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DE69738601T2 - Stabile, nicht-hygroskopische, kristalline form von n-än-n(4-(piperidin-4-yl)butanoyl)-n-ethylglycyl verbindungen - Google Patents

Stabile, nicht-hygroskopische, kristalline form von n-än-n(4-(piperidin-4-yl)butanoyl)-n-ethylglycyl verbindungen Download PDF

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DE69738601T2
DE69738601T2 DE69738601T DE69738601T DE69738601T2 DE 69738601 T2 DE69738601 T2 DE 69738601T2 DE 69738601 T DE69738601 T DE 69738601T DE 69738601 T DE69738601 T DE 69738601T DE 69738601 T2 DE69738601 T2 DE 69738601T2
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DE
Germany
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ethylglycyl
piperidin
hygroscopic
aspartyl
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DE69738601D1 (de
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Zofia J. Chrzan
James J. Lansdale MENCEL
David Lansdale TOLEDO-VELASQUEZ
Vincent Green Lane WINDISCH
Rick G. Harleysville WOODWARD
Diane C. Salazar
Narasimha M. Phoenixville VEMURI
Anthony J. Oley GARDETTO
Matthew R. Barto POWERS
Gregory G. Wilmington KUBIAK
Robert C. Walnut Creek LIU
Benoit J. Collegeville VANASSE
James P. Voorhees SHERBINE
Walter Douglasville RODRIGUEZ
Adam W. Collegeville SLEDESKI
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Aventis Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Aventis Pharmaceuticals Inc
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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • 1. Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft eine nichthygroskopische, stabile kristalline Form von N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid der Formel I.
  • Die Verbindung hat antithrombotische Wirkung,
    Figure 00010001
    einschließlich der Inhibierung der Thrombozytenaggregation und der Thrombusbildung in Säugetieren, und eignet sich zur Prävention und Behandlung von Thrombose, die mit Krankheitszuständen wie Herzinfarkt, Schlaganfall, peripherer arterieller Verschlußkrankheit und disseminierter intravasaler Koagulation assoziiert ist.
  • Darüber hinaus betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung der kristallinen Form von N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid, eine pharmazeutische Zusammensetzung davon und Zwischenprodukte davon.
  • Die Hämostase, die Biochemie der Blutgerinnung, ist ein außerordentlich komplexes Phänomen, bei dem normales Vollblut und Körpergewebe spontan die Blutung aus verletzten Blutgefäßen stoppen. Eine effektive Hämostase erfordert die kombinierte Aktivität von Gefäß-, Thrombozyten- und Plasmafaktoren sowie einen Kontrollmechanismus zur Verhinderung einer übermäßigen Gerinnung. Defekte, Mängel oder Exzesse einer dieser Komponenten können hämorrhagische oder thrombotische Folgen haben.
  • Die Thrombozytenadhäsion und ihre Ausbreitung und Aggregation an extrazelluläre Matrizen sind zentrale Ereignisse bei der Thrombusbildung. Diese Ereignisse werden durch eine Familie adhäsiver Glykoproteine, d. h. Fibrinogen, Fibronectin und dem von-Willebrand-Faktor vermittelt. Bei Fibrinogen handelt es sich um einen Kofaktor bei der Thrombozytenaggregation, während Fibronectin die Thrombozytenanbindungs- und -ausbreitungsreaktionen unterstützt und der von-Willebrand-Faktor bei der Anbindung von Thrombozyten an und der Ausbreitung auf Subendothelialmatrizen von Bedeutung ist. Die Bindungsstellen für Fibrinogen, Fibronectin und von-Willebrand-Faktor wurden auf dem als Glykoprotein IIb/IIIa bekannten Thrombozytenmembranproteinkomplex lokalisiert.
  • Adhäsive Glykoproteine wie Fibrinogen binden sich nicht an normale, ruhende Thrombozyten. Ist jedoch ein Thrombozyt durch einen Agonisten wie Thrombin oder Adenosindiphosphat aktiviert, so ändert der Thrombozyt seine Form, wodurch möglicherweise die GPIIb/IIIa-Bindungsstelle dem Fibrinogen zugänglich gemacht wird. Die unter den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung fallende Verbindung blockiert den Fibrinogenrezeptor und weist somit die obenerwähnte antithrombotische Wirkung auf.
  • 2. Stand der Technik
  • Es wurde beobachtet, daß das Vorhandensein von Arg-Gly-Asp (RGD) in Fibrinogen, Fibronectin und von-Willebrand-Faktor für ihre Wechselwirkung mit dem Zelloberflächenrezeptor erforderlich ist (Ruoslahti E. Pierschbacher, Cell 1986, 44, 517–18). Zwei andere Aminosäuresequenzen scheinen ebenfalls an der Thrombo zytenanbindungsfunktion von Fibrinogen beteiligt zu sein, nämlich die Gly-Pro-Arg-Sequenz und die His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val-Dodecapeptidsequenz. Es wurde gezeigt, daß kleine synthetische Peptide, die RGD oder das Dodecapeptid enthalten, sich an den GPIIb/IIIa-Rezeptor der Thrombozyten binden und kompetitiv die Bindung von Fibrinogen, Fibronectin und von-Willebrand-Faktor inhibieren sowie auch die Aggregation von aktivierten Thrombozyten inhibieren (Plow, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1985, 82, 8057–61; Ruggeri, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986, 5708–12; Ginsberg, et al., J. Biol. Chem. 1985, 260, 3931–36; und Gartner, et al., J. Biol. Chem. 1987, 260, 11, 891–94).
  • Von Guanidinoalkanoyl- und Guanidinoalkenoyl-aspartyl-Einheiten enthaltenden Indolylverbindungen wird von Tjoeng, et al., US-Patente Nr. 5,037,808 und 4,879,313 , beschrieben, daß es sich bei ihnen um Inhibitoren der Aggregation von Thrombozyten handelt.
  • In dem am 12. Februar 1991 herausgegebenen US-Patent Nr. 4,992,463 (Tjoeng, et al.) wird allgemein offenbart, daß eine Reihe von aryl- und aralkylguanidinoalkylpeptidmimetischen Verbindungen eine die Thrombozytenaggregation inhibierende Wirkung zeigt, und speziell wird eine Reihe von mono- und dimethoxyphenylpeptidmimetischen Verbindungen und eine biphenylalkylpeptidmimetische Verbindung offenbart.
  • In dem am 15. August 1989 herausgegebenen US-Patent Nr. 4,857,508 (Adams, et al.) wird allgemein offenbart, daß eine Reihe von Guanidinoalkylpeptidderivaten mit terminalen Aralkylsubstituenten eine die Thrombozytenaggregation hemmende Wirkung zeigt, und speziell wird eine Reihe von O-Methyltyrosin-, Biphenyl- und Naphthylderivaten mit einer terminalen Amidfunktionalität offenbart.
  • Haverstick, D. M. et al. offenbaren in Blood 66 (4), 946–952 (1985), daß eine Reihe synthetischer Peptide einschließlich arg-gly-asp-ser und gly-arg-gly-asp-ser dazu fähig sind, die durch Thrombin induzierte Thrombozytenaggregation zu hemmen.
  • Plow, E. F. et al. offenbaren in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 3711–3715 (1982), daß das Tetrapeptid Glycyl-L-prolyl-L-arginyl-L-prolin die Bindung von Fibrinogen an humane Thrombozyten inhibiert.
  • In der am 15. Dezember 1986 eingereichten französischen Anmeldung Nr. 86/17507 wird offenbart, daß die -arg-gly-asp-Sequenz enthaltende Tetra-, Penta- und Hexapeptidderivate sich als antithrombotische Mittel eignen.
  • In dem am 28. Juli 1987 herausgegebenen US-Patent Nr. 4,683,291 (Zimmerman, et al.) wird offenbart, daß es sich bei einer Reihe von Peptiden mit sechs bis vierzig Aminosäuren, die die Sequenz -arg-gly-asp- enthalten, um Inhibitoren der Thrombozytenbindung handelt.
  • In der am 7. Juni 1989 veröffentlichten europäischen Anmeldung mit der Publikationsnummer 0 319 506 wird offenbart, daß es sich bei einer Reihe von Tetra-, Penta- und Hexapeptidderivaten mit der -arg-gly-asp-Sequenz um Inhibitoren der Thrombozytenaggregation handelt.
  • Im US-Patent Nr. 5,023,233 wird berichtet, daß es sich bei cyclischen Peptidanaloga, die die Einheit Gly-Asp enthalten, um Fibrinogenrezeptorantagonisten handelt.
  • Peptide und Pseudopeptide mit Amino-, Guanidino-, Imidizaloyl- und/oder Amidinoalkanoyl- und Alkenoyleinheiten werden als antithrombotische Mittel in den anhängigen US-Anmeldungen mit den Serien Nr. 07/677.006, 07/534.385 und 07/460.777, eingereicht am 28. März 1991, am 7. Juni 1990 beziehungsweise am 4. Januar 1990, sowie in US-Patent Nr. 4,952,562 und in der am 25. September 1990 eingereichten internationalen Anmeldung Nr. PCT/US90/05448, die alle von der gleichen Anmelderin wie die vorliegende Erfindung stammen, beschrieben.
  • Peptide und Pseudopeptide mit Amino- und Guanidinoalkyl- und -alkenyl-benzoyl-, Phenylalkanoyl- und Phenylalkenoyleinheiten werden als antithrombotische Mittel in der anhängigen US-Anmeldung mit der Serien Nr. 07/475.043, eingereicht am 5. Februar 1990, und in der Internationalen Anmeldung Nr. PCT/US91/02471, eingereicht am 11. April 1991, veröffentlicht unter der internationalen Publikationsnr. WO 92/13117 , 29. Oktober 1992, die von derselben Anmelderin wie die vorliegende Erfindung stammt, beschrieben.
  • Alkanoyl- und substituierte Alkanoylazacycloalkylformylaspartamsäurederivate werden in dem am 1. Dezember 1989 eingereichten US-Patent Nr. 5,053,392 , das von der gleichen Anmelderin und den gleichen Erfindern wie die vorliegende Erfindung stammt, als Inhibitoren der Thrombozytenaggregation beschrieben.
  • N-substituierte cyclische Azacycloalkylcarbonylaminoacylaspartamsäurederivate werden in dem am 5. April 1990 eingereichten US-Patent Nr. 5,064,814 von den gleichen Erfindern und der gleichen Anmelderin wie die vorliegende Erfindung als Antithrombotika beschrieben. Azacycloalkylformylglycylaspartamsäurederivate werden im am 10. Oktober 1989 eingereichten US-Patent Nr. 5,051,405 , das von der gleichen Anmelderin wie die vorliegende Erfindung stammt, als Antithrombotika beschrieben.
  • In der europäischen Patentanmeldung 0 479 481 , veröffentlicht am 8. April 1992, werden Azacycloalkylalkanoylglycylaspartylaminosäuren als Fibrinogenrezeptorantagonisten beschrieben.
  • In der am 1. April 1992 veröffentlichten europäischen Patentanmeldung 0 478 362 werden Azacycloalkylalkanoylpeptidyl-β-alanine als Fibronogenrezeptorantagonisten beschrieben.
  • In der PCT-Patentanmeldung mit der Publikationsnr. WO95/10295 werden Azacycloalkylalkanoylpeptide und -pseudopeptide der Formel II
    Figure 00060001
    und insbesondere N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid beschrieben, welche die Thrombozytenaggregation und Thrombusbildung in Säugetieren hemmen und sich für die Prävention und Behandlung von Thrombose eignen. Das gemäß der PCT-Patentanmeldung mit der Publikationsnr. WO95/10295 hergestellte N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid ist amorph, hygroskopisch und physikalisch instabil, da es Feuchtigkeit absorbiert. Eine nichthygroskopische, stabile kristalline Form von N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid wird in der PCT-Patentanmeldung mit der Publikationsnr. WO95/10295 nicht offenbart.
  • In der PCT-Patentanmeldung mit der Publikationsnr. WO95/10295 wird außerdem offenbart, daß die Azacycloalkylalkanoylpeptide und -pseudopeptide im allgemeinen nach Standardvorschriften der Festphasenpeptidsynthese oder Lösungsphasenpeptid synthese unter Einsatz von Ausgangsmaterialien und/oder leicht erhältlichen Zwischenprodukten von chemischen Lieferfirmen wie Aldrich oder Sigma hergestellt werden (H. Paulsen, G. Merz, V. Weichart. „Solid-Phase Synthesis of O-Glycopeptide Sequences", Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 27 (1988); H. Mergler, R. Tanner, J. Gosteli und P. Grogg, „Peptide Synthesis by a Combination of Solid-Phase and Solution Methods I: A New Very Acid-Labile Anchor Group for the Solid-Phase Synthesis of Fully Protected Fragments, Tetrahedron letters 29, 4005 (1988); Merrifield, R. B., "Solid Phase Peptide Synthesis after 25 Years: The Design and Synthesis of Antagonists of Glucagon", Makromol. Chem. Macromol. Symp. 19, 31 (1988)). Weiterhin wird in der PCT-Patentanmeldung mit der Publikationsnr. WO95/10295 offenbart, daß die amorphe und hygroskopische Form von N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]–(L)-β-cyclohexylalaninamid durch eine sequentielle Synthese von der C-terminalen Aminosäure wie in Schema 1 gezeigt hergestellt wird.
  • Schema 1
    Figure 00070001
  • In der PCT-Patentanmeldung mit der Publikationsnr. WO95/10295 wird nicht die Bildung von Tetraazacycloalkylalkanoylpeptiden und -pseudopeptiden bzw. insbesondere N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid aus einem zentralen Di(pseudopeptid bzw. -peptid) offenbart, bei der die N- und C-terminalen Enden des zentralen Di(pseudopeptids bzw. -peptids) beide unter Bildung der Tetraazacycloalkylalkanoylpeptide bzw. -pseudopeptide mit Pseudoaminosäuren und/oder Aminosäuren gekuppelt werden.
  • KURZE DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine nichthygroskopische, stabile kristalline Form von N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid der Formel I. Die Verbindung hat antithrombotische Wirkung,
    Figure 00080001
    einschließlich der Inhibierung der Thrombozytenaggregation und der Thrombusbildung in Säugetieren, und eignet sich zur Prävention und Behandlung von Thrombose, die mit Krankheitszuständen wie Herzinfarkt, Schlaganfall, peripherer arterieller Verschlußkrankheit und disseminierter intravasaler Koagulation assoziiert ist. Die Erfindung betrifft außerdem eine pharmazeutische Zusammensetzung der nichthygroskopischen, stabilen kristallinen Form von N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1 stellt ein Röntgenpulverdiffraktogramm einer Probe der in Beispiel 13, Verfahren A, hergestellten nichthygroskopischen kristallinen Form von N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid dar.
  • 2 stellt ein Röntgenpulverdiffraktogramm einer Probe der in Beispiel 13, Verfahren B(a), hergestellten nichthygroskopischen kristallinen Form von N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid dar.
  • 3 stellt ein Röntgenpulverdiffraktogramm einer Probe der in Beispiel 13, Verfahren B(b), hergestellten nichthygroskopischen kristallinen Form von N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid dar.
