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DE3854190T2 - Attenuierte herpesviren, herpesviren, die für eine aminosäuresequenz kodierende fremde dns beeinhalten und sie enthaltende impfstoffe. - Google Patents

Attenuierte herpesviren, herpesviren, die für eine aminosäuresequenz kodierende fremde dns beeinhalten und sie enthaltende impfstoffe.

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Publication number
DE3854190T2
DE3854190T2 DE3854190T DE3854190T DE3854190T2 DE 3854190 T2 DE3854190 T2 DE 3854190T2 DE 3854190 T DE3854190 T DE 3854190T DE 3854190 T DE3854190 T DE 3854190T DE 3854190 T2 DE3854190 T2 DE 3854190T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
prv
gene
dna
virus
recombinant
Prior art date
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Expired - Lifetime
Application number
DE3854190T
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English (en)
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DE3854190D1 (de
Inventor
Christina Chiang
Mark Cochran
William Macconnell
Richard Macdonald
Meng-Fu Shih
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Syntro Corp
Original Assignee
Syntro Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Syntro Corp filed Critical Syntro Corp
Publication of DE3854190D1 publication Critical patent/DE3854190D1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE3854190T2 publication Critical patent/DE3854190T2/de
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Description

  • Die vorliegende Patentanmeldung ist eine Continuation-inpart-Anmeldung der am 27. Juli 1987 eingereichten US-Patentanmeldung mit der Serial No. 078 519, der am 20. November 1986 eingereichten US-Patentanmeldung mit der Serial Nr. 933 107, der am 2. September 1986 eingereichten US-Patentanmeldung mit der Serial No. 902 877, der am 17. Juli 1986 eingereichten US-Patentanmeldung mit der Serial No. 887 140, der am 27. Januar 1986 eingereichten US-Patentanmeldung mit der Serial No. 823 102 und der am 6. September 1985 eingereichten US-Patentanmeldung mit der Serial No. 773 403. Der Inhalt einer jeden der obengenannten Patentanmeldungen wird durch Bezugnahme in die vorliegende Patentanmeldung aufgenommen.
    • Hintergrund der Erfindung
  • In dieser Patentanmeldung sind verschiedene Veröffentlichungen durch arabische Zahlen in Klammern angegeben. Die vollständigen Zitate dieser Literaturstellen finden sich am Ende der Beschreibung unmittelbar vor den Patentansprüchen. Die Offenbarungen dieser Veröffentlichungen in ihrer Gänze werden hier durch Bezugnahme in diese Patentanmeldung aufgenommen, um den Stand der Technik, auf den sich die vorliegende Erfindung bezieht, vollständig zu beschreiben.
  • Das Entstehen der rekombinanten DNA-Techniken ermöglichte die Manipulation der natürlich vorkommenden DNA-Sequenzen in einem Organismus (des Genoms), um die Funktionen des Organismus durch genetische Konstruktion in gewisser Weise zu verändern. Die vorliegende Erfindung betrifft als Viren bezeichnete Organismen, die Tiere befallen und DNA als ihr genetisches Material enthalten. Insbesondere betrifft sie die Viren, die zur Herpesvirusgruppe (Herpesviren) gehören (23). Diese Gruppe von Viren umfaßt zahlreiche pathogene Stoffe, die eine Reihe von Targetspezies, wie Schweine, Rinder, Hühner, Pferde, Hunden, Katzen usw. infizieren und bei diesen Spezies eine Erkrankung verursachen. Jeder Herpesvirus ist für seine Wirtspezies spezifisch, sie sind jedoch alle bezüglich der Struktur ihrer Genome, ihres Replikationsmodus und in gewissem Ausmaß bezüglich der Pathologie, die sie im Wirtstier verursachen, und bezüglich des Mechanismus der Immunantwort des Wirts auf die Virusinfektion verwandt.
  • Die Typen des genetischen Konstruierens, die bei diesen Herpesviren durchgeführt wurden, bestehen in einem Klonieren von Teilen der Virus-DNA in Plasmide in Bakterien, einer Rekonstruktion der Virus-DNA, während sie sich im klonierten Zustand befindet, so daß die DNA Deletionen bestimmter Sequenzen enthält, und der weiteren in einer Hinzufügung von fremden DNA-Sequenzen entweder an der Stelle der Deletionen oder an von den Deletionen entfernten Stellen. Das übliche Verfahren besteht darin, fremde DNA in Virussequenzen zu insertieren, obwohl die fremde DNA auch an das Ende der Virus-DNA angefügt werden kann. Die Anfügung fremder Sequenzen läßt sich auf eine Art nutzen, wenn die fremde Sequenz für ein fremdes Protein kodiert, das während der Virusinfektion des Tieres exprimiert wird. Ein Virus mit diesen Eigenschaften wird als Vektor bezeichnet, da er zu einem lebenden Vektor wird, der das fremde Protein im Tier trägt und exprimiert. Im Endeffekt wird er ein kunstvolles Abgabesystem für das fremde Protein.
  • Der Stand der Technik für die vorliegende Erfindung beruht zuerst auf der Fähigkeit, DNA in bakteriellen Plasmiden zu klonieren und zu analysieren. Die meistens einsetzbaren Techniken sind detailliert bei Maniatis und Mitarbeitern (1) beschrieben. Diese Veröffentlichung beschreibt die allgemeinen rekombinanten DNA-Techniken des Standes der Technik.
  • Die Anwendung rekombinanter DNA-Techniken bei tierischen Viren besitzt eine relativ junge Geschichte seit etwa 1980. Die ersten Viren, die konstruiert werden konnten, waren die kleinsten, d. h. die Papovaviren. Diese Viren enthalten in ihrem Genom eine DNA mit einer Länge von 3000 bis 4000 Basenpaaren (bp). Ihre geringe Größe macht die Analyse ihrer Genome relativ einfach, wobei in der Tat die meisten der untersuchten Viren (SV40, Polyom, Rinderpapillom) vollständig sequenziert wurden. Da diese Viruspartikel klein sind und nicht viel extra DNA aufnehmen können und da ihre DNA mit essentiellen Sequenzen (d. h. mit für die Replikation erforderlichen Sequenzen) dicht gepackt ist, war es nicht möglich, diese Viren als lebende Vektoren für eine Fremdgenexpression zu konstruieren. Ihre ganze Verwendung bei der genetischen Konstruktion bestand in der Nutzung als defektive Replikons für die Expression von Fremdgenen in tierischen Zellen in Kulturen (dieses ist grob analog zu Plasmiden in bakteriellen Systemen) oder in ihrer Verwendung in gemischten Populationen von Virionen, in denen Viren vom Wildtyp als Helfer für das Virus, bei dem ein essentieller Teil der DNA durch Fremdgene ersetzt ist, fungiert. Die Studien bei Papovaviren lehren das Konzept von lebenden Virusvektoren als Abgabesysteme für Wirttiere nicht, noch legen sie dieses Konzept nahe.
  • Die nächstgrößten tierischen DNA-Viren sind die Adenoviren. In diesen Viren gibt es eine kleine Menge von nicht essentieller DNA, die durch Fremdsequenzen ersetzt werden kann. Die einzigen Fremdgene, die in Adenoviren scheinbar exprimiert wurden, sind die T-Antigengene aus Papovaviren (2, 3, 4, 5) und das Herpes-simplex-Virus-Thymidinkinasegen (28). Ausgehend von diesem anfänglichen Erfolg kann man sich die Insertion von weiteren kleinen Fremdgenen in Adenoviren vorstellen. Die bei Adenoviren verwendeten Techniken lehren jedoch nicht, wie man dasselbe Ergebnis bei Herpesviren erreichen soll. Insbesondere identifizieren diese Ergebnisse nicht die nicht essentiellen Bereiche in Herpesviren, wo Fremd-DNA insertiert werden kann, noch lehren sie, wie die Expression der Fremdgene in Herpesviren erreicht werden soll, beispielsweise welche Promotorsignale und Terminationssignale zu verwenden sind.
  • Eine weitere Gruppe von tierischen Viren, die konstruiert wurden, sind die Pockenviren. Ein Vertreter dieser Gruppe, das Kuhpockenvirus, war Gegenstand zahlreicher Forschungen bezüglich einer Fremdgenexpression. Pockenviren sind große DNA enthaltende Viren, die im Cytoplasma von infizierten Zellen replizieren. Sie besitzen eine Struktur, die unter Viren sehr einzigartig ist - sie enthalten keinerlei Capsid, das auf einer icosaedrischen Symmetrie oder einer helikalen Symmetrie basiert. In Theorien über den Ursprung von Viren sind es die Pockenviren, von denen mit höchster Wahrscheinlichkeit angenommen wird, daß sie von bakterienartigen Mikroorganismen durch Verlust von Funktionen und Degeneration abstammen. Teilweise aufgrund dieser Einzigartigkeit lassen sich die bei der genetischen Konstruktion von Pockenviren erreichten Fortschritte nicht direkt auf andere Virussysteme, einschließlich Herpesviren, extrapolieren. In einer Reihe von Laboratorien wurden rekombinante Kuhpockenviruskonstrukte hergestellt, die die folgenden insertierten Fremdgene exprimieren: Das Herpes-simplex-Virus-Thymidinkinasegen (6, 7), das Hepatitis-B-Oberflächenantigen (8, 9, 29), das Herpes-simplex-Virus-Glycoprotein-D-Gen (8, 29), das Influenza-Hemaglutiningen (10, 11), das Malaria-Antigengen (12) und das Vesikulärstomatitis-Glycoprotein-G-Gen (13). Die allgemeinen Gesamtmerkmale der Arbeit mit rekombinanter Kuhpocken-DNA ähneln den bei allen Viren verwendeten Techniken, insbesondere sofern sie die Techniken in der Literaturstelle (1) betreffen. Im Detail lehren die Kuhpockentechniken jedoch nicht, wie Herpesviren zu konstruieren sind. Kuhpocken-DNA ist nicht infektiös, so daß der Einbau von Fremd-DNA eine Infektions/Transfektions-Stufe umfassen muß, die bei anderen Viren nicht geeignet ist, wobei das Kuhpockenvirus einzigartige Stabilitätseigenschaften besitzt, die das Screening einfacher machen. Darüber hinaus ist die durch Promotoren verwendete Signalfrequenz im Kuhpockenvirus einzigartig und funktioniert nicht in anderen Viren. Die Einsetzbarkeit des Kuhpockenvirus als Impfstoffvektor ist aufgrund seiner nahen Verwandtschaft zu den menschlichen Pocken und aufgrund seiner bekannten Pathogenität bei Menschen fraglich. Die Verwendung wirtspezifischer Herpesviren verspricht, bei der Schutzimpfung von Tieren die bessere Lösung zu sein.
  • Herpesviren enthalten als genetisches Material eine DNA mit einer Länge von 100.000 bis 150.000 Basenpaaren, wobei mehrere Bereiche des Genoms identifiziert wurden, die für die Replikation des Virus in vitro in Zellkulturen entbehrlich sind. Modifikationen dieser Bereiche der DNA verringern bekanntermaßen die Pathogenität des Virus, d. h. schwächen das Virus für eine tierische Spezies ab. Beispielsweise macht die Inaktivierung des Thymidinkinasegens das menschliche Herpes simplex-Virus nicht pathogen (45) und das Pseudorabiesvirus von Schweinen nicht pathogen (46 und 47).
  • Die Entfernung eines Teils des Repeatbereichs macht das menschliche Herpes-simplex-Virus nicht pathogen (48 und 49). Ein Repeatbereich wurde im Virus der Marek'schen Erkrankung identifiziert, der mit einer Virusonkogenität in Verbindung steht (50). Ein Bereich im Herpesvirus Saimiri wurde in ähnlicher Weise mit Onkogenität korreliert (51). Modifikationen in diesen Repeatbereichen lehren jedoch die Konstruktion von abgeschwächten Virus-Glycoviren mit Deletionen in Repeatsequenzen nicht.
  • Der Grad der Abschwächung eines Virus ist bei der Verwendung des Virus als Impfstoff wichtig. Deletionen, die eine zu starke Abschwächung des Virus verursachen, führen zu einem Impfstoff, der bei der Produktion einer geeigneten Immunantwort versagt.
  • Von den Herpesviren ist bekannt, daß sie die verschiedensten latenten und wiederkehrenden Infektionen bei Menschen und anderen Wirbeltieren hervorrufen. Es ist sogar bekannt, daß sie Pilze und Austern infizieren. Unter den mit Herpesvirus- Infektionen verbundenen Zuständen finden sich die durch Herpes-simplex Typ 1 hervorgerufenen Fieberbläschen, die durch Herpes-simplex Typ 2 hervorgerufene Genitalherpes und die durch Herpes-zoster-Infektion hervorgerufenen Windpocken bei Kindern und die durch Herpes-zoster-Infektion hervorgerufene Gürtelrose bei Erwachsenen. Das Pseudorabiesvirus (PRV)-, ein Klasse-D-Herpesvirus, induziert die Aujesky-Erkrankung, ein akutes und häufig tödliches Nervenleiden bei Haus- und Wildtieren.
  • Unter den Herpesviren sind bis zu der vorliegenden Veröffentlichung lediglich Herpes-simplex-Viren von Menschen und in einem begrenzten Ausmaß Herpes-saimiri-Viren von Affen so konstruiert worden, daß sie fremde DNA-Sequenzen enthalten. Die früheste Arbeit bezüglich der genetischen Manipulation von Herpes-simplex-Virus umfaßte die Gewinnung von temperaturempfindlichen Mutanten des Virus unter Verwendung von gereinigten Restriktionsfragmenten von DNA (14). Diese Arbeit umfaßte keine Klonierung der DNA-Fragmente in das Virusgenom. Die erste Verwendung rekombinanter DNA zur Manipulation des Herpes-simplex-Virus umfaßte ein Klonieren eines DNA-Teils aus dem L-S-Verbindungsbereich in den einzigen langen Bereich der DNA, insbesondere in das Thymidinkinasegen (15). Dieses Insert war kein fremdes DNA-Stück, es war vielmehr ein natürlich vorkommendes Stück von Herpesvirus- DNA, das an einer anderen Stelle im Genom dupliziert wurde.
  • Dieses DNA-Stück war nicht so konstruiert, daß es speziell irgendein Protein exprimiert, so daß hierdurch nicht gelehrt wurde, wie Proteine in Herpesviren exprimiert werden könnten. Die Manipulation von Herpes simplex umfaßte als nächstes die Erzeugung von Deletionen im Virusgenom durch eine Kombinationen von rekombinanter DNA und Thymidinkinaseauswahl. Die erste Stufe bestand darin, eine spezifische Deletion des Thymidinkinasegens herzustellen (16). Die nächste Stufe umfaßte die Insertion des Thymidinkinasegens an einer bestimmten Stelle in das Genom, worauf das Thymidinkinasegen und die flankierende DNA an der neuen Stelle durch eine Auswahl gegen Thymidinkinase deletiert wurden (17). Auf diese Weise wurde das Herpes-simplex-alpha-22-Gen deletiert (17). In einer jüngsten Weiterentwicklung dieser Technik wurde eine 15.000 bp lange DNA-Sequenz aus dem internen Repeat von Herpes-simplex-Virus deletiert (18).
  • Die Insertion von Genen mit Kodierung für ein Protein in Primaten-Herpesviren umfaßte sieben Fälle: Die Insertion von Herpes-simplex-Glycoprotein C zurück in eine natürlich vorkommende Deletionsmutante dieses Gens in Herpes-simplex-Virus (19); die Insertion von Glycoprotein D von Herpes-simplex Typ 2 in Herpes-simplex Typ 1 (20), abermals ohne Manipulation der Promotoren, da das Gen nicht wirklich "fremd" ist; die Insertion von Hepatitis B-Oberflächenantigen in Herpes-simplex-Virus unter Steuerung des Herpes-simplex- ICP4-Promotors (21) und die Insertion von Rinderwachstumshormon in Herpes-saimiri-Virus mit einem SV40-Promotor, der in der Tat in diesem System nicht arbeitete (ein endogener Stromaufpromotor, der zur Transkription des Gens diente) (22). Zwei weitere Fälle von Fremdgenen (Hühnereiweißgen und Epstein-Barr-Virus-Kernantigen) wurden in Herpes-simplex-Virus insertiert (30). Des weiteren wurde Glycoprotein X von Pseudorabiesvirus in Herpes-simplex-Virus insertiert (31).
  • Diese begrenzten Fälle von Deletionen und Insertionen von Genen in Herpesviren zeigen, daß es möglich ist, Herpesvirusgenome durch rekombinante DNA-Techniken genetisch zu konstruieren. Die zur Insertion von Genen verwendeten Verfahren umfassen eine homologe Rekombination zwischen der auf Plasmide klonierten Virus-DNA und der in dieselbe Tierzelle transfizierten gereinigten Virus-DNA. Insgesamt wird dies als die homologe Rekombinationstechnik bezeichnet. Diese Technik ist mit geringfügigen Modifikationen bei anderen Herpesviren, die wir konstruiert haben, anwendbar. Das Ausmaß, in dem man die Lage der Deletion und die Stellen zur Insertion von Fremdgenen generalisieren kann, ist aus diesen früheren Studien jedoch nicht nahegelegt. Des weiteren ist es auch nicht nahegelegt, daß Nichtprimaten-Herpesviren für dieselben Techniken wie die Primaten-Herpesviren verwendbar sind und daß man einen zielgerichteten Ansatz zur Deletion, Insertion und Expression von Fremdgenen findet.
  • Das infektiöse Rinderrhinotracheitis (IBR)-Virus, ein alpha- Herpesvirus mit einem Klasse D-Genom, ist ein wichtiges Rinderpathogen. Dieses Virus steht mit Atmungserkrankungen, Augenerkrankungen, Fortpflanzungserkrankungen, Erkrankungen des zentralen Nervensystems, Darmerkrankungen, Erkrankungen bei Neugeborenen und Hauterkrankungen in Verbindung (37). Rinder sind die normalen Wirte von IBR-Virus, es infiziert jedoch auch Ziegen, Schweine, Wasserbüffel, Wildebeest, Nerze und Frettchen. Experimentelle Infektionen entwickelten sich bei Maultierhirschen, Ziegen, Schweinen, Frettchen und Kaninchen (38).
  • Übliche modifizierte lebende Virusimpfstoffe wurden zur Bekämpfung von durch IBR verursachten Erkrankungen in breitem Maße verwendet. Diese Impfstoffviren können jedoch zu einer Virulenz zurückkehren. In jüngster Zeit wurden abgetötete Virus-IBR-Impfstoffe verwendet, ihre Wirksamkeit scheint jedoch marginal zu sein.
  • IBR wurde auf molekularem Niveau analysiert (vgl. Übersicht in (39)). Eine Restriktionskarte des Genoms ist in dieser Literaturstelle beschrieben. Diese Restriktionskarte unterstützt die genetische Konstruktion von IBR im Rahmen des erfindungsgemäß bereitgestellten Verfahrens. Es fand sich kein Hinweis, daß IBR konstruiert worden war, das eine Deletion oder Insertion von Fremd-DNA enthält.
  • Das Virus der Marek Erkrankung (MDV) verursacht Geflügellähmung, eine übliche lymphoproliferative Erkrankung von Hühnern. Die Erkrankung tritt üblicherweise bei jungen Hühnern in einem Alter zwischen 2 und 5 Monaten auf. Die vorherrschenden klinischen Anzeichen sind fortschreitende Lähmung einer oder mehrerer Extremitäten, eine Fehlkoordination infolge der Lähmung der Beine, ein Herunterfallen der Armgliedmaßen infolge der Miteinbeziehung der Schwingen und eine niedrigere Kopfposition infolge der Miteinbeziehung der Nackenmuskeln. In akuten Fällen kann es zu schweren Depressionen kommen. Im Falle der hochonkogenen Stämme gibt es charakteristische Bursa- und Thymusatrophien. Darüber hinaus entstehen lymphoide Tumoren, die die Gonaden, Lungen, die Leber, die Milz, die Nieren und den Thymus befallen (37).
  • Alle Hühner werden gegen MDV am ersten Lebenstag geimpft, um sie ein Leben lang gegen MDV zu schützen. Ein Impfverfahren für MDV umfaßt die Verwendung von Truthahnherpesvirus (HVT). Es wäre von Vorteil, andere Antigene in diesen Impfstoff am ersten Lebenstag einzuarbeiten, Anstrengungen zur Vereinigung von Impfstoffen haben sich bis heute jedoch aufgrund der Konkurrenz und der Immunosuppression unter den Pathogenen nicht als wirksam erwiesen. Die erfindungsgemäß konstruierten Mehrfachimpfstoffe sind ein neuer Weg zur gleichzeitigen Impfung gegen eine Reihe von unterschiedlichen Pathogenen.
  • Restriktionskarten von sowohl MDV (43) als auch HVT (34) finden sich in der Literatur. Es gibt keinerlei Hinweis für die Vermutung, daß irgendjemand bis zur vorliegenden Veröffentlichung erfolgreich Deletionen oder Insertionen von Fremd-DNA in MDV oder HVT durchgeführt hat.
  • Andere für diese Vorgänge als geeignet angesehene Herpesviren sind Katzenherpesvirus (FHV), Pferdeherpesvirus (EHV) und Hundeherpesvirus (CHV). Diese Pathogene verursachen Erkrankungen in jedem ihrer jeweiligen Wirte. Katzenherpesvirus verursacht Katzenrhinotracheitis, eine akute Infektion des oberen Atmungstrakts, die durch Fieber, ausgeprägtes Niesen, Nasen- und Tränensekretionen und Depression charakterisiert ist. Das Virus kann eine Hornhautgeschwürbildung und Fehlgeburten verursachen. Die Nasenwege und Nasenmuscheln zeigen eine fokale Nekrose. Ferner sind die Mandeln vergrößert und hämorrhagisch. Pferdeherpesvirus verursacht Rhinopneumonitis, Fehlgeburten, ein Exanthem der Genitalien und gelegentlich eine neurologische Erkrankung. Die akute Erkrankung ist durch Fieber, Anorexie und reichlichen, serösen Nasenausfluß gekennzeichnet. Die neurologischen Symptome - wenn sie vorhandene sind - bestehen aus Ataxie, Schwäche und Paralyse. Das Hundeherpesvirus verursacht bei jungen Hunden eine schwere Erkrankung, deren Mortalität 80% erreichen kann. Die Erkrankung ist durch Viremie, Anorexie, respiratorische Erkrankung, abdominale Schmerzen, Erbrechen und unaufhörliches Schreien gekennzeichnet. Im allgemeinen tritt kein Fieber auf. Die hauptsächlichen Läsionen sind eine verteilte Nekrose und Blutungen in den Nieren, der Leber und der Lunge.
  • Die Molekularbiologie der Katzen-, Pferde- und Hunde-Herpesviren befindet sich in ihren Anfangsstadien. Teilweise Restriktionskarten sind für das Pferde-Herpesvirus verfügbar. Für Katzen-Herpesvirus sind die Restriktionskarten in mindestens einem Labor im Entstehen. Über diesen Typ einer Genomanalyse hinaus gibt es keinerlei Anzeichen bezüglich der Deletion oder Insertion von Fremdgenen in diese Viren.
  • Die vorliegende Erfindung umfaßt die Verwendung genetisch konstruierter Herpesviren zum Schutz von Tieren gegen Erkrankungen. Es ist nicht naheliegend, welche Deletionen in Herpesviren dafür sorgen, das Virus in geeignetem Ausmaß abzuschwächen. Selbst Testimpfkandidaten in Tiermodellen, beispielsweise Mäusen, dienen nicht als gültiges Voraussagemodell bezüglich der Sicherheit und Wirksamkeit des Impfstoffs in der Zieltierspezies, beispielsweise bei Schweinen.
  • Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Impfstoff für Pseudorabiesvirus (Herpesvirus suis, Suidherpesvirus 1 oder Aujesky-Erkrankung-Virus)-Erkrankung von Schweinen. Schweine sind der natürliche Wirt von Pseudorabiesvirus, wobei eine Infektion bei älteren Tieren im allgemeinen unsichtbar ist, jedoch durch Fieber, Krämpfe und den Tod, insbesondere bei jüngeren Tieren, gekennzeichnet sein kann. Das Pseudorabiesvirus infiziert auch Rinder, Schafe, Hunde, Katzen, Frettchen, Füchse und Ratten (37), wobei die Infektion üblicherweise zum Tod führt. Dem Tod geht üblicherweise ein intensives Hautjucken, Manie, Encephalitis, Paralyse und ein Koma voraus. Herkömmliche lebende Impfstoffe sind zur Verwendung bei Schweinen erhältlich, sie sind jedoch für andere Tiere todbringend. Ein verbesserter Impfstoff für Pseudorabies würde eine zuverlässigere Immunantwort bei Schweinen induzieren, speziell abgeschwächt sein, um nicht in einen Virulenzzustand zurückkehren zu können, und keine Erkrankung bei anderen Wirten hervorrufen.
  • Pseudorabiesvirus, ein alpha-Herpesvirus von Schweinen, weist ein Genom der Klasse D auf (23). Das heißt, es sind zwei Kopien eines einzelnen Repeatbereichs enthalten, eine Kopie befindet sich zwischen dem einzigen langen und dem einzigen kurzen DNA-Bereich und eine Kopie befindet sich am Ende des einzigen kurzen Bereichs (vgl. Fig. 1). Herpes-simplex-Virus ist ein alpha-Herpesvirus mit einem Klasse E-Genom (23). Das heißt, es enthält zwei Kopien von jeweils zwei Repeats. Herpes-saimiri ist ein gamma-Herpesvirus mit einem Klasse B-Genom. Das heißt, es enthält zahlreiche Wiederholungen derselben Sequenz an beiden Enden (23). Da die Genomstruktur zwischen diesen verschiedenen Klassen von Herpesviren deutlich verschieden ist und da die unterschiedlichen Viren in ihren Wirten unterschiedliche Zellen angreifen und unterschiedliche Pathologien hervorrufen; ist es notwendig, in jedem Fall herauszufinden, welche spezifischen Bereiche entfernt werden können, um eine Abschwächung herbeizuführen, und welche Bereiche verändert werden können, um fremde Gene zu exprimieren.
  • Pseudorabiesvirus wurde mit Hilfe der Werkzeuge der Molekularbiologie, einschließlich der Verwendung rekombinanter DNA-Techniken, untersucht. Die BamHI-, KpnI- und BgIII-Restriktionskarten des Virusgenoms wurden veröffentlicht (24, 27) . Das DNA-Transfektionsvorgehen wurde ausgenützt, um temperaturempfindliche und Deletionsmutanten des Virus mit Hilfe des homologen Rekombinationsvorgehens (24) zu gewinnen. Es gibt zwei Beispiele von Deletionen, die im Pseudorabiesvirusgenom vorgenommen wurden: eines ist eine Thymidinkinasegendeletion (25), die auch in der US-A-4 514 497 mit dem Titel "Modified Live Pseudorabies Viruses" veröffentlicht ist. Dieses Patent lehrt lediglich Thymidinkinasedeletionen und schlägt keine anderen abschwächenden Deletionen vor, noch schlägt es eine Insertion von fremden DNA-Sequenzen vor. Die andere Literaturstelle beschreibt die Deletion einer kleinen DNA-Sequenz um eine HindIII-Restriktionsstelle im Repeatbereich herum (26). Hierauf basiert die am 15. Mai 1985 veröffentlichte europäische Patentveröffentlichung 0 141 458, die der am 12. Oktober 1984 eingereichten europäischen Patentanmeldung Nr. 84 201 474.8 entspricht. Diese Patentanmeldung lehrt weder abschwächende Deletionen oder schlägt solche vor noch lehrt sie die Insertion von DNA-Sequenzen in Pseudorabiesviren oder schlägt derartige Insertionen vor.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Deletionen, die im Pseudorabiesvirusgenom an bisher nicht veröffentlichten Stellen vorgenommen wurden. Ferner wurden fremde DNA-Sequenzen in das abgeschwächte Pseudorabiesvirusgenom eingeführt und als Proteine exprimiert. Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft einen Impfstoff mit Eignung zur Verhinderung von Pseudorabies- und anderen Schweineerkrankungen mit einem einzelnen Impfstoff.
  • Andere hier veröffentlichte relevante Pseudorabiesliteratur betrifft die Anwesenheit von natürlich vorkommenden Deletionen im Genom von zwei Vaccinestämmen von Pseudorabiesviren (27). Diese Deletionen sind zumindestens teilweise für die abgeschwächte Natur dieser Vaccine verantwortlich, sie treten jedoch nicht in einer Repeatsequenz auf und lassen nicht die Abschwächung von Pseudorabiesvirus durch Deletieren eines Teils einer Repeatsequenz vermuten. Derartige natürlich vorkommende Deletionen lehren nicht Verfahren zur Durchführung dieser Deletionen unter Ausgehen von Wildtyp- Pseudorabiesvirus-DNA, noch legen sie andere Stellen nahe, an denen abschwächende Deletionen durchgeführt werden können. Es gibt keine Beispiele für natürlich vorkommende Insertionen von Fremd-DNA in Herpesviren.
  • Der natürliche Wirt von Pseudorabiesvirus ist das Schwein, bei dem eine Infektion im allgemeinen nicht sichtbar ist, jedoch durch Fieber, Krämpfe und Paralyse gekennzeichnet sein kann. Das Pseudorabiesvirus infiziert auch Rinder, Schafe, Hunde, Katzen, Füchse und Nerze, wo eine Infektion üblicherweise zum Tode des Wirts führt. Die vorwiegenden sichtbaren Merkmale einer Pseudorabiesvirusinfektion sind intensives Hautjucken, das im allgemeinen zu einer Verstümmelung der befallenen Stellen des Wirts führt. Dem üblicherweise innerhalb einiger Tage nach Auftreten der klinischen Anzeichen eintretenden Tod gehen starke Reizungen, Anfälle und eine Paralyse, alles Symptome einer Encephalomyelitis, voraus.
  • Die Pseudorabiesviruserkrankung bei Schweinen ist weltweit ein ernstes Anliegen der Regierungen. In den Vereinigten Staaten können Schweine aus infizierten Herden nur an Schlachthöfe verkauft werden. Mehrere Staaten haben getrennt voneinander auf eine Ausrottung gerichtete Bekämpfungspraktiken gegen Pseudorabies erlassen. Gegenwärtig wird jedes beliebige auf Pseudorabieserkrankung geimpfte Tier behandelt, als ob es mit Pseudorabiesvirus infiziert wäre und unterliegt somit denselben regulatorischen Zwängen. Dies ist hauptsächlich auf das Fehlen eines diagnostischen Tests zur Differenzierung geimpfter von infizierten Tieren zurückzuführen.
  • Der Trend der Forschung und Entwicklung innerhalb herkömmlicher Impfstoffhersteller hat sich im allgemeinen auf die Forschung zur Entwicklung eher von Impfstoffen, die auf Virusuntereinheiten basieren, als von auf lebenden Viren basierenden Impfstoffen konzentriert. Dieses Abgehen von auf lebendem Virus basierenden Impfstoffen ist teilweise auf den erkannten Sicherheitsaspekt der Untereinheiten enthaltenden Impfstoffe und auf die Unwahrscheinlichkeit derselben, infektiöse lebende Viren zu enthalten, zurückzuführen. Ein weiterer Grund für die Entwicklung von Untereinheiten enthaltenden Impfstoffen bestand darin, für die Entwicklung eines diagnostischen Tests zu sorgen, der den Impfstoff begleiten würde und geimpfte von infizierten Tieren differenzieren würde, so daß man den der Verwendung anderer Impfstoffe folgenden regulatorischen Zwängen entkommen könnte.
  • Untereinheiten enthaltende Impfstoffe besitzen auch Einschränkungen. Verglichen mit der Zahl der durch lebende Viren gebildeten Virusantigene enthalten diese Impfstoffe eine begrenzte Zahl von Virusantigenen. Diese geringe Zahl von Antigenen führt zu einer schwachen Immunantwort von kurzer Dauer beim geimpften Tier bei deutlich größeren Kosten als bei einer Impfung mit lebenden Viren. Das beschränkte Spektrum von Antigenen in dem Untereinheiten enthaltenden Impfstoff gewährleistet jedoch die Unterscheidung von geimpften Schweinen von mit dem Wildtypvirus infizierten Schweinen. Die Fähigkeit, geimpfte von infizierten Schweinen zu unterscheiden, ist eine wichtige Eigenschaft eines Pseudorabiesimpfstoffs, da keiner der bekannten Impfstoffe verhindert, daß die geimpften Tiere durch Wildtypvirus superinfiziert werden. Obwohl die geimpften Tiere bei einer Superinfektion nicht erkranken, gibt es deutliche Anzeichen, daß sie Träger des Wildtypvirus werden können und den Wildtypvirus auf andere Schweine übertragen können.
  • In jedem auf die Eliminierung des Pseudorabiesvirus gerichteten Ausrottungsprogramm wäre ein Impfstoff von Vorteil, der Eigenschaften besitzt,, die die Unterscheidung von geimpften Tieren von mit dem Wildtypvirus infizierten Tieren erlaubt. Die Untereinheiten enthaltenden Impfstoffe sind teuer und gering wirksam, ein mit diesem Typ von Impfstoff geimpftes Tier bildet jedoch Antikörper gegen lediglich ein begrenztes Spektrum von im Impfstoff vorhandenen Antigenen. Durch Entnahme von Serumproben bei den Schweinen ist es möglich zu zeigen, daß das geimpfte Tier Antikörper lediglich gegen die in dem Impfstoff enthaltenen Antigene besitzt, während ein mit dem Wildtypvirus infiziertes Tier Antikörper gegen einen breiteren Bereich von Antigenen aufweisen würde. Ein in dieser Weise zur Differenzierung geimpfter von mit Pseudorabies infizierten Tieren verwendeter, Untereinheiten enthaltender Impfstoff ist in der am 4. September 1985 eingereichten europäischen Patentanmeldung Nr. 8540074.4 (EP-A- 0 162 738, die am 27. November 1985 veröffentlicht wurde) mit dem Titel "Production of Pseudorabies Virus Subunit Vaccines" beschrieben. Diese veröffentlichte Patentanmeldung lehrt nicht die Konstruktion oder Verwendung eines ähnlichen diagnostischen Tests in Verbindung mit einem lebende Viren enthaltenden Impfstoff, noch legt sie eine derartige Konstruktion oder Verwendung nahe. Die Impfung von Tieren mit lebenden Viren, die zu einer von einer Wildtypinfektion unterscheidbaren Immunantwort führen würde, würde ferner die weiteren Vorteile eines niedrigen Preises und einer hohen Wirksamkeit, wie sie mit lebende Viren enthaltenden Impfstoffen verbunden sind, besitzen.
  • Deletionen in Genen mit Kodierung für virale Antigene wurden bereits beschrieben. Eine spontane Deletion im Glycoprotein- C-Gen des Herpes-simplex-Virus (52), eine spontane Deletion im Glycoprotein-A-Gen des Marek-Erkrankung-Virus (53), eine spontane Deletion im Glycoprotein-A-Gen (auch als Glycoprotein gI bezeichnet) von PRV (27, 55) und die Abwesenheit oder deutlich verringerte Menge von Glycoprotein gIII in einigen PRV-Mutanten (54) sind bekannt. Alle diese Deletionen entstehen jedoch spontan in einem nicht gesteuerten Prozeß. Folglich war die Steuerung von Deletionen bei DNA mit Kodierung für spezielle Antigene zur Steuerung des Deletionsprozesses und die Steuerung der Deletionen bei Antigenen mit spezieller Eignung als diagnostische Marker nicht möglich.
  • Die Anwesenheit oder Abwesenheit spezieller Antigene in einer beliebigen infektiösen Erkrankung kann als diagnostischer Test für den infektiösen Erreger benutzt werden. Diese Anwesenheit oder Abwesenheit bildet die Basis für alle immunologischen diagnostischen Tests, die sich lediglich in den Details ihres speziellen immunologischen Ansatzes unterscheiden. Zu den mit der vorliegenden Erfindung in Verbindung stehenden Publikationen gehört die von Wathan und Wathan (54), die berichten, daß entweder das gI-Gen oder das gIII-Gen aus PRV deletiert werden kann, und vermuten, daß das erhaltene Virus zur Unterscheidung geimpfter von infizierten Schweinen verwendet werden kann. Sie beschrieben jedoch die zur Herstellung des Impfstoffs notwendige Methodologie nicht, sie zeigten nicht die Einsetzbarkeit eines derartigen Impfstoffs in serologischen Tests und sie zeigten in keiner Weise die Brauchbarkeit eines derartigen Impfstoffs.
  • Van Oirschot und Mitarbeiter (56) bedienten sich eines speziellen immunologischen Nachweissystems auf monoklonaler Basis für das gI-Gen von PRV und zeigten, daß mit natürlich vorkommenden Vaccinestämmen, denen mindestens ein Teil des gI-Gens fehlt, geimpfte Schweine von mit Wildtyp-PRV infizierten Schweinen unterschieden werden können. Dieser diagnostische Test kann jedoch für jeden beliebigen der verschiedenen Impfstoffe gegen PRV, die bereits sowohl in Europa als auch in den Vereinigten Staaten existieren, verwendet werden, ohne daß differenziert werden kann, welcher Impfstoff verwendet wurde. Dies schränkt die Eignung dieses Diagnostikums ein, da die nachweisbaren Impfstoffe unterschiedliche biologische und Virulenzeigenschaften aufweisen.
  • Der Ansatz des Deletierens eines Gens zur Abschwächung eines Virus, gekoppelt mit einem Diagnostikum für das Gen, liefert einen Impfstoff, der von jedem beliebigen der gegenwärtig verwendeten PRV-Impfstoffe und von Wildtyp-PRV unterschieden werden kann. Es ist wichtig, einen neuen, sichereren Impfstoff von den gegenwärtig verwendeten zu unterscheiden, da die die gegenwärtigen Impfstoffe erhaltenden Schweine alle im selben Ausmaß wie die mit dem Wildtyp-PRV infizierten Schweine im Rahmen von Ausrottungsprogrammen denselben Regeln unterliegen.
  • Antigene der Wahl für einen diagnostischen Marker hätten die folgenden Eigenschaften: 1) Die Antigene und ihre Gene wären für die Herstellung eines infektiösen Virus in Gewebekultur nicht essentiell; und 2) das Antigen würde eine serologische Hauptantwort im Tier hervorrufen, es ist jedoch vorzugsweise kein wichtiges neutralisierendes Antigen.
  • Die vorliegende Erfindung umfaßt folglich die Fähigkeit, Pseudorabiesvirus von Schweinen abzuschwächen, um einen lebende Viren enthaltenden Impfstoff zu erzeugen, und die Fähigkeit zu unterscheiden, ob ein Tier geimpft wurde oder ob das Tier mit dem Pseudorabiesvirus vom Wildtyp infiziert ist.
    • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein rekombinantes Nichtprimaten-Herpesvirus, das eine in einen nicht essentiellen Bereich der genomischen DNA eines Herpesvirus insertierte fremde DNA-Sequenz umfaßt. Die insertierte fremde DNA-Sequenz, die in einer mit dem rekombinanten Herpesvirus infizierten Wirtzelle exprimiert wird, kodiert für ein rekombinantes Fusionsprotein, das mindestens einen Teil des Pseudorabiesvirus-Glycoproteins X und ein an das Carboxyende des Teils des Glycoproteins X fusioniertes Polypeptid umfaßt.
  • Die vorliegende Erfindung liefert des weiteren ein rekombinantes Fusionsprotein, das mindestens einen Teil des Pseudorabiesvirus-Glycoproteins X und ein an das Carboxyende des Teils des Pseudorabiesvirus-Glycoproteins X fusioniertes Polypeptid umfaßt.
  • Darüber hinaus liefert die vorliegende Erfindung ein rekombinantes Herpesvirus, das eine in einen nicht essentiellen Bereich der genomischen DNA eines Herpesvirus insertierte fremde DNA-Sequenz umfaßt. Die insertierte fremde DNA-Sequenz, die in einer mit dem rekombinanten Herpesvirus infizierten Wirtzelle exprimiert wird, kodiert für ein rekombinantes Fusionsprotein, das E. coli b-Galactosidase umfaßt, die an ihrem Carboxyterminus an ein Polypeptid fusioniert ist.
  • Des weiteren liefert die vorliegende Erfindung einen Impfstoff, der eine wirksame immunisierende Menge des rekombinanten Herpesvirus der vorliegenden Erfindung und einen geeigneten Träger umfaßt.
    • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • In dieser Anmeldung sind verschiedene Herpesviren zumindestens teilweise unter Bezugnahme auf ihre ATCC-Hinterlegungsnummern beschrieben. Diese Herpesviren wurden beim American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 hinterlegt. Diese Hinterlegungen erfolgten gemäß dem Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren.
  • Fig. 1: Details des Wildtypstamms Iowa S-62A
  • A. Diagramm der PRV-Genom-DNA, das den einzigen langen Bereich (UL), den einzigen kurzen Bereich (US), den internen Repeatbereich (IR) und den terminalen Repeatbereich (TR) zeigt.
  • b. BamHI-Restriktionsenzymkarte von PRV. Die Fragmente sind in der Reihenfolge abnehmender Größe numeriert.
  • Fig. 2: Details der S-PRV-004-Konstruktion und Kartendaten
  • A. Detaillierte Karte von BamHI #8' und #8. Die Lage des internen Repeat (IR)-Bereichs ist angegeben.
  • B. Detaillierte Karte des BamHI #8'-TK-8-Fragments, das schließlich im rekombinanten Virus vorhanden ist.
  • C. Diagramm des S-PRVL004-DNA-Genoms, das die Lage des in den Verbindungsbereich zwischen dem UL- und TR-Bereich insertierten HSV-1-TK-Gens zeigt.
  • Legende der Restriktionsenzyme: B = BamHI; K = KpnI; N = NdeI; P = PvuII; S = StuI.
  • Fig. 3: Details der S-PRV-005-Konstruktion und Kartendaten
  • A. Detaillierte Karte von BamHI #5. Das an den HSV-1-ICP4- Promotor fusionierte HSV-1-TK-Gen ist auf einem PvuII- Fragment dargestellt.
  • B. Detaillierte Karte von BamHI #5 nach Insertion des TK- Gen-Konstrukts.
  • C. Diagramm des S-PRV-005-DNA-Genoms, das die Stelle des in beide Kopien von BamHI #5 im Repeatbereich des Genoms insertierten TK-Gens und die Erzeugung neuer Deletionen zeigt.
  • Legende der Restriktionsenzyme: B = BamHI; H = HindIII; Hp = HpaI; K = KpnI; P = PvuII; X = XbaI.
  • Fig. 4: Konstruktion des in S-PRV-010 verwendeten Fremd- DNA-Inserts
  • A. Diagramm des relevanten Teils von pJF751, der das lac- Z-(beta-Galactosidase)-Gen enthält. Die Position des TAA-Terminationskodons für das Polypeptid ist angegeben.
  • B. Diagramm der Promotorsequenz aus dem HSV-1-TK-Gen.
  • C. Diagramm des RsaI-Fragments des TK-Gens, nun mit durch BamHI modifizierten Enden.
  • D. Diagramm des Endplasmids, das das lac-Z-Gen enthält, das an den HSV-1-TK-Promotor fusioniert ist.
  • Legende der Restriktionsenzyme: B = BamHI; Ba = BalI; Bc = BclI; Bg = BglII; H = HindIII; Ha = HaeIII; N = NdeI; R = RsaI; X = XbaI.
