gebildetem Knochen gefüllt wurden.
TG-pl-PTH_1-34 wurde in einer Konzentrationsreihe von 20 bis 1000 μg/ml getestet. Für jede getestete Dosis wurde eine signifikante Steigerung der Heilungsreaktion beobachtet. Wenn beispielsweise 100 μg/ml TG-pl-PTH_1-34 verwendet wurden, stieg die Heilungsrate auf fast 60%.
In einer zweiten Reihe von Experimenten wurde TGPTH_1-34 getestet. Die Verwendung von TGPTH_1-34 verbesserte ebenfalls die Knochenheilung. Beispielsweise verbesserte die Verwendung von 400 μg/ml die Heilungsreaktion auf 40%, und 1000 μg/ml erhöhten die Knochenheilung auf 65%. So führte die Zugabe von jeder der beiden modifizierten PTH_1-34-Sequenzen zu einer stärkeren Heilungsreaktion als die Kontrolle.

Schließlich wurde, wenn jeweils eines der beiden modifizierten PTH_1-34-Moleküle an die Matrix gebunden wurde und ein Granalien/Matrix-Gemisch verwendet wurde, die Wirksamkeit des PTH_1-34 beibehalten. Dies wurde sowohl für TG-pl-PTH_1-34 (siehe Tabelle 4) als auch für TGPTH_1-34 (siehe Tabelle 5) getestet. Tabelle 4: Heilung eines Schaf-Bohrungsdefekts mit TG-pl-PTH_1-34, eingebaut in eine Fibrinmatrix; Heilungszeit 8 Wochen

Probe	Dosis (μg/ml)	Heilung (% Defekt gefüllt mit Knochen)
Fibrin (Kontrolle)	0	20
TG-pl-PTH_1-34	50	31,3
TG-pl-PTH_1-34	100	59,7
TG-pl-PTH_1-34	400	73
TG-pl-PTH_1-34	1000	77
TG-pl-PTH_1-34 400 TCP	400	68

Tabelle 5: Heilung eines Schaf-Bohrungsdefekts mit PTH_1-34, an eine Fibrinmatrix gebunden; Heilungszeit 8 Wochen

Probe	Dosis (μg/ml)	Heilung (% Defekt gefüllt mit Knochen)
Fibrin	0	20
TGPTH_1-34	400	40
TGPTH_1-34	1000	65
TG-PTH_1-34 400 TCP	400	71

