DE69720473T2

DE69720473T2 - Verfahren zur reinigung von nukleinsäuren

Info

Publication number: DE69720473T2
Application number: DE69720473T
Authority: DE
Inventors: B. Lee BUSSEY; Robert San Pablo ADAMSON; Alan Atchley
Original assignee: Urigen Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Urigen Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1996-08-01
Filing date: 1997-07-31
Publication date: 2004-05-06
Anticipated expiration: 2017-08-01
Also published as: AU4049097A; WO1998005673A8; AU717136B2; JP3492702B2; DK0923592T3; ATE236183T1; EP0923592A1; EP0923592B1; WO1998005673A1; CA2261150C; US6011148A; DE69720473D1; CA2261150A1; JP2000500028A

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von hochreinen Nukleinsäuren. Die Erfindung betrifft besonders die Herstellung von Nukleinsäuren mit pharmazeutischer Qualität. Die Erfindung betrifft insbesondere Verfahren zur Herstellung von Plasmid-DNA mit pharmazeutischer Qualität.
Hintergrund der Erfindung
Seit dem Beginn rekombinanter DNA wurden Verfahren zur Reinigung von DNA und RNA zur Förderung molekularbiologischer Forschung entwickelt und verbessert. Obwohl diese Verfahren im Umfeld der Forschung ein beachtliches Studium von Nukleinsäuren ermöglicht haben, haben sie keine Themen angesprochen, welche die klinische Verwendung gereinigter Nukleinsäuren beim Menschen betreffen, so wie es für viele gegenwärtige Gentherapieprotokolle erforderlich ist.
Die Gentherapie betrifft das Einführen von Nukleinsäuren in Patientenzellen, welche, wenn sie exprimiert werden, dem Patienten einen therapeutischen Vorteil verschaffen. Beispiele schließen das Einbringen eines exogenen funktionellen Gens ein, um einen Gendefekt in einem Patienten, der ein defektes Gen trägt, zu korrigieren, oder um ein Gen zu kompensieren, welches nicht ausreichender stark exprimiert wird. Andere Beispiele schließen das Einbringen von mutierten Genen, Antisensesequenzen oder Ribozymen ein, um eine genetische Funktion zu blockieren, z. B. bei der Behandlung viraler Infektionen oder von Krebs.
Ein Hauptinteresse bei der Gentherapie galt der Verwendung viraler Vektoren, insbesondere retroviraler Vektoren, zum Einbringen exogener Nukleinsäuren in Patientenzellen. Bislang sind die meisten dieser Protokolle für eine ex vivo-Gentherapie gewesen, wobei die Zellen des Patienten zuerst vom Patienten entnommen werden, ex vivo genetisch modifiziert werden, und dann dem Patienten wieder verabreicht werden. Die Alternative zur ex vivo-Gentherapie ist die in vivo-Gentherapie. In vivo-Gentherapie betrifft das Einbringen eines exogenen genetischen Potentials direkt in den Patienten, wo es von den Zielzellen aufgenommen wird, welche dann das eingebrachte Gen exprimieren und ein therapeutisches Produkt produzieren. Es wurden virale Vektoren für die in vivo-Gentherapie verwendet, obwohl deren Verwendung mit einer Vielzahl von Nachteilen verbunden ist, z. B. der Immunogenität des viralen Vektors und Sicherheitsbedenken, wie etwa eine Insertionsmutagenese oder eine virale Kontamination.
Andere Mittel zur in vivo-Genlieferung schließen das Einbringen von nackter DNA in eine Zielzelle von Interesse oder die Verwendung einer lipidvermittelten DNA-Lieferung ein. Normalerweise wird das Einbringen nackter DNA verwendet werden, wenn das exogene genetische Potential direkt in das Zielgewebe eingebracht werden soll. Durch Komplexieren mit Liposomen oder Lipiden wird die DNA komprimiert, was eine systemische Lieferung der Lipid/DNA-Komplexe zu verschiedenen interessierenden Geweben erlaubt. Siehe PCT-Patentanmeldung WO 93/25673. Lipid/DNA-Komplexe können durch Veränderung der Lipidzusammensetzung, des Lipid/DNA-Verhältnisses, der Art der Verabreichung usw. gezielt zu bestimmten Geweben geliefert werden.
Für jede Applikation, bei der eine Nukleinsäure in einen Patienten eingeführt wird, besteht ein Bedarf, eine hochreine Nukleinsäure mit pharmazeutischer Qualität herzustellen. Solch eine gereinigte Nukleinsäure muss Arzneimittelqualitätsstandards zur Sicherheit, Potenz und Wirksamkeit erfüllen. Außerdem ist es wünschenswert, ein im Maßstab veränderliches Verfahren zu haben, welches verwendet werden kann, um große Mengen von DNA herzustellen, z. B. im Bereich von Hunderten von Milligramm bis zu Hunderten von Gramm. Somit ist es wünschenswert, ein Verfahren zur Herstellung hochreiner Nukleinsäure zu haben, welches keine toxischen Chemikalien, bekannten Mutagene, organische Lösungsmittel oder andere Reagenzien verwendet, welche der Sicherheit oder Effizienz der resultierenden Nukleinsäure schaden oder eine Maßstabsvergrößerung schwierig oder nicht praktizierbar machen. Es ist auch wünschenswert, Nukleinsäuren herzustellen, die frei von kontaminierenden Endotoxinen sind, welche eine toxische Antwort auslösen können, wenn sie einem Patienten verabreicht werden. Die Entfernung von kontaminierenden Endotoxinen ist besonders wichtig, wenn die Nukleinsäure aus gramnegativen Bakterienquellen aufgereinigt wurde, z. B. Plasmid- oder Bakteriophagen-DNA, welche hohe Mengen an Endotoxinen besitzen.
Die unten beschriebene Erfindung erfüllt diese Bedürfnisse und stellt ebenso andere verwandte Vorteile bereit.
Relevante Literatur
Lis et al. (1975) Nucleic Acids Res. 2: 383–389 beschreiben auf Polyethylenglykol basierende DNA-Reinigungsverfahren. Zasloff et al., (1978) Nucleic Acids Res. 5: 1139–1153 beschreiben eine Säurephenolreinigung von Plasmid-DNA. Sambrook et al., (1989) „Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschreiben mehrere verschiedene Verfahren für Plasmid-DNA-Reinigung in Forschungsqualität in einem relativ kleinen Maßstab. Ausubel et al., Ed. (1989) „Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, offenbaren auch verschiedene Verfahren für Methoden mit relativ kleinem Maßstab zur Reinigung von Plasmid-DNA zur Forschungszwecken.
Chandra et al. (1992) Anal. Biochem. 203: 169–172 beschreiben die Verwendung von Hi-Load-Q-Sepharose-Säulenchromatographie zur Herstellung von Plasmid-DNA. Marquet et al., (1995) BioPharm September 1995: 26–37 und Horn et al., (1995) Hum. Gene Therapy 6: 565–573 diskutieren Themen zur Verfahrensentwicklung und Techniken, einschließlich die Verwendung von Polyethylenglykol und Gelfiltration/Größenausschlusschromatographie, um Plasmid-DNA herzustellen. Davis et al., (1996) BioTechniques 21: 92–99 vergleichen Cäsiumchlorid-gereinigte und Anionenaustausch-gereinigte Plasmid-DNA hinsichtlich der Gentransfereffizienz. Hochleistungsflüssigchromatographie unter Verwendung von Anionenaustauschchromatographieharzen zur Reinigung von Plasmid-DNA werden in Thompson (1996) BioChromatography 1(2): 68–80 und Coppella et al., (1987) J. Chromatography 402: 189–199 beschrieben.
Die Prinzipien, Theorie und Vorrichtungen, die für eine Tangentialflussfiltration verwendet werden, werden in Michaels, S. L. et al., "Tangential Flow Filtration" in „Separations Technology, Pharmaceutical and Biotechnology Applications", W. P. Olson, Ed., Interpharm Press, Inc., Buffalo Grove, IL (1995) beschrieben. Verfahren zur Entfernung von Endotoxin aus biologischen Proben werden in Sharma, (1986) Biotech. and Applied Biochem. 8: 5–22; Vanhaecke, et al., (1989) J. Clin. Microbiol. 27(12): 2710–2712; Weiss et al., Sartorius Corporation, "Developing Methods #7", "Endotoxin Removal", Edgewood, NY; Talmadge et al., (1989) J. Chromatography 476: 175–185 und Hou et al., (1990) Biotech. and Applied Biochem. 12: 315-324 beschrieben. Montbriand et al., (1996) J. Biochtechnology 44: 43–46, beschreiben die Entfernung von Endotoxin aus DNA unter Verwendung von Polymyxin-B-Harz.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist auf ein Verfahren zur Reinigung einer Nukleinsäure aus einer Lösungen gerichtet, umfassend Filtrieren der Lösung durch eine Ultrafiltrationseinheit, umfassend eine Gelschicht, um eine Permeat-Lösung und eine Retentat-Lösung bereitzustellen, wobei die Nukleinsäure in der Retentat-Lösung zurückgehalten wird, und Sammeln der Retentat-Lösung, um eine gereinigte Nukleinsäurelösung bereitzustellen.