  • 4 stellt ein Röntgenpulverdiffraktogramm einer Probe der in Beispiel 14 hergestellten hygroskopischen kristallinen Form von N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid dar.
  • 5 stellt ein Röntgenpulverdiffraktogramm einer Probe der in Beispiel 14 hergestellten nichthygroskopischen kristallinen Form von N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid dar.
  • 6 stellt einen isothermalen mikrokalorimetrischen Graphen der Leistungsabgabe als Funktion der Zeit für drei verschiedene Experimente, die wie in Beispiel 15 beschrieben durchgeführt werden, dar. Bei den Experimenten wird die thermale Aktivität verschiedener kristalliner Formen von N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid aufgezeichnet, wenn diese verschiedenen Lösungsmitteldämpfen ausgesetzt werden. Die (A)-Spur in 6 zeigt, daß ein stark exothermes Ereignis stattfindet, wenn man gemäß Beispiel 5 oder 11 hergestelltes hygroskopisches N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid bei 40°C 30 Stunden lang einer relativen Feuchte von 80% (gesättigte KCl-Lösung) aussetzt, wobei während dieses Aussetzens die hygroskopische Form der Verbindung in die nichthygroskopische Form der Verbindung umgewandelt wird. Die (B)-Spur in 6 zeigt, daß kein exothermes Umwandlungsereignis stattfindet, wenn man gemäß Beispiel 5 oder 11 hergestelltes hygroskopisches N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid bei 40°C Methanoldämpfen (einem Lösungsmittel, in dem die Verbindung löslich ist, bei dem es sich jedoch nicht um Wasser handelt) aussetzt, und daß somit Methanol die Mobilität in den Kristallen dieser Form für die Umwandlung in die nichthygroskopische Form nicht unterstützt. Die (C)-Spur in 6 zeigt, daß kein exotherms Umwandlungsereignis stattfindet, wenn man gemäß Beispiel 13 hergestelltes nichthygroskopisches N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid bei 40°C einer relativen Feuchte von 80% aussetzt, und daß die nichthygroskopische Form der Verbindung somit unter diesen Bedingungen keine Formumwandlung durchläuft, d. h. daß es sich um eine stabile Form handelt.
  • 7 stellt einen isothermalen mikrokalorimetrischen Graphen der Leistungsabgabe als Funktion der Zeit für drei verschiedene, wie in Experiment 15 durchgeführte Experimente dar. Bei den Experimenten wird die thermale Aktivität der Umwandlung der hygroskopischen kristallinen Form von N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid in ihre nichthygroskopische Form aufgezeichnet, wenn diese bei 40°C, 50°C bzw. 60°C einer relativen Feuchte von 80% ausgesetzt wird. Aus der Figur geht hervor, daß die Umwandlung bei 40°C etwa 24 Stunden, bei 50°C etwa 6,5 Stunden und bei 60°C etwa 3 Stunden dauert.
  • 8 stellt einen isothermalen mikrokalorimetrischen Graphen der Leistungsabgabe als Funktion der Zeit für vier verschiedene, wie in Experiment 15 durchgeführte Experimente dar. Bei den Experimenten wird die thermale Aktivität der Umwandlung der hygroskopischen kristallinen Form von N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid in ihre nichthygroskopische Form aufgezeichnet, wenn diese bei 60°C einer relativen Feuchte von 65%, 75%, 80% bzw. 100% ausgesetzt wird. Ein springender Punkt von 8 ist die Feststellung, daß höhere relative Feuchten zu einer schnelleren Umwandlung führen. Ein weiterer springender Punkt ist die Feststellung, daß die Umwandlung in die nichthygroskopische Form der Verbindung bei 60°C bei einer relativen Feuchte von 100% ohne die Verflüssigung stattfindet, die bei der hygroskopischen Form bei Raumtemperatur auftritt. Auf Grundlage dieser Ergebnisse steht zu erwarten, daß die Umwandlungsgeschwindigkeit in die nichthygroskopische Form sehr viel schneller ist als die Verflüssigungsgeschwindigkeit der hygroskopischen Form bei 60°C.
  • 9 stellt einen Vergleich der Auftragungen der prozentualen Gewichtszunahme gegen die prozentuale relative Feuchte für die hygroskopischen
    Figure 00110001
    und nichthygroskopischen
    Figure 00110002
    Formen von N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]- (L)-β-cyclohexylalaninamid bei 25°C dar, die wie in Experiment 16 beschrieben durchgeführt werden. Aus 9 geht hervor, daß die hygroskopische Form mit zunehmender relativer Feuchte mehr Wasser aufnimmt als die nichthygroskopische Form, und daß dies bei relativen Feuchten von mehr als 60% ausgeprägter ist. Weiterhin geht aus 9 hervor, daß die hygroskopische Form der Verbindung nicht auf ihr ursprüngliches prozentuales Gewicht desorbiert, während die nichthygroskopische Form der Verbindung auf ihr ursprüngliches prozentuales Gewicht desorbiert.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Wie oben und in der gesamten Beschreibung der vorliegenden Erfindung verwendet, sind die folgenden Ausdrücke, wenn nicht anders angegeben, so zu verstehen, daß sie die folgenden Bedeutungen haben:
    Die hier verwendeten Abkürzungen schließen die folgenden ein:
    BOC (t-Butyloxycarbonyl, CBZ (Benzyloxycarbonyl), Gly (Glycin), Asp (Asparaginsäure), Obzl (Benzyloxy), TFA (Trifluoressigsäure), Cha (β-Cyclohexylalanin), EtOAc (Essigsäureethylester), DMF (Dimethylformamid), DCC (Dicyclohexylcarbodiimid), HOBT (Hydroxybenzotriazol), TBTU (2-1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluorborat), DI (vollentsalztes Wasser), PNP (p-Nitrophenol), PFP (Pentafluorphenol), DCU (Dicyclohexylharnstoff), NMM (N-Methylmorpholin), MTBE (Methyl-t-butylether), RF (relative Feuchte), THF (Tetrahydrofuran), PipBu(4-piperidinbuttersäure) und PipBuen((4-Piperidin)butylidenylcarbonsäure) ist eine Verbindung der Formel
    Figure 00120001
  • „Pharmazeutisch unbedenkliches Salz" bedeutet eine Salzform der Stammverbindung der Formel I, die bei der Verwendung in therapeutischen Dosierungen für einen Patienten relativ unschädlich ist, so daß die nutzbringenden pharmazeutischen Eigenschaften der Stammverbindung der Formel I nicht durch einem Gegenion dieser Salzform zuschreibbare Nebenwirkungen hinfällig gemacht werden. Pharmazeutisch unbedenkliches Salz schließt auch Zwitterionen und innere Salze der Verbindungen der Formel I ein.
  • „Hygroskopizität" bedeutet Sorption, was eine aufgenommene Menge an Wasser bzw. einen Wasserzustand impliziert, die bzw. der ausreicht, um die physikalischen oder chemischen Eigenschaften der Substanz zu beeinflussen (Hrsg. J. Swarbrick und J. C. Boylan, Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, Band 10, S. 33).
  • Bevorzugte Ausführungsformen
  • Eine erfindungsgemäße Ausführungsform ist die Bildung einer stabilen, nichthygroskopischen kristallinen Form von N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid. Erfindungsgemäß kann diese Form der Verbindung als stabile Formulierung der Verbindung entwickelt werden. Die stabile, nichthygroskopische kristalline Form von N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid hat außerdem einen hohen Schmelzpunkt und neigt nicht dazu, Wasser zu absorbieren. Die stabile Form zeigt darüber hinaus eine einzigartige und unerwartete Stabilität gegen Feuchtigkeiten und Temperaturen, die die normalerweise bei der Versendung, der Herstellung der Dosierungsform oder einer längeren Verschiffung oder Aufbewahrung angetroffenen weit übersteigen. Durch diese Eigenschaften wird außerdem die Herstellung von Dosierungsformen erleichtert. Die Umwandlung in die stabile Form führt darüber hinaus nicht zu einem Verlust an Material oder dessen Reinheit, und hat keine negativen Auswirkungen auf dessen Partikeleigenschaften.
  • Ist eine Verbindung der vorliegenden Erfindung mit einer basischen Einheit substituiert, so wird ein Säureadditionssalz gebildet, bei dem es sich einfach um eine zweckmäßigere Anwendungsform handelt; und in der Praxis ist die Verwendung der Salzform schon an sich die Verwendung der freien Basenform. Bei der zur Herstellung des Säureadditionssalzes verwendeten Säure handelt es sich vorzugsweise um eine Säure, die bei der Kombination mit der freien Base ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz liefert, d. h. ein Salz, dessen Anion bei den pharmazeutischen Dosierungen des Salzes für den Patienten nicht toxisch ist, so daß die nutzbringenden hemmenden Wirkungen auf die Thrombozytenaggregation und die Thrombusbildung, die der freien Base eigen sind, nicht durch dem Anion zuschreibbare Nebenwirkungen hinfällig gemacht werden. Pharmazeutisch unbedenkliche Salze der erwähnten basischen Verbindungen sind bevorzugt; es eignen sich jedoch alle Säureadditionssalze als Quellen für die freie Basenform, auch wenn das jeweilige Salz an sich nur als ein Zwischenprodukt erwünscht ist, zum Beispiel, wenn das Salz lediglich zum Zweck der Aufreinigung und Identifizierung gebildet wird, oder wenn es als Zwischenprodukt bei der Herstellung eines pharmazeutisch unbedenklichen Salzes durch Ionenaustauschvorschriften verwendet wird. Pharmazeutisch unbedenkliche Salze, die in den Schutzbereich der Erfindung fallen, sind die, die sich von den folgenden Säuren ableiten: Mineralsäuren wie Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure und Sulfaminsäure; und organische Säuren wie Essigsäure, Citronensäure, Milchsäure, Weinsäure, Malonsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Cyclohexylsulfaminsäure, Chinasäure und dergleichen. Die entsprechenden Säureadditionssalze schließen die folgenden ein: Hydrohalogenide, z. B. Hydrochlorid und Hydrobromid, Sulfat, Phosphat, Nitrat, Sulfamat, Acetat, Citrat, Lactat, Tartarat, Malonat, Oxalat, Salicylat, Propionat, Succinat, Fumarat, Maleat, Methylen-bis-β-hydroxynaphthoate, Gentisate, Mesylate, Isethionate und Di-p-toluoyltartratemethansulfonat, Ethansulfonat, Benzolsulfonat, p-Toluolsulfonat, Cyclohexylsulfamat bzw. Chinat.
  • Gemäß einem weiteren Merkmal der Erfindung werden Säureadditionssalze der Verbindungen der vorliegenden Erfindung durch Umsetzung der freien Base mit der entsprechenden Säure unter Anwendung oder Anpassung bekannter Methoden hergestellt. Die Säureadditionssalze der Verbindungen der vorliegenden Erfindung werden zum Beispiel hergestellt, indem man entweder die freie Base in wäßriger oder wäßrig-alkoholischer Lösung oder in anderen geeigneten Lösungsmitteln, die die entsprechende Säure enthalten, löst und das Salz durch Eindampfen der Lösung isoliert, oder die freie Base und die Säure in einem organischen Lösungsmittel umsetzt, wobei in diesem Fall das Salz direkt ausfällt oder durch Einengen der Lösung erhalten werden kann.
  • Die Säureadditionssalze der Verbindungen der vorliegenden Erfindung lassen sich durch die Anwendung oder Anpassung bekannter Methoden aus den Salzen zurückgewinnen. So kann man zum Beispiel die Stammverbindungen der Erfindung durch Behandlung mit Alkali, zum Beispiel wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung oder wäßriger Ammoniaklösung, aus ihren Säureadditionssalzen zurückgewinnen.
  • Ist die Verbindung der vorliegenden Erfindung mit einer sauren Einheit substituiert, so können Basenadditionssalze gebildet werden, bei denen es sich einfach um eine zweckmäßigere Anwendungsform handelt; und in der Praxis ist die Verwendung der Salzform schon an sich die Verwendung der freien Säureform. Bei den zur Herstellung der Basenadditionssalze verwendeten Basen handelt es sich vorzugsweise um solche Basen, die bei der Kombination mit der freien Säure pharmazeutisch unbedenkliche Salze liefern, das heißt Salze, deren Kationen in den pharmazeutischen Dosierungen der Salze nicht toxisch für den tierischen Organismus sind, so daß die nutzbringenden hemmenden Wirkungen auf die Thrombozytenaggregation und die Thrombusbildung, die der freien Säure eigen sind, nicht durch den Kationen zuschreibbare Nebenwirkungen hinfällig gemacht werden. Pharmazeutisch unbedenkliche Salze, die zum Beispiel Alkali- und Erdalkalisalze einschließen, die in den Schutzbereich der Erfindung fallen, sind die, die sich von den folgenden Basen ableiten: Natriumhydrid, Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Calciumhydroxid, Aluminiumhydroxid, Lithiumhydroxid, Magnesiumhydroxid, Zinkhydroxid, Ammoniak, Ethylendiamin, N-Methylglucamin, Lysin, Arginin, Ornithin, Cholin, N,N'-Dibenzylethylendiamin, Chlorprocain, Diethanolamin, Procain, N-Benzylphenethylamin, Diethylamin, Piperazin, Tris(hydroxymethyl)aminomethan, Tetramethylammoniumhydroxid und dergleichen.
  • Metallsalze der Verbindungen der vorliegenden Erfindung lassen sich erhalten, indem man ein Hydrid, ein Hydroxid, ein Carbonat oder eine ähnliche reaktive Verbindung des gewählten Metalls in einem wäßrigen oder organischen Lösungsmittel mit der freien Säureform der Verbindung in Kontakt bringt. Bei dem verwendeten wäßrigen Lösungsmittel kann es sich um Wasser oder um eine Mischung von Wasser mit einem organischen Lösungsmittel, vorzugsweise einem Alkohol wie Methanol oder Ethanol, einem Keton wie Aceton, einem aliphatischen Ether wie Tetrahydrofuran oder einem Ester wie Essigsäureethylester, handeln. Diese Umsetzungen werden normalerweise bei Raumtemperatur durchgeführt, sie können jedoch auch, falls gewünscht, unter Erhitzen durchgeführt werden.
  • Aminsalze der Verbindungen der vorliegenden Erfindung lassen sich erhalten, indem man ein Amin in einem wäßrigen oder organischen Lösungsmittel mit der freien Säureform der Verbindung in Kontakt bringt. Geeignete wäßrige Lösungsmittel schließen Wasser und Mischungen von Wasser mit Alkoholen wie Methanol oder Ethanol, Ethern wie Tetrahydrofuran, Nitrilen wie Acetonitril oder Ketonen wie Aceton ein. Aminosäuresalze können auf ähnliche Weise hergestellt werden.
  • Die Basenadditionssalze der Verbindungen der vorliegenden Erfindung lassen sich durch Anwendung oder Anpassung bekannter Methoden aus den Salzen zurückgewinnen. So kann man zum Beispiel die Stammverbindungen der Erfindung durch Behandeln mit einer Säure, zum Beispiel Salzsäure, aus ihren Basenadditionssalzen zurückgewinnen.
