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DE69535618T2 - Rekombinanter aviärer Lebendimpfstoff, der einen aviären Herpesvirusvektor nutzt - Google Patents

Rekombinanter aviärer Lebendimpfstoff, der einen aviären Herpesvirusvektor nutzt Download PDF

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DE69535618T2
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Michel Bublot
Raphael Darteil
Carole Duinat
Eliane Laplace
Michel Riviere
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Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verwendung eines HVT-Virus (Herpes Virus of Turkey; Putenherpesvirus), in dem durch genetische Rekombination mindestens eine Nukleotidsequenz inseriert wurde, die für ein antigenes Polypeptid eines pathogenen Agens aus einem Vogel kodiert und dieses exprimiert, für die Herstellung eines Impfstoffs zur Anwendung bei Vögeln, unter Bedingungen mit dem Zweck, eine Immunisierung sicher zu stellen, die zu einem wirksamen Schutz des geimpften Tiers gegen das pathogene Agens führt.
  • Es sind bereits eine gewisse Anzahl rekombinanter Vogelvirusvektoren mit der Absicht vorgeschlagen worden, Vögel gegen aviäre pathogene Agenzien, insbesondere pathogene Viren zu impfen, worunter die Viren der Marek'schen-Krankheit (MDV), der Newcastle-Krankheit (NDV), der infektiösen Laryngotracheitis (ILTV), der Gumboro-Krankheit (infektiöse Bursitis, IBDV), der infektiösen Bronchitis (IBV) und der aviären Anämie (CAV) fallen.
  • Die verwendeten Virusvektoren umfassen Avipox, insbesondere Fowlpox ( EP-A-0 517 292 ; N. -G. Heine et al., Arch. Virol. 1993, 131, 277-292; D. B. Boyle et al., Veterinary Microbiology 1994, 41, 173-181; C. D. Bayliss et al., Arch. Virol. 1991, 120, 193-205), die Marek-Viren, insbesondere die Serotypen 2 und 3 (HVT) ( WO-A-87 04463 ; WO-A-89 01040 ; WO-A-93 25665 ; EP-A-0 513 921 ; J. McMillen, Poultry Condemnation Meeting, October 1994, 359-363; P. J. A. Sondermeijer et al., Vaccine 1993, 11, 349-357; R. W. Morgan et al., Avian Diseases 1992, 36, 858-870, und 1993, 37, 1032-1040) oder auch die ILTV-Viren und das aviäre Adenovirus.
  • Wenn diese rekombinanten Viren zur Impfung verwendet werden, induzieren sie einen Schutz in unterschiedlicher Höhe, der im allgemeinen schwach oder unvollständig ist, selbst wenn in besonderen, seltenen Fällen ein bedeutender Schutz gezeigt werden kann.
  • Unter dem Schutz, der sich durch lebende, rekombinante Vogelimpfstoffe am schwierigsten sicher stellen lässt, befindet sich der gegen das Virus der Gumboro-Krankheit oder das IBDV-Virus. Wenn es auch klassische, abgeschwächte oder inaktivierte Lebendimpfstoffe gibt, die gegen diese Krankheit wirksam sind, ist tatsächlich noch von keinem rekombinanten Lebendimpfstoff eine angemessene Wirksamkeit bewiesen worden.
  • Das Genom des Virus' der Gumboro-Krankheit besteht aus einer doppelsträngigen RNA. Das größte Segment (Segment A) kodiert für ein Polyprotein mit 115 kDa, das sich sekundär in drei Proteine VP2 (41 kDa), VP4 (28 kDa), VP3 (32 kDa) aufspaltet. VP4 ist eine Protease, die an der Reifung des Polyproteins mit 115 kDa beteiligt ist. Die Position der Spaltungsstelle zwischen VP2 und VP4 ist nur ungefähr bestimmt (M. Jagadish, J. Virol. 1988, 62, 1084-1 087). Das Protein VP2 ist ein Immunogen, das neutralisierende Antikörper und einen Schutz gegen die Gumboro-Krankheit induziert.
  • Es ist bereits vorgeschlagen worden, Gene, die für immunogene IBDV-Proteine kodieren, in verschiedene Lebendvektoren zu inserieren: EP-A-0 517 292 (Insertion der für VP2 oder das Polyprotein in einem Avipox kodierenden Sequenzen); C. D. Bayliss 1991, H. -G. Heine 1993 und D. B. Boyle 1994, supra (VP2 in Fowlpox).
  • Die Viren der Marek'schen-Krankheit sind ebenfalls in der WO-A-90 02802 und WO-A-90 02803 (verschiedene Insertionsstellen wie etwa gC, TK, RR1, RR2), in den französischen Patentanmeldungen Nr. 90 03105 (RR2) und 90 11146 (U53) wie auch insbesondere in den Patentanmeldungen WO-A-87 04463 und WO-A-89 01040 (BamHI #16 und #19) und WO-A-93 25655 (US2) vorgeschlagen worden.
  • R. J. Isfort et al. (Virology 1994, 203, 125-133) haben eine bestimmte Anzahl an Integrationsstellen des Retrovirus in dem HVT-Genom bestimmt, Stellen, die sich in den Restriktionsfragmenten BamHI F, A und 1 befinden. Andere Beispiele von Insertionsstellen im HVT-Genom sind in der EP-A-0 431668 (US-Region) und EP-4 200 384 (gA) vorgeschlagen worden.
  • FR-A-2 697 534 beschreibt ein rekombinantes HVT, dass eine Sequenz inseriert in der US2 (Unique Short Sequence, BamHI A) unter der Kontrolle des HCMV IE Promotors exprimiert, die für das VP2 Protein von IBDV kodiert. Das rekombinante Virus exprimiert das Protein in vitro, aber wird in einem Vakzine-Protokoll in vivo nicht nachgewiesen.
  • DARTEIL, R. et al., Virology, Bd. 211, Nr. 2, Februar 1995, Seiten 481-490, berichtet die Verwendung von zwei rekombinanten HVT, die das VP2 Protein von IBDV inseriert an einer nicht-essentiellen Stelle des HVT-Genoms im Bam HI Fragment K1, d. h. in der kleinen Untereinheit des Gens der Ribonukleotidreduktase (RR2) ohne exogenen Promotor (Virus vHVT001), bzw. an einer Stelle des g1 Gens unter der Kontrolle des humanen CMV immediate early (IE)-Promotors exprimieren, für die Herstellung eines aviären, rekombinanten Lebendimpfstoffs, der für die Vakzination bzw. Impfung von ein Tag alten Küken und Adulten gegen das Virus der Gumboro-Krankheit (IBDV) bestimmt ist. Die ein Tag alten SPF-Küken wurden durch einmalige intramuskuläre Injektion mit variablen Dosen geimpft und in einem Alter von 21 Tagen durch intraokuläre Applikation eines IBDV Virus' des Stammes 52/70 auf die Probe gestellt. Die Ergebnisse wurden dahingehend mit denen von Vergleichstieren verglichen, die nicht geimpft oder mit dem inaktivierten Impfstoff GUMBORIFFA (ND) geimpft wurden, ob sie einen Schutz durch das rekombinante Virus vHVT002 aufwiesen, der eine Produktion von neutralisierenden anti-VP2-Antikörpern induzieren und die Mortalität sowie die klinischen Läsionen reduzieren kann, da vHVT001 keinen teilweisen Schutz bietet. Der Vergleich der zwei rekombinanten HVT-Viren zeigte, dass die Insertionsstelle des exogenen Gens nebst des verwendeten Promotors zur Steuerung der Expression des Gens zwei wichtige Parameter sind.