Bevorzugt ist die Nukleinsäure DNA, insbesondere virale oder Plasmid-DNA. Die Ultrafiltrationseinheit ist bevorzugt eine offenkanalige, flache Plattenvorrichtung oder eine Hohlfaservorrichtung. Für die meisten Nukleinsäuren sollte die Ültrafiltrationsmembran einen Molekulargewichts-Abtrennung von zwischen 1 K und 1000 K besitzen, bevorzugt um 50 K bis 500 K für Plasmid-DNA, und am meisten bevorzugt um 300 K bis 500 K. Höhere Reinheiten werden erhalten, wenn die Ultrafiltration unter Bedingungen durchgeführt wird, wobei eine Gelschicht gebildet werden kann. Die Gelschicht kann sich für bis zu etwa 90 min bilden, unter Verwendung eines Drucks von etwa 5 psi (34,5 kPa) bis etwa 30 psi (206,8 kPa), bevorzugt um 10 psi (68,9 kPa) bis 20 psi (137,9 kPa). Die Nukleinsäurelösung kann während des Ultrafiltrationsschrittes im Bereich von etwa 2-fach bis etwa 50-fach aufkonzentriert werden.
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen wird die Plasmid-DNA nach der Tangentialflussultrafiltration durch Filtrieren der Retentat-Lösung durch einen 0,2 μm-Filter und Applizieren der filtrierten Plasmid-DNA-Lösung auf ein positiv geladenes lonenaustausch-Chromatographieharz weiter aufgereinigt werden, worin die Plasmid-DNA vom lonenaustauschchromatographieharz mit einem Salzgradienten eluiert wird. Die gereinigte Plasmid-DNA kann durch einen zusätzlichen Diafiltrationsschritt weiter aufgereinigt werden, und gegebenenfalls weiter aufkonzentriert und/oder in einen Puffer ausgetauscht werden, der für die beabsichtigte Verwendung der gereinigten Plasmid-DNA geeignet ist.
Die Erfindung stellt weiterhin eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, umfassend die Nukleinsäure, hergestellt durch das erfindungsgemäße Verfahren. Die pharmazeutische Zusammensetzung ist bevorzugt Plasmid-DNA und umfasst weniger als etwa 100 Endotoxineinheiten pro Milligramm Nukleinsäure, weniger als etwa 2% RNA, weniger als etwa 1% Einzelstrang- DNA, weniger als etwa 0,1% Protein, weniger als etwa 1% genomische DNA und mehr als 90% geschlossene zirkuläre Plasmid-DNA.
Es ist ein Vorteil der vorliegenden Erfindung, dass Nukleinsäure ohne die Verwendung organischer Lösungsmittel, einschließlich Phenol, Chloroform, Ether, Ethanol, Isopropanol, Isoamylalkohol, n-Butanol oder anderen organischen Lösungsmitteln hergestellt wird. Die Verwendung solcher Lösungsmittel wirft aufgrund der Möglichkeit von Spurenmengen im Endprodukt Sicherheits- und Kontrollbedenken auf. Außerdem sind solche Lösungsmittel toxisch und entflammbar und werfen schwere Risiken und Entsorgungsprobleme auf, wenn sie in den Mengen verwendet werden, die für eine Reinigung im großen Maßstab erforderlich sind. Die gereinigte Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung ist auch im Wesentlichen frei von kontaminierendem Endotoxin.
Es ist auch ein Vorteil der vorliegenden Erfindung, dass eine Nukleinsäure, hergestellt durch das erfindungsgemäße Verfahren, hochrein ist. Eine hochreine Nukleinsäure ist vorteilhaft wegen Sicherheitsgründen, ebenso wie für eine Verbesserung der Reproduzierbarkeit und Wirksamkeit von Verfahren, die eine solche Nukleinsäure verwenden. Insbesondere wird die hochreine DNA der vorliegenden Erfindung vorteilhaft für eine Genlieferung unter Verwendung von Lipidträgern verwendet, wobei reproduzierbare hohe Transfektionseffizienzen erhalten werden.
Besondere bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden genaueren Beschreibung bestimmen bevorzugter Ausführungsformen und der Ansprüche offensichtlich werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine schematische Darstellung eines Tangentialfluss-Ultrafiltrationsverfahrens.
2 veranschaulicht eine schematische Darstellung einer Plasmid-DNA-Reinigung in großem Maßstab, wie in Beispiel 1 beschrieben.
3 ist eine schematische Darstellung des Plasmids p4119.
4 ist eine graphische Darstellung von HPLC-Analysen einer p4119-Präparation vor TFU (Feld A) und der Retentat-Fraktion, erhalten nach TFU (Feld B), wie in Beispiel 1 beschrieben.
5 zeigt die Ergebnisse einer Agarosegelelektrophorese eines p4119-Endreinigungsprodukts, wie in Beispiel 1 beschrieben. Von links nach rechts sind die Spuren: (a) Molekulargewichtsmarker, (b) p4119 viermal geschnitten, (c) p4119 zweimal geschnitten, (d) p4119 einmal geschnitten und (e) p4119 nicht geschnitten.
6 ist eine graphische Darstellung einer HPLC-Analyse des Endprodukts der in Beispiel 1 beschriebenen p4119-Reinigung.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen Definitionen:
"Diafiltration" ist eine Betriebsweise eines Ultrafiltrationssystems, worin das Retentat kontinuierlich rückgeführt und mit frischer Waschlösung verdünnt wird, um das als Permeat entfernte zu ersetzen. Diafiltration wird im Allgemeinen eine reinere Auftrennung von Makromolekülen ermöglichen, die in der Retentatprobe zurückgehalten werden, während die kleineren Moleküle in das Filtrat durchlaufen. Sie kann auch verwendet werden, um eine Lösungsmittelentfernung oder einen Pufferaustausch im gleichen Schritt durchzuführen. "Kontinuierliche Diafiltration" bezieht sich auf die kontinuierliche Zugabe von frischem Waschpuffer, wenn die Filtration stattfindet. "Nicht kontinuierliche Diafiltration" bezieht sich auf die wiederholten Schritte von Aufkonzentrieren der Probe durch Ultrafiltration und Wiederverdünnen mit Puffer.
Eine "Gelschicht" bezieht sich auf eine dünne gelatineartige Schicht von Biomolekülen, die sich auf oder in einer Ultrafiltrationsmembran bilden kann. Die Gelschicht ist im Allgmeinen eine kohäsive adhärente Schicht aus einer konstanten Konzentration gelöster Stoffe, normalerweise auch als Konzentrationspolarisation bezeichnet. Sie wird normalerweise ein gewisses Ausmaß einer hydraulische Permeabilität besitzen, in Abhängigkeit der Natur des gelösten Stoffs, der die Schicht bildet. "Gelschicht-kontrollierte" Ultrafiltration bezeichnet Filtrationsbedingungen, worin die Gelschicht der limitierende Faktor für die Fließgeschwindigkeit des Filtrats wird und weitere Drucksteigerungen einen geringen oder keinen Effekt besitzen. Im Gegensatz dazu sind "Membran-kontrollierte" Bedingungen solche Bedingungen, worin die Fließgeschwindigkeit des Filtrats durch die Permeabilität der Membran und den angewendeten Druck gesteuert wird.
Ein "offenkanaliger" Filter ist ein Filter, welcher kein Sieb im Zufuhrkanal besitzt. Im Gegensatz dazu ist ein "Siebkanal" oder ein "geschlossener Kanal" ein Filter, der ein Sieb im Zufuhrkanal besitzt.
"Permeat" bezieht sich auf den Teil einer Probe, der durch die Ultrafiltrationsmembran durchläuft und wird auch das "Filtrat" genannt. "Retentat" bezieht sich auf den Teil einer Probe, der nicht durch die Ultrafiltrationsmembran durchläuft.
"Tangentialfluss"- oder "Querstrom"-Filtration bezeichnet ein Filtrationsverfahren, worin die Probenlösung über das obere Ende der Membran zirkuliert, während ein angelegter Druck verursacht, dass gelöste Stoffe und kleine Moleküle durch die Membran durchgehen.