  • Die Salze der Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind nicht nur für sich als Wirkstoffe von Nutzen, sie eignen sich auch für die Zwecke der Aufreinigung der Verbindungen, zum Beispiel, indem man Löslichkeitsunterschiede zwischen den Salzen und den Stammverbindungen, Nebenprodukten und/oder Ausgangsmaterialien unter Anwendung von dem Fachmann gut bekannten Verfahren ausnutzt.
  • Ein neues erfindungsgemäßes Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel II und insbesondere einer kristallinen Verbindung der Formel I gemäß der vorliegenden Erfindung wird durch die in Schema II gezeigte Synthese beschrieben, Schema II
    Figure 00180001
    wobei B, E1, E2, G, R, m, n und p wie oben definiert sind und P1 für eine hydrierungslabile Säureschutzgruppe wie Benzyl steht, P2 für eine säurelabile Aminschutzgruppe wie t-Butoxycarbonyl (BOC) steht und P3 für eine hydrierungslabile Aminschutzgruppe wie Benzyloxycarbonyl (CBZ) steht.
  • Während der Herstellung der Verbindungen der Formel II oder von Zwischenprodukten davon kann es außerdem wünschenswert oder erforderlich sein, eine Kreuzreaktion zwischen chemisch aktiven Substituenten an den an natürlich vorkommenden Aminosäuren oder Pseudoaminosäuren vorhandenen zu verhindern. Die Substituenten können durch Standard-Schutzgruppen geschützt werden, die anschließend je nach Erfordernis erhalten bleiben oder entfernt werden, unter Anwendung von bekannten Verfahren, wodurch man die gewünschten Produkte bzw. Zwischenprodukte erhält (siehe zum Beispiel Green, „Protective Groups in Organic Synthesis", Wiley, New York, 1981). Ein selektives Schützen bzw. Entschützen kann auch für die Umwandlung oder das Entfernen vorhandener Substituenten oder für eine anschließende Umsetzung unter Bildung des gewünschten Endprodukts erforderlich oder wünschenswert sein.
  • Das Verfahren in Schema II wird durch die Herstellung der Verbindung der Formel II beispielhaft erläutert.
  • Ein anderes erfindungsgemäßes Verfahren ist die Bildung von stabilem, nichthygroskopischem kristallinem N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid, das sich reproduzierbar durch eine neue Festphasenumwandlung aus hygroskopischem kristallinem N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid, hergestellt nach dem in Schema II beschriebenen Verfahren und den angeführten alternativen Reaktionsschritten, erhalten läßt.
  • Die hygroskopische kristalline Form von N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid ist physikalisch instabil und wird, wenn man sie Feuchtigkeit und Temperatur aussetzt, in die hochstabile, nichthygroskopische kristalline Form N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid umgewandelt.
  • Die erfindungsgemäßen allgemeinen Bedingungen für die Umwandlung der hygroskopischen kristallinen Form von N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid in die hochstabile, nichthygroskopische kristalline Form N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid wurden unter statischen und dynamischen Bedingungen durchgeführt.
  • Die statische erfindungsgemäße Vorschrift ist als eine statische Umwandlung beschrieben, da hierbei die hygroskopische kristalline Form von N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid in einem nicht bewegten Gefäß wie in Ampullen oder Schalen in einer klimatisierten Kammer bestimmten Temperatur- und Feuchtigkeitsbedingung ausgesetzt wird. Diese „statische" Umwandlung wird bei Temperaturen und relativen Feuchten im Bereich von etwa 20°C bis etwa 80°C, besonders bevorzugt etwa 40°C bis etwa 80°C, und etwa 40% bis etwa 100% RF, vorzugsweise etwa 65 bis etwa 80% RF, durchgeführt.
  • Die dynamische erfindungsgemäße Vorschrift ist als eine dynamische Umwandlung beschrieben, da hierbei die hygroskopische kristalline Form von N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid unter Inkubation bei den gleichen Feuchtigkeits- und Temperaturbedingungen wie in dem statischen Modell ausgesetzt wird, wobei jedoch gerührt wird, was das Drehen der hygroskopischen kristallinen Form von N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid in einem Rotationsverdampferkolben oder in einem zylindrischen Gefäß (in einem Feuchtigkeitsofen) unter Rühren mit einem Propeller einschließt.
  • Wenn nicht anders angegeben, sind die angeführten Daten für die Massenspektralanalyse Fast Atom Bombardment mit geringer Auflösung, durchgeführt auf einem VG 70SE-Gerät, wobei die „berechneten" Werte (M+H)+ sind. Die Spektraldaten für die kernmagnetische Resonanz (NMR) werden auf einem Brucker ACF 300-Gerät in D2O erhalten. Die Flash-Chromatographie wird an Kieselgel durchgeführt. Die Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) erfolgt an C-18 Umkehrphasensäulen mit einer Partikelgröße im Bereich von 8–15 μ.
  • Wenn nicht anders angegeben, werden die angeführten Röntgenpulverdiffraktionsgraphen mit einem Siemens D5000-Diffraktometer mit einer Cu-Strahlenquelle (1,8 kW, 45 kV und 40 mA) zum Scannen der Pulverproben erhalten. Die Proben werden vor der Messung gemahlen, um einen Einfluß der Partikelgröße auf die Peakintensitäten zu eliminieren. Ungefähr 60 mg der Probe werden in einen 1,5 × 1 cm Probenhalter gegeben und im Bereich von 3–40° 2 Theta (2θ) mit einer Schrittgröße von 0,04° und einer Gesamtexposition von 1 Sekunde pro Schritt gescannt.
  • Beispiel 1 Darstellung von BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-OH (Schritt 1 von Schema II)
  • 51 g (0,25 mol) BOC-N(Et)Gly-OH, 35 g (0,25 mol) PNP, 400 ml EtOAc und 100 ml DMF werden in einen 1-l-Dreihalsrundkolben gegeben. Die Mischung wird bis zur Lösung gerührt und auf 4–6°C abgekühlt. Eine Lösung von 51,5 g (0,25 mol) DCC in 125 ml EtOAc wird im Verlauf von 10 Minuten zugetropft, wobei die Temperatur zwischen etwa 5°C bis etwa 8°C gehalten wird. Nachdem alles DCC zugetropft ist, wird das Kühlbad entfernt und die Mischung 1,5 Stunden lang rühren gelassen, wobei sie sich auf Raumtemperatur (20–22°C) erwärmt. Während dieser Zeitspanne bildet sich ein fester Niederschlag, DCH. Das Ende der Bildung des PNP-Esters wird durch analytische HPLC (Verschwinden von BOC-N(Et)Gly-OH) bestimmt. Die Reaktionsmischung wird filtriert, und der DCH-Rückstand wird mit 2–50 ml Portionen EtOAc gewaschen, und die Waschlösungen werden zum Filtrat gegeben. Der DCH wird verworfen.
  • Die gerührte, filtrierte Lösung wird mit einer Aufschlämmung von 67 g (0,3 mol) H2N-(L)-Asp(OBzl)-OH in 150 ml (138 g, 1,36 mol) NMM versetzt. Die Mischung wird auf 38–40°C erhitzt und 41 Stunden lang bei dieser Temperatur gehalten, wobei zu diesem Zeitpunkt eine analytische HPLC darauf hindeutet, daß alles BOC-N(Et)Gly-OPNP verbraucht ist. Die Reaktionsmischung wird auf 25°C abgekühlt, und nicht umgesetztes H2N-(L)-Asp(OBzl)-OH wird abfiltriert. Die Lösung wird gekühlt und nochmals filtriert, wodurch man weitere 1,2 g erhält (21,7 g zurückgewonnen; 11,2 g sind der zugesetzte 20%ige Überschuß, und 10,5 g (0,047 mol) sind nicht umgesetztes Material).
  • Die filtrierte Lösung wird in einem 2-l-Squibb-Trichter mit einer Portion von 500 ml voll entsalztem Wasser, gefolgt von 2-250-ml-Portionen, extrahiert. Die vereinigte wäßrige Lösung wird mit 3-300-ml-Portionen von 1:1 MTBE/EtOAc extrahiert, um verbliebenes PNP zu entfernen (die analytische HPLC zeigt, daß nur noch eine Spur verblieben ist), dann auf 5°C abgekühlt und durch die tropfenweise Zugabe von 150 ml konzentrierter HCl von einem pH-Wert von 8,9 auf einen pH-Wert von 1,79 angesäuert. Die angesäuerte wäßrige Lösung wird mit 2-200-ml-Portionen EtOAc extrahiert. Eine HPLC-Analyse der wäßrigen Phase zeigt, daß kein gewünschtes Produkt verblieben ist. Die EtOAc-Extrakte werden vereinigt, über MgSO4 getrocknet, filtriert und an einem Rotationsverdampfer bei 35°C eingeengt. Das auf diese Weise erhaltene hellorangefarbene Öl wird zum maximalen Entfernen des verbliebenen Lösungsmittels bei 35°C gepumpt, wodurch man 85,68 g BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-OH als ein Öl erhält (21,3 mmol, 85,5% Ausbeute, nicht auf Lösungsmittelrückstände korrigiert).
  • Charakterisierung:
    • NMR (250 MHz): 7,3 ppm (s), 5,1 ppm (s), 3,3 ppm (dq), 3,0 (dq), 1,4 ppm (s), 1,1 (t)
    • MS: M = 408; M+1obsvd = 409
    • HPLC: 90,79 Fl.-% (3,87 Fl.-% p-Nitrophenol, nicht für e korrigiert)
    • Elementaranalyse: C20H28N2O7:H, N; Cgef 57,54, Cber. 58,81
  • Beispiel 2 Darstellung von BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2 (Schritt 2 von Schema II)
  • Verfahren A: Chlorameisensäureisopropylesterverfahren
  • Ein Äquivalent BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-OH wird in EtOAc (6–8 Volumina; 1:6,5 w/v) gelöst und bei einer Temperatur zwischen –15–0°C gehalten. NMM (1 Äquivalent) wird zugesetzt, wobei die Temperatur auf zwischen etwa –15°C und etwa 0°C gehalten wird. Die Lösung des geschützten Dipeptids wird bei einer Temperatur zwischen –15–0°C mit Chlorameisensäureisopropylester (1–1,1 äquivalente) versetzt. Der Ansatz wird zwei bis fünf Minuten lang bei einer Temperatur zwischen etwa –15°C und etwa 0°C gehalten. Die gekühlte Dipeptidlösung wird mit einer Lösung von H2N-(L)-Cha-NH2 (1 Äquivalent) in THF (10 Volumina; 1:10 w/v) versetzt, wobei die Temperatur auf etwa –15°C bis etwa 0°C gehalten wird. Die Umsetzung wird durch nach 15 Minuten, 1 Stunde und 2 Stunden entnommene Verfahrenskontrollproben (HPLC) zum Bewerten der Vollständigkeit der Umsetzung kontrolliert. (Die Umsetzung ist beendet, wenn die Menge an beobachtetem Dipeptid weniger als 10% der Fläche bei der HPLC-Analyse ausmacht.)
  • Das BOC-Tripeptid-Produkt fällt direkt aus der Reaktionslösung aus und wird von der Reaktionsmischung abfiltriert, mit EtOAc (2 ×, 1 Volumen; w/v) gewaschen und im Vakuum getrocknet. Typische Ausbeuten sind > 60%, mit einer Reinheit von > 90 Fl.-%; < 1 Fl.-% des epimeren Aspartamsäurediastereomers werden typischerweise beobachtet.
  • Durch eine erneute Aufschlämmung in EtOAc erhält man Endausbeuten von ungefähr 60% an BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2, wobei die Reinheit auf > 95 Fl.-% verbessert wird, während der Anteil an Diastereomer auf < 0,5% reduziert wird.
  • Als spezifisches Beispiel für das Chlorameisensäureisopropylesterverfahren erhält man, wenn man sich an die allgemeine Vorschrift von Beispiel a hält und 4,55 g (8,1 mmol) BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-OH einsetzt, 3,26 g an BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2 (97,9 Fl.-% rein, 0,3 Fl.-% Diastereomer), eine theoretische Ausbeute von 70%.
  • Verfahren B: Pentafluorphenol-DCC-Komplex-Verfahren
  • Pentafluorphenol (PEP, 2,9 Äquivalente) und DCC (1 Äquivalent) werden bei Raumtemperatur in EtOAc (5 Volumina; 1:5 w/v) gelöst und auf eine Temperatur zwischen –15–0°C abgekühlt. Ein Äquivalent BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-OH wird in EtOAc (6 Volumina; 1:6 w/v) gelöst und mit einem zuvor in DMF (10 Volumina; 1:10 w/v) gelöstem H2N-(L)-Cha-NH2 gemischt. Die Dipeptid/H2N-(L)-Cha-NH2-Lösung wird tropfenweise zu der Lösung von PEP und DCC gegeben, wobei die Temperatur zwischen –15–0°C erhalten wird. Der Ansatz wird fünf bis sechzehn Stunden lang bei einer Temperatur zwischen 15–22°C gehalten, wobei zur Bewertung der Vollständigkeit der Umsetzung nach 1, 2, 3, 4 und 16 Stunden Verfahrenskontrollproben (HPLC) entnommen werden. (Die Umsetzung ist beendet, wenn die Menge an beobachtetem Dipeptid weniger als 2% der Fläche bei der HPLC-Analyse ausmacht.)
  • Die Reaktionsmischung wird filtriert, und der Filterkuchen (DCH) wird mit EtOAc (2 × 0,5 Volumina; w/v) gewaschen. Das Filtrat wird mit Wasser (10 Volumina; 1:10 w/v) behandelt, die wäßrige Phase wird entfernt. Die EtOAc-Phase wird mit Wasser (1 ×, 5 Volumina; 1:5 w/v) gewaschen. Die EtOAc-Phase wird zum Ausfällen des Produktes abgekühlt, und das Produkt wird abfiltriert und mit EtOAc (2 × 0,4 Volumina; 1:0,4 w/v) gewaschen. Die isolierten molaren Ausbeuten betragen > 60%, mit typischen Reinheiten von > 90 Fl.-%, mit 1–4 Fl.-% des epimeren Aspartamsäurediastereomers.
  • Durch eine erneute Aufschlämmung in EtOAc erhält man Endausbeuten von ~60% BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2, wobei die Reinheit auf > 99 Fl.-% verbessert wird, während der Anteil an Diastereomer auf < 0,5% reduziert wird.
  • Als spezifisches Beispiel für das Pentafluorphenol-DCC-Komplex-Verfahren erhält man, wenn man sich an die allgemeine Vorschrift von Verfahren B hält und 10 g (24,5 mmol) BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-OH einsetzt, 8,15 g an BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2 (99 Fl.-% rein, 0,49 Fl.-% Diastereomer), eine theoretische Ausbeute von 59%.