  • Fig. 5: Details der S-PRV-010 Konstruktion und Kartendaten
  • A. Detaillierte Karte von BamHI #5. Das an den HSV-1-TK- Promotor fusionierte lac-Z-Gen (beta-Galactosidase) ist auf einem XbaI-Fragment (vgl. Fig. 4) dargestellt. Die Position der Deletion in S-PRV-002 ist angegeben.
  • B. Detaillierte Karte von BamHI #5 nach Insertion des lac- Z-Gen-Konstrukts.
  • C. Diagramm der S-PRV-010-Genom-DNA, das die Stelle des in beide Kopien von BamHI #5 im Repeatbereich des Genoms insertierten lac-Z-Gens angibt.
  • Legende der Restriktionsenzyme: B = BamHI; Bc = BclI; H = HindIII; Hp = HpaI; K = KpnI; N = NdeI; X = XbaI.
  • Fig. 6: Details der S-PRV-007-Konstruktion und Kartendaten
  • A. Detaillierte Karte von BamHI #5 aus S-PRV-005.
  • B. Detaillierte Karte von BamHI #5 nach der Substitution des TK-Gens durch das Schweinerotavirus-gp38-Gen.
  • C. Diagramm des S-PRV-007-DNA-Genoms, das die Stelle des in beide Kopien von BamHI #5 in den Repeatbereichen des Genoms insertierten gp38-Gens angibt.
  • Legende der Restriktionsenzyme: B = BamHI; H = HindIII; K = KpnI.
  • Fig. 7: Konstruktion des in S-PRV-007 verwendeten Fremd- DNA-Inserts
  • Fig. 8: Details der S-PRV-012-Konstruktion und Kartendaten
  • A. Detaillierte Karte von PRV, die sich von BamHI #10 bis BamHI #7 erstreckt.
  • B. Detaillierte Karte von PRV, die sich von BamHI #10 bis BamHI #7 nach der Insertion des TK-Gens in das rekombinante Virus erstreckt.
  • C. Diagramm des S-PRV-012-DNA-Genoms, das die Stelle des in den gpX-Bereich insertierten TK-Gens und die Erzeugung einer Deletion, die den größten Teil des Kodierbereichs des gpX-Gens entfernt und das Virus unfähig macht, das gpX-Polypeptid zu synthetisieren, zeigt.
  • Legende der Restriktionsenzyme: B = BamHI; K = KpnI; N = NdeI; P = PvuII; Ps = PstI; S = StuI.
  • Fig. 9: Details der S-PRV-013-, S-PRV-014- und S-PRV-016- Konstruktion und Kartendaten
  • A. Detaillierte Karte von PRV, die sich von BamHI #10 bis BamHI #7 erstreckt.
  • B. Detaillierte Karte von PRV, die sich von BamHI #10 bis BamHI #7 nach der Insertion des lac-Z-Gens in das rekombinante Virus erstreckt.
  • C. Diagramm des S-PRV-013-DNA-Genoms, das die Stelle des in den gpX-Bereich insertierten lac-Z-Gens und die Erzeugung einer Deletion, die den größten Teil des Kodierbereichs des gpX-Gens entfernt und das Virus unfähig macht, das gpX-Polypeptid zu synthetisieren, zeigt. Weitere Deletionen im TK-Bereich und den Repeatbereichen sind durch () angegeben.
  • D. Diagramm des S-PRV-014-DNA-Genoms, das die Stelle des in den gpX-Bereich insertierten lac-Z-Gens und die Erzeugung einer Deletion, die den größten Teil des Kodierbereichs des gpX-Gens entfernte und das Virus unfähig macht, das gpX-Polypeptid zu synthetisieren, zeigt. In diesem Virus gibt es keine weiteren Deletionen.
  • E. Diagramm des S-PRV-016-DNA-Genoms, das die Stelle des in den gpX-Bereich insertierten lac-Z-Gens und die Erzeugung einer Deletion, die den größten Teil des Kodierbereichs des gpX-Gens entfernte und das Virus unfähig macht, das gpX-Polypeptid zu synthetisieren, zeigt. Weitere Deletionen in den Repeatbereichen sind durch () angegeben.
  • Legende der Restriktionsenzyme: B = BamHI; Ba = BalI; K
  • - KpnI; N = NdeI; Ps = PstI; S = StuI.
  • Fig. 10A und 10B: Schweinerotavirus-gp38-Gen-Sequenz in psY565
  • Fig. 11A und 11B: Schweineparvovirus-B-Gen-Sequenz in pSY875
  • Fig. 12: Schweineparvovirus-B-Gen-Konstruktion mit Signalsequenz
  • A. pSY864, das das B-Gen von der AccI-Stelle beim Nucleotid #391 bis zur RsaI-Stelle beim Nucleotid #2051, das zwischen die BamHI-Stelle in BamHI #10 und die NdeI- Stelle in BamHI #7 kloniert ist, enthält.
  • B. pSY957, das das SalI-Fragment von pSY864, das in einem Polylinker in pSP65 kloniert ist, so daß die XbaI-Stellen das Insert flankieren, enthält.
  • Legende: pSP = E. coli-Plasmid; PRV = Pseudorabiesvirus-DNA; PPV = Schweineparvovirus-DNA; Pv = PvuII; RV = EcoRV; Ps = PstI; B = BamHI; A = AccI; R = RsaI; N = NdeI; Sa = SalI; Sm = SmaI; S = StuI; X = XbaI; gpX pro = Glycoprotein X-Promotor; gpX pA = Glycoprotein X- Polyadenylierungssignalsequenzen.
  • Fig. 13: Details der S-PRV-020-Konstruktion und Kartendaten
  • A. Detaillierte Karte von PRV, die sich von BamHI #10 bis BamHI #7 erstreckt und das Parvovirus-B-Gen, das das gpX-Gen ersetzt, zeigt.
  • B. Detaillierte Karte von PRV von BamHI #10 bis BamHI #7 nach Insertion des Schweineparvovirus-B-Gens an die Stelle des gpX-Gens.
  • C. Diagramm des S-PRV-020-Genoms, das die Stelle des in den gpX-Bereich von PRV insertierten Schweineparvovirus-B-Gens zeigt.
  • Legende der Restriktionsenzyme: B = BamHI; Ps = PstI; Sa = SalI; N = NdeI; S = StuI; A = AccI; R = RsaI.
  • Fig. 14: Details der S-PRV-025-Konstruktion und Kartendaten
  • A. Bereich des S-PRV-002-Ausgangsvirus, der das BamHI #5- Fragment zeigt. Das Parvovirus-B-Gen-XbaI-Fragment aus pSY957 ist in einem Diagramm darunter angegeben, wobei gezeigt ist, wie es durch direkte Ligation in die XbaI- Stelle insertiert wird.
  • B. Bereich von BamHI #5 nach Insertion des Parvovirus-B- Gens.
  • C. Stelle des in beide Kopien des Repeatbereichs in S-PRV- 025 insertierten Parvovirus-B-Gens.
  • Legende: B = BamHI; H = HindIII; X = XbaI; S = SalI; pA = Glycoprotein-X-Polyadenylierungssignalsequenzen; UL, = einziger langer Bereich; US = einziger kurzer Bereich; IR = interner Repeatbereich; TR = terminaler Repeatbereich.
  • Fig. 15: Details der S-PRV-029-Konstruktion und Kartendaten
  • A. Detaillierte Karte von PRV, die sich von BamHI #10 bis BamHI #7 erstreckt und das lac-Z-Gen zeigt, das das gpX-Gen ersetzt.
  • B. Detaillierte Karte von PRV, die sich von BamHI #8' bis BamHI #8 an der Verbindung des einzigen langen Bereichs und des internen Repeatbereichs (IR) erstreckt. Das lac-Z-Gen als SalI-Fragment ersetzt die DNA zwischen den StuI-Stellen, die die Verbindung einklammern.
  • C. Diagramm des S-PRV-029-Genoms, das die Stellen der lac- Z-Gene im gpX-Bereich und den Verbindungsbereich zeigt.
  • Legende der Restriktionsenzyme: B = BamHI; Ps = PstI; Sa = SalI; N = NdeI; S = StuI; Ba = BalI; K = KpnI.
  • Fig. 16: Restriktionskarte des deletierten S-IBR-002-EcoRI B-Fragments und EcoRI F-Fragments
  • Eine 800 bp große Deletion, die die EcoRV- und BglIII- Restriktionsstellen umfaßt, wurde in beiden Repeatfragmenten kartiert.
  • Fig. 17: Konstruktion des rekombinanten S-IBR-004-Virus
  • S-IBR-004 ist ein rekombinantes IBR-Virus, das ein insertiertes fremdes Gen (NEO) unter der Steuerung des PRV-gpX-Promotors trägt. Eine neue XbaI-Stelle wurde an dem einzigen kleinen Bereich geschaffen und die ursprüngliche SacI-Stelle deletiert.
  • Fig. 18: Konstruktion des rekombinanten S-IBR-008-Virus
  • S-IBR-008 ist ein rekombinantes IBR-Virus, das ein Rinderrotaglycoproteingen und den in den XbaI-Stelle auf dem einzigen langen Bereich insertierten Plasmidvektor aufweist. Eine stellenspezifische Deletion wurde an der [SacI]-Stelle infolge des Verlustes des NEO-Gens in dem einzigen kleinen Bereich erzeugt.
  • Fig. 19: Details der HVT-Konstruktion und Kartendaten
  • A. Die BamHI-Restriktionsfragmentkarte von HVT. Die Fragmente sind in der Reihenfolge abnehmender Größe numeriert. Die Buchstaben bezeichnen kleine Fragmente, deren vergleichbare Größe nicht bestimmt wurde.
  • B. Das BamHI #16-Fragment, das die Stelle der beta- Galactosidasegeninsertion in S-HVT-001 zeigt.
  • C. Das BamHI #19-Fragment, das die Stelle der beta- Galactosidasegeninsertion zeigt.
  • Legende: B = BamHI; X = XhoI; H = HindIII; P = PstI; S = SalI; N = NdeI; R = EcoRI.
  • Fig. 20: Westernblot von in das Medium von PRV-infizierten Zellen freigesetzten Proteinen, der die Abwesenheit von gpX in S-PRV-012 und S-PRV-013, jedoch die Anwesenheit desselben in PRV-000 vom Wildtyp zeigt. Spur (A) Molekulargewichtsmarker, Spur (B) nichtinfizierte Verozellen, Spur (C) Wildtyp-PRV, Spur (D) S-PRV-012, Spur (E) S-PRV-013.
  • Fig. 21: Diagnosetest bezüglich der Anwesenheit von Antikörpern gegen gpX im Serum eines mit S-PRV-013 am Tag 0 geimpften und mit Pseudorabiesvirus vom Wildtyp am Tag 28 (bezüglich einer Immunantwort) herausgeforderten Schweins.
  • Fig. 22 A und 22B: Sequenz des Purduestamms des TGE-Virus gp195-Gens
  • Fig. 23: Details der S-PRV-055-Konstruktion
  • A. Die erste Zeile zeigt die Karte des PRV-BamHI # 5-Fragments, die die XbaI-Stelle der Insertion der TGE-pg195- Gen-Konstruktion zeigt. Die zweite Zeile zeigt die TGE- pg195-Gen-Konstruktion mit dem PRV-gX-Promotor und der HSV-TK-poly-A (TKpA) -Signalsequenz als XbaI-Fragment, das in die XbaI-Stelle in BamHI #5 eingesetzt wurde.
  • B. Die Karte des PRV BamHI #5-Fragments nach Insertion des TGE-gp195-Gens.
  • C. S-PRV-055-Genom, das die Stelle des TGE gp195-Gens in den Repeatbereichen angibt.
  • Legende: B = BamHI; X = XbaI; Bs = BstEII; S = SacI; H = MindIII; HP = HpaI; TKpA = HSV-TK-poly-A-Signalsequenz; UL = einziger langer Bereich; US = einziger kurzer Bereich; IR = interner Repeatbereich; TR = terminaler Repeatbereich.
  • Fig. 24: Sequenz des Pi-3 (SF-4-Stamm)-HN-Gens
  • Fig. 25: Details der S-IBR-018-Konstruktion
  • A. Die erste Zeile zeigt die IBR (Cooper-Stamm)-BamHI-C- Fragmentkarte. Die zweite Zeile zeigt die Konstruktion des alpha-4-Promotors auf dem PI-3-HN-Gen und seine Insertion in die HindIII-Stelle in BamHI-C. Ferner sind die beta-gal- und Neomycin (NEO)-Genkonstruktionen unter Steuerung des gX-Promotors dargestellt, die in die XbaI-Stelle eingesetzt und als auswählbare Marker zur Reinigung des rekombinanten Virus verwendet wurden.
  • B. Die BamHI-C-Fragmentkarte von S-IBR-018 nach Insertion des Pi-3-HN-, beta-gal- und Neomycin-Gens.
  • C. Das S-IBR-018-Genom, das die Stelle der drei insertierten fremden Gene zeigt.
  • Legende: B = BamHI; H = HindIII; X = XbaI; S = StuI; UL = einziger langer Bereich; US = einziger kurzer Bereich; IR = interner Repeatbereich; TR = terminaler Repeatbereich.
  • Fig. 26: Details der S-IBR-019-Konstruktion
  • A. Die erste Zeile zeigt die Karte des IBR (Cooper-Stamm)- BamHI-C-Fragments. Die zweite Zeile zeigt die Konstruktion des alpha-4-Promotors auf dem Pi-3-F-Gen und seine Insertion in die HindIII-Stelle in BamHI-C. Ferner dargestellt sind die beta-gal- und Neomycin (NEO)-Genkonstruktionen unter Steuerung des gX-Promotors, die in die XbaI-Stelle eingesetzt und als auswählbare Marker zur Reinigung des rekombinanten Virus verwendet wurden.
  • B. Die BamHI-C-Fragmentkarte von S-IBR-019 nach Insertion des Pi-3 F-, beta-gal- und Neomycin-Gens.
  • C. Das S-IBR-019-Genom, das die Stelle der drei insertierten fremden Gene zeigt.
  • Legende: B = BamHI; H = HindIII; X = XbaI; S = StuI; UL = einziger langer Bereich; US = einziger kurzer Bereich; IR = interner Repeatbereich; TR = terminaler Repeatbereich.
  • Fig. 27: Sequenz des großen IBDV (S40747)-cDNA-Fragments
  • Fig. 28: Insertion in das Plasmid 191-47
  • Fig. 29: Details der S-HVT-003-Konstruktion
  • A. Restriktionskarte der HVT-DNA im Bereich des BamHI #16- Fragments. Dieses Fragment ist in einem großen HindIII- Fragment, das auf dem einschlägigen Fachgebiet nach Wissen der Anmelder keinen Namen hat, enthalten. Ferner ist die XhoI-Stelle (X) dargestellt, wo die Anmelder ihre Insertion vorgenommen haben. Für diese Konstruktionen wurde die XhoI-Stelle zuerst mit Hilfe eines "Linkers" und unter Verwendung von Standardkloniertechniken zu einer EcoRI (R)-Stelle verändert.
  • B. Details der Konstruktion des beta-gal-Gens und des IBDV-Gens, die zur Verwendung in einer homologen Rekombination in das BamHI #16-Fragment insertiert wurden. Beide Gene befanden sich unter der Steuerung des PRV-gX-Gen-Promotors (gX).
  • C. Das S-HVT-003-Genom, das die Stelle der beiden insertierten Fremdgene beta-gal und IBDV zeigt.
  • Legende: H = HindIII; B = BamHI; X = XhoI; R = EcoRI; Xb = XbaI; Hp = HpaI; S = SmaI; UL = einziger langer Bereich; US = einziger kurzer Bereich; IR = interner Repeatbereich; TR = terminaler Repeatbereich.
  • Fig. 30: Vollständige Nucleotidsequenz des HVT Bam # 16-Genomfragments, 3335 Reste.
  • Fig. 31: Westernblot, der die unterschiedliche Expression des 32 kD großen TBDV-Antigens in Zellysaten von mit S- HVT-003 infizierten Zellen (32 kD vorhanden) und von mit S-HVT-001 infizierten Zellen (32 kD nicht vorhanden) zeigt. Die IBDV-spezifischen Polypeptide wurden durch Sondieren des Blots mit hyperimmunem Rattenantiserum, das gegen denaturierte IBDV-Virionen gerichtet ist, identifiziert. Dieses Serum reagiert hauptsächlich mit dem immunodominanten 32 kD großen Antigen (VP3). Die Spuren auf dem Blot enthalten: 1) Proteinmolekulargewichtsstandards, 2) nichtinfizierte CEF-Zellen, 3) mit S-HVT-001 infizierte CEF-Zellen, 4) 5) und 6) mit S-HVT-003 infizierte CEF-Zellen und 7) IBDV-Virionpolypeptide.
  • Fig. 32: Westernblot, der die Anwesenheit des 42 kD großen IBDV-Polypeptid (VP2)-Produkts in Zellysaten aus CEF- Zellen, die entweder mit Wildtyp HVT-Virus oder mit S- HVT-001, das beta-Galactosidase exprimiert, zeigt. Die IBDV-spezifischen Polypeptide wurden unter Verwendung eines VP-2-spezifischen Kaninchenantipeptidantiserums identifiziert. Die Spuren enthalten: 1) Proteinmolekulargewichtstandards, 2) mit Wildtyp HVT infizierte CEF-Zellen, 3) mit S-HVT-001 infizierte CEF-Zellen, 4) mit S-HVT-003 infizierte CEF-Zellen, 5) mit S-HVT-003 infizierte CEF-Zellen und 6) IBDV-Virionpolypeptide.
  • Fig. 33: Details der S-HVT-004-Konstruktion
  • A. Restriktionskarte der HVT-DNA im Bereich des BamHI #16- Fragments. Dieses Fragment ist in einem großen HindIII- Fragment enthalten, das auf dem einschlägigen Fachgebiet nach Wissen der Anmelder keinen Namen besitzt. Ferner ist die XhoI-Stelle (X) dargestellt, wo die Anmelder ihre Insertion vorgenommen haben. Für diese Konstruktionen wurde XhoI-Stelle mit Hilfe eines "Linkers" und unter Verwendung von Standardklonierverfahren zuerst zu einer EcoRI (R)-Stelle verändert.
  • B. Details der Konstruktion des beta-gal-Gens und des MDV- gA-Gens, die in das BamHI #16-Fragment zur Verwendung in einer homologen Rekombination insertiert wurden. Das beta-gal-Gen befand sich unter der Steuerung des PRV- gX-Gen-Promotors (gX), während sich das MDV-gA-Gen unter der Steuerung seines eigenen Promotors befand.
  • C. Das S-HVT-004-Genom, das die Stelle der beiden insertierten fremden Gene beta-gal und MDV gA zeigt.
  • Legende: H = HindIII, B = BamHI; X = XhoI; R = EcoRI; Xb = XbaI; UL = einziger langer Bereich; US = einziger kurzer Bereich; IR = interner Repeatbereich; TR = terminaler Repeatbereich.
  • Fig. 34 A und 34B: Translation der DNA-Sequenz des Schweineparvovirus-B-Gens, wobei die kodierten Aminosäuren dargestellt sind. Der in den Fusionen in S-PRV-039 und S-PRV-061 enthaltene B-Gen-Bereich (039-Fragment genannt), ist durch (***) hervorgehoben.
  • Fig. 35: Translation zweier Versionen des Schweineparvovirus-B-Gen 039-Fragments
  • A. Translation des natürlichen 039-Fragments, das den Parvovirus-Kodongebrauch und einen G + C-Gesamtgehalt von 34% aufweist.
  • B. Translation der synthetischen 039-Synthese-DNA, die die Parvovirusaminosäuresequenz beibehält, jedoch bezüglich der Ausnutzung der Pseudorabiesviruskodons optimiert ist. Der G + C-Gesamtgehalt entspricht 61%, nahezu das Doppelte von dem der natürlichen Parvovirussequenz.
  • Fig. 36: Graph, der den Grad veranschaulicht, in dem das natürliche 039-Fragment des Parvovirus-B-Gens von der Base 1 bis zur Base 123 über einen Bereich von 10 Kodons mit den Pseudorabiesvirus-Kodons zusammenpaßt. Dieser Graph wurde unter Verwendung des Pustell Sequence Analysis Programms (international Biotechnologies, Inc.) erstellt. Der Grad des Zusammenpassens ist als Bereich von 1,0 bis 4,0 (links nach rechts) angegeben. Der linke Rand (R) gibt ein zufälliges Zusammenpassen an, wobei die 1,5-Linie (1M5) ein minimales Zusammenpassen angibt. Höhere Werte stehen für ein besseres Zusammenpassen. Das 039-Frament zeigt meistens ein zufälliges (schlechtes) Zusammenpassen mit vier Punkten, die ein gewissen Zusammenpassen zeigen, das jedoch immer weniger als das "Minimum" ist.
  • Fig. 37: Ein mit Hilfe des Pustell Sequence Analysis Programms erzeugter Graph, der den Grad zeigt, in dem die synthetische 039-Synthese-DNA des Parvovirus-B-Gens von der Base 1 bis zur Base 123 über einen Bereich von 10 Kodons mit den Pseudorabiesvirus-Kodons zusammenpaßt.
  • Dieses Fragment wurde so gestaltet, daß es maximal mit dem Pseudorabiesvirus zusammenpaßt. Der Grad des Zusammenpassens ist als Bereich von 1,0 bis 4,0 (von links nach rechts) angegeben. Der linke Rand (R) steht für ein zufälliges Zusammenpassen, wobei die 1,5-Linie (1M5) ein minimales Zusammenpassen angibt. Höhere Werte bedeuten ein besseres Zusammenpassen. Die 039-Synthese- DNA zeigt einen hohen Grad des Zusammenpassens, d. h. in der Tat einen so hohen Grad des Zusammenpassens, wie er mit dieser Sequenz (nur) erreicht werden kann. Da dieses Computerprogramm über ein Fenster von 10 Kodons mittelt, kann der erste und letzte Teil der Sequenz in der Analyse nicht verwendet werden.
  • Fig. 38: Aminoterminale Fusionen des Parvovirus-B-Gens an beta-gal
  • A. Details der Konstruktion der zur Expression verwendeten Signalsequenzen. Sie umfassen (von links nach rechts) den PRV-gpX-Promotor, das HSV-TK-Startkodon (ATG), verschiedene mit beta-gal durch eine im Rahmen liegende Fusion verknüpfte Fragmente des Parvovirus-B-Gens (vgl. B), das beta-gal-Gen und die PRV-gpX-polyA-Signalsequenz (pA). Die gesamte Konstruktion war auf einem XbaI-Fragment enthalten, das zur direkten Ligation in das PRV-Genom verwendet wurde.
  • B. Der Satz der als aminoterminale Fusionen an beta-gal hergestellten Viruskonstruktionen zeigt den Ursprung der Parvovirusfragmente, bezogen auf eine Restriktionskarte des Parvovirusgens.
  • Fig. 39: Carboxvterminale Fusionen des Parvovirus-B-Gens an beta-gal
  • A. Details der Konstruktion der zur Expression verwendeten Signalsequenzen. Sie umfassen (von links nach rechts) den PRV-gpX-Promotor, das gpX-Startkodon und sieben Aminosäuren des gpX-Gens, beta-gal im Rahmen mit den gpX-Kodons, verschiedene Fragmente des Parvovirus-B- Gens (vgl. B) und die PRV-gpX-PolyA-Signalsequenz (pA). Die gesamte Konstruktion war auf einem XbaI-Fragment (auch flankiert durch HindIII-Stellen), das zur direkten Ligation in das PRV-Genom verwendet wurde, enthalten.
  • B. Der Satz der Viruskonstruktionen, die als carboxyterminale Fusionen an beta-gal hergestellt worden waren, zeigt den Ursprung der Parvovirusfragmente, bezogen auf eine Restriktionskarte des Parvovirusgens.
  • Fig. 40: Beschreibung der DNA-Insertion in das Plasmid 244- 25.3D. Die angegebenen Restriktionsenzyme sind die, die in den im Text genannten Quellen-DNAs vorhanden sind. Die in Klammern befindlichen Restriktionsenzyme zeigen Stellen, die bei der Erzeugung der Segmentverbindungen zerstört wurden.
  • Abkürzungen: gpX = Glycoprotein X; -GAL = -Galactosidase; vpA = Virusprotein A; PRV- = Pseudorabies; PRV - Pseudorabiesvirus; PPV = Schweineparvovirus; pA = Poly A-Additionssignal; aa = Aminosäuren.
  • Fig. 41: Struktur von S-PRV-065 und Zusammenfassung der durch das rekombinante Virus exprimierten Fremdgene.
  • Abkürzungen: gp = Glycoprotein; TK = Thymidinkinase; IE = immediate early; -GAL = -Galactosidase; vpA = Virusprotein A; PRV = Pseudorabiesvirus; PPV = Schweineparvovirus; KB = Kilobasenpaare; BP = Basenpaare; kd = Kilodalton; pA = Poly A-Additionssignal; aa = Aminosäuren.
  • Fig. 42: Westernblot von Lysaten, die aus rekombinanten Pseudorabiesviren, die -Galactosidase-Fusionsproteine exprimieren, hergestellt wurden.
  • Fig. 43: Beschreibung der DNA-Insertion im Plasmid 244- 49.2H. Die angegebenen Restriktionsenzyme sind die, die in den im Text angegebenen Quellen-DNAs vorhanden sind. Die in Klammern angegebenen Restriktionsenzyme geben Stellen an, die bei der Erzeugung der Segmentverbindungen zerstört wurden.
  • Abkürzungen: gpX = Glycoprotein X; -GAL = -Galactosidase; vpA = Virusprotein A; PRV = Pseudorabies; PPV = Schweineparvovirus; pA = Poly A-Additionssignal; aa = Aminosäuren.
  • Fig. 44: Struktur von S-PRV-086 und Zusammenfassung der durch das rekombinante Virus exprimierten Fremdgene
  • Abkürzungen: gp = Glycoprotein; TK = Thymidinkinase; IE = immediate early; -GAL = -Galactosidase; vpA = Virusprotein A; PRV = Pseudorabiesvirus; PPV = Schweineparvovirus; KB = Kilobasenpaare; BP = Basenpaare; kd = Kilodalton; pA = Poly A-Additionssignal; aa = Aminosäuren.
  • Fig. 45: Beschreibung der DNA-Insertion im Plasmid 167- 72.54G. Die angegebenen Restriktionsenzyme sind die, die in den im Text erwähnten Quellen-DNAs vorhanden sind. Die in Klammern angegebenen Restriktionsenzyme geben Stellen an, die bei der Erzeugung der Segmentverbindungen zerstört wurden.
  • Abkürzungen: gpX = Glycoprotein X; vpA = Virusprotein A; PRV = Pseudorabies; PPV = Schweineparvovirus; pA = Poly A-Additionssignal; aa = Aminosäuren.
  • Fig. 46: Struktur von S-PRV-040 und Zusammenfassung der durch das rekombinante Virus exprimierten Fremdgene.
  • Abkürzungen: gp = Glycoprotein; TK = Thymidinkinase; IE = immediate early; vpA = Virusprotein A; PRV = Pseudorabiesvirus; PPV = Schweineparvovirus; KB = Kilobasenpaare; BP = Basenpaare; kd = Kilodalton; pA = Poly A-Additionssignal; aa = Aminosäuren.
  • Fig. 47: Struktur von S-PRV-098 und Zusammenfassung der durch das rekombinante Virus exprimierten Fremdgene.
  • Abkürzungen: gp = Glycoprotein; TK = Thymidinkinase; IE = immediate early; -GAL = -Galactosidase; vpA = Virusprotein A; PRV = Pseudorabiesvirus; PPV = Schweineparvovirus; KB = Kilobasenpaare; BP = Basenpaare; kd = Kilodalton; pA = Poly A-Additionssignal; aa = Aminosäuren.
  • Fig. 48: Beschreibung der DNA-Insertion im Plasmid 181- 42.2. Die angegebenen Restriktionsenzyme sind die, die in den im Text angegebenen Quellen-DNAs vorhanden sind. Die in Klammern angegebenen Restriktionsenzyme zeigen Stellen, die bei der Erzeugung der Segmentverbindungen zerstört wurden.
  • Abkürzungen: gpX = Glycoprotein X; CSP = Circumsporozoitprotein; vpA = Virusprotein A; PRV = Pseudorabiesvirus; P.fal. = Plasmodium falciparum; pA = Poly A-Additionssignal; aa = Aminosäuren.
  • Fig. 49: Struktur von S-PRV-066 und Zusammenfassung der durch das rekombinante Virus exprimierten Fremdgene.
  • Abkürzungen: gp = Glycoprotein; TK = Thymidinkinase; IE
  • - immediate early; CSP = Circumsporozoitprotein; vpA = Virusprotein A; PRV = Pseudorabiesvirus; P.fal. = Plasmodium falciparum; KB = Kilobasenpaare; BP = Basenpaare; kd = Kilodalton; pA = Poly A-Additionssignal; aa = Aminosäuren.
  • Fig. 50: Westernblot der aus rekombinanten Pseudorabiesviren, die -Galactosidase-Fusionsproteine exprimieren, hergestellten Lysate.
  • Fig. 51: Beschreibung der DNA-Insertion im Plasmid PSY1373. Die angegebenen Restriktionsenzyme sind die, die in den im Text angegebenen Quellen-DNAs vorhanden sind. Die in Klammern angegebenen Restriktionsenzyme geben Stellen an, die bei der Erzeugung der Segmentverbindungen zerstört wurden.
  • Abkürzungen: gpX = Glycoprotein X; CSP = Circumsporozoitprotein; vpA = Virusprotein A; PRV = Pseudorabiesvirus; P.fal. = Plasmodium falciparum; pA = Poly A-Additionssignal; aa = Aminosäuren.
  • Fig. 52: Struktur von S-PRV-088 und Zusammenfassung der durch das rekombinante Virus exprimierten Fremdgene.
  • Abkürzungen: gp = Glycoprotein; TK = Thymdinkinase; IE = immediate early; CSP = Circumsporozoitprotein; vpA = Virusprotein A; PRV = Pseudorabiesvirus; P.fal. = Plasmodium falciparum; KB = Kilobasenpaare; BP = Basenpaare; kd = Kilodalton; pA = Poly A-Additionssignal; aa = Aminosäuren.
  • Fig. 53: Beschreibung der DNA-Insertion in das Plasmid 181- 66.26. Die angegebenen Restriktionsenzyme sind die, die in den im Text angegebenen Quellen-DNAs vorhanden sind. Die in Klammern angegebenen Restriktionsenzyme geben Stellen an, die bei der Erzeugung der Segmentverbindungen zerstört wurden.
  • Abkürzungen: gpX = Glycoprotein X; CSP = Circumsporozoitprotein; vpA = Virusprotein A; PRV = Pseudorabiesvirus; P.fal. = Plasmodium falciparum; pA = Poly A-Additionssignal; aa = Aminosäuren.
  • Fig. 54: Struktur von S-PRV-093 und Zusammenfassung der durch das rekombinante Virus exprimierten Fremdgene.
  • Abkürzungen: gp = Glycoprotein; TK = Thymdinkinase; IE = immediate early; CSP = Circumsporozoitprotein; vpA = Virusprotein A; PRV = Pseudorabiesvirus; P.fal. = Plasmodium falciparum; KB = Kilobasenpaare; BP = Basenpaare; kd = Kilodalton; pA = Poly A-Additionssignal; aa = Aminosäuren.
    • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung liefert ein rekombinantes Nichtprimaten-Herpesvirus, das eine in einen nicht essentiellen Bereich der Genom-DNA eines Herpesvirus insertierte Fremd- DNA-Sequenz umfaßt. Die insertierte Fremd-DNA-Sequenz kodiert für ein rekombinantes Fusionsprotein, das mindestens einen Teil des Pseudorabiesvirus-Glycoproteins X und ein an den Carboxyterminus des Teils des Glycoproteins X fusioniertes Polypeptid umfaßt. Die insertierte Fremd-DNA-Sequenz wird in einer mit dem rekombinanten Herpesvirus infizierten Wirtzelle exprimiert. Vorzugsweise ist das Herpesvirus, in das die Fremd-DNA-Sequenz insertiert ist, ein Pseudorabiesvirus. Vorzugsweise ist das Pseudorabiesvirus abgeschwächt.
  • Beispiele für erfindungsgemäße rekombinante Herpesviren sind die rekombinanten Viren mit der Bezeichnung S-PRV-040 (ATCC- Hinterlegungsnr. VR 2214), S-PRV-098 (ATCC-Hinterlegungsnr. VR 2219), S-PRV-088 (ATCC-Hinterlegungsnr. VR 2217) und S- PRV-093 (ATCC-Hinterlegungsnr. VR 2218).
  • Die Expression der insertierten Fremd-DNA-Sequenz befindet sich unter der Steuerung eines stromauf der Fremd-DNA-Sequenz gelegenen Promotors. Beispiele für derartige Promotoren sind der Herpes-simplex-Virus-Typ-1-Thymidinkinasepromotor und der Pseudorabiesvirus -Glycoprotein-X- Promotor.
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das an den Carboxyterminus des Teils des Glycoproteins X fusionierte Polypeptid ein antigenes Polypeptid. Das antigene Polypeptid kann ein Teil des Schweineparvovirus-Capsidproteins, des Malaria-CSP-Proteins oder des Malaria-CSP-Repeatbereichs sein.
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Polypeptid in das Pseudorabiesvirus-Glycoprotein X eingebettet. In einer anderen Ausführungsform ist das Polypeptid an die aminoterminale Transmembransignalsequenz des Glycoproteins X fusioniert.
  • Die vorliegende Erfindung liefert des weiteren ein rekombinantes Fusionsprotein, das mindestens einen Teil des Pseudorabiesvirus-Glycoproteins X und ein an den Carboxyterminus des Teils des Pseudorabiesvirus-Glycoproteins X fusioniertes Polypeptid umfaßt.
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das an den Carboxyterminus des Teils des Glycoproteins X fusionierte Polypeptid ein antigenes Polypeptid. Das antigene Polypeptid kann ein Teil des Schweineparvovirus-Capsidproteins, des Malaria-CSP-Proteins oder des Malaria-CSP-Repeatbereichs ein.
  • Darüber hinaus liefert die vorliegende Erfindung ein rekombinantes Nichtprimaten-Herpesvirus, das eine in einen nicht essentiellen Bereich der Genom-DNA eines Herpesvirus insertierte Fremd-DNA-Sequenz umfaßt. Die insertierte Fremd-DNA- Sequenz kodiert für ein rekombinantes Fusionsprotein, das die E. coli b-Galactosidase umfaßt, die an ihrem Carboxyterminus an ein Polypeptid fusioniert ist. Die insertierte Fremd-DNA-Sequenz wird in einer mit dem rekombinanten Herpesvirus infizierten Wirtzelle exprimiert. Vorzugsweise ist das Herpesvirus, in das die Fremd-DNA-Sequenz insertiert ist, ein Pseudorabiesvirus. Vorzugsweise ist das Pseudorabiesvirus abgeschwächt.
  • Beispiele für das rekombinante Herpesvirus der vorliegenden Erfindung sind die rekombinanten Viren mit der Bezeichnung S-PRV-065 (ATCC-Hinterlegungsnr. VR 2215) und S-PRV-086 (ATCC-Hinterlegungsnr. 7R 2216).
  • Die Expression der insertierten Fremd-DNA-Sequenz befindet sich unter Steuerung eines stromauf der Fremd-DNA-Sequenz gelegenen Promotors. Beispiele für derartige Promotoren sind der Herpes-simplex-Virus-Typ-1-Thymidinkinasepromotor und der Pseudorabiesvirus-Glycoprotein-X-Promotor.
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Polypeptid, das an den Carboxyterminus der E. coli b-Galactosidase fusioniert ist, ein antigenes Polypeptid. Das antigene Polypeptid kann ein Teil des Schweineparvovirus-Capsidproteins, des Malaria-CSP-Proteins oder des Malaria-CSP-Repeatbereichs sein.
  • Nach dem Fachmann auf dem einschlägigen Fachgebiet wohlbekannten Verfahren kann eine wirksame immunisierende Menge des rekombinanten Herpesvirus der vorliegenden Erfindung in Impfstoffe eingearbeitet werden.
    • Materialien und Methoden
  • ZÜCHTUNG DER HERPESVIREN IN GEWEBEKULTUREN: Alle zur Diskussion stehenden Herpesviren wurden in Gewebekulturzellen gezüchtet. Sofern nicht anders angegeben, waren die verwendeten Zellen die folgenden: Verozellen für PRV; MDBK-Zellen für IBR; CEF-Zellen für HVT; Crandall-Katzennierenzellen für FHV. Verozellen eignen sich für EHV und MDCK-Zellen eignen sich für CHV.
  • HERSTELLUNG DER HERPESVIRUSVORRATSPROBEN: Herpesvirusvorratsproben wurden durch Infizieren von Gewebekulturzellen bei einer Infektionsmultiplizität von 0,01 PFU/Zelle in Dulbecco's modifiziertem Eaglemedium (DMEM), das 2 mmol Glutamin, 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 Einheiten/ml Streptomycin (diese Komponenten wurden von Irvine Scientific oder einem gleichwertigen Hersteller erhalten und werden im folgenden als vollständiges DME-Medium bezeichnet) plus 1% fötales Rinderserum enthält, hergestellt. Nachdem der cytopathische Effekt vollständig war, wurden das Medium und die Zellen geerntet und die Zellen 5 min in einer Klinikzentrifuge bei 3000 l/min pelletiert. Bei allen Herpesviren mit Ausnahme von HVT wurden die Zellen in 1/10 des ursprünglichen Volumens des Mediums resuspendiert, worauf ein gleiches Volumen einer zweimal autoklavierten Magermilch (9% g/g Magermilchpulver in H&sub2;O) zugegeben wurde. Die Virusprobe wurde zweimal eingefroren und wieder aufgetaut, in aliquote Teile unterteilt und bei -70ºC eingefroren aufbewahrt. Der Titer betrug üblicherweise etwa 10&sup8; plaquebildende Einheiten pro ml. Bei HVT wurden die infizierten Zellen in 20% fötales Rinderserum, 10% DMSO enthaltendem, vollständigem Medium resuspendiert und bei -70ºC gefroren aufbewahrt.
  • HERSTELLUNG DER HERPESVIRUS-DNA: Für die Herpesvirus-DNA- Herstellung wurde eine konfluente Monoschicht aus Gewebekulturzellen in einem 25 cm² Kolben oder einer 60 mm Petrischale mit 100 ul einer Virusprobe in 1 ml Medium infiziert. In einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO&sub2; in Luft wurde 1 bis 2 h bei 37ºC eine Adsorption durchgeführt. Nach der Adsorption wurden 4 ml vollständiges DME-Medium plus 1% fötales Rinderserum zugegeben. Nach einer Inkubation über Nacht oder wenn die Zellen einen 100%igen cytopathischen Effekt zeigten, wurden die Zellen mit einem Zellabstreifer (Warenzeichen Costar) in das Medium abgestriffen. Die Zellen und das Medium wurden 5 min in einer Klinikzentrifuge bei 3000 l/min zentrifugiert. Das Medium wurde abdekantiert, worauf das Zellpellet vorsichtig in 0,5 ml Lösung, die 0,01 mol Tris eines pH-Werts von 7,5, 1 mmol EDTA und 0,5% Nonidet P-40 (NP40, ein ionisches Reinigungsmittel, das ein Octylphenolethylenoxidkondensat mit im Mittel 9 mol Ethylenoxid pro Molekül umfaßt, bezogen von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.) enthält, resuspendiert wurde. Die Probe wurde bei Raumtemperatur 10 min inkubiert. Nach Zugabe von 10 u1 einer Vorratslösung von RNase A (Sigma) (die Vorratslösung enthielt 10 mg/ml und war zur Inaktivierung von DNase 10 min aufgekocht worden) wurde die Probe 5 min in einer Klinikzentrifuge zur Pelletierung der Kerne bei 3000 l/min zentrifugiert. Das DNA-Pellet wurde mit einer Pasteurpipette oder einem Holzstab entfernt und verworfen. Die überstehende Flüssigkeit wurde in 1,5 ml Eppendorfröhrchen, die 25 ul 20%iges Natriumdodecylsulfat (Sigma) und 25 ul Proteinase-K (10 mg/ml, Hersteller Boehringer Mannheim) enthielten, dekantiert. Die Probe wurde 30 bis 60 min bei 37ºC vermischt und inkubiert. Nach Zugabe eines gleichen Volumens von wassergesättigtem Phenol wurde die Probe 1 min mit einem Wirbelmischer vermischt. Die Probe wurde 5 min bei voller Geschwindigkeit in einer Eppendorf-Minizentrifuge zentrifugiert. Die obere wäßrige Schicht wurde in eines neues Eppendorfröhrchen entfernt, worauf 2 Volumina absolutes Ethanol einer Temperatur von -20ºC zugegeben wurden. Anschließend wurde das Röhrchen 30 min in eine Umgebung von -20ºC gebracht, um die Nucleinsäure zu fällen. Die Probe wurde in einer Eppendorfzentrifuge 5 min bei 4ºC zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert, worauf das Pellet einmal mit kaltem 80%igem Ethanol gewaschen wurde. Das Pellet wurde in einem Lyophilisator getrocknet und in 17 ul H&sub2;O rehydratisiert. Zur Herstellung größerer Mengen DNA wurde das Vorgehen maßstäblich vergrößert, wobei von 850 cm² Walzengefäßen von Verozellen ausgegangen wurde. Die DNA wurde in H&sub2;O oder in 0,01 mol Tris eines pH-Werts von 7,5, 1 mmol EDTA bei -20ºC oder +4ºC aufbewahrt.