  • Verschiedene Promotoren, worunter sich die allgemein im Handel erhältlichen befinden, wurden bei verschiedenen Konstruktionen des Standes der Technik verwendet, darunter die Promotoren PRV gX, HCMV IE (humaner (CMV) Immediate-early), Herpes simplex alpha-4, FPV P. E/L (Fowlpox-Promotor) (N. Heine et al., Arch. Virol. 1993, 131, 277-292), P7.5 (C. Bayliss et al., Arch. Virol. 1991, 120, 193-205) und P11 des Virus des Impfstoffs (D. Boyle et al., Vet. Microb. 1994, 41, 173-181), der aus der LTR-Sequenz des RSV-Virus (Rous Sarcoma Virus) stammt, SV40 early, sowie MDV- oder HVT-Promotoren, wie etwa die Promotoren der Gene gB, gC, TK, RR2 usw., ohne dass dabei, insbesondere im Fall von Konstruktionen in HVT, eine gewisse Regelmäßigkeit festgestellt werden konnte. Die Sequenzen bestimmter Promotoren können die Replikation der rekombinanten HVT- oder MDV-Vektoren hemmen (D. R. Marshall et al., J. Vir. Meth. 1992, 40, 195-204, und Virology 1993, 195, 638-648). Unter den angeführten Promotoren haben eine gewisse Anzahl, wie zum Beispiel SV40, LTR RSV und PRV gX, ebenso wie gewisse Promotoren, die bestimmten Genen des Marek-Virus zu eigen sind, insbesondere des Serotyps 3, eine gewisse Wirksamkeit gezeigt.
  • Es verbleibt ein Bedürfnis auf diesem Gebiet, einen anderen HVT-Vektor für die Vakzination in ovo, für ein Tag alte Küken und für Adulte zu entwickeln, um ein breiteres Vakzinationsspektrum zur Verfügung zu stellen, und um einen angemessenen Schutz gegen verschiedene aviäre Pathogene zu entwickeln.
  • Die Erfindung ermöglicht das Bereitstellen eines rekombinanten Lebendimpfstoffs auf der Grundlage eines HVT-Vektors, in den mindestens eine Sequenz inseriert ist, die für ein aviäres Immunogen, insbesondere das Protein VP2 des IBDV, kodiert. Ein derartiger Impfstoff, der eine für VP2 kodierende Sequenz umfasst, sollte einen zufriedenstellenden Schutz der Tiere gegen die Gumboro-Krankheit, nämlich einen Schutz gegenüber der Sterblichkeit und Läsionen der Bursa fabricius darstellen.
  • Die vorliegende Erfindung hat die Verwendung eines aviären Herpesvirus HVT für die Herstellung eines rekombinanten aviären Lebendimpfstoffs zum Gegenstand, das mindestens eine Nukleotidsequenz umfasst, die für ein antigenes Polypeptid eines pathogenen Agens aus einem Vogel kodiert und dieses exprimiert und die in das Restriktionsfragment BamHI 1 des HVT, bekanntlich in eine der drei intergenen Bereiche 1, 2 und 3, insbesondere unter der Kontrolle des Immediate-early-Promotors des CMV inseriert ist. Das Fragment BamHI 1 des HVT ist von A. E. Buckmaster in J. Gen. Virol. 1988, 69, 2033-2042 vorgestellt worden. Diese intergenen Bereiche entsprechen, bezogen auf den Stamm HVT, insbesondere auf den, dem die Nukleotidsequenz der 1 entspricht, den Nukleotiden der 1 1213 bis 1383 für das Intergen 1, 1942 bis 2283 für das Intergen 2, und 3082 bis 3569 für das Intergen 3.
  • Unter einer Insertion in die Insertionsregion versteht man insbesondere eine Insertion ohne eine Deletion oder mit einer Deletion einiger Basen der intergenen Bereiche.
  • Unter dem CMV Immediate-early-(IE)-Promotor versteht man sowohl das in den Beispielen angegebene Fragment als auch seine Unterfragmente, die dieselbe Promotoraktivität bewahrt haben.
  • Der Promotor CMV IE kann der humane Promotor (HCMV IE) oder der murine Promotor (MCMV IE) oder auch ein CMV IE Promotor anderer Herkunft sein, zum Beispiel aus der Ratte oder dem Meerschweinchen.
  • Die zum Exprimieren in den Marek-Vektor inserierte Nukleotidsequenz kann jede Sequenz eines aviären pathogenen Agens sein, die für ein antigenes Polypeptid kodiert, und die in der Lage ist, wenn sie einmal unter den von der Erfindung bereitgestellten Bedingungen exprimiert ist, eine Immunisierung sicherzustellen, die zu einem wirksamen Schutz des geimpften Tiers gegen das pathogene Agens führt. Man kann somit unter den Bedingungen der Erfindung die für die interessierenden Antigene für eine vorgegebene Krankheit kodierenden Nukleotidsequenzen inserieren.
  • Die erfindungsgemäß erhaltenen Impfstoffe sind für Impfung in ovo, 1 Tag alter oder älterer Küken oder von Ausgewachsenen (Adulten) bestimmt.
  • Die Erfindung kann insbesondere zur Insertion einer Nukleotidsequenz benützt werden, die zweckdienlich für das Polypeptid VP2 des IBDV-Virus kodiert. Man erhält auf diese Weise einen rekombinanten Lebendimpfstoff, der außer einem Schutz gegen die Marek-Krankheit einen zufriedenstellenden Schutz gegen die Gumboro-Krankheit sicherstellt. Falls gewünscht, kann man auch eine Sequenz inserieren, die für ein anderes IBDV-Antigen wie etwa VP3 oder auch das Polyprotein VP2 + VP4 + VP3 kodiert, wobei diese anderen Möglichkeiten nicht bevorzugt sind.
  • Der rekombinante Impfstoff gegen die Gumboro-Krankheit liegt vorzugsweise zu 10 bis 104 pfu/Dosis vor.
  • Andere bevorzugte Fälle der Erfindung sind die Insertion von Nukleotidsequenzen, die für die Antigene des Virus der Marek-Krankheit, insbesondere die Gene gB, gC, gD und gH + gL ( WO-A-90 02803 ), des Virus' der Newcastle-Krankheit, insbesondere die Gene F und NH, des Virus der infektiösen Bronchitis (IBV), insbesondere die Gene S und M (M. Sinns et al., J. Gen. Virol. 1985, 66, 719-726; M. Boursnell et al., Virus Research 1984, 1, 303-313), des Virus' der aviären Anämie (CAV), insbesondere VP1 (52 kDa) + VP2 (24 kDa) (N. H. M. Noteborn et al., J. Virol., 1991, 65, 3131-3139) und des Virus' der infektiösen Laryngotracheitis (ILTV), insbesondere gB ( WO-A-90 02802 ), gC, gD und gH + gL kodieren.
  • Die Dosen sind vorzugsweise dieselben wie die für den Gumboro-Impfstoff.
  • Gemäß einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung verbindet man mit dem Promotor CMV IE einen weiteren Promotor in der Art, dass die Promotoren den entgegen gesetzten Transkriptions-Sinn aufweisen, was es gestattet, in die Insertionszone zwei Nukleotidsequenzen, die eine in Abhängigkeit vom Promotor CMV IE, die andere in der des verbundenen Promotors, zu inserieren. Diese Konstruktion ist durch die Tatsache bemerkenswert, dass die Anwesenheit des Promotors CMV IE, und insbesondere seines aktivierenden Teils (Verstärker), die durch den verbundenen Promotor induzierte Transkription aktiviert. Ein bevorzugter verbundener Promotor ist der Promotor Marek RNA 1.8, dessen Transkriptionsaktivität unter diesen Bedingungen ungefähr die 4,4-fache ist.
  • Ein interessanter Fall der Erfindung ist ein Impfstoff, der eine Nukleotidsequenz, die unter der Kontrolle des CMV IE für das VP2 des IBDV kodiert, und eine Nukleotidsequenz umfasst, die für ein Antigen einer anderen Vogelkrankheit, insbesondere die weiter oben angeführten, unter der Kontrolle des anderen Promotors kodiert.
  • Man kann auch zwei Promotoren CMV IE unterschiedlicher Herkunft in Kopf-Schwanz-Anordnung zusammenstellen.