"Ultrafiltration" bezeichnet ein Verfahren zur Trennung von Partikeln durch Filtration durch Membranen mit Porengrößen im Bereich von etwa 0,001 um bis etwa 0,05 um. Ultrafiltrationsmembranen besitzen normalerweise eine Molekulargewichts-Abtrennung (MWCO "molecular weight cut-off") im Bereich von 1000 bis 1.000.000 Dalton. Die MWCO ist normalerweise definiert als das Molekulargewicht der kugelförmigen gelösten Stoffe, welches zu 90% von dieser Membran zurückgehalten wird. Siehe Filtron Katalog, 1995/96, S.5. Das tatsächliche Molekulargewicht der Partikel, die durch die Membran durchgehen oder von der Membran zurückgehalten werden, wird sowohl von der Größe als auch von der Konformation und Ladung eines gegebenen Moleküls, der Natur oder der Membranporen oder Matrix und der Leitfähigkeit und dem pH der Lösung abhängen.
Es wurde nun gefunden, dass Nukleinsäuren aus einem Gemisch von Substanzen, einschließlich Proteinen, Zelltrümmern, Endotoxin, kleinen degradierten Nukleotiden und dergleichen durch Tangentialfluss-Ultrafiltration (TFU) hochrein erhalten werden kann. Dieses Verfahren ist einfach, effizient und ergibt in einem einzelnen Schritt Nukleinsäuren mit sehr hoher Reinheit, oft an die Grenze von 95% bis 100% Reinheit durch HPLC-Analyse. Es wird auch mit einer Diafiltration bequem in einem einzelnen Schritt kombiniert, wobei die Nukleinsäurelösung aufkonzentriert werden kann und/oder in eine andere Pufferlösung ausgetauscht werden kann, um Lösungsmittel, Salze und dergleichen zu entfernen.
Nukleinsäuren, die gemäß den hierin beschriebenen Verfahren gereinigt und/oder aufkonzentriert werden können, schließen DNA, RNA und chimäre DNA/RNA-Moleküle ein, und können aus jeder biologischen Quelle, einschließlich eukaryontischen und prokaryontischen Zellen stammen, oder können synthetisch sein. Nukleinsäuren, welche gereinigt werden können, schließen chromosomale DNA-Fragmente, ribosomale RNA, mRNA, snRNAs, tRNA, Plasmid-DNA, virale RNA oder DNA, synthetische Oligonukleotide, Ribozyme und dergleichen ein. Bevorzugt sind virale Nukleinsäuren und extrachromosomale DNAs. Von besonderem Interesse sind Plasmid-DNAs, die für therapeutische Gene codieren. Von "therapeutischen Genen" sollen funktionelle Gene oder Genfragmente eingeschlossen werden, welche in einer geeigneten Wirtszelle exprimiert werden können, um ein defektes oder unterexprimiertes Gen in der Wirtszelle zu ergänzen, ebenso wie Gene oder Genfragmente, welche die Funktion eines Gens in der Wirtszelle inhibieren oder hemmen, wenn sie exprimiert werden, einschließlich z. B. Antisense-Sequenzen, Ribozyme, transdominante Inhibitoren und dergleichen.
Somit können z. B. virale DNA oder RNA aus prokaryontischen oder eukaryontischen Viren gereinigt werden, worin die vitalen Partikel anfänglich aus Kulturen oder Zellen gereinigt werden, die einer viralen Infektion zugänglich sind, in Übereinstimmung mit konventionellen Verfahren, z. B. aus bakteriellen, Insekten-, Hefe-, Pflanzen- oder Säugetierzellkulturen. Extrachromosomale DNAs schließen autonom replizierende DNAs von einer Vielzahl von Quellen ein, einschließlich z. B. Säugetierzellen (siehe z. B. Yates et al., Nature (1985) 313: 812–815; Heinzel et al., Mol. Cell. Biol. (1991) 11(4): 2263–2272), Pflanzenzellen, Hefezellen (z. B. 2 um Plasmide) und prokaryontische Zellen. Aus prokaryontischen Zellen isolierte Plasmid-DNA schließt sowohl natürlich vorkommende Plasmide als auch rekombinante Plasmide ein, die für ein interessierendes Gen codieren, einschließlich z. B. Markergene oder therapeutischer Gene.
Eine anfängliche präparative Reinigung der Nukleinsäureprobe vor der Tangentialfluss-Ultrafiltration wird von der Quelle der Nukleinsäure und dem Ausmaß der erwünschten Reinheit abhängen. Idealerweise werden viele Verunreinigungen durch einen oder mehrere grobe Reinigungsschritte vor der Tangentialfluss-Ultrafiltration entfernt, um die Anzahl von kontaminierenden Partikeln zu verringern, welche die Ultrafiltrationsmembran verstopfen könnten, die Durchführung behindern könnten und die Menge von allen größeren Verunreinigungen verringert, die mit der Nukleinsäure zurückgehalten werden würden. Für Nukleinsäuren, die aus biologischen Quellen erhalten werden, z. B. Geweben und Zellen, einschließlich Zelllinien, Säugetier-, Hefe-, Pflanzen- oder bakteriellen Zellen, können anfängliche präparative Schritte durchgeführt werden, um Zellen zu lysieren und Zellkomponenten, z. B. Proteine, Zellwände oder Membranen zu entfernen, unter Verwendung konventioneller Verfahren, die Fachleuten bekannt sind. Siehe z. B. Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1989. Zur Reinigung von extrachromosomaler DNA, wie etwa Plasmid-DNA, ist es wünschenswert, Verfahren zu verwenden, welche chromosomale DNA nicht scheren, deren Entfernung einfacher machen und eine Kontamination mit dem Plasmid-DNA-Endprodukt vermeiden. Somit kann z. B. Plasmid-DNA aus bakteriellen Quellen unter Verwendung konventioneller Verfahren, einschließlich Lyse mit Alkali und/oder Detergenzien, z. B. SDS, NP40, Tween 20 etc., gefolgt von einer Präzipitation von Proteinen, chromosomaler DNA und Zelltrümmern isoliert werden. Zur Reinigung extrachromosomaler DNA aus Säugetierzellen kann z. B. eine konventionelle Hirt-Extraktion verwendet werden. Hirt, B., (1967) J. Mol. Biol. 26: 365–369. Für synthetische Nukleinsäuren kann wenig oder keine Vorbehandlung vor der TFU notwendig sein.
Falls eine Nukleinsäure mit pharmazeutischer Qualität erwünscht ist, ist es höchst bevorzugt, dass die präparativen Schritte nicht die Verwendung von organischen Lösungsmitteln oder toxischen Chemikalien einschließen, welche Sicherheits- und Kontrollbedenken auslösen können. Beispiel 1 unten erläutert ein Verfahren zur Herstellung hochreiner Plasmid-DNA mit pharmazeutischer Qualität, ohne die Verwendung von organischen oder toxischen Chemikalien unter Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung.
1 ist eine schematische Darstellung eines Tangentialfluss-Ultrafiltrationsverfahrens. Kurz, der Zufuhrtank 10 umfasst die zu filtrierende Probenlösung. Die Lösung tritt in die Filtrationseinheit 50 durch den Zufuhrkanal oder die Zufuhrleitung 20 ein. Die Umlaufpumpe 30, lokalisiert in der Zufuhrleitung 20, kontrolliert den Lösungsfluss. Die Filtrationseinheit 50 umfasst die Ultrafiltrationsmembran. Eine Filtration durch die Ultrafiltrationsmembran trennt die Probenlösung in eine Permeat-Lösung und eine Retentat-Lösung. Die Permeat-Lösung verlässt die Einheit durch den Permeatkanal oder die Permeatleitung 60. Der Fluss durch den Permeatkanal kann durch ein Permeatventil gesteuert werden, lokalisiert im Permeatkanal 60. Die Retentat-Lösung fließt in den Retentatkanal oder die Retentatleitung 90, welche in den Zufuhrtank 10 zurückzirkuliert. Der Druck über die Ultrafiltrationsmembran (Transmembrandruck oder TMP) wird durch Druckdetektoren im Zufuhrkanal 40 und im Retentatkanal 80 gemessen. Der TMP wird durch Anpassen des Retentatventils 100 angepasst. Wenn die TFU im Diafiltrationsmodus durchgeführt wird, wird der Diafütrationspuffer 110 zu der Probenlösung im Zufuhrtank 10 zugegeben. Aber wenn eine TFU verwendet ist, um die Probenlösung aufzukonzentrieren, wird der Diafiltrationspuffer 110 nicht zu dem Zufuhrtank 10 zugegeben. Die Systemsteuerung kann manuell oder automatisiert sein, mit Drucksensoren, Durchflussmessern, zwischengeschalteten Leitfähigkeitsmessern und anderen Regelkreisen.