  • HERSTELLUNG DES HERPESVIRUS VON TRUTHAHN-DNA: Alle Truthahnherpesvirus (HVT) erfordernden Manipulationen erfolgten unter Verwendung des Stamms FC-126 (ATCC #584-C). Zur Herstellung der HVT-Virus-DNA aus dem Cytoplasma infizierter Zellen wurden primäre Hühnerembryofibroblasten bei einer MOI, die ausreicht, um einen ausgiebigen cytopathischen Effekt herbeizuführen, bevor die Zellen überwachsen, infiziert. Alle Inkubationen erfolgten bei 39ºC in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO&sub2; in Luft. Die besten DNA-Ausbeuten wurden durch Ernten von Monoschichten, die maximal infiziert waren, jedoch eine unvollständige Zellyse zeigten, (typischerweise nach 5 bis 7 Tagen) erhalten. Infizierte Zellen wurden durch Abstreifen der Zellen in das Medium mit Hilfe eines Zellabstreifers (Warenzeichen Costar) geerntet. Die Zellsuspension wurde 10 min bei 5ºC in einem GS-3-Rotor (Sorvall Instruments) bei 3000 l/min zentrifugiert. Das erhaltene Pellet wurde in kaltem PBS (20 ml/Walzengefäß) resuspendiert und abermals 10 min in der Kälte bei 3000 l/min zentrifugiert. Nach Dekantieren des PBS wurde das Zellpellet in 4 ml/Walzengefäß RSB-Puffer (10 mmol Tris eines pH-Werts von 7,5, 1 mmol EDTA und 1,5 mmol MgCl&sub2;) resuspendiert. Nach Zugeben von NP40 (Nonidet P-40; Sigma) zu der Probe auf eine Endkonzentration von 0,5% erfolgte eine Inkubation auf Eis während 15 min unter gelegentlichem Mischen. Die Probe wurde 10 min bei 3000 l/min in der Kälte zur Pelletierung der Kerne und Entfernung der Zellbruchstücke zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde sorgfältig in ein 15 ml Corex Zentrifugenröhrchen überführt. Nach Zugabe von sowohl EDTA (0,5 mol, pH-Wert 8,0) als auch SDS (Natriumdodecylsulfat; Vorratslösung 20%) zu der Probe auf Endkonzentrationen von 5 mmol bzw. 1% wurden pro 4 ml Probe 100 ul Proteinase-K (10 mg/ml; Boehringer Mannheim) zugegeben. Anschließend wurde gemischt und 1 bis 2 h bei 45ºC inkubiert. Danach wurde die Probe mit einem gleichen Volumen von wassergesättigtem Phenol versetzt, worauf von Hand schonend durchgemischt wurde. Die Probe wurde in einer Klinikzentrifuge 5 min bei 3000 l/min zur Trennung der Phasen zentrifugiert. Nach Zugabe von NaOAc zu der oberen wäßrigen Phase auf eine Endkonzentration von 0,3 mol (Vorratslösung 3 mol; pH-Wert 5,2) wurde die Nucleinsäure nach Zugabe von 2,5 Volumina eines kalten absoluten Ethanols 30 min bei -70ºC gefällt. Die DNA in der Probe wurde durch 20minütiges Zentrifugieren bei 8000 l/min in einem HB-4-Rotor bei 5ºC pelletiert. Der Überstand wurde sorgfältig entfernt, worauf das DNA-Pellet einmal mit 25 ml 80%igem Ethanol gewaschen-wurde. Das DNA-Pellet wurde kurz unter Vakuum (2-3 min) getrocknet und anschließend in 50 ul/Walzengefäß infizierter Zellen von T&sub1;&sub0;E&sub1;-Puffer (10 mmol Tris eines pH-Werts von 7,5, 1 mmol EDTA) resuspendiert. Typischerweise lag die Ausbeute an Virus-DNA in einem Bereich von 5-10 ug/Walzengefäß der infizierten Zellen. Die gesamte Virus-DNA wurde bei 10ºC aufbewahrt.
  • HERSTELLUNG VON HERPESVIRUSZELLYSATEN: Zur Zellysatherstellung wurde eine konfluente Monoschicht von Gewebekulturzellen in einem 25 cm²-Kolben oder einer 60 mm Petrischale mit 100 ul Virusprobe in 1 ml Medium infiziert. Die Adsorption erfolgte während 1-2 h bei 37ºC in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO&sub2; in Luft. Nach der Adsorption wurden 4 ml Medium zugegeben. Nach einer Inkubation über Nacht oder wenn die Zellen einen 100%igen cytopathischen Effekt zeigten, wurden die Zellen mit einem Zellabstreifer (Warenzeichen Costar) in das Medium abgestreift. Die Zellen und das Medium wurden 5 min in einer Klinikzentrifuge bei 3000 l/min zentrifugiert. Das Medium wurde abdekantiert, worauf das Zellpellet in 250 ul Zerstörungspuffer (2% Natriumdodecylsulfat, 2% beta-Mercapto-ethanol) suspendiert wurde. Die Proben wurden 30 s auf Eis beschallt und bei -20ºC aufbewahrt.
  • PHENOLEXTRAKTION: Die Phenolextraktion wurde mit jedem beliebigen üblichen Volumen DNA-Probe (typischerweise mit Volumina zwischen 100 ul und 1 ml) durchgeführt. Die DNA-Probe wurde in 0,01 mol Tris eines pH-Werts von 7,5, 1 mmol EDTA verdünnt und mit einem gleichen Volumen von wassergesättigtem Phenol versetzt. Die Probe wurde kurz mit einem Wirbelmischer durchgemischt und 3 min auf Eis gelegt. Nach einem 3minütigem Zentrifugieren in einer Mikrozentrifuge wurde die wäßrige Schicht in ein neues Röhrchen entfernt und mit Ethanol gefällt.
  • ETHANOLFÄLLUNG: Die DNA in einer Probe wurde durch Ethanolfällung aufkonzentriert. Die DNA-Probe wurde mit 1/10 Volumen 3 mol Natriumacetat eines pH-Werts von 7,5 und 3 Volumina kaltem Ethanol versetzt. Die DNA wurde 30 min bei -70ºC oder über Nacht bei -20ºC gefällt und anschließend durch Zentrifugation in einer Mikrozentrifuge während 15 min bei 4ºC pelletiert. Das Pellet wurde einmal mit 200 ul eines kalten 80%igen Ethanols gewaschen und abermals während 10 min bei 4ºC pelletiert. Nach einem Trocknen an Luft oder Lyophilisieren wurden die Pellets in einem geeigneten Puffer oder H&sub2;O resuspendiert.
  • VERDAUUNG MIT RESTRIKTIONSENZYMEN: Die DNA wurde mit Hilfe von Restriktionsenzymen unter Verwendung des vom Hersteller empfohlenen Puffers (International Biotechnologies Inc., New Haven, CT (IBI), Bethesda Research Laboratories, Bethesda, MD (BRL) und New England Biolabs, Beverly, MA) geschnitten. Sofern möglich, wurde die DNA-Konzentration unter 1 ug/50 ul gehalten. Die Inkubation erfolgte bei 37ºC während 1-4 h.
  • AGAROSEGELELEKTROPHORESE DER DNA: Zur Sichtbarmachung des Restriktionsmusters der DNA wurden 5 ul Auftragungspuffer (5X Elektrophoresepuffer, 0,01% Bromphenolblau-Farbstoff, 50 mmol EDTA und 50% Glycerin) zugegeben. Die Probe wurde in einer Spur in einer horizontalen Unterwasserelektrophoreseeinheit, die ein 0,6% Agarosegel enthielt, aufgegeben. Der Elektrophoresepuffer bestand aus 40 mmol Tris, 10 mmol EDTA, eingestellt auf einen pH-Wert von 7,8 mit Essigsäure, und enthielt gegebenenfalls 0,5 ug/ml Ethidiumbromid. Das Gel wurde während 18 h bei 40-50 V laufengelassen, worauf das Gel entfernt und mit 0,5 ug/ml Ethidiumbromid während 30 min angefärbt wurde. Die DNA-Banden wurden auf einer langwelligen UV-Durchleuchtungsvorrichtung sichtbar gemacht.
  • PHOPHATASEBEHANDLUNG DER DNA: Die Phosphatasebehandlung der DNA erfolgte durch Zugeben von 1 ul (25 Einheiten) Kalbsdarmphosphatase (Boehringer Mannheim) direkt zu den Verdauungsreaktionen mit Restriktionsenzymen und Fortsetzen der Inkubation während 30 min bei 37ºC. Die Phosphatase wurde während 60 min bei 65ºC vor der Phenolextraktion inaktiviert.
  • POLYMERASEAUFFÜLLREAKTION: Die DNA wurde in 50 mmol Tris eines pH-Werts von 7,4, 50 mmol KCl, 5 mmol MgCl&sub2; und 400 umol eines jeden der vier Desoxynucleotide enthaltendem Puffer resuspendiert. Nach Zugabe von 10 Einheiten Klenow-DNA-Polymerase (BRL) wurde die Reaktion während 15 min bei Raumtemperatur ablaufen gelassen. Die DNA wurde anschließend mit Phenol extrahiert, worauf wie oben mit Ethanol gefällt wurde.
  • EXONUCLEASERESEKTIONSREAKTION: Die DNA wurde in 100 ul von 60 mmol Tris eines pH-Werts von 8,0, 0,66 mmol MgCl&sub2; und 1 mmol beta-Mercapto-ethanol resuspendiert. Die Probe wurde während 5 min auf 30ºC erwärmt, worauf 10 Einheiten lambda-Exonuclease 111 (BRL) zugegeben wurden. In häufigen Zeitintervallen (beispielsweise alle 2,5 min) wurden 10 ul Aliquote in 100 ul von 30 mmol Natriumacetat eines pH-Wert von 4,5, 250 mmol NaCl, 1 mmol ZnSO&sub4;&sub1; 4 ug/100 ul Hefe-tRNA und 30 Einheiten/100 ul S1-Nuclease verdünnt. Nach 45 min bei 30ºC wurden 15 ul Abstoppuffer aus 625 mmol Tris eines pH- Werts von 9,0, 150 mmol EDTA und 1% SDS zugegeben. Die Proben wurden anschließend mit Phenol extrahiert, worauf wie oben mit Ethanol gefällt wurde. Die DNA-Verdauungsprodukte wurde anschließend durch Agarosegelelektrophorese analysiert und gereinigt.
  • PHENOLEXTRAKTION DER DNA AUS AGAROSE: Die DNA-Banden, die aus Agarosegelen mit niedrigem Schmelzpunkt herausgeschnitten worden waren, wurden auf weniger als 0,5% Agarose auf eine Endkonzentration von 0,3 mol Natriumacetat verdünnt. Die Proben wurden zum Schmelzen der Agarose auf 65ºC erwärmt und anschließend während 5 min auf 37ºC gekühlt. Nach Zugabe eines gleichen Volumens Phenol wurde die Probe dreimal mit Phenol extrahiert (vgl. Phenolextraktion). Die DNA wurde anschließend mit Ethanol gefällt, worauf das Pellet in einer Konzentration von 3 bis 6 fmol DNA/ul resuspendiert wurde.
  • LIGATION: Die DNA wurde durch die Wirkung des Enzyms T4-DNA- Ligase (BRL) miteinander verbunden. Die Ligationsreaktionen enthielten 10 fmol DNA, 20 mmol Tris eines pH-Werts von 7,5, 10 mmol MgCl&sub2;, 10 mmol Dithiothreitol (DTT), 200 umol ATP und 20 Einheiten T4-DNA-Ligase in 10 ul Endreaktionsvolumen. Die Ligation wurde während 3 bis 16 h bei 15ºC durchgeführt.
  • Typischerweise wurden die zu ligierenden DNA-Fragmente in einem äquimolaren Verhältnis zusammen zugegeben. Typischerweise wurden zwei unterschiedliche DNA-Fragmente während der Ligation verbunden, es war jedoch auch die Verbindung von 3 oder 4 verschiedenen DNAs auf einmal möglich.
  • RESTRIKTIONSKARTIERUNG DER DNA: Die Restriktionskartierung der DNA erfolgte gemäß der detaillierten Beschreibung bei Maniatis und Mitarbeiter (1). Sobald sie kloniert war, wurde die DNA mit einer Reihe von verschiedenen Restriktionsenzymen verdaut, worauf die DNAs auf Agarosegelen analysiert und die Größen der erhaltenen Fragmente bestimmt wurden. Eine doppelte Verdauung mit zwei unterschiedlichen Restriktionsenzymen wurde bei derselben DNA-Probe durchgeführt, um bei der Interpretation der Karten zu helfen. Ein weiterer benutzter Ansatz bestand darin, die DNA mit einem Restriktionsenzym, das eine einzelne einzige Stelle in der DNA besitzt, zu schneiden, das Ende der DNA mit ³²P unter Verwendung von T4-DNA-Kinase oder Klenow-DNA-Polymerase (vgl. Polymeraseauffüllreaktion) zu markieren und anschließend die DNA mit anderen Restriktionsenzymen bei niedriger Temperatur oder während kurzer Zeit so zu schneiden, daß lediglich eine teilweise Verdauung stattfand. Die nachfolgende Analyse der Teilverdauungsfragmente auf Agarosegelen diente dazu, die Restriktionsstellen auf der Karte zu ordnen. Alle diese Kartierungsmaßnahmen sind dem Fachmann auf dem einschlägigen Fachgebiet wohlbekannt und detailliert bei Maniatis und Mitarbeitern (1) beschrieben. Die vollständigsten Restriktionskarten können lediglich gebildet werden, wenn die DNA sequenziert worden ist, wobei die Sequenz anschließend mit Hilfe einer Computersuche aller bekannten Restriktionsenzymstellen analysiert wird. Einige unserer Karten wurden aus der Sequenzinformation erstellt.
  • SOUTHERN-BLOTTING DER DNA: Das allgemeine Vorgehen des Southern-Blottings wurde von Maniatis und Mitarbeitern (1) übernommen. Die DNA wurde auf Nitrocellulosefilter (S& S BA85) in 20X SSC (1X SSC = 0,15 mol NaCl, 0,015 mol Natriumcitrat, pH-Wert 7,0) geblottet und in Hybridisierlösung aus 30% Formamid, 1X Denhardt's Lösung (0,02% Polyvinylpyrrolidon (PVP), 0,02% Rinderserumalbumin (BSA), 0,02% Ficoll), 6X SSC, 50 mmol NaH&sub2;PO&sub4;, pH-Wert 6,8, 200 ug/ml Lachssperma-DNA während 4-24 h bei 55ºC vorhybridisiert. Durch Nicktranslation unter Verwendung eines Kits von Bethesda Research Laboratories (BRL) und eines ³²P-markierten Nucleotids markierte Sonden-DNA wurde zugesetzt. Die Sonden-DNA wurde von den nicht eingebauten Nucleotiden mit Hilfe einer NACS-Säule (BRL) oder auf einer Sephadex G50-Säule (Pharmacia) getrennt. Nach einer Hybridisierung über Nacht bei 55ºC wurde das Filter einmal mit 2X SSC bei Raumtemperatur und anschließend zweimal mit 0,1X SSC, 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS) während 30 min bei 55ºC gewaschen. Das Filter wurde getrocknet und autoradiographiert.
  • DNA-TRANSFEKTION ZUR ERZEUGUNG EINES REKOMBINANTEN VIRUS: Das Verfahren basiert auf dem Calciumphosphat-DNA-Fällungsvorgehen von Graham und Van der Eb (32) unter Durchführung der folgenden Modifikationen. Zur Transfektion in tierische Zellen wurden 0,1 bis 0,2 ug Plasmid-DNA, die die durch geeignete klonierte Herpesvirussequenzen flankierte Fremd-DNA enthielt, (der Homoyektor) mit 0,3 ug intakter DNA vermischt. Beide DNAs wurden entweder in H&sub2;O oder in 0,01 mol Tris eines pH-Werts von 7,5 und 1 mmol EDTA aufbewahrt, wobei das Endvolumen weniger als 0,25 ml betragen sollte. Dieses Gemisch wurde mit einem gleichen Volumen gepufferter 2X HEPES-Kochsalzlösung (10 g N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-2- ethansulfonsäure (HEPES), 16 g NaCl, 0,74 g KCl, 0,25 g Na&sub2;HPO&sub4; · 2H&sub2;O, 2 g Dextrose pro l H&sub2;O und gepuffert mit NaOH auf einen pH-Wert von 7,4) versetzt. Anschließend wurde das Gemisch durch Zugabe eines geeigneten Volumens von gepufferter 1X HEPES-Kochsalzlösung (hergestellt durch Verdünnen der obigen Lösung 1 : 1 mit H&sub2;O) auf 0,5 ml verdünnt. Nach dem Vermischen wurden dem DNA-Gemisch 35 ul 2,2 mol CaCl&sub2; zugegeben, worauf das ganze vermischt wurde. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur während 30 min inkubiert. Das Medium wurde aus einer 80%igen konfluenten Monoschicht von Kaninchenhautzellen, Verozellen oder CEF-Zellen, die in einem 25 cm²-Kolben wuchsen, entfernt, worauf das DNA-Gemisch in den Kolben eingetragen und über den Zellen verteilt wurde. Nach einer 30minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden 5 ml voll ständiges DME-Medium plus 10% fötales Rinderserum zugegeben. Die Zellen wurden 5 h bei 37ºC in einem befeuchteten Inkubator, der 5% CO&sub2; in Luft enthielt, inkubiert. Das Medium wurde nach 5 h entweder mit oder ohne Glycerinschock gewechselt. Sofern er durchgeführt wurde, bestand der Glycerinschock aus einem Entfernen des Mediums und einem Zugeben von 20% Glycerin enthaltendem DME während 3 min bei Raumtemperatur, einem anschließenden Waschen mit 10% Glycerin in DME und einem Waschen in 5% Glycerin in DME und einer anschließenden Zugabe von frischem vollständigem DME-Medium plus 10% fötalem Rinderserum. Die Zellen wurden wie oben während 3-4 Tagen bei 37ºC inkubiert, bis der cytopathische Effekt von dem Virus 50-100% betrug. Das Virus wurde wie oben für die Herstellung der Virusvorratslösungen geerntet. Diese Vorratslösung wurde als Transfektionsvorratslösung bezeichnet und nachfolgend entweder mit oder ohne Selektionsmechanismus zur Anreicherung rekombinanter Plaques gemäß der folgenden Beschreibung bezüglich rekombinanter Viren gescreent.
  • DNA-COTRANSFEKTION ZUR ERZEUGUNG EINES REKOMBINANTEN HVT-VI- RUS: Das Verfahren basiert auf dem Polypren-DMSO-Vorgehen von Kawai und Nishizawa (Mol and Cell bio., Band 4, S. 1172- 1174, 1984) unter Durchführung der folgenden Modifikationen. Die Erzeugung des rekombinanten HVT-Virus hängt von der homologen Rekombination zwischen HVT-Virus-DNA und dem die gewünschte Fremd-DNA, die durch die geeigneten klonierten Herpesvirussequenzen flankiert ist, enthaltenden Plasmidhomologievektor ab. Die Transfektionen erfolgten in 6 cm Schalen (Corning Kunststoff) aus 50% konfluenten primären Hühnerembryofibroblasten (CEF)-Zellen. Die Zellen wurden am Tag zuvor in den CEF-Wachstumsmedien (1X F10/199, 5% fötales Kalbserum, 2% Glutamin, 1% nicht essentielle Aminosäuren und 2% Penicillin/Streptomycin), die 4 ug/ml Polypren (Vorratslösung 4 mg/ml in 1X HBSS) enthielten, ausplattiert. Für die Cotransfektionen in CEF-Zellen wurden 5 ug Plasmidhomologievektor mit 5 ug intakter HVT-DNA vermischt, worauf das Gemisch in 1 ml CEF-Medium, das 30 ug/ml Polypren (Vorratslösung 4 mg/ml in 1X HBSS) enthielt, suspendiert wurde. Die DNA-Polypren-Suspension (1 ml) wurde anschließend in eine 6 cm Schale von CEF-Zellen, woraus das Medium abgesaugt worden war, eingetragen, worauf 30 min bei 39ºC inkubiert wurde. Die Schalen wurden während dieses Zeitraums zur abermaligen Verteilung des Impfguts periodisch hin- und herbewegt. Danach wurden 4 ml CEF-Wachstumsmedium direkt in jede Schale eingebracht, und weitere 2,5 h bei 39ºC inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wurde das Medium aus jeder Schale entfernt, worauf die Zellen mit 2 ml 30%igem DMSO (Dimethylsulfoxid, J.T. Baker Chemical Co.) in 1X HBSS während 4 min bei Raumtemperatur geschockt bzw. geschreckt wurden. Das 30%ige DMSO wurde sorgfältig entfernt, worauf die Monoschichten einmal mit 1X HBSS bei Raumtemperatur gewaschen wurden. Die Zellen wurden anschließend nach Zugabe von 5 ml CEF-Wachstumsmedium bei 39ºC inkubiert. Am nächsten Tag wurde das Medium gewechselt, um jegliche letzte Spuren von DM50 zu entfernen und ein Zellwachstum zu stimulieren. Der cytopathische Effekt von dem Virus wurde innerhalb von 6 Tagen sichtbar. Die Herstellung einer einen hohen Titer aufweisenden Vorratslösung (80%-90% CPE) kann üblicherweise innerhalb 1 Woche von diesem Tag weg erfolgen. HVT-Vorratsproben wurden durch Resuspendieren der infizierten Zellen in CEF-Wachstumsmedium, das 20% fötales Kalbserum und 10% DMSO enthielt, hergestellt und bei -70ºC aufbewahrt.
  • DIREKTES LIGATIONSVORGEHEN ZUR ERZEUGUNG VON REKOMBINANTEN HERPESVIREN: Anstelle der Verwendung von Homovektoren und des Zurückgreifens auf eine homologe Rekombination zur Erzeugung von rekombinanten Viren wurde die Technik der direkten Ligation entwickelt, um fremde Gene in Herpesviren zu insertieren. In diesem Fall erforderte das klonierte Fremdgen keine flankierenden Herpesvirus-DNA-Sequenzen, sondern lediglich, daß es verfügbare Restriktionsstellen aufweist, um das Fremdgenfragment aus dem Plasmidvektor heraus zuschneiden. Zum Schneiden der Herpesvirus-DNA wurde ein kompatibles Restriktionsenzym verwendet. Eine Anforderung an die Technik bestand darin, daß das zum Schneiden der Herpesvirus-DNA verwendete Restriktionsenzym an einer begrenzten Zahl von Stellen, vorzugsweise an weniger als drei Stellen, schneiden muß. Für PRV-DNA haben wir xbaI verwendet, das die PRV-DNA an zwei Stellen schneidet und die Verwendung von HindIII (2 Schnitte), EcoRV (2 oder 3 Schnitte) oder NdeI (3-5 Schnitte) in Erwägung gezogen. Die Herpesvirus-DNA wurde mit einem 30fachen molaren Überschuß von Plasmid-DNA vermischt, worauf das Gemisch mit dem geeigneten Restriktionsenzym geschnitten wurde. Das DNA-Gemisch wurde mit Phenol extrahiert und, mit Ethanol gefällt, um die Restriktionsenzyme zu entfernen, worauf entsprechend dem detailliert oben ausgeführten Ligationsvorgehen miteinander ligiert wurde. Das ligierte DNA-Gemisch wurde anschließend mit Phenol extrahiert, mit Ethanol gefällt und in 298 ul aus 0,01 mol Tris eines pH-Werts von 7,5 und 1 mmol EDTA resuspendiert. Nach Zugabe von 42 ul von 2 mol CaCl&sub2; und anschließender Zugabe eines gleichen Volumens von gepufferter 1X HEPES- Kochsalzlösung (vgl. oben) wurde die Probe zur Transfektion von tierischen Zellen gemäß der obigen Beschreibung verwendet.
  • Das Virus in der Transfektionsvorratslösung wurde anschließend bezüglich Fremd-DNA-Inserte gemäß der folgenden Beschreibung gescreent. Der Vorteil der direkten Ligationstechnik bestand darin, daß sie in geringerem Maße die Konstruktion von Subklonen im Plasmidzustand erforderte und daß das rekombinante Virus in der Transfektionsvorratslösung in viel größerer Häufigkeit als bei homologer Rekombination vorhanden war.
  • HAT-AUSWAHL VON THYMIDINKINASE EXPRIMIERENDEN REKOMBINANTEN- HERPESVIREN: Es wurden Deletionsmutanten von Herpesviren konstruiert, die Deletionen im Thymidinkinase (TK)-Gen erfahren hatten. Diese PRV-Stämme wurden S-PRV-002 und S-PRV- 003 genannt und beim ATCC unter der Hinterlegungsnr. VR 2107 bzw. VR 2108 hinterlegt. Diese TK-minus (TK-)-Viren wurden als Empfänger der Insertion des fremden Herpes-simplex Typ 1 (HSV-1)-TK-Gens verwendet. Ein HSV-1-TK-Gen, das wir verwendeten, enthält den HSV-1-ICP4-Promotor und stammte von B. Roizman (16). Es wurde beispielsweise durch Insertion des TK-Gens in das PRV BamHI #5-Fragment zwischen die XbaI-Stelle und HpaI-Stelle subkloniert, um zwischen zwei flankierenden Bereichen von PRV-DNA zu liegen. Das Plasmidkonstrukt wurde anschließend mit der PRV-TK-minus-DNA transfiziert, wobei ein rekombinantes Virus erhalten wurde. Die Transfektionsvorratslösung wurde bezüglich des TK-enthaltenden Virus durch das in (35) beschriebene HAT-Auswahlvorgehen angereichert. Die Transfektionsvorratslösung wurde verwendet, um Monoschichten der 143 TK-minus-Zellen in 60 mm Kulturschalen, die während 16 h bei 37ºC in HAT-Medium (HAT-Medium: Medium 199 mit 2 mmol Glutamin, 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 Einheiten/ml Streptomycin, 10% fötalem Rinderserum, 5 &sub1; 10&supmin;&sup5; mol Hypoxanthin, 10&supmin;&sup5; mol Thymidin, 5 · 10&supmin;&sup6; mol Aminopterin) vorinkubiert worden waren), zu infizieren. Proben des Transfektionsvorratsvirus wurden unter Verwendung von 10&supmin;³ bis 10&supmin;&sup7; Verdünnungen des Virus in die 143 TK-minus- Zellen infiziert. Nach 1 oder 2 Tagen bei 37ºC wurden die mit der höchsten Verdünnung an Virus angeimpften und noch Virusplaques zeigenden Schalen bezüglich der Virusvorratslösungen geerntet, worauf die Auswahl ein zweites Mal wiederholt wurde. Die aus der zweiten HAT-Auswahl geerntete Virusvorratslösung wurde in einem Plaqueassay verwendet, wobei einzelne Plaques herausgenommen und bezüglich fremder DNA- Inserte gemäß der folgenden Beschreibung getestet wurden.
  • BROMDESOXYURIDINAUSWAHL REKOMBINANTER HERPESVIREN: Zur Insertion eines Fremdgens an die Stelle eines bereits in dem Herpesvirusgenom vorhandenen TK-Gens wurde das Fremdgen in Plasmide so kloniert, daß es dieselben flankierenden Homologiebereiche wie die TK-Gene enthielt. Diese flankierenden Bereiche können Teil des TK-Gens selbst oder Teil des das TK-Gen flankierenden Herpesvirus sein. In jedem Fall wurde die das Fremdgen enthaltende Plasmid-DNA mit intakter Herpesvirus-Genom-DNA, die das HSV-1-TK-Gen enthielt, transfiziert. Die Transfektionsvorratslösung des rekombinanten Virus wurde für zwei Selektionen in 143 TK-minus-Zellen in Anwesenheit von 40 ug/ml Bromdesoxyuridin (BUDR, Sigma) in voll ständigem DME-Medium plus 10% fötalem Rinderserum gezüchtet. Das Arzneimittel BUDR ist ein Thymidinanaloges, das durch das Virusenzym Thymidinkinase (TK) erkannt wird und schließlich in die DNA eingebaut wird. Nach dem Einbau in die DNA ist BUDR mutagen und letal und wählt somit gegen Viren aus, die ein aktives TK-Gen besitzen. Durch dieses Auswahlverfahren wurden Viren, bei denen das TK-Gen durch ein Fremdgen durch homologe Rekombination ausgetauscht worden war, in der Population angereichert. Ein Screenen bezüglich der rekombinanten Viren erfolgte anschließend im Rahmen einer der im folgenden beschriebenen Techniken.
  • HYBRIDISIERUNGSUNTERSUCHUNG BEZÜGLICH REKOMBINANTER HERPES- VIREN: Ein verwendetes Vorgehen ist in (36) beschrieben. Diese Technik umfaßt die Durchführung einer Plaqueuntersuchung auf PRV unter Agarose, das Entfernen der Agarose, sobald sich Plaques gebildet haben, und ein Anheben der Zellmonoschicht aus der Schale auf ein Nitrocellulosemembranfilter. Das Filter wurde anschließend im Rahmen des oben detailliert beschriebenen Southern-Vorgehens zur DNA- Hybridisierung behandelt. Die in dem Vorgehen verwendete DNA-Sonde wurde aus dem Fremdgen, das in das Virus insertiert worden war, hergestellt. Somit wurden das Fremdgen enthaltende Plaques identifiziert und aus der aufbewahrten Agarosedeckschicht herausgenommen.
  • BLUOGALUNTERSUCHUNG BEZÜGLICH REKOMBINANTER HERPESVIREN: Wenn das Fremdgen für das Enzym beta-Galactosidase kodierte, wurden die das Gen enthaltenden Plaques auf einfachere Weise sichtbar gemacht. Die Chemikalie Bluogal (BRL) wurde in einer Menge von 200-300 ug/ml während der Plaqueuntersuchung in die Agarosedeckschicht eingearbeitet, worauf sich die Plaques, die aktive beta-Galactosidase exprimierten, blau färbten. Die blauen Plaques wurden anschließend durch weitere Isolierungen von blauen Plaques aufgenommen und gereinigt. Andere Fremdgene wurden durch homologe Rekombination in einer Weise insertiert, daß sie das beta-Galactosidasegen ersetzten. In diesem Fall wurden zur Reinigung des rekombinanten Virus nicht blaue Plaques aufgenommen.
  • ANTIKÖRPERUNTERSUCHUNG BEZÜGLICH REKOMBINANTER HERPESVIREN: Ein drittes Verfahren zum Screenen der Vorratslösung von rekombinanten Viren bestand darin, mit Antikörpern direkt auf die Expression des Fremdgens zu schauen. Die Herpesvirusplaques wurden gekennzeichnet (spotted) und durch Führen eines Zahnstochers durch die Agarose hindurch oberhalb des Plaques und Abstreifen der Plaquefläche auf der Schale aufgenommen. Anschließend wurden die Viren von dem Zahnstocher durch Ein-. bringen des Zahnstochers in eine Ausnehmung einer 96 Ausnehmungen aufweisenden Mikrotiterplatte (Falcon-Kunststoff), die eine konfluente Monoschicht von Gewebekulturzellen, die dreimal in DME-Medium ohne Serum gewaschen worden waren, enthielt, gespült. Es war wichtig, daß das Virus in dieser Stufe ohne Serum wuchs, um zu gewährleisten, daß das immunologische Vorgehen funktioniert. Nachdem der cytopathische Effekt vollständig war, wurden die Platten auf -70ºC gebracht, um ein Gefrieren und eine Lyse der Zellen zu erreichen. Das Medium wurde aufgetaut, worauf das Gefrier/Auftau- Vorgehen ein zweites Mal wiederholt wurde. Anschließend wurden 50 bis 100 ul Medium aus jeder Ausnehmung entfernt und unter Verwendung einer Dot-Blot-Vorrichtung (BRL) unter Vakuum durch eine Nitrocellulosemembran (S& S BA85) filtriert. Die Filterblots wurden in einer Blockierlösung von 0,01 mol Tris eines pH-Werts von 7,5, 0,1 mol NaCl und 3% Rinderserumalbumin während 2 h unter Schütteln bei Raumtemperatur eingeweicht. Die Filterblots wurden anschließend in einen verschließbaren Behälter (Sears Seal-A-Meal oder eine äquivalente Vorrichtung) eingebracht, worauf 10 ml Blockierlösung, die 10 ul eines für das Fremdprotein spezifischen Antikörpers enthielt, zugegeben wurden. Nach Inkubieren über Nacht bei Raumtemperatur unter Schütteln wurde, der Blot dreimal mit 100 ml 0,01 mol Tris eines pH-Werts von 7,5, 0,1 mol NaCl und 0,5% Tween-20-Reinigungsmittel (Sigma) gewaschen. Der Blot wurde in einen anderen verschließbaren Behälter eingebracht, worauf 10 ml Blockierlösung, die 106 Counts pro min von ¹²&sup5;I-Protein A (New England Nuclear) enthielt, zugegeben wurden. Nachdem das Protein A während 2 h bei Raumtemperatur unter Schütteln an den Antikörper gebunden hatte, wurde der Blot wie oben gewaschen, getrocknet und mit einem Röntgenfilm und einem Verstärkerschirm (Dupont) überschichtet. Anschließend wurde während 1-3 Tagen bei -70ºC autoradiographiert. Der Film wurde nach Standardverfahren entwickelt. Das Virus aus den positiven Ausnehmungen, das das rekombinante Virus enthielt, wurde weiter gereinigt.
  • WESTERNBLOTVORGEHEN: Proben der Zellysate, positive Vergleiche und Proteinstandards wurden auf einem Polyacrylamidgel entsprechend dem Vorgehen von Laemmli (42) laufengelassen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel in einem Transferpuffer (0,025 mol Tris-Grundlage, 0,192 mol Glycin, 20% Methanol) plus 0,1% SDS während 20 min eingeweicht. Der Stapelgelteil wurde entfernt und das Trenngel auf ein Whatman-3- mm-Papier aufgebracht. Ein Nitrocellulosefilterblatt passender Größe wurde in Transferpuffer vorbenetzt und auf das Polyacrylamidgel aufgebracht, um das Gel vollständig zu bedecken und einen innigen Kontakt herzustellen. Auf die Oberseite des Nitrocellulosefilters wurde ein vorbenetztes Blatt Whatman-3-mm-Papier aufgebracht, um ein "Sandwich" zu erzeugen. Dieses Sandwich wurde in eine Elektrophoresetransfervorrichtung (Biorad) eingesetzt. Das Sandwich wurde vollständig in Transferpuffer untergetaucht. Der Elektrophoresetransfer erfolgte während 3 h bei 250 mA. Nach dem Transfer wurde das Nitrocellulosefilter aus der Baueinheit entfernt und in eine 50 ml Blockierpuffer (50 mg/ml-Rinderserumalbumin, 10 mmol Magnesiumchlorid, 100 mmol Kaliumchlorid, 1 mmol Calciumchlorid, 10 mmol Imidazol eines pH-Werts von 7,0, 0,3% Tween-20, 0,02% Natriumazid) enthaltende Schale gelegt. Der Nitrocelluloseblot wurde 1-2 h in Blockierpuffer bei Raumtemperatur auf einem Schüttler inkubiert. Der Blot wurde anschließend in einen 15 ml Blockierpuffer plus das spezifische Antiserum als Sonde enthaltenden verschließbaren Behälter eingebracht und über Nacht bei 37ºC auf einem Schüttler inkubiert. Der Blot wurde anschließend aus der Sondenlösung entfernt und mit 5-6 mal gewechselter phosphatgepufferter Kochsalzlösung über eine Periode von 1 h hinweg gespült. Die phosphatgepufferte Kochsalzlösung wurde entfernt, worauf 50 ml eines 5 · 105 cpm ¹²&sup5;I markiertes Protein A (Amersham) enthaltenden Blockierpuffers zugegeben wurden. Der Blot wurde 1 h mit der Lösung des markierten Proteins A inkubiert, worauf die Lösung des markierten Proteins A entfernt und der Blot unter fünf- bis sechsmaligem Wechseln der phosphatgepufferten Kochsalzlösung, die 0,3% Tween-20 enthielt, gespült wurde. Der Blot wurde an Luft getrocknet und über Nacht mit einem Verstärkerschirm autoradiographiert.
  • VERFAHREN ZUR CDNA-KLONIERUNG VON SCHWEINEROTAVIRUS-gp38-GEN VIRUSWACHSTUM: Der OSU-Stamm von Schweinerotavirus (ATCC VR- 892) wurde auf MA-104-Zellen (Nierenzellen von Rhesusaffen von MA Bioproducts) vermehrt. Konfluente Monoschichten wurden bei einer Infektionsmultiplizität von mehr als 10 in DMEM, das 5 ug/ml Trypsin enthielt, infiziert. Die Zellen wurden mit dem Virus während 48 h oder bis zur Erreichung eines cytopathischen Effekts inkubiert. Das Medium und die Zellbruchstücke wurden gesammelt und während 20 min bei 4ºC und 10.000 g zentrifugiert. Der das Rotavirus enthaltende Überstand wurde anschließend in einem präparativen Beckman- Ti45-Rotor bei 4ºC und 10.000 g zentrifugiert. Die Viruspellets wurden in 5M-Medium (50 mmol Tris-HCl eines pH-Werts von 7,5, 100 mmol KCl, 10 mmol MgCl&sub2;) resuspendiert und schwach in einem Homogenisator vom Dounce-Typ homogenisiert. Das resuspendierte Virus wurde während 10 min bei 10.000 g zentrifugiert und anschließend auf 25-50% Cäsiumchloridgradienten in 5M-Puffer aufgetragen. Die Gradienten wurden während 4 h bei 20ºC und 100.000 g zentrifugiert. Die zwei blauweißen Banden, die intakte Virionen und Kerne des Rotavirus darstellen, wurden gesammelt und verdünnt, worauf das Cäsiumchloridgradientenvorgehen ein zweites Mal wiederholt wurde. Das aus dem zweiten Gradienten erhaltene Virus wurde über Nacht gegen SM-Puffer bei 4ºC dialysiert.
  • VIRUS-RNA-ISOLIERUNG: Das dialysierte Schweinerotavirus wurde zweimal mit einem gleichen Volumen SDS/Phenol und anschließend abermals zweimal mit Chloroform/isoamylalkohol (24/1) extrahiert. Die doppelsträngige RNA wurde mit Ethanol in Gegenwart von 0,2 mol Natriumacetat gefällt, zentrifugiert und in Wasser resuspendiert. Die Ausbeute betrug typischerweise 100 ug aus 1000 cm² infizierten Zellen.
  • SYNTHESE UND KLONIERUNG VON gp-38-cDNA: 160 ug der doppelsträngigen Schweinerotavirus-RNA, die aus dem obigen Vorgehen erhalten worden war, wurden mit 1 ug eines jeden der beiden synthetischen Oligonucleotidprimer in einem Volumen von 160 ul (die Sequenzen der Primer waren:
  • 5'-GGGAATTCTGCAGGTCACATCATACAATTCTAATCTAAG-3 und 5'- GGGAATTCTGCAGGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGTTTGGCTA-3'), herrührend von der veröffentlichten Sequenz des Rinderrotavirus (24), gemischt. Das RNA-Primergemisch wurde 3 min in einem Wasserbad gekocht und anschließend auf Eis abgeschreckt. Nacheinander wurden 25 ul 1 mol Tris-HCl eines pH-Werts von 8,3, 35 ul 1 mol KCl, 10 ul 0,25 mol MgCl&sub2;, 7 ul 0,7 mol 2-Mercaptoethanol, 7 ul 20 mmol dNTP's und 6 ul Reverse Transcriptase (100 Einheiten) zugegeben. Die Reaktion wurde während 1,5 h bei 42ºC inkubiert, anschließend wurden 10 ul 0,5 mol EDTA eines pH-Werts von 8,0 zugegeben, worauf die Lösung einmal mit Chloroform/Phenol (1/1) extrahiert wurde. Die wäßrige Schicht wurde entfernt und mit 250 ul 4 mol Ammoniumacetat und 1,0 ml 95%igem Ethanol versetzt, worauf das Gemisch in Trockeneis eingefroren und in der Kälte zentrifugiert wurde. Das erhaltene Pellet wurde in 100 ul 10 mmol Tris-HCl eines pH-Werts von 7,5 resuspendiert, worauf das Ammoniumacetatfällungsvorgehen wiederholt wurde. Das Pellet wurde in 100 ul 0,3 mol KOH resuspendiert und bei Raumtemperatur über Nacht und anschließend bei 37ºC während 2 h inkubiert. Die Lösung wurde durch Zugabe von 10 ul 3,0 mol HCl und 25 ul 1,0 mol Tris-HCl eines pH-Werts von 7,5 auf einen neutralen pH-Wert gebracht. Die erhaltene einzelsträngige cDNA wurde anschließend zweimal mit Hilfe des oben beschriebenen Ammoniumacetat/Ethanol-Vorgehens gefällt. Das erhaltene Pellet wurde in 50 ul 10 mmol Tris-HCl eines pH- Werts von 7,5, 100 mmol NaCl, 1 mmol EDTA resuspendiert, in einem Wasserbad während 2 min gekocht und anschließend während 16 h bei 59ºC inkubiert. Die Lösung wurde auf ein Volumen von 15 ul lyophilisiert, worauf die erhaltene doppelsträngige cDNA auf einem 1,0% Agarosegel (Sigma Agarose Typ II) laufengelassen wurde. Die mit Ethidiumbromid angefärbte und bei einer Länge von 1000 bis 1100 Basenpaaren wandernde DNA wurde aus dem Gel herausgeschnitten und in einer CBS- Elektroeluiervorrichtung elektroeluiert. Die Lösung wurde lyophilisiert, worauf die cDNA in 25 ul Wasser resuspendiert wurde. Die Lösung wurde mit 2 ul 1,0 mol Tris-HCl eines pH- Werts von 7,5, 2 ul 1 mol KCl, 1 ul 0,25 mol MgCl&sub2;, 1 ul 20 mmol dNTP's und 5 Einheiten E. coli-DNA-Polymerase 1 versetzt. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur während 15 min inkubiert, anschließend mit Chloroform/Phenol extrahiert und gemäß der obigen Beschreibung mit Ammoniumacetat/Ethanol gefällt. Die erhaltene cDNA wurde unter Verwendung von terminaler Desoxynucleotidtransferase (BRL-Puffer und Enzym wurden verwendet) mit einem dCTP-Schwanz versehen. Die Reaktion wurde mit 2 ul 0,5 mol EDTA abgestoppt, mit Chloroform/Phenol extrahiert und mit Natriumacetat in Gegenwart von 10 ug Träger-tRNA ausgefällt. Die resuspendierte cDNA wurde mit 200 ng von einen dGMP-Schwanz aufweisenden, mit Pst I geschnittenem PBR322 (BRL-Katalog #5355SA) in 200 ul 10 mmol Tris-HCl eines pH-Werts von 7,5, 100 mmol NaCl, 1 mmol EDTA vermischt und danach 5 min auf 65ºC und 2 h auf 57ºC erwärmt. Der annealte cDNA-Vektor pBR322 wurde auf für eine hocheffiziente Transformation hergestellte E. coli-DH- 1-Zellen transformiert. Eine Empfindlichkeit gegenüber Ampicillin und eine Tetracyclinresistenz zeigende Kolonien wurden gezüchtet, worauf DNA hergestellt und mit Pst-I geschnitten wurde, um die Größe des cDNA-Inserts zu bestimmen. Mehrere, Pst-I-Inserte einer Länge von 1050-1100 Basenpaaren aufweisende Klone wurden analysiert, wobei festgestellt wurde, daß sie identische Restriktionsenzymverdauungsmuster aufweisen. Das größte Klon wurde als pSY565 bezeichnet und beim. ATCC unter der Hinterlegungsnr. 53340 hinterlegt. Für eines dieser Klone wurde das 1100 Basenpaare große Pst-I-Insert in den M13-Phagen-Sequenziervektor subkloniert. Die gesamte DNA-Sequenz dieses Klons wurde bestimmt und ist in den Fig. 10A und 10B dargestellt. Die Stelle des offenen Leserahmens von gp38 wurde aus der Aminosäuresequenzhomologie zu bereits veröffentlichten Human- und Rindersequenzen (44) bestimmt.
  • VERFAHREN ZUR cDNA-KLONIERUNG DES RINDERROTAVIRUS-gp38-GENS VIRUSWACHSTUM: Der Kalb-Nebraska-Stamm von Rinderrotavirus (USDA) wurde auf MA-104-Zellen (Nierenzellen von Rhesusaffen von MA Bioproducts) vermehrt. Konfluente Monoschichten wurden bei einer Infektionsmultiplizität von mehr als 10 in DMEM, das 5 ug/ml Trypsin enthielt, infiziert. Die Zellen wurden mit dem Virus während 48 h oder bis zur Erreichung eines cytopathischen Effekts inkubiert. Das Medium und die Zellbruchstücke wurden gesammelt und während 20 min bei 4ºC und 10.000 g zentrifugiert. Der das Rotavirus enthaltende Überstand wurde anschließend in einem präparativen Beckman- Ti45-Rotor bei 4ºC und 10.000 g zentrifugiert. Die Viruspellets wurden in 5M-Medium (50 mmol Tris-HCl eines pH-Werts von 7,5, 100 mmol KCl, 10 mmol MgCl&sub2;) resuspendiert und schwach in einem Homogenisator vom Dounce-Typ homogenisiert. Das resuspendierte Virus wurde während 10 min bei 10.000 g zentrifugiert und anschließend auf 25-50% Cäsiumchloridgradienten in 5M-Puffer aufgetragen. Die Gradienten wurden während 4 h bei 20ºC und 100.000 g zentrifugiert. Die zwei blauweißen Banden, die intakte Virionen und Kerne des Rotavirus darstellen, wurden gesammelt und verdünnt, worauf das Cäsiumchloridgradientenvorgehen ein zweites Mal wiederholt wurde. Das aus dem zweiten Gradienten erhaltene Virus wurde über Nacht gegen 5M-Puffer bei 4ºC dialysiert.