  • Der Promotor RNA 1.8 kann auch allein anstelle des Promotors CMV IE, insbesondere für Impfstoffe gegen die Marek'sche-Krankheit, die Newcastle-Krankheit, die infektiöse Laryngotracheitis, die infektiöse Bronchitis und die aviäre Anämie verwendet werden.
  • Die Erfindung wird nun mit Hilfe der nicht eischränkenden Ausführungsbeispiele genauer beschrieben, wobei auf die Zeichnungen Bezug genommen wird, worin:
  • Aufstellung der Zeichnungen und der Sequenzen für die Konstruktionen in den intergenen Stellen
  • 1: Sequenz des Fragments NVT BamHI 1
  • 2: Plasmid pEL039
  • 3: Plasmid pEL077
  • 4: Plasmid pEL079
  • 5: Plasmid pEL076
  • 6: Plasmid pEL078
  • 7: Plasmid pEL054
  • 8: Plasmid pEL055
  • 9: Plasmid pEL062
  • 10: Plasmid pEL066
  • 11: Plasmid pEL022
  • 12: Plasmid pEL023
  • 13: Plasmid pEL024
  • 14: Plasmid pCMVβ
  • 15: Plasmid pEL026
  • 16: Plasmid pEL090
  • 17: Plasmid pCD002
  • 18: Plasmid pCD009
  • 19: Plasmid pEL068
  • 20: Plasmid pEL070
  • 21: Plasmid pEL091
  • 22: Plasmid pCD011
  • 23: Plasmid pCD020
  • 24: Plasmid pEL092
  • 25: Sequenz des Gens NDV HN
  • 26: Plasmid pEL028
  • 27: Plasmid pEL029 bis
  • 28: Plasmid pEL030
  • 29: Plasmid pEL032
  • 30: Plasmid pEL093
  • 31: Plasmid pEL033
  • 32: Plasmid pEL034
  • 33: Plasmid pEL094
  • 34: Sequenz des Promotors MDV RNA 1.8 kbp
  • 35: Plasmid pBS002
  • 36: Plasmid pEL069
  • 37: Plasmid pEL080
  • 38: Plasmid pEL081
  • 39: Plasmid pEL095
  • 40: Plasmid pEL098
  • Aufstellung der Sequenzen SEQ ID für die Konstruktionen in den intergenen Stellen
    • SEQ ID N° 1 Sequenz des Fragments HVT BamHI 1
    • SEQ ID N° 2 Oligonukleotid EL102
    • SEQ ID N° 3 Oligonukleotid EL161
    • SEQ ID N° 4 Oligonukleotid EL147
    • SEQ ID N° 5 Oligonukleotid EL162
    • SEQ ID N° 6 Oligonukleotid EL154
    • SEQ ID N° 7 Oligonukleotid EL163
    • SEQ ID N° 8 Oligonukleotid EL164
    • SEQ ID N° 9 Oligonukleotid EL165
    • SEQ ID N° 10 Oligonukleotid EL132
    • SEQ ID N° 11 Oligonukleotid EL133
    • SEQ ID N° 12 Oligonukleotid MB070
    • SEQ ID N° 13 Oligonukleotid MB071
    • SEQ ID N° 14 Oligonukleotid CD001
    • SEQ ID N° 15 Oligonukleotid CD002
    • SEQ ID N° 16 Oligonukleotid CD003
    • SEQ ID N° 17 Oligonukleotid CD004
    • SEQ ID N° 18 Sequenz des Gens NDV HN
    • SEQ ID N° 19 Oligonukleotid EL071
    • SEQ ID N° 20 Oligonukleotid EL073
    • SEQ ID N° 21 Oligonukleotid EL074
    • SEQ ID N° 22 Oligonukleotid EL075
    • SEQ ID N° 23 Oligonukleotid EL076
    • SEQ ID N° 24 Oligonukleotid EL077
    • SEQ ID N° 25 Sequenz des Promotors MDV RNA 1.8 kbp
    • SEQ ID N° 26 Oligonukleotid MB047
    • SEQ ID N° 27 Oligonukleotid MB048
    • SEQ ID N° 28 Oligonukleotid MB072
  • 2. Beispiele
  • Alle Plasmidkonstruktionen wurden durch Verwenden der von Sambrook J. et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Ausgabe. Cold Spring Harbor Laboratory. New York. 1989) beschriebenen Standardtechniken der Molekularbiologie ausgeführt. Alle in der vorliegenden Erfindung verwendeten Restriktionsfragmente wurden unter Verwenden des Kits „Geneclean" (BIOl0l Inc. La Jolla, CA) isoliert.
  • Das als Elternvirus verwendete Virus ist der Stamm FC126 des Putenherpesvirus (HVT), der von Dr. Witter vom Regional Poultry Research Laboratory (USDA, East Lansing, Michigan) aus einer Herde 23 Wochen alter Puten isoliert wurde (Witter R. L. et al., Am. J. Vet. Res. 1970, 31, 525-538). Die Kulturbedingungen dieses Virus sind die an anderer Stelle beschriebenen ( französische Patentanmeldung 90 03105 ).
  • Beispiel 1: Extraktion der DNA des Virus der Marek'schen-Krankheit
  • Das Gesamtblut eines 7 Tage alten Versuchshühnchens mit dem Stamm MDV RB1B wird mit einer Spritze über einem Antikoagulans (Heparinlösung mit 100 IE/ml) 14 Tage nach der Infektion isoliert. Dieses Blut wird anschließend 15 Minuten bei 30 g und Raumtemperatur zentrifugiert. Das Plasma sowie der „buffy coat" werden entnommen und in steriler PBS verdünnt, um ein Endvolumen von 10 ml zu erhalten. Nach 15 Minuten Zentrifugieren bei 150 g wird das Zellpellet in 2 ml Kulturmedium 199 (Gibco-BRL Cat# 042-011 83M), das 2% fetales Kälberserum enthält (SVF), erneut suspendiert.
  • Die gesamte DNA der infizierten Lymphozyten wird anschließend gemäß der von R. Morgan et al. (Avian Diseases, 1990, 34, 345-351) beschriebenen Technik extrahiert und kann direkt als Matrize für die PCR-Versuche dienen. Zur Klonierung der Genomfragmente des MDV-Virus wurde der Stamm RB1B auf CEP kultiviert und die Virus-DNA wurde aus den gereinigten Virusteilchen wie von Lee Y. et al. (J. Gen. Virol. 1980, 51, 245-253) beschrieben hergestellt.
  • Beispiel 2: Herstellung der Genom-DNA des MCMV-Virus (Mouse Cyto-MegaloVirus)
  • Der MCMV-Virusstamm Smith wurde von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA (ATCC Nr. VR-194) erhalten. Dieses Virus wurde auf Embryonenzellen der Maus Balb/C kultiviert und die Virus-DNA dieses Virus wurde wie bei Ebeling A. et al. (J. Virol. 1983, 47, 421-433) beschrieben hergestellt.
  • Beispiel 3: Herstellung der Genom-DNA des HVT-Virus für die Transfektionsversuche:
  • Die zu den Transfektionsversuchen verwendete Virus-DNA wurde gemäß der von R. Morgan et al. (Avian Diseases, 1990, 34, 345-351) beschriebenen Technik aus einer mit dem Stamm FC126 des NVT-Virus infizierten sekundären CEP-Kultur (CEP II) hergestellt.