  • Verfahren C: Hydroxybenzotriazol-(HOBT-)/2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluorborat-(TBTU-) Verfahren
  • Ein Äquivalent BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-OH wird in DMF (9–10 Volumina; 1:10 w/w) gelöst und bei Raumtemperatur gehalten. Diese Lösung wird mit H2N-(L)-Cha-NH2 (1 Äquivalent) und Hydroxybenzotriazol (HOBT, 1 Äquivalent) versetzt. Die auf diese Weise erhaltene Lösung wird auf etwa 0°C bis auf etwa 10°C abgekühlt und mit NMM (1–1,1 Äquivalente) versetzt. Das Kupplungsreaens TBTU (1–1,1 Äquivalente) wird in DMF (4–5 Volumina; 1:5 w/w) gelöst und bei einer Temperatur von 0°C bis etwa 10°C zu der Lösung des geschützten Dipeptids gegeben. Diese Lösung wird etwa 3 Stunden lang bei etwa 10°C bis etwa 25°C gerührt, bis die HPLC-Analyse zeigt, daß die Reaktion abgeschlossen ist (weniger als 2% Ausgangsmaterial gemäß Fläche). Die Reaktionsmischung wird zu einer gerührten Mischung von 5% wäßrigem Natriumchlorid (etwa 4 Volumina im Vergleich zum Reaktionsvolumen) und EtOAc (etwa 2 Volumina im Vergleich zum Reaktionsvolumen) gegeben. Die Phasen werden getrennt, und die wäßrige Phase wird mit einer weiteren Portion EtOAc (etwa 1,5 Volumina im Vergleich zum Reaktionsvolumen) extrahiert. Die organischen Phasen werden vereinigt und nacheinander mit 0,5 N wäßriger Zitronensäure (etwa 0,6–0,7 Volumina im Vergleich zum Volumen der organischen Phase), 10%iger wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung (zweimal, jeweils etwa 0,6–0,7 Volumina im Vergleich zum Volumen der organischen Phase) und 25%iger wäßriger Natriumchloridlösung (etwa 0,3–0,4 Volumina im Vergleich zum Volumen der organischen Phase) gewaschen. Die auf diese Weise erhaltene organische Phase wird im Vakuum bei etwa 30–50°C auf etwa 1/4 bis 1/2 des Volumens eingeengt, und diese warme Lösung wird mit dem gleichen Volumen an Heptan versetzt. Die Mischung wird unter Rühren auf etwa 0°C bis etwa 20°C abkühlen gelassen, um das gewünschte Tripeptid auszufällen. Dieser Feststoff wird abfiltriert, mit einer Mischung von EtOAc und Heptan gewaschen und getrocknet. Eine typische Ausbeute ist > 60%, mit typischen Reinheiten von > 95,7 Fl.-% und Konzentrationen des epimeren Aspartamsäurediastereomers von < 2 Fl.-%.
  • Als spezifisches Beispiel für das HOBT/TBTU-Verfahren erhält man, wenn man sich an die allgemeine Vorschrift hält und 10 g (24,5 mmol) BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-OH einsetzt, 9,3 g an BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2 (96,1 Fl.-% rein, 1,77 Fl.-% Diastereomer an Asp), eine theoretische Ausbeute von 67,7%.
    Massenspektrum: Mber. 560,7; M+1beob. 561
    Schmp. 182,17 (DSC)
    1H-NMR (δ bezogen auf TMS, D6 DMSO): 0,89 m (1H); 0,94, m (1H); 1,0, dt (2H); 1,15, m (2H); 1,06-1,3, m (4H); 1,36, d (9H); 1,4-1,74, m (6H); 2,65, m (1H); 2,85, m (1H); 3,18, m (2H); 3,75, d (2H); 4,2, s (1H); 4,66, d (1H); 5,08, s (2H); 7,02, s (1H), 7,18, d (1H); 7,36, s (5H); 7,88, dd (1H); 8,24, dd (1H).
  • Beispiel 3 Darstellung von TFA-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2 (Schritt 3 von Schema II)
  • BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2 wird in Dichlormethan (~1:12 w/w) gelöst, und diese Lösung wird bei Umgebungstemperatur mit TFA versetzt. Die Mischung wird dann gerührt, bis die HPLC eine vollständige Umsetzung zeigt (3–5 Stunden). Die Lösung wird bei 40–45°C auf etwa 1/2 ihres Volumens eingeengt. Diese warme Lösung wird mit MTBE (~1:10 w/w gegenüber BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2) versetzt, wobei die Temperatur auf > 40°C gehalten wird. Die Mischung wird langsam auf etwa 5°C abgekühlt und 1 Stunde lang gerührt, um sicherzustellen, daß die Kristallisation vollständig erfolgt. Die auf diese Weise erhaltenen Feststoffe werden abfiltriert und mit gekühltem MTBE gewaschen. Die Feststoffe werden im Vakuum getrocknet und auf ihren TFA·N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2-Gehalt analysiert (HPLC-w/w-Assay). Die Ausbeute ist im allgemeinen nahezu quantitativ, Reinheit > 95 Fl.-%.
    Massenspektrum: Mber. 460 (freie Base); M+1beob. 461
    Elementaranalyse: C26H37N4O7F3 H, N, F, C 54,35, fd, 53,82
    1H-NMR (δ bezogen auf TMS, D6 DMSO): 0,9 m (2H); 1,15, t (6H); 1,5, m (1H); 1,5-1,8, m (6H); 2,65, dd (1H); 2,9, m (3H); 3,7, s (2H); 3,9, m (2H); 4,2, m (1H); 4,75, m (1H); 5,1, s (2H); 7,0, s (1H); 7,15, s (1H); 7,2, s (5H); 8,13, d (1H); 8,7-8,8, m (3H).
    13C-NMR (hervorspringende Signale, δ bezogen auf TMS, D6 DMSO): 10,76, 25,49, 25,68, 25,96, 31,66, 33,07, 33,36, 36,25, 38,59, 41,88, 47,02, 49,40, 50,47, 65,71, 127,81-128,34, 135,82, 165,10, 169,34, 173,79
  • Spezifische Beispiele für die Entschützung sind in Tabelle A gezeigt. Tabelle A
    Labor-Beispiel Reaktionsmaßstab, Menge an (BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2) Ausbeute und Fl.-% Reinheit (TFA·N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2)
    Beispiel 1 7,5 g (13,3 mmol) 7,4 g (12,9 mmol) 97% Ausbeute; 98,8 Fl.-% rein
    Beispiel 2 6,53 g (11/6 mmol) 6,4 g (11,1 mmol) 96% Ausbeute; 98,47 Fl.-% rein
  • Beispiel 4 Darstellung von CBZ-PipBu-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2 (Schritt 4 von Schema II)
  • Eine Suspension von ~ equimolaren Mengen an TFA·N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2, CBZ-PipBu und TBTU in EtOAc, DMF und Wasser (100:8:4 v/v, ~11:1 insgesamt v/w gegenüber TFA-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2) wird zubereitet. Diese Suspension wird auf 0–10°C abgekühlt und mit etwa 3–4 Äquivalenten an NMM versetzt. Die Mischung wird auf Raumtemperatur erwärmen gelassen und gerührt, bis die HPLC zeigt, daß die Umsetzung abgeschlossen ist (1–3 Stunden; im Verlauf dieser Zeitspanne kommt es zur Bildung einer Lösung). Wasser wird zugesetzt (2–3 × die ursprüngliche Menge an zugesetztem Wasser), und die Phasen werden trennen gelassen. Die wäßrige Phase wird zurückgestellt, und die organische Phase wird mit zwei weiteren Portionen Wasser gewaschen. Diese vereinigten wäßrigen Waschlösungen werden mit EtOAc rückextrahiert, und die vereinigten organischen Phasen werden mit einer 25%igen wäßrigen Natriumchloridlösung gewaschen. Die organische Phase wird im Vakuum auf ~1/2 ihres Volumens eingeengt und mit MTBE (~1/2 v/v gegenüber dem Volumen der Lösung) versetzt. Diese Mischung wird kristallisieren gelassen (mehrere Stunden), und die Feststoffe werden abfiltriert, wobei mit einer gekühlten Mischung von EtOAc und MTBE gespült wird. Die Feststoffe werden im Vakuum getrocknet. Der Gehalt an CBZ-PipBu-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2 wird mit einem HPLC-w/w-Assay analysiert. Die Ausbeute beträgt im allgemeinen > 80%, die Reinheit > 95 Fl.-%.
  • Als spezifisches Beispiel für die obige Darstellung erhält man, wenn man sich an die allgemeine Vorschrift von Schritt 4 hält, aus 7,25 g TFA·N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2 7,9 g CBZ-PipBu-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2 (> 99 Fl.-% rein, 0,08 Fl.-% Diastereomer an Asp), eine theoretische Ausbeute von 84%.
    Elementaranalyse: C41H57N5O8: H, N, C 65,84, fd, 65,38
    Massenspektrum: Mber. 747; M+1beob. 748
    Schmp. 101,6 (DSC)
    1H-NMR (δ bezogen auf TMS, CDCl3): 0,88 m (1H); 0,98, m (1H); 1,13 (2H); 1,23, m (6H); 1,4, m (1H); 1,62-1,76, m (8H); 1,86, qd (1H); 2,35, t (1H); 2,74, dd (2H); 3,25, dd (1H); 3,47, q (2H); 3,7, d (1H); 3,84, d (1H); 4,15, ds (2H); 4,5, qd (1H); 4,68, dt (1H); 5,07, d (1H); 5,14 bd (2H); 5,16, d (1H); 7,28-7,39, m (10H); 7,57, dd (1H)
    13C-NMR (δ bezogen auf TMS, CDCl3): [hervorspringende Signale] 66,93 (beide Benzylkohlenstoffe), 127,78-128,64 (beide Phenylringe), 155,249, 170,00, 170,24, 171,69, 174,27, 175,21 (alle Carbonylkohlenstoffe)
  • Beispiel 5 Darstellung der hygroskopischen kristallinen Form von Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid (Schritt 5 von Schema II)
  • Eine Mischung von CBZ-PipBu-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2, Ammoniumformiat und 10% Pd/C in 20:1 Alkohol/Wasser (10:1 v/w gegenüber CBZ-PipBu-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2) wird zubereitet. Diese Mischung wird auf 40–50°C erhitzt und gerührt, bis die HPLC zeigt, daß die Umsetzung abgeschlossen ist (1–2 Stunden). Die Mischung wird auf Raumtemperatur abgekühlt und zum Entfernen des Katalysators filtriert. Die auf diese Weise erhaltene Lösung wird auf 40–50°C erhitzt und mit Aceton versetzt (~ gleiches Volumen wie die filtrierte Lösung), wobei die Lösung auf 35–40°C abkühlen gelassen wird. Die Mischung wird mit Impfkristallen von N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid versetzt, worauf sich beim Abkühlen auf Raumtemperatur (mehrere Stunden) die hygroskopische Form von N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid kristallisiert. Die Feststoffe werden unter Stickstoff abfiltriert, wobei mit Aceton gespült wird. Die Feststoffe werden im Vakuum getrocknet und auf den Gehalt an der hygroskopischen kristallinen Form von N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid analysiert (HPLC-w/w-Assay). Die Ausbeute beträgt im allgemeinen > 85%, die Reinheit > 95 Fl.-%.
  • Als spezifisches Beispiel für die obige Zubereitung erhält man, wenn man sich an die allgemeine Vorschrift von Schritt 5 hält, aus 5 g CBZ-PipBu-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2 3,1 g einer hygroskopischen kristallinen Form von N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid als weißen Feststoff (99,6 Fl.-% rein), eine stöchiometrische Ausbeute von 89,4%.
  • Beispiel 6 Darstellung von 4-N-CBZ-Piperidon
  • Eine Mischung von 40 kg N-Benzyloxycarbonyloxysuccinimid und 26 kg (175 mol) 4-Piperidon·HCl·H2O in 38,8 kg Wasser und 88 kg THF wird bei 15°C ± 5°C gerührt, bis alles in Lösung gegangen ist (~15 Minuten). Die gerührte Mischung wird mit NMM (22,8 kg) versetzt (exotherm), wobei die Temperatur auf oder unter 20°C gehalten wird. Die Charge wird 2,5 Stunden lang bei 20°C ± 5°C gerührt, worauf die HPLC zeigt, daß die Umsetzung abgeschlossen ist. Die Mischung wird mit 115,2 kg MTBE und 38,8 kg Wasser verdünnt und 5 Minuten lang bei 20°C ± 5°C gerührt. Man stoppt das Rühren und läßt die Phasen trennen, und die wäßrige (untere) Phase wird abgenommen und verworfen. Die organische Phase wird mit 2 × 129,6 kg Wasser gewaschen (5 Minuten rühren, trennen der Phasen, abnehmen/verwerfen der wäßrigen [unteren] Phase). Die organische Phase wird mit 5,2 kg NaCl in 46,8 kg Wasser gewaschen (5 Minuten rühren, trennen der Phasen, abnehmen/verwerfen der wäßrigen [unteren] Phase). Die organische Phase wird mit 11,5 kg MgSO4 behandelt, wobei 1 Stunde lang gerührt wird, und die Mischung wird dann filtriert. Der Reaktor wird mit 8 kg MTBE gespült (filtrieren, vereinigen mit dem Hauptfiltrat; Gesamtwassergehalt des Filtrats: 0,52%). Das Volumen der Mischung wird durch Destillieren im Vakuum bei 30°C auf die Hälfte reduziert. Es wird unter Stickstoff entspannt, und der Rückstand wird auf 20°C gekühlt (Wassergehalt des Rückstands im Topf: 0,43%). Der Rückstand wird mit 57,6 kg MTBE verdünnt, und die Mischung wird dann abermals durch Destillieren im Vakuum bei 30°C auf die Hälfte ihres Volumens reduziert. Es wird unter Stickstoff entspannt, und die Mischung wird auf 20°C gekühlt (Wassergehalt des Rückstands im Topf: 0,250%). Dies wird noch 5mal wiederholt. Der letztendlich erhaltene Rückstand im Topf wird mit 28,8 kg MTBE verdünnt und 5 Minuten lang gemischt und dann auf den Wassergehalt und den Gehalt an 4-N-CBZ-Piperidon untersucht (Wasser: 0,05%; w/w-Assay 4-N-CBZ-Piperidon: 22,66 Gew.-%, 35,36 kg, 155 mol, 88,6% stöchiometrische Ausbeute).