  • VIRUS-RNA-ISOLIERUNG: Das dialysierte Rinderrotavirus wurde zweimal mit einem gleichen Volumen SDS/Phenol und anschließend abermals zweimal mit Chloroform/Isoamylalkohol (24/1) extrahiert. Die doppelsträngige RNA wurde mit Ethanol in Gegenwart von 0,2 mol Natriumacetat gefällt, zentrifugiert und in Wasser resuspendiert. Die Ausbeute betrug typischerweise 100 ug aus 1000 cm² infizierten Zellen.
  • SYNTHESE UND KLONIERUNG VON gp-38-cDNA: 160 ug der doppelsträngigen Rinderrotavirus-RNA, die aus dem obigen Vorgehen erhalten worden war, wurden mit 1 ug eines jeden der beiden synthetischen Oligonucleotidprimer in einem Volumen von 160 ul (die Sequenzen der Primer waren:
  • 5'-GGGAATTCTGCAGGTCACATCATACAATTCTAATCTAAG-3' und 5'- GGGAATTCTGCAGGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGTTTGGCTA-3'), herrührend von der veröffentlichten Sequenz des Rinderrotavirus (24), gemischt. Das RNA-Primergemisch wurde 3 min in einem Wasserbad gekocht und anschließend auf Eis abgeschreckt. Nacheinander wurden 25 ul 1 mol Tris-HCl eines pH-Werts von 8,3, 35 ul 1 mol KCl, 10 ul 0,25 mol MgCl&sub2;, 7 ul 0,7 mol 2-Mercaptoethanol, 7 ul 20 mmol dNTP's und 6 ul Reverse Transcriptase (100 Einheiten) zugegeben. Die Reaktion wurde während 1,5 h bei 42ºC inkubiert, anschließend wurden 1b ul 0,5 mol EDTA eines pH-Werts von 8,0 zugegeben, worauf die Lösung einmal mit Chloroform/Phenol (1/1) extrahiert wurde. Die wäßrige Schicht wurde entfernt, und mit 250 ul 4 mol Ammoniumacetat und 1,0 ml 95%igem Ethanol versetzt, worauf das Gemisch in Trockeneis eingefroren und in der Kälte zentrifugiert wurde. Das erhaltene Pellet wurde in 100 ul 10 mmol Tris-HCl eines pH-Werts von 7,5 resuspendiert, worauf das Ammoniumacetatfällungsvorgehen wiederholt wurde. Das Pellet wurde in 100 ul 0,3 mol KOH resuspendiert und bei Raumtemperatur über Nacht und anschließend bei 37ºC während 2 h inkubiert. Die Lösung wurde durch Zugabe von 10 ul 3,0 mol HCl und 25 ul 1,0 mol Tris-HCl eines pH-Werts von 7,5 auf einen neutralen pH-Wert gebracht. Die erhaltene einzelsträngige cDNA wurde anschließend zweimal mit Hilfe des oben beschriebenen Ammoniumacetat-Ethanol-Vorgehens gefällt. Das erhaltene Pellet wurde in 50 ul 10 mmol Tris-HCl eines pH- Werts von 7,5, 100 mmol NaCl, 1 mmol EDTA resuspendiert, in einem Wasserbad während 2 min gekocht und anschließend während 16 h bei 59ºC inkubiert. Die Lösung wurde auf ein Volumen von 15 ul lyophilisiert, worauf die erhaltene doppelsträngige cDNA auf einem 1,0% Agarosegel (Sigma Agarose Typ II) laufengelassen wurde. Die mit Ethidiumbromid angefärbte und bei einer Länge von 1000 bis 1100 Basenpaaren wandernde DNA wurde aus dem Gel herausgeschnitten und in einer CBS- Elektroeluiervorrichtung elektroeluiert. Die Lösung wurde lyophilisiert, worauf die cDNA in 25 ul Wasser resuspendiert wurde. Die Lösung wurde mit 2 ul 1,0 mol Tris-HCl eines pH- Werts von 7,5, 2 ul 1 mol KCl, 1 ul 0,25 mol MgCl&sub2;, 1 ul 20 mmol dNTP's und 5 Einheiten E. coli-DNA-Polymerase I versetzt. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur während 15 min inkubiert, anschließend mit Chloroform/Phenol extrahiert und gemäß der obigen Beschreibung mit Ammoniumacetat/Ethanol gefällt. Die erhaltene cDNA wurde unter Verwendung von terminaler Desoxynucleotidtransferase (BRL-Puffer und Enzym wurden verwendet) mit einem dCTP-Schwanz versehen. Die Reaktion wurde mit 2 ul 0,5 mol EDTA abgestoppt, mit Chloroform/Phenol extrahiert und mit Natriumacetat in Gegenwart von 10 ug Träger-tRNA ausgefällt. Die resuspendierte cDNA wurde mit 200 ng von einen dGMP-Schwanz aufweisenden, mit Pst-I geschnittenem PBR322 (BRL-Katalog #5355SA) in 200 ul 10 mmol Tris-HCl eines pH-Werts von 7,5, 100 mmol NaCl, 1 mmol EDTA vermischt, worauf 5 min auf 65ºC und 2 h auf 57ºC erwärmt wurde. Der annealte cDNA-Vektor pBR322 wurde auf für eine hocheffiziente Transformation hergestellte E. coli-DH- 1-Zellen transformiert. Eine Empfindlichkeit gegenüber Ampicillin und eine Tetracyclinresistenz zeigende Kolonien wurden gezüchtet, worauf DNA hergestellt und mit Pst I geschnitten wurde, um die Größe des cDNA-Inserts zu bestimmen. Mehrere, Pst-I-Inserte einer Länge von 1050-1100 Basenpaaren aufweisende Klone wurden analysiert, wobei festgestellt wurde, daß sie identische Restriktionsenzymverdauungsmuster aufweisen. Für eines dieser Klone wurde das 1100 Basenpaare große Pst-I-Insert in den Ml3-Phagen-Sequenziervektor subkloniert. Ein Teil der DNA-Sequenz dieses Klons wurde bestimmt, wobei festgestellt wurde, daß sie mit der veröffentlichten Sequenz (24) identisch war.
  • AUSWAHL DER G418-RESISTENTEN HERPESVIREN: Das Antibiotikum G418 (GIBCO) besitzt einen breiten Bereich von Hemmakvitität auf eine Proteinsynthese. Das rekombinante Virus exprimierte jedoch nach Aufnahme des fremden Gens die durch das NEO-Gen kodierte Aminoglycosid-3'-phosphotransferase und wurde gegenüber G418 resistent. Die Transfektionsvorratslösungen der rekombinanten Viren wurden auf MDBK- (für IBR-Virus), Vero- (für PRV) oder QT35- (für HVT)-Zellen in Gegenwart von 500 ug/ml G418 in vollständigem DME-Medium plus 1% fötalem Rinderserum gezüchtet. Nach 1 oder 2 Tagen bei 37ºC wurden die Plaques von den mit der höchsten Verdünnung des Virus angeimpften Platten für die Virusvorratslösungen entnommen. Die Auswahl wurde ein zweites und ein drittes Mal wiederholt. Die aus der G418-Auswahl erzeugten Virusvorratslösungen wurden bezüglich einer NEO-Geninsertion im Rahmen des oben beschriebenen Southern-Blot-Vorgehens des DNA-Hybridisierverfahrens getestet.
  • REINIGUNG VON gpX: gpX wurde aus dem Gewebekulturmedium von infizierten Verozellen, die in vollständigem DME plus 1% fötalem Rinderserum gezüchtet worden waren, gereinigt. Konfluente Verozellen wurden bei einer Infektionsmultiplizität, die 5 entspricht, mit dem Wildtyppseudorabisvirus vom Iowa- S-62-Stamm infiziert. Die Virusproteine wurden mit ¹&sup4;C-Glucosamin und/oder ³&sup5;S-Methionin durch Eintragen der geeigneten Markierung in den Kolben 8 h nach Infektion radioaktiv markiert. Die Zellen und Medien wurden 20 h nach Infektion, wenn die Zellen einen deutlichen cytopathischen Effekt zeigten, geerntet, worauf die Flüssigkeiten zentrifugiert wurden.
  • Die überstehende Flüssigkeit wurde 10fach aufkonzentriert und gegen 0,02 mol Natriumsulfat/0,01 mol Natriumphosphat- Puffer eines pH-Werts von 7,2 (16 h, 0ºC) und anschließend gegen zwei gewechselte 0,01 mol Natriumphosphatpuffer eines pH-Werts von 7,2 (24 h, 0ºC) dialysiert. Das Dialysat wurde 30 min bei 0ºC mit 70%iger Perchlorsäure auf eine Endkonzentration von 0,2 mol Perchlorsäure versetzt, worauf 25 min bei 10.000 l/min zentrifugiert wurde. Die überstehende Flüssigkeit wurde gegen 0,02 mol Tris eines pH-Werts von 8,5 dialysiert.
  • Die Reinigung erfolgte durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie auf einem Beckman-HPCL-Gerät Modell 334.
  • Die säurelöslichen Proteine wurden auf einer Biogel TSK DEAE 5-PW Säule (75 · 75 mm) unter Verwendung eines 60 min Lineargradienten bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,8 ml/min getrennt. Der Ausgangspuffer war 0,02 mol Tris eines pH-Werts von 8,5, der Grenzpuffer war 0,02 Tris eines pH- Werts von 7,0, der 0,75 mol NaCl enthielt.
  • Das gpX eluierte als radioaktiver Hauptpeak bei 64% des Grenzpuffers. Das gewonnene Material bildete 25% der eingesetzten Radioaktivität.
  • ELISATEST: Zur Bestimmung des Immunstatus der Schweine nach Impfung und Herausforderung (bezüglich einer Immunantwort) wurde ein Festphasenenzymimmunoassay (ELISA)-Protokoll verwendet.
  • Eine gereinigte gpX-Antigenlösung (40 ul) wurde an die Ausnehmungen einer Polycarbonatmikrotiterplatte während 2 h bei Raumtemperatur adsorbieren gelassen. Das Antigen lag in einem (0,015 mol) Carbonat-(0,04 mol)Bicarbonat-Puffer eines pH-Werts von 9,6 vor. Die beschichteten Ausnehmungen wurden dreimal mit ELISA-Waschlösung (0,05% Tween-20, nichtionisches Reinigungsmittel in phosphatgepufferter Kochsalzlösung eines pH-Werts von 7,5) gespült.
  • In die Ausnehmungen wurden anschließend 40 ul eines gpX- Antikörper enthaltenden Serums (verdünnt 1 : 10 in Tris-Puffer, der 1% Rinderserumalbumin und 0,05% Tween-20 enthält) eingetragen und 1 h bei 37ºC inkubiert.
  • Das Antiserum wurde entfernt und die Ausnehmungen dreimal mit ELISA-Waschlösung gewaschen. Eine Staphylococcus-Protein A, gekoppelt an Meerrettichperoxidase (Bio-Rad), enthaltende Lösung (verdünnt 1 : 10.000 in dem oben beschriebenen Tris/- BSA/Tween-Puffer) wurde in einer Menge von 50 ul zugegeben, um die Ausnehmungen, die einen Antikörper gegen das spezifische Antigen enthalten, sichtbar zu machen. Die Lösung wurde 1 h bei 37ºC inkubiert, anschließend entfernt, worauf die Ausnehmungen dreimal mit ELISA-Waschlösung gewaschen wurden. 100 ul Substratlösung (gleiche Volumina von Wasserstoffperoxid und ATBS-Puffer (Bio-Rad)) wurden in jede Ausnehmung eingetragen, worauf während 20 min auf eine Farbentstehung gewartet wurde.
  • Die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 ul 0,01 mol Oxalsäure beendet. Die Farbe wurde bei einer Absorption (A) bei 410 nm auf einer automatischen Plattenlesevorrichtung gelesen.
  • IMPFUNTERSUCHUNGEN BEI SCHWEINEN: Entwöhnte Schweine (4-6 Wochen alt) und schwangere Mutterschweine wurden von Schweineherden bezogen, von denen bekannt war, daß sie keine Pseudorabieserkrankung aufweisen. Die Empfänglichkeit der Testtiere gegen Pseudorabies wurde des weiteren durch Testen des Schweineserums auf die Abwesenheit neutralisierender Antikörper gegen Pseudorabiesvirus (PRV) verifiziert. Die entwöhnten Schweine und 3-4 Tage alte Ferkel wurden intramuskulär mit 1 ml Virusflüssigkeit, die etwa 104 bis 106 infektiöse Einheiten enthielt (TCID&sub5;&sub0;), geimpft. Die Tiere wurden jeden Tag nach der Impfung auf widrige Reaktionen (klinische Anzeichen der PRV-Erkrankung) beobachtet und die Körpertemperaturen aufgezeichnet. Proben der Mandelsekretionen wurden entnommen und gezüchtet, um zu bestimmen, ob das Impfstoffvirus auf andere Tiere übertragen und verteilt werden konnte. Eine Immunität wurde durch Messen der PRV-Serum- Antikörpergehalte in wöchentlichen Intervallen und in einigen Fällen durch Herausfordern der geimpften Schweine (bezüglich einer Immunantwort) mit virulentem Virus bestimmt. Im letzteren Fall wurden die geimpften Tiere und eine Gruppe von nicht geimpften Schweinen unter Verwendung einer Virusmenge, die bei mindestens 80% der nicht geimpften Schweinegruppe eine PRV-Erkrankung verursachte, mit dem virulenten Towa-S-62-Stamm-PRV angeimpft. Dies erfolgte etwa 28 Tage nach der Impfung. Die herausgeforderten Tiere wurden täglich auf Krankheitsanzeichen und erhöhte Körpertemperatur beobachtet. Eine Nekropsie erfolgte bei Tieren, die verstarben, wobei ausgewählte Gewebe bezüglich PRV untersucht und gezüchtet wurden.
  • cDNA-KLONIERUNG: Die cDNA-Klonierung meint Verfahren, die verwendet wurden, um RNA-Moleküle in DNA-Moleküle gemäß den Verfahren des Standes der Technik,umzuwandeln. Die Verfahren der Anmelder sind in (57) beschrieben. Bethesda Research Laboratories (Gaithersburg, MD) haben einen cDNA-Klonierungskit entwickelt, der der von den Anmeldern verwendeten Vorgehensweise sehr ähnlich ist und das beste Set von Reagenzien und Protokollen zur Duplizierung unserer Ergebnisse enthält.
  • HERSTELLUNG VON RNA: Zur Klonierung einer Virus-mRNA-Spezies wurde eine gegenüber einer Infektion durch das Virus empfindliche Wirtzellinie bei 5-10 plaquebildenden Einheiten pro Zelle infiziert. Wenn der cytopathische Effekt sichtbar war, jedoch vor der vollständigen Zerstörung, wurde das Medium entfernt und die Zellen in 10 ml Lysepuffer (4 mol Guanidinthiocyanat, 0,1% Antifoam A, 25 mmol Natriumcitrat eines pH-Werts von 7,0, 0,5% N-Lauroylsarcosin, 0,1 mol beta- Mercaptoethanol) lysiert. Das Zellysat wurde in einen sterilisierten Dounce-Homogenisator gegossen und auf Eis 8 bis 10mal homogenisiert, bis die Lösung homogen war. Für eine RNA-Reinigung wurden 3,5 ml Cäsiumchloridlösung (5,7 mol Cäsiumchlorid, 25 mmol Natriumcitrat eines pH-Werts von 7,0) in einem Beckman-SW41-Zentrifugenröhrchen vorsichtig mit 8 ml Zellysat überschichtet. Die Proben wurden während 18 h bei 20ºC und 36.000 l/min in einem Beckman-SW41-Rotor zentrifugiert. Die Röhrchen wurden auf Eis gelegt und die Überstände aus den Röhrchen sorgfältig durch Absaugen ohne Störung des RNA-Pellets entfernt. Das Pellet wurde in 400 ul glasdestilliertem Wasser resuspendiert, worauf 2,6 ml Guanidinlösung (7,5 mol Guanidin-HCl, 25 mmol Natriumcitrat eines pH-Werts von 7,0, 5 mmol Dithiothreitol) zugegeben wurden. Anschließend wurden 0,37 Volumina 1 mol Essigsäure und danach 0,75 Volumina kaltes Ethanol zugegeben, worauf die Probe während 18 h zur Fällung der RNA bei -20ºC aufgehoben wurde. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugation einer Sorvall-Zentrifuge während 10 min bei 4ºC und 10.000 l/min in einem SS34-Rotor zentrifugiert. Das Pellet wurde in 1 ml destilliertem Wasser gelöst, bei 13.000 l/min abermals zentrifugiert und der Überstand gewonnen. Die RNA wurde aus dem Pellet zwei weitere Male wie oben mit 0,5 ml destilliertem Wasser reextrahiert, wobei der Überstand gesammelt wurde. Nach Zugabe von 0,1 Volumen 2 mol Kaliumacetatlösung und anschließender Zugabe von 2 Volumina kaltem Ethanol wurde die Probe während 18 h bei -20ºC aufbewahrt. Die gefällte RNA wurde Zentrifugation in einem SS34-Rotor während 10 min bei 4ºC und 10.000 l/min gesammelt. Das Pellet wurde in 1 ml destilliertem Wasser gelöst und die Konzentration durch Adsorption bei A260/280 bestimmt. Die RNA wurde bei -70ºC aufbewahrt.
  • POLY-A-AUSWAHL: mRNA mit Polyadenylatschwänzen (poly-A) wurde unter Verwendung von oligo-dT-Cellulose (Pharmacia #27 5543-0) ausgewählt. 3 mg Gesamt-RNA wurde gekocht, abgeschreckt und auf eine 100 mg oligo-dT-Cellulosesäule in bindendem Puffer (0,1 mol Tris eines pH-Werts von 7,5, 0,5 mol LiCl, 5 mmol EDTA eines pH-Werts von 8,0, 0,1% Lithiumdodecylsulfat) appliziert. Die festgehaltene poly-A&spplus;-RNA wurde aus der Säule mit Eluierpuffer (5 mmol Tris eines pH-Werts von 7,5, 1 mmol EDTA eines pH-Werts von 8,0, 0,1% Natriumdodecylsulfat) eluiert. Diese mRNA wurde auf eine oligo-dT- Säule in bindendem Puffer reappliziert und abermals in Eluierpuffer eluiert. Die Probe wurde mit 200 mmol Natriumacetat und 2 Volumina kaltem Ethanol während 18 h bei -20ºC gefällt. Die RNA wurde in 50 ul destilliertem Wasser resuspendiert.
  • ERSTSTRANGREAKTION: 10 ug poly-A&spplus;-RNA wurde in 20 mmol Methylquecksilberhydroxid während 6 min bei 22ºC denaturiert. Nach Zugabe von beta-Mercaptoethanol auf 75 mmol wurde die Probe während 5 min bei 22ºC inkubiert. Das Reaktionsgemisch für die Erststrang-cDNA-Synthese in 0,25 ml enthielt 1 ug oligo-dT-Primer (P-L Biochemicals) oder 1 ug synthetischen Primer, 28 Einheiten Placentaribonucleasehemmer (Bethesda Research Labs #5518SA), 100 mmol Tris eines pH-Werts von 8,3, 140 mmol KCl, 10 mmol MgCl&sub2;, 0,8 mmol dATP, dCTP, dGTP und dTTP (Pharmacia), 100 Mikrocurie ³²P-markiertes dCTP (New England Nuclear #NEG-013H) und 180 Einheiten AMV-Reverse-Transkriptase (Molecular Genetics Resources #MG 101). Das Reaktionsgemisch wurde während 90 min bei 42ºC inkubiert, worauf die Reaktion mit 20 mmol EDTA eines pH-Werts von 8,0 beendet wurde. Die Probe wurde mit einem gleichen Volumen Phenol/Chloroform (1/1) extrahiert und mit 2 mol Ammoniumacetat und 2 Volumina kaltem Ethanol während 3 h bei -20ºC gefällt. Nach der Fällung und Zentrifugation wurde das Pellet in 100 ul destilliertem Wasser gelöst. Die Probe wurde auf eine 15 ml G-100-Sephadexsäule (Pharmacia) in Puffer (100 mmol Tris eines pH-Werts von 7,5, 1 mmol EDTA eines pH-Werts von 8,0, 100 mmol NaCl) aufgetragen. Die vorauseilende Kante der eluierten DNA-Fraktionen wurde gesammelt, worauf die DNA durch Lyophilisieren aufkonzentriert wurde, bis das Volumen etwa 100 ul betrug. Anschließend wurde die DNA mit Ammoniumacetat plus Ethanol wie oben gefällt.
  • ZWEITSTRANGREAKTION: Die gesamte Erststrangprobe wurde zur Zweitstrangreaktion, die dem Verfahren von Gubler und Hoffman (57) folgte, mit der Ausnahme, daß 50 ug/ml dNTP's, 5,4 Einheiten DNA-Polymerase I (Boehringer Mannheim #642-711) und 100 Einheiten/ml E. coli-DNA-Ligase (New England Biolabs #205) in einem Gesamtvolumen von 50 ul verwendet wurden, verwendet. Nach der Zweitstrangsynthese wurde die cDNA mit Phenol/Chloroform extrahiert und gefällt. Die DNA wurde in 10 ul destilliertem Wasser resuspendiert, mit 1 ug RNase A während 10 min bei 22ºC behandelt und durch ein 1% Agarosegel (Sigma Typ II Agarose) in 40 mmol Tris-acetatpuffer eines pH-Werts von 6,85 elektrophoresiert. Das Gel wurde mit Ethidiumbromid angefärbt, worauf die DNA im erwarteten Größenbereich aus dem Gel ausgeschnitten und in 8 mmol Trisacetat eines pH-Werts von 6,85 elektroeluiert wurde. Die elektroeluierte DNA wurde zu etwa 100 ul lyophilisiert und, mit Natriumacetat und Ethanol wie oben gefällt. Die DNA wurde in 20 ul Wasser resuspendiert.
  • VERSEHEN DER DNA MIT SCHWÄNZEN (TAILING DER DNA): Oligo-dC- Schwänze wurden der DNA zugegeben, um das Klonieren zu erleichtern. Die Reaktion enthielt die DNA, 100 mmol Kaliumcacodylat eines pH-Werts von 7,2, 0,2 mmol Dithiotreitol, 2 mmol CoCl&sub2;, 80 umol dCTP und 25 Einheiten terminale Desoxynucleotidyltransferase (Molecular Genetic Resources #S1001) in 50 ul. Nach 30 min bei 37ºC wurde die Reaktion mit 10 mmol EDTA beendet, worauf die Probe mit Phenol/Chloroform extrahiert und wie oben gefällt wurde.
  • KLONIEREN DER cDNA: Die DNA-Probe mit dC-Schwänzen wurde an 200 ng Plasmidvektor pBR322, der oligo-dG-Schwänze enthielt (Bethesda Research Labs #5355 SA/SB), in 200 ul 0,01 mol Tris eines pH-Werts von 7,5, 0,1 mol NaCl, 1 mmol EDTA eines pH-Werts von 8,0 während 2 min bei 65ºC und anschließend während 2 h bei 57ºC annealt. Frische kompetente E. coli-DH- 1-Zellen wurden hergestellt und gemäß der Beschreibung von Hanahan (58) unter Verwendung der Hälfte der annealten cDNA- Probe in zwanzig 200 ul Zellaliquoten transformiert. Die transformierten Zellen wurden auf L-Brühe-Agarplatten plus 10 ug/ml Tetracyclin plattiert. Die Kolonien wurden bezüglich der Anwesenheit von Inserten im Ampicillingen unter Verwendung von Ampscreen (Bethesda Research Labs #5537 UA) gescreent, wobei die positiven Kolonien für eine Analyse entnommen wurden.
  • MITTEL ZUR BESTIMMUNG DER EIGNUNG VON GENEN ZUR EXPRESS ION IN HERPESVIREN: Die erste Stufe bei der Analyse besteht darin, den Gesamt-G- + C-gehalt des infragekommenden Gens zu bestimmen. Für eine gute Expression eines Fremdantigens in Herpesviren muß der G + C-Gehalt der Fremd-DNA dem G + C-Gehalt der konkurrierenden mRNAs entsprechen oder diesen übersteigen. Anders gesagt, je höher der G + C-Gehalt des Fremdgens ist, desto besser ist seine Expression. Die zweite Stufe besteht darin, mit Hilfe eines Computerprogramms, beispielsweise des IBI-DNA-Analysesystems, das in Beispiel 24 diskutiert wird, eine "Codondegenerations"-Tabelle für bekannte Gene des Herpesvirus zu konstruieren. Die erhaltene Tabelle der "triplett-Frequenzen" bildet die Endbasis zum Vergleich der Sequenz. Die IBI-DNA-Analyseeinheit liefert einen Weg, die Ähnlichkeit eines beliebigen Gens mit einer Codondegenerationstabelle zu plotten. Aus diesem Plot kann man das relative Passen des Fremdgens zu einem Herpesvirusgen bestimmen (vgl. Beispiel 24).
  • Die Analyse kann dann dazu verwendet werden, eine Voraussage zu machen: Wird das Gen im Kontext eines Herpesvirusgenoms gut exprimiert werden? Je höher der G + C-Gehalt ist, desto besser ist das Zusammenpassen mit dem Herpesviruscodongebrauch, desto höher ist die Expression des Gens im Herpesvirusgenom und desto geringer ist der Bedarf, die erfindungsgemäßen Verfahren durchzuführen.
  • Aus dieser Analyse werden die Mängel im Fremdgen offensichtlich. Wenn der G + C-Gehalt gering ist, muß der G + C-Gehalt erhöht werden. Dies ist ein Weg zur praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung. Wenn die Erhöhung des G + C-Gehalts durch DNA-Synthese praktisch durchgeführt werden soll, besteht das Verfahren der Wahl bei der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung darin, die Codongebrauchsdegeneration des Herpesvirus zu befragen, um die Codons, die am besten zu dem Herpesviruscodongebrauch passen, bei der Synthese zu gebrauchen.
  • FREMDGENE, DIE BEREITS FÜR EINE HERPESVIRUSEXPRESSION GÜN- STIG SIND: Die Anmelder haben einige bereits existierende Gene gefunden, die für die Expression in Herpesviren günstig sind. Die einfachen Fälle sind die Gene, die bereits im Herpesvirusgenom vorhanden sind, d. h. die Herpesvirusgene selbst. Jedoch nicht alle Herpesvirusgene arbeiten in allen anderen Herpesviren. Beispielsweise wird das Truthahn-Herpesvirus (HVT)-Glycoprotein-A-Gen in Pseudorabiesvirus nicht gut exprimiert (unveröffentlichte Arbeit der Anmelder). Dieses Ergebnis wird durch die obige Analyse vorausgesagt: Das HVT-gA-Gen besitzt einen G + C-Gehalt von 47% und das PRV besitzt einen G + C-Gehalt von 70%, so daß ihr Codongebrauch sehr verschieden ist.
  • Die Anmelder haben mehrere Gene verwendet, die in Pseudorabiesvirus gut exprimiert werden, wobei einige auch in IBR und HVT getestet wurden. Diese Gene umfassen das E. coli-beta-Galactosidasegen, das Neomycinresistenzgen und das HSV-1-Thymidinkinasegen. Diese Gene besitzen einen G + C-Gehalt, der über dem mittleren G + C-Gehalt liegt (55-60%), wobei sie chancenreich besser zu dem Pseudorabiescodongebrauch passen als der Mittelwert. Ein zweites Verfahren zur praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung besteht darin, eines dieser Gene zu benutzen, um die Expression des Fremdgens in einem Herpesvirus durch Verknüpfen der beiden Gene zusammen in einer Fusion herbeizuführen.
  • Die meisten der anderen Gene, die für die antigenen Proteine von Tierviren kodieren, besitzen einen relativ niedrigen G + C-Gehalt und passen nicht zum Herpesviruscodongebrauch, wobei ihre Expression in Herpesviren durch die praktische Durchführung der vorliegenden Erfindung verbessert werden kann. Einige Beispiele für diese Viren sind das Schweineparvovirus (37,8% G + C), das Schweine- und Rinderrotavirus (34% G + C), das übertragbare Schweinegastroenteritisvirus (37% G + C), das Parainfluenza-Typ-3-Virus (35% G + C), das Rinderdiarrhövirus, das Newcastle-Erkrankung-Virus (46% G + C), das infektiöse Bronchitis-Virus (36% G + C) und in einem geringeren Ausmaß das infektiöse Schleimbeutelerkrankung-Virus (53% G + C) .
  • BETA-GALACTOSIDASE-ONPG-TESTVERFAHREN (67): Das Testverfahren durchlief die folgenden Stufen:
  • 1. Infizieren von Verozellen oder anderen Zellen bei hoher Infektionsmultiplizität und Warten auf den vollständigen cytopathischen Effekt (üblicherweise am nächsten Tag).
  • 2. Eintragen des Reinigungsmittels NP40 in das Medium in einer jeden Schale auf eine Endkonzentration von 1% (verwende 20% NP40-Vorratslösung in Wasser). Pipettieren, um eine Lyse der Zellen herbeizuführen, und Pelletieren zur Klärung des Überstands. Aufbewahren des Überstands zur Untersuchung.
  • 3. Herstellen von Z-Puffer wie folgt Herstellen einer Vorratslösung von ONPG (o-Nitrophenyl-B, D-Galactopyranosid von Sigma) in einer Konzentration von 4 mg/ml in Z-Puffer. Aufbewahren von sowohl Z-Puffer als auch ONPG-Lösung bei 4ºC in Dunkeln.
  • 4. Für die Reaktion Vermischen von 0,7 ml Z-Puffer, 0,2 ml ONPG-Lösung und 0,1 ml überstehende Probe in einem Röhrchen. Ablaufenlassen der Reaktion bei Raumtemperatur, bis sich eine gelbe Farbe bildet. Die Intensität der gelben Farbe zeigt die beta-gal-Aktivität an.
  • 5. Für eine quantitative Bestimmung müssen Spektrophotometerableseergebnisse bei A420 erhalten werden. Das erste Ablesen muß bei +10-15 min der Reaktion aus Ausgangspunkt erfolgen. Das zweite Ablesen sollte erfolgen, wenn eine gute gelbe Farbe vorhanden ist, vorausgesetzt, die folgenden Zwänge sind erfüllt: Die Reaktion läuft weniger als 20 h und das Ablesen bei A420 muß weniger als 0,9 auf dem Spektrophotometer betragen. Innerhalb dieser Zwänge ist die Reaktion linear. Die Berechnungen der Anmelder sind die folgenden:
  • Rate = [(A420 bei T2) - (A420 bei T1)]/(T2-T1 in min) Einheiten = Rate/0,0045 (ein nmol NP = 0,0045) Gesamteinheiten = Einheiten · Gesamt-ml im Überstand · 10 Eine Einheit = 1 nmol ONPG, umgewandelt in NP pro min.
  • Die Anmelder führten ihre meisten Vergleiche in "Gesamteinheiten" durch. Zur Information bestimmten die Anmelder, daß 267 Einheiten beta-Galactosidaseaktivität 1 ug aktives Protein entspricht.
  • Z-Puffer pro Liter
  • 16,1 g Na&sub2;HPO&sub4; · 7H&sub2;O (0,06 mol)
  • 5,5 g NaH&sub2;PO&sub4; · H&sub2;O (0,04 mol)
  • 0,75 g KCl (0,01 mol)
  • 0,246 g MgSO&sub4; · 7H&sub2;O (0,001 mol)
  • 2,7 ml beta-Mercaptoethanol (0,05 mol)
  • Einstellen des pH-Werts auf 7,3-7,6 (ursprüngliche Literaturstelle sagt auf einen pH-Wert von 7,0) Nicht Autoklavieren
  • SCHUTZ DER GEIMPFTEN SCHWEINE GEGEN PARVOVIRUSVIRÄMIE: 4-6 Wochen alte entwöhnte Schweine wurden aus einer Schweineherde erhalten, von der bekannt war, daß sie frei von Schweineparvovirus ist. Die Empfänglichkeit der Schweine wurde durch Demonstrieren der Abwesenheit von neutralisierenden Serumantikörpern gegen Parvovirus zur Zeit der Impfung verifiziert. Die Schweine erhielten in einem Abstand von 21 bis 28 Tagen zwei Dosen eines 106 PFU Virus enthaltenden Impfstoffs. Eine Impfstoffgruppe erhielt einen im Handel erhältlichen, inaktivierten Parvovirusimpfstoff als zweite Dosis. Die Serumproben wurden wöchentlich zur Bewertung der Serumantikörper auf Pseudorabiesvirus und Schweineparvovirus entnommen. 21 bis 28 Tage nach der zweiten Impfung wurden die geimpften Schweine und zwei nicht geimpfte im Alter passende Schweine orinasal mit virulentem Parvovirus (bezüglich einer Immunantwort) herausgefordert. Die Parvovirusvirämie war das zur Bestimmung der Impfstoffwirksamkeit verwendete Kriterium.
  • Eine Parvovirusvirämie wurde wie folgt gemessen: Ganzblut wurde gesammelt und die Zellen vom Plasma getrennt. Die Lymphozyten wurden durch Passage über einen Ficollgradienten abgetrennt, worauf ihre DNA nach einer Behandlung der Zellen mit Protease und Phenol gewonnen wurde. Die isolierte DNA wurde in einer Slot-Blot-Untersuchung (Schleicher & Schuell) mit ¹²P-markierter Parvovirus-RNA umgesetzt. Die Slot-Blots wurden auf Kronex-Röntgenfilm (Kodak) belichtet und entwickelt.
  • Neutralisierende Parvovirusserumantikörper wurden durch Infizieren von Schweinehodenzellkulturen, die mit wechselnden Verdünnungen von Serum geimpfter Schweine inkubiert worden waren, mit Parvovirus bestimmt. Drei Tage nach Infektion wurden die Zellkulturmonoschichten in Aceton/Methanol fixiert und mit einem polyklonalen Kaninchen-anti-PPV-Serum inkubiert. Die fluoreszierende Markierung war Ziegen-anti- Kaninchen-IgG (Kirkegaard & Perry). Der Serumantikörpertiter wurde so bestimmt, daß er die Verdünnung war, die zu einer 50%igen oder stärkeren Verringerung der fluoreszierenden Herde führte.
    • BEISPIELE BEISPIEL 1 S-PRV-004
  • Wir haben ein Virus geschaffen, das im Verbindungsbereich zwischen der einzigen langen DNA und dem internen Repeat von PRV eine Deletion und im endogenen PRV-Thymidinkinasegen im einzigen langen Bereich eine Deletion aufweist. In die Verbindungsdeletion haben wir das Herpes-simplex-Typ-1 (HSV-1)- Thymidinkinase (TK)-Gen unter Steuerung des ICP4-Promotors kloniert. Dieses Virus wird als S-PRV-004 bezeichnet.
  • Zur Schaffung dieses Virus haben wir zuerst das Sall-#1- Fragment von PRV kloniert. PRV-DNA wurde hergestellt und anschließend mit SalI-Restriktionsenzym geschnitten. Die geschnittene DNA wurde auf einem Agarosegel elektrophoresiert und die größte SalI-Bande (15 kb) von dem Gel gereinigt (vgl. Phenolextraktion der DNA aus Agarose). Die gereinigte DNA wurde in das Plasmid pSP64 ligiert (vgl. Ligation), worauf das DNA-Gemisch verwendet wurde, um E. coli-HB101 gemäß Maniatis und Mitarbeitern (1) zu transformieren. Das SalI- #1-Klon wurde bezüglich der Restriktionsstellen kartiert.
  • Das homologe Rekombinationsvorgehen wurde dazu verwendet, S- PRV-004 zu erzeugen (vgl. Fig. 2). Die genaue Position der Verbindungsstelle wurde durch Sequenzieren der DNA aus dem SalI-#1-Fragment bestimmt. Es wurde festgestellt, daß der Verbindungsbereich zwischen zwei StuI-Stellen gelegen war (Fig. 2A). Zwei DNA-Fragmente aus dem SalI-Klon wurden verwendet, um den Homologievektor für eine Rekombination zu erzeugen. Eines war ein Fragment aus BamHI #8' von StuI bis BamHI und das andere war ein Fragment aus BamHI #8 von BamHI bis StuI (vgl. die Fig. 1B und 2A). Diese Fragmente wurden in die BamHI-Stelle von pSP64 kloniert. Dieses Plasmid wurde mit StuI geschnitten, worauf ein 3,8 kb großes PvuII-Fragment, daß von B. Roizman (16), The University of Chicago, erhalten worden war und den ICP4-Promotor auf dem BamHI-N- Fragment und das HSV-1-TK-Gen auf dem BamHI-Q-Fragment, fusioniert an der BamHI/BglII-Stelle, enthielt, in die StuI- Stelle ligiert wurde. Das Nettoergebnis aus dieser Serie von Klonierungen war ein Plasmid, das eine Deletion von 3 kb zwischen den StuI-Stellen aufwies und in das 3,8 kb des Fremd-TK-Gens eingebaut war (vgl. Fig. 2B). Das TK-Gen wurde somit von PRV-DNA-Sequenzen flankiert, um eine Insertion des Fremdgens in das PRV-Genom durch homologe Rekombination zu gewährleisten. Die Plasmid-DNA wurde zusammen mit der intakten PRV-DNA von S-PRV-003, bei dem es sich um ein eine Deletion im endogenen TK-Gen aufweisendes Pseudorabiesvirus handelt, in Kaninchenhautzellen transfiziert. Die Transfektionsvorratslösung des Virus wurde in HAT-Medium selektiert, worauf das Virus durch Analyse des Restriktionsmusters der aus den infizierten Zellen isolierten DNA identifiziert und ausgewählt wurde.
  • S-PRV-004 enthielt das HSV-1-TK-Gen und exprimierte dieses Gen, wie durch den Einbau von 14C-Thymidin im Rahmen einer bei Tenser und Mitarbeitern (40) beschriebenen Plaqueuntersuchung und durch direkte Analyse der TK-Aktivität in infizierten Zellextrakten gemäß dem Vorgehen von Cheng und Mitarbeitern (41) demonstriert wurde. Die Stelle dieses Gens im Genom von PRV ist in Fig. 2C dargestellt.
  • Sechs entwöhnte Schweine wurden mit 105,0 infektiösen Einheiten S-PRV-004 geimpft und 28 Tage später gemäß dem unter "Impfuntersuchungen bei Schweinen" beschriebenen Vorgehen mit virulentem PRV herausgefordert. Die geimpften Schweine blieben nach der Impfung gesund und entwickelten neutralisierende Serumantikörper gegen PRV (vgl. die folgende Tabelle I). Das Impfstoffvirus wurde nicht aus Sekreten der Nase oder Mandeln gewonnen. Nachdem die Schweine virulentem PRV ausgesetzt worden waren, waren 83% der geimpften Schweine vor einer PRV-Erkrankung geschützt. TABELLE I ANTWORT DER ENTWÖHNTEN, MIT S-PRV-004 GEIMPFTEN UND MIT VIRULENTEM PRV HERAUSGEFORDERTEN SCHWEINE Nach Impfung Nach Herausforderung Antigengehalt Schwein Nr. Tag Klinische Anzeichen Virusisolation Abstrich Schlüssel für klinische Anzeichen: C = ZNS, F = Fieber
    • BEISPIEL 2 S-PRV-005
  • S-PRV-005 ist ein Pseudorabiesvirus, das eine Deletion im Repeatbereich und im endogenen PRV-TK-Gen im einzigen langen Bereich und eine Insertion des HSV-1-TK-Gens unter Steuerung des ICP4-Promotors, die in beide Kopien des Repeatbereichs zwischen der XbaI-Stelle und der HpaI-Stelle im BamHI-#5- Fragment eingebaut ist, besitzt (vgl. Fig. 3).
  • Zur Erzeugung dieses Virus haben wir zuerst aus PRV ein Klon des BamHi-#5-Fragments (Fig. 1B) hergestellt. Das BamHI-#5- Fragment wurde an der BamHI-Stelle in das Plasmid pACYC184 kloniert (vgl. Ligierung oben). Eine Karte des BamHI-#5- Fragments ist in Fig. 3A dargestellt.
  • Das das BamHI-#5-Fragment enthaltende Plasmid wurde mit XbaI und HpaI geschnitten und das linearisierte Plasmid gereinigt (vgl. Phenolextraktion der DNA aus Agarose). Das in Beispiel 1 beschriebene 3,8 kb lange PvuII-Fragment, das das TK-Gen und den ICP4-Promotor enthält, wurde in ähnlicher Weise gereinigt. Die XbaI-Stelle wurde aufgefüllt, um sie stumpfendig zu, machen (vgl. Polymeraseauffüllreaktion), worauf die beiden DNAs vermischt und miteinander ligiert wurden. Das erhaltene Plasmid, in das das TK-Gen in der XbaI-HpaI-Deletion eingebaut war, wurde ausgewählt und durch Restriktionskartierung analysiert (Fig. 3B).
  • Das Plasmid, das das durch PRV-BamHI-#5-Sequenzen flankierte TK-Gen enthielt, wurde dazu verwendet, Kaninchenhautzellen zusammen mit gereinigter DNA aus S-PRV-003, einem Pseudorabiesvirus, das eine Deletion im endogenen TK-Gen aufwies, zu infizieren. Das erhaltene rekombinante PRV, in das in die Deletion in den Repeats das HSV-1-TK-Gen eingebaut war, wurde aus der Transfektionsvorratslösung durch das unter "Hybridisierungsuntersuchung bezüglich rekombinanter Herpesviren" beschriebene Vorgehen ohne jegliche vorhergehende Selektion gescreent und gereinigt.
  • Durch Einbau von ¹&sup4;C-Thymidin im Rahmen einer Plaqueuntersuchung (40), durch Analyse der TK-Aktivität in infizierten Zellysaten (41) und durch Immunonachweis des HSV-1-TK-Proteins gemäß dem oben unter "Antikörperuntersuchung bezüglich rekombinanter Herpesviren" beschriebenen Vorgehen wurde gezeigt, daß das rekombinante PRV S-PRV-005 das HSV-1-TK-Gen exprimiert. Die Stelle dieses Gens im Genom von PRV ist in Fig. 3C dargestellt.
    • BEISPIEL 3 S-PRV-010
  • S-PRV-010 ist ein Pseudorabiesvirus, das eine Deletion im PRV-TK-Gen im einzigen langen Bereich, eine Deletion im Repeatbereich und die Insertion des E. coli-beta-Galactosidasegens (lacZ-Gen), das in beide Kopien der Repeats an der XbaI-Stelle im BamHI-#5-Fragment eingebaut ist, aufweist (vgl. Fig. 5A). Das beta-Galactosidasegen wurde so konstruiert, daß es unter Verwendung des HSV-1-TK-Gen-Promotors, der, wie wir gezeigt haben, in diesem Konstrukt in PRV aktiv ist, exprimiert wird.