  • Beispiel 4: Beschreibung des Fragments BamHI I
  • Das Fragment BamHI I mit 5,8 kbp des HVT-Virusstamms FC126 (Igarashi et al., J. Gen. Virol., 1989, 70, 1789-1804) wurde durch Geneclean isoliert und in die BamHI-Stelle des Vektors pBS-SK+ kloniert, um das Plasmid pEL037 zu ergeben. Die Sequenz dieses Fragments wurde in Gänze aufgestellt (5838 bp) (1 und SEQ ID Nr. 1). 6 offene Leserahmen (= „open reading frames" = „ORF") wurden in dieser Sequenz identifiziert. Die Untersuchung der möglicherweise durch diese ORF kodierten Proteine hat gezeigt, dass gewisse Proteine davon eine Homologie mit Proteinen zeigen, die durch ORF kodiert werden, die bei anderen alpha-Herpesviren vorhanden sind. Der erste ORF (ORF1) (Position 676 bis Position 1209 auf der SEQ ID N° 1) zeigt eine Homologie mit den ORF HSV-1 UL55, EHV-1 Gen 4 und VZV Gen 5 und kodiert für ein theoretisches HVT-Protein UL55 aus 178 Aminosäuren (aa). Der ORF2 befindet sich an Position 1941 bis Position 1387 auf der SEQ ID N° 1 und kodiert für ein Protein aus 185 aa, das zu dem durch den ORF3 EHV-1 Gen 3 kodierten Protein homolog ist. Der ORF3 ist unvollständig. Er befindet sich an Position 5838 bis 3573 auf der SEQ ID N° 1 und er zeigt eine Homologie mit dem ORF 21 des MDV (Ross N. et al., Virus Genes, 1993, 7, 33-51). Drei andere auf dieser Sequenz identifizierte ORF: ORF4 (Position 1403 bis Position 1957 (Protein aus 185 aa)), ORF5 (Position 3081 bis Position 2287 (Protein aus 265 aa)) und ORF6 (unvollständig; Position 479 bis Position 1) besitzen keine Homologie in den Sequenzbanken. Der Genomaufbau des Fragments BamHI I des HVT-Virusstamms FC126 ist derart, dass es 3 intergene Regionen gibt, die als Insertionsstellen für die Expressionskassetten von Fremdgenen verwendet werden können:
    Eine intergene Region (intergene Region 1) besteht zwischen dem ORF1 und dem ORF 265 aa. Eine zweite intergene Region (intergene Region 2) besteht zwischen dem ORF2 und dem ORF 265 aa. Eine dritte intergene Region (intergene Region 3) besteht zwischen dem ORF 265 aa und dem ORF3 HVT. Diese drei Regionen sind zum Inserieren von Expressionskassetten verwendbar, ohne die in-vivo-Replikation der so erhaltenen rekombinanten HVT-Viren zu beeinflussen. Beispiele von Donor-Plasmidkonstrukten für die intergenen Regionen 1, 2 und 3 werden nachstehend beschrieben:
  • Beispiel 5: Konstruktion des Donor-Plasmids für die intergene Region 1
  • Das Plasmid pEL037 wurde durch BamHI und EcoRI verdaut; um die Fragmente BamHI-EcoRI mit 2672 bp und 2163 bp zu isolieren. Diese Fragmente wurden mit dem Vektor pBS-SK+ ligiert, der zuvor durch BamHI und EcoRI verdaut worden war, um die Plasmide pEL039 mit 5167 bp beziehungsweise pEL040 mit 6104 bp zu ergeben. Das Plasmid pEL039 (2) wurde durch BamHI und PstI verdaut, um das Fragment BamHI-PstI mit 997 bp (Fragment A) zu ergeben. Eine PCR wurde mit den folgenden Oligonukleotiden:
    Figure 00130001
    und der Matrize pEL039 zum Erzeugen eines Fragments mit 420 bp durchgeführt. Dieses Fragment wurde durch PstI und SalI verdaut, um ein Fragment PstI-SalI mit 250 bp (Fragment B) zu isolieren. Die Fragmente A und B wurden zusammen mit dem Vektor pBSII-SK+ (Stratagene) ligiert, der zuvor durch BamHI und SalI verdaut worden war, um das Plasmid pEL077 mit 4160 bp zu ergeben (3). Das Plasmid pEL039 wurde durch BstBI und ScaI verdaut, um ein Fragment BstBI-ScaI (freies Ende) mit 475 bp (Fragment C) zu isolieren. Eine PCR wurde mit den folgenden Oligonukleotiden:
    Figure 00140001
    und der Matrize pEL039 durchgeführt, um ein PCR-Fragment mit 715 bp zu erzeugen. Dieses Fragment wurde durch BstBI und SalI verdaut, um das Fragment BstBI-SalI mit 465 bp (Fragment D) zu isolieren. Die Fragmente C und D wurden zusammen mit dem zuvor durch ApaI verdauten Plasmid pEL077 ligiert, mit Klenow-Polymerase wiederhergestellt und durch SalI verdaut, um das Plasmid pEL079 mit 5082 bp (4) zu ergeben. Dieses Plasmid enthält einen Polylinker EcoRI-SmaI-SalI an der intergenen Stelle 1.
  • Beispiel 6: Konstruktion des Donor-Plasmids für die intergene Region 2
  • Das Plasmid pEL039 (Beispiel 5) wurde durch BstBI und PstI verdaut, um das Fragment BstBI-PstI mit 715 bp (Fragment A) zu isolieren. Eine PCR wurde mit den folgenden Oligonukleotiden:
    Figure 00140002
    und der Matrize pEL039 durchgeführt, um ein PCR-Fragment mit 500 bp herzustellen. Dieses Fragment wurde durch BstBI und SalI verdaut, um das Fragment BstBI-SalI mit 430 bp (Fragment B) zu isolieren. Die Fragmente A und B wurden zusammen mit dem Vektor pBSII-SK+ ligiert, der zuvor durch PstI und SalI verdaut worden war, um das Plasmid pEL076 mit 4081 bp (5) zu ergeben.
  • Eine weitere PCR wurde mit den folgenden Oligonukleotiden:
    Figure 00150001
    und der Matrize pEL039 zum Herstellen eines PCR-Fragments mit 565 bp durchgeführt. Dieses Fragment wurde durch SalI und SspI verdaut, um das Fragment SalI-SspI mit 535 bp zu isolieren. Dieses Fragment wurde mit dem Plasmid pEL076 ligiert, das zuvor durch ApaI verdaut worden war, mit Klenow-Polymerase wiederhergestellt und durch SalI verdaut, um das Plasmid pEL078 mit 4598 bp (6) zu ergeben. Dieses Plasmid enthält einen Polylinker EcoRI-SmaI-SalI in der intergenen Region 2.
  • Beispiel 7: Konstruktion des Donor-Plasmids für die intergene Region 3
  • Das Plasmid pEL040 (siehe Beispiel 5) wurde durch NcoI und SphI unter Isolieren des Fragments NcoI-SphI mit 1468 bp verdaut. Dieses Fragment wurde mit dem Plasmid pUC BM20 (Boehringer Mannheim Cat# 1219235) ligiert, das zuvor durch NcoI und SphI verdaut worden war, um das Plasmid pEL054 mit 4182 bp (7) zu ergeben. Das Plasmid pEL040 wurde mit EcoRI und SphI verdaut, um das Fragment EcoRI-SphI mit 614 bp zu isolieren. Dieses Fragment wurde mit dem Plasmid pUC BM20, das zuvor durch EcoRI und SphI verdaut worden war, unter Ergeben des Plasmids pEL055 mit 3263 bp (8) ligiert. Das Plasmid pEL055 wurde mit EcoRI verdaut, mit Klenow-Polymerase wiederhergestellt, mit sich selbst ligiert, durch HindIII verdaut, mit Klenow-Polymerase wiederhergestellt und schließlich mit sich selbst unter Ergeben des Plasmids pEL062 mit 3279 bp (9) ligiert. Das Plasmid pEL054 wurde durch NcoI und SalI verdaut, um das Fragment NcoI-SalI mit 1492 bp (Fragment A) zu isolieren. Die beiden folgenden Oligonukleotide:
    Figure 00160001
    wurden untereinander hybridisiert, um das Fragment SalI-SphI mit 24 bp (Fragment B) zu erzeugen. Die Fragmente A und B wurden zusammen mit dem Plasmid pEL062, das zuvor durch NcoI und SphI verdaut worden war, unter Ergeben des Plasmids pEL066 mit 4787 bp (10) ligiert. Dieses Plasmid enthielt einen Polylinker EooRI-HindIII-SalI in der intergenen Region 3.