Die histologische Untersuchung zeigte eine hohe Infiltration von Spindel- und Osteoblasten-Vorläuferzellen, getragen auf einer extrazellulären Matrix, in den ursprünglichen Defekt. Aktive Osteoide mit großen gerundeten Osteoblasten waren üblich, und es wurden Anzeichen von endochondraler Knochenbildung (Chondrocyten) beobachtet. Nach 8 Wochen konnten Osteoclasten und gesunde Anzeichen für Umbildung gefunden werden. Aber anders als bei den Ergebnissen, die bei kontinuierlicher systemischer PTH-Exposition erhalten wurden, wurde keine offenkundige Reaktion von Osteoclasten beobachtet, und die Bildung von neuem Knochen war signifikant größer als die Absorption in und um den Defektbereich. Keine Fremdkörper-Entzündungsreaktion wurde nachgewiesen (d. h. Keine Riesenzellen und nur schwache Monozyten-Anwesenheit). In Proben mit zugesetzten mineralischen Partikeln waren die Granalien noch vorhanden.
Beispiel 3: Herstellung von Vorläuferkomponenten für synthetische Matrices
Herstellung von PEG-vinylsulfonen
Im Handel erhältliche verzweigte PEGs (vierarmiges PEG, Molekulargewicht 14.800, vierarmiges PEG, Molekulargewicht 10.000 und achtarmiges PEG, Molekulargewicht 20.000; Shearwater Polymers, Huntsville, AL, USA) wurden an den OH-Enden funktionalisiert.
PEG-vinylsulfone wurden unter Argon-Atmosphäre durch Zur-Reaktion-Bringen einer Dichlormethan-Lösung der Vorläuferpolymere (vorher über Molekularsieben getrocknet) mit NaH und dann, nach Wasserstoffentwicklung, mit Divinylsulfon (Molverhältnisse: OH 1: NaH 5: Divinylsulfon 50) hergestellt. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 3 Tage lang unter Argon unter dauerndem Rühren durchgeführt. Nach Neutralisierung der Reaktionslösung mit konzentrierter Essigsäure wurde die Lösung durch Papier filtriert, bis sie klar war. Das derivatisierte Polymer wurde durch Fällung in eiskaltem Diethylether isoliert. Das Produkt wurde zweimal erneut in Dichlormethan gelöst und erneut in Diethylether gefällt (mit sorgfältigem Waschen), um alles überschüssige Divinylsulfon zu entfernen. Schließlich wurde das Produkt unter Vakuum getrocknet. Die Derivatisierung wurde mit ¹H-NMR bestätigt. Das Produkt zeigte charakteristische Vinylsulfon-Peaks bei 6,21 ppm (zwei Wasserstoffe) und 6,97 ppm (ein Wasserstoff). Es wurde gefunden, dass der Endgruppen-Umsetzungsgrad 100% war.
Herstellung von PEG-Acrylaten
PEG-Acrylate wurden unter Argon-Atmosphäre durch Zur-Reaktion-Bringen einer azeotrop getrockneten Toluol-Lösung der Vorläuferpolymere mit Acryloylchlorid in Anwesenheit von Triethylamin (Molverhältnisse: OH 1: Acryloylchlorid 2: Triethylamin 2,2) hergestellt. Die Reaktion verlief unter Rühren über Nacht im Dun kein bei Raumtemperatur. Die sich ergebende blassgelbe Lösung wurde durch ein neutrales Aluminiumoxidbett filtriert; nach Verdampfen des Lösungsmittels wurde das Reaktionsprodukt in Dichlormethan gelöst, mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und in kaltem Diethylether ausgefällt. Ausbeute: 88%; Umsetzung von OH zu Acrylat: 100% (aus ¹H-NMR-Analyse)