  • Beispiel 7 Darstellung von PipBu
  • Unter einem N2-Strom und Rühren wird eine Lösung von 53,5 kg 3-Carboxypropyltriphenylphosphoniumbromid in 230,1 kg 1,2-Dimethoxyethan zubereitet. Kalium-tert.-butanolat/THF (20 Gew.-%, 141,8 kg an Lösung) wird im Verlauf von 35 Minuten zugesetzt, wobei die Temperatur auf 24–28°C gehalten wird. Die Mischung wird 0,5 Stunden lang bei dieser Temperatur gerührt, worauf HPLC zeigt, daß die Umsetzung abgeschlossen ist. Die gerührte Mischung wird auf 10°C ± 2°C gekühlt und dann im Verlauf von 40 Minuten mit 96,45 kg (Titer: 1,15 Moläq. bezogen auf) 4-CBZ-Piperidon in MTBE so versetzt, daß die Temperatur der Charge bei 12°C ± 2°C bleibt. Die Mischung wird 10 Minuten lang bei dieser Temperatur gerührt und dann auf 20°C ± 2°C erhitzt und bei dieser Temperatur 2 Stunden lang gerührt. Die gerührte Mischung wird so mit einer Lösung von 22,5 kg konzentrierter wäßriger HCl in 245,6 kg Wasser versetzt, daß die Mischung bei 20°C ± 2°C bleibt; der letztlich erhaltene pH-Wert beträgt 0,5. Die Mischung wird unter Rühren mit 214,0 kg Methyl-tert.-butylether extrahiert. Man stoppt das Rühren und läßt die Phasen trennen, und die wäßrige Phase (untere Phase) wird abgenommen und verworfen. Die organische Phase wird mit 133,75 kg Wasser gewaschen (5 Minuten rühren, trennen, abnehmen/verwerfen der wäßrigen [unteren] Phase) und dann mit 10,7 kg 50%iger NaOH in 126,8 kg Wasser gewaschen (10 Minuten rühren, trennen der Phasen, entfernen/verwerfen der organischen [oberen] Phase). Die wäßrige Phase wird mit 2 × 123,05 kg EtOAc extrahiert (5 Minuten rühren, trennen der Phasen, entfernen/verwerfen der organischen [oberen] Phasen). Die gerührte wäßrige Phase wird mit 13,1 kg konzentrierter wäßriger HCl versetzt, so daß man einen pH-Wert von 2,5–3,5 (letztendlich: 2,82) erhält, dann wird die Mischung mit 123,05 kg EtOAc extrahiert (5 Minuten rühren, trennen der Phasen, entfernen/verwerfen der wäßrigen [unteren] Phase). Die EtOAc-Lösung wird mit 133,75 kg Wasser gewaschen (5 Minuten rühren, trennen der Phasen, abnehmen/verwerfen der wäßrigen [unteren] Phase) und dann auf den Gehalt an CBZ-PipBuen (w/w) untersucht (Gesamtgewicht: 194,86 kg, 17,05% CBZ-PipBuen [33,22 kg, 108 mol], 87,9% stöchiometrische Ausbeute).
  • Die EtOAc-Lösung von PipBuen wird zusammen mit 6,6 kg 5% Pd/C (50 Gew.-% Wasser) unter Rühren in einen Drucktank aus Edelstahl gegeben, und die Mischung wird dann auf 55°C ± 2°C erhitzt. In 66,4 kg Wasser gelöstes Kaliumformiat (38,2 kg) wird so zugesetzt, daß die Temperatur der Reaktionsmischung bei 55°C ± 2°C verbleibt (~30 Minuten). Die Mischung wird 2 Stunden lang bei 55°C ± 2°C gerührt, wonach die Umsetzung beendet war (HPLC). 6,6 kg Celite und 33,2 kg Wasser werden in den Reaktor gegeben, und die Mischung wird gerührt und dann filtriert. Der Reaktor wird mit 33,2 kg Wasser ausgespült (filtrieren und dann dem Hauptfiltrat zusetzen). Das Filtrat wird in ein neues Gefäß gegeben, auf 20–25°C gekühlt, die Phasen werden trennen gelassen, und die organische Phase wird abgenommen und verworfen. Die wäßrige Phase wird mit 52,1 kg konzentrierter wäßriger HCl auf einen pH-Wert von 2–3 (letztendlicher Wert: 2,82) angesäuert und dann mit 4 × 129,5 kg Methylenchlorid extrahiert (5 Minuten rühren, trennen der Phasen, entfernen/verwerfen der organischen [unteren] Phasen). Die wäßrige Phase wird auf einen pH-Wert von 6,1 eingestellt, indem man unter Rühren 17,85 kg 50%ige wäßrige NaOH zusetzt. Die Mischung wird filtriert, was 224 kg Lösung mit 17,6 kg (103 mol) 4-(3'-Carboxypropyl)piperidin liefert.
  • Beispiel 8 Darstellung von CBZ-PipBu
  • Die 224 kg der Lösung von 4-(3'-Carboxypropyl)piperidin in wäßriger NaOH wird mit 55,3 kg THF vereinigt, und die Mischung wird unter Rühren auf 8°C ± 2°C gekühlt. NMM (20,9 kg) wird zugesetzt, wobei die Temperatur auf < 10°C gehalten wird. Nach dem Ende der Zugabe wird die Temperatur auf 8°C ± 2°C eingestellt, und dann wird im Verlauf von 1 Stunde mit in 49,8 kg THF gelösten 25,7 kg 1-(Benzyloxycarbonyl)succinimid versetzt, wobei die Temperatur auf < 15°C gehalten wird. Die Umsetzung ist nach 3 Stunden bei 10–15°C abgeschlossen (analytische HPLC). Der pH-Wert wird durch Zugabe von konzentrierter wäßriger HCl (29,9 kg) auf 2,5–3,5 (Endwert: 3,3) eingestellt, dann wird mit 61,4 kg MTBE versetzt, und die Mischung wird 5 Minuten lang gerührt. Man stoppt das Rühren und läßt die Phasen trennen, und die wäßrige (untere) Phase wird abgetrennt (Abfall). Die MTBE-Phase wird mit drei 83,1-kg-Portionen von Wasser gewaschen (10 Minuten, dann 5 Minuten und 5 Minuten Rührphasen); die wäßrige Phase wird jeweils abtrennen gelassen und abgenommen (Abfall). Eine Lösung von 8,3 kg 50%iger wäßriger NaOH in 95,7 kg Wasser wird ohne Rühren zugesetzt, und nach dem Ende der Zugabe wird die Mischung dann ~5 Minuten lang gerührt. Man stoppt das Rühren und läßt die Phasen trennen, und die organische (obere) Phase wird abgetrennt und verworfen. Die wäßrige Phase wird zurück in den Reaktor gegeben und mit 2 × 38,4 kg Methyl-tert.-butylether extrahiert (5 Minuten rühren, trennen der Phasen, abnehmen/verwerfen der organischen [oberen] Phasen). Dieser Arbeitsschritt wird mit 18,5 kg Methyl-tert.-butylether wiederholt. Die in den Reaktor zurückgeführte wäßrige Phase wird mit 9,9 kg konzentrierter wäßriger HCl auf einen pH-Wert von 2,5–3,5 (Endwert: 3,37) angesäuert. Die Mischung wird mit 76,4 kg Methyl-tert.-butylether extrahiert (5 Minuten rühren, trennen der Phasen, abnehmen/verwerfen der unteren [wäßrigen] Phase). Die organische Phase wird mit einer Lösung von 1,1 kg NaHCO3 in 12,4 kg Wasser (5 Minuten rühren) gewaschen (5 Minuten rühren, trennen der Phasen, abnehmen/verwerfen der wäßrigen [unteren] Phase) und dann mit 41,5 kg Wasser gewaschen (5 Minuten rühren, trennen der Phasen, abnehmen/verwerfen der wäßrigen [unteren] Phase). Der Reaktor wird unter Vakuum gegeben, und die flüchtigen Lösungsmittel werden bei 55°C entfernt, bis kein Destillat mehr übergeht. Toluol (32,4 kg) wird zugegeben, und die Mischung wird unter Normaldruck destilliert, bis kein Destillat mehr übergeht, wobei die Temperatur der Charge auf 90–95°C ansteigt. Die Mischung wird dann auf 30–35°C gekühlt, Heptan (56,85 kg) wird in den Reaktor gegeben (zwei Phasen), und die Mischung wird auf 90–95°C erhitzt (einzelne Phase) und dann wieder auf 38–42°C abgekühlt. Impfkristalle von CBZ-PipBu werden zugesetzt, und das Produkt kristallisiert im Verlauf von 1 Stunde aus der Mischung. Der Feststoff wird abfiltriert und mit 19,35 kg 1:2 Toluol/Heptan und dann mit 33,4 kg Heptan gewaschen. Der Filterkuchen wird im Vakuum bei 40°C getrocknet (auf gemäß Analyse 0,13% Gesichtsverlust beim Trocknen), wodurch man 22,4 kg (72,96 mol, 42% stöchiometrische Ausbeute aus 4-Piperidon) an CBZ-PipBu erhält.
  • Beispiel 9 Darstellung von CBZ-PipBuen
  • Eine Suspension von 82 g 3-Carbxypropyltriphenylphosphoniumbromid in 407 ml 1,2-Diethoxyethan wird bei 14°C im Verlauf von 25 Minuten mit 220 g 20 Gew.-% Kalium-tert.-butanolat in Tetrahydrofuran versetzt, wobei die Temperatur der Reaktionsmischung auf 24–28°C gehalten wird. Die Mischung wird 1 Stunde lang gerührt, auf 10°C abgekühlt und dann im Verlauf von 30 Minuten mit einer Lösung von 52,5 g 4-N-CBZ-Piperidon in 246 ml tert.-Butyl-methyl-ether versetzt, wobei weiter gekühlt wird. Nach dem Ende der Zugabe wird die Mischung 10 Minuten lang bei 12°C gerührt und dann auf 20°C erwärmt und weitere 30 Minuten lang gerührt. Die Reaktionsmischung wird 10 Minuten lang mit 410 ml 1 N wäßriger HCl behandelt, mit 328 ml t.-Butyl-methyl-ether verdünnt, und die Phasen werden dann getrennt. Die organische Phase wird mit 205 ml Wasser und dann mit 210 ml 1 N wäßriger NaOH gewaschen. Die NaOH-Phase, die das Produkt enthält, wird getrennt gesammelt, mit drei 189-g-Portionen Essigsäureethylester gewaschen, mit konzentrierter HCl auf einen pH-Wert von 3,48 angesäuert und dann mit 189 ml Essigsäureethylester extrahiert. Die Essigsäureethylesterphase wird abgetrennt, mit 211 ml Wasser gewaschen, dann 30 Minuten lang bei 10 g MgSO4 getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Der ölige Rückstand (50,7 g) wird aus Toluol/Heptan kristallisiert, wodurch man insgesamt 29,46 g (50,9% Ausbeute; ~95 Fl.-% rein) an CBZ-PipBuen erhält.
    Massenspektrum: Mber. 303, M+1beob. 304
    1H-NMR (δ bezogen auf TMS, CDCl3) 2,2, t (2H); 2,25, t (2H); 2,35 t (4H); 3,45, m (4H), 5,15, s (2H); 5,2, m (1H); 7,33, 2 (5H).
    13C-NMR (δ bezogen auf TMS, CDCl3) 22,43, 28,2, 34,26, 35,66, 44,88, 45,74, 67,20, 122,02, 127,83. 127,95, 128,45, 128,69, 128,90, 136,17, 136,72, 155,34, 178,39
  • Beispiel 10 Darstellung von CBZ-PipBuen-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2 (alternativer Schritt 4 von Schema II)
  • CBZ-PipBuen (70 g, 0,23 mol) und DMF (230 ml) werden in einen ummantelten 1-l-Kolben gegeben und gerührt, wobei auf 0°C abgekühlt wird, und dann wird TBTU (74,9 g, 0,23 mol) in einer Portion zugesetzt. Die Temperatur wird auf 0°C gehalten, und es wird mit der Zugabe von DIPEA (61,9 g, 0,61 mol) begonnen. Nach 45 min wird TFA-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2 (138,7 g, 0,24 mol) als eine Lösung in DMF (230 ml) zugesetzt. Der pH-Wert wird durch Zugabe von DIPEA (45 ml) auf 7–8 eingestellt, und die Mischung wird auf Raumtemperatur erwärmen gelassen. Nach 2 Stunden ist die Umsetzung beendet (HPLC-Analyse). Die Mischung wird in Wasser (2,5 l) gequencht und mit EtOAc (1 l) extrahiert. Die wäßrige Phase wird mit EtOAc (0,3 l) rückextrahiert. Die organischen Phasen werden vereinigt, mit wäßriger Zitronensäure (5 Gew.-%, 2 × 1 l) gewaschen, mit wäßriger NaHCO3 (5 Gew.-%, 2 × 1 l) gewaschen und mit Wasser (2 l) gewaschen. Die EtOAc-Phase wird in einen 2 l-Kolben gegeben und unter Rühren mit Heptan (500 ml) versetzt, um die Kristallisation herbeizuführen. Die Feststoffe werden auf einem Büchner-Trichter abgesaugt, mit EtOAc/Heptan (2:1 v/v, 1 l) gewaschen und bis zur Gewichtskonstanz getrocknet, wodurch man CBZ-PipBuen-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2 (143,2 g, 0,19 mol, 83% Ausbeute) erhält.
    Elementaranalyse: C41H55N5O7 C: ber. 66.02; fd. 65,53, H, N.
    Massenspektrum: Mber. 745,91; M+1beob. 746
    1H-NMR (δ bezogen auf TMS, CDCl3): 0,86 qd (1H); 0,98, qd (1H); 1,16, t (2H), 1,24, dt (6H); 1,37, m (1H); 1,64-1,78, m (4H); 1,86, qd (1H); 2,2 bd (4H); 2,35, m (1H); 2,4, m (2H); 2,74, dd (1H); 3,07, m (4H); 3,52, d, (1H); 3,85, d (1H); 4,12, q (1H); 4,49, qd (1H); 4,68, dt (1H); 5,07, d (1H); 5,14, s (1H); 5,16, d (1H); 5,22, t (2H); 6,45, s (1H); 7,28, d (1H); 7,26, s (5H); 7,35, s (5H); 7,56, d (1H)
    13C-NMR (δ bezogen auf TMS, CDCl3): 14,15, 22,68, 24,95, 25,61, 26,03, 26,45, 28,20, 31,71, 32,89, 33,80, 33,89, 34,00, 35,63, 38,37, 44,79, 45,13, 45,65, 50,23, 51,34, 60,40, 66,87, 67,06, 76,50, 77,13, 77,77, 122,46, 126,88, 127,80-128,60, 135,15, 155,19, 170,11, 170,20, 171,61, 173,76, 175,35.