  • Beispiel 8: Konstruktion des Donor-Plasmids pEL090 und Isolierung von vHVT16
  • Das Plasmid pEL004 (= in der französischen Patentanmeldung 92.13108 beschriebenes Plasmid pGH004), das das IBDV-VP2-Gen in Form einer BamHI-HindIII-Kassette enthält, wurde durch BamHI und XbaI verdaut, um das Fragment BamHI-XbaI (verkürztes VP2-Gen) mit 1104 bp zu isolieren. Dieses Fragment wurde in den Vektor pBS-SK+ kloniert, der zuvor mit XbaI und BamHI verdaut worden war, um das Plasmid pEL022 mit 4052 bp (11) zu ergeben. Der Vektor pBS-SK+ wurde durch EcoRV und XbaI verdaut, dann mit sich selbst unter Ergeben von pBS-SK* (modifiziert) ligiert. Das Plasmid pEL004 wurde durch KpnI und HindIII unter Isolieren des Fragments KpnI-HindIII mit 1387 bp verdaut, das das vollständige IBDV-VP2-Gen enthielt. Dieses Fragment wurde in den Vektor pBS-SK* kloniert, der zuvor durch KpnI und HindIII verdaut worden war, um das Plasmid pEL023 mit 4292 bp (12) zu ergeben. Das Plasmid pEL022 wurde durch BamHI und NotI unter Isolieren des Fragments BamHI-NotI mit 1122 bp (Fragment A) verdaut. Das Plasmid pEL023 wurde durch BamHI und NotI unter Isolieren des Fragments BamHI-NotI mit 333 bp (Fragment B) verdaut. Die Fragmente A und B wurden zusammen mit dem Vektor pBS-SK+, der zuvor durch NotI verdaut und mit alkalischer Phosphatase behandelt worden war, unter Ergeben des Plasmids pEL024 mit 4369 bp (23) ligiert. Das Plasmid pEL024 wurde durch NotI unter Isolieren des Fragments NotI-NotI mit 1445 bp verdaut. Dieses Fragment wurde mit dem Plasmid pCMVß (Clontech Cat# 6177-1) (14), das zuvor durch Not' verdaut worden war, unter Ergeben des Plasmids pEL026 mit 5095 bp (15) ligiert. Das Plasmid pEL026 wurde durch EcoRI, SalI und XmnI unter Isolieren des Fragments EcoRI-SalI mit 2428 bp verdaut. Dieses Fragment wurde mit dem Plasmid pEL079 (siehe Beispiel 5), das zuvor durch EcoRI und SalI verdaut worden war, unter Ergeben des Plasmids pEL090 mit 7514 bp (16) ligiert. Dieses Plasmid gestattet die Insertion der Expressionskassette HCMV-IE/IBDV VP2 in die intergene Stelle 1 des HVT-Virus.
  • 24 Stunden alte primäre CEP-Zellen wurden anschließend mit dem folgenden Gemisch transfiziert: 1 pg linearisiertes Plasmid pEL090 + 5 pg HVT-Virus-DNA in 300 μl OptiMEM-Medium (Gibco BRL Cat# 041-01985H) und 100 pg in 300 μl Medium verdünntes LipofectAMINE (Endvolumen des Gemisches = 600 μl). Diese 600 μl wurden anschließend in 3 ml (Endvolumen) Medium verdünnt und auf 3.106 CEP I ausgestrichen. Man beließ das Gemisch 5 Stunden in Kontakt mit den Zellen, entfernte und ersetzte es dann durch 5 ml Kulturmedium. Man ließ die Zellen darauf 3 Stunden bei +37°C kultivieren, dann wurden sie mit Pronase behandelt, mit frischen CEP II gemischt (3:1-Gemisch) und auf 1 Platte mit 96 Vertiefungen gegeben. Man kultivierte diese Platte 3 Tage, dann wurden die Zellen mit Pronase behandelt, mit frischen CEP II gemischt und auf 2 Platten mit 96 Vertiefungen gegeben, wobei eine Anfangsvertiefung zwei Schwestervertiefungen ergibt. Die Platten mit 96 Vertiefungen wurden bis zum Auftreten eines zytopathischen Effekts kultiviert. Nach 72 Stunden Kultur wurde eine der beiden Platten mit 96 Vertiefungen 30 Minuten mit 95%igem Aceton fixiert und es wurde eine indirekte Immunfluoreszenzreaktion (IFI) mit einem monoklonalen Anti-VP2-Antikörper durchgeführt, um nach das Protein VP2 exprimierenden Plaques zu suchen. Die „Schwester"-Vertiefungen der bei der IFI positive Plaques aufweisenden Vertiefungen wurden mit Pronase behandelt, mit frischen CEP II gemischt und in Grenzverdünnung auf Platten mit 96 Vertiefungen aufgebracht. Nach 3 Tagen Kultur wurden die eine zytopathische Wirkung aufweisenden Vertiefungen mit Pronase behandelt, mit CEP II gemischt und erneut auf Platten mit 96 Vertiefungen gegeben, wobei eine Anfangsvertiefung 2 Schwestervertiefungen ergab. 3 Tage danach wurde nach den Protein VP2 exprimierenden Plaques von neuem wie voranstehend durch IFI auf einer der 2 Schwesterplatten durchmustert.
  • Im allgemeinen reichen 4 aufeinanderfolgende Isolierzyklen (Ernten einer Vertiefung, Ausstreichen, Kontrolle durch IFI, Umsetzen einer Schwestervertiefung...) zum Erhalten rekombinanter Viren aus, deren gesamte Nachkommenschaft eine spezifische Fluoreszenz zeigt. Ein Virusplaque, der bei der IFI mit einem monoklonalen Anti-VP2-Antikörper 100% positive Plaques ergeben hatte, wurde vHVT16 genannt. Die Genom-DNA dieses rekombinanten Virus wurde auf molekularer Ebene durch klassische PCR-Techniken und Southern Blot unter Verwenden geeigneter Oligonukleotide und DNA-Sonden charakterisiert.
  • Beispiel 9: Konstruktion des Donor-Plasmids pEL091 und Isolierung von vHVT17
  • Das Plasmid pCMVß (14) wurde durch SalI und SmaI unter Isolieren des Fragments SalI-SmaI mit 3679 bp verdaut, das sowohl das Gen lacZ als auch das Polyadenylierungssignal des späten Gens des SV40-Virus enthielt. Dieses Fragment wurde in den Vektor pBS-SK+, der zuvor durch SalI und EcoRV verdaut worden war, unter Ergeben des Plasmids pCD002 mit 6625 bp (17) ligiert. Dieses Plasmid enthält das Reportergen lacZ, es befindet sich jedoch kein Promotor stromaufwärts dieses Gens. Die Virusgenom-DNA des MCMV-Virus wurde wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt und durch PstI unter Isolieren des Fragments PstI-PstI mit 2285 bp verdaut. Dieses Fragment wurde in den Vektor pBS-SK+, der zuvor durch PstI verdaut und mit alkalischer Phosphatase behandelt worden war, unter Ergeben des Plasmids pCD004 kloniert. Das Plasmid pCD004 wurde durch HpaI und PstI unter Isolieren des Fragments HpaI-PstI mit 1389 bp verdaut, das die Promotor-/Aktivatorregion des Immediateearly-Gens des murinen Cytomegalovirus (Murine CytoMegaloVirus = MCMV) enthielt (Dorsch-Häsler K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1985, 82, 8325-8329, und Patentanmeldung WO-A-87/03905 ). Dieses Fragment wurde in das zuvor durch PstI und SmaI verdaute Plasmid pCDOO2 unter Ergeben des Plasmids pCD009 mit 8007 bp (18) kloniert.