Die Ultrafiltrationsmembran wird ausgewählt werden, basierend auf der Größe und Konformation der zu reinigenden Nukleinsäure, und wird normalerweise eine Molekulargewichts-Abtrennung (MWCO) im Bereich von 1 K bis 1000 K Dalton besitzen. Viele Plasmid-DNAs in Supercoil-Form können Ultrafiltrationsmembranen mit einem MWCO um 300 K bis 500 K Dalton verwendet werden. Aber für einige größere Plasmide wird eine verbesserte Geschwindigkeit, Reinheit und Qualität der resultierenden DNA erhalten, wenn Membranen mit größerem MWCO verwendet werden. Bevorzugt werden deshalb Plasmid-DNAs mit Größen im Bereich von etwa 2 Kb bis 15 Kb unter Verwendung von Ultrafiltrationsmembranen mit einem MWCO von 300 K Dalton gereinigt; Plasmids im Bereich von etwa 15 Kb bis etwa 50 Kb können unter Verwendung von Membranen mit einem MWCO von 500 K Dalton gereinigt werden; und Plasmide von etwa 40 Kb oder größer können unter Verwendung von Membranen mit einem MWCO von 1000 K Dalton gereinigt werden. Mit einigen Hohlfaser-Ultrafiltrationsvorrichtungen, z. B. diejenigen mit symmetrischen Poren, können größere nominelle Porengrößen verwendet werden. Z. B. kann Plasmid-DNA von bis zu etwa 5 Kb unter Verwendung von Membranen mit bis zu 500 K Dalton MWCO in einer Hohlfaservorrichtung gereinigt werden.
Unter diesen Bedingungen wird die Plasmid-DNA im Retentat zurückgehalten, während kontaminierende Substanzen, einschließlich vieler Proteine, Zellmembrantrümmer, Kohlenhydrate, kleiner degradierter Nukleotide usw. durch die Membran in das Filtrat durchgehen. Kleinere Nukleinsäuren, z. B. kleine synthetische Oligonukleotide, können unter Verwendung von Ultrafiltrationsmembranen mit einem MWCO von um 1 K bis 5 K Dalton gereinigt werden. Für jede zu reinigende Nukleinsäure kann die optimale Membranporengröße empirisch bestimmt werden unter Verwendung von Vorrichtungen für einen kleinen Maßstab, z. B. Zentrifugations-Vorrichtungen, Rührzellvorrichtungen oder Kleinmaßstab-Hohlfasersysteme, erhältlich von einer Vielzahl von kommerziellen Herstellern. Es kann ein vielfältiges System verwendet werden zur Optimierung von Parametern in der Entwicklung eines Prozessmaßstabs. Kommerzielle Quellen für Ultrafiltrationsvorrichtungen schließen Pall-Filtron (Northborough, MA), Millipore (Bedford, MA) und Amicon (Danvers, MA) ein.
Viele Typen von Ultrafiltrationsvorrichtungen, die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, sind kommerziell erhältlich, einschließlich z. B. eine Flachplattenvorrichtung, eine spiralförmig gewickelte Patrone, eine Hohlfaser-, eine tubuläre oder eine Einzelblattvorrichtung. Siehe Michaels et al., (1995). Bevorzugt ist die Ultrafiltrationseinheit eine Flachplattenvorrichtung oder eine Hohlfaservorrichtung.
Es wurde gefunden, dass das Scheren von Nukleinsäure minimiert wird, wenn die für die TFU verwendete Filtrationsvorrichtung eine offenkanalige Vorrichtung ist. Abgeschirmte Kanäle hemmen die Bildung einer Gelschicht und es wurde gefunden, dass sie die zurückgehaltene Nukleinsäure scheren und die Ausbeute verringern. Abgeschirmte Kanäle können aber mit einer minimalen Kompression der Scheiben entworfen werden, so dass die Scherung und der Verlust der Nukleinsäure minimiert werden kann.
Die Oberfläche der verwendeten Ultrafiltrationsmembran wird von der Menge zu reinigender Nukleinsäure abhängen. Im Allgemeinen werden etwa 10 Quadratfuß Membran pro g Nukleinsäure verwendet. Somit werden etwa 5 Quadratfuß Membran pro 200 bis 800 mg Nukleinsäure verwendet; normalerweise werden etwa 5 Quadratfuß Membran für 400 bis etwa 600 mg Nukleinsäure verwendet.
Die Membran kann aus einem gering bindenden Material bestehen, um adsorptive Verluste zu minimieren, und sollte dauerhaft, zu reinigen und mit den zu verwendenden Puffern chemisch kompatibel sein. Eine Anzahl geeigneter Membranen sind kommerziell erhältlich, einschließlich z. B. Zelluloseacetat, Polysulfon, Polyethersulfon und Polyvinylidendifluorid. Bevorzugt ist das Membranmaterial Polyethersulfon.
Es wurde gefunden, dass höhere Ausbeuten und Reinheiten erhalten werden, wenn an der Membranoberfläche vor Beginn der TFU eine Gelschicht gebildet werden kann. Somit wird die Probenlösung anfänglich durch die Ultrafiltrationsvorrichtung 50 zirkuliert, wobei das Permeatventil 70 offen ist und die Permeat-Lösung wird in den Zufuhrtank 10 wieder zurück zirkuliert, für eine Zeit, die zur Bildung einer Gelschicht ausreicht. Die Menge an für eine Gelschichtbildung benötigter Zeit kann empirisch bestimmt werden durch Überwachen der Permeat-Lösung auf Produktverlust, z. B. durch HPLC-Analyse. Die Gelschicht ist angemessen, wenn der Produktverlust in das Permeat ausreichend gering ist. Unter bevorzugten Bedingungen agiert die Gelschicht als eine zweite Membranbarriere, welche Nukleinsäuremoleküle, die normalerweise durch die Membran durchgehen würden, zurückhält. Aber es ist nicht notwendig, die Ultrafiltration unter Bedingungen durchzuführen, z. B. Druck und Zufuhr, welche vollständig von der Gelschicht gesteuert sind. Wie hierin verwendet, bedeutet somit eine Filtration in Gegenwart einer Gelschicht, dass ausreichend Gelschicht vorhanden ist, um eine zusätzliche Feststoffretention zu verursachen über die allein von der Ultrafiltrationsmembran verursachte hinaus.
Normalerweise kann sich die Gelschicht für ungefähr 5 bis 90 min bilden, bevorzugt um 20 bis 60 min, in Abhängigkeit von der Vorrichtung und der Größe der Nukleinsäure. Unter Verwendung einer Flachplattenvorrichtung zur Reinigung kleiner Plasmid-DNAs (z. B. 2 Kb) wird die Gelschicht z. B. in etwa 60 bis 90 min gebildet sein; für größere Plasmid-DNAs (z. B. 2–7 Kb) wird die Gelschicht in etwa 30 min gebildet sein. Unter Verwendung einer Hohlfaservorrichtung kann die Gelschicht für die meisten Plasmid-DNAs in ungefähr 5 bis 30 min gebildet sein, oder für Plasmid-DNAs mit weniger als etwa 2 Kb in bis zu 45 min. Nach der Bildung der Gelschicht wird die Permeatleitung 60 in einen Abfallbehälter entleert und die Filtration kann fortgesetzt werden.
Wenn sich während einer anfänglichen Zirkulationsperiode keine Gelschicht bilden kann, wird normalerweise Produkt durch einen Schwund in die Permeat-Lösung verloren gehen. Die Menge des Produktverlustes wird vom Typ der verwendeten Vorrichtung, der Membran MWCO und der Gesamtmenge an Nukleinsäure in der Probe abhängen. Somit kann unter Umständen, wo die Produktausbeute nicht kritisch ist, die Filtration ohne eine anfängliche Zirkulationsperiode durchgeführt werden, während sich die Gelschicht bildet. In solchen Fällen kann sich die Gelschicht während der anfänglichen Filtrationsperiode bilden, wonach ein Produktschwund in die Permeat-Lösung abnehmen wird und das Produkt dann in der Retentat-Lösung zurückgehalten wird. Da in einer Hohlfaservorrichtung eine Gelschicht in einer kurzen Zeitperiode gebildet werden kann (z. B. etwa 5 min für Plasmid-DNA von 5 Kb und etwa 150 mg DNA/Quadratfuß) kann beispielsweise der Produktverlust während der anfänglichen Periode der Gelbildung nicht wesentlich sein und deswegen kann eine Rückzirkulation der Permeat-Lösung in den Zufuhrtank, während sich die Gelschicht bildet, nicht notwendig sein.