  • Beispiel 11 Darstellung der hygroskopischen kristallinen Form von Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid (alternativer Schritt 5 von Schema II)
  • CBZ-PipBuen-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2 (140 g, 0,19 mol), Ammoniumformiat (61 g, 0,96 mol) und 10% Pd/C (50% feucht, Degussa-Typ, 28 g) werden in einen ummantelten 5-l-Kolben gegeben. EtOH (200%ig, 1260 ml), iPrOH (70 ml) und Wasser (vollentsalzt, 70 g) werden zugesetzt. Diese Mischung wird auf 40–50°C erhitzt und gerührt, bis die HPLC zeigt, daß die Umsetzung beendet ist (5 Stunden). Die Mischung wird auf Raumtemperatur abgekühlt und zum Entfernen des Katalysators filtriert. Die auf diese Weise erhaltene Lösung wird auf 40–50°C erhitzt und mit Aceton (~ gleiches Volumen wie die filtrierte Lösung) versetzt, wodurch die Lösung auf 35–40°C abgekühlt wird. Impfkristalle von N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid werden zur Mischung gegeben, und die hygroskopische Form von N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclo hexylalaninamid kristallisiert aus der Mischung beim Abkühlen auf Raumtemperatur (mehrere Stunden). Die Feststoffe werden auf einem Büchner-Trichter unter Stickstoff abgesaugt, der Kuchen wird mit Aceton gewaschen und bis zur Gewichtskonstanz an der Luft getrocknet, wodurch man N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid erhält (84,3 g, 0,16 mol, 84,8% Ausbeute, > 95 Fl.-%)
  • Beispiel 12 Verknüpfte Darstellung von TFA-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2 (Alternative zu Schritten 1–3 von Schema II)
  • In einen mit einer Temperatursonde ausgestatteten 500-ml-Kolben werden BOC-N(Et)-Gly (20,3 g, 0,1 mol), N-Hydroxysuccinimid (11,5 g, 0,1 mol) und Dichlormethan (200 ml) gegeben. Die Mischung wird bei mäßiger Geschwindigkeit gerührt, und die auf diese Weise erhaltene Lösung wird in einer Portion mit DCC (20,6 g, 0,1 mol) als Feststoff versetzt. Diese Lösung wird 1 Stunde lang gerührt, wobei man eine leicht exotherme Reaktion beobachtet (Temperaturanstieg von 20°C auf 28°C) und DCH ausfällt. Die auf diese Weise erhaltene Suspension wird in einem mit Whatman Nr. 1 Filterpapier ausgestatteten Büchner-Trichter vakuumfiltriert. Der Kuchen wird mit Dichlormethan (2 × 25 ml) gewaschen. Die Filtrate werden in den ursprünglichen 500-ml-Kolben zurückgegeben und dann nacheinander mit (L)Asp(OBzl) (22,3 g, 0,1 mol), NMM (33,8 ml, 0,3 mol) und DMF (80 g, 1,01 mol) versetzt. Nach 2 Stunden Rühren bei Raumtemperatur ist die Bildung von BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl) beendet (HPLC-Kontrolle). Die Reaktionsmischung wird in einen Eiswasser (100 ml) enthaltenden Schütteltrichter gegeben. Die Mischung wird mit HCl (36%, 25 ml) auf einen pH-Wert von 1 angesäuert. Die Phasen werden getrennt, und die Dichlormethanphase wird mit Eiswasser (100 ml) gewaschen, und die Phasen werden getrennt (wäßrige Phase pH-Wert 3–4). Die Dichlormethanphase wird in den ursprünglichen 500-ml-Kolben zurückgegeben, in den nacheinander NH2-(L)-Cha-NH2 (17 g, 0,1 mol), N-Hydroxysuccinimid (11,5 g, 0,1 mol) und DCC (20,6 g, 0,1 mol) in einer Portion, jeweils als Feststoffe, gegeben werden. Nach 2 Stunden Rühren bei Raumtemperatur ist die Bildung von BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2 abgeschlossen (HPLC-Kontrolle), und der DCH wird mit einem mit einem Whatman Nr. 1 Filterpapier ausgestatteten Büchner-Trichter im Vakuum abfiltriert. Der Kuchen wird mit Dichlormethan (2 × 25 ml) gewaschen. Das Filtrat wird in einen Schütteltrichter gegeben und mit voll entsalztem Wasser (200 ml), das N-Methylmorpholin (15 ml, pH-Wert 8–9) enthält, gewaschen. Die Phasen werden getrennt, und die Dichlormethanphase wird nochmals mit Wasser gewaschen (vollentsalzt, 2 × 150 ml). Die Dichlormethanphase wird mit 150 ml 1 N HCl (pH-Wert 1) gewaschen. Die Phasen werden getrennt, und die Dichlormethanphase wird mit voll entsalztem Wasser (200 ml, pH-Wert 3) gewaschen. Die Dichlormethanlösung BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2 wird in einen sauberen 500-ml-Kolben zurückgegeben und dann mit TFA (100 ml) versetzt. Nach 2 Stunden Rühren bei Raumtemperatur ist die Bildung von TFA·HN(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2 abgeschlossen (HPLC-Kontrolle). Die Reaktionsmischung wird zum Entfernen des Dichlormethans und des größten Teils der TFA im Vakuum destilliert und dann mit MTBE (500 ml) und Impfkristallen zur Herbeiführung der Kristallisation des Produktes versetzt. Die Mischung wird mit einem mit Whatman Nr. 1 Filterpapier ausgestatteten Büchner-Trichter im Vakuum filtriert. Der Kuchen wird mit MTBE gewaschen (2 × 25 ml) und an der Luft getrocknet, wodurch man TFA·HN(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2 (46,8 g, 81,5% Ausbeute) als einen weißen Feststoff (> 97 Fl.-% rein, < 0,2 Fl.-% D-Asp-Diast.) erhält.
  • Beispiel 13 Darstellung der stabilen, nichthygroskopischen kristallinen Form von N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid
  • Verfahren A. Statische Umwandlung
  • Die hygroskopische kristalline Form von N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid (7,45 kg) wird in einer Hammermühle gemahlen. Der auf diese Weise erhaltene Feststoff, 7,35 kg wird in eine Trockenschale (90 × 28 cm) aus Edelstahl gegeben und die Schale wird mit durchlöcherter Aluminiumfolie abgedeckt. Die Schale wird dann in einem Feuchtigkeitsofen (LUNAIRE Humidity Cabinet Modell Nr. CEO 941W-3) versiegelt; der Ofen wird während des Formumwandlungsverfahrens außer zur Entnahme von Proben für die Analyse geschlossen gehalten. Der Ofen wird auf 40% RF und 60°C eingestellt und 1 Stunde lang bei diesen Werten gehalten. Der Feuchtigkeitsofen wird dann auf 80% RF/60°C eingestellt und 12 Stunden lang bei diesen Werten gehalten. Nach 18 Stunden bei 80% RF/60°C wird eine Probe entnommen und durch Röntgenpulverdiffraktionsanalyse zur Abschätzung der Umwandlung der nichthygroskopischen kristallinen Form von N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid überprüft. Der Feuchtigkeitsofen wird wieder geschlossen und auf 40% RF/60°C eingestellt und 2 Stunden lang bei diesen Werten gehalten. Der Ofen wird wieder auf Normalwerte eingestellt, dann wird die Schale aus dem Ofen genommen und die nichthygroskopische kristalline Form von N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid wird gewonnen (7,2 kg, 96,6% Ausbeute). Die Bestätigung der Umwandlung erfolgt mit einem Röntgenpulverdiffraktionsgraphen (1). Die Röntgenpulverdiffraktion wird auch als Funktion der zunehmenden Größenordnung des Diffraktionswinkels (2θ) tabularisiert, entsprechend der interplanaren Entfernung des Kristalls (d) in Angström-Einheiten (Å), Counts per Second (Cps) und relativer Peak-Intensität (%) (Tabelle 1). Tabelle 1
    -N- 2θ ---d--- ---Cps--- ---%---
    1 5.065 17.4314 86.00 5.82
    2 6.323 13.9672 248.00 16.78
    3 7.518 11.7489 221.00 14.95
    4 8.163 10.8222 496.00 33.56
    5 8.780 10.0633 155.00 10.49
    6 10.383 8.5125 218.00 14.75
    7 11.351 7.7886 112.00 7.58
    8 12.596 7.0218 999.00 67.59
    9 13.858 6.3852 316.00 21.38
    10 15.191 5.8274 1338.00 90.53
    11 16.476 5.3759 481.00 32.54
    12 16.745 5.2901 556.00 37.62
    13 17.980 4.9294 679.00 45.95
    14 18.572 4.7735 1079.00 73.00
    15 18.799 4.7165 1230.00 83.22
    16 19.147 4.6315 1229.00 83.15
    17 19.619 4.5211 1380.00 93.37
    18 20.200 4.3924 1246.00 84.30
    19 20.466 4.3360 1478.00 100.00
    20 20.870 4.2528 1088.00 73.61
    21 21.625 4.1061 584.00 39.51
    22 22.088 4.0210 891.00 60.28
    23 22.840 3.8903 613.00 41.47
    24 23.947 3.7129 597.00 40.39
    25 24.569 3.6203 680.00 46.01
    26 25.608 3.4757 506.00 34.24
    27 27.015 3.2978 1100.00 74.42
    28 27.837 3.2022 420.00 28.42
    29 27.967 3.1877 400.00 27.06
    30 29.255 3.0502 536.00 36.27
    31 29.689 3.0066 603.00 40.80
    32 30.665 2.9130 518.00 35.05
    33 31.318 2.8538 451.00 30.51
    34 31.89 2.8036 533.00 36.06
    35 33.370 2.6829 518.00 35.05
    36 33,562 2,6679 552,00 37,35
    37 33,919 2,6407 581,00 39,31
    38 34,840 2,5730 561,00 37,96
    39 35,789 2,5069 559,00 37,82
    40 35,940 2,4967 560,00 37,89
    41 36,780 2,4416 740,00 50,07
    42 37,042 2,4249 736,00 49,80
    43 37,959 2,3684 683,00 46,21
    44 39,017 2,3066 643,00 43,50
  • Verfahren B. Dynamische Bedingungen
  • a. Formumwandlung
  • Die hygroskopische kristalline Form von N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid (50 g) wird in einen 400-ml-Meßzylinder (Betthöhe 6 cm), der sich an einem Ringständer befindet und mit einem mechanischen Rührer ausgestattet ist, gegeben. Der Apparat wird in einen Ofen mit kontrollierter Feuchtigkeit (LUNAIRE Feuchtigkeitskabinett Modell Nr. CEO 941W-3) gegeben. Es wird bei 275 U/min gerührt, und die Temperatur und die RF werden im Verlauf von 30 Minuten auf 60°C bzw. 40% eingestellt. Die Verbindung wird 1 Stunde lang unter diesen Bedingungen gehalten, dann werden die Bedingungen im Verlauf von 45 Minuten auf 80% RF/60°C geändert. Die Verbindung wird dann 16 Stunden lang unter diesen Bedingungen gehalten, bevor der Ofen wieder auf 40% RF/60°C eingestellt und 3,25 Stunden lang auf diesen Werten gehalten wird. Die Verbindung wird dann wieder auf Umgebungsbedingungen gebracht (Betthöhe 4 cm) und anschließend aus dem Zylinder entnommen, wodurch man die nichthygroskopische kristalline Form von N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid erhält (Ausbeute > 95%). Die Bestätigung der Umwandlung erfolgt durch Röntgenpulverdiffraktionsanalyse (2). Die Röntgenpulverdiffraktion wird auch als Funktion der zunehmenden Größenordnung des Diffraktionswinkels (2θ) tabularisiert, entsprechend der interplanaren Entfernung des Kristalls (d) in Angström-Einheiten (Å), Counts per Second (Cps) und relativer Peak-Intensität (%) (Tabelle 2). Tabelle 2
    -N- 2θ ---d--- ---Cps--- ---%---
    1 5.186 17.0268 196.00 8.43
    2 6.371 13.8615 722.00 31.07
    3 7.570 11.6689 516.00 22.20
    4 8.232 10.7323 1094.00 47.07
    5 8.817 10.0206 257.00 11.06
    6 10.428 8.4761 365.00 15.71
    7 11.377 7.7714 129.00 5.55
    8 11.600 7.6223 117.00 5.55
    9 12.667 6.9828 1805.00 77.67
    10 13.913 6.3599 551.00 23.71
    11 14.398 6.1468 178.00 7.66
    12 15.226 5.844 2285.00 98.32
    13 16.538 5.3557 861.00 37.05
    14 16.773 5.2814 929.00 39.97
    15 18.019 4.9190 1132.00 48.71
    16 18.672 4.7483 1871.00 80.51
    17 18.815 4.7125 2052.00 88.30
    18 19.204 4.6178 2071.00 89.11
    19 19,654 4,5132 2226,00 95,78
    20 20,237 4,3845 1939,00 83,43
    21 20,523 4,3240 2324,00 100,00
    22 20,934 4,2400 1656,00 71,26
    23 21,691 4,0938 923,00 39,72
    24 22,143 4,0112 1411,00 60,71
    25 22,910 3,8786 994,00 42,77
    26 24,007 3,7037 964,00 41,48
    27 24,642 3,6097 991,00 42,64
    28 25,642 3,6097 991,00 42,64
    29 27,070 3,2913 1687,00 72,59
    30 27,855 3,2002 688,00 29,60
    31 29,497 3,0258 843,00 36,27
    32 29,497 3,0013 878,00 37,78
    33 30,751 2,9051 809,00 34,81
    34 31,916 2,8017 821,00 35,33
    35 33,982 2,6360 882,00 37,95
    36 35,200 2,5475 865,00 37,22
    37 36,001 2,4926 841,00 36,19
    38 36,927 2,4322 1106,00 47,59
    39 38,389 2,3429 968,00 41,65
  • b. Formumwandlung
  • Die hygroskopische kristalline Form von N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid (370 g) wird in einen 2-l-Rotationsverdampferkolben eingebracht. Der Kolben wird am Rotationsverdampfer (Heidolph UV 2002) befestigt und in ein vorgeheiztes (58°C) Bad (Heidolph MR 2002) gegeben. Der Apparat wird unter Verwendung einer Vakuumpumpe (Divatrion DV1) auf ein Vakuum von 60 mBar gebracht, und das Vakuum wird dann in kontrollierter Weise wieder aufgehoben, so daß eine in einem getrennten, erhitzten wasserhaltigen Kolben erzeugte feuchte Atmosphäre eingelassen werden kann. Das Einlassen der feuchten Atmosphäre wird mit einem Apparat zur Steuerung der Feuchtigkeit (Vausalo Humiditique and Temperature Traumettor) gesteuert, so daß die RF im Apparat 79% beträgt (130–180 mBar Innendruck). Das Rotationsverdampfergefäß wird dann 5 Stunden lang bei 145–160 Umdrehung pro Minute gedreht, wobei das Heizbad auf ~60°C und die RF im Gefäß auf 71–79% gehalten wird. Das Vakuum wird dann mit Stickstoff aufgehoben, das Gefäß und sein Inhalt werden auf Raumtemperatur abkühlen gelassen und das Produkt wird entnommen, wodurch man die nichthygroskopische kristalline Form von N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid erhält. Eine zweite 317-g-Charge der hygroskopischen kristallinen Form von N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid wird auf ähnliche Weise behandelt, wodurch man die nichthygroskopische kristalline Form von N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid erhält. Die Bestätigung der Umwandlung erfolgt durch Röntgenpulverdiffraktionsanalyse (3). Die beiden Chargen zusammen lieferten 667 g der nichthygroskopischen kristallinen Form von N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid (97% Gesamtausbeute). Die Bestätigung der Umwandlung erfolgt durch Röntgenpulverdiffraktionsanalyse (3). Die Röntgenpulverdiffraktion wird auch als Funktion der zunehmenden Größenordnung des Diffraktionswinkels (2θ) tabularisiert, entsprechend der interplanaren Entfernung des Kristalls (d) in Angström-Einheiten (Å), Counts per Second (Cps) und relativer Peak-Intensität (%) (Tabelle 3). Tabelle 3