¹H-NMR (CDCl₃); 3,6 (341H (14800 vierarmig: 337H theor.), 230 (10000 vierarmig: 227H theor.), oder 210H (20000 achtarmig: 227H theor.), PEG-Kettenprotonen), 4,3 (t, 2H, -CH₂-CH ₂-O-CO-CH=CH₂), 5,8 (dd, 1H, CH₂=CH-COO-), 6,1 und 6,4 (dd, 1H, CH ₂=CH-COO-) ppm.
FT-IR (Film auf ATR-Platte): 2990–2790 (γ C-H), 1724 (γ C=O), 1460 (γ_s CH₂), 1344, 1281, 1242, 1097 (γ_as C-O-C), 952, 842 (γ_s C-O-C) cm^–1.
Peptid-Synthese
Alle Peptide wurden auf Festharz unter Verwendung einer automatischen Peptid-Syntheseeinrichtung (9050 Pep Plus Synthesizer, Millipore, Framingham, USA) mit Standard-9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-Chemie synthetisiert. Hydrophobe Reinigungsmittel und abgespaltene Schutzgruppen wurden durch Ausfällung des Peptids in kaltem Diethylether und Auflösen in deionisiertem Wasser entfernt. Nach Gefriertrocknung wurden die Peptide wieder in 0,03 M Tris-gepufferter Salzlösung (TBS, pH 7,0) gelöst und unter Verwendung von HPLC (Waters; Milford, USA) auf einer Größenausschlusssäule mit TBS, pH 7,0 als Laufpuffer gereinigt.
Matrixbildung durch Konjugat-Additionsreaktion
MMP-empfindliche Gele, hergestellt durch Konjugat-Addition mit einem peptidverknüpften Nucleophil und einer PEG-verknüpften konjugierten Ungesättigtheit, die eine proteolytische Zellenwanderung erlauben.
Die Synthese der Gele wird vollständig durch Additionsreaktion vom Michael-Typ von Thiol-PEG an Vinylsulfon-funktionalisiertes PEG bewerkstelligt. In einem ersten Schritt wurden Adhäsionspeptide anhängend (z. B. das Peptid Ac-GCGYGRGDSPG-NH₂ (SEQ ID NO: 20)) an ein mehrarmiges PEG-vinylsulfon angeheftet, und dann wurde dieser Vorläufer mit einem Dithiol enthaltenden Peptid (z. B. dem MMP-Substrat Ac-GCRDGPQGIAGFDRCG-NH₂ (SEQ ID NO: 21)) vernetzt. Bei einer typischen Geldarstellung für 3-dimensionale in vitro-Studien wurde vierarmiges PEG-vinylsulfon (Molekulargewicht 15000) in einem TEOA-Puffer (0,3M, pH 8,0) gelöst, um eine 10%ige (w/w) Lösung zu ergeben. Um die Gele zellenadhäsiv zu machen, wurde das gelöste Peptid Ac-GCGYGRGDSPG-NH₂ (SEQ ID NO 20)(gleicher Puffer) zu dieser Lösung zugegeben. Das Adhäsionspeptid wurde 30 min lang bei 37°C reagieren lassen. Danach wurde das Vernetzerpeptid Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH₂ (SEQ ID NO: 21) mit der obigen Lösung gemischt, und es wurden Gele synthetisiert. Das Gelieren geschah innerhalb von wenigen Minuten, jedoch wurde die Vernetzungsreaktion bei 37°C 1 h lang durchgeführt, um eine vollständige Reaktion zu garantieren.
MMP-unempfindliche Gele, hergestellt durch Konjugat-Addition mit einem PEG-verknüpften Nucleophil und einer PEG-verknüpften konjugierten Ungesättigtheit, die nicht-proteolytische Zellenwanderung erlauben.