  • Das zur Insertion des beta-Galactosidasegens in S-PRV-010 verwendete Verfahren war eine direkte Ligation (vgl. direktes Ligationsvorgehen zur Erzeugung rekombinanter Herpesviren). Das beta-Galactosidasegen befand sich auf dem von Jim Hoch, Scripps Clinic and Research Foundation erhaltenen Plasmid pJF751. Dieses Gen wurde am 5'-Ende mit einer BamHI- Stelle, die mit dem AGT-Initiationscodon entfernt worden war, stumpfendig gemacht, wobei die AvaI-Stelle in pBR322 am anderen Ende verwendet wurde (vgl. Fig. 4A). Der HSV-1-TK- Promotor (Fig. 4B) wurde als ein RsaI-Fragment aus dem McKnight-TK-Gen genommen, gelgereinigt und an ein synthetisches DNA-Stück, das eine BamHI-Stelle in der Sequenz CGGATCCG enthielt, ligiert (Fig. 4C). Nach Verdauung mit BamHI wurde das Fragment in die BamHI-Stelle am Beginn des beta-Galactosidasegens kloniert (Fig. 4D). Das Plasmid wurde mit den E. coli-Plasmiden pSP64 und pSP65 so konstruiert, daß XbaI-Stellen aus den Polylinkern zum Herausschneiden des gesamten Konstrukts aus dem Plasmid verwendet werden konnten. Das Ligationsgemisch wurde zur Transfektion von E. coli HB101 gemäß dem veröffentlichten Vorgehen (Maniatis und Mitarbeiter (1)) verwendet. Dieses Konstrukt wurde so geplant, daß die ersten drei Aminosäuren des Proteins vom HSV-1-TK- Gen, die nächsten vom synthetischen Polylinker und der Rest vom beta-Galactosidasegen stammten. Das Gen enthielt die folgende Sequenz an der Fusionierung zwischen TK und lacZ:
  • 5' CGT ATG GCT TCG TCG GAT CCC GTC GTT TTA . . . . . . 3' MET ala ser ser asp pro val val leu . . . . . . TK-Gen lac Z BamHI-Linker
  • Ein mit S-PRV-002 bezeichnetes Pseudorabiesviruskonstrukt, das eine Deletion im PRV-TK-Gen im einzigen langen Bereich und eine Deletion im Repeatbereich aufwies, wurde als Empfänger für das beta-Galactosidasegen verwendet. Intakte S- PRV-002-DNA wurde mit einem 30fachen molaren Überschuß Plasmid-DNA, die das beta-Galactosidasegen unter Steuerung des HSV-1-TK-Promotors enthielt, vermischt, worauf dieses Gemisch mit einem XbaI-Restriktionsenzym verdaut wurde. Die ligierte DNA wurde zur Transfizierung von tierischen Zellen verwendet, worauf die Transfektionsvorratslösung bezüglich rekombinantem PRV analysiert wurde. Zuerst wurde PRV-DNA aus mit dem Transfektionsvorratsvirus infizierten Zellen hergestellt, worauf diese DNA mit Restriktionsenzymen geschnitten und auf einem Agarosegel analysiert wurde. Diese Analyse zeigte, daß das rekombinante Virus als die Hauptspezies in der Transfektionsvorratslösung vorhanden war. Anschließend wurde das rekombinante Virus von den anderen Virusspezies im Rahmen einer Plaqueuntersuchung, gekoppelt mit der Bluogaluntersuchung bezüglich rekombinanter Herpesviren, gereinigt. Da beta-Galactosidase mit dem Arzneimittel Bluogal unter Bildung eines Produkts mit blauer Farbe reagierte, war es möglich, das rekombinante Virus durch Aufnehmen blauer Plaques plaquezureinigen.
  • Das Endergebnis der Reinigung war das rekombinante PRV mit der Bezeichnung S-PRV-010. Durch die Bildung von blauen Plaques gemäß den obigen Ausführungen und durch Nachweis des Enzyms in infizierten Zellextrakten unter Verwendung des Substrats o-Nitrophenyl-beta-D-galactopyranosid (Sigma) gemäß dem Vorgehen von Norton und Coffin (33) wurde gezeigt, daß das rekombinante PRV S-PRV-010 das Enzym beta-Galactosidase exprimiert. Die Stelle dieses Gens im Genom von PRV ist in Fig. 5C dargestellt.
  • Frühere Untersuchungen zeigten, daß mit S-PRV-002 geimpfte Schweine Antikörper gegen PRV entwickelten und vor einer klinischen Erkrankung, nachdem sie einem virulentem PRV-Virus ausgesetzt worden waren, vollständig geschützt waren. Tieruntersuchungen wurden mit S-PRV-010 durchgeführt, um die Eignung eines rekombinanten Pseudorabiesvirus als Impfstoff gegen eine Pseudorabieserkrankung zu bestimmen.
  • Eine Gruppe von entwöhnten Schweinen und ein Wurf von 4 Tage alten Ferkeln wurde mit S-PRV-010 geimpft und 3-4 Wochen später gemäß "Impfuntersuchungen bei Schweinen" (bezüglich einer Immunantwort) herausgefordert.
  • Die Antworten der mit S-PRV-010 geimpften, entwöhnten Schweine sind in Tabelle II dargestellt. Die Verabreichung dieses Virus verursachte bei den Schweinen keine widrigen Reaktionen. Die geimpften Tiere entwickelten neutralisierende PRV-Antikörper. Zwei mit den geimpften Tieren in Kontakt gebrachte, nicht geimpfte Vergleichstiere (Nr. 75 und Nr. 91) entwickelten vor der Herausforderung keine PRV-Antikörper. Dies zeigt, daß das Impfstoffvirus von den geimpften Tieren nicht übertragen wurde. Nach der Herausforderung blieben alle zehn geimpften Tiere klinisch normal und wiesen keine PRV-Erkrankung auf. Im Gegensatz dazu entwickelten die beiden in Kontakt gebrachten Vergleichstiere und drei der fünf nicht geimpften Vergleichstiere eine PRV-Erkrankung, wobei eines dieser Schweine an PRV verstarb.
  • Um des weiteren die Eignung von S-PRV-010 als Impfstoff zu testen, wurden 4 Tage alte Ferkel mit dem Virus geimpft. Die in Tabelle III dargestellten Ergebnisse zeigten, daß das Virus bei geimpften Ferkeln ein Antikörperansprechen hervorrief und keine widrigen Reaktionen verursachte. Das Virus wurde scheinbar von den geimpften Tieren verbreitet, da eines (Nr. 67) von zwei nicht geimpften, (mit den geimpften Tieren) in Kontakt gebrachten Vergleichsferkeln am 24. Tag PRV-Antikörper gebildet hatte. Nach der Herausforderung blieben alle geimpften Tiere und das seropositive, in Kontakt gebrachte Vergleichstier frei von einer PRV-Erkrankung. Im Vergleich dazu entwickelten die drei nicht geimpften Vergleichsschweine und das zweite in Kontakt gebrachte Vergleichsschwein klinische Anzeichen von PRV und verstarben.
  • Der Schluß aus dieser Untersuchung ist, daß in einer Dosis von 104,0 oder 106,0 gegebenes S-PRV-010 bei geimpften Ferkeln oder entwöhnten Schweinen eine schützende Antwort mit der Fähigkeit zur Verhinderung einer Infektion durch virulentes Virus hervorruft. TABELLE II SEROLOGISCHE UND KLINISCHE ANTWORT ENTWÖHNTER SCHWEINE NACH EINER IMPFUNG MIT S-PRV-010 UND EINER HERAUSFORDERUNG MIT PRV VOM WILDTYP Antikörpertiter Nach Herausforderung Impfstoffgruppe Schwein Nr. Nach Impfung Nach Herausforderung Klinische Anzeichen Tag pro Dosis Depression, Dyspnoe, ZNS-AnzeichenC Rhinitis, ZNS-Anzeichen, Tod a Bestimmt durch RIDEA
  • b In Kontakt gebrachte Vergleichstiere
  • c Die ZNS-Anzeichen umfassen Ataxie, Fehlkoordination, Im- Kreis-Bewegen und Seitenlage
  • NT: Nicht untersucht TABELLE 3 SEROLOGISCHE UND KLINISCHE ANTWORT VON 4 TAGE ALTEN FERKELN NACH IMPFUNG MIT S-PRV-010 UND HERAUSFORDERUNG MIT PRV VOM WILDTYP Antikörpertiter Nach Herausforderung Impfstoffgruppe Schwein Nr. Nach Impfung Klinische Anzeichen Tag pro Dosis In-Kontakt-gebrachte Vergleichstiere Koma, Tod ZNS-Anzeichend, Tod ZNS-Anzeichen, Tod Tod a Bestimmt durch RIDEA b verstarb am 8. Tag nach Impfung an Magendurchbruch c verstarb am oder vor dem 7. Tag nach Herausforderung d Die ZNS-Anzeichen umfassen Ataxie, Fehlkoordination, Im-Kreis-Bewegen und Seitenlage NT: Nicht untersucht
    • BEISPIEL 4 S-PRV-007
  • S-PRV-007 ist ein Pseudorabiesvirus, das eine Deletion im PRV-TK-Gen im einzigen langen Bereich, eine Deletion im Repeatbereich und das in den Repeatbereich insertierte Schweinerotavirus-Glycoprotein-38-Gen unter Steuerung des HSV-1- ICP4-Promotors, aufweist.
  • Das im obigen Beispiel 2 beschriebene S-PRV-005-Virus wurde des weiteren so konstruiert, daß es das Rotavirusantigen (vgl. Fig. 6) wie folgt enthält. Das Schweinerotavirus gp38- Gen wurde im Rahmen des oben beschriebenen Vorgehens an der PstI-Stelle in das Plasmid pBR322 kloniert. Das erhaltene Plasmid wurde als pSY565 bezeichnet (vgl. Fig. 7). Das das gp38 enthaltende, 1090 bp lange PstI-Fragment wurde an der PstI-Stelle derart in den Vektor pUC4K kloniert, daß es in einem als pSY762 bezeichneten Plasmid durch BamHI-Stellen flankiert war.
  • Das Plasmid pSY590 hatte, wie durch das Fließschema gezeigt wird, einen komplexen Ursprung. Diese Klonierungen waren von der Natur her Routineklonierungen und sind von historischem Interesse, jedoch zur praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung nicht strikt erforderlich. Kurz gesagt ist die Historie die folgende:
  • (1) Das McKnight-TK-Gen war das HSV-1-BamHI-Q-Fragment von HaeIII bei-178, bezogen auf die CAP-Stelle bis BamHI bei +2700, das zwischen HindIII und BamHI in pBR327 kloniert war.
  • (2) pSY491: Der gesamte TK-Kodierbereich von der BglII- Stelle bei +55 (bezogen auf die CAP-Stelle) bis zur BamHI- Stelle bei +2700 wurde in die BamHI-Stelle in pSP65 kloniert und als pSY491 bezeichnet.
  • (3) pSY481: Die polyA-Signalsequenz (pA) auf einem 800 bp langen SmaI-Fragment von TK wurde in die SmaI-Stelle in pSP65 subkloniert und als pSY481 bezeichnet.
  • (4) pSY583: Das 800 bp lange pA SmaI-Fragment von pSY481 wurde in die HincII-Stelle in pSP65 kloniert und als pSY583 bezeichnet.
  • (5) pSY429: Das HSV-1-BamHI-N-Fragment wurde von Dr. B. Roizman erhalten, in die BamHI-Stelle von pBR322 kloniert und als pSY429 bezeichnet.
  • (6) pSY584: Das 2,2 kb lange Fragment von BamHI N von PvuII bis BamHI (Ref. 16) in pSY420 wurde in pSP65 zwischen HincII und BamHI im Polylinker subkloniert und als pSY584 bezeichnet.
  • (7) pSY479: Ein Plasmid wurde aus pSP64 und pSP65 konstruiert, das eine fusionierte Polylinkersequenz enthielt. Beide Plasmide wurden mit PstI im Polylinker und PvuI im Plasmidkörper geschnitten. Die Nettowirkung dieses Konstrukts bestand darin, ein als PSP66 bezeichnetes Fusionsplasmid zu erzeugen, das eine symmetrische Polylinkersequenz aufwies, die auf der PstI-Stelle zentriert war. pSY479 ist der Name dieses Plasmids. Es enthält auch ein in die PstI-Stelle kloniertes PstI-Fragment, das für die folgenden Manipulationen ohne Bedeutung ist.
  • Das Plasmid pSY590 wurde aus pSY583, pSY584 und pSY479 in einer drei-Fragment-Ligation der folgenden Elemente geschaffen: Die mit PstI geschnittenen, 3 kb langen Plasmidsequenzen von pSY479 (pSP66), das mit PstI und BamHI aus dem Polylinker in pSY583 herausgeschnittene 800 bp lange SmaI-pA- Fragment und das mit PstI und BamHI aus pSY583 herausgeschnittene, 2200 bp lange BamHI-N-Fragment. Fig. 7 zeigt die Endkonfiguration aller dieser DNA-Fragmente in pSY590. Im Plasmid gibt .es zwischen dem Promotor in BamHI N und dem TK- pA-Signal eine einzelne BamHI-Stelle, die dazu verwendet wurde, den Kodierbereich des gp38-Gens zu insertieren.
  • Für die Erzeugung des bei der Bildung von S-PRV-007 verwendeten Homologievektors wurde das Plasmid pSY590 mit BamHI geöffnet, das 1090 bp lange gp38-Gen aus pSY762 durch Schneiden mit BamHI entfernt und diese beiden Fragmente miteinander unter Bildung von pSY596 ligiert. Die richtige Orientierung des gp38-Gens wurde durch diagnostische Restriktionsenzymverdauung unter Ausnutzung von Stellen mit gp38 bestätigt (vgl. Fig. 10A und 10B).
  • Im oben beschriebenen pSY596 lag das gp38-Gen zwischen zwei flankierenden HSV-1-DNA-Fragmenten. Diese beiden Bereiche waren somit zu ähnlichen Bereichen auf dem HSV-1-TK-Gen in S-PRV-005 homolog, wobei diese Bereiche für die homologe Rekombination unter Erzeugung von S-PRV-007 verwendet wurden (Fig. 6A). Das Plasmid und die S-PRV-005-DNAs wurden im Rahmen des "DNA-Transfektionsvorgehens zur Erzeugung rekombinanter Viren" vermischt und verwendet. Ein Virus, in das das Rotavirusantigen anstelle des TK-Gens eingebaut war, ,wurde mit BUDR ausgewählt. Rekombinante Viren aus der ausgewählten Virusvorratslösung, in die die Rotavirus-DNA eingebaut war, wurden mit Hilfe der "Hybridisieruntersuchung bezüglich rekombinanter Herpesviren" und durch Analyse der Restriktionsverdauungen der DNA mit Hilfe des Southern-Blot-Vorgehens von DNA unter Verwendung des klonierten Rotavirus-gp38-Gens als Sonde gescreent.
  • Das Endergebnis dieser Untersuchung war das rekombinante PRV mit der Bezeichnung S-PRV-007, das das in den Repeatbereich zwischen der XbaI-Stelle und der HpaI-Stelle im in Fig. 6 dargestellten PRV-BamHI-#5-Fragment eingebaute Rotavirusgp38-Gen aufwies. Die Anwesenheit von durch S-PRV-007 exprimiertem gp38 in einem Wirt wurde bis jetzt nicht nachgewiesen.
    • BEISPIEL 5 S-PRV-012
  • S-PRV-012 ist ein Pseudorabiesvirus, das eine Deletion im PRV-TK-Bereich im einzigen langen Bereich, eine Deletion im Repeatbereich und eine Deletion im einzigen kurzen Bereich mit Kodierung für das PRV-Glycoprotein X (als gpX bezeichnet und von Rea und Mitarbeiter (23) identifiziert und kartiert) aufweist. Das HSV-1-TK-Gen unter Steuerung des ICP4-Promotors war an die Stelle des gpX-Gens insertiert.
  • Das folgende Vorgehen wurde dazu verwendet, die Deletion von gpX und die simultane Insertion des HSV-1-TK-Gens durchzuführen. Die flankierenden Bereiche für die Homologie zu PRV stammten aus klonierten Fragmenten des BamHI-#10-Fragments und des BamHI-#7-Fragments mit einer Erstreckung von NdeI bis BamHI (Fig. 8). Die BamHI- und NdeI-Stelle wurden gemäß "Polymeraseauffüllreaktion" aufgefüllt und das PvuII-Fragment der HSV-1-DNA durch "Ligation" insertiert. Dieses Plasmid wurde mit intakter S-PRV-002-DNA gemäß "DNA-Transfektion zur Erzeugung rekombinanter Viren" transfiziert. Das rekombinante Virus wurde durch "HAT-Auswahl rekombinanter Herpesviren" ausgewählt und durch das unter "Antikörperuntersuchung bezüglich rekombinanter Herpesviren" beschriebene Vorgehen unter Verwendung von für das HSV-1- Protein spezifischen Antikörpern gescreent.
  • Das im Rahmen dieses Verfahrens ausgewählte rekombinante Virus wurde mit S-PRV-012 bezeichnet und beim ATCC unter der Hinterlegungsnr. VR-2119 hinterlegt. Durch Restriktionskartierung der DNA und Southern Blotting der DNA wurde gezeigt, daß es das an die Stelle des gpX-Gens insertierte HSV-1-TK- Gen enthielt (Fig. 8B). Das bei "Antikörperuntersuchung bezüglich rekombinanter Herpesviren" beschriebene Vorgehen zeigte, daß das Virus das insertierte HSV-1-TK-Gen exprimierte. Die Struktur dieses Virus ist in Fig. 8C dargestellt.
    • BEISPIEL 6 S-PRV-013
  • S-PRV-013 ist ein Pseudorabiesvirus, das eine Deletion im TK-Gen im einzigen langen Bereich, eine Deletion im Repeatbereich und eine Deletion im gpX-Kodierbereich aufweist. Das Gen für E. coli-beta-Galactosidase (lacZ-Gen) wurde an die Stelle des gpX-Gens insertiert und befindet sich unter Steuerung des endogenen gpX-Gen-Promotors.
  • Das folgende Vorgehen wurde zur Konstruktion von S-PRV-013 durch homologe Rekombination verwendet. Die flankierenden PRV-Homologiebereiche stammten von dem den gpX-Promotor enthaltenden klonierten BamHI-#10-Fragment und von dem sich von der NdeI-Stelle bis zur BamHI-Stelle erstreckenden klonierten BamHI-#7-Fragment (Fig. 9A). Die NdeI-Stelle wurde gemäß "Polymeraseauffüllreaktion" aufgefüllt und das beta-Galactosidasegen zwischen das BamHI-#10- und das BamHI-#7-Fragment insertiert. In diesem Konstrukt lag das beta-Galactosidasegen zwischen dem gpX-Promotor und den gpX-poly-A-Signalsequenzen mit einer Deletion nahezu aller Kodierbereiche von gpX. Die Plasmid-DNA und die DNA von S-PRV-002, einem PRV- Stamm mit einer Deletion in beiden Repeatsequenzen und einer Deletion im Thymidinkinasegen, wurden vermischt und gemäß dem bei "DNA-Transfektion zur Erzeugung rekombinanter Viren" beschriebenen Vorgehen transfiziert. Das rekombinante Virus wurde im Rahmen des bei "Bluogaluntersuchung bezüglich rekombinanter Herpesviren" beschriebenen Vorgehens gescreent und von der Transfektionsvorratslösung gereinigt.
  • Das bei dieser Untersuchung erhaltene Virus wurde als S-PRV- 013 bezeichnet und beim ATCC unter der Hinterlegungsnr. VR 2120 hinterlegt. Es enthielt das beta-Galactosidasegen gemäß Bestimmung durch "Herstellung von Herpesvirus-DNA" und anschließendes "Southern-Blotting von DNA" an der Stelle der gpX-Kodierbereiche (Fig. 9B und 9C). Die Expression des beta-Galactosidasegens wurde durch den bei "Bluogaluntersuchung bezüglich rekombinanter Herpesviren" beschriebenen Test und durch die o-Nitrophenylgalactopyranosidsubstratuntersuchung (33) bestätigt.
  • Zur Bestätigung, daß der Kodierbereich für gpX aus S-PRV-013 entfernt worden war, wurde aus einer Vorratslösung von gereinigtem S-PRV-013 extrahierte DNA mit BamHI verdaut und die Fragmente auf einer Agarosegelelektrophorese getrennt und durch Southern-Blot-Hybridisierung analysiert. Die Hybridisierungssonde war das BamHI-NDE-Fragment des Pseudorabies-BamHI-#7-Fragments aus dem einzigen kurzen Bereich. Dieses Sondenfragment umfaßte 90% der Kodiersequenzen von gpX. Bei dieser Analyse zeigte es sich, daß der gpX-Bereich in S-PRV-013 fehlt.
  • Um diese Ergebnisse zu bestätigen, wurden Zellen mit entweder Pseudorabies vom Wildtyp, S-PRV-012 oder S-PRV-013 infiziert, worauf Medienproben aus den infizierten Kulturen einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese unterzogen wurden. Die Zellen wurden im Rahmen des Western-Blot-Vorgehens geblottet und analysiert. Das verwendete Antiserum war ein gegen ein antigenes, mit Rinderserumalbumin verknüpftes, chemisch synthetisiertes gpX-Peptid erzeugtes hyperimmunes Kaninchenserum. Wie in Fig. 4 dargestellt, ist gpX im Medium der mit Virus vom Wildtyp (PRV 000) infizierten Zellen vorherrschend, es wird im Medium von mit S-PRV-012 oder S-PRV- 013 infizierten Zellen jedoch nicht nachgewiesen. Diese Ergebnisse zeigen, daß das gpX-Gen sowohl bei S-PRV-012 als auch bei S-PRV-013 fehlt und daß das Protein gpX bei mit entweder S-PRV-012 oder S-PRV-13 infizierten Zellen nicht gebildet wird.
  • Die folgenden Experimente zeigen, daß S-PRV-013 als Impfstoff zum Schutz von Schweinen vor einer Pseudorabieserkrankung verwendet werden kann und daß S-PRV-013 eine Immunantwort hervorruft, die ohne Schwierigkeiten von der Infektion durch Wildtypvirus unterschieden werden kann.
  • In der ersten Untersuchung wurden empfängliche entwöhnte Schweine und vier Tage alte Ferkel intramuskulär mit S-PRV- 013 wie folgt geimpft: 4 Tiere einer jeden Gruppe wurden mit 10&sup6; TClD&sub5;&sub0; geimpft und 4 Tiere erhielten 10&sup4; TClD&sub5;&sub0; Virus. Die Tiere wurden beobachtet und anschließend wie bei "Impfuntersuchungen bei Schweinen" beschrieben, (bezüglich einer Immunantwort) herausgefordert (vgl. folgende Tabelle IV). TABELLE IV ANTWORT VON MIT S-PRV-013 GEIMPFTEN UND MIT VTRULENTEM PRV HERAUSGEFORDERTEN, 4 TAGE ALTEN FERKELN Nach Impfung Nach Herausforderung Schweinegruppe Impfstoffdosis Schwein Nr. Antikörper Tag klinische Anzeichen Virusisolation entwöhnt Ferkel In-Kontakt-gebrachte Vergleichstiere Herausgeforderte Vergleichstiere nicht applizierbar a Schlüssel für die klinischen Anzeichen: NEG = negativ, C = ZNS, D = Tod, F = Fieber, R = Atmung, S = Durchfall b nicht untersucht c getötet am 4. Tag nach der Impfung d getötet am 7. Tag nach der Impfung; ein einen schlechten Eindruck machender Kümmerling
  • Nach der Impfung waren alle Tiere frei von widrigen Reaktionen, wobei alle Tiere mit Ausnahme von zwei (entwöhnten Schweinen) neutralisierende Serumantikörpertiter von 1 : 2 bis 1 : 64 entwickelten. Das Virus wurde aus Mandelabstrichen irgendeines Schweins oder aus dem Ferkel Nr. 11, das am Tag 4 getötet worden war, entnommenen Geweben nicht gewonnen. Eines von zwei in-Kontakt-gebrachten Vergleichsferkeln (Nr. 19) wurde im Rahmen des Experiments am 7. Tag getötet, da es ein Kümmerling war und einen schlechten Eindruck machte. Gewebe aus diesem Ferkel waren bei Züchtung bezüglich PRV negativ. Das andere in-Kontakt-gebrachte Vergleichstier blieb gesund und entwickelte vor dem Herausfordern keine PRV-Antikörper.
  • Nach der Herausforderung blieben alle geimpften Tiere klinisch normal und entwickelten eine Sekundärantikörperantwort. Das in-Kontakt-gebrachte Vergleichsferkel und die drei herausgeforderten Vergleichsschweine entwickelten alle typische ZNS-Anzeichen von PRV, wobei ein Vergleichstier nach der Herausforderung starb.
  • In einer zweiten Untersuchung mit S-PRV-013 unter Verwendung größerer Anzahlen von Tieren wurden zwei Würfe empfänglicher 3 Tage alter Ferkel und eine Gruppe von 15 empfänglichen entwöhnten Schweinen mit 104 TClD&sub5;&sub0;-Virus geimpft und anschließend wie bei "Impfuntersuchungen mit Schweinen" beschrieben, (bezüglich einer Immunantwort) herausgefordert (vgl. die folgenden Tabellen V und VI). TABELLE V ANTWORT DER MIT S-PRV-013 GEIMPFTEN UND MIT VIRULENTEM PRV HERAUSGEFORDERTEN 3 TAGE ALTEN FERKEL Nach Impfung Nach Herausforderung Antikörper Gruppe Schwein Nr. Tag klinische Anzeichen Virusisolation geimpfte Tiere des Wurfs Neg In-Kontakt gebrachte Vergleichstiere herausgeforderte Vergleichstiere nicht applizierbar Abstrich Mandeln a klinische Anzeichen: NEG = negativ, C = ZNS, D = Tod, F = Fieber, R = Atmung b eine Temperaturerhöhung von 1ºF wurde bei diesen geimpften Tieren am Tag 1 beobachtet. TABELLE VI ANTWORT DER MIT S-PRV-013 GEIMPFTEN UND MIT VIRULENTEM PRV HERAUSGEFORDERTEN, ENTWÖHNTEN SCHWEINEN Nach Impfung Nach Herausforderung Antikörper Gruppe Schwein Nr. Tag klinische Anzeichen Virusisolation geimpfte Tiere Neg nicht applizierbar Vergleichstiere Mandeln, a Klinische Anzeichen: NEG = negativ, C = ZNS, D = Tod, F = Fieber, R = Atmung b nicht untersucht
  • In diesem Experiment blieben alle geimpften Tiere nach der Impfung gesund, entwickelten neutralisierende Serumantikörper gegen PRV und verbreiteten keinen Impfstoffvirus in Mandelsekreten. Nach der Herausforderung mit virulentem Virus bleiben die geimpften Tiere beider Altersgruppen ohne PRV- Erkrankung, während die drei nicht geimpften, in-Kontakt-gebrachten Vergleichstiere und 10 von 11 herausgeforderten Vergleichstieren eine strenge Pseudorabieserkrankung erfuhren.
  • Die aus den geimpften und herausgeforderten Schweinen gesammelten Serumproben wurden mit Hilfe des gpX-ELISA-Tests untersucht. Da das Gen für gpX aus S-PRV-013 deletiert war, wurde erwartet, daß mit S-PRV-013 geimpfte Schweine beim ELISA-Test für dieses Antigen seronegativ sind. Der Herausforderungsvirus trägt ist das gpX-Gen. Die geimpften Tiere waren durch die Impfung vor der Pseudorabieserkrankung bei Herausforderung mit dem Virus vom Wildtyp geschützt. Die geimpften Tiere waren jedoch durch den Herausforderungsstamm asymptotisch superinfiziert, so daß erwartet wurde, daß sie bei Herausforderung Antikörper gegen gpX bilden.
  • Wie in Fig. 5 dargestellt, blieb das Serum eines mit S-PRV- 013 geimpften Tiers für gpX negativ bis nach der Herausforderung mit dem Virus vom Wildtyp. Diese Ergebnisse zeigen, daß S-PRV-013 ein wirksamer Impfstoffstamm ist, der erlaubt, daß die geimpften Tiere von den mit einem Virus vom Wildtyp infizierten Tieren durch eine Diagnoseuntersuchung von Serumproben unterschieden werden können.
    • BEISPIEL 7 S-PRV-014
  • S-PRV-014 ist ein Pseudorabiesvirus, das eine Deletion im gpX-Kodierbereich besitzt. Das Gen für E. coli-beta-Galactosidase wurde anstelle des gpX-Gens insertiert und befindet sich unter der Steuerung des endogenen gpX-Promotors.
  • Das folgende Vorgehen wurde zur Herstellung von S-PRV-014 durch homologe Rekombination verwendet. Die flankierenden PRV-Homologiebereiche stammten von dem den gpX-Promotor enthaltenden klonierten BamHI-#10-Fragment und von dem sich von der NdeI-Stelle bis zur BamHI-Stelle erstreckenden klonierten BamHI-#7-Fragment (Fig. 9). Die NdeI-Stelle wurde gemäß "Polymeraseauffüllreaktion" aufgefüllt und das beta-Galactosidasegen zwischen dem BamHI-#10- und dem BamHI-#7-Fragment insertiert. In diesem Konstrukt lag das beta-Galactosidasegen hinter dem gpX-Promotor und der gpX-poly-A-Signalsequenz mit einer Deletion beinahe des gesamten Kodierbereichs von gpX. Die Plasmid-DNA und DNA von PRV vom Wildtyp wurden gemischt und gemäß dem unter "DNA-Transfektion zur Erzeugung rekombinanter Viren" beschriebenen Vorgehen transfiziert. Das rekombinante Virus wurde gescreent und gemäß dem unter "Bluogaluntersuchung bezüglich rekombinanter Herpesviren" beschriebenen Vorgehen von der Transfektionsvorratslösung gereinigt.
  • Das erhaltene Virus aus dieser Untersuchung wurde als S-PRV- 014 bezeichnet und beim ATCC unter der Hinterlegungsnr. VR 2135 hinterlegt. Es enthält das beta-Galactosidasegen gemäß Bestimmung nach der "Herstellung von Herpesvirus-DNA" und dem anschließenden "Southern Blotting von DNA" anstelle des gpX-Kodierbereichs. Die Expression des beta-Galactosidasegens wurde durch den unter "Bluogaluntersuchung bezüglich rekombinanter Herpesviren" beschriebenen Test und durch die o-Nitrophenylgalactopyranosidsubstratuntersuchung (33) bestätigt. Die Struktur dieses Virus ist in Fig. 9D dargestellt.
    • BEISPIEL 8 S-PRV-016
  • S-PRV-016 ist ein Pseudorabiesvirus, das eine Deletion in beiden Repeatsequenzen und eine Deletion im gpX-Kodierbereich besitzt. Das Gen für E. coli-beta-Galactosidase wurde anstelle des gpX-Gens insertiert und befindet sich unter der Steuerung des endogenen gpX-Promotors.
  • Das folgende Vorgehen wurde zur Konstruktion von S-PRV-016 durch homologe Rekombination verwendet. Die flankierenden PRV-Homologiebereiche stammten von dem den gpX-Promotor enthaltenden klonierten BamHI-#10-Fragment und von dem sich von der NdeI-Stelle bis zur BamHI-Stelle erstreckenden klonierten BamHI-#7-Fragment (Fig. 9). Die NdeI-Stelle wurde gemäß "Polymeraseauffüllreaktion" aufgefüllt und das beta-Galactosidasegen zwischen dem BamHI-#10- und dem BamHI-#7-Fragment insertiert. In diesem Konstrukt lag das beta-Galactosidasegen hinter dem gpX-Promotor und der gpX-poly-A-Signalsequenz mit einer Deletion nahezu des gesamten Kodierbereichs von gpX. Die Plasmid-DNA und DNA von S-PRV-001 wurden gemischt und gemäß unter "DNA-Transfektion zur Erzeugung rekombinanter Viren" beschriebenen Vorgehen transfiziert. Das rekombinante Virus ,wurde gescreent und gemäß dem unter "Bluogaluntersuchung bezüglich rekombinanter Herpesviren" beschriebenen Vorgehen von der Transfektionsvorratslösung gereinigt.
  • Das erhaltene Virus aus dieser Untersuchung wurde als S-PRV- 016 bezeichnet und beim ATCC unter der Hinterlegungsnr. VR 2136 hinterlegt. Es enthält das beta-Galactosidasegen gemäß Bestimmung nach der "Herstellung von Herpesvirus-DNA" und dem anschließenden "Southern Blotting von DNA" anstelle des gpX-Kodierbereichs. Die Expression des beta-Galactosidasegens wurde durch den unter "Bluogaluntersuchung bezüglich rekombinanter Herpesviren" beschriebenen Test und durch die o-Nitrophenylgalactopyranosidsubstratuntersuchung (33) bestätigt. Die Struktur dieses Virus ist in Fig. 9E dargestellt.
    • BEISPIEL 9 S-PRV-020
  • S-PRV-020 ist ein Pseudorabiesvirus, das eine Deletion im TK-Gen, eine Deletion in den Repeatbereichen und eine Deletion im gpX-Gen zusammen mit einer Insertion des Schweineparvovirus-B-Capsidproteingens in den gpX-Bereich besitzt.
  • Zur Klonierung des Schweineparvovirus-B-Gens wurde die doppelsträngige, in der replikativen Form vorliegende DNA vom NADL-8-Stamm aus mit Schweineparvovirus infizierten Zellen gereinigt und von Dr. T. Molitor, University of Minnesota bezogen. Die Parvovirus-NADL-8-DNA wurde nach detailliert in (15) beschriebenen Verfahren in das E. coli-Plasmid pSP64 kloniert. Die DNA wurde teilweise sequenziert, um die Bestimmung des Starts und des Endes des Hauptcapsidproteingens, des B-Gens bestimmen zu können. Die Identifizierung wurde durch Vergleich verwandter Sequenzen im Ratten-HI- Parvovirus-Capsidgen (28, 29) bestätigt. Die Sequenz des Schweineparvovirus-B-Gens ist in den Fig. 11A und 11B dargestellt.
  • Der PRV-Glycoprotein-X (gpX)-Genpromotor wurde zur Expression des B-Gens verwendet, wobei die gpX-poly-A-Signalsequenz verwendet wurde, um die Transkription zu beenden. Das Parvovirus-B-Gen von der AccI-Stelle am Nucleotid #391 bis zur RsaI-Stelle am Nucleotid #2051 wurde zwischen die BamHI- und NdeI-Stelle von gpX kloniert (vgl. Fig. 7A und B). Das Plasmid pSY864 enthielt dieses Fragment des Parvovirus-B- Gens, das durch die in Fig. 13 dargestellte gpX-Signalsequenz flankiert war. Es wurde als die homologe DNA zur Förderung einer homologen Rekombination zwischen S-PRV-013-DNA und der Plasmid-DNA zur Erleichterung des Einbaus des B-Gens in das PRV-Genom verwendet. Die Plasmid-DNA und die S-PRV- 013-DNA wurden vermischt und gemäß dem unter "DNA-Transfektion zur Erzeugung rekombinanter Viren" beschriebenen Vorgehen miteinander transfiziert. Das rekombinante Virus wurde gescreent und gemäß dem unter "Bluogaluntersuchung bezüglich rekombinanter Merpesviren" beschriebenen Vorgehen mit der folgenden Modifikation von der Transfektionsvorratslösung gereinigt. Da das Elternvirus S-PRV-013 das beta-Galactosidasegen enthielt, erzeugte es beim Screeningvorgehen blaue Plaques. Da das Parvovirus-B-Gen das beta-Galactosidasegen im Virus ersetzen sollte, sollten die Plaques mit diesem insert farblos sein. Folglich wurden farblose Plaques aufgenommen und während dieses Screenings analysiert. Ein Virus, das das B-Gen enthielt, wurde aus dieser Untersuchung isoliert und als S-PRV-020 bezeichnet. S-PRV-020 wurde beim ATCC unter der Hinterlegungsnr. VR 2137 hinterlegt.
  • DNA aus S-PRV-020 wurde gemäß dem unter "Herstellung von Herpesvirus-DNA" beschriebenen Vorgehen isoliert und zur Bestätigung der Insertion des Parvovirus-B-Gens gemäß dem unter "Southern Blotting von DNA" beschriebenen Vorgehen unter Verwendung des B-Gens als Sonde verwendet. Der Test zeigte, daß das Parvovirus-B-Gen wie erwartet in das PRV-Genom eingebaut worden war. Die Struktur von S-PRV-020 ist in Fig. 13C dargestellt.
    • BEISPIEL 10 S-PRV-025
  • Das Klonieren des B-Gens und die Konstruktion dieser Signalsequenzen auf dem B-Gen sind in Beispiel 9 beschrieben und in Fig. 12 dargestellt.
  • Das "direkte Ligationsvorgehen zur Erzeugung rekombinanter Herpesviren" wurde zur insertion des Parvovirus-B-Gens in PRV verwendet. Das das B-Gen enthaltende Plasmid pSY957 wurde mit S-PRV-002-DNA vermischt, worauf sie mit dem Restriktionsenzym XbaI geschnitten wurden. Das DNA-Gemisch wurde wie beim Verfahren beschrieben ligiert und die DNA in Verozellen transfiziert. Ein das B-Gen enthaltendes Virus wurde aus der Transfektionsvorratslösung des Virus isoliert und als S-PRV-025 bezeichnet. S-PRV-025 wurde beim ATCC unter der Hinterlegungsnr. VR 2138 hinterlegt.
  • DNA aus S-PRV-025 wurde gemäß dem unter "Herstellung von Herpesvirus-DNA" beschriebenen Vorgehen isoliert und zur Bestätigung der Insertion des Parvovirus-B-Gens gemäß dem unter "Southern Blotting von DNA" beschriebenen Vorgehen unter Verwendung des B-Gens als Sonde verwendet. Der Test zeigte, daß das Parvovirus-B-Gen wie erwartet in das PRV-Genom eingebaut worden war. Die Struktur von S-PRV-025 ist in Fig. 14 dargestellt.
    • BEISPIEL 11 S-PRV-029
  • S-PRV-029 ist ein Pseudorabiesvirus, das eine Deletion im Verbindungsbereich zwischen dem einzigen langen Bereich und dem internen Repeat von PRV und eine Deletion im gpX-Gen im einzigen kurzen Bereich aufweist. In beide Deletionen in S- PRV-029 wurde das E. coli-beta-Galactosidasegen unter Steuerung des gpX-Promotors und der Polyadenylierungssignale insertiert.
  • Zur Konstruktion dieses Virus wurde zuerst das SalI-# 1-Fragment von PRV kloniert. PRV-DNA wurde hergestellt und anschließend mit SalI-Restriktionsenzym geschnitten. Die geschnittene DNA wurde auf einem Agarosegel elektrophoresiert und die größte SalI-Band (15 kb) von dem Gel gereinigt (vgl. Phenolextraktion von DNA aus Agarose). Die gereinigte DNA wurde in das Plasmid pSP64 ligiert (vgl. Ligation) und das DNA-Gemisch zur Transformation von E. coli HB101 gemäß Maniatis und Mitarbeitern (1) verwendet. Das SalI-#1-Klon wurde bezüglich der Restriktionsstellen kartiert.
  • Das homologe Rekombinationsvorgehen wurde zur Erzeugung von S-PRV-029 verwendet. Die genaue Position des Verbindungsbereichs wurde durch Sequenzieren der DNA aus dem SalI-#1- Fragment bestimmt. Es wurde festgestellt, daß der Verbindungsbereich zwischen zwei StuI-Stellen gelegen war (vgl. Fig. 15B). Zwei DNA-Fragmente aus dem SalI-Klon wurden zur Erzeugung des Homologievektors zur Rekombination verwendet. Eines war ein Fragment von BamHI #8' von StuI bis BamHI und das andere war ein Fragment von BamHI bis StuI (Fig. 15B).
  • Das E. coli-beta-Galactosidasegen wurde vorher so konstruiert, daß es den gpX-Promotor und Polyadenylierungssignale gemäß der Beschreibung bei S-PRV-013 enthält. Um dieses beta-Galactosidasegen in das den Verbindungsbereich aufweisende Klon einzufügen, wurde zuerst ein HindIII-Linker in die StuI-Stelle zwischen BamHI #8 und BamHI #8' insertiert. In diese HindIII-Stelle wurde dann ein das beta-Galactosidasegen mit den gpX-Signalen enthaltendes HindIII-Fragment kloniert.
  • Das erhaltene Plasmid plus PRV-DNA vom Wildtyp wurden gemäß dem unter "DNA-Transfektion zur Erzeugung rekombinanter Viren" beschriebenen Vorgehen in Verozellen transfiziert. Aus der Transfektionsvorratslösung wurde ein Virus isoliert, in das das sowohl in die Verbindungsdeletion (Fig. 15B) als auch die gpX-Deletion (Fig. 15A) insertierte beta-Galactosidasegen insertiert war, wie sich aus dem Vorhandensein einer Homologie zu diesen beiden Bereichen im Plasmid ergab. Dieses Virus wurde durch das unter "Bluogaluntersuchung bezüglich rekombinanter Herpesviren" beschriebene Vorgehen gereinigt und als S-PRV-029 bezeichnet. S-PRV-029 wurde beim ATCC unter der Hinterlegungsnr. VR 2139 hinterlegt.
  • Durch das unter "Bluogaluntersuchung bezüglich rekombinanter Herpesviren" beschriebene Vorgehen und die o-Nitrophenylgalactopyranosiduntersuchung (33) wurde gezeigt, daß S-PRV-029 beta-Galactosidase exprimiert. Die Struktur dieses Virus ist in Fig. 15C dargestellt.
    • BEISPIEL 12 S-IBR-002
  • S-IBR-002 ist ein IBR-Virus, das eine Deletion einer Länge von etwa 800 bp im Repeatbereich des Genoms besitzt. Diese Deletion entfernt die lediglich zwei EcoRV-Restriktionsstellen auf dem Virusgenom und eine benachbarte BglII-Stelle (Fig. 16).
  • Zur Konstruktion dieses Virus wurde das unter "direktes Ligationsvorgehen zur Erzeugung rekombinanter Herpesviren" beschriebene Vorgehen durchgeführt. Mit EcoRV-Restriktionsenzym verdaute, gereinigte IBR-DNA (Cooper-Strang) wurde mit mit DraI-Restriktionsenzym verdauter Plasmid-DNA, die das beta-Galactosidasegen unter der Steuerung des HSV-1-TK-Promotors enthielt, vermischt. Nach der Ligation wurde das Gemisch zur Transfektion von tierischen Zellen verwendet, wobei die Transfektionsvorratslösung bezüglich rekombinanter IBR-Viren im Rahmen des unter "Hybridisieruntersuchung bezüglich rekombinanter Herpesviren" beschriebenen Vorgehens gescreent wurde. Das Endergebnis der Reinigung war das rekombinante IBR mit der Bezeichnung S-IBR-002. Durch Southernhybridisierung wurde gezeigt, daß dieses Virus keinerlei Fremdgene trägt. Eine Restriktionsenzymanalyse zeigte ferner, daß die Insertionsstellen (EcoRV) an beiden Repeats deletiert waren. Fig. 16 zeigt die Restriktionskarte des EcoRI-B-Fragments, das die EcoRV-Restriktionsstellen enthält, und die Karte von S-IBR-002, dem die EcoRV-Stellen fehlen. S-IBR-002 wurde beim ATCC unter der Hinterlegungsnr. VR 2140 hinterlegt.