Die Filtration wird unter Verwendung des Tangentialflusses durchgeführt werden, um den Probenpuffer zu zirkulieren, wenn er die Membranoberfläche kreuzt. Während einer Tangentialflussfiltration wird Druck über die Membran ausgeübt, was kleineren Molekülen erlauben wird, die Membran zu passieren, während das Retentat wieder zirkuliert wird. Normalerweise wird die Fließgeschwindigkeit so eingestellt sein, dass ein konstanter Transmembrandruck beibehalten wird. Die Fließgeschwindigkeit und der Druck werden normalerweise anfänglich wegen der Bildung einer Gelschicht schwanken. Im Allgemeinen wird die Filtration schneller voranschreiten mit einem höheren Druck und höheren Fließgeschwindigkeiten, aber höhere Fließgeschwindigkeiten verursachen wahrscheinlich ein Scheren der Nukleinsäure oder einen Verlust wegen der Passage durch die Membran. Außerdem können verschiedene TFU-Vorrichtungen bestimmte Druckbeschränkungen für deren Betrieb besitzen. Der Druck kann deshalb gemäß der Angabe des Herstellers eingestellt werden. Für Flachplattenvorrichtungen beträgt der Druck bevorzugt von etwa 5 psi (34,5 kPa) bis etwa 30 psi (206,8 kPa), am meisten bevorzugt im Bereich von 10 psi (68,9 kPa) bis 20 psi (137,9 kPa). Für die meisten Plasmid-DNAs sind 15 psi (103,5 kPa) bis 20 psi (137,9 kPa) bevorzugt. Die Zirkulationspumpe 30 wird ausgewählt sein, um eine minimale Scherung der Nukleinsäure sicherzustellen. Normalerweise ist die Zirkulationspumpe 30 eine peristaltische Pumpe oder eine Diaphragmapumpe im Zufuhrkanal 20, und der Druck wird durch Anpassen des Retentatventifs 100 gesteuert.
Die Filtration wird normalerweise im Diafiltrationsmodus durchgeführt. Gegebenenfalls kann die Probenlösung anfänglich ohne Zugabe von Puffer filtriert werden, bis sie auf das gewünschte Volumen aufkonzentriert ist. Wenn sie einmal aufkonzentriert ist, wird Diafiltrationspuffer 110 zugegeben und die Filtration wird fortgeführt, um die Retentat-Lösung von kontaminierenden kleinen Molekülen zu reinigen und unerwünschte Lösungsmittel und Salze zu entfernen. Die Diafiltration kann entweder kontinuierlich oder diskontinuierlich sein. Bevorzugt ist die Diafiltration kontinuierlich und wird durchgeführt, bis von etwa 5 bis etwa 500 Volumenäquivalente ausgetauscht worden sind, bevorzugt etwa 10 bis 100 Volumenäquivalente. Im Allgemeinen wird mit steigenden Kontaminanten, die an die Nukleinsäuren gebunden sind, verstärkt eine Diafiltration durchgeführt, in Abhängigkeit von der erforderlichen Reinheit.
Um die Ausbeute der gereinigten Nukleinsäure nach der TFU weiter zu verbessern, wird die Retentat-Lösung durch die Filtrationseinheit 50 mit geschlossenem Permeatventil 70 für mehrere Minuten rückzirkuliert, um restfiche Nukleinsäure zu entfernen. Die Retentat-Lösung wird gesammelt und zusätzlicher Diafiltrationspuffer 110 wird zugegeben, um den Membranfilter zur waschen. Normalerweise werden 1 oder 2 Volumenäquivalente Diafiltrationspuffer 110 verwendet, um den Membranfilter zu waschen. Das Retentat wird erneut gesammelt und mit der originalen Retentat-Lösung, welche die gereinigte Nukleinsäure enthält, vereinigt.
Durch Tangentialfluss-Ultrafiltration gereinigte Nukleinsäuren können direkt verwendet werden oder können weiter gereinigt werden, abhängig vom Ausmaß und Typ der Kontamination in der Startprobe und der gewünschten Verwendung. Normalerweise wird die durch Tangentialflussfiltration gereinigte Nukleinsäure eine Reinheit von mehr als 90%, oft mehr als 95% bis 100% besitzen, wie durch HPLC analysiert. Die so gereinigte Nukleinsäure kann für eine Anzahl von Anwendungen, z. B. molekularbiologische Anwendungen wie etwa Klonierung oder Genexpression oder für diagnostische Anwendungen unter Verwendung beispielsweise von PCR, RT-PCR, Dendromerbildung usw. verwendet werden.
Für therapeutische Verwendungen, z. B. einer Verwendung in der Gentherapie, kann es wünschenswert sein, die Nukleinsäure, die vom Tangentialflussfiltrationsschritt erhalten wird, weiter zu reinigen. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Nukleinsäureprobe, erhalten vom Tangentialflussfiltrationsschritt, nachfolgend durch einen 0,2 μm-Filter filtriert, unter Verwendung einer lonenaustauschchromatographie weiter gereinigt und gegebenenfalls erneut durch einen 0,2 μm-Filter filtriert. Es ist erstrebenswert, dass die Nukleinsäure weiter aufkonzentriert und unter Verwendung von Ultrafiltration diafiltriert wird und erneut durch einen 0,2 μm-Filter als einen letzten Sterilisationsschritt filtriert wird.
Eine Filtration durch 0,2 μm-Filter kann verwendet werden, um Endotoxin und Mikroorganismen zu entfernen, resultierend in einem minimalen Nukleinsäureverlust. 0,2 μm-Filter sind erhältlich von einer Vielzahl kommerzieller Quellen, einschließlich z. B. Pall-Filtron (East Hills, NY), Sartorius (Edgewood, NY) und Gelman (Ann Arbor, Ml). Idealerweise wird der verwendete Filter ein Filter sein, der Endotoxin bindet, während Nukleinsäure durchgehen kann. Es wurde gefunden, dass Pall Ultipor^® N₆₆ ^®-Filter Endotoxin mit einer hohen Ausbeute an Nukleinsäure weitgehend entfernen. Bevorzugt wird die Nukleinsäurelösung durch einen 0,45 μm-Filter vor der Filtration durch den 0,2 μm-Filter vorfiltriert. Filter, die für die Entfernung von Endotoxin hergestellt sind, z. B. lonenaustauschfilter, sind in vielen Fällen nicht geeignet für eine Verwendung bei der Nukleinsäurereinigung, weil die Nukleinsäure an den Filter binden wird.
Es kann eine lonenaustauschchromatographie verwendet werden, um die Nukleinsäure weiter zu reinigen, insbesondere von kontaminierendem Endotoxin, Spurproteinen und verbleibenden zellulären Verunreinigungen. Eine Chromatographiesäule wird mit einem Anionenaustausch-Chromatographieharz gepackt. Die optimale Kapazität der Säule wird empirisch bestimmt werden, bezogen auf das verwendete Harz und die Größe der zu reinigenden Nukleinsäure.
Ionenaustausch-Chromatographieharze sind kommerziell erhältlich, einschließlich von EM Separations (Gibbstown, NJ), BioSepra (Marlborough, MA), Polymer Laboratories (Amherst, MA), Perseptive Biosystems (Cambridge, MA), Taso Hass (Montgomeryville, PA) und Pharmacia (Uppsala, Schweden). Für die meisten Plasmid-DNAs sind bevorzugte Harze solche ohne Poren oder mit einen großen Porengröße, z. B. größer als 1000 A, bevorzugt um etwa 3000 A bis 4000 A; mit einer mittleren Perlengröße, z. B. etwa 20 bis 500 um Durchmesser; welche keine Matrixkomponenten auswaschen. Idealerweise ist das Harz auch waschbar, z. B. mit Natriumhydroxid, um eine wiederholte Verwendung zu ermöglichen.
Eine Chromatographiesäule wird mit einem Anionenaustausch-Chromatographieharz gepackt. Die optimale Kapazität der Säule wird empirisch bestimmt, bezogen auf das verwendete Harz und Größe der zu reinigenden Nukleinsäure. Die Säule wird unter einem geringen Druck gepackt, normalerweise weniger als etwa 7 bar. Der Druck wird vom verwendeten Harz abhängen und wird normalerweise entsprechend der Beschreibung des Herstellers sein. Der Säulendruck kann geringer sein, wo die Harzporengröße kleiner ist, um ein Einfangen der Nukleinsäure in den Harzporen zu beschränken. Somit kann der Säulendruck für Harze ohne Poren erhöht werden. Die Säule wird in Übereinstimmung mit konventionellen Verfahren bei etwa dem Zweifachen der erwarteten Fließgeschwindigkeit gepackt.
Die Nukleinsäureprobe wird auf die Säule geladen in einem Ladepuffer, umfassend eine Salzkonzentration unterhalb der Konzentration, bei der die Nukleinsäure aus der Säule eluieren wird. Normalerweise beträgt die Salzkonzentration etwa 10 bis 50 mS, in Abhängigkeit vom verwendeten Harz. Für schwächere Anionenaustauschharze wird eine Lösung mit geringerer Leitfähigkeit verwendet werden, wogegen für stärkere Anionenaustauschharze eine Lösung mit einer höheren Leitfähigkeit verwendet werden wird. Die Säule wird dann mit mehreren Säulenvolumen Puffer gewaschen, um diejenigen Substanzen zu entfernen, die schwach an das Harz binden. Dann werden Fraktionen aus der Säule eluiert unter Verwendung eines flachen kontinuierlichen Salzgradienten gemäß konventionellen Verfahren, z. B. unter Verwendung von bis zu 1,5 M NaCl in einem Tris-HCI-Puffer. Probenfraktionen werden von der Säule gesammelt. Für Präparationen mit mittlerem Maßstab (z. B. von etwa 100 mg bis etwa 3 g Nukleinsäure) werden die Fraktionen normalerweise mindestens 50 ml bis 2 l betragen, wo der Nukleinsäurepeak erwartet wird, dann im Volumen ansteigend nach dem erwarteten Peak. Analytische Bestimmungen der Nukleinsäureausbeute und -reinheit werden von jeder Fraktion durchgeführt. Außerdem können Limulus-Amöbozyten-Lysat(LAL)-Analysen mit jeder Fraktion durchgeführt werden, um restliche Endotoxinmengen in jeder Fraktion zu bestimmen. Fraktionen, die hohe Mengen an Nukleinsäure und geringes Endotoxin enthalten, werden vereinigt. Die resultierende Nukleinsäureprobe kann erneut durch einen 0,2 μm-Filter filtriert werden, in Abhängigkeit von den Endotoxinspiegeln und der gewünschten Reinheit.