  • Ein doppelsträngiges Oligonukleotid wurde durch Hybridisierung der beiden folgenden Oligonukleotide erhalten:
    Figure 00190001
  • Dieses doppelsträngige Oligonukleotid wurde in den zuvor durch KpnI und SacI verdauten Vektor pBS-SK+ unter Ergeben des Plasmids pEL067 ligiert. Das Plasmid pCD009 wurde durch PstI und SpeI unter Isolieren des Fragments PstI-SpeI mit 1396 bp verdaut. Dieses Fragment wurde mit dem zuvor mit PstI und SpeI verdauten Plasmid pEL067 unter Ergeben des Plasmids pEL068 (19) ligiert. Das Plasmid pEL026 (siehe Beispiel 8) wurde durch HindIII und SalI unter Isolieren des Fragments HindIII-SalI mit 235 bp (Fragment B) verdaut. Die Fragmente A und B wurden zusammen mit dem zuvor durch NotI und SalI verdauten Plasmid pEL068 unter Ergeben des Plasmids pEL070 mit 5908 bp (20) ligiert. Das Plasmid pEL070 wurde durch EcoRI, SalI und XmnI unter Isolieren des Fragments EcoRI-SalI mit 3035 bp verdaut. Dieses Fragment wurde mit dem zuvor durch EcoRI und SalI verdauten Plasmid pEL079 (siehe Beispiel 5) unter Ergeben des Plasmids pEL091 mit 8109 bp (21) ligiert. Dieses Plasmid gestattet die Insertion der Expressionskassette MCMV-IE/IBDV VP2 in die intergene Stelle 1 des HVT-Virus.
  • Eine wie in Beispiel 8 beschrieben durchgeführte Co-Transfektion mit dem Plasmid pEL091 und der Genom-DNA des HVT-Virus führte zur Isolierung und Reinigung von rekombinantem vHVT1 7.
  • Beispiel 10: Konstruktion des Donor-Plasmids pEL092 und Isolierung von vHVT18
  • Das Fragment EcoRI-SalI mit 3,9 kbp der Genom-DNA des MDV-Virusstamms RB1B, der das MDV-Gen gB enthält (Sequenz veröffentlicht von Ross N. et al., J. Gen. Virol. 1989, 70, 1789-1 804), wurde mit dem zuvor durch EcoRI und SalI verdauten Vektor pUC13 unter Ergeben des Plasmids pCD007 ligiert. Dieses Plasmid wurde mit SacI und XhoI unter Isolieren des Fragments SacI-XhoI mit 2260 bp (zentraler Teil des Gens gB = Fragment A). Eine PCR wurde mit den folgenden Oligonukleotiden:
    Figure 00210001
    und der Matrize pCD007 unter Erzeugen eines PCR-Fragments mit 222 bp durchgeführt. Dieses Fragment wurde durch KpnI und XbaI unter Isolieren eines Fragments KpnI-XbaI mit 190 bp (5'-Ende des Gens gB = Fragment B) verdaut. Eine weitere PCR wurde mit den folgenden Oligonukleotiden:
    Figure 00210002
    und der Matrize pCD007 unter Erzeugen eines PCR-Fragments mit 195 bp durchgeführt. Dieses Fragment wurde durch SacI und SacII unter Isolieren des Fragments SacI-SacII mit 162 bp (3'-Ende des Gens gB = Fragment C) verdaut. Die Fragmente A, B und C wurden zusammen mit dem zuvor durch KpnI und SacI verdauten Vektor pBS-SK+ unter Ergeben des Plasmids pCD011 mit 5485 bp (22) ligiert. Das Plasmid pCD011 wurde durch NotI unter Isolieren des Fragments NotI-NotI mit 2608 bp (gesamtes MDV-gB-Gen) verdaut. Dieses Fragment wurde mit dem zuvor durch NotI verdauten und mit alkalischer Phosphatase behandelten Plasmid pCMVß unter Ergeben des Plasmids pCD020 mit 6299 bp (23) verdaut. (In diesem Plasmid ist das MDV-gB-Gen durch das lacZ-Gen ersetzt.) Das Plasmid pCD020 wurde durch EcoRI und SalI unter Isolieren des Fragments EcoRI-SalI mit 3648 bp verdaut. Dieses Fragment wurde mit dem zuvor durch EcoRI und SalI verdauten Plasmid pEL079 (siehe Beispiel 5) unter Ergeben des Plasmids pEL092 mit 8718 bp (24) ligiert. Dieses Plasmid gestattet die Insertion der Expressionskassette HCMV-IE/MDV-gB in die intergene Stelle 1 des HVT-Virus.
  • Eine wie in Beispiel 8 beschrieben durchgeführte Co-Transfektion mit dem Plasmid pEL092 und der Genom-DNA des HVT-Virus führte zur Isolierung und der Reinigung von rekombinantem vHVT18.
  • Beispiel 11: Konstruktion des Donor-Plasmids pEL093 und Isolierung von vHVT19
  • Der Aufbau einer komplementären DNA-Bank des Genoms des Virus der Newcastle-Krankheit (NDV), Stamm Texas, wurde wie von Taylor J. et al. (J. Virol., 1990, 64, 1441-1450) beschrieben durchgeführt. Ein das Ende des Fusionsgens (F), die Gesamtheit des Hämagglutinin-Neuraminidase-Gens (HN) und den Anfang des Polymerasegens enthaltender pBR322-Klon wurde als pHN01 identifiziert. Die Sequenz des auf diesem Klon vorhandenen NDV-HN-Gens wird in 25 dargestellt (SEQ ID N° 18). Das Plasmid pHN01 wurde durch SphI und XbaI unter Isolieren des Fragments SphI-XbaI mit 2520 bp verdaut. Dieses Fragment wurde mit dem zuvor durch SphI und XbaI verdauten Vektor pUC19 unter Ergeben des Plasmids pHN02 mit 5192 bp ligiert. Das Plasmid pHN02 wurde mit ClaI und PstI unter Isolieren des Fragments ClaI-PstI mit 700 bp (Fragment A) verdaut. Eine PCR wurde mit den folgenden Oligonukleotiden
    Figure 00220001
    und der Matrize pHN02 für das Erzeugen eines PCR-Fragments mit 270 bp durchgeführt. Dieses Fragment wurde mit HindIII und PstI für das Isolieren eines Fragments HindIII-PstI mit 220 bp (Fragment B) verdaut. Die Fragmente A und B wurden zusammen mit dem zuvor durch ClaI und HindIII verdauten Vektor pBS-SK+ unter Ergeben des Plasmids pEL028 mit 3872 bp (26) ligiert. Das Plasmid pHN02 wurde durch BsphI und ClaI für das Isolieren des Fragments BsphI-ClaI mit 425 bp (Fragment C) verdaut. Eine PCR wurde mit den folgenden Oligonukleotiden:
    Figure 00220002
    Figure 00230001
    und der Matrize pHN02 für das Erzeugen eines PCR-Fragments mit 425 bp durchgeführt. Dieses Fragment wurde durch BsphI und NotI für das Isolieren des Fragments BsphI-NotI mit 390 bp (Fragment D) verdaut. Die Fragmente C und D wurden zusammen mit dem zuvor durch ClaI und NotI verdauten Vektor pBS-SK+ für das Ergeben des Plasmids pEL029 bis mit 3727 bp (27) verdaut. Das Plasmid pEL028 wurde durch ClaI und SacII für das Isolieren des Fragments ClaI-SacII mit 960 bp (Fragment E) verdaut. Das Plasmid pEL029 bis wurde durch ClaI und NotI für das Isolieren des Fragments ClaI-NotI mit 820 bp (Fragment F) verdaut. Die Fragmente E und F wurden zusammen mit dem zuvor durch NotI und SacII verdauten Vektor pBS-SK+ für das Ergeben des Plasmids pEL030 mit 4745 bp (28) ligiert. Das Plasmid pEL030 wurde durch NotI für das Isolieren des Fragments NotI-NotI mit 1780 bp (gesamtes NDV-HN-Gen) verdaut. Dieses Fragment wurde anstelle des lacZ-Gens mit dem zuvor durch NotI verdauten und mit alkalischer Phosphatase behandelten Plasmid pCMVß für das Ergeben des Plasmids pEL032 mit 5471 bp (29) ligiert. Das Plasmid pEL032 wurde durch EcoRI und ClaI für das Isolieren des Fragments EcoRI-ClaI mit 1636 bp (Fragment G) verdaut. Das Plasmid pEL032 wurde durch ClaI und SalI für das Isolieren des Fragments ClaI-SalI mit 1182 bp (Fragment H) verdaut. Die Fragmente G und H wurden zusammen mit dem zuvor durch EcoRI und SalI verdauten Plasmid pEL079 (siehe Beispiel 5) für das Ergeben des Plasmids pEL093 mit 7890 bp (30) ligiert. Dieses Plasmid gestattet die Insertion der Expressionskassette HCMV-IE/NDV HN in die intergene Stelle 1 des NVT-Virus.