Die Synthese der Gele wird ebenfalls vollständig durch Additionsreaktion vom Michael-Typ von Thiol-PEG an Vinylsulfon-funktionalisiertes PEG bewerkstelligt. In einem ersten Schritt wurden Adhäsionspeptide anhängend (z. B. das Peptid Ac-GCGYGRGDSPG-NH₂ (SEQ ID NO: 20)) an ein mehrarmiges PEG-vinylsulfon angeheftet, und dann wurde dieser Vorläufer mit einem PEG-dithiol (mw 3,4 kD) vernetzt. Bei einer typischen Geldarstellung für dreidimensionale in vitro-Studien wurde vierarmiges PEG-vinylsulfon (Molekulargewicht 15.000) in einem TEOA-Puffer (0,3 M, pH 8,0) gelöst, um eine 10%ige (w/w) Lösung zu ergeben. Um die Gele zellenadhäsiv zu machen, wurde das gelöste Peptid Ac-GCGYGRGDSPG-NH₂ (SEQ ID NO: 20)(im gleichen Puffer) zu dieser Lösung zugegeben. Das Adhäsionspeptid wurde 30 min lang bei 37°C reagieren lassen. Danach wurde der PEG-dithiol-Vorläufer mit der obigen Lösung gemischt, und die Gele wurden synthetisiert. Das Gelieren geschah innerhalb weniger Minuten, jedoch wurde die Vernetzungsreaktion bei 37°C eine Stunde lang durchgeführt, um eine vollständige Reaktion zu garantieren.
Matrixbildung durch Kondensationsreaktionen
MMP-empfindliche Gele, hergestellt durch Kondensationsreaktionen mit einem mehrere Amine enthaltenden Peptid X-Linker und einem elektrophil aktiven PEG, die eine proteolytische Zellenwanderung erlauben.
MMP-empfindliche Hydrogele wurden ebenfalls durch Durchführen einer Kondensationsreaktion zwischen MMP-empfindlichem Oligopeptid, das zwei MMP-Substrate und drei Lys enthielt (Ac-GKGPQGIAGQKGPQGIAGQKG-NH₂ (SEQ ID NO: 22)), und einem im Handel erhältlichen (Shearwater polymers) difunktionellen Doppelester-PEG-N-hydroxysuccinimid (NHS-HBS-CM-PEG-CM-HBA-NHS) erzeugt. In einem ersten Schritt wurde ein Adhäsionspeptid (z. B. das Peptid Ac-GCGYGRGDSPG-NH₂)(SEQ ID NO: 20) mit einem kleinen Anteil an NHS-HBS-CM-PEG-CM-HBA-NHS zur Reaktion gebracht, und dann wurde dieser Vorläufer durch Vermischen mit dem Peptid Ac-GKGPQGIAGQKGPQGIAGQKG-NH₂ (SEQ ID NO: 22), das drei ε-Amine (und ein primäres Amin) trug, zu einem Netzwerk verknüpft. Bei einer typischen Geldarstellung für dreidimensionale in vitro-Studien wurden beide Komponenten in 10 mM PBS bei pH 7,4 gelöst, um eine 10%ige (w/w) Lösung zu ergeben, und innerhalb von weniger als einer Stunde wurden Hydrogele gebildet.
Im Gegensatz zu den vorliegenden, durch Reaktion vom Michael-Typ gebildeten Hydrogelen ist die gewünschte Eigenselektivität bei diesem Verfahren nicht garantiert, da in biologischen Materialien wie Zellen oder Geweben vorhandene Amine ebenfalls mit den difunktionellen aktivierten Doppelestern reagieren. Dies trifft auch für andere elektrophile Funktionalitäten tragende PEGs wie PEG-Oxycarbonylimidazol (CDI-PEG) oder PEG-nitrophenylcarbonat zu.
MMP-unempfindliche Hydrogele, hergestellt durch Kondensationsreaktionen mit einem PEG-Amin-Vernetzer und einem elektrophil aktiven PEG, die eine nicht-proteolytische Zellenwanderung erlauben.
Hydrogele wurden ebenfalls durch Durchführen einer Kondensationsreaktion zwischen im Handel erhältlichen verzweigten PEG-Aminen (Jeffamines) und demselben difunktionellen Doppelester PEG-N-hydroxysuccinimid (NHS-HBS-CM-PEG-CM-HBA-NHS) hergestellt. In einem ersten Schritt wurde das Adhäsionspeptid (z. B. das Peptid Ac-GCGYGRGDSPG-NH₂)(SEQ ID NO: 20) mit einem kleinen Anteil an NHS-HBS-CM-PEG-CM-HBA-NHS zur Reaktion gebracht, und dann wurde dieser Vorläufer durch Vermischen mit dem mehrarmigen PEG-Amin zu einem Netzwerk verknüpft. Bei einer typischen Geldarstellung für dreidimensionale in vitro-Studien wurden beide Komponenten in 10 mM PBS bei pH 7,4 gelöst, um eine 10%ige (w/w) Lösung zu ergeben, und innerhalb von weniger als einer Stunde wurden Hydrogele gebildet.