Für viele Anwendungen wird es wünschenswert sein, die Nukleinsäure weiter zu reinigen, die Salzkonzentration der resultierenden Nukleinsäureprobe zu verringern, die Probe aufzukonzentrieren und/oder den Puffer gegen einen für nachfolgende Verwendungen geeigneteren Puffer auszutauschen. Ein abschließender Diafiltrationsschritt kann in diesem Stadium durchgeführt werden, um dieses Ergebnis zu erreichen. Falls erwünscht, kann eine kleinere MWCO-Ultrafiltrationsmembran für diesen nachfolgenden Diafiltrationsschritt verwendet werden, als zuvor für die Reinigung verwendet, da die Nukleinsäure in diesem Stadium hochrein ist und überwiegend kleine gelöste Moleküle durch die Membran in das Filtrat durchgegangen sind. Für viele Plasmid-DNAs wird eine 10 K bis 100 K MWCO-Membran verwendet. Hohlfaservorrichtungen mit einer MWCO-Membran mit etwa 100 K sind in diesem Stadium bevorzugt, insbesondere beim Handhaben konzentrierter Nukleinsäurelösungen, aufgrund geringerer Rückhaltevolumen, einem erhöhten Fluss, höheren Ausbeuten und geringeren Betriebszeiten.
Wo eine DNA, die gemäß dem obigen Protokoll gereinigt ist, mit einem Lipidträger für eine Verwendung in der Gentherapie komplexiert werden soll, ist es wünschenswert, die DNA in einen Puffer mit geringer Leitfähigkeit auszutauschen, bevorzugt durch Diafiltration. Ein Puffer mit geringer Leitfähigkeit soll jeden Puffer mit weniger als etwa 10 mS einschließen, bevorzugt mit weniger als etwa 1 mS.
An einer Vielzahl von Stellen im obigen Protokoll ist es vorteilhaft, analytische Bestimmungen der Nukleinsäureausbeute und -reinheit durchzuführen. Normalerweise werden solche Assays vor und nach jedem Reinigungsschritt durchgeführt, ebenso wie mit jeder Nukleinsäure-haltigen Fraktion von beispielsweise einer präparativen lonenaustausch-Chromatographie. Bevorzugte Mittel zur Durchführung dieser analytischen Bestimmungen schließen eine HPLC-Analyse der Reinheit, spektrophotometrische Abschätzung der Ausbeute, Silberfärbung und SDS- PAGE zur Proteinanalyse und eine Agarosegelelektrophorese und Southern Blotting zur DNA-Analyse ein.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen bestimmte Aspekte des oben beschriebenen Verfahrens und vorteilhafte Ergebnisse. Das folgende Beispiel wird zur Veranschaulichung und nicht zur Beschränkung gezeigt.
Beispiel 1
Präparation von p4119-DNA
DNA in pharmazeutischer Qualität wurde wie folgt hergestellt, unter Verwendung von sterilen Kulturbedingungen für alle Zellkulturverfahren. 2 ist eine schematische Darstellung der Verfahrensschritte.
Ein Inokulum von E.coli, enthaltend das Plasmid p4119 (3) wurde aus einem gefrorenen Stock durch die Zugabe von 1 ml gefrorener (–80°C) Bakterienkultur in einen mit Schaumstoff verschlossenen 500 ml-Kolben, enthaltend 100 ml TB-Nährbrühe (Sambrook et al., 1989), ergänzt mit Carbenicillin (100 μg/ml) hergestellt. Die Kulturen wurden bei 37°C inkubiert und mit 220 rpm für ungefähr 6 h geschüttelt. Das Kulturwachstum wurde durch visuelle Überprüfung oder durch Bestimmung der OD₆₀₀ bestimmt, wobei OD-Werte zwischen 0,5 und 5 als annehmbar erachtet wurden.
5 ml dieser Kultur wurden verwendet, um jeden von 4 Bioreaktoren zu beimpfen, enthaltend 10 l TB-Medium, ergänzt mit Carbenicillin (100 μg/ml) und mit 1 ml/10 l Mazu DF204-Antischaummittel. Die Kulturen wurden bei 37°Cinkubiert und anfänglich mit etwa 300 rpm gerührt. Die Kulturen wurden belüftet und der gelöste Sauerstoff wurde mittels Kaskadenregelkreisen, Bewegung, Luftfluss und Sauerstoffanreicherung auf durchschnittlich etwa 40% Sättigung gesteuert. Die Kulturen wurden für etwa 10 bis 16 h inkubiert. Nach der Inkubation wurde der Zellgehalt jeder Kultur mittels OD₆₀₀ bestimmt; OD₆₀₀-Werte lagen im Bereich von 16–18. Die Zellen wurden durch Zentrifugation in einer gekühlten kontinuierlichen Carr-Fließzentrifuge zentrifugiert.
Die Zellpellets wurden in dünne Scheiben verteilt und bei –80°C bis zum Gebrauch für eine weitere Plasmidreinigung eingefroren. 3,2 kg des Zellpellets wurde in 16 l Lösung l (25 μM Tris-HCl, pH 8, 10 mM EDTA, 50 mM Dextrose) unter Rühren bei 150 rpm für 1 h bei Raumtemperatur resuspendiert. Ein RNase-Verdau wurde durch die Zugabe von RNase (305 mg RNase/kg Zellpaste) und Inkubation der Lösung auf Eis für 2 h erreicht. Die Zellen wurden durch die Zugabe der Zellen zu 23 l Lösung II (0,2 NaOH/1% SDS) in einem Eisbad lysiert. Die Lösung wird unter Verwendung eines „Bow-Tie"-Rührers (Cole Parmer, Vernon Hills, IL) für 25 min gerührt. Diese Lösung wurde dann neutralisiert und Zelltrümmer und chromosomale DNA wurden durch die Zugabe von 16 1 eiskalter Lösung III (3 M Kalium, 5 M Acetat, pH 5,5) präzipitiert. Diese Lösung wurde mit einem „Bow-Tie"-Rührer auf Eis für 25 min gemischt.
Das präzipitierte Material wurde von der neutralisierten Zelllyselösung durch Zentrifugation entfernt. Die Lösung wurde in 1 l Zentrifugenbecher aliquotiert und bei 5300 rpm für 20 min bei 2°C zentrifugiert. Die Überstände wurden dann durch zwei Schichten Miracloth (CalBiochem, La Jolla, CA), die mit 90% zueinander angeordnet waren in einen Behälter bei Raumtemperatur dekantiert. Die dekantierten Überstände wurden dann durch 1,2 und 0,2 μm-Filter, in Reihe angeordnet, filtriert. Als eine Alternative zur Zentrifugation in diesem Stadium kann präzipitiertes Material durch eine Filtration durch ein Diatomeenerdematerial wie etwa Celite^® HYFLO SUPER CELL (Celite Corp., Lompoc, Calif.) entfernt werden. Siehe US-Patent Nr. 5,576,196.
Die filtrierten Materialien wurden dann in eine Ultrafiltrationseinheit gepumpt und die DNA-Lösung wurde durch Tangentialflussfiltration filtriert durch eine offenkanalige Pall-Filtron Omega Centrasette-Einheit unter Verwendung einer 25 ft² (2,3 × 10⁴ cm²) Polyethersulfon(PES)-Membran mit einem MWCO von 300 K. Die Lösung wurde unter einem Druck von 10 psi (68,9 kPa) in die Einheit eingeführt, wobei der Permeatkanal offen war und die Lösung wurde für etwa 50 min durch die Einheit zirkuliert, bis sich eine Gelschicht bildete. Der Permeatkanal wurde dann zu einem Abfallbehälter geleitet und die DNA-Lösung wurde unter einem Druck von 10 psi (68,9 kPa) filtriert, bis die Lösung auf ein Volumen von etwa 3,6 1 aufkonzentriert war. Dann wurde Diafiltrationspuffer (Tris-HCl, pH 8,5) zugegeben und die Lösung wurde kontinuierlich bei einem Druck von 10 psi (68,9 kPa), einer Fließgeschwindigkeit von etwa 1 l/min diafiltriert, bis ungefähr 50 Vofumenaustausche durchgeführt waren.