    • BEISPIEL 13 S-IBR-004
  • S-IBR-004 ist ein rekombinantes IBR-Virus, das ein insertiertes Fremdgen, das Tn5-NEO (Aminoglycosid-3'-phosphotransferase)-Gen, unter der Steuerung des Pseudorabiesvirus (PRV)-Glycoprotein-X-Promotors trägt.
  • Zur Konstruktion dieses Virus wurde das HindIII-K-DNA-Fragment aus IBR-Virus vom Wildtyp in das Plasmid pSP64 an der HindIII-Stelle kloniert. Dieses Plasmid wurde als pSY524 bezeichnet. Eine Karte des HindIII-K-Fragments ist in Fig. 17 dargestellt. Die DNA von der XhoI-Stelle bis zur HindIII- Stelle, die die NdeI-Stelle von pSY524 enthält, wurde in das Plasmid pSP65 kloniert und als pSY846 bezeichnet. Das NdeI bis EcoRI-Fragment wurde durch Verdauung mit NdeI- und EcoRI-Restriktionsenzymen von pSY846 entfernt, worauf eine Polymeraseauffüllreaktion und eine Ligation durchgeführt wurden. Das erhaltene Plasmid wurde als pSY862 bezeichnet. Das Plasmid pNEO (P.L. Biochemicals, inc.) enthält das Aminoglycosid-3'-phosphotransferase (NEO)-Gen und verleiht E. coli-Wirten eine Ampicillin- und Neomycinresistenz. Der Kodierbereich dieses Gens (BglII-BamHI-Fragment) wurde isoliert und zwischen den PRV-gpX-Promotor und die HSV-Tk-poly- A-Sequenz in einem als pSY845 bezeichneten Plasmid kloniert.
  • Das NEO-Gen-Konstrukt in pSY845 wurde mit HindIII ausgeschnitten, mit Hilfe der Polymeraseauffüllreaktion stumpfendig gemacht und in die SacI-Stelle des Plasmids pSY862 kloniert. Das Endprodukt wurde als pSY868 bezeichnet.
  • IBR-DNA vom Wildtyp wurde mit pSY868-DNA vermischt und das Gemisch unter Erzeugung von rekombinantem IBR in Kaninchenhautzellen transfiziert. Das ein funktionelles NEO-Gen tragende rekombinante IBR-Virus wurde anschließend gemäß dem unter "Selektion von G418-resistenten Viren" beschriebenen Verfahren isoliert und gereinigt.
  • Anhand der Tatsache, daß mit diesem Virus infizierte Zellen gegenüber der Toxizität von G418 resistent waren, wurde gezeigt, daß das rekombinante IBR S-IBR-004 das NEO-Gen exprimiert. Eine detaillierte Karte der Plasmidkonstruktion ist in Fig. 17 dargestellt. Die Struktur von S-IBR-004 ist ferner in Fig. 17 dargestellt. S-IBR-004 wurde beim ATCC unter der Hinterlegungsnr. VR 2134 hinterlegt.
    • BEISPIEL 14 S-IBR-008
  • S-IBR-008 ist ein IBR-Virus, das eine Deletion im einzigen kurzen Bereich und eine Insertion des Rinderrotavirus-Glycoprotein-38 (gp38)-Gens in der XbaI-Stelle im einzigen langen Bereich besitzt.
  • Zuerst wurde das Rinderrotavirus-gp-38-Gen so konstruiert, daß es die Herpesvirus-Regulatorsignale gemäß der Darstellung in Fig. 18 enthält. Dies erfolgte durch Klonieren des in pSY1053 enthaltenen gp38-Gen-BamHI-Fragments zwischen die BamHI- und BgIII-Stelle in pSY1052. Das erhaltene Plasmid pSY1023 enthielt den PRV-gpX-Promotor vor dem gp38-Gen und das HSV-1-TK-Polyadenylierungssignal hinter dem gp38-Gen. Das gesamte Konstrukt wurde von XbaI-Stellen flankiert, um die Insertion des XbaI-Fragments in IBR durch direkte Ligation zu gewährleisten.
  • S-IBR-004 war das Ausgangsvirus für die Erzeugung von S-TBR- 008. S-IBR-004-DNA und pSY1023-DNA wurden miteinander vermischt, mit XbaI geschnitten und gemäß dem unter "direkte Ligation zur Erzeugung rekombinanter Herpesviren" beschriebenen Vorgehen in Kaninchenhautzellen transfiziert. Die Transfektionsvorratslösung wurde bezüglich rekombinanter Viren gemäß dem unter "Antikörperuntersuchung bezüglich rekombinanter Herpesviren" beschriebenen Vorgehen unter Verwendung von gegen das Rotavirus-gp38-Protein hergestellten Antikörper gescreent.
  • Eines der im Rahmen dieser Untersuchung gereinigten Viren war S-IBR-008, das die folgenden Eigenschaften besitzt. Es enthält das Rotavirus-gp38-Gen plus die in die XbaI-Stelle im einzigen langen Bereich des Virusgenoms insertierte Plasmid-DNA, nicht mehr jedoch das NEO-Gen des Elternvirus S- IBR-004 im einzigen kurzen Bereich. In der Tat war im einzigen kurzen Bereich an der Stelle des NEO-Gens eine kleine Deletion geschaffen worden, wie sich aus der Abwesenheit einer XbaI-Stelle an dieser Stelle in S-IBR-008 ergibt.
  • Durch Analyse einer RNA-Transkription in infizierten Zellen und durch das unter "Antikörperuntersuchung bezüglich rekombinanter Herpesviren" beschriebene Vorgehen unter Verwendung von für das gp38-Gen spezifischen Antikörpern wurde gezeigt, daß S-IBR-008 das Rotavirus-gp38-Gen exprimiert. S-IBR-008 wurde beim ATCC unter der Hinterlegungsnr. VR 2141 hinterlegt. Die Struktur dieses Virus ist in Fig. 18 dargestellt.
    • BEISPIEL 15 Herpesvirus von Truthähnen
  • Das Truthahn-Herpesvirus (HVT) ist ein weiteres Herpesvirus, das in der Organisation und Struktur den anderen oben beschriebenen tierischen Herpesvirusbeispielen ähnelt. Die Restriktionsenzymkarte von HVT wurde veröffentlicht (34). Diese Information wurde als Ausgangspunkt zur Konstruktion der Insertion von Fremdgenen in HVT verwendet. Die BamHI-Restriktionskarte von HVT ist in Fig. 19A dargestellt. Aus diesen Daten wurden mehrere unterschiedliche Bereiche der HVT-DNA festgelegt, in die Insertionen von Fremdgenen vorgenommen werden könnten. Das zur Insertion ausgewählte Fremdgen war das E. coli-beta-Galactosidasegen (beta-gal), das wir in PRV verwendet haben. Der Promotor war der PRV-gpX- Promotor. Das beta-gal-Gen wurde in den einzigen langen Bereich von HVT, genauer gesagt in die XhoI-Stelle im BamHI- #16 (3300 bp)-Fragment insertiert, wobei durch Bildung von blauen Plaques unter Verwendung des Substrats Bluogal gezeigt wurde, daß das beta-gal-Gen in einem rekombinanten HVT-Virus exprimiert werden kann. In ähnlicher Weise wurde das beta-gal-Gen in die SalI-Stelle in dem in dem BamHI-#19 (900 bp)-Fragment enthaltenen Repeatbereich insertiert.
  • Diese Experimente zeigen, daß HVT für die in dieser Anmeldung bezüglich Insertion und Expression von Fremdgenen in Herpesviren beschriebenen Verfahren verwendbar ist. Insbesondere wurden zwei Stellen zur Insertion von Fremd-DNA identifiziert (Fig. 19B und 19C).
    • BEISPIEL 16 Verfahren zur Konstruktion eines ein Fremd-DNA-Insert enthaltenden, abgeschwächten Herpesvirus
  • Die Anmelder sind der Überzeugung, daß die hier beschriebenen Vorgehensweisen, die zur Abschwächung und Insertion von Fremd-DNA-Sequenzen in PRV, IBR und HVT verwendet wurden, zur Konstruktion anderer Herpesviren geeignet sind, die abgeschwächt sind und/oder insertierte Fremd-DNA-Sequenzen enthalten, die in einem Wirt in Aminosäuresequenzen translatiert werden. Es wird davon ausgegangen, daß Pferde-Herpesvirus-1 (EHV), Hunde-Merpesvirus-1 (CHV), Katzen-Herpesvirus-1 (FHV) oder ein beliebiges anderes tierisches Herpesvirus, dessen Genomstruktur mit diesen Viren verwandt ist, bei diesen Verfahren verwendbar ist. Insbesondere können die folgenden Verfahren zur Konstruktion derartiger Viren angewandt werden.
  • ZÜCHTEN TIERISCHER HERPESVIREN IN ZELLKULTUREN: Hergestellte Zellinien oder Primärzellen können verwendet werden. Die Methodologie für die Züchtung dieser Viren findet sind in der Literatur und erfordert keine neuen Kenntnisse. EHV wächst in Verozellen, CHV wächst in Madin-Darby-Hundenierenzellen und FHV wächst in Crandell-Katzennierenzellen.
  • REINIGUNG VON HERPESVIRUS-DNA: Das hier beschriebene Vorgehen zur Reinigung von Herpesvirus-DNA war bei allen untersuchten Herpesviren, einschließlich PRV, IBR, HVT und Cytomegalovirus, erfolgreich und ist ein für alle Herpesviren einsetzbares allgemeines Verfahren.
  • KLONIERUNG VON RESTRIKTIONSFRAGMENTEN: Die Klonierung von Herpesvirusrestriktionsfragmenten ist ein auf dem einschlägigen Fachgebiet bekanntes rekombinantes DNA-Vorgehen und bei Maniatis und Mitarbeitern (1) beschrieben.
  • KARTIERUNG DER RESTRIKTIONSFRAGMENTE ZU EINEM GENOM: Es ist günstig, eine Restriktionsenzymkarte des Virusgenoms zu haben, um Bereiche für eine Deletion und Insertion zu identifizieren und auszuwählen. Derartige Karten sind für PRV und IBR und teilweise für HVT erhältlich. Für EHV existiert eine Karte, nicht jedoch so für CHV und FHV. Die Erzeugung dieser Karte erfordert jedoch keinerlei neue Technologie und ist detailliert bei Maniatis und Mitarbeitern (1) beschrieben.
  • IDENTIFIZIERUNG VON RESTRIKTIONSFRAGMENTEN, DIE DEM REPEAT- BEREICH ENTSPRECHEN: Die Identifizierung von Repeatbereichen erfordert das detailliert im Abschnitt Methoden beschriebene Southern-Blotting-Vorgehen. Klone des Repeatbereichs hybridisieren zu mehrfachen Banden in einer Restriktionsenzymverdauung infolge der Tatsache, daß sie im Virusgenom wiederholt werden. Dieses Merkmal, gekoppelt mit ihrer Lage im Genom, ist ein Diagnosehilfsmittel der Repeatbereiche.
  • DURCHFÜHREN EINER DELETION IN EINEM EINEN REPEATBEREICH AUF- WEISENDEN KLON: Die genetische Information im Repeatbereich ist in der anderen Kopie des Repeats im Genom dupliziert. Folglich ist eine Kopie des Repeatbereichs zur Replikation des Virus nicht essentiell. Folglich eignet sich der Repeatbereich für Deletionen und Insertionen von Fremd-DNA. Nachdem der Repeatbereich durch Restriktionsenzyme kloniert und kartiert ist, können Enzyme ausgewählt werden, um die Repeatdeletion zu konstruieren und Fremd-DNA zu insertieren. Für den Fachmann auf dem einschlägigen Fachgebiet ist es selbstverständlich, daß in einem gegebenen DNA-Strang Enzymstellen vorhanden sind und daß sie sich durch Analyse auffinden lassen. Die Methodologie umfaßt die "Restriktionsverdauung von DNA, die Agarasogelelektrophorese von DNA, die Ligation" und das Klonieren in Bakterienzellen gemäß den detaillierten Ausführungen im Abschnitt Methoden und bei Maniatis und Mitarbeitern (1).
  • DURCHFÜHRUNG VON INSERTIONEN DES MARKER-GENS IN EINE DELE- TION IM EINEN REPEATBEREICH AUFWEISENDEN KLON: Die Methodologie dieser Insertion entspricht der bei Maniatis und Mitarbeitern (1) für die Klonierung von Genen in Bakterien beschriebenen. Bis zur vorliegenden Offenbarung nicht naheliegend ist die Tatsache, welche Marker-Gene verwendet werden können, die in einem Herpesvirus aktiv sind oder welche Signalsequenzen zur Expression von Fremdgenen in diesen Herpesviren verwendet werden können. Das E. coli-beta-Galactosidasegen und das Neomycinresistenzgen unter Steuerung des HSV-1-ICP4-Promotors, des PRV-gpX-Promotors oder des HSV-1- TK-Promotors wurden verwendet. Insbesondere arbeitet der gpX-Promotor in PRV, IBR und HVT. Die anderen Promotoren arbeiten auch in einer eingeschränkteren Untersuchung.
  • TRANSFEKTION MIT EINEM MARKER-GEN-KLON UND HERPESVIRUS-DNA: Das Bestreben dieses Vorgehens besteht darin, die intakte Herpesvirus-DNA und das einen Repeatbereich aufweisenden Klon mit der Deletion, das das Marker-Gen enthält, in dieselbe Zelle zu bringen. Sobald diese beiden DNAs in derselben Zelle vorhanden sind, gewährleisten normale Mechanismen einer homologen Rekombination, daß mit einer Häufigkeit von etwa 1% zwischen den homologen Bereichen im Klon und demselben Bereich in der Herpesvirus-DNA unter Substituieren der deletierten Bereiche im Virus durch das Marker-Gen eine Rekombination auftritt. Diese Technik umfaßt das Transfektionsvorgehen zur Erzeugung rekombinanter Herpesviren gemäß der detaillierten Darstellung im Abschnitt Methoden.
  • REINIGUNG VON HERPESVIRUS-DNA: Die Herpesvirus-DNA kann gemäß den oben beschriebenen Verfahren gereinigt werden.
  • AUSWAHL REKOMBINANTER PLAQUES: Alle erfindungsgemäß herangezogenen Herpesviren bilden Plaques (Infektionsherde in einer Zellkultur), die ihre Reinigung gewährleisten. Ein Plaque entsteht aus einer Infektion durch ein einzelnes Viruspartikel. Das Herausgreifen eines einzelnen Plaques bedeutet somit eine Auswahl bezüglich der Nachkommenschaft eines einzelnen Rekombinationsvorgangs. Dieser technische Akt erfordert ein Verfahren zur Identifizierung, welches Plaque herauszugreifen ist. Die hier verwendeten Verfahren umfassen ein Southern-Blotting von DNA zum Herausgreifen von Plaques auf der Basis der Anwesenheit des insertierten Gens, Antikörperuntersuchungen bezüglich rekombinanter Herpesviren zum Herausgreifen von Plaques auf der Basis der Anwesenheit von aus diesem Gen hergestelltem Protein, eine Bluogaluntersuchung bezüglich rekombinanter Herpesviren zum Herausgreifen von Plaques, die das Marker-Gen beta-Galactosidase exprimieren, oder eine G-418-Selektion zur Reinigung rekombinanter Herpesviren zum Herausgreifen von Plaques aufgrund ihrer Fähigkeit zur Bildung in Gegenwart des Antibiotikums G-418. Die ersten beiden Verfahren sind bei jedem beliebigen Gen anwendbar. Die letzteren beiden Verfahren sind spezifisch für das beta-Galactosidasegen bzw. das Neomycinresistenzgen. Die Biologie dieser Screening- und Selektionssysteme ist derart, daß sie bei beliebigen Herpesviren, einschließlich EHV, CHF, FHV und beliebigen hiermit verwandten tierischen Herpesviren anwendbar sind.
  • REINIGUNG REKOMBINANTER VIREN: Dieses Vorgehen umfaßt eine Mehrfachplaquereinigung in aufeinanderfolgenden Schritten zur vollständigen Reinigung des rekombinanten Virus von dem Muttervirus. Das Screenen erfolgt in jeder Stufe, um das Plaque auszuwählen, mit dem fortgesetzt werden soll. Die Vorgänge sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Virologie bekannt.
  • Mehrfachimpfstoffe für Tiere können durch Insertieren eines fremden Antigengens in ein Herpesvirus konstruiert werden. Die Vorgänge und die Methodologie sind analog zu denjenigen, wie sie bei der anfänglichen Insertion des Marker-Gens in das Virus durchgeführt wurden, und können wie folgt ablaufen.
  • ERSETZEN VON MARKER-GEN DURCH FREMDES ANTIGENGEN IM REPEAT- KLON: Dies ist ein Klonierexperiment, das ein Stellen des Antigengens hinter den mit dem Marker-Gen verwendeten selben Herpesviruspromotor und ein Insertieren dieser Konstruktion in dieselbe identische Deletion im Repeatklon umfaßt. Die Verfahren für diese Klonierung sind bei Maniatis und Mitarbeitern (1) beschrieben.
  • TRANSFEKTION MIT EINEM ANTIGENKLON UND REKOMBINANTER HERPES- DNA, DIE EINEN MARKER ENTHÄLT: Das Marker-Gen, das bereits in dem Herpesvirusgenom vorhanden ist, kann zur Unterstützung der Auswahl des neuen rekombinanten Virus verwendet werden. Beispielsweise hat es sich als geeignet erwiesen, anstelle von blauen weiße Plaques auszuwählen, um einen Test bezüglich der Abwesenheit von beta-Galactosidase in dieser Stufe durchzuführen. Ein Grund für das Vorhandensein eines weißen Plaques ist der Ersatz des fremden Antigengens durch homologe Rekombination durch das beta-Galactosidasegen (das gewünschte Ergebnis). Ein fortgesetztes Screening bezüglich dieses neuen rekombinanten Virus im Rahmen des Southern- Blot-Vorgehens oder im Rahmen eines Antikörperscreenens bezüglich rekombinanter Herpesviren wird spezieller, weniger zeitraubend und identifiziert insbesondere die interessierenden rekombinanten Viren.
  • ISOLIEREN VON REKOMBINANTER HERPES-DNA: Das Transfektionsvorgehen erfordert eine intakte infektiöse Herpesvirus-DNA. Rekombinante Herpesviren, die ein insertiertes Marker-Gen umfassen, können verwendet werden. Die Isolierung des Herpesvirus-DNA-Vorgehens ist in gleicher Weise bei diesen rekombinanten Viren anwendbar.
  • SCREENEN DER TRANSFEKTIONSVORRATSLÖSUNG BEZÜGLICH EINER FREMDGENINSERTION: Screeningverfahren wurden oben beschrieben. Sie sind eine Kombination indirekter Verfahren (Screening bezüglich der Abwesenheit des Markers) sowie direkter Verfahren (Southern-Blotting bezüglich des Antigengens und Antikörperscreenen bezüglich des exprimierten Proteins). Die Verfahren können sequentiell während der Reinigung des Virus durchgeführt werden.
  • REINIGUNG REKOMBINANTER VIREN, DIE FREMDANTIGENGEN ENTHAL- TEN: Das das Fremdantigengen enthaltende rekombinante Virus, kann gemäß dem oben beschriebenen Vorgehen gereinigt werden.
  • Diese Abfolge von Stufen ermöglicht es dem Fachmann auf dem einschlägigen Fachgebiet zusammen mit den hier beschriebenen Verfahren und Beispielen, die vorliegende Erfindung mit jedem beliebigen tierischen Herpesvirus erfolgreich praktisch durchzuführen.
    • BEISPIEL 17
  • Die vorliegende Erfindung umfaßt die Verwendung von genetisch konstruierten Herpesviren zum Schutz der Tiere vor Erkrankung. Zu Beginn der Untersuchungen war es nicht offensichtlich, welche Deletionen in Herpesviren dazu diesen würden, die Viren auf den geeigneten Grad abzuschwächen, der sie dazu befähigt, als Impfstoffe verwendet zu werden. Selbst eine Untersuchung von Impfstoffkandidaten im Rahmen von Tiermodellen, beispielsweise in einem Mausmodell, dient nicht als gültiger Indikator für die Sicherheit und Wirksamkeit des Impfstoffs in einer Targettierspezies, beispielsweise dem Schwein. Um diesen Punkt deutlicher zu veranschaulichen, zeigt Tabelle VII summarische Daten der Sicherheit und Wirksamkeit verschiedener Pseudorabiesviren, die konstruiert und in Schweinen gemäß dem unter Impfstudien bei Schweinen beschriebenen Vorgehen getestet wurden. TABELLE VII ZUSAMMENFASSUNG DER BEI SCHWEINEN MIT VERSCHIEDENEN PSEUDORABISVIRUSKONSTRUKTEN DURCHGEFÜHRTEN UNTERSUCHUNGEN Nach Impfung Konstrukt (Deletionen/Insertionen) Zahl der Schweine Alter der Schweine Antikörperverhältnis Klinische Anzeichen Prozentualer Schutz gegen Herausforderung Wochen Tage Ja Wochen ¹ A = Repeats; B = TK; C = Verbindung; D = gpX; E = beta-Galactosidaseinsert
  • Die acht getesteten Konstrukte weisen die folgenden Deletionen und Insertionen im Genom des virulenten Shope-Stamms von PRV auf: S-PRV-001 besitzt eine Deletion in beiden Repeatbereichen; S-PRV-002 besitzt eine Deletion in beiden Repeatbereichen und im Thymidinkinasegen; S-PRV-003 besitzt eine Deletion im Thymidinkinasegen; S-PRV-004, S-PRV-010, S-PRV- 013, S-PRV-014 und S-PRV-016 sind in den Beispielen Nr. 1, 3, 6, 7 bzw. 8 beschrieben.
  • Ein überlegenes Impfstoffprodukt darf bei 3-4 Tage alten Ferkeln (das empfindlichere Alter) keine klinischen Anzeichen hervorrufen und liefert bei Schweinen eines jeden Alters einen 100%igen Schutz. Aus Tabelle VII ist ersichtlich, daß jeder Impfstoffkandidat einen gewissen Grad der Abschwächung und des Schutzes bei Schweinen hervorrief, daß jeder Impfstoff jedoch eine einzige Antwort lieferte. Der beste Impfstoffkandidat, der sich aus der Liste ergibt, ist S-PRV- 013, das drei Deletionen enthält: Eine im Repeatbereich, eine im TK-Gen und eine im gpX-Gen. Die Eignung dieser Kombination von Deletionen war unerwartet. Diese Ergebnisse sind neu, unerwartet und bei der Auswahl eines überlegenen Pseudorabiesimpfstoffprodukts geeignet.
    • BEISPIEL 18 S-PRV-055
  • S-PRV-055 ist ein Pseudorabiesvirus, das eine Deletion im TK-Gen, eine Deletion im Repeatbereich und eine Insertion des übertragbaren Gastroenteritisvirus (TGE)-gp195-Gens in der XbaI-Stelle im Repeatbereich besitzt.
  • Zur Klonierung des TGE-gp195-Gens wurde der Purdue-Stamm von TGE in Schweinehodenzellen in Kultur gezüchtet und die RNA aus infizierten Zellen extrahiert. Die RNA wurde in einem in dem cDNA-Kloniervorgehen beschriebenen Reverse Transkriptionsprotokoll unter Verwendung von poly-dT als Primer für die Reverse Transkriptase verwendet. Aus diesem Vorgehen wurde eine Reihe von Klonen erhalten, die Teile des Genoms des TGE-Virus umfaßten. Die Stelle des Gens mit Kodierung für das TGE-gp195-Gen ist veröffentlicht (59), wobei diese Information zur Lokalisierung des Gens in unseren Klonen verwendet wurde. Der gesamte offene Leserahmen des gp195- Gens wurde durch die Anmelder sequenziert und ist in Fig. 22 dargestellt.
  • Der PRV-gpX-Promotor wurde zur Expression des TGE-gp195-Gens verwendet, wobei das HSV-TK-poly-A-Signal zur Beendigung der Transkription verwendet wurde. Das Konstruieren dieses Konstrukts erfolgte gemäß der Darstellung in den Fig. 23A und B. Das Konstrukt enthielt (in 5'- zu 3'-Richtung) den gX- Promotor, die gX-TATA-Box, die gX-Capstelle, den gX-5'- nichttranslatierten Bereich, das gX-Startcodon, 28 Codons des gX-Gens, eine im Rahmen liegende Fusion zum TGE-gp195- Gen an der BstEII-Stelle, das TGE-Strukturgen, das TGE-Stopcodon, eine Fusion in dem TGE-3'-nichttranslatierten Bereich an den HSV-TK-3'-nichttranslatierten Bereich und die HSV-TK- poly-A-Signalsequenz.
  • Die TGE-Konstruktion wurde in dem "direkten Ligationsvorgehen zur Erzeugung rekombinanter Herpesviren" verwendet. Das Restriktionsenzym XbaI wurde zum Schneiden der PRV-DNA und der Plasmid-DNA vor dem Ligieren verwendet. Nach der Transfektionsstufe im Vorgehen wurde das erhaltene rekombinante Virus aus der Transfektionsvorratslösung durch Analyse der DNA in jeder Stufe plaquegereinigt. Das aus dieser Untersuchung resultierende Virus wurde als S-PRV-055 bezeichnet.
  • S-PRV-055 enthielt das an der XbaI-Stelle im Repeatbereich insertierte TGE-gp195-Gen, wie im Rahmen des unter "Southern-Blotting von DNA" beschriebenen Vorgehens unter Verwendung des TGE-Kodierbereichs als Sonde gezeigt wurde. Die Expression des gp195-Proteins wurde durch das unter "Antikörperuntersuchung bezüglich rekombinanter Herpesviren" beschriebene Vorgehen gezeigt.
  • Die Struktur von S-PRV-055 ist in Fig. 23C dargestellt.
    • BEISPIEL 19 S-IBR-018
  • S-IBR-018 ist ein IBR-Virus, das drei insertierte Fremdgene besitzt: Das E. coli-beta-Galactosidasegen und das Neomycinresistenzgen in der XbaI-Stelle im einzigen langen Bereich und das Parainfluenza-3 (PI-3)-Virus-Hämagglutiningen (HN) in der HindIII-Stelle im einzigen langen Bereich in unmittelbarer Nähe zur XbaI-Stelle.
  • Zum Klonieren des PI-3-HN-Gens wurde der SF-4-Stamm von PT-3 in Kultur in MADIN-DARBY-Rindernieren (MDBK)-Zellen gezüchtet und die RNA aus infizierten Zellen extrahiert. Die RNA wurde in dem unter "cDNA-Klonieren" beschriebenen Vorgehen in dem dargestellten Reverse Transkriptionsprotokoll unter Verwendung von poly-dT als Primer für die Reverse Transkriptase verwendet. Aus diesem Vorgehen wurde eine Reihe von Klonen erhalten, die Teile des Genoms des PE-3-Virus umfaßten. Die Stelle des Gens für das Human-PI-3-HN-Gen ist veröffentlicht (60, 61), wobei diese Information zur Lokalisierung des Gens in den Rinder-PI-3-Klonen der Anmelder verwendet wurde. Der gesamte offene Leserahmen des Rinder- PI-3-HN-Gens wurde durch die Anmelder sequenziert und ist in Fig. 24 dargestellt.
  • Der HSV-ICP4-Promotor wurde zur Expression des PI-3-HN-Gens verwendet, wobei das HSV-TK-poly-A-Signal zur Beendigung der Transkription verwendet wurde. Die Konstruktion dieses Konstrukts erfolgte gemäß der Darstellung in den Fig. 25A und B. Das Konstrukt enthielt (in 5'- zu 3'-Richtung) den HSV- ICP4-Promotor, die ICP4-TATA-Box, die ICP4-Capstelle, eine Fusion im ICP4-5'-nichtranslatierten Bereich an das PT-3-HN- Gen an der HhaI-Stelle, das HN-Gen-Startcodon, das HN-Strukturgen, das HN-Stopcodon, eine Fusion im HN-3'-nichttranslatierten Bereich an den HSV-TK-nichttranslatierten 3'-Bereich und die HSV-TK-poly-A-Signalsequenz.
  • Dieses Plasmid enthielt auch das beta-Galactosidasegen unter Steuerung des PRV-gpX-Promotors mit dem gpX-poly-A-Terminationssignal sowie das Neomycinresistenzgen unter Steuerung des gpX-Promotors mit dem TK-poly-A-Terminationssignal. Diese letzteren zwei Gene wurden hintereinander an der XbaI- Stelle im BamHI-C-Fragment kloniert (Fig. 25A und B). Dieses BamHI-C-Fragment enthielt die Homologiebereiche zur Verwendung in dem unter "DNA-Transfektion zur Erzeugung rekombinanter Viren" beschriebenen Vorgehen. Nach der Transfekttionsstufe im Vorgehen wurde das erhaltene rekombinante Virus aus der Transfektionsvorratslösung im Rahmen des unter "Selektion von G418-resistenten Herpesviren" beschriebenen
  • Vorgehens, gefolgt von dem unter "Bluogaluntersuchung bezüglich rekombinanter Herpesviren" beschriebenen Vorgehen ausgewählt und danach bezüglich der Insertion des PI-3-HN-Gens im Rahmen des unter "Southern-Blotting von DNA" beschriebenen Vorgehens analysiert. Das aus dieser Untersuchung resultierende Virus wurde als S-TBR-018 bezeichnet.
  • Die Struktur von S-IBR-018 ist in Fig. 25C dargestellt.
    • BEISPIEL 20 S-IBR-019
  • S-IBR-019 ist ein IBR-Virus, der drei insertierte Fremdgene besitzt: Das E. coli-beta-Galactosidasegen und das Neomycinresistenzgen in der XbaI-Stelle im einzigen langen Bereich und das Parainfluenza-3 (PI-3)-Virusfusionsgen (F) in der HindIII-Stelle im einzigen langen Bereich in unmittelbarer Nähe zur XbaI-Stelle.
  • Zum Klonieren des PI-3-F-Gens wurde der SF-4-Stamm von PI-3 in Kultur in MADIN-DARBY-Rindernieren (MDBK)-Zellen gezüchtet und die RNA aus infizierten Zellen extrahiert. Die RNA wurde in dem unter "cDNA-Klonieren" beschriebenen Vorgehen in dem dargestellten Reverse Transkriptionsprotokoll unter Verwendung von poly-dT als Primer für die Reverse Transkriptase verwendet. Aus diesem Vorgehen wurde eine Reihe von Klonen erhalten, die Teile des Genoms des PE-3-Virus umfaßten. Die Stelle des Gens für das Sendai-Virus-F-Gen ist veröffentlicht (6.2), wobei diese Information über die vergleichbare Sequenz zur Lokalisierung des Gens in den Rinder-PI-3-Klonen der Anmelder verwendet wurde.
  • Der HSV-ICP4-Promotor wurde zur Expression des PI-3-F-Gens verwendet, wobei das HSV-TK-poly-A-Signal zur Beendigung der Transkription verwendet wurde. Das Konstrukt enthielt (in 5'- zu 3'-Richtung) den HSV-ICP4-Promotor, die ICP4-TATA- Box, die ICP4-Capstelle, eine Fusion im ICP4-5'-nichtranslatierten Bereich an das PI-3-F-Gen, das F-Startcodon, das F-Strukturgen, das F-Stopcodon, eine Fusion im F-3'-nichttranslatierten Bereich an den HSV-TK-3'-nichttranslatierten Bereich und die TK-poly-A-Signalsequenz.
  • Dieses Plasmid enthielt auch das beta-Galactosidasegen unter Steuerung des PRV-gpX-Promotors mit dem gpX-poly-A-Terminationssignal sowie das Neomycinresistenzgen unter Steuerung des gpX-Promotors mit dem TK-poly-A-Terminationssignal. Diese letzteren zwei Gene wurden hintereinander an der XbaI- Stelle im BamHI-C-Fragment kloniert (Fig. 26A und B). Dieses BamHI-C-Fragment enthielt die Homologiebereiche zur Verwendung in dem unter "DNA-Transfektion zur Erzeugung rekombinanter Viren" beschriebenen Vorgehen. Nach der Transfekttionsstufe im Vergehen wurde das erhaltene rekombinante Virus aus der Transfektionsvorratslösung im Rahmen des unter "Selektion von G418-resistenten Herpesviren" beschriebenen Vorgehens, gefolgt von dem unter "Bluogaluntersuchung bezüglich rekombinanter Herpesviren" beschriebenen Vorgehen ausgewählt und danach bezüglich der Insertion des PI-3-F-Gens im Rahmen des unter "Southern-Blotting von DNA" beschriebenen Vorgehens analysiert. Das aus dieser Untersuchung resultierende Virus wurde als S-IBR-019 bezeichnet.
  • Die Struktur von S-IBR-019 ist in Fig. 26C dargestellt.
    • BEISPIEL 21 S-HVT-003
  • S-HVT-003 ist ein Truthahn-Herpesvirus (HVT), das das in den einzigen langen Bereich des HVT-Genoms insertierte E. colibeta-Galactosidasegen plus das große RNA-Segment (als cDNA- Kopie) des infektiösen Schleimbeutelerkrankung-Virus (IBDV)- Stamms S40747 enthält. Diese IBDV-DNA enthält einen offenen Leserahmen, der für drei Proteine (5'VP2-VP4-VP3 3') kodiert, wobei zwei von ihnen Antigene sind, um einen Schutz vor IBDV-Hühnerinfektionen zu liefern. Die Expression der Gene für sowohl beta-Galactosidase als auch das IBDV-Polyprotein befindet sich unter der Steuerung des Pseudorabiesvirus (PRV)-gpX-Genpromotors. Das unter der ATCC Hinterlegungsnr. VR 2178 hinterlegte S-HVT-003 wurde durch homologe Rekombination hergestellt.
  • Die IBDV-Gene wurden im Rahmen des cDNA-Klonierungsvorgehens kloniert. Das Genom von IBDV darstellende Klone wurden im Rahmen des unter "Southern-Blotting von DNA" beschriebenen Vorgehens gegen authentische IBDV-RNA enthaltende Blots gescreent. Positive Klone wurden anschließend durch Restriktionskartierung charakterisiert, um Gruppen von Klonen zu identifizieren. Zwei derartige Klone wurden identifiziert, wobei festgestellt wurde, daß sie zusammen den gesamten Kodierbereich des großen IBDV-RNA-Segments darstellen (3,3 kb dsRNA). Ein cDNA-Klon (2-84) enthielt ein etwa 2500 Basenpaare großes Segment, das die erste Hälfte des IBDV-Gens darstellt. Das zweite Klon (2-40) enthielt ein etwa 2000 Basenpaare großes Fragment, das die distale Hälfte des IBDV- Gens darstellt. Das das gesamte IBDV-Gen darstellende Plasmid 2-84/2-40 wurde durch Verbinden des Klons 2-84 und 2-40 an einer einzigen in den überlappenden Sequenzen vorhandenen PvuII-Stelle konstruiert. Das IBDV-Genom kann aus dem Plasmid 2-84/2-40 als ein etwa 3400 Basenpaare großes SmaI- bis HpaI-Fragment erhalten werden. Die Bestätigung der Natur der durch das IBDV-Gen kodierten Proteine wurde durch Exprimieren des Klons (2-84/2-40) in E. coli und Nachweisen des VP3- Antigens unter Verwendung von gegen gereinigte IBDV-Capsidproteine hergestelltem Antiserum auf Westernblots erhalten. Die durch die Anmelder festgestellte Sequenz des großen DNA-Segments mit Kodierung für die IBDV-Antigene ist in Fig. 27 dargestellt. Diese Sequenz zeigt einen offenen Leserahmen, der im folgenden als das IBDV-Gen bezeichnet wird.
  • Jüngst wurde die Sequenz eines australischen IBDV-Stamms veröffentlicht, der eine große Homologie mit der Sequenz der Anmelder besitzt (63). Ein Vergleich der Aminosäureunterschiede zwischen den beiden Viren zeigte in dem 1012 Aminosäure umfassenden Kodierbereich Änderungen bei 29 Aminosäuren. Für VP4 wurden Unterschiede bei lediglich drei Aminosäuren und für VP3 Unterschiede bei lediglich acht Aminosäuren festgestellt. Im Gegensatz dazu fanden sich bei VP2 Änderungen in 18 Aminosäuren, wobei 14 von ihnen zwischen den Aminosäuren 139 und 332 versammelt waren.
  • Zur Insertion in das Genom von HVT wurde der Kodierbereich für das IBDV-Gen zwischen den PRV-gpX-Promotor und die HSV- TK-poly-A-Signalsequenz unter Erzeugung des Plasmids 191-23 kloniert. Zur Unterstützung der Identifizierung der durch homologe Rekombination hergestellten HVT-Rekombinanten, die das IBDV-Gen enthielten, wurde das einen gpX-Promotor aufweisende IBDV-Fragment aus dem Plasmid 191-23 hinter (im Anschluß an) ein beta-Galactosidasegen, das durch einen gpX- Promotor gesteuert wird, insertiert. Das erhaltene Plasmid 191-47 enthält das E. coli-beta-Galactosidasegen und das IBDV-Gen unter Steuerung einzelner PRV-gpX-Promotoren. Bei der Konstruktion des Plasmids 191-47 wurden verschiedene DNA-Fragmente durch rekombinante DNA-Techniken unter Verwendung entweder natürlich vorkommender Restriktionsstellen oder unter Verwendung synthetischer Linker-DNA verbunden. Details bezüglich der Konstruktion dieser im Plasmid 191-47 enthaltenen Gene finden sich in Fig. 28. Das erste Segment der DNA (Segment 1, Fig. 28) enthält den gpX-Promotorbereich, einschließlich der Reste mit Kodierung für die ersten sieben Aminosäuren des gpX-Gens und ist von einem Subklon des PRV-BamHI-#10-Fragments als einem etwa 800 Basenpaare langen SalI- bis BamHI-Fragment abgeleitet. Das zweite Segment der DNA (Segment 2, Fig. 28) enthält den E. coli-beta- Galactosidasekodierbereich von der Aminosäure 10 bis zur Aminosäure 1024 und stammt von dem Plasmid pJF751 (erhalten von Jim Hoch, Scripps Clinic and Research Foundation) in Form eines etwa 3300 Basenpaare großen BamHI- bis BalI-Fragments, gefolgt von einem etwa 40 Basenpaare langen AvaI- bis SmaI-Fragment. Das dritte Segment der DNA (Segment 3, Fig. 28) enthält die gpX-poly-A-Sequenz und stammt von einem Subklon des PRV-BamHI-#7-Fragments in Form eines etwa 700 Basenpaare großen NdeI- bis StuI-Fragments. Das Segment 3 wurde mit dem Segment 2 durch Ligieren des NdeI-Endes, das gemäß Polymeraseauffüllreaktion aufgefüllt worden war, mit der SmaI-Stelle verbunden. Das vierte Segment der DNA (Segment 4, Fig. 28) enthält den gpX-Promotor (TATA-Box plus Capstelle) und stammt von einem Subklon aus dem PRV-BamHI- #10-Fragment in Form eines etwa 330 Basenpaare großen NaeI- bis AluI-Fragments. Darüber hinaus enthält das Segment 4 etwa 36 Basenpaare einer HSV-TK-5'-nichttranslatierten Leadersequenz in Form eines PstI- bis BglII-Fragments, in dem die PstI-Stelle mit der AluI-Stelle unter Verwendung eines synthetischen DNA-Linkers (64) verbunden ist. Die DNA- Segmente vier bis sechs wurden in Form einer Einheit in die einzige KpnI-Stelle des Segments 3, die sich 3' der gpX- poly-A-Signalsequenz befindet, insertiert. Das fünfte Segment der DNA (Segment 5, Fig. 28) enthält den gesamten Kodierbereich des großen IBDV-Segments der RNA (cDNA-Klon) in Form eines etwa 3400 Basenpaare großen SmaI- bis HpaI-Fragments. Die SmaI-Stelle des Segments 5 wurde an die BgIII- Stelle des Segments 4, das gemäß Polymeraseauffüllreaktion aufgefüllt worden war, fusioniert. Die Expression des IBDV- Gens (5'VP2-VP4-VP3 3') befindet sich unter der Steuerung des gpX-Promotors (Segment 4), sie besitzt jedoch ihre eigenen natürlichen Start- und Stoppcodons. Das sechste DNA-Segment (Segment 6, Fig. 28) enthält die HSV-TK-poly-A-Signalsequenz in Form eines etwa 800 Basenpaare großen SmaI-Fragments (erhalten von Bernard Roizman, Univ. of Chicago). Die HpaI-Stelle des Segments 5 wurde an die SmaI-Stelle des Segments 6 unter Verwendung eines synthetischen DNA-Linkers fusioniert.
  • Zusammengefaßt enthält das zur Erzeugung von S-HVT-003 verwendete Konstrukt (Plasmid 191-47) (in 5'- zu 3'-Richtung) den PRV-Promotor, die gpX-TATA-Box, die gpX-Capstelle, die ersten sieben Aminosäuren von gpX, das E. coli-beta-Galactosidasegen, die PRV-poly-A-Signalsequenz, den PRV-gpX-Promotor, die gpX-TATA-Box, die gpX-Capstelle, eine Fusion im gpX-nichttranslatierten-5'-Leader an das IBDV-Gen, das IBDV- Startcodon, eine Fusion im IBDV-nichttranslatierten-3'-Ende an das HSV-TK-nichttranslatierte 3'-Ende und die TK-poly-A- Signalsequenz. Die diese Gene enthaltende Kassette wurde derart konstruiert, daß sie von zwei EcoRI-Restriktionsendonucleasestellen flankiert ist. Als Ergebnis kann ein sowohl beta-Galactosidase- als auch das IBDV-Gen enthaltendes, etwa 9100 Basenpaare großes Fragment durch Verdauung mit EcoRI erhalten werden. Folglich wird das 9161 Basenpaare große EcoRI-Fragment im folgenden als IBDV/b-gal-Kassette bezeichnet.
