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DE69705838T2 - Substrate und inhibitoren von proteolytischen enzymen - Google Patents

Substrate und inhibitoren von proteolytischen enzymen

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DE69705838T2
DE69705838T2 DE69705838T DE69705838T DE69705838T2 DE 69705838 T2 DE69705838 T2 DE 69705838T2 DE 69705838 T DE69705838 T DE 69705838T DE 69705838 T DE69705838 T DE 69705838T DE 69705838 T2 DE69705838 T2 DE 69705838T2
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Medivir UK Ltd
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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft den Bereich von Verbindungen, die Substrate oder Inhibitoren proteolytischer Enzyme sind, sowie eine Vorrichtung und Verfahren zur Identifizierung von Substraten oder Inhibitoren proteolytischer Enzyme.
  • Viele therapeutisch nutzvolle Arzneimittel wirken als Enzyminhibitoren. In der pharmazeutischen Industrie wird Inhibitoren proteolytischer Enzyme besonders viel Beachtung geschenkt, da sie die verschiedensten Rollen in einer Vielzahl biologischer Systeme spielen. Ihre proteolytischen Aktivitäten stehen in Zusammenhang mit Prozessen, die von mit metastatischem Krebs assoziierter Zellinvasion bis hin zur Evasion einer Immunantwort, wie in bestimmten parasitischen Organismen zu sehen ist, von der Ernährung über intrazelluläre Signalisierung zur ortsspezifischen Proteolyse viraler Proteasen und eukaryotischer Hormonverarbeitungsenzyme reichen. Die traditionellen zufälligen Screening-Verfahren zur Identifizierung von Leitmolekülen als Inhibitoren proteolytischer Enzyme sind jedoch oft umständlich und zeitaufwendig. Es besteht daher ein großer Bedarf an effizienten Verfahren, mit denen der Arzneimittelentdeckungsprozess beschleunigt werden kann.
  • Wir gehen davon aus, dass Proteasen einen aktiven katalytischen Ort beinhalten, dessen Aktivierung gewöhnlich zunimmt, während die Erkennungstaschen¹ (S&sub1; und S&sub2; usw.) und (S&sub1;' und S&sub2;' usw.) besser belegt werden. Es ist daher wichtig, dass solche Teile (P&sub1; und P&sub2; usw.) (P&sub1;' und P&sub2;' usw.) des Inhibitors, die am besten in diese Taschen passen, möglichst schnell identifiziert werden, um neuartige Proteaseinhibitoren zu entwickeln. Wir haben folglich ein kombinatorisches Verfahren für die schnelle Identifizierung dieser Bindungsmotive entwickelt, das die Synthese von Inhibitoren für eine Vielfalt proteolytischer Enzyme wie Aspartylproteasen, Serinproteasen, Metalloproteasen und Cysteinylproteasen stark beschleunigen wird.
  • Interessante Proteasen sind (unter anderem) folgende:
  • 1. Aspartylproteasen wie Renin, HIV, Cathepsin D und Cathespin [*1] E usw.
  • 2. Metalloproteasen wie ECE, Gelatinase A und B, Kollagenasen, Stromolysine usw.
  • 3. Cysteinylproteasen wie Apopain, ICI, DerPI, Cathepsin B, Cathepsin K usw.
  • 4. Serinproteasen wie Thrombin, Faktor VIIa, Faktor Xa, Elastase, Trypsin.
  • 5. Threonylproteasen wie Proteasom S.
  • Die Verwendung eines Fluoreszenz- Resonanzenergietransfer-(FRET)-Substrats zur Analyse proteolytischer Enzymspezifität wurde erstmalig von Carmel² veröffentlicht. Seither wurden viele verschiedene gelöschte fluorogene Substrate zur Messung der Enzyminhibition in der Literatur beschrieben.&sup4;&supmin;¹¹ Diese Substrate enthalten einen Fluorophor, F, in einer P-Position (vide supra), der von einer anderen Gruppe, Q, die in einer P'-Position vorhanden ist (vide supra), gelöscht und von F durch die leicht spaltbare Bindung getrennt wird. Der Vorteil der Positionierung dieser Reste, F und Q, besteht darin, dass die Spaltung einer Peptidbindung zwischen den beiden natürlichen Resten stattfindet und daher eher ein natürliches hydrolytisches Ereignis darstellt als die Spaltung und Freisetzung eines C-terminalen Chromophores.