    -N- 2θ ---d--- ---CpS--- ---%---
    1 5.124 17.2309 180.00 10.17
    2 6.328 13.9565 408.00 23.05
    3 7.574 11.6623 305.00 17.23
    4 8.191 10.7851 556.00 31.41
    5 8.797 10.0432 166.00 9.38
    6 10.398 8.5004 244.00 13.79
    7 12.628 7.0040 1198.00 67.68
    8 13.871 6.3791 353.00 19.94
    9 15.218 5.8172 1543.00 87.18
    10 15.723 5.6317 187.00 10.56
    11 16.538 5.3558 589.00 33.28
    12 16.751 5.2882 621.00 35.08
    13 18.024 4.9175 869.00 49.10
    14 18.640 4.7563 1156.00 65.31
    15 18.809 4.7141 1241.00 70.11
    16 19.191 4.6210 1521.00 85.93
    17 19.659 4.5120 1413.00 79.83
    18 20.865 4.4064 1303.00 73.62
    19 20.495 4.3299 1770.00 100.00
    20 20.865 4.2539 1120.00 63.28
    21 21.616 4.1077 683.00 38.59
    22 22.113 4.0166 919.00 51.92
    23 22.950 3.8719 697.00 39.38
    24 24.117 3.6871 659.00 37.23
    25 24.618 3.6132 716.00 40.45
    26 25.644 3.4709 662.00 37.40
    27 26.297 3.3862 486.00 27.46
    28 27.052 3.2934 1270.00 71.75
    29 27.960 3.1885 518.00 29.27
    30 29.640 3.0115 705./00 39.38
    31 30.744 2.9058 695.00 39.27
    32 33.465 2.6755 697.00 39.38
    33 33.840 2.6467 764.00 43.16
    34 35.812 2.5053 736.00 41,58
    35 36.811 2.4396 858.00 48.47
    36 37.076 2.4228 919.00 51.92
    37 38.185 2.3549 870 49.15
    38 39.622 2.2728 882.00 49.83
  • Beispiel 14 Röntgenpulverdiffraktionsgraphen einer Probe von N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid in seiner hygroskopischen kristallinen Form und seiner umgewandelten nichthygroskopischen kristallinen Form
  • Eine Probe von hygroskopischem kristallinem N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]- (L)-β-cyclohexylalaninamid wird wie in Beispiel 5 oder 11 dargestellt und gemäß einem Verfahren von Beispiel 13 in die entsprechende nichthygroskopische kristalline Form umgewandelt. Die Röntgenpulverdiffraktionsgraphen der hygroskopischen kristallinen Form und der nichthygroskopischen kristallinen Form sind in 4 beziehungsweise 5 gezeigt. Die Röntgenpulverdiffraktionsgraphen für die hygroskopische kristalline Form und die nichthygroskopische kristalline Form sind auch als Funktion der zunehmenden Größenordnung des Diffraktionswinkels (2θ) tabularisiert, entsprechend der interplanaren Entfernung des Kristalls (d) in Angström-Einheiten (Å), Counts per Second (Cps) und relativer Peak-Intensität (%) in Tabelle 4 beziehungsweise Tabelle 5. Tabelle 4
    -N- 2θ ---d--- ---Cps--- ---%---
    1 5.073 17.4037 1487.00 86.50
    2 6.451 13.6905 447.00 26.00
    3 7.837 11.2712 411.00 23.91
    4 8.491 10.4049 602.00 35.02
    5 9.699 9.1119 93.00 5.41
    6 10.488 8.4278 421.00 24.49
    7 11.570 7.6423 92.00 5.35
    8 12.550 7.0474 411.00 23.91
    9 13.576 6.5168 760.00 44.21
    10 15.327 5.7763 606.00 35.25
    11 15.790 5.6080 456.00 26.53
    12 16.179 5.4739 346.00 20.13
    13 16.770 5.2824 938.00 54.57
    14 17.085 5.1856 685.00 39.85
    15 17.750 4.9927 924.00 53.75
    16 18.151 4.8835 741.00 43.11
    17 18.504 4.7909 593.00 34.50
    18 19.323 4.5897 930.00 54.10
    19 19.714 4.4996 792.00 46.07
    20 20.545 4.3194 1719.00 100.00
    21 21.388 4.1510 897.00 52.18
    22 22.381 3.9691 373.00 21.70
    23 22.870 3.8852 258.00 15.01
    24 23.640 3.7604 563.00 32.75
    25 23.841 3.7292 680.00 39.56
    26 24.048 3.6976 623.00 36.24
    27 24.746 3.5949 338.00 19.66
    28 25.200 3.5311 366.00 21.29
    29 25.792 3.4513 590.00 34.32
    30 26.266 3.3901 731.00 42.52
    31 26.959 3.3045 555.00 32.29
    32 27.426 3.2494 769.00 44.74
    33 27.967 3.1876 528.00 30.72
    34 29.020 3.0744 771.00 44.85
    35 29.922 2.9837 491.00 28.56
    36 30.970 2.8851 384.00 22.34
    37 31.552 2.8332 510.00 29.67
    38 33.338 2.6854 627.00 36.47
    39 34.838 2.5731 520.00 30.25
    40 35.873 2.5012 653.00 37.99
    41 36.107 2.4855 639.00 37.17
    42 37.162 2.4174 683.00 39.73
    43 38.509 2.3359 775.00 45.08
    44 39.701 2.2684 784.00 45.61
    Tabelle 5
    -N- 2θ ---d--- ---Cps--- ---%---
    1 5.152 17.1371 123.00 7.34
    2 6.386 13.8287 483.00 28.84
    3 7.580 11.6540 389.00 23.22
    4 8.225 10.7410 752.00 44.90
    5 8.801 10.0390 180.00 10.75
    6 10.408 8.4928 276.00 16.48
    7 12.660 6.9863 1399.00 83.52
    8 13.914 6.3594 391.00 23.34
    9 15.251 5.8047 1675.00 100.00
    10 16.541 5.3548 608.00 36.30
    11 16.771 5.2818 652.00 38.93
    12 18.047 4.9112 775.00 46.27
    13 18.676 4.7472 1078.00 64.36
    14 18.902 4.6910 1099.00 65.61
    15 19.182 4.6231 1151.00 68.72
    16 19.697 4.5035 1164.00 69.49
    17 20.240 4.3838 1049.00 62.63
    18 20.568 4.3147 1403.00 83.76
    19 29.933 4.2403 1024.00 61.13
    20 21.684 4.0951 569.00 33.97
    21 22.122 4.0150 746.00 44.54
    22 22.970 3.8685 564.00 33.67
    23 24.080 3.6927 546.00 32.60
    24 24.218 3.6720 556.00 33.19
    25 24.694 3.6023 618.00 36.90
    26 25.680 3.4662 510.00 30.45
    27 26.400 3.3732 403.00 24.06
    28 27.105 3.2871 1093.00 65.25
    29 27.929 3.1920 450.00 26.87
    30 29.360 3.0395 555.00 33.13
    31 29.724 3.0031 595.00 35.52
    32 30.340 2.9435 429.00 25.61
    33 30.693 2.9105 552.00 32.96
    34 31.353 2.8507 476.00 28.42
    35 31.822 2.8098 531.00 31.70
    36 32.006 2.7940 545.00 32.54
    37 32.885 2.7213 485.00 28.96
    38 33.508 2.6722 547.00 32.66
    39 34.040 2.6316 606.00 36.18
    40 34.839 2.5730 580.00 34.63
    41 35.998 2.4928 596.00 35.58
    42 36.680 2.4480 629.00 37.55
    43 36.948 2.4309 727.00 43.40
    44 37.197 2.4152 703.00 41.97
    45 39.602 2.2739 697.00 41.61
  • Beispiel 15 Isotherme mikrokalorimetrische Experimente mit den hygroskopischen und nichthygroskopischen kristallinen Formen von N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid
  • Isotherme mikrokalorimetrische Experimente mit den hygroskopischen und nichthygroskopischen kristallinen Formen von N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid wurden mit einem Thermometric® Thermal Activity Monitor (TAM) durchgeführt. Die Festphasenumwandlungen verschiedener kristalliner Formen wurden untersucht, indem man die Formen verschiedenen Feuchtigkeiten oder Lösungsmitteldämpfen bei verschiedenen Temperaturen aussetzte. Bei den zum Erhalten verschiedener Feuchtigkeiten verwendeten gesättigten Salzlösungen handelt es sich um: KCl (80% RF), NaCl (75% RF) und NaBr (65% RF). Mengen von ungefähr 100 mg der Formen werden in eine TAM-Glasampulle ausgewogen, und ein Mikrohygrostat mit einer gesättigten Salzlösung (mit einem Überschuß an Feststoff) oder einem organischen Lösungsmittel wird in die Ampulle gegeben. Die Ampulle wird verschlossen, auf die Temperatur des Experiments equilibriert und in die Meßposition im TAM herabgelassen. Ein identisches System mit gewaschenem Seesand anstelle der zu testenden Form wird auf die Vergleichsseite gegeben. Die Abgabeleistung (μW) wird als Funktion der Zeit gemessen (6–8).
  • Beispiel 16 Feuchtigkeitssorptionsisotherme der hygroskopischen und nichthygroskopischen kristallinen Formen von N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid
  • Feuchtigkeitssorptionsisotherme der hygroskopischen und nichthygroskopischen kristallinen Formen von N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid werden mit einer VTI MB300G-Feuchtigkeitswaage erhalten. Die Experimente werden entweder durchgeführt, indem man ungefähr 15 mg der betreffenden kristallinen Form einer schrittweisen Erhöhung und Erniedrigung von % RF unterzieht und die Gewichtszunahme (bei jedem Gleichgewichtsschritt) als Funktion von % RF aufzeichnet (9), oder indem man die betreffende kristalline Form bei einer konstanten Feuchte hält und die Gewichtszunahme als Funktion der Zeit aufzeichnet.
  • Die Verbindungen der Formel II zeigen eine wertvolle pharmakologische Wirkung und können dementsprechend in pharmazeutische Zusammensetzungen eingearbeitet und zur Behandlung von Patienten, die an bestimmten pathologischen Konditionen leiden, verwendet werden.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten, der an Konditionen leidet, die sich durch die Verabreichung eines Thrombozytenaggregationshemmers lindern oder verhindern lassen, oder der diesen Konditionen unterliegt, wobei die Bindung von Fibrinogen an aktivierte Thrombozyten und andere an der Thrombozytenaggregation und der Blutgerinnung beteiligte adhäsive Glykoproteine inhibiert wird. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Prävention oder Behandlung von mit bestimmten Krankheitszuständen wie Herzinfarkt, Schlaganfall, peripherer Verschlußkrankheit und disseminierter intravasaler Koagulation bei Menschen und anderen Säugetieren assoziierter Thrombose.
  • Verweise auf eine Behandlung sollen hier als sowohl die prophylaktische Therapie als auch die Behandlung von etablierten Konditionen einschließend verstanden werden.
  • Die vorliegende Erfindung schließt außerdem in ihrem Umfang eine pharmazeutische Zusammensetzung ein, die eine pharmazeutisch unbedenkliche Menge wenigstens einer Verbindung der Formel I zusammen mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger oder Exzipienten enthält.
  • In der Praxis können die Verbindungen bzw. Zusammensetzungen zur Behandlung gemäß der vorliegenden Erfindung auf eine beliebige geeignete Weise verabreicht werden, zum Beispiel topisch, durch Inhalation, parenteral, rektal oder oral; sie werden jedoch vorzugsweise oral verabreicht.
  • Die Verbindungen der Formel II können in Formen dargereicht werden, die eine Verabreichung auf die geeignetste Route erlauben, und die Erfindung betrifft außerdem pharmazeutische Zusammensetzungen, die wenigstens eine erfindungsgemäße Verbindung enthalten und für die Verwendung in der Human- oder Veterinärmedizin geeignet sind. Diese Zusammensetzungen können auf herkömmliche Weise hergestellt werden, wobei ein oder mehrere pharmazeutisch unbedenkliche Adjuvantien oder Exzipienten zur Anwendung kommen. Zu den Adjuvantien zählen unter anderem Verdünnungsmittel, sterile wäßrige Medien und verschiedene nichttoxische organische Lösungsmittel. Die Zusammensetzungen können in Form von Tabletten, Pillen, Kapseln, Granulaten, Pulvern, wäßrigen Lösungen oder Suspensionen, Injektionslösungen, Elixieren, Sirupen und dergleichen dargereicht werden und können ein oder mehrere aus der Gruppe der Süßstoffe, Geschmacksstoffe, Farbstoffe, Stabilisatoren oder Konservierungsstoffe ausgewählte Mittel enthalten, so daß man pharmazeutisch unbedenkliche Zubereitungen erhält.
  • Die Wahl an Vehikel und Wirkstoffgehalt im Vehikel wird im allgemeinen gemäß der Löslichkeit und der chemischen Eigenschaften des Produkts, der jeweiligen Verabreichungsweise und den in der pharmazeutischen Praxis zu berücksichtigenden Vorbehalten erfolgen. So kann man zum Beispiel zur Herstellung von Tabletten Exzipienten wie Laktose, Natriumcitrat, Calciumcarbonat, Dicalciumphosphat und Sprengmittel wie Stärke, Algensäuren und bestimmte Komplexe Kieselgele in Kombination mit Gleitmitteln wie Magnesiumstearat, Natriumlaurylsulfat und Talkum verwenden. Zur Herstellung einer Kapsel ist die Verwendung von Laktose und hochmolekularen Polyethylenglykolen vorteilhaft. Verwendet man wäßrige Suspensionen, so können diese Emulgatoren oder Suspensionsmittel enthalten. Verdünnungsmittel wie Saccharose, Ethanol, Polyethylenglykol, Propylenglykol, Glycerin und Chloroform oder Kombinationen davon können ebenso wie auch andere Materialien zur Anwendung gelangen.
  • Für die parenterale Verabreichung verwendet man Emulsionen, Suspensionen oder Lösungen der erfindungsgemäßen Verbindungen in Pflanzenöl, zum Beispiel Sesamöl, Erdnußöl oder Olivenöl, oder wäßrigorganische Lösungen wie Wasser oder Propylenglykol, injizierbare organische Ester wie Ölsäureethylester sowie sterile wäßrige Lösungen der pharmazeutisch unbedenklichen Salze. Die Lösungen der Salze der erfindungsgemäßen Produkte eignen sich auch für die Verabreichung durch intramuskuläre oder subkutane Injektion. Die wäßrigen Lösungen, zu denen auch die Lösungen der Salze in reinem destilliertem Wasser zählen, können zur intravenösen Verabreichung verwendet werden, mit der Maßgabe, daß ihr pH-Wert geeignet eingestellt wird, daß sie sachgemäß gepuffert werden und mit einer ausreichenden Menge an Glucose oder Natriumchlorid isotonisch gemacht werden, und daß sie durch Erhitzen, Bestrahlen und/oder Mikrofiltration sterilisiert werden.
  • Für die topische Verabreichung können Gele (auf Basis von Wasser oder Alkohol), Cremes oder Salben, die die erfindungsgemäßen Verbindungen enthalten, verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch in eine Gel- oder Matrixgrundlage zur Applikation in einem Pflaster eingearbeitet werden, was eine kontrollierte Freisetzung der Verbindung durch die Transdermalbarriere ermöglicht.