  • Die folgenden Vorgänge wurden dazu verwendet, S-HVT-003 durch homologe Rekombination zu konstruieren. Die IBDV/bgal-Kassette wurde in die einzige XhoI-Stelle, die in einem Subklon des HVT-BamHI-#16-Fragments vorhanden war, insertiert. Um dies zu erreichen, wurde die XhoI-Stelle zuerst unter Verwendung eines EcoRI-Linkers zu einer EcoRI-Stelle verändert. Diese Stelle hat sich vormals durch die Insertion von beta-Galactosidase in HVT (S-HVT-001) als nicht essentiell erwiesen. Es war ferner gezeigt worden, daß die flankierenden Homologiebereiche in BamHI #16 bei einer homologen Rekombination wirksam waren. Wie in Fig. 29 dargestellt, ist die Genomstelle des BamHI-#16-Fragments kartographisch in dem einzigen langen Bereich von HVT gelegen. Die vollständige Nucleotidsequenz des etwa 3329 Basenpaare großen BamHI-#16-Fragments findet sich in Fig. 30. Die HvT-DNA wurde durch das unter "Herstellung von Herpesviren von Truthahn-DNA" beschriebene Vorgehen hergestellt. Cotransfektionen von HVT-DNA und Plasmid-DNA in primäre Hühnerembryofibroblasten (CEF)-Zellen erfolgten gemäß dem unter "DNA-Cotransfektion zur Erzeugung rekombinanter HVT-Viren" beschriebenen Vorgehen. Das rekombinante Virus aus der Cotransfektionsvorratslösung wurde durch drei aufeinanderfolgende Runden einer Plaquereinigung unter Verwendung des unter "Bluogaluntersuchung bezüglich rekombinanter Herpesviren" beschriebenen Vorgehens gereinigt. Wenn 100% der Plaques blau waren, wurde die DNA bezüglich der Anwesenheit des IBDV-Gens durch das unter "Southern-Blotting von DNA" beschriebenen Vorgehens analysiert. Die Southern Blots, die mit EcoRI verdaute S-HVT-003-DNA mit einer IBDV-spezifischen nicktranslatierten Sonde sondieren (Plasmid 2-84/2-40), bestätigten die Anwesenheit des 9100 Basenpaare großen EcoRI- Fragments. Dieses Ergebnis bestätigte, daß in das Genom von S-HVT-003 sowohl das beta-Galactosidasegen als auch das IBDV-Gen eingebaut waren. Weitere Southern Blots unter Verwendung einer für BamHI #16 spezifischen Sonde bestätigten, daß die homologe Rekombination an einer geeigneten Position in Bam 16 auftrat und daß keine Deletionen erzeugt wurden. In vitro wurden keine Unterschiede beim Wachstum von S-HVT- 003, verglichen mit Virus vom Wildtyp (S-HVT-000), beobachtet.
  • Die Expression von IBDV-spezifischen Proteinen aus S-HVT-003 wurde in vitro unter Verwendung des Westernblotvorgehens untersucht. Zellysate wurden gemäß "Herstellung von Herpesviruszellysaten" hergestellt. Kurz gesagt, wurden die in den Zellysaten von S-HVT-003 enthaltenen Proteine durch Polyacrylamidgelelektrophorese getrennt, auf Nitrocellulose übertragen und mit entweder einem gegen denaturierte gereinigte IBDV-Capsidproteine hergestellten Antiserum oder einem gegen ein synthetisches Peptid, das einem vorausgesagten immunodominanten Bereich des 40 kd großen IBDV (VP2)-Capsidproteins entspricht, hergestellten Antiserum sondiert. Die Filter wurden gewaschen und mit ¹²&sup5;I-Protein A zum Nachweis der Position der gebundenen Antikörper behandelt. Fig. 31 zeigt die unter Verwendung des gegen denaturierte gereinigte IBDV-Capsidproteine, von denen die Anmelder gezeigt haben, daß sie hauptsächlich mit VP3 (einem 32 kd großen Protein) reagieren, hergestellten Antiserums erhaltenen Ergebnisse. Wie dargestellt ist, liefert S-HVT-003 ein Protein, das immunologisch von dem authentischen VP3-Protein von intakten IBDV-Virionen ununterscheidbar ist. Darüber hinaus scheint das Polyprotein richtig behandelt worden zu sein, da eine VP3-Spezies gebildet wird, die mit dem authentischen VP3- Protein mitwandert. Jüngste Hinweise unter Verwendung eines australischen IBDV-Stamms zeigen, daß VP4 bei der Behandlung des Vorläuferpolyproteins zu einer reifen VP2- und VP3- Proteinspezies beteiligt ist (65)
  • Fig. 32 zeigt die Ergebnisse, die unter Verwendung eines gegen ein synthetisches Peptid, das zu einem 14 Aminosäure großen Bereich des IBDV-VP2 (40 kd)-Capsidproteins homolog ist, erzeugten Kaninchenantiserums erhalten wurden. Wie ersichtlich ist, liefert S-HVT-003 ein Protein, das immunologisch von dem authentischen Virus-VP2-Protein ununterscheidbar ist. Darüber hinaus wandert das durch S-HVT-003 gebildete VP2-Protein mit der 40 kd großen Spezies von VP2, die aus intakten IBDV-Virionen isoliert wurde, mit. Diese Spezies stellt die Hauptkomponente der infektiösen (vollständigen) Virusteilchen dar.
  • Zusammengefaßt läßt sich sagen, daß eine Analyse der Expression der IBDV-spezifischen Proteine von S-HVT-003 zeigt, daß das Polyprotein in CEF-Zellkulturen unter Bildung von Proteinen der geeigneten Größe, die zu immunologischen Reagenzien reagieren, die für entweder VP2- oder VP3-Proteine auf Westernblots spezifisch sind, verarbeitet werden.
  • Der folgende Satz von Experimenten erfolgte bei Hühnern zur Analyse der in vivo-Expression der in S-HVT-003 enthaltenen IBDV-Gene gemäß Bestimmung durch Serokonversionsdaten, Serumneutralisationsergebnisse und Schutz gegenüber einer IBDV-Herausforderung.
  • Das erste Experiment war darauf ausgelegt, die Serokonversion von Hühnern gegenüber IBDV nach Impfung mit S-HVT-003 zu zeigen. Elf 11 Wochen alte Hühner, die gegenüber HVT und IBDV serumnegativ waren, wurden von SPAFAS Inc. erhalten. Sechs Vögel wurden subkutan im Abdominalbereich mit 1/2 ml einer Zellsuspension von S-HVT-003 enthaltenden CEF-Zellen (40.000 PFU pro ml) geimpft. Alle 7 Tage wurden 8 Wochen lang bei allen Vögeln in dieser Untersuchung Serumproben entnommen. Am 28. Tag (4. Woche) erhielten drei dieser Vögel eine Verstärkung von S-HVT-003, während die anderen drei Vögel 1/2 ml eines inaktivierten IBDV-Impfstoffs erhielten, der subkutan im Cervicalbereich verabreicht wurde. Drei weitere Vögel erhielten lediglich den inaktivierten Impfstoff am 28. Tag. Zwei Vögel dienten als in-Kontakt-gebrachte Vergleichstiere und erhielten keine Impfung. Am 56. Tag wurden alle Vögel getötet und einer Nekropsie unterzogen. Tabelle VIII zeigt die Ergebnisse der Serumneutralisationsuntersuchung gegen IBDV. Bei den Vögeln, denen lediglich S-HVT- 003 gegeben worden war, wurde keine nachweisbare SN-Aktivität beobachtet. Darüber hinaus zeigte einer der drei Vögel, die lediglich den inaktivierten Impfstoff erhalten hatten, eine geringe, jedoch nachweisbare SN-Aktivität. Die SN-Titer wurden auch bei einem der drei Vögel nachgewiesen, die das S-HVT-003 und anschließend inaktivierte IBDV-Impfstoffverstärkung erhalten hatten. Diese Titer befanden sich auf einem viel höheren Niveau, als wenn der inaktivierte IBDV- Impfstoff alleine verabreicht worden war. Diese Ergebnisse legen die Vermutung nahe, daß S-HVT-003 die Vögel für eine Sekundärantwort gegen IBDV vorbereitet. Eine in vitro-Analyse der Serumproben durch Western-Blotting bestätigte die Serokonversion der Hühner gegenüber IBDV nach Impfung mit S- HVT-003 sowohl vor als auch nach der am 28. Tag verabreichten Verstärkung. TABELLE VIII Tag
  • Im zweiten Experiment wurden 25 ein-Tage-alte SPF-Hühner mit S-HVT-003 geimpft (20 subkutan mit 0,2 ml und 5 durch beidseitige Augentropfen). Zwanzig Hühner wurden als Vergleichstiere gehalten. Am 4. und 7. Tag nach Infektion wurden fünf geimpfte und zwei Vergleichsvögel ausbluten gelassen, getötet und ihre Milz für eine Virusisolation entfernt. Die Milzzellsuspensionen wurden nach Standardverfahren hergestellt, wobei ungefähr 1 · 10&sup6; Zellen in 3 ml Hühnerembryofibroblasten (CEF)-Wachstumsmedium direkt auf Sekundärzellen angeimpft wurden. Die Kulturen wurden 6-7 Tage inkubiert und anschließend bezüglich der cytopathischen Effekte (CPE) gemäß Bestimmung durch Beobachtung der Zellmorphologie bewertet. Die Kulturen wurden ein zweites Mal durchgeschleust und abermals bezüglich CPE bewertet. Die Ergebnisse sind in Tabelle IX dargestellt. Alle nichtgeimpften Vergleichstiere blieben bezüglich HVT sowohl am 4. als auch am 7. Tag der Milzzellisolationen negativ. Vier von fünf mit S-HVT-003 geimpften Vögeln waren gegenüber HVT am 4. Tag sowohl des ersten als auch des zweiten Durchlaufs positiv. Ein Vogel lieferte kein Virus. Dies kann ein Impfversagen sein. Fünf von 5 Vögeln waren bezüglich HVT am 7. Tag sowohl beim ersten als auch beim zweiten Durchschleusen positiv. Insgesamt zeigt das Vektorgewinnungsexperiment, daß S-HVT-003 im selben Maße wie das HVT-Virus vom Wildtyp in vivo repliziert und daß eine Insertion der IBDV-/beta-Galactosidase-Kassette in die XhoI-Stelle von BamHI #16 nicht zu einer nachweisbaren Abschwächung des Virus führt. Nachfolgende Experimente zur Untersuchung des gewonnenen Virus durch das unter "Bluogaluntersuchung bezüglich rekombinanter Herpesviren" beschriebene Vorgehen bestätigten die in vivo-Stabilität von S-HVT-003, indem eine beta-Galactosidaseexpression bei 100% der Viren demonstriert wurde. TABELLE IX Erntedatum 4. Tag 7. Tag Probe verunreinigt N = Vergleich, T = geimpft CPE lag in einem Bereich von negativ (-) bis 5+
  • An den Tagen 0, 4, 7, 14, 21 und 27 nach Infektion wurden vom Rest der Hühner Blutproben zur Bestimmung der Serum- ELISA-Titer gegenüber IBDV- und HVT-Antigenen sowie Virusneutralisationsuntersuchungen gegenüber IBDV entnommen. Darüber hinaus wurden am 21. Tag nach Infektion fünf Vergleichstiere und vierzehn geimpfte Hühner mit virulentem IBDV durch beidseitige Augentropfen (103,8EID&sub5;&sub0;) (bezüglich einer Immunantwort) herausgefordert. Alle Vögel wurden am 6. Tag nach Herausforderung getötet, wobei das Verhältnis Schleimbeutel/Körpergewicht bestimmt wurde. Eine Zusammenfassung der Ergebnisse ist in den Tabellen X bzw. XI dargestellt. Wie in Tabelle X ersichtlich, wurden im Rahmen eines ELISA-Tests vor dem 21. bis 27. Tag nach Impfung keine Antikörper nachgewiesen. Bei Hühnern ist die Immunantwort während der ersten beiden Wochen nach einem Ausbrüten sowohl unreif als auch parental unterdrückt, so daß diese Ergebnisse nicht total unerwartet sind. Im Gegensatz dazu waren IBDV-ELISA bis zum 21. Tag nach der Impfung negativ und lediglich nach Herausforderung am 27. Tag nachweisbar. Die am 27. Tag nach Impfung erhaltenen ELISA-Gehalte zeigen eine Primärantwort auf IBDV. Tabelle XI, die das Verhältnis Schleimbeutel/Körpergewicht für herausgeforderte Vergleichstiere und geimpfte/herausgeforderte Gruppen vergleicht, zeigt keine signifikanten Unterschiede. Eine Impfung mit S-HVT-003 unter diesen Bedingungen verhinderte eine Infektion der geimpften Vögel durch eine IBDV-Herausforderung, wie durch den Tod der vier geimpften Vögel nach Herausforderung gezeigt ist, nicht. TABELLE X ELISA Probengruppe C = Vergleich, T = geimpft, CC = herausgeforderter Vergleich, CT = herausgefordert und geimpft. Die ELISA-Titer sind GMTs und liegen in einem Bereich von 0 bis 9. TABELLE XI Probengruppe Körpergewicht Schleimbeutelgewicht Vergleich herausgeford. Vergleich herausgeford. behandelte Tiere
  • Die Werte sind Mittelwerte. Die Körpergewichte unterscheiden sich bei der Vergleichsgruppe, da herausgeforderte Vögel nicht gut fraßen. Vier herausgeforderte, behandelte Vögel starben.
  • Ein drittes Experiment wurde unter Wiederholung von Experiment 2, jedoch unter Verwendung von immunologisch antwortenden Hühnern (3 Wochen alt) durchgeführt. Sechs drei Wochen alte SPF-Leghornhühner wurden intraperitoneal mit 0,2 ml S- HVT-003 (1 Tropfen in jedes Auge) geimpft. Alle 7 Tage wurden während 6 Wochen Serumproben entnommen, wobei die Vögel am 43. Tag nach Impfung mit dem virulenten USDA-Standard- Herausforderungs-IBDV-Virus herausgefordert wurden. Sechs Tage nach Herausforderung wurden die Vergleichstiere, die geimpften herausgeforderten Tiere und die herausgeforderten Tiere getötet und die Schleimbeutel zur Sondierung mit monoklonalen Anti-IBDV-Antikörpern (MAB) (bezogen von Dr. David Snyder, Virginia-Maryland Regional College of Veterinary Medicine) entnommen. Schleimbeutelhomogenate wurden durch Vermischen von 1 ml 0,5% NP40 mit 1 Schleimbeutel hergestellt. Die Schleimbeutel wurden anschließend vermahlen und kurz beschallt. Die Überstände aus den Homogenaten wurden mit R63 MAB, das an 96 Ausnehmungen aufweisende ELISA-Platten über eine Protein-A-Verknüpfung fixiert war, umgesetzt. Nach Inkubation wurde eine Biotin-markierte Zubereitung des R63 MABs zugegeben. Nach Waschen wurde ein Avidinmeerrettichperoxidasekonjugat zugegeben, worauf inkubiert wurde. Die Tests wurden mit Tris-malcatpuffer (TMB) plus H&sub2;O&sub2;-substrat entwickelt. Die Testergebnisse sind in Tabelle XII dargestellt. Die Daten zeigen die Anwesenheit hoher Gehalte an IBDV-Antigen in allen Schleimbeuteln in der geimpften, herausgeforderten Gruppe und in der herausgeforderten Gruppe. Bei den Vergleichstieren wurde kein IBDV-Antigen nachgewiesen. IBDV-spezifisches Antigen konnte bei Verdünnungen von über 1/1000 nachgewiesen werden, wobei scheinbar zwischen geimpften und nicht geimpften herausgeforderten Gruppen keine Unterschiede auftreten. HVT-Titer gemäß Bestimmung durch ELISA waren zuerst am 7. Tag bei vier von sechs geimpften Vögeln nachweisbar. Bis zum 14. Tag zeigten sechs von sechs geimpften Vögeln Titer gegenüber HVT. Alle sechs Vögel zeigten kontinuierlich HVT-Titer über das Experiment hinweg. Vor der Herausforderung wurden keine IBDV-SN-Titer festgestellt. Im Gegensatz dazu zeigte eine Analyse dieser selben Serumproben durch ein Western-Blotting-Vorgehen die Serokonversion der mit S-HVT-003 geimpften Vögel gegenüber IBDV vor Verabreichung der Virusherausforderung. Das Niveau der Antwort blieb jedoch gering, sofern nicht durch Herausforderung eine Verstärkung erfolgte. Ein Vergleich zwischen der geimpften/herausgeforderten Gruppe und der lediglich herausgeforderten Gruppe zeigt deutlich, daß das Niveau der Reaktivität durch Westernblots bei der geimpften/herausgeforderten Gruppe viel höher ist. Diese Ergebnisse zeigen, daß S-HVT-003 zu einer Serokonversion bei geimpften Vögeln gegenüber IBDV führt. Ferner legen diese Ergebnisse die Vermutung nahe, daß das Niveau der IBDV-spezifischen Expression nicht hoch genug ist, um eine neutralisierende Antwort bei den Vögeln zu induzieren.
  • S-HVT-003 zeigt die Wirkung des Impfstoffs, die die Anmelder angestrebt haben. HVT wurde so konstruiert, daß es simultan die fremden Antigene (das b-Galactosidasegen und IBDV-Antigen) exprimiert, die im Wirt durch eine gegen diese Proteine gerichtete Immunantwort erkannt werden. Die Erfindung der Anmelder ermöglicht einen Fortschritt in Richtung auf ein auf dieser Technologie basierendes Produkt. TABELLE XII Serologie: Herpes/IBDV-ELISA-Titer Ausbluttag Vögel Nr. geimpft/herausgefordert Vergleich lediglich herausgefordert das maximale Titergehalt ist 9
    • BEISPIEL 22 S-HVT-004
  • S-HVT-004 ist ein rekombinantes Truthahn-Herpesvirus, das das in den einzigen langen Bereich insertierte Marek's Erkrankung-Virus (MDV)-Glycoprotein-A (gpA)-Gen und das auch in den einzigen langen Bereich insertierte beta-Galactosidasegen enthält. Das MDV-Antigen entfaltet mit höherer Wahrscheinlichkeit die geeignete antigene Antwort als das äquivalente HVT-Antigen.
  • Das MDV-gpA-Gen wurde durch Standardvorgehen zur DNA-Klonierung von gpA kloniert. Es wurde berichtet, daß das EcoRI- Restriktionsfragment das MDV-gpA-Gen enthält (66), wobei dieses Fragment durch seine Größe in den DNA-Klonen identifiziert wurde. Der Bereich der DNA, von dem berichtet wurde, daß er das gpA-Gen enthält, wurde durch die Anmelder sequenziert, wobei festgestellt wurde, daß er wie erwartet ein Glycoproteingen enthält. Die DNA aus diesem Gen wurde dazu verwendet, das entsprechende Gen in HVT im Rahmen des unter "Southern-Blotting von DNA" beschriebenen Vorgehens aufzufinden, wobei ein Gen in HVT identifiziert wurde, das eine sehr ähnliche Sequenz enthielt. Dieses Gen ist dasselbe, früher als gpA bezeichnete (66) Gen.
  • Zur Insertion in das HVT-Genom wurde das MDV-gpA-Gen in intakter Form verwendet, da es bereits gute Herpesvirussignalsequenzen besitzt. Das beta-Galactosidasegen wurde in das XhoI-Fragment im BamHI-Fragment #16 insertiert, worauf das MDV-gpA-Gen hinter beta-gal gemäß der Darstellung in Fig. 33A und B insertiert wurde. Die flankierenden Bereiche in BamHI #16 wurden zur homologen Rekombination verwendet. HVT-DNA und Plasmid-DNA wurden gemäß dem unter "DNA-Transfektion zur Erzeugung rekombinanter Viren" beschriebenen Vorgehen in primäre Hühnerembryofibroblasten (CEF)-Zellen cotransfiziert. Das Virus aus der Transfektionsvorratslösung wurde durch aufeinanderfolgende Plaquereinigungen unter Verwendung des unter "Bluogaluntersuchung bezüglich rekombinanter Herpesviren" beschriebenen Vorgehens gereinigt. Am Ende dieses Vorgehens, wenn 100% der Plaques blau waren, wurde die DNA bezüglich der Anwesenheit des MDV-gpA-Gens analysiert. S-HVT-004 ist ein rekombinantes Virus, in dessen Genom sowohl das beta-Galactosidasegen als auch das MDV-gpA- Gen eingebaut sind.
  • Fig. 33C zeigt die Struktur von S-HVT-004.
    • BEISPIEL 23 RINDERCORONAVIRUS
  • Rindercoronavirus (BCV) ist von der Gesamtstruktur her mit dem TGE-Virus nah verwandt. Wir haben die neutralisierenden Hauptantigene von BCV zur Verwendung in einem Herpesvirusabgabesystem (infektiöses Rinderrhinotracheitisvirus, IBR) kloniert.
  • Die Vorgehensweisen, die wir für die Konstruktion der Herpesvirussignalsequenzen zur Expression verwendet haben, wurden bei BCV angewendet. Es sei darauf hingewiesen, daß die zur Exprimierung von TGE in PRV und von PI-3 in IBR verwendeten, auch hier beschriebenen Vorgehensweisen auch bei BCV anwendbar sind.
    • NEWCASTLE DISEASE-VIRUS
  • Newcastle Disease-Virus (NDV) ist von seiner Gesamtstruktur her mit PI-3 eng verwandt. Wir haben das Hämaglutinin (HN)- und Fusions (F)-Gen von NDV zur Verwendung in dem Herpesvirusabgabesystem (Truthahn-Herpesvirus, HVT) kloniert.
  • Die Vorgehensweisen, die wir für die Konstruktion der Herpesvirussignalsequenzen zur Expression verwendet haben, lassen sich bei NDV anwenden. Es sei darauf hingewiesen, daß die Vorgehensweisen, die zur Expression von IBDV in HVT und PI-3 in IBR verwendet wurden und auch hier beschrieben sind, auch bei NDV anwendbar sind.
    • INFEKTIÖSES BRONCHITIS-VIRUS
  • Infektiöses Bronchitis-Virus (IBV) ist ein Virus von Hühnern, das von der Gesamt struktur her mit TGE eng verwandt ist. Wir haben die neutralisierenden Hauptantigene von drei IBV-Stämmen: Massachusetts, Connecticut und Arkansas-99 zur Verwendung in einem Herpesvirusabgabesystem (HVT) kloniert.
  • Die Vorgehensweisen, die wir für die Konstruktion der Herpesvirussignalsequenzen zur Expression verwendet haben, sind bei IBV anwendbar. Es sei darauf hingewiesen, daß die Vorgehensweisen, die wir zur Expression von IBDV in HVT und TGE in PRV verwendet haben, und die hier beschrieben sind, auch bei IBV anwendbar sind.
    • RINDERDIARRHOE-VIRUS
  • Rinderdiarrhoe-Virus (BVD) ist ein Rindervirus. Wir haben das neutralisierende Hauptantigen von BVD zur Verwendung in einem Herpesvirusabgabesystem (IBR) kloniert.
  • Die Vorgehensweisen, die wir für die Konstruktion der Herpesvirussignalsequenzen zur Expression verwendet haben, sind bei BVD anwendbar. Es sei darauf hingewiesen, daß die Vorgehensweisen, die wir zur Expression von TGE in PRV und PI-3 in IBR verwendet haben und die hier beschrieben sind, auch bei BVD anwendbar sind.
    • BEISPIEL 24
  • Synthetische DNA-Sequenzen können zur Bereitstellung der günstigen Triplettfrequenzen zur Expression im Herpesvirusgenom verwendet werden. Das Herpesvirus ist ein Pseudorabiesvirus von Schweinen (PRV) und das Fremdgen ist ein DNA-Fragment von Schweineparvovirus-B-Gen. Dieses Fragment der Parvovirus-DNA ist klein, es veranschaulicht jedoch dramatisch die Wirkung, die selbst eine derartige kurze ungünstige Sequenz auf die Expression besitzt, wobei sie klein genug ist, daß eine synthetische DNA-Sequenz ohne Schwierigkeiten hierfür synthetisiert werden kann. Größere ungünstige Sequenzen besitzen einen noch dramatischeren Effekt auf die Expression. Sie können auch bei einem gewissen Aufwand an Materialkosten und Arbeitsleistung synthetisch hergestellt werden.
  • Fig. 34 zeigt die Sequenz des gesamten Parvovirus-B-Gens, wobei die Sequenz des Fragments (im folgenden als 039-Fragment bezeichnet) überstrichen ist. Fig. 35A zeigt die Aminosäuren, die durch das 039-Fragment im Parvovirus-B-Protein kodiert sind.
  • Die Ausgestaltung des synthetischen DNA-Fragments beginnt mit der Aminosäuresequenz des authentischen Gens. Diese Aminosäuresequenz wurde mit Hilfe eines Computerprogramms zurück in DNA "reverse translatiert". Ein derartiges Programm wird von International Biotechnologies, Inc., New Haven, Connecticut vertrieben und wird als IBI DNA/Proteinsequenzanalysesystem bezeichnet. Bei der Konstruktion eines neuen Gens können in die synthetische DNA an einem beliebigen Punkt unter Verwendung alternativer Codons für jede beliebige Aminosäure Änderungen eingebaut werden. Die nächste Stufe der Analyse ist, eine neue synthetische DNA auf der Basis des G + C-Gehalts anzunähern. Das 039-Fragment besitzt einen G + C-Gehalt von 34%, während das Herpesvirus PRV einen G + C-Gehalt von etwa 70% aufweist. Folglich müssen Codons, die reicher an G + C sind, sofern möglich in der synthetischen DNA ersetzt werden. Die nächste Stufe besteht darin, potentielle synthetische DNA-Stücke für das 039-Fragment mit tatsächlichen Kodierbereichen von PRV zu vergleichen, um die beste neue Sequenz zu bestimmen. Dies erfolgt durch ein anderes Programm im selben Computer, der zuerst eine "Codondegenerations"-Tabelle für bekannte PRV-Gene erzeugt. Unter Verwendung dieser Tabelle kann die synthetische DNA bestimmt werden, die am besten zu dem PRV-Codongebrauch paßt. Dies ist die synthetische DNA der Wahl, da sie am meisten einem PRV-Gen ähnelt.
  • Fig. 35B zeigt das synthetische DNA-Fragment (als synthetisches 039-Fragment bezeichnet), das hergestellt wurde, um mit dem 039-Fragment in der Aminosäuresequenz zusammenzupassen. Es ist ein erfindungsgemäßes Erfordernis, daß die sowohl durch die natürliche als auch die synthetische DNA kodierten Aminosäuren im wesentlichen dieselben bleiben. In der Praxis können einige Aminosäuren verändert werden, um passende Restriktionsstellen für die nachfolgende Verwendung der synthetischen DNA in Konstruktionen zu erzeugen. Üblicherweise können diese Veränderungen auf die Zugabe von extra Aminosäuren an den Enden der interessierenden Sequenz beschränkt sein. Weitere Veränderungen im Körper der synthetischen DNA werden hier ebenso in Betracht gezogen und fallen unter den Umfang der vorliegenden Erfindung, sie sind jedoch im Grunde genommen bei der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung unnötig.
  • Die Fig. 36 und 37 veranschaulichen den Grad, in dem das natürliche 039-Fragment und das synthetisierte synthetische 039-Fragment bezüglich der Codondegeneration eines PRV-Gens zusammenpassen. Die Figuren zeigen deutlich, daß die synthetische DNA bezüglich des PRV-Codongebrauchs und des G + C- Gehalts optimiert wurde.
    • BEISPIEL 25
  • Ein Fusionsprotein kann zur Bereitstellung des Fremdantigens mit den notwendigen Triplettnucleotidfrequenzen, um eine Expression im Herpesvirusgenom zu erreichen, verwendet werden. In diesem Fall war das Fusionsprotein das E. coli-beta-Galactosidase (beta-gal)-Gen, das im Pseudorabiesvirusgenom in wirksamer Weise exprimiert wird und das einen hohen G + C- Gehalt und eine Triplettnucleotidfrequenz besitzt, die in ausreichendem Maße derjenigen eines realen Herpesvirusgens ähnelt.
  • Um die Verbesserungsaspekte der vorliegenden Erfindung zu zeigen, haben die Anmelder sowohl aminoterminale Fusionen des Parvovirus-B-Gen an beta-gal (nicht erfindungsgemäß) als auch carboxyterminale Fusionen an beta-gal (erfindungsgemäß) durchgeführt und ihre Expression in Pseudorabiesvirus verglichen. Fig. 38 zeigt die Konstruktionsdetails der aminoterminalen Fusionen, die an beta-gal erfolgten. Fig. 39 zeigt die Konstruktionsdetails der carboxyterminalen Fusionen, die an beta-gal erfolgten. Repräsentative Beispiele dieser Fusionen wurden bezüglich des von der Fusion hervorgebrachten beta-gal-Expressionsgehalts getestet. Das Verfahren zum Testen der Expression war das im Abschnitt Methoden angegebene beta-Galactosidase-ONPG-Testverfahren. Darüber hinaus wurde das Westernblotverfahren dazu verwendet, die Menge an in dem infizierten Lysat vorhandenem beta-gal, die nicht auf einer aktiven beta-gal-Expression beruhte, zu bestimmen. In allen Fällen war die Menge an enzymatisch bestimmtem beta-gal und die Menge an immunologisch bestimmten beta-gal dieselbe. Die Größe des beta-gal-Fusionsproteins auf Westernblots zeigte, daß das Protein die an beta-gal angefügte Parvovirusaminosäuresequenz enthielt.
  • Tabelle XIII zeigt die Ergebnisse der Analyse der Expression von beta-gal in repräsentativen Beispielen der Fusionen. Die Ergebnisse sind auf einen Vergleich für eine beta-gal- Expression, nämlich S-PRV-043, das keine Parvovirussequenzen enthält, normiert. Es zeigt sich deutlich, daß ein Setzen der Parvovirus-B-Sequenzen vor beta-gal (am Aminosäureterminus) drastisch die Expression von beta-gal verringert. Im Gegensatz dazu führt das Setzen der Parvovirussequenz hinter beta-gal (am Carboxyterminus) in signifikanter Weise zu einer besseren Expression sowohl des beta-gal-Teils der Fusion (Tabelle XIII) als auch vom Parvovirusteil der Fusion (wie durch die Größe und die Menge an dem Fusionsprotein auf Westernblots bestimmt wurde). Der beste direkte Vergleich, um diesen Effekt zu sehen, besteht darin, S-PRV-039 (6% Expression mit S-PRV-061 (72% Expression) zu vergleichen, wo dieselben 44 Aminosäuren von Parvovirus beteiligt sind (Tabelle XIII).
  • Dieses Beispiel liefert eine Demonstration des zweiten Verfahrens der Expression des Gens in Herpesviren. Zur praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung sollte eine Fusion durchgeführt werden, indem ein Gen, das gut exprimiert wird, an den Aminoterminus gesetzt wird und indem ein Gen, das weniger gut exprimiert wird, an den Carboxyterminus gesetzt wird. Die Reihenfolge dieser beiden Gene darf nicht verändert werden, um einen Nutzen aus der vorliegenden Erfindung zu ziehen. TABELLE XIII Expression von beta-gal in Fusionen mit dem Parvovirus-B-Gen VIRUS INSERT EXPRESSION VON B-GAL Vergleich S-PRV-043 β-gal alleine Aminofusionen Carboxyfusionen
    • BEISPIEL 26 S-PRV-065
  • S-PRV-065 ist ein Pseudorabiesvirus, das eine Deletion im TK-Gen im einzigen langen Bereich und eine Deletion im Repeatbereich besitzt. In die Repeatbereiche wurde ein Gen mit Kodierung für ein Fusionsprotein zwischen E. coli-beta- Galactosidase (lacZ-Gen) und dem Schweineparvovirus-A-Capsid insertiert.
  • Das Virus ist ein Beispiel eines einzigartigen Verfahrens zur Expression fremder Antigene aus einem Herpesvirusvektor. Das Verfahren umfaßt die Konstruktion eines Herpesvirus, das ein Gen mit Kodierung für das fremde Antigen in Form einer carboxyterminalen Fusion an E. coli-beta-Galactosidase umfaßt. Dieses Verfahren besitzt gegenüber früher bekannten Ansätzen mehrere Vorteile. Zuerst und insbesondere führt dieses Verfahren häufig zu einer dramatischen Erhöhung der absoluten Menge an Antigen, das von dem rekombinanten Virus gebildet wird. Zweitens führt das hier durchgeführte Verfahren zu einem enzymatisch aktiven Fusionsprotein, das die Reinigung des rekombinanten Virus durch das unter "Bluogaluntersuchung bezüglich rekombinanter Herpesviren" beschriebene Vorgehen gewährleistet. Drittens kann das erhaltene Fusionsprotein ohne Schwierigkeiten durch das Westernblotvorgehen unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Antikörpers zu E. coli-beta-Galactosidase charakterisiert werden.
  • Das direkte Ligationsvorgehen zur Erzeugung rekombinanter Herpesviren wurde zur Konstruktion von PRV-065 verwendet. Dieses Vorgehen erfordert eine Elternvirus-DNA, eine Elternplasmid-DNA und ein spezifisches Restriktionsenzym. Die Elternvirus-DNA stammte von PRV-002, das unter der ATCC-Hinterlegungsnr. VR 2107 hinterlegt und in der am 6. September 1985 eingereichten US-Stammanmeldung mit der Serial No. 773 403 beschrieben ist. Die Elternplasmid-DNA stammt von 244-25.3D (vgl. Fig. 40). Das verwendete Restriktionsenzym war XbaI. Das Plasmid 244-25.3D enthält ein E. coli-beta-Galactosidase-Schweineparvovirus-Fusionsgen als ein XbaI-Fragment in dem Plasmidvektor pSP65. Mehrere DNA-Segmente wurden miteinander unter Verwendung entweder natürlich vorkommender Restriktionsstellen oder synthetischer Linker-DNA verknüpft. Die detaillierte Struktur dieses Gens ist in Fig. 40 dargestellt. Das erste DNA-Segment (Segment 1 in Fig. 40) enthält den gpX-Promotor einschließlich den ersten sieben Aminosäuren des gpX-Kodierbereichs und stammte von einem Subklon des PRV-BamHI-#10-Fragments in Form eines etwa 400 Basenpaare großen SalI- bis BamHI-Fragments. Das zweite Segment der DNA (Segment 2 in Fig. 40) enthält den E. coli-beta-Galactosidasekodierbereich von der Aminosäure 10 bis zur Aminosäure 1024 und stammte von dem Plasmid pJF751 (erhalten von Jim Hoch, Scripps Clinic and Research Foundation) in Form von zwei DNA-Fragmenten, d. h. eines etwa 3000 Basenpaare großen BamHI- bis NdeI-Fragments, gefolgt von einem etwa 55 Basenpaare großen NdeI- bis PvuII-Fragment. Das dritte DNA-Segment (Segment 3 in Fig. 40) enthält den Schweineparvovirus- Capsid-A-Kodierbereich von der Aminosäure 64 bis zur Aminosäure 729 und konnte von der in replikativer Form vorliegenden Schweineparvovirus-DNA (68) in Form von zwei DNA-Fragmenten, d. h. einem etwa 1600 Basenpaare großen PvuII- bis NdeI-Fragment, gefolgt von einem etwa 450 Basenpaare großen NdeI- bis RsaI-Fragment, abgeleitet werden. Diese Segmente wurden gemäß den Angaben in Fig. 40 zusammengebaut. Das aus dieser Konstruktion stammende rekombinante Virus wurde im Rahmen der Bluogaluntersuchung bezüglich rekombinanter Herpesviren gereinigt und durch Restriktionsanalyse der aus dem gereinigten Virus hergestellten Virus-DNA bestätigt. Dieses Virus wurde als S-PRV-065 bezeichnet und beim ATCC unter der Hinterlegungsnr. VR 2216 hinterlegt. Die Struktur von PRV- 065 ist in Fig. 41 dargestellt.
  • Die Expression des Parvovirus-Antigens wurde in vitro unter Verwendung des Westernblotvorgehens untersucht. Zellysate wurden wie bei "Herstellung von Herpesviruszellysaten" beschrieben hergestellt. Fig. 42 zeigt, daß eine Bande der erwarteten Größe (185 Kilodalton) für ein beta-Galactosidase- Schweineparvovirus-Capsid-A-Fusionsprotein spezifisch mit einem gegen beta-Galactosidase gerichteten Antikörper reagiert. Basierend auf Vergleichen mit bekannten Mengen von gereinigtem beta-Galactosidaseprotein wird vermutet, daß ungefähr 30 ng Parvovirus-Capsid A aus einer Infektion einer 60 mm Petrischale von Verozellen mit S-PRV-065 gebildet werden. Die Expression des Parvovirusantigens wurde ferner in vitro unter Verwendung der ELISA-Untersuchung bezüglich Parvovirusantigen untersucht. Tabelle XIV zeigt, daß S-PRV-065 Antigen exprimiert, das spezifisch mit gegen Parvovirusprotein gerichtetem Antikörper reagiert.
  • Die Ergebnisse eines Experiments, in dem entwöhnte Schweine mit S-PRV-065 gemäß der Darstellung in Tabelle XIV geimpft wurden, zeigen, das S-PRV-065 als Impfstoff zum Schutz von Schweinen vor einer Parvovirusinfektion verwendet werden kann. Nach der Impfung waren alle Tiere frei von widrigen Reaktionen und fünf von fünf Schweinen entwickelten neutralisierende Serumantikörper gegen Schweineparvovirus. Nach der Herausforderung zeigten die geimpften Tiere eine signifikante Verringerung der Virämie, bezogen auf nichtgeimpfte Vergleichstiere.
    • TABELLE XIV
  • PROBENLYSAT MITTLERER ABSORPTIONSWERT
  • Nichtinfizierte Zellen 0,181
  • PRV-013 0,074
  • PRV-040 0,300
  • PRV-065 0,511
  • PRV-086 0,440
  • PRV-098 0,598
  • ELISA-Untersuchung bezüglich Parvovirusantigen: Ein Sandwich-ELISA wurde unter Beschichten einer Mikroausnehmungen aufweisenden Platte mit polyklonalem Kaninchenantiserum, das gegen durch Cäsiumchlorid gereinigtes Schweineparvovirus hergestellt worden war, durchgeführt. Die beschichteten Platten wurden mit Lysaten von infizierten Zellen versetzt und 90 min reagierengelassen. Die Ausnehmungen wurden gewaschen und mit einem polyklonalen Mäuseantiserum gegen Schweineparvovirus umgesetzt. Anschließend wurde ein Biotin/Avidinantimaus-IgG, das an Meerrettichperoxidase konjugiert war, zugesetzt und die Reaktion bei 405 nm abgelesen. TABELLE XV IMPFSTOFFGRUPPE SCHWEIN NR. (TAGE NACH IMPFUNG) PPV-VIRÄMIE (TAGE NACH HERAUSFORDERUNG)* DOSIS TAG VERGLEICH NICHT EINSETZBAR** *Die Herausforderung wurde am 56. Tag verabreicht **Die Schweine wurden zum Zeitpunkt der Herausforderung in die Untersuchung eingebracht - Die Lymphozyten waren bezüglich PPV negativ + Die Lymphozyten waren bezüglich PPV positiv
    • BEISPIEL 27 S-PRV-086
  • S-PRV-086 ist ein Pseudorabiesvirus, das eine Deletion im TK-Gen im einzigen langen Bereich, eine Deletion im Repeatbereich und eine Deletion im gpX-Kodierbereich besitzt. In die Deletion im gpX-Kodierbereich wurde ein Gen mit Kodierung für ein Fusionsprotein zwischen E. coli-beta- Galactosidase (lacZ-Gen) und dem Schweineparvovirus-A-Capsid insertiert.
  • Das Virus ist ein Beispiel der Kombination des einzigartigen Verfahrens der Expression eines Fremdantigens, das für PRV- 065 (Beispiel 26) beschrieben wurde, mit einer erhöhten Sicherheit und einem negativen serologischen Marker, wie er bei PRV-013 (Beispiel 6) beschrieben wurde.
  • S-PRV-086 wurde durch homologe Rekombination unter Verwendung der "DNA-Transfektion zur Erzeugung von rekombinantem PRV" konstruiert. Dieses Vorgehen erfordert eine Elternvirus-DNA und eine homologe Rekombinationsplasmid-DNA. Die Elternvirus-DNA stammte von PRV-002, das unter der ATCC-Hinterlegungsnr. VR 2107 hinterlegt und in der am 6. September 1985 eingereichten US-Stammanmeldung mit der Serial No. 773 403 beschrieben ist. Das homologe Rekombinationsplasmidwar 244-49.2H (vgl. Fig. 43). Das Plasmid 244-49.2H enthält ein durch zum gpX-Bereich homologe PRV-DNA flankiertes E. coli-beta-Galactosidase-Schweineparvovirus-Fusionsgen, das in den Plasmidvektor pSP65 kloniert ist. Mehrere DNA-Segmente wurden miteinander unter Verwendung entweder natürlich vorkommender Restriktionsstellen und/oder synthetischer Linker-DNA verknüpft. Die detaillierte Struktur dieses Gens ist in Fig. 43 dargestellt. Das erste DNA-Segment (Segment 1 in Fig. 43) enthält den gpX-Promotor einschließlich den ersten sieben Aminosäuren des gpX-Kodierbereichs und stammte von einem Subklon des PRV-BamHI-#10-Fragments in Form eines etwa 1400 Basenpaare großen EcoRV- bis BamHI-Fragments. Das zweite Segment der DNA (Segment 2 in Fig. 43) enthält den E. coli-beta-Galactosidasekodierbereich von der Aminosäure 10 bis zur Aminosäure 1024 und stammte von dem Plasmid pJF751 (erhalten von Jim Hoch, Scripps Clinic and Research Foundation) in Form von zwei DNA-Fragmenten, d. h. eines etwa 3000 Basenpaare großen BamHI- bis NdeI-Fragments, gefolgt von einem etwa 55 Basenpaare großen NdeI- bis PvuII-Fragment. Das dritte DNA-Segment (Segment 3 in Fig. 43) enthält den Schweineparvovirus-Capsid-A-Kodierbereich von der Aminosäure 64 bis zur Aminosäure 729 und konnte von der in replikativer Form vorliegenden Schweineparvovirus-DNA (68) in Form von zwei DNA-Fragmenten, d. h. einem etwa 1600 Basenpaare großen PvuII- bis NdeI-Fragment, gefolgt von einem etwa 450 Basenpaare großen NdeI- bis RsaI-Fragment, abgeleitet werden. Das vierte Segment (Segment 4 in Fig. 43) enthält das gpX-poly- A-Additionssignal und stammte von einem Subklon des PRV- BamHI-Fragments #7 in Form eines etwa 1800 Basenpaare großen NdeI-bis StuI-Fragments. Diese Segmente wurden gemäß den Angaben in Fig. 43 zusammengebaut. Das aus dieser Konstruktion stammende rekombinante Virus wurde im Rahmen der Bluogaluntersuchung bezüglich rekombinanter Herpesviren gereinigt und durch Restriktionsanalyse der aus dem gereinigten Virus hergestellten Virus-DNA bestätigt. Dieses Virus wurde als S-PRV-086 bezeichnet und beim ATCC unter der Hinterlegungsnr. VR 2216 hinterlegt. Die Struktur von PRV-086 ist in Fig. 44 dargestellt.
  • Die Expression des Parvovirus-Antigens wurde in vitro unter Verwendung des Westernblotvorgehens untersucht. Zellysate wurden wie bei "Herstellung von Herpesviruszellysaten" beschrieben hergestellt. Fig. 42 zeigt, daß eine Bande der erwarteten Größe (180 Kilodalton) für ein beta-Galactosidase- Schweineparvovirus-Capsid-A-Fusionsprotein spezifisch mit einem gegen beta-Galactosidase gerichteten Antikörper reagiert. Basierend auf Vergleichen mit bekannten Mengen von gereinigtem beta-Galactosidaseprotein wird angenommen, daß ungefähr 15 ng Parvovirus-Capsid A aus einer Infektion einer 60 mm Petrischale von Verozellen mit S-PRV-086 gebildet werden.