Wiederum ist, im Gegensatz zu den vorliegenden, durch Reaktion vom Michael-Typ hergestellten Hydrogelen, die erwünschte Eigenselektivität bei diesem Verfahren nicht garantiert, da in biologischen Materialien wie Zellen oder Geweben vorhandene Amine ebenfalls mit den difunktionellen aktivierten Doppelestern reagieren. Dies trifft auch für andere elektrophile Funktionalitäten tragende PEGs wie PEG-oxycarbonylimidazol (CDI-PEG) oder PEG-nitrophenylcarbonat zu.
Beispiel 4: Knochen-Neubildung mit synthetischen enzymatisch abbaubaren Matrices
Es wurden zwei verschiedene Ausgangskonzentrationen der enzymatisch abbaubaren Gele verwendet. In jedem davon wurde die Konzentration an RGD und an dem aktiven Faktor (CplPTH bei 100 μg/ml) konstant gehalten. Das polymere Netzwerk wurde aus einem vierarmigen verzweigten PEG, das mit vier Vinylsulfon-Endgruppen eines Molekulargewichts von 20 kD (Molekulargewicht jedes der Arme 5 kD) funktionalisiert war, und einem Dithiol-Peptid der folgenden Sequenz Gly-Cys-Arg-Asp-(Gly-Pro-Gln-Gly-Ile-Trp-Gly-Gln)-Asp-Arg-Cys-Gly (SEQ ID NO: 21) hergestellt. Beide Vorläuferkomponenten wurden in 0,3 M Triethanolamin gelöst. Die Ausgangskonzentration des funktionalisierten PEG (erstes Vorläufermolekül) und des Dithiol-Peptids (zweites Vorläufermolekül) wurde variiert. In einem Fall war die Konzentration 12,6 Gew.-% des Gesamtgewichts der Zusammensetzung (erste und zweite Vorläuferkomponente + Triethanolamin-Lösung). Die 12,6 Gew.-% entsprechen einer 10 Gew.-%igen Lösung, wenn auf der Basis von nur der ersten Vorläuferkomponente gerechnet wird (100 mg/ml erstes Vorläufermolekül). Die zweite Ausgangskonzentration war 9,5 Gew.-% des Gesamtgewichts der Zusammensetzung (erste und zweite Vorläuferkomponente + Triethanolamin-Lösung), was 7,5 Gew.-% auf der Basis nur des ersten Vorläufermoleküls (75 mg/ml erstes Vorläufermolekül) des Gesamtgewichts entspricht. Dies hat die Folge, dass die Menge an Dithiol-Peptid so verändert wurde, dass das Molverhältnis zwischen Vinylsulfonen und Thiolen beibehalten wurde.
Das Gel, das mit einer Ausgangskonzentration von 12,6 Gew.-% begann, quoll auf eine Konzentration von 8,9 Gew.-% des Gesamtgewichts des polymeren Netzwerks plus Wasser auf, so dass die Matrix einen Wassergehalt von 91,1 hatte. Das Gel, das mit einer Ausgangskonzentration von 9,5 Gew.-% begann, quoll auf eine Endkonzentration von 7,4 Gew.-% des Gesamtgewichts des polymeren Netzwerks plus Wasser auf, hatte also einen Wassergehalt von 92,6.
Um die Wirkung dieser Veränderung zu untersuchen, wurden diese Materialien in einem Schaf-Bohrungsdefekt getestet. Hier wurde ein Defekt von 750 μl in der Spongiosa der Diaphysen von Schaf-Femur und Schaf-Numerus angebracht und mit einem in situ gelierenden enzymatischen Gel gefüllt. Die folgende Menge an calcifiziertem Gewebe wurde erhalten, bestimmt mittels μCT, mit jeder Gruppe bei N = 2:

Ausgangskonzentration des Gels calcifiziertes Gewebe

12,6% 2,7%

9,5% 38,4%
Indem man die Gele weniger dicht und für eine Zellenpenetration einfacher machte, war die sich ergebende Heilungsreaktion bei der Zugabe eines aktiven Faktors stärker. Die Auswirkung von endgültigen Feststoff-Konzentrationen von unter 8,5 Gew.-% ist aus diesen Ergebnissen offensichtlich.
Es ist dann klar, dass der Aufbau der Matrix kritisch für die Ermöglichung einer Heilung in Wundschäden ist. Jedes dieser Hydrogele bestand aus großen Ketten von Polyethylenglykol, die zur Erzeugung einer Matrix endenverknüpft waren. Die Einzelheiten, wie sie verknüpft waren, über enzymatische Abbaustellen, die Dichte der Linker und mehrere andere Variablen waren jedoch kritisch für die Ermöglichung einer funktionellen Heilungsreaktion. Diese Unterschiede wurden sehr deutlich in dem Schaf-Bohrungsdefektmodell beobachtet.
Beispiel 5: Knochenbildung mit synthetischen, hydrolytisch abbaubaren Matrices
PTH 1-34-Fusionspeptid wurde auch in einem synthetischen Gel in dem Schaf-Bohrungsdefektmodell getestet, genau wie für die Fibrinmatrices beschrieben. Ein Hydrogel-Netzwerk wurde erzeugt durch Zusammenmischen von acryliertem vierarmigem Polyethylenglykol, MW 15.000 (Peg 4* 15 Acr) mit einem linearen Polyethylenglykol-dithiol mit MW 3400. Wenn die beiden Komponenten in einem Puffer von 0,3 M Triethanolamin bei pH 8,0 gemischt werden, können die sich ergebenden Thiolate, die bei diesem pH gebildet werden, dann durch eine Reaktion vom Michael-Typ mit der konjugierten Ungesättigtheit des Acrylats reagieren, um eine kovalente Bindung zu erzeugen. Durch Zusammenmischen von mehrfunktionellen Vorläufern dergestalt, dass die vereinigte Mehrfunktionalität größer als oder gleich fünf ist, wird ein Hydrogel gebildet. Zusätzlich können biologisch aktive Faktoren durch ein identisches Reaktionsschema zu der Matrix zugegeben werden. In diesem Fall könnten biologisch aktive Faktoren, wozu Zellenadhäionsmotive oder morphogene oder mitogene Faktoren gehören, an die Matrix gebunden werden, indem an die Sequenz ein Cystein, die Thiol enthaltende Aminosäure, hinzugefügt wird. Hier haben wir ein Cystein an die Zellenadhäsionssequenz, RGD, und genauer RGDSP (SEQ ID NO: 23), sowie an die PTH_1-34-Sequenz hinzugefügt, und beide wurden mittels der Acrylate in dem Vernetzer an die Matrix gebunden. Danach haben diese neu gebildeten Hydrogele dann zahlreiche Ester nahe einem Thiol, wovon gezeigt wurde, dass es hydrolytisch instabil ist. Diese Instabilität erlaubt, dass die Gele sich langsam abbauen und durch neu gebildetes Gewebe ersetzt werden.
Diese bestimmten Gele, die hydrolytisch abbaubar sind mit kovalent an die Matrix gebundenem RGD und PTH wurden in dem Schaf-Bohrungsdefektmodell getestet, um die Fähigkeit von matrixgebundenem C-PTH_1-34 zur Steigerung des Knochenwachstums zu testen. Um den Steigerungsbetrag zu bestimmen, wurden der Matrix 0, 100 und 400 μg/ml PTH_1-34-Fusionspeptid zugegeben. Wenn dies getan wurde, wurde bei der Zugabe von PTH_1-34 ein Anstieg der Knochenbildung beobachtet. In jedem Test wurde die Heilungsreaktion zum selben Zeitpunkt von 8 Wochen gemessen. Dies wurde mit Defekten, die leer gelassen wurden, verglichen. Wenn die synthetische hydrolytisch abbaubare Matrix ohne PTH-Fusionspeptid verwendet wurde, wurde die Heilungsreaktion bei etwa 40% gemessen. Dies bedeutet, dass 40% des ursprünglichen Defektvolumens mit neu gebildetem Knochengewebe gefüllt waren. Dann, wenn 400 μg/ml modifiziertes PTH_1-34-Fusionspeptid verwendet wurden, stieg die Heilungsreaktion auf näherungsweise 60%. Zum Vergleich, wenn die Defekte leer gelassen wurden, wurde näherungsweise 10% mit calcifiziertem Gewebe gefüllt. Diese Daten sind in Tabelle 6 unten gezeigt. Tabelle 6: Heilungsreaktion mit synthetischen Matrices mit und ohne modifiziertes PTH

Behandlung Heilung (% calcifiziertes Gewebe)

leer 10

hydrolytisches Gel 40

hydrolytisches Gel mit 100 μq/ml CPTH 54

hydrolytisches Gel mit 400 μg/ml CPTH 60
Verglichen mit einem leeren Defekt hatte die Zugabe des hydrolytisch abbaubaren PEG-Gels alleine eine große Auswirkung auf die Knochenheilung, wobei die Menge an calcifiziertem Gewebe um 300% mehr wurde. Wenn PTH_1-34 an diese Matrix gebunden wurde, erhöhte sich die Heilung noch mehr, wobei das Ausmaß bis zu 50% höher ist als bei einer alleinigen Verwendung der Matrix, und 500% höher als das Ausmaß der Heilung, das erhalten wurde, wenn der Defekt leer gelassen wurde.
Die im Sequenzprotokoll verwendeten englischen Begriffe haben folgende deutsche Bedeutung:
<120> growth factor modified Protein matrices for tissue engineering – Wachstumsfaktor-modifizierte Proteinmatrices zur Gewebekonstruktion
<213> artificial sequence – künstliche Sequenz
<223> bidomain peptide – Zweidomänen-Peptid dansyl leucine – dansyliertes Leucin SEQUENCE LISTING