  • Feste Zusammensetzungen zur rektalen Verabreichung schließen Zäpfchen ein, die nach bekannten Verfahren formuliert werden und wenigstens eine Verbindung der Formel II enthalten.
  • Der prozentuale Anteil an Wirkstoff in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen kann variiert werden, wobei er einen Anteil einer geeigneten Dosierung darstellen sollte. Offensichtlich können mehrere Einheitsdosierungsformen zu etwa dergleichen Zeit verabreicht werden. Die eingesetzte Dosis wird von einem Arzt oder medizinisch qualifiziertem Personal bestimmt und hängt von der gewünschten therapeutischen Wirkung, dem Verabreichungsweg und der Dauer der Behandlung sowie dem Zustand des Patienten ab. Das Dosierungsprotokoll bei der Durchführung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist so bemessen, daß eine maximale therapeutische Reaktion sichergestellt ist, bis eine Verbesserung erzielt wird, und im Anschluß daran minimale wirksame Spiegel, die Linderung geben. Im allgemeinen kann die orale Dosis zwischen etwa 0,1 mg/kg und etwa 100 mg/kg, vorzugsweise zwischen etwa 0,1 mg/kg und 20 mg/kg und ganz besonders bevorzugt zwischen etwa 1 mg/kg und 20 mg/kg und die i.v.-Dosis von etwa 0,1 μg/kg bis etwa 100 μg/kg, vorzugsweise zwischen etwa 0,1 mg/kg bis 50 mg/kg, liegen. Bei jedem einzelnen Fall werden die Dosierungen gemäß den Faktoren bestimmt, die für den zu behandelnden Patienten kennzeichnend sind, wie z. B. Alter, Gewicht, allgemeiner Gesundheitszustand und andere Eigenschaften, die die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindung beeinflussen können.
  • Die Verbindungen der Formel II können weiterhin so häufig wie nötig verabreicht werden, um die gewünschte therapeutische Wirkung zu erzielen. Einige Patienten können schnell auf eine höhere oder niedrigere Dosis ansprechen und viel kleinere Erhaltungsdosen ausreichend finden. Bei anderen Patienten können Langzeitbehandlungen bei einer Rate von 1 bis 4 oralen Dosen pro Tag, vorzugsweise einmal oder zweimal täglich, gemäß den physiologischen Bedürfnissen des jeweiligen Patienten erforderlich sein. Im allgemeinen kann der Wirkstoff ein- bis viermal pro Tag oral verabreicht werden. Natürlich wird es für einige Patienten notwendig sein, nicht mehr als eine oder zwei Dosen pro Tag zu verschreiben.
  • Die Verbindungen der Formel II zeigen gemäß in der Literatur beschriebenen Tests deutliche pharmakologische Wirkungen, wobei angenommen wird, daß die Testergebnisse in Korrelation mit der pharmakologischen Wirkung in Menschen und anderen Säugetieren stehen. Die folgenden pharmakologischen In-vitro- und In-vivo-Testergebnisse sind für die Kennzeichnung einer Verbindung der Formel II typisch.
  • Mit den folgenden pharmakologischen Tests wird die hemmende Wirkung von Verbindungen der Formel II auf die fibrinogenvermittelte Thrombozytenaggregation, die Bindung von Fibrinogen an thrombinstimulierte Thrombozyten und die Inhibierung der ADP-induzierten Ex-vivo-Thrombozytenaggregation untersucht, und die Ergebnisse dieser Tests stehen in Korrelation mit den inhibitorischen In-Vivo-Eigenschaften der Verbindungen der Formel II.
  • Der Thrombozytenaggregationsassay beruht auf dem in Blood 66 (4), 946–952 (1985) beschriebenen. Bei dem Fibrinogenbindungsassay handelt es sich im wesentlichen um den von Ruggeri, Z. M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 5708–5712 (1986) und Plow, E. F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 8057–8061 (1985). Die Inhibierung der ADP-induzierten Ex-vivo-Thrombozytenaggregation beruht auf der von Zucker, „Platelet Aggregation Measured by the Photoelectric Method", Methods in Enzymology 169, 117–133 (1989).
  • Thrombozytenaggregationsassay
  • Gewinnung von fixierten aktivierten Thrombozyten
  • Thrombozyten werden unter Anwendung des Gelfiltrationsverfahrens wie von Marguerie, G. A. et al., J. Biol. Chem. 254, 5357–5363 (1979) und Ruggeri, Z. M. et al., J. Clin. Invest. 72, 1–12 (1983) aus Konzentraten humaner Thrombozyten isoliert. Die Thrombozyten werden in einer Konzentration von 2 × 108 Zellen/ml in modifiziertem calciumfreiem Tyrode-Puffer mit 127 mM Natriumchlorid, 2 mM Magnesiumchlorid, 0,42 mM Na2HPO4, 11,9 mM NaHCO3, 2,9 mM KCl, 5,5 mM Glucose, 10 mM HEPES bei einem pH-Wert von 7,35 und 0,35% humanem Serumalbumin (HSA) suspendiert. Die gewaschenen Thrombozyten werden durch Zugabe von humanem a-Thrombin in einer Endkonzentration von 2 Einheiten/ml gefolgt von Thrombininhibitor I-2581 in einer Endkonzentration von 40 μM aktiviert. Die aktivierten Thrombozyten werden mit Paraformaldehyd in einer Endkonzentration von 0,50% versetzt, und diese Mischung wird 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die fixierten aktivierten Thrombozyten werden dann durch 15minütiges Zentrifugieren bei 650 × g gesammelt. Die Thrombozytenpellets werden viermal mit dem obigen Tyrode-0,35%-HSA-Puffer gewaschen und in einer Konzentration von 2 × 108 Zellen/ml in dem gleichen Puffer resuspendiert.
  • Thrombozytenaggregationsassay
  • Die fixierten aktivierten Thrombozyten werden zur Inhibition der Thrombozytenaggregation eine Minute lang mit einer ausgewählten Dosis der zu testenden Verbindung inkubiert, und die Aggregation wird durch Zugabe von humanem Fibrinogen in einer Endkonzentration von 250 μg/ml eingeleitet. Zur Aufzeichnung der Thrombozytenaggregation wird ein Thrombozytenaggregationsprofiler Modell PAP-4 verwendet. Das Ausmaß der Inhibierung der Aggregation wird in Prozent der in Abwesenheit von Inhibitor beobachteten Aggregationsgeschwindigkeit ausgedrückt. Anschließend wird der IC50 d. h. die Menge an Inhibitor, die erforderlich ist, um die Aggregationsgeschwindigkeit um 50% zu senken, für die jeweilige Verbindung berechnet (siehe zum Beispiel Plow, E. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 8057–8061 (1985)).
  • Fibrinogenbindungsassay
  • Thrombozyten werden nach dem Albumin-Dichtegradientenverfahren von Walsh, P. N. et al., Br. J. Haematol. 281–296 (1977), modifiziert nach Trapani-Lombardo, V. et al., J. Clin. Invest. 76, 1950–1958 (1985) frei von Plasmabestandteilen gewaschen. Die Thrombozyten in den jeweiligen experimentellen Mischungen werden in modifiziertem Tyrode-Puffer (Ruggeri, Z. M. et al., J. Clin. Invest. 72, 1–12 (1983) bei 22–25°C 10 Minuten lang mit humanem a-Thrombin stimuliert (3,125 × 1011 Thrombozyten pro Liter und 0,1 NIH-Einheiten/ml Thrombin). Dann wird ein 25facher Überschuß (Einheit/Einheit) an Herudin zugesetzt, worauf nach 5 Minuten das mit 125I markierte Fibrinogen und die zu testende Verbindung zugesetzt werden. Nach diesen Zugaben beträgt die letztendlich erhaltene Thrombozytenzahl in der Mischung 1 × 1011/l. Nach weiteren 30 Minuten Inkubation bei 20–25°C werden gebundener und freier Ligand getrennt, indem man 50 μl der Mischung bei 12 000 × g 4 Minuten lang durch 300 μl 20%ige Saccharose zentrifugiert. Das Thrombozytenpellet wird dann vom Rest der Mischung abgetrennt, um die thrombozytengebundene Radioaktivität zu bestimmen. Die nichtspezifische Bindung wird in Mischungen mit einem Überschuß an nichtmarkiertem Liganden gemessen. Beim Analysieren der Bindungskurven durch Scatchard-Analyse erhält man die nicht spezifische Bindung als angepaßten Parameter aus der Bindungsisotherme mittels eines Computerprogramms (Munson, P. J., Methods Enzymol. 92, 542–576 (1983)). Zur Bestimmung der für die Inhibierung von 50% der Fibrinogenbindung an thrombinstimulierte Thrombozyten erforderlichen Konzentration der jeweiligen Verbindung (IC50) werden die Verbindungen jeweils bei 6 oder mehr Konzentrationen mit bei 0,176 μmol/l (60 μg/ml) gehaltenem, mit 125I markierten Fibrinogen getestet. Man erhält den IC50 durch Auftragung der verbliebenen Fibrinogenbindung gegen den Logarithmus der Konzentration der Verbindung in der Probe.
  • Inhibierung der ADP-induzierten Ex-vivo-Thrombozytenaggregation
  • Experimentelles Protokoll
  • Blutproben für die Kontrolle werden 5–10 Minuten vor der Verabreichung der Testverbindung an Mischlingshunde mit einem Gewicht von 10 bis 20 kg gewonnen. Die Verbindung wird intragastrisch wäßrig über eine Schlundssonde oder oral als Gelatinekapsel verabreicht. Dann werden über 3 Stunden in 30 Minuten Abständen und 6, 12 und 24 Stunden nach der Verabreichung Blutproben (5 ml) entnommen. Die einzelnen Blutproben werden durch Venipunktion der V. cephalica entnommen und direkt in einer Plastikspritze mit einem Teil 3,8%iger Trinatriumcitratlösung auf neun Teile Blut gesammelt.
  • Ex-vivo-Thrombozytenaggregation bei Hunden
  • Die Blutproben werden zur Gewinnung von thromobozytenreichem Plasma (Platelet Rich Plasma, (PRP)) 10 Minuten lang bei 1000 U/min zentrifugiert. Nach der Abnahme des PRP wird die Probe weitere 10 Minuten lang bei 2000 U/min zentrifugiert, wodurch man thrombozytenarmes Plasma (Platelet Poor Plasma, (PPP)) gewinnt. Die Thrombozytenzahl im PRP wird mit einem Coulter-Zähler (Coulter Electronics, Hialeah, FL, USA) bestimmt. Ist die Thrombozytenkonzentration im PRP größer als 300 000 Thrombozyten/μl, dann wird das PRP zum Einstellen der Thrombozytenzahl auf 300 000 Thrombozyten/μl mit PPP verdünnt. Aliquots von PRP (250 μl) werden dann in silikonisierte Glasküvetten (7,25 × 55 mm, Bio/Data Corp., Horsham, PA, USA) gegeben. Das PRP wird dann mit Epinephrin (Endkonzentration 1 μM) versetzt und eine Minute lang bei 37°C inkubiert. Dann wird dem PRP der Thrombozytenaggregationsstimulator ADP in einer Endkonzentration von 10 μM zugesetzt. Die Thrombozytenaggregation wird spektrophotometrisch unter Verwendung eines Lichttransmissionsaggregometers (Bio/Data Platelet Aggregation Profiler, Modell PAP-4, Bio/Data Corp., Horsham, PA, USA) verfolgt. Beim Testen einer Verbindung wird die Geschwindigkeitsänderung (Steigung) der Lichtdurchlässigkeit und die maximale Lichtdurchlässigkeit (maximale Aggregation) jeweils zweimal bestimmt. Die Thrombozytenaggregationsdaten werden als prozentuale Abnahme (Mittelwert ± SEM) bei der Steigung oder der maximalen Aggregation, verglichen mit Daten, die vom Kontroll-PRP stammen, das aus vor der Verabreichung der Testverbindung gewonnenen Blutproben hergestellt wird, angegeben.
  • Verbindungen der Formel II zeigen bei den oben genannten Tests deutliche Aktivität und werden als von Nutzen bei der Prävention und Behandlung von Thrombose assoziiert mit bestimmten Krankheitszuständen angesehen. Die antithrombotische Aktivität bei der Ex-vivo-Thrombozytenaggregation in Hunden ist prädiktiv für eine solche Aktivität in Menschen (siehe zum Beispiel Catalfamo, J. L., und Dodds, W. Jean, „Isolation of Platelets from Laboratory Animals", Methods Enzymol. 169, Teil A, 27, (1989)). Die Ergebnisse des Tests einer Verbindung der Formel II nach den obigen Methoden sind unten in Tabelle 6 aufgeführt. Ebenfalls aufgeführt in der Tabelle sind die Ergebnisse von Vergleichstests für 4-4-(Piperidyl)butanoyl-glycyl-aspartyl-tryptophan, d. h. die in der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0479,481 offenbarte Verbindung. Tabelle 6
    Beispiel Nummer Inhibierung der fixierten Verbindung von Thrombozytenaggregation (IC50 μM) Dosis (mg/kg) Inhibierung der ADP-induzierten Ex-vivo-Thrombozytenaggregation % Inhibierung der Ex-vivo-Thrombozytenaggregation nach oraler Verabreichung
    1h 3h 6h 12h 24h
    15 0,097 5 100 100 100 98 50
    (Verbindung aus EPA '481) 0,047 5 53 < 20
  • Dem Fachmann wird einleuchten, daß die vorliegende Erfindung sich gut für die Bewältigung der Aufgaben der Erfindung eignet, sowie zum Erreichen der erwähnten Ziele und Vorteile, sowie den diesen eigenen. Die hier beschriebenen Verbindungen, Zusammensetzungen und Verfahren werden als repräsentativ für die bevorzugten Ausführungsformen angeführt bzw. sollen als beispielhaft gelten, und sollen den Umfang der vorliegenden Erfindung nicht einschränken.
  • Schlüssel zu Figuren
  • Fig. 1–Fig. 5
    2-Theta-Scale 2-Theta-Skala
    Decimal points Decimal commas
    Fig. 6 + Fig. 7
    TIME, HOUR ZEIT, STUNDE
    Fig. 8
    TIME, HOUR ZEIT, STUNDE
    RH RF
    Fig. 9
    WEIGHT GAIN GEWICHTSZUNAHME
    RH RF

Claims (7)

  1. Verbindung, bei der es sich um nichthygroskopisches kristallines N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz davon handelt.
  2. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend die Verbindung nach Anspruch 1 und einen pharmazeutisch unbedenklichen Träger.
  3. Verfahren zur Herstellung von nichthygroskopischem kristallinem N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid nach Anspruch 1, bei dem man hygroskopisches kristallines N-[N-[N-(4-Piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyclohexylalaninamid relativen Feuchtigkeiten von 40% bis 100% und einer Temperatur von 20°C bis 80°C aussetzt.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei man die Verbindung relativen Feuchtigkeiten von 65% bis 80% aussetzt.
  5. Verfahren nach Anspruch 3, wobei man die Verbindung einer Temperatur von 40°C bis 80°C aussetzt.
  6. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Aussetzen unter statischen Bedingungen geschieht.
  7. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Aussetzen unter dynamischen Bedingungen geschieht.
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