  • Die Ergebnisse eines Experiments, in dem entwöhnte Schweine mit S-PRV-086 gemäß der Darstellung in Tabelle XVI geimpft wurden, zeigen, das S-PRV-086 als Impfstoff zum Schutz von Schweinen vor einer Parvovirusinfektion verwendet werden kann. Nach der Impfung waren alle Tiere frei von widrigen Reaktionen und zwei von drei Schweinen entwickelten neutralisierende Serumantikörper gegen Schweineparvovirus. Nach der Herausforderung zeigten die geimpften Tiere eine signifikante Verringerung der Virämie, bezogen auf nichtgeimpfte Vergleichstiere. TABELLE XVI IMPFSTOFFGRUPPE SCHWEIN NR. (TAGE NACH IMPFUNG) PPV-VIRÄMIE (TAGE NACH HERAUSFORDERUNG)* TAG VERGLEICH * Herausforderung nach 42 Tagen - Die Lymphozyten waren bezüglich PPV negativ + Die Lymphozyten waren bezüglich PPV positiv
    • BEISPIEL 28 S-PRV-040
  • S-PRV-040 ist ein Pseudorabiesvirus, das eine Deletion im TK-Gen im einzigen langen Bereich und eine Deletion im Repeatbereich besitzt. In die Repeatbereiche wurde ein Gen mit Kodierung für ein Fusionsprotein zwischen der Pseudorabies-gpX-Sekretionssignalsequenz und dem Schweineparvovirus- A-Capsid insertiert.
  • Das Virus ist ein Beispiel eines einzigartigen Verfahrens zur Expression fremder Antigene aus einem Herpesvirusvektor. Das Verfahren umfaßt die Konstruktion eines Herpesvirus, das ein Gen umfaßt, das für das fremde Antigen in Form einer carboxyterminalen Fusion an eine Herpesvirus-Sekretionssignalsequenz kodiert. Dieses Verfahren besitzt gegenüber früher bekannten Ansätzen mehrere Vorteile. Erstens führt dieses Verfahren häufig zu einer Erhöhung der absoluten Menge an Antigen, das von dem rekombinanten Virus gebildet wird. Zweitens führt das Verfahren häufig zu der Sekretion des Fremdantigens aus mit dem Herpesvirusvektor infizierten Zellen. Drittens wird das Sekretionssignal häufig aus dem Fusionsprotein abgespalten. Dies führt zu einem Protein, das dem nicht fusionierten Antigen stärker ähnelt.
  • Das direkte Ligationsvorgehen zur Erzeugung rekombinanter Herpesviren wurde zur Konstruktion von PRV-040 verwendet. Dieses Vorgehen erfordert eine Elternvirus-DNA, eine Elternplasmid-DNA und ein spezifisches Restriktionsenzym. Die Elternvirus-DNA stammte von PRV-002, das unter der ATCC-Hinterlegungsnr. VR 2107 hinterlegt und in der am 6. September 1985 eingereichten US-Stammanmeldung mit der Serial No. 773 403 beschrieben ist. Die Elternplasmid-DNA stammt von 167-72.546 (vgl. Fig. 45). Das verwendete Restriktionsenzym war XbaI. Das Plasmid 167-72.546 enthält ein PRV-gpX-Sekretionssignalsequenz-Schweineparvovirus-Fusionsgen als ein XbaI-Fragment in dem Plasmidvektor pSP65. Mehrere DNA-Segmente wurden miteinander unter Verwendung entweder natürlich vorkommender Restriktionsstellen und/oder synthetischer Linker-DNA verknüpft. Die detaillierte Struktur dieses Gens ist in Fig. 45 dargestellt. Das erste DNA-Segment (Segment 1 in Fig. 45) enthält den gpX-Promotor einschließlich den ersten sieben Aminosäuren des gpX-Kodierbereichs und stammte von einem Subklon des PRV-Kpn-J'-Fragments in Form eines etwa 500 Basenpaare großen SalI- bis SacI-Fragments. Das zweite Segment der DNA (Segment 2 in Fig. 45) enthält den Schweineparvovirus-Capsid-A-Kodierbereich von der Aminosäure 64 bis zur Aminosäure 729 und konnte von der in replikativer Form vorliegenden Schweineparvovirus-DNA (68) in Form von zwei DNA-Fragmenten, d. h. einem etwa 1600 Basenpaare großen PvuII- bis NdeI-Fragment, gefolgt von einem etwa 450 Basenpaare großen NdeI- bis RsaI-Fragment, abgeleitet werden. Diese Segmente wurden gemäß den Angaben in Fig. 40 zusammengebaut. Eine mit Hilfe des direkten Ligationsvorgehens zur Erzeugung rekombinanter Herpesviren hergestellte Transfektionsvorratslösung des rekombinanten Virus wurde ausplattiert. Zwölf Plaques wurden aufgenommen und bezüglich der Anwesenheit der ein XbaI-Fragment enthaltenden, etwa 2600 Basenpaare großen Parvovirus-DNA analysiert. Zwei der Viren enthielten das erwartete Xba-Fragment. Eines dieser Viren wurde als S-PRV-040 bezeichnet und beim ATCC unter der Hinterlegungsnr. VR 2214 hinterlegt. Die Struktur von PRV- 040 ist in Fig. 46 dargestellt.
  • Die Ergebnisse eines Experiments, in dem entwöhnte Schweine mit S-PRV-040 gemäß der Darstellung in Tabelle XVI geimpft wurden, zeigen, das S-PRV-040 als Impfstoff zum Schutz von Schweinen vor einer Parvovirusinfektion verwendet werden kann. Nach der Impfung waren alle Tiere frei von widrigen Reaktionen und zwei von drei Schweinen entwickelten neutralisierende Serumantikörper gegen Schweineparvovirus. Nach der Herausforderung zeigten die geimpften Tiere eine signifikante Verringerung der Virämie, bezogen auf nichtgeimpfte Vergleichstiere.
    • BEISPIEL 29 S-PRV-098
  • S-PRV-098 ist ein Pseudorabiesvirus, das eine Deletion im TK-Gen im einzigen langen Bereich, eine Deletion im Repeatbereich und eine Deletion im gpX-Kodierbereich besitzt. In die Deletion im gpX-Kodierbereich wurde ein Gen mit Kodierung für ein Fusionsprotein zwischen E. coli-beta- Galactosidase (lacZ-Gen) und dem Schweineparvovirus-A-Capsid insertiert. In die Repeatbereiche wurde ein zweites Gen mit Kodierung für ein Fusionsprotein zwischen der PseudorabiesgpX-Sekretionssignalsequenz und dem Schweineparvovirus-A- Capsid insertiert.
  • Dieses Virus ist ein Beispiel der Kombination der einzigartigen Verfahren zur Expression eines fremden Antigens, wie sie für PRV-065 (Beispiel 26) und PRV-040 (Beispiel 28) beschrieben sind, mit einer erhöhten Sicherheit und einem negativen serologischen Marker, wie er für PRV-013 (Beispiel 6) beschrieben ist.
  • Das direkte Ligationsvorgehen zur Erzeugung rekombinanter Herpesviren wurde zur Konstruktion von PRV-098 verwendet. Dieses Vorgehen erfordert eine Elternvirus-DNA, eine Elternplasmid-DNA und ein spezifisches Restriktionsenzym. Die Elternvirus-DNA stammte von PRV-086 (Beispiel 27), die Elternplasmid-DNA stammte von 167-72.54G (vgl. Fig. 45). Das verwendete Restriktionsenzym war XbaI. Das Plasmid 167-72.54G enthält ein PRV-gpX-Sekretionssignal-Schweineparvovirus-Fusionsgen in Form eines XbaI-Fragments im Plasmidvektor pSP65.
  • Ein dieses XbaI-Insert enthaltendes Virus wurde gemäß der Beschreibung für PRV-040 (Beispiel 28) gereinigt. Dieses Virus wurde als S-PRV-098 bezeichnet und beim ATCC unter der Hinterlegungsnr. VR 2219 hinterlegt. Die Struktur von PRV- 098 ist in Fig. 47 dargestellt.
  • Die Expression des Parvovirusantigens wurde in vitro unter Verwendung des ELISA-Tests für Parvovirusantigene untersucht. Tabelle XIV zeigt, daß S-PRV-098 das Parvovirusantigen exprimiert, das spezifisch mit dem gegen authentisches Parvovirusprotein gerichteten Antikörper reagiert.
    • BEISPIEL 30 S-PRV-066
  • S-PRV-066 ist ein Pseudorabiesvirus, das eine Deletion im TK-Gen im einzigen langen Bereich und eine Deletion im Repeatbereich besitzt. In die Repeatbereiche wurde ein Gen mit Kodierung für ein Fusionsprotein zwischen der Pseudorabies-gpX-Sekretionssignalsequenz und dem Plasmodium-falciparum (P. fal.)-Circumsporozoitprotein (CSP) insertiert.
  • Das Virus ist ein Beispiel eines einzigartigen Verfahrens zur Expression fremder Antigene aus einem Herpesvirusvektor. Dieses Verfahren umfaßt die Konstruktion eines Herpesvirus, das ein Gen umfaßt, das für das fremde Antigen in Form einer carboxyterminalen Fusion an eine Herpesvirus-Sekretionssignalsequenz kodiert. Dieses Verfahren besitzt gegenüber früher bekannten Ansätzen mehrere Vorteile. Erstens führt dieses Verfahren häufig zu einer Erhöhung der absoluten Menge an Antigen, das von dem rekombinanten Virus gebildet wird. Zweitens führt das Verfahren häufig zu der Sekretion des Fremdantigens aus mit dem Herpesvirusvektor infizierten Zellen. Drittens wird das Sekretionssignal häufig aus dem Fusionsprotein abgespalten. Dies führt zu einem Protein, das dem nicht fusionierten Antigen stärker ähnelt.
  • Das direkte Ligationsvorgehen zur Erzeugung rekombinanter Herpesviren wurde zur Konstruktion von PRV-066 verwendet. Dieses Vorgehen erfordert eine Elternvirus-DNA, eine Elternplasmid-DNA und ein spezifisches Restriktionsenzym. Die Elternvirus-DNA stammte von PRV-002, das unter der ATCC-Hinterlegungsnr. VR 2107 hinterlegt und in der am 6. September 1985 eingereichten US-Stammanmeldung mit der Serial No. 773 403 beschrieben ist. Die Elternplasmid-DNA stammt von 181-42.2 (vgl. Fig. 48). Das verwendete Restriktionsenzym war XbaI. Das Plasmid 181-42.2 enthält ein PRV-gpX-Sekretionssignal-P.fal.CSP-Fusionsgen als ein XbaI-Fragment in dem Plasmidvektor pSP18. Mehrere DNA-Segmente wurden miteinander unter Verwendung entweder natürlich vorkommender Restriktionsstellen und/oder synthetischer Linker-DNA verknüpft. Die detaillierte Struktur dieses Gens ist in Fig. 48 dargestellt. Das erste DNA-Segment (Segment 1 in Fig. 48) enthält den gpX-Promotor einschließlich den ersten 27 Aminosäuren des gpX-Kodierbereichs und stammte von einem Subklon des PRV-Kpu-J'-Fragments in Form eines etwa 500 Basenpaare großen SalI- bis SacI-Fragments. Das zweite Segment der DNA (Segment 2 in Fig. 48) enthält den P.fal.CSP-Kodierbereich von der Aminosäure 19 bis zur Aminosäure 412 und stammte von dem Plasmid pUC8/lambda mpf 5 (erhalten vom Institute of Immunology, Dept. of the Army, Walter Reed Institute of Research) in Form eines etwa 1200 Basenpaare großen StuI- bis RsaI-Fragments. Das dritte DNA-Segment (Segment 3 in Fig. 48) enthält das Herpes-simplex-Virus(HSV)-Thymidinkinase(TK)-poly A-Additionssignal und stammte vom Plasmid D5'-0.20 (68) in Form eines etwa 600 Basenpaare großen SmaI- bis PruII-Fragments. Diese Segmente wurden gemäß den Angaben in Fig. 48 zusammengebaut und im direkten Ligationsvorgehen zur Erzeugung rekombinanter Herpesviren verwendet. Ein das erwartete XbaI-Insert enthaltendes Virus wurde gemäß der Beschreibung bei PRV-040 (Beispiel 28) gereinigt. Dieses Virus wurde als S-PRV-066 bezeichnet. Die Struktur von PRV-066 ist in Fig. 49 dargestellt.
  • Die Expression des CSP-Antigens wurde in vitro unter Verwendung des Westernblotvorgehens untersucht. Zellysate wurden wie bei "Herstellung von Herpesviruszellysaten" beschrieben hergestellt. Fig. 50 zeigt, daß eine Bande der erwarteten Größe (ca. 46 Kilodalton) für ein gpX-Sekretionssignalsequenz-P.fal.-CSP-Fusionsprotein spezifisch mit einem gegen den Repeatbereich des CSP-Proteins gerichteten Antikörper reagiert. Basierend auf Vergleichen mit bekannten Mengen von gereinigtem CSP-Protein wird angenommen, daß ungefähr 2 ng CSP aus einer Infektion einer 60 mm Petrischale von Verozellen mit S-PRV-066 gebildet werden.
  • Das Potential von PRV-066 zur Induzierung einer Immunantwort in vivo wurde untersucht. Drei entwöhnte Schweine wurden geimpft. Am 21. Tag nach Infektion zeigte eines der Schweine auf der Basis der ELISA-Titer eine deutliche Serokonversion zu dem CSP-Antigen (69). Dieses Experiment zeigt die Eignung dieses Expressionsansatzes zur Induktion einer Immunantwort auf das CSP-Antigen in einem Wirttier.
    • BEISPIEL 31 S-PRV-088
  • S-PRV-088 ist ein Pseudorabiesvirus, das eine Deletion im TK-Gen im einzigen langen Bereich, eine Deletion im Repeatbereich und eine Deletion im gpX-Kodierbereich besitzt. In die Deletion im gpX-Kodierbereich wurde ein Gen für E. colibeta-Galactosidase (lacZ-Gen) insertiert. In die Repeatbereiche wurde ein zweites Gen mit Kodierung für ein eingebettetes Fusionsprotein zwischen dem PRV-gpX und dem P.fal.CPS insertiert.
  • Dieses Virus ist ein Beispiel eines einzigartigen Verfahrens zur Expression der antigenen Determinante eines fremden Antigens. Dieses Verfahren umfaßt die Konstruktion eines Herpesvirus, das ein Gen mit Kodierung für ein Herpesvirusprotein enthält, in dem eine antigene Determinante des Herpesvirusproteins durch eine antigene Determinante aus dem fremden Antigen ersetzt ist. Ein derartiges Gen enthält die fremde Determinante als eine eingebettete Fusion in das Herpesvirusprotein. Dieses Verfahren besitzt gegenüber bisher bekannten Ansätzen mehrere Vorteile. Zuerst führt dieses Verfahren häufig zu einer dramatischen (bis zur 5000fachen) Erhöhung der absoluten Menge der antigenen Determinante, die von dem rekombinanten Virus gebildet wird. Zweites erfährt die fremde antigene Determinante häufig vorteilhafte Eigenschaften des Herpesvirusproteins, beispielsweise die Lokalisation (abgeschieden, Oberfläche oder intrazellulär) und die Stimulation des Wirtimmunsystems. Drittens macht der hohe Expressionsgehalt dieses Konstrukts in vitro die Reinigung dieses Antigens von Gewebekultur zur Verwendung als ein Untereinheitsimpfstoff möglich.
  • Das direkte Ligationsvorgehen zur Erzeugung rekombinanter Herpesviren wurde zur Konstruktion von PRV-088 verwendet. Dieses Vorgehen erfordert eine Elternvirus-DNA, eine Elternplasmid-DNA und ein spezifisches Restriktionsenzym. Die Elternvirus-DNA stammte von PRV-013 (Beispiel 2). Die Elternplasmid-DNA stammt von PSY 1373 (vgl. Fig. 51). Das verwendete Restriktionsenzym war HindIII. Das Plasmid PSY enthält ein eingebettetes PRV-gpX-P.fal.-CSP-Fusionsgen als ein HindIII-Fragment in dem Plasmidvektor pSP65. Die in gpX zu ersetzende antigene Determinante wurde durch Computeranalyse der gpX-Aminosäuresequenz identifiziert. Die Stelle wurde durch Bilden von Kaninchen-Antiserum gegen ein chemisch synthetisiertes Peptid (Peptid 85.12, Aminosäure 299 bis 316) bestätigt, wobei gezeigt wurde, daß Antiserum spezifisch mit dem natürlich synthetisierten gpX-Protein reagiert (vgl. Beispiel 2, Fig. 4). Die antigene Determinante von P.fal.- CSP wurde von Dame und Mitarbeitern (69) bestimmt und besteht aus Tandemrepeats des Tetrapeptids asn-ala-asn-pro. Zur Konstruktion der geeigneten eingebetteten Fusion wurden verschiedene DNA-Segmente miteinander unter Verwendung entweder natürlich vorkommender Restriktionsstellen und/oder synthetischer linker DNA verknüpft. Die detaillierte Struktur dieses Gens ist in Fig. 51 dargestellt. Das erste DNA- Segment (Segment 1 in Fig. 51) enthält den gpX-Promotor und die ersten 269 Aminosäuren des gpX-Kodierbereichs und stammte von einem Subklon des PRV-Kpn-J'-Fragments in Form eines etwa 12000 Basenpaare großen SalI- bis BstEII-Fragments. Das zweite Segment der DNA (Segment 2 in Fig. 51) enthält die Antigene P.fal.-Determinante in Form von ca. 32 Tandemrepeats des Tetrapeptids und kann von dem Plasmid pUC8/lambda mpf 5 (erhalten vom Institute of Immunology, Dept. of the Army, Walter Reed Institute of Research) in Form von zwei Kopien eines etwa 200 Basenpaare großen XhoII- bis XhoII-DNA-Fragments abgeleitet werden (es sei darauf hingewiesen, daß dieses Fragment, wenn es an seinen XhoII-Enden in derselben Translationsorientierung ligiert wird, den Leserahmen von CSP beibehält). Das dritte DNA-Segment (Segment 3 in Fig. 51) enthält den C-terminalen Bereich von gpX (Aminosäuren 356 bis 498), einschließlich dem Poly A-Additionssignal, und kann von einem Subklon des PRV-BamHI- #10-Fragments in Form eines etwa 1100 Basenpaare großen BstEII- bis SalI-DNA-Fragment abgeleitet werden.
  • Diese Segmente wurden gemäß den Angaben in Fig. 31 A zusammengebaut und in dem direkten Ligationsvorgehen zur Erzeugung rekombinanter Herpesviren verwendet. Ein das erwartete HindIII-Insert enthaltendes Virus wurde gemäß der Beschreibung bei PRV-040 (Beispiel 28) gereinigt. Dieses Virus wurde als S-PRV-088 bezeichnet und beim ATCC unter der Hinterlegungsnummer VR 2217 hinterlegt. Die Struktur von PRV-088 ist in Fig. 52 dargestellt.
  • Die Expression des CSP-Antigens wurde in vitro unter Verwendung des Western-Blotting-Vorgehens untersucht. Zellysate wurden wie bei "Herstellung von Herpesviruszellysaten" beschrieben hergestellt. Fig. 50 zeigt, daß eine Bande der erwarteten Größe (ca. 60 Kilodalton) für das eingebettete gpX- P.fal.-CSP-Fusionsprotein spezifisch mit einem gegen den Repeatbereich des CSP-Proteins gerichteten Antikörper reagiert. Basierend auf Vergleichen mit bekannten Mengen von gereinigtem CSP-Protein wird angenommen, daß ungefähr 25 ng CSP aus einer Infektion einer 60 mm Petrischale von Verozellen mit S-PRV-088 gebildet werden.
    • BEISPIEL 32 S-PRV-093
  • S-PRV-093 ist ein Pseudorabiesvirus, das eine Deletion im TK-Gen im einzigen langen Bereich, eine Deletion im Repeatbereich und eine Deletion im gpX-Kodierbereich besitzt. In die Deletion im gpX-Kodierbereich wurde ein Gen für E. colibeta-Galactosidase (lacZ-Gen) insertiert. In die Repeatbereiche wurde ein zweites Gen mit Kodierung für ein Hybridprotein zwischen dem PRV-gpX und dem P.fal.CPS insertiert.
  • Diese Virus ist ein Beispiel eines einzigartigen Verfahrens zur Expression eines fremden Antigens. Das Verfahren umfaßt die Konstruktion eines Herpesvirus, das ein Gen umfaßt, das für ein Hybridprotein kodiert, dessen aminoterminaler Teil ein Herpesvirus und dessen carboxyterminaler Teil ein fremdes Antigen ist. Dieses Verfahren besitzt gegenüber früher bekannten Ansätzen mehrere Vorteile. Erstens führt dieses Verfahren häufig zu einer Erhöhung der absoluten Menge an Antigen, das von dem rekombinanten Virus gebildet wird.
  • Zweitens besitzt das fremde Antigen häufig vorteilhafte Eigenschaften sowohl des Herpesvirus als auch des fremden Antigens. Diese Eigenschaften können eine Lokalisation (abgeschieden, Oberfläche oder intrazellulär) und eine Stimulation des Wirtimmunsystems umfassen.
  • Das direkte Ligationsvorgehen zur Erzeugung rekombinanter Herpesviren wurde zur Konstruktion von PRV-093 verwendet. Dieses Vorgehen erfordert eine Elternvirus-DNA, eine Elternplasmid-DNA und ein spezifisches Restriktionsenzym. Die Elternvirus-DNA stammte von PRV-013 (Beispiel 2). Die Elternplasmid-DNA stammt von 181-66.26 (vgl. Fig. 53). Das verwendete Restriktionsenzym war HindIII. Das Plasmid 181-66.26 enthält ein PRV-gpX-P.fal.-CSP-Hybridgen als ein HindIII- Fragment in dem Plasmidvektor pSP65. Zur Konstruktion der geeigneten Hybridfusion wurden mehrere DNA-Segmente miteinander unter Verwendung entweder natürlich vorkommender Restriktionsstellen und/oder synthetischer Linker-DNA verknüpft. Die detaillierte Struktur dieses Gens ist in Fig. 53 dargestellt. Das erste DNA-Segment (Segment 1 in Fig. 53) enthält den gpX-Promotor und die ersten 269 Aminosäuren des gpX-Kodierbereichs und stammte von einem Subklon des PRV- Kpn-J'-Fragments in Form eines etwa 12.000 Basenpaare großen SalI- bis BstEII-Fragments. Das zweite Segment der DNA (Segment 2 in Fig. 53) enthält den P.fal.-CSP-Kodierbereich von der Aminosäure 19 bis zur Aminosäure 412 und stammte von dem Plasmid pUC8/lambda mpf 5 (erhalten vom Institute of Immunology, Dept. of the Army, Walter Reed Institute of Research) in Form eines etwa 1200 Basenpaare großen StuI- bis RsaI-Fragments. Das dritte DNA-Segment (Segment 3 in Fig. 53) enthält das gpX-poly A-Additionssignal und konnte von einem Subklon des PRV-BamHI-#10-Fragments in Form eines etwa 1100 Basenpaare großen BstEII- bis SalI-DNA-Fragments. Diese Segmente wurden gemäß den Angaben in Fig. 53 zusammengebaut und im direkten Ligationsvorgehen zur Erzeugung rekombinanter Herpesviren verwendet. Ein das erwartete HindIII-Insert enthaltendes Virus wurde gemäß der Beschreibung für S-PRV- 040 (Beispiel 28) gereinigt. Dieses Virus wurde als S-PRV- 093 bezeichnet und beim ATCC unter der Hinterlegungsnummer VR 2218 hinterlegt. Die Struktur von PRV-093 ist in Fig. 54 dargestellt.
  • Die Expression des CSP-Antigens wurde in vitro unter Verwendung des Westernblotvorgehens untersucht. Zellysate wurden wie bei "Herstellung von Herpesviruszellysaten" beschrieben hergestellt. Fig. 50 zeigt, daß eine Bande der erwarteten Größe (ca. 72 Kilodalton) für das gpX-P.fal.-CSP-Hybridprotein spezifisch mit einem gegen den Repeatbereich des CSP- Proteins gerichteten Antikörper reagiert. Basierend auf Vergleichen mit bekannten Mengen von gereinigtem CSP-Protein wird angenommen, daß ungefähr 600 ng CSP aus einer Infektion einer 60 mm Petrischale von Verozellen mit S-PRV-093 gebildet werden.
    • Literaturstellen
  • 1. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1982).
  • 2. S.L. Mansour, et al., Proceeding of the National Academy of Sciences USA 82, 1359-1363 (1985)
  • 3. C. Thummel, et al., Cell, 33, 455-464 (1983).
  • 4. D. Scolnick, Cell, 24, 135-143 (1981)
  • 5. C. Thummel et al., Cell, 23, 825-836 (1981).
  • 6. M. Mackett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 7415-7419 (1982)
  • 7. D. Panicali und E. Paoletti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 4927-4931 (1982)
  • 8. E. Paoletti et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 193-197 (1984)
  • 9. G.L. Smith et al., Nature, 302, 490-495 (1983).
  • 10. D. Pancicali et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 5364-5368 (1983)
  • 11. G.L. Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 7155-7159 (1983)
  • 12. G.L. Smith et al., Science, 224, 397-399 (1984).
  • 13. M. Mackett et al., Science, 227, 433-435 (1985).
  • 14. D.M. Knipe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 3896-3900 (1978)
  • 15. E.S. Mocarski et al., Cell, 22, 243-255 (1980).
  • 16. L.E. Post et al., Cell, 24, 555-565 (1981).
  • 17. L.E. Post und B. Roizman, Cell, 25, 227-232 (1981)
  • 18. K.L. Poffenberger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 2690-2694 (1981)
  • 19. M.G. Gibson und P.G. Spear, Journal of Virology, 48, 396-404 (1983)
  • 20. G. T.-Y. Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6612-6616 (1982)
  • 21. M.-F. Shih et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81. 5867-5870 (1984)
  • 22. R. Desrosiers et al., Ninth Annual Herpesvirus Meeting, Seattle, Abstract #280 (1984)
  • 23. T.J. Rea, et al., Journal of Virology 54 : 21-29 (1984).
  • 24. S. Ihara et al., Virology, 122, 268-278 (1982).
  • 25. S. Kit et al., American Journal of Veterinary Research 46, 1359-1367 (1985)
  • 26. A. Berns et al.,J. Virology, 53 89-93 (1985).
  • 27. B. Lomniczi et al., J. Virology, 49, 970-979 (1984).
  • 28. Y. Hay-Ahmed und F.L. Graham, J. Virology, 57, 267-274 (1986)
  • 29. J.H. Gillespie et al., J. Clin. Microbiology, 23, 283- 288 (1986)
  • 30. M. Arsenakis und B. Roizman, in "The High Technology Route to Virus Vaccines", American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1985 (Proceedings of the First Annual Southwest Foundation for Biomedical Research International Symposium, Houston, Texas, 8.-10. November 1984).
  • 31. L.E. Post et al., Tenth International Herpesvirus Workshop, Ann Arbor, August, 1985.
  • 32. F.L. Graham und A. Van der Eb, Virology, 52, 556-567, 1973.
  • 33. P.A. Norton und J.M. Coffin, Molecular und Cellular Biology 5, 281-290, 1985.
  • 34. T. Igarashi, et al., 10th International Herpesvirus Workshop, Abstrakt Nr. 17, Ann Arbor Michigan, August 1985.
  • 35. J. Campione - Piccardo, et al., J. Virology 31, 281- 287, 1979.
  • 36. L. Villarreal und P. Berg, Science 196, 183-185 (1977)
  • 37. S.B. Mohanty und S.K. Dutta, Veterinary virology, Lea und Febiger, Herausgeber, Philadelphia (1981).
  • 38. R. Crandell in Current Veterinary Therapy, S. 543-546, W.B. Saunders, Herausgeber, Philadelphia (1981).
  • 39. H. Ludwig in The Herpesviruses, Band 2, B. Roizman, Herausgeber, Plenum Press (1983)
  • 40. R.B. Tenser et al., J. Clinical Microbiol. 17; 122-127 (1983)
  • 41. Y-C. Cheng et al., J. Virological Methods 5, 209-217 (1982)
  • 42. U.K. Laemmli, Natrue 227, 680-685 (1970).
  • 43. K. Fukuchi, et al., J. of Virology 51, 102-109, (1984).
  • 44. M.A. Richardson et al., J. Virology 51, 860, 1985.
  • 45. R.W. Price und A. Kahn, Infection and Immunity 34, 571- 580, 1981.
  • 46. P.B. Tenser, et al., Journal of General Virology 64, 1369-1373, 1983.
  • 47. S. Kit et al., Nith International Herpesvirus Workshop, Seattle, Augsut 24-29, 1984.
  • 48. Roizman, et al., Codlspring Harbor Conference on New Approaches to Viral Vaccines, September, 1983.
  • 49. R.L. Thompson, et al., Virology 131, 180-192, 1983.
  • 50. K. Fukuchi, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 751-754, 1985.
  • 51. J.M. Koomey, et al., Journal of Virology 50, 662-665, 1984.
  • 52. T.C. Holland, et al., Journal of Virology, 52, 566-574, 1984.
  • 53. A.E. Churchill, et al., Journal of General Virology 4, 557-563, 1969.
  • 54. M.W. Wathan und L.M.K. Wathan, Journal of Virology 58, 173-178, 1986.
  • 55. T.C. Mettenleiter, et al., Journal of Virology 56, 307- 311, 1985.
  • 56. J.T. Van Oirschot, et al., Journal of General Virology 67, 1179-1182, 1986.
  • 57. U. Gubler und B.J. Hoffman, Gene 25, 263-269, 1983.
  • 58. D. Hanahan, Molecular Biology 166, 557-580, 1983.
  • 59. S. Hu, et al., in Modern Approaches to Vaccines, R.M. Chanock und R.A. Lerner, Herausgeber, 219-223, Cold Spring Harbor Press (1984).
  • 60. N. Elango, et al., Journal of Virology, 57, 481-489 (1986)
  • 61. M.K. Spriggs und P.L. Collins, Journal of Virology, 59, 646-654 (1986) .
  • 62. B.M. Blumenberg, et al., Journal of General Virology, 66, 317-331 (1985)
  • 63. P.J. Hudson, et al., Nucleic Acid Research, 14, 5001- 5012 (1986)
  • 64. S.L. McKnight und R. Kingbury, Science 217, 316-324.
  • 65. M.N. Jagadish, et al., J. of Virol., 62 1084-1087 (1988)
  • 66. R.J. Isfort, et al., Ninth International Herpesvirus Workshop, Abstract #146, Seattle, Washington, August 1984.
  • 67. J.H. Miller (Herausgeber), Experiments in Molecular Genetics, 352-355, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1972)
  • 68. B. Hirt, J. Mol. Biol. 26 : 365-369 (1967)
  • 69. S.L. McKnight und E.R. Gravis, Nucleic Acids. Research, 8, 3931-3949 (1980)
  • 70. J.B. Dame, et al., Science 225, 593-599 (1984).

Claims (32)

1. Rekombinanter, nicht von Primaten stammender Herpesvirus, der eine in eine nicht essentielle Region der genomischen DNA eines Herpesvirus insertierte, fremde DNA-Sequenz umfaßt, wobei die fremde DNA-Sequenz für ein rekombinantes Fusionsprotein kodiert, das mindestens einen Teil des Pseudorabiesvirus-gpX Glycoproteins und ein an das Carboxyende des Teils des gpX Glycoproteins angeschmolzenes Polypeptid umfaßt, und wobei die fremde DNA-Sequenz in einer mit dem rekombinanten Herpesvirus infizierten Wirtzelle exprimiert wird.
2. Rekombinanter Herpesvirus nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid ein antigenes Polypeptid ist.
3. Rekombinanter Herpesvirus nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Polypeptid in das Pseudorabiesvirus-gpX Glycoprotein eingebettet ist.
4. Rekombinanter Herpesvirus nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Teil des gpX Glycoproteins die aminoterminale Transmembransignalsequenz des gpX Glycoproteins umfaßt.
5. Rekombinanter Herpesvirus nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Expression der fremden DNA unter Steuerung des Herpessimplex-Virus Typ 1-Tymidinkinasepromotors oder des Pseudorabiesvirus-gpX Glycoproteinpromotors erfolgt.
6. Rekombinanter Herpesvirus nach Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5, wobei der Herpesvirus ein Pseudorabiesvirus ist.
7. Rekombinanter Herpesvirus nach Anspruch 6, wobei der Pseudorabiesvirus abgeschwächt ist.
8. Rekombinanter Herpesvirus nach Anspruch 6, wobei das antigene Polypeptid Teil des Schweineparvovirus-Capsidproteins ist.
9. Rekombinanter Herpesvirus nach Anspruch 6, wobei das antigene Polypeptid Teil des Malaria-CSP-Proteins ist.
10. Rekombinanter Herpesvirus nach Anspruch 6, wobei das antigene Polypeptid Teil der Malaria-CSP-Repeat-Region ist.
11. Rekombinanter Herpesvirus nach Anspruch 6, der als S-PRV- 040 bezeichnet wird und unter der ATCC Nr. VR 2214 hinterlegt ist.
12. Rekombinanter Herpesvirus nach Anspruch 6, der als S-PRV- 098 bezeichnet wird und unter der ATCC Nr. VR 2219 hinterlegt ist.
13. Rekombinanter Herpesvirus nach Anspruch 6, der als S-PRV- 088 bezeichnet wird und unter der ATCC Nr. VR 2217 hinterlegt ist.
14. Rekombinanter Herpesvirus nach Anspruch 6, der als S-PRV- 093 bezeichnet wird und unter der ATCC Nr. VR 2218 hinterlegt ist.
15. Impfstoff, der eine wirksam immunisierende Menge des rekombinanten, nicht von Primaten stammenden Herpesvirus nach Anspruch 2, 6 oder 7 und einen geeigneten Träger umfaßt.
16. Rekombinantes Fusionsprotein, das mindestens einen Teil des Pseudorabiesvirus-gpX Glycoproteins und ein an das Carboxyende des Teils des gpX Glycoproteins angeschmolzenes Polypeptid umfaßt.
17. Rekombinantes Fusionsprotein nach Anspruch 16, wobei das antigene Polypeptid in das Pseudorabiesvirus-gpX Glycoprotein eingebettet ist.
18. Rekombinantes Fusionsprotein nach Anspruch 16, wobei der Teil des gpX Glycoproteins die aminoterminale Transmembransignalsequenz des gpX Glycoproteins umfaßt.
19. Rekombinantes Fusionsprotein nach Anspruch 16, wobei das antigene Polypeptid Teil des Schweineparvovirus-Capsidproteins ist.
20. Rekombinantes Fusionsprotein nach Anspruch 16, wobei das antigene Polypeptid Teil des Malaria-CSP-Proteins ist.
21. Rekombinantes Fusionsprotein nach Anspruch 16, wobei das antigene Polypeptid Teil der Malaria-CSP-Repeat-Region ist.
22. Rekombinanter, nicht von Primaten stammender Herpesvirus, der eine in eine nicht essentielle Region der genomischen DNA eines Herpesvirus insertierte, fremde DNA-Sequenz umfaßt, wobei die fremde DNA-Sequenz für ein rekombinantes Fusionsprotein kodiert, das das E. coli b-Galactosidaseprotein, das an seinem Carboxyterminus an ein Polypeptid angeschmolzen ist, umfaßt, und wobei die fremde DNA-Sequenz in einer mit dem rekombinanten Herpesvirus infizierten Wirtzelle exprimiert wird.
23. Rekombinanter Herpesvirus nach Anspruch 22, wobei das Polypeptid ein antigenes Polypeptid ist.
24. Rekombinanter Herpesvirus nach Anspruch 22 oder 23, wobei die Expression der fremden DNA unter Steuerung des Herpessimplex-Virus Typ 1-Tymidinkinasepromotors oder des Pseudorabiesvirus-gpX Glycoproteinpromotors erfolgt.
25. Rekombinanter Herpesvirus nach Anspruch 22, 23 oder 24, wobei der Herpesvirus ein Pseudorabiesvirus ist.
26. Rekombinanter Herpesvirus nach Anspruch 25, wobei der Pseudorabiesvirus abgeschwächt ist.
27. Rekombinanter Herpesvirus nach Anspruch 25, wobei das antigene Polypeptid Teil des Schweineparvovirus-Capsidproteins ist.
28. Rekombinanter Herpesvirus nach Anspruch 25, wobei das antigene Polypeptid Teil des Malaria-CSP-Proteins ist.
29. Rekombinanter Herpesvirus nach Anspruch 25, wobei das antigene Polypeptid Teil der Malaria-CSP-Repeat-Region ist.
30. Rekombinanter Herpesvirus nach Anspruch 25, der als S- PRV-065 bezeichnet wird und unter der ATCC Nr. VR 2215 hinterlegt ist.
31. Rekombinanter Herpesvirus nach Anspruch 25, der als S- PRV-086 bezeichnet wird und unter der ATCC Nr. VR 2216 hinterlegt ist.
32. Impfstoff, der eine wirksam inununisierende Menge des rekombinanten Herpesvirus nach Anspruch 23, 25 oder 26 und einen geeigneten Träger umfaßt.
DE3854190T 1987-07-27 1988-07-27 Attenuierte herpesviren, herpesviren, die für eine aminosäuresequenz kodierende fremde dns beeinhalten und sie enthaltende impfstoffe. Expired - Lifetime DE3854190T2 (de)

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WO (1) WO1989001040A1 (de)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5763269A (en) * 1985-09-06 1998-06-09 Syntro Corporation Recombinant infectious bovine rhinotrocheitis virus
US5928648A (en) * 1985-09-06 1999-07-27 Syntro Corporation Recombinant herpesvirus of turkeys and uses thereof
US5965138A (en) * 1985-09-06 1999-10-12 Syntro Corporation Recombinant chimeric virus and uses thereof
AU623333B2 (en) * 1986-01-27 1992-05-14 Syntro Corporation Attenuated herpesviruses, herpesviruses which include foreign dna encoding an amino acid sequence and vaccine containing same
DE3853819T2 (de) * 1987-03-19 1995-09-21 Synergen Inc Virales vektorsystem zum einführen fremder dns-expressionserzeugnisse in gallinaceenvögeln.
JP2583115B2 (ja) * 1988-09-10 1997-02-19 財団法人化学及血清療法研究所 組換えマレック病ウイルスおよびその製法
GB8821441D0 (en) * 1988-09-13 1988-10-12 Animal Health Inst Viral vectors
US5695765A (en) * 1989-08-17 1997-12-09 Stichting Voor De Technische Wetenschappen Mutant pseudorabies virus, and vaccines containing the same
NL8902087A (nl) * 1989-08-17 1991-03-18 Stichting Tech Wetenschapp Niet-natuurlijk voorkomend pseudorabiesvirus en vaccins die dit bevatten.
EP0431668B1 (de) * 1989-12-04 1995-02-15 Akzo Nobel N.V. Rekombinantes Truthahn-Herpesvirus und davon abgeleiteter Lebendimpfstoffvektor
US5086372A (en) * 1990-06-29 1992-02-04 Amp Incorporated Card edge power distribution system
US5231023A (en) * 1990-07-30 1993-07-27 Akzo N.V. Recombinant Marek's disease virus
US5240703A (en) * 1991-03-01 1993-08-31 Syntro Corporation Attenuated, genetically-engineered pseudorabies virus s-prv-155 and uses thereof
DE4110962A1 (de) 1991-04-05 1992-10-08 Bayer Ag Equine herpesviren (ehv), die fremd-dna enthalten, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung in impfstoffen
US5690939A (en) * 1991-05-14 1997-11-25 Akzo Nobel N.V. Recombinant vaccine against marek's disease
ZA923041B (en) * 1991-05-14 1993-04-28 Akzo Nv Recombinant vaccine against marek's disease
AU672583B2 (en) * 1991-07-18 1996-10-10 Prutech Research And Development Partnership Recombinant infectious bovine rhinotracheitis virus
US5658572A (en) * 1991-07-26 1997-08-19 Virogenetics Corporation Infectious bursal disease virus recombinant poxvirus vaccine
US5853733A (en) * 1993-02-26 1998-12-29 Syntro Corporation Recombinant herpesvirus of turkeys and uses thereof
FR2697534A1 (fr) * 1992-11-02 1994-05-06 Rhone Merieux Virus herpès de la dinde recombinant pour la réalisation de vaccin de la maladie de Gumboro, son procédé de préparation et vaccin obtenu.
US6875856B2 (en) 1993-09-24 2005-04-05 Syntro Corporation Recombinant infectious laryngotracheitis virus and uses thereof
FR2728795B1 (fr) * 1994-12-30 1997-03-21 Rhone Merieux Vaccin vivant recombinant aviaire, utilisant comme vecteur un virus herpes aviaire
FR2728794B1 (fr) * 1994-12-30 1997-03-21 Rhone Merieux Vaccin recombinant aviaire a base de virus herpes aviaire, notamment contre la maladie de gumboro
WO1999002695A2 (en) * 1997-07-08 1999-01-21 Stichting Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid Epitopes and active sites of paramyxoviridae proteins and uses thereof
FR2824327B1 (fr) * 2001-05-02 2003-07-11 Agronomique Inst Nat Rech Particules pseudovirales de birnavirus
US6764684B2 (en) 2001-09-28 2004-07-20 Zeon Corporation Avian herpesvirus-based recombinant infectious bursal disease vaccine
PL2419132T3 (pl) 2009-04-15 2015-03-31 Ceva Sante Animale Wektory z rekombinowanego herpeswirusa ptaków i szczepionki do immunizacji wodnych gatunków ptactwa
BR112014009565A2 (pt) 2011-10-21 2017-04-18 Intervet Int Bv vírus da doença de marek não patogênico recombinante, ácido nucleico recombinante, vacina, e, método para ajudar na proteção de um frango contra vírus
RU2593950C2 (ru) 2011-10-21 2016-08-10 Интервет Интернэшнл Б.В. Рекомбинантный непатогенный mdv-вектор, обеспечивающий полиспецифический иммунитет
US11007236B2 (en) * 2016-06-09 2021-05-18 Alma Mater Studiorum Universita Di Bologna Herpesvirus with modified glycoprotein B

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0074808A3 (de) * 1981-09-16 1984-07-04 University Patents, Inc. Rekombinantes Verfahren und Materialien
US4593002A (en) * 1982-01-11 1986-06-03 Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Viruses with recombinant surface proteins
NL8303501A (nl) * 1983-10-12 1985-05-01 Centraal Diergeneeskundig Inst Deletiemutant van een herpesvirus en vaccin, dat dit virus bevat.
US4514497B1 (en) * 1983-12-30 1998-02-24 Novagene Inc Modified live pseudorabies viruses
EP0162738A1 (de) * 1984-04-09 1985-11-27 MOLECULAR GENETICS RESEARCH & DEVELOPMENT LIMITED PARTNERSHIP Herstellung von Untereinheiten von Pseudorabiesvirus-Vakzinen
ATE60799T1 (de) * 1985-07-29 1991-02-15 Upjohn Co Virus-impfstoff.
US4877737A (en) * 1985-09-06 1989-10-31 Prutech Research And Development Partnership Attenuated pseudorabies virus which has a deletion in at least a portion of a repeat sequence and vaccine containing same
AU623333B2 (en) * 1986-01-27 1992-05-14 Syntro Corporation Attenuated herpesviruses, herpesviruses which include foreign dna encoding an amino acid sequence and vaccine containing same
US5037742A (en) * 1986-07-18 1991-08-06 E. I. Du Pont De Nemours And Company Pseudorabies virus recombinants and their use in the production of proteins

Also Published As

Publication number Publication date
EP0332677A1 (de) 1989-09-20
EP0332677A4 (en) 1990-10-10
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EP0658623A3 (de) 1995-09-27
WO1989001040A1 (en) 1989-02-09
CA1337120C (en) 1995-09-26
EP0332677B1 (de) 1995-07-19
AU2308388A (en) 1989-03-01

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