Claims

Fusionspeptid aufweisend eine erste Domäne, die Nebenschilddrüsenhormon (PTH) aufweist, und eine zweite Domäne, die eine Substratdomäne aufweist, die so mit einem Fibrin-Matrixmaterial oder mit einem synthetischen Matrixmaterial kovalent vernetzbar ist, dass das Fusionspeptid durch die zweite Domäne an die Matrix gebunden werden kann.
Fusionspeptid nach Anspruch 1, wobei die Matrix Fibrin ist und die zweite Domäne eine Transglutaminase-Substratdomäne aufweist.
Fusionspeptid nach Anspruch 2, wobei die zweite Domäne eine Faktor XIIIa-Substratdomäne aufweist.
Fusionspeptid nach Anspruch 3, wobei die Faktor XIIIa-Substratdomäne SEQ ID NO: 12 aufweist.
Fusionspeptid nach Anspruch 1, wobei die Matrix eine synthetische Matrix ist und die zweite Domäne mindestens ein Cystein aufweist.
Fusionspeptid nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das PTH ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus PTH 1-84, PTH 1-38, PTH 1-34, PTH 1-31 und PTH 1-25 besteht.
Fusionspeptid nach Anspruch 6, wobei das PTH PTH 1-34 ist.
Fusionspeptid nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, außerdem aufweisend eine Abbau-Stelle zwischen der ersten und der zweiten Domäne.
Fusionspeptid nach Anspruch 8, wobei die Abbau-Stelle eine enzymatische oder hydrolytische Abbau-Stelle ist.
Fusionspeptid nach Anspruch 8, wobei die Abbau-Stelle eine enzymatische Abbau-Stelle ist, die durch ein Enzym gespalten wird, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Plasmin und Matrix-Metalloproteinase besteht.
Kit aufweisend das Fusionspeptid nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10.
Kit nach Anspruch 1, außerdem aufweisend Fibrinogen, Thrombin und eine Calcium-Quelle.
Kit nach Anspruch 11, wobei das Kit außerdem ein vernetzendes Enzym aufweist.
Matrix, die zum Wachsen von Zellen oder zum Einwachsen von Zellen geeignet ist, aufweisend das Fusionspeptid nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Fusionspeptid kovalent an die Matrix gebunden ist.
Matrix nach Anspruch 14, wobei die Matrix Fibrin ist.
Matrix nach Anspruch 14, wobei die Matrix durch eine Additionsreaktion vom Michael-Typ zwischen einem ersten Vorläufermolekül, das n nucleophile Gruppen aufweist, und einem zweiten Vorläufermolekül, das m electrophile Gruppen aufweist, wobei n und m mindestens zwei sind und die Summe n + m mindestens fünf ist, gebildet ist.
Matrix nach Anspruch 16, wobei die electrophilen Gruppen konjugierte ungesättigte Gruppen sind und die nucleophilen Gruppen aus der Gruppe, die aus Thiolen und Aminen besteht, ausgewählt sind.
Matrix nach Anspruch 14, wobei die Matrix Polyethylenglykol aufweist.
Verfahren zur Herstellung einer Matrix, aufweisend Bereitstellen mindestens eines Matrixmaterials, das zur Bildung einer vernetzten Matrix in der Lage ist, wobei das Matrixmaterial ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus Proteinen und synthetischen Materialien besteht, Zugeben des Fusionspeptids nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10 zu dem Matrixmaterial, und Vernetzen des Matrixmaterials dergestalt, dass das Fusionspeptid durch die zweite Domäne an die Matrix gebunden wird.