  • Eine wie in Beispiel 8 beschrieben durchgeführte Co-Transfektion mit dem Plasmid pEL093 und der Genom-DNA des HVT-Virus führte zur Isolierung und zur Reinigung von rekombinantem vHVT1 9.
  • Beispiel 12: Konstruktion des Donor-Plasmids pEL094 und Isolierung von vHVT20
  • Ein aus der komplementären DNA-Bank des Genoms des Virus der Newcastle-Krankheit (siehe Beispiel 11) stammender Klon, der das gesamte Fusionsgen (F) enthielt, wurde pNDV81 genannt. Dieses Plasmid wurde früher beschrieben und die Sequenz des bei diesem Klon vorhandenen NDV-F-Gens wurde veröffentlicht (Taylor J. et al., J. Virol., 1990, 64, 1441-1450). Das Plasmid pNDV81 wurde durch NarI und PstI unter Isolieren des Fragments NarI-PstI mit 1870 bp (Fragment A) verdaut. Eine PCR wurde mit den folgen Oligonukleotiden:
    Figure 00240001
    und der Matrize pNDV81 unter Erzeugen eines Fragments mit 160 bp durchgeführt. Dieses Fragment wurde durch PstI und SalI unter Isolieren des Fragments PstI-SalI mit 130 bp (Fragment B) verdaut. Die Fragmente A und B wurden zusammen mit dem zuvor durch ClaI und SalI verdauten Vektor pBS-SK+ für das Ergeben des Plasmids pEL033 mit 4846 bp (31) ligiert. Das Plasmid pEL033 wurde durch NotI für das Isolieren des Fragments NotI-NotI mit 1935 bp (gesamtes Gen F) verdaut. Dieses Fragment wurde mit dem zuvor durch NotI verdauten und mit alkalischer Phosphatase behandelten Plasmid pCMVß für das Ergeben des Plasmids pEL034 mit 5624 bp (das lacZ-Gen wurde durch das NDV-F-Gen ersetzt) ligiert (32). Das Plasmid pEL034 wurde durch EcoRI und KpnI für das Isolieren des Fragments EcoRI-KpnI mit 866 bp (Fragment C) verdaut. Das Plasmid pEL034 wurde durch KpnI und SalI für das Isolieren des Fragments KpnI-SalI mit 2114 bp (Fragment D) verdaut. Die Fragmente C und D wurden zusammen mit dem zuvor durch EcoRI und SalI verdauten Plasmid pEL079 (siehe Beispiel 5) für das Ergeben des Plasmids pEL094 mit 8043 bp (33) ligiert. Das Plasmid erlaubt die Insertion der Expressionskassette HCMV-IE/NDV F in die intergene Stelle 1 des HVT-Virus.
  • Eine wie im Beispiel 8 beschrieben durchgeführte Co-Transfektion mit dem Plasmid pEL094 und der Genom-DNA des HVT-Virus führte zur Isolierung und der Reinigung von rekombinantem vHVT20.
  • Beispiel 13: Konstruktion des Donor-Plasmids pEL095 und Isolierung von vHVT21
  • Die stromaufwärts gelegenen Sequenzen des MDV-RNA-Gens mit 1,8 kbp werden bei Bradley G. et al. (J. Virol., 1989, 63, 2534-2542) (34 und SEQ ID N° 25) beschrieben. Eine PCR-Amplifikation wurde ausgehend von einem DNA-Extrakt von Lymphozyten, die aus mit dem Stamm MDV RB1 B (siehe Beispiel 1) infizierten Hühnchen gewonnen wurden, mit den folgenden Oligonukleotiden durchgeführt:
    Figure 00250001
  • Das auf diese Weise erhaltene PCR-Fragment mit 163 bp wurde durch EcoRI und SpeI verdaut und dann mit dem zuvor durch EcoRI und SpeI verdauten Plasmid pCD002 (siehe Beispiel 9) für das Ergeben des Plasmids pBS002 mit 6774 bp (35) ligiert. Das Plasmid pB5002 enthält den stromaufwärts des lacZ-Gens klonierten Promotor des MDV-RNA-Gens mit 1,8 kb.
  • Eine PCR wurde mit den Oligonukleotiden
    Figure 00250002
    und der Matrize pBS002 durchgeführt. Das auf diese Weise erhaltene PCR-Fragment wurde durch PstI und SpeI für das Isolieren eines Fragments PstI-SpeI mit 200 bp verdaut. Dieses Fragment wurde mit dem zuvor durch PstI und SpeI verdauten Plasmid pEL067 (siehe Beispiel 9) für das Ergeben des Plasmids pEL069 (36) ligiert. Das Plasmid pCD007 (siehe Beispiel 10) wurde durch EcoRI und XbaI unter Isolieren des Fragments EcoRI-XbaI mit 2670 bp (Fragment A) verdaut. Das Plasmid pCDO11 (siehe Beispiel 10) wurde durch NotI und XbaI für das Isolieren des Fragments NotI-XbaI mit 180 bp (Fragment) verdaut. Das Plasmid pEL069 wurde durch NotI und SpeI für das Isolieren des Fragments NotI-SpeI mit 180 bp (Fragment C) verdaut. Die Fragmente A, B und C wurden zusammen mit dem zuvor durch EcoRI und SpeI verdauten Plasmid pEL067 (siehe Beispiel 9) für das Ergeben des Plasmids pEL080 mit 5939 bp (37) ligiert. Das Plasmid pEL070 (siehe Beispiel 9) wurde durch KpnI und SpeI für das Isolieren des Fragments KpnI-SpeI mit 1345 bp (Fragment D) verdaut. Das Plasmid pEL070 wurde ebenfalls durch KpnI und SalI unter Isolieren des Fragments KpnI-SalI mit 1658 bp (Fragment E) verdaut. Die Fragmente D und E wurden zusammen mit dem zuvor durch SalI und SpeI verdauten Plasmid pEL080 für das Ergeben des Plasmids pEL081 mit 8938 bp (38) ligiert. Das Plasmid pEL081 wurde durch EcoRI und SalI für das Isolieren des Fragments EcoRI-SalI mit 6066 bp verdaut. Dieses Fragment wurde mit dem zuvor durch EcoRI und SalI verdauten Plasmid pEL079 (siehe Beispiel 5) für das Ergeben des Plasmids pEL095 mit 11139 bp (39) ligiert. Dieses Plasmid gestattet das Inserieren der Doppelexpressionskassette VP2/MCMV-IE//RNA 1,8 kbp/MDV gB in die intergene Stelle 1 des NVT-Virus.
  • Eine wie im Beispiel 8 beschrieben durchgeführte Co-Transfektion mit dem Plasmid pEL095 und der Genom-DNA des HVT-Virus führte zur Isolierung und der Reinigung von rekombinantem vHVT21.
  • Beispiel 14: Konstruktion des Donor-Plasmids pEL098 und Isolierung von vHVT24
  • Das Plasmid pEL08O (siehe Beispiel 13) wurde durch EcoRI und SalI für das Isolieren des Fragments EcoRI-SalI mit 3040 bp (RNA-Kassette 1,8 kbp/MDV gB) verdaut. Dieses Fragment wurde mit dem zuvor durch EcoRI und SalI verdauten Plasmid pEL079 (siehe Beispiel 5) unter Ergeben des Plasmids pEL098 mit 8140 bp (40) ligiert. Dieses Plasmid gestattet die Insertion der RNA-Kassette 1,8 kbp/MDV gB in die intergene Stelle 1 des HVT-Virus.