Nach der Diafiltration wurde das Retentat für 10 min durch den Ultrafilter rückzirkuliert, wobei das Permeatventil geschlossen war. Das Retentat wurde entfernt und die Membran wurde zweimal durch einen zusätzlichen Liter Diafiltrationspuffer pro Wäsche jeweils für 10 min gewaschen, wobei das Permeatventil geschlossen war. Die Waschlösungen wurden zu dem Retentat zugegeben und durch HPLC und einer OD_260/280-Analyse analysiert.
HPLC-Analysen wurden auf einer 4,6 mm × 3,5 cm HPLC-Säule durchgeführt, gepackt mit TSK-GEL DEAE-NPR-Harz mit einer Pufferfließgeschwindigkeit von 1 ml/min und bei 254 nm überwacht. Die Proben wurden 1 : 20 mit Puffer A (20 mM Tris-HCl, pH 8) verdünnt und auf die Säule in einem Volumen von 25 μl injiziert. Die Probe wurde in einem Gradienten von 0% Puffer B (20 mM Tris-HCl, pH 8/2 M KCl):100% Puffer A bis 60% Puffer B: 40% Puffer A über 9 min eluiert. Die HPLC-Analyse des Permeats (Feld A) und des Retentats, enthaltend das Plasmid-DNA-Produkt (Feld B) sind in 4 gezeigt. Die Plasmid-DNA ist normalerweise 95% rein und oft 100% rein, wie durch HPLC in diesem Stadium bestimmt wird.
Die spektrophotometrische Analyse wurde bei den Wellenlängen 250, 260 und 280 nm durchgeführt. Typische Verhältnisse für gereinigte DNA sind OD₂₆₀/OD₂₅₀ > 1,1 und OD₂₆₀/OD₂₈₀ > 1,9. Es wurden insgesamt 2,307 g Plasmid-DNA isoliert und im obigen Verfahren gereinigt, mit einer OD₂₆₀/OD₂₅₀ von 1,1047 und einer OD₂₆₀/OD₂₈₀ von 1,9290.
Die rückgewonnene Plasmid-DNA wurde zweimal durch einen Gelman Ground WaterCapsule 0,45 μm-Filter filtriert, gefolgt von zwei Filtrationen durch einen Pall-Filtron Capsule N₆₆ 0,22 μm-Filter.
Die Plasmid-DNA wurde weiter durch lonenaustausch-Chromatographie gereinigt. Die DNA wurde in einem Gesamtvolumen von 4740 ml auf eine Amicon Vantage A-Säule geladen, gepackt mit einem 2,5 l-Bettvolumen von TMAE-650 (M) (Trimethylaminoethyl) Fractogel (EM Separations, Gibbstown, NJ). Die Säule wurde bei einer LFV (lineare Fließgeschwindigkeit, "linear flow velocity") zwischen 80 bis 150 cm/h bei 0,5 bar Säulendruck mit Äquilibrierungspuffer (50 mM Tris, pH 8,5) äquilibriert. Die DNA wurde bei einer Fließgeschwindigkeit von 225 ml/min mit 0,7 bar Säulendruck geladen. Die Säule wurde mit 3 bis 5 Säulenvolumen Äquilibrierungspuffer bei 32 bis 35 mS gewaschen. Die DNA wurde von der Säule eluiert über einen Elutionsgradienten von 32 mS bis 59 mS oder von 0,5 M NaCl bis 1,5 M NaCl in 50 mM Tris, pH 8,5 mit einer Fließgeschwindigkeit von 225 ml/min und einem Säulendruck von 0,55 bar. Die Fraktionen wurden in Volumina von 130 bis 1650 ml gesammelt, beginnend, wenn der A₂₆₀ größer als 0,2 war und endend, wenn der A₂₆₀ geringer als 0,2 war.
Alle Fraktionen wurden durch HPLC und LAL-Endotoxin-Assay analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Es wurden insgesamt 2044 mg DNA auf die Säule geladen und 1946 mg wurden in einem Gesamtvolumen von 6079 ml rückgewonnen, eine Ausbeute von 95,22%. Die Säulenfraktionen 2 bis 10 wurden vereinigt (1905 mg DNA und 3,73 × 105 EU LPS in 5941 ml). Die zu vereinigenden Fraktionen wurden ausgewählt, um die maximale Ausbeute an rückgewonnener DNA bereitzustellen, während die Menge an kontaminierendem Lipopolysaccharid (LPS) in der Präparation minimiert wurde.
Tabelle 1
Die rückgewonnene DNA-Lösung wurde durch einen Pall Ultipor N₆₆ 0,2 μm-Filter filtriert. Um den Salzgehalt zu verringern, wurde die DNA-Lösung einem abschließenden Diafiltrationsschritt unterzogen unter Verwendung einer offenkanaligen Pall-Filtron Centramate 100 K MWCO-Membran (2,0 Quadratfuss). Die Filtrationseinheit und die Membran wurden zuerst mit 1 l einer Lösung von 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 äquüibriert. Der Puffer wird unter Verwendung einer Pumpe und einer sterilen Speicherflasche durch die Membran zirkuliert. Die DNA-Lösung wurde zugegeben, wobei der Permeatkanal ganz offen war, und die Lösung zirkulierte für ungefähr 30 min bei 10 psi. Die DNA-Lösung wurde dann ultrafiltriert, bis sie auf ein Volumen von ungefähr 100 ml aufkonzentriert war. Die konzentrierte Lösung wurde dann unter Verwendung einer kontinuierlichen Diafiltration bei 10 psi und einer Permeatfließgeschwindigkeit von 120 ml/min gegen eine Lösung von 10 mM Tris-HCl, pH 8 diafiltriert, bis die Leitfähigkeit der Lösung von einem anfänglichen Wert von 35 mS bis auf weniger als 1 mS (0,60) (Pufferleitfähigkeit = 0,53 mS) abgenommen hatte. Mit geschlossenem Permeatventil wurde das Retentat dann für 10 min durch den Ultrafilter rückzirkuliert. Das Retentat wurde dann gesammelt und die Membran wurde dreimal mit 100 ml 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 gewaschen.
Die DNA- und Endofioxinkonzentrationen der diafiltrierten DNA-Lösung und jeder der drei Wäschen wurden wie oben beschrieben bestimmt. Das Retentat und die erste Wäsche wurden vereinigt, was 1,366 g DNA mit einer Konzentration von 5,564 mg/ml und 90,35 EU/ml oder 16,24 EU/mg DNA ergab. Diese DNA-Lösung wurde durch einen Millipore Millipak 40 0,22 μm-Filter filtriert, gefolgt von einer Filtration mit zusätzlichen 25 ml des Enddiafiltrationspuffers, und die zwei Lösungen wurden vereinigt, um das Endprodukt zu ergeben.

Die Ausbeute des Plasmid-DNA-Endprodukts aus der abschließenden Ultrafiltration betrug 80%. Das Endprodukt wurde dann aliquotiert und bis zur Verwendung bei –20°Cgelagert. Es wurde bestimmt, dass das Endprodukt die folgenden Qualitätskontrollspezifizierungen einhielt:

Farbe	klar bis leicht trüb
Endotoxin	< 100 EU/ml
Reinheit	> 95% durch HPLC
DNA-Homogenität	> 90% ccc ("covalently closed circular")
RNA	< 2% durch analytische HPLC
ssDNA	< 1% durch analytische HPLC
Protein	< 0,1% durch analytische HPLC, Silberfärbung und SDS-PAGE
genomische DNA	< 1% durch analytische HPLC und Southern Blotting
Leitfähigkeit	< 1 mS
pH	7–8,5

Die Sterilität wurde dadurch untersucht, dass eine Tryptose-Nährkultur am Tag 21 keine Kolonien zeigte. Die Identität wurde durch einen Restriktionsendonukleaseverdau und eine Analyse mittels Agarosegelelektrophorese bestimmt. Ergebnisse der Analyse von p4119 sind in 5 gezeigt. Eine HPLC-Analyse des Endprodukts ist in 6 gezeigt.
Es wird von Fachleuten verstanden werden, dass das Ausmaß der erreichten Reinheit unter Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung von den beabsichtigten Verwendungen der gereinigten Nukleinsäure abhängen wird. Entsprechend beabsichtigt die Erfindung, Ausführungsformen zu umfassen, wobei jeglicher Reinheitsgrad, einschließlich des Reinheitsgrads, der durch die Beispiele hierin veranschaulicht wird, erreicht werden kann. Die Erfindung ist deshalb nicht im Umfang der Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren in ihren optimalen Ausführungsformen oder auf die Herstellung von Nukleinsäuren für eine maximal erhältliche Reinheit beschränkt.
Es wird verstanden werden, dass die vorhergehende Offenbarung bestimmte besondere Ausführungsformen der Erfindung betont, und dass alle dazu äquivalenten Modifikationen und Alternativen innerhalb des Geistes und des Umfangs der Erfindung liegen, wie in den angefügten Ansprüchen dargelegt.

Claims

Verfahren zur Reinigung einer Nukleinsäure aus einer die Nukleinsäure umfassenden Lösung, wobei das Verfahren umfasst: (a) Filtrieren der Lösung durch eine Ultrafiltrationseinheit, umfassend eine Gelschicht, um eine Permeat-Lösung und eine Retentat-Lösung bereitzustellen, wobei die Nukleinsäure in der Retentat-Lösung zurückgehalten wird, und (b) Sammeln der Retentat-Lösung, wobei eine gereinigte Nukleinsäure-Lösung erhalten wird.
Verfahren zum Filtrieren einer eine Nukleinsäure umfassende Lösung, wobei das Verfahren umfasst: (a) Filtrieren der Lösung durch eine Ultrafiltrationseinheit, umfassend eine Gelschicht, um eine Permat-Lösung und eine Retentat-Lösung bereitzustellen, wobei die Nukleinsäure in der Retentat-Lösung zurückgehalten wird, und (b) Sammeln der Retentat-Lösung, wobei eine filtrierte Nukleinsäure-Lösung erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin die Nukleinsäure DNA oder RNA ist.
Verfahren nach Anspruch 3, worin die DNA Plasmid-DNA oder virale DNA ist.
Verfahren nach Anspruch 3, worin die RNA virale RNA ist.
Verfahren nach Anspruch 4, worin die DNA Plasmid-DNA ist und die Ultrafiltrationseinheit eine Membran mit einer Molekulargewichts-Abtrennung von etwa 50 K bis etwa 500 K Dalton umfasst.
Verfahren zur Reinigung von Plasmid-DNA aus einer die Plasmid-DNA umfassenden Lösung, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Filtrieren der Lösung durch eine offenkanalige Ultrafiltrationseinheit, umfassend eine Membran mit einer Molekulargewichts-Abtrennung im Bereich von etwa 50K bis etwa 500K Dalton, um eine Permat-Lösung und eine Retentat-Lösung bereitzustellen, wobei die Nukleinsäure in der Retentat-Lösung zurückgehalten wird, und (b) Sammeln der Retentat-Lösung, um eine gereinigte Plasmid-DNA-Lösung bereitzustellen.
Verfahren zum Filtrieren einer Lösung, umfassend eine Plasmid-DNA, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Filtrieren der Lösung durch eine offenkanalige Ultrafiltrationseinheit, umfassend eine Membran mit einer Molekulargewichts-Abtrennung im Bereich von etwa 50K bis etwa 500K Dalton, um eine Permat-Lösung und eine Retentat-Lösung bereitzustellen, wobei die Plasmid-DNA in der Retentat-Lösung zurückgehalten wird, und (b) Sammeln der Retentat-Lösung, um eine filtrierte DNA-Lösung bereitzustellen.
Verfahren nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, worin die Filtration in Gegenwart einer Gelschicht durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, worin die Ultrafiltrationsmembran eine Molekulargewichts-Abtrennung von etwa 300 K Dalton besitzt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, weiter umfassend Diafiltrieren der Lösung, um einen Volumenaustausch von etwa 10 bis 100 Volumen-Äquivalenten der Retentat-Lösung bereitzustellen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder 9 bis 1 1, worin die Gelschicht unter einem Druck von etwa 34,5 KPascal bis etwa 206,8 KPascal (etwa 5 psi bis etwa 30 psi) gebildet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, weiter umfassend Aufkonzentrieren der Lösung, um eine konzentrierte Nukleinsäure-Lösung bereitzustellen, und Diafiltrieren der konzentrierten Nukleinsäure-Lösung mit einem Diafiltrationspuffer.
Verfahren nach Anspruch 13, weiter umfassend Zirkulieren des Diafiltrationspuffers durch die Ultrafiltrationseinheit nach dem Sammeln der Retentat-Lösung, um eine Waschlösung bereitzustellen, und Vereinigen der Waschlösung mit der Retentat-Lösung.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, weiter umfassend den Schritt Filtrieren der gereinigten oder filtrierten Nukleinsäure-Lösung durch einen 0,2 um Filter.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, weiter umfassend den Schritt Auftragen der gereinigten oder filtrierten Nukleinsäure-Lösung auf ein positiv geladenes lonenaustausch-Chromatographieharz, wobei die Nukleinsäure mit einem Salzgradienten von dem lonenaustausch-Chromatographieharz eluiert wird, um eine eluierte Nukleinsäure-Lösung bereitzustellen.
Verfahren nach Anspruch 16, weiter umfassend den Schritt Diafiltrieren der eluierten Nukleinsäure-Lösung.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die gereinigte Nukleinsäure-Lösung mindestens etwa 90% reine Nukleinsäure oder mindestens etwa 90% geschlossene, zirkuläre Plasmid-DNA umfasst.
Verfahren zur Herstellung einer gereinigten Plasmid-DNA aus einer die Nukleinsäure umfassenden Lösung, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: a) Zirkulieren der Lösung durch eine offenkanalige Ultrafiltrationseinheit, umfassend eine Membran mit einer Molekulargewichts-Abtrennung im Bereich von etwa 300 K Dalton bis etwa 500K Dalton, unter einem Druck von etwa 5 psi (34,5 KPascal) bis etwa 30 psi (206,8 KPascal) für eine Zeit, die ausreichend ist, damit eine Gelschicht gebildet werden kann; b) Filtrieren der Lösung durch eine Ultrafiltrationseinheit, umfassend eine Gelschicht, um eine Permat-Lösung und eine Retentat-Lösung bereitzustellen, wobei die Plasmid-DNA in der Retentat-Lösung zurückgehalten wird; c) Diafiltrieren der Retentat-Lösung mit einem Diafiltrationspuffer; d) Sammeln der Retentat-Lösung; e) Filtrieren der vereinigten Retentat-Lösung durch einen 0,2 um Filter, um eine im Wesentlichen gereinigte Plasmid-DNA-Lösung bereitzustellen; f) Auftragen der im Wesentlichen gereinigten Plasmid-DNA-Lösung auf ein positiv geladenes lonenaustausch-Chromatographieharz, wobei die Plasmid-DNA mit einem Salzgradienten von dem lonenaustausch-Chromatographieharz eluiert wird, um eine eluierte Plasmid-DNA-Lösung bereitzustellen; wobei eine gereinigte Plasmid-DNA-Lösung erhalten wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 19, worin die Lösung, umfassend die Plasmid-DNA, aus der Lyse bakterieller Zellen unter Verwendung eines detergenzienhaltigen Puffers und der wesentlichen Entfernung von Zelltrümmern und Proteinen erhalten wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Ultrafiltrationseinheit eine offenkanalige Vorrichtung ist.
Verfahren nach Anspruch 21, worin die Ultrafiltrationseinheit eine Vorrichtung mit einer flachen Platte oder eine Hohlfaser-Vorrichtung oder eine Tangentialfluss-Vorrichtung ist.
Verfahren zur Reinigung von Plasmid-DNA aus einem Gemisch von Zellen, umfassend die Schritte: a) Zerstören der Integrität der Zellen, umfassend das Gemisch aus Zellen in einer detergenzienhaltigen Pufferlösung, um eine solubilisierte Zell-Lösung bereitzustellen; b) enzymatisches Verdauen zellulärer RNA; c) differenzielles Abscheiden von Zelltrümmern und Proteinen von Nukleinsäure in der solubilisierten Zell-Lösung, um eine die Nukleinsäure umfassende Überstandslösung bereitzustellen; d) Entfernen der präzipitierten Zelltrümmer und Proteine aus der Überstandslösung, um eine im Wesentlichen gereinigte Plasmid-DNA-Lösung bereitzustellen; e) weiteres Reinigen der Plasmid-DNA durch Filtrieren der im Wesentlichen gereinigten Plasmid-DNA-Lösung durch eine Tangentialfluss-Ultrafiltration, um eine Permat-Lösung und eine Retentat-Lösung bereitzustellen, wobei die Plasmid-DNA in der Retentat-Lösung zurückgehalten wird; f) Sammeln der Retentat-Lösung; wobei eine gereinigte Plasmid-DNA-Zusammensetzung erhalten wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Nukleinsäure, hergestellt durch das Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 24, worin die Nukleinsäure Plasmid-DNA ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 25, umfassend mindestens etwa 90% geschlossene zirkuläre Plasmid-DNA.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 25 oder Anspruch 26, umfassend: weniger als etwa 100 Endotoxin-Einheiten pro Milligramm Plasmid-DNA, oder weniger als etwa 2% RNA, oder weniger als etwa 1% Einzelstrang-DNA, oder weniger als etwa 0,1% Protein, oder weniger als etwa 1% genomische DNA.