  • Eine wie im Beispiel 8 beschrieben durchgeführte Co-Transfektion mit dem Plasmid pEL098 und der Genom-DNA des HVT-Virus führte zur Isolierung und der Reinigung von rekombinantem vHVT24.
  • Beispiel 15: Konstruktion von Donor-Plasmiden zur Insertion der Expressionskassetten IBV M und S in die intergene Stelle 1 des HVT-Virus
  • Nach derselben Strategie wie der weiter oben zur Insertion von Expressionskassetten (unter die Kontrolle der HCMV-IE- oder MCMV-IE-Promotoren oder des MCMV-IE/RNA-Doppelpromotors 1,8 kbp stehende Gene) in die intergene Stelle 1 ist es möglich, rekombinante HVT-Viren herzustellen, die die Membran-(M) oder Spikeproteine (S) des Virus der infektiösen aviären Bronchitis (IBV) auf höherem Niveau exprimieren. Man stellt bevorzugt ein Konstrukt her, bei dem das IBV-S-Gen unter der Abhängigkeit des HCMV-IE-Promotors oder des MCMV-IE-Promotors steht, oder ein Konstrukt her, bei dem die IBV-M- und IBV-S-Gene zusammen mit dem MCMV-IE/RNA-Doppelpromotor 1,8 kbp in die intergene Stelle 1 inseriert sind, wobei das M-Gen unter der Kontrolle des RNA-Promotors 1,8 kbp steht und das S-Gen unter der Kontrolle des MCMV-IE-Promotors steht. In dieser Konfiguration wird der RNA-Promotor 1,8 kbp durch die Aktivatorregion des MCMV-IE-Promotors aktiviert.
  • Beispiel 16: Konstruktion rekombinanter HVT-Viren, die in die intergenen Stellen 2 und 3 inserierte Fremdgene umfassen
  • Der Erhalt rekombinanter HVT-Viren, die in die intergenen Stellen 2 und 3 inserierte Expressionskassetten von Fremdgenen aufweisen, erfolgt dadurch, dass man der für die Beispiele 8 bis 14 beschriebenen Strategie folgt, aber die Plasmide pEL078 (intergene Stelle 2) beziehungsweise pEL066 (intergene Stelle 3) anstelle des Plasmids pEL079 in den Beispielen 8 bis 14 zum Aufbauen der speziellen Donor-Plasmide verwendet.
  • Beispiel 17: Herstellung eines erfindungsgemäßen Impfstoffs:
  • Die Herstellung erfindungsgemäßer Impfstoffe kann durch jede dem Fachmann bekannte Technik, zum Beispiel durch Rollflaschenkultur erfolgen. Rollflaschen (175 cm2), in die 200.106 Primärzellen aus Hühnchenembryonen eingesät sind, werden nach 24 Stunden Inkubation bei 37°C mit 1 ml einer Viruslösung von rekombinantem HVT-Virus mit einem Gehalt von 105 pfu/ml beimpft. Nach 4 Stunden Inkubation bei 37°C wird der Überstand entfernt, die Zellen werden mit einer Trypsin/Versene-Lösung getrennt und dann isoliert. Die infizierten Zellen werden darauf zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und die Zellen werden durch 20 ml einer einen Stabilisator zur Lyophilisierung (zum Beispiel SPGA: Saccharose, Phosphat, Glutamat, Albumin) enthaltenden Lösung wieder aufgenommen. Dieses Gemisch wird danach beschallt, in Gläschen zu Fraktionen von 1 ml verteilt und schließlich lyophilisiert.
  • Falls notwenig, kann der Impfstoff statt lyophilisiert zu werden auch aufgeteilt und eingefroren werden.
  • Beispiel 18:
  • Ein erfindungsgemäß erhaltener rekombinanter Impfstoffkandidat, der das Protein VP2 des Virus der Gumboro-Krankheit exprimiert, wurde zum Immunisieren von 1 Tag alten Küken auf intramuskulärem Weg verwendet. Diese Küken wurden darauf im Alter von 21 Tagen dem Virus der Gumboro-Krankheit ausgesetzt. Die Ergebnisse des Schutzes wurden 11 Tage nach dem Aussetzen durch Vergleichen der Läsionen der Bursa fabricius und der Sterblichkeit zwischen den Impfgruppen und der nicht geimpften Kontrollgruppe bewertet. Die Ergebnisse dieses Impfungs-/Aussetzungsverfahrens haben gezeigt, dass der gemäß der Erfindung erhaltene Impfstoff den Erhalt eines guten Schutzniveaus gestattet.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00300001
  • Figure 00310001
  • Figure 00320001
  • Figure 00330001
  • Figure 00340001
  • Figure 00350001
  • Figure 00360001
  • Figure 00370001
  • Figure 00380001

Claims (18)

  1. Verwendung eines rekombinanten HVT-Virus (Herpes Virus of Turkeys), das wenigstens eine Nukleotidsequenz umfasst, die für ein Antigen eines aviären pathogenen Agens kodiert und dieses exprimiert, und die in einen der intergenen Bereiche 1, 2 und 3 des BamHI I-Fragmentes des Genoms des HVT-Virus eingefügt wurde, wobei diese intergenen Bereiche, bezogen auf den besonderen HVT-Stamm mit der Nukleotidsequenz der 1, den Nukleotiden 1213 bis 1383 der 1 für das Intergen 1, den Nukleotiden 1942 bis 2283 für das Intergen 2 und den Nukleotiden 3082 bis 3569 für das Intergen 3 entsprechen, für die Herstellung eines aviären, rekombinanten Lebendimpfstoffs, der für die Impfung in ovo, der ein Tag alten Küken oder der ausgewachsenen Tiere gegen das aviäre pathogene Agens bestimmt ist.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das aviäre pathogene Agens das Virus der Gumboro-Krankheit (IBDV) ist.
  3. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das aviäre pathogene Agens das Virus der Marek-Krankheit ist.
  4. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das aviäre pathogene Agens das Virus der Newcastle-Krankheit (NDV) ist.
  5. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das aviäre pathogene Agens das Virus der Infektiösen Bronchitis (IBV) ist.
  6. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das aviäre pathogene Agens das Virus der Infektiösen Laryngotracheitis (ILTV) ist.
  7. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das aviäre pathogene Agens das Virus der Aviären Anämie (CAV) ist.
  8. Verwendung nach Anspruch 2, wobei die eingefügte Nukleotidsequenz eine Nukleotidsequenz ist, die für das Polypeptid VP2 des IBDV-Virus kodiert.
  9. Verwendung nach Anspruch 2, wobei die eingefügte Nukleotidsequenz für VP3 oder für VP2 + VP4 + VP3 des IBDV-Virus kodiert.
  10. Verwendung nach Anspruch 3, wobei die Nukleotidsequenz für gB, gC, gD oder gH + gL des Virus der Marek-Krankheit kodiert.
  11. Verwendung nach Anspruch 4, wobei die Nukleotidsequenz für F oder HN des Virus der Newcastle-Krankheit kodiert.
  12. Verwendung nach Anspruch 5, wobei die Nukleotidsequenz für S oder M des Virus der Infektiösen Bronchitis kodiert.
  13. Verwendung nach Anspruch 6, wobei die Nukleotidsequenz für gB, gC, gD oder gH + gL des Virus der Infektiösen Laryngotracheitis kodiert.
  14. Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Nukleotidsequenz für VP1 (52 kDa) + VP2 (24 kDa) des Virus der Aviären Anämie kodiert.
  15. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Nukleotidsequenz unter der Kontrolle des CMV Immediate Early-Promotors eingefügt wurde.
  16. Verwendung nach Anspruch 15, wobei der CMV Immediate Early-Promotor der humane HMCV IE-Promotor oder der murine MCMV IE-Promotor ist.
  17. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Nukleotidsequenz unter der Kontrolle des Marek RNA1.8-Promotors eingefügt ist.
  18. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei pro Impfdosis eine PFU von 10 bis 104 des rekombinanten HVT-Virus verwendet wird.
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