  • Bratovanova und Petkov¹² haben zum Beispiel fluorogene Substrate von Peptid-4-nitroaniliden synthetisiert. Eine N- Acylierung von Peptid-4-nitroaniliden mit der Aminobenzoyl- (ABz)-Gruppe erbrachte Substrate, die durch die Anwesenheit des 4-Nitroanilidanteils intern gelöscht sind. Nach einer Hydrolyse der Aminoacyl-4-nitroanilid-Bindung wird die stark fluoreszierende N-ABz-Gruppe entweder an eine Aminosäure oder ein Peptid angelagert freigesetzt.
  • Immobilisierte Bibliotheken, bei denen Substrate an einen Polymer- oder Biopolymerträger gebunden sind, wurden ebenfalls zum Kartieren von Protease-Bindungsorten verwendet.
  • Meldal et al (PNAS Bd 91, Nr. 8, 12. April 1994, S. 3314-3318) offenbaren zum Beispiel die Verwendung fluorogener Peptide mit intramolekularer Löschung in "Mischprotein-Peptidbibliotheken" zur Unterort-Kartierung von Endoproteasespezifität. Es wurde eine einzige Bibliothek mit harzgebundenen Substraten synthetisiert und in einem Festphasentest verwendet, um eine statistische Verteilung bevorzugter Aminosäuren zu jedem Unterort zu bestimmen.
  • Die WO-A-91 16336 offenbart zum Beispiel fluorogene Peptide mit intramolekularer [*2] Löschung, sowie ihre Verwendung bei der Bestimmung enzymatischer Aktivitäten (wie Proteasen), unter Anwendung eines biologischen Screening-Tests mit einer Anordnung [*3] diskreter, individuell adressierbarer Bereiche für die Aufnahme von "biopolymer-zurückhaltendem Substratmaterial" (d. h. Peptide).
  • Singh et al¹³ berichteten kürzlich, dass enzymatische Substrataktivität von 38 ausgewählten Octapeptiden, die über einen Linker an Controlled Pore Glass angefügt sind, eine Prognose für die gleiche Aktivität ähnlicher Peptide in Lösung geben. Dies sind jedoch vorläufige Ergebnisse, die sich nur auf ein bestimmtes Beispiel beziehen. Es ist daher unklar, ob an Polymere angelagerte immobilisierte Substrate zuverlässig lösliche Substrate beim Kartieren der behinderten Proteasebindungsorte ersetzen können, besonders weil die hydrophile oder lipophile Beschaffenheit des Polymers und die Größe der Interstitialräume innerhalb des Polymers zwangsläufig die Reaktion zwischen dem Enzym und seinen Substraten beeinflussen.
  • Gemische von intern gelöschten, fluorogenen Substraten wurden ebenfalls vor kurzem beschrieben, bei denen die Löschergruppe, Q, 2,4-Dinitrophenyl (Dnp) und an der P- Seite der leicht spaltbaren Bindung angelagert ist, während die fluorogene Gruppe N-Methylanthranilsäure (Nma) und an der P'-Seite angelagert ist.¹&sup4;
  • Beispiele für andere Donor-Akzeptor-Chromophorpaare, die in biologischen Systemen zur Anwendung gekommen sind, sind in Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle 1: Donor-Akzeptor-Chromophorpaare, die in biologischen Proben zur Anwendung gekommen sind
  • ANAI, 2-Anthracen-N-acetylimidazol; BPE, B-Phykoerythrin; CF, Carboxyfluorescein-succinimidylester; CPM, 7- Doethylamino-3-(4'maleimidylphenyl)-4-methylcumann; CY5, Carboxymethylindocyanin-N-hydroxysuccinimidylester; dil-C&sub1;&sub8;, 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3'3'-tetramethyl-indocarbocyanin; DiO- C&sub1;&sub4;, 3,3'-Ditetradecyloxacarbocyanin; DABM, 4- Dimethylaniniphenylazo-phenyl-4'-maleimid; DACM, (7- (Dimethylamino)cumann-4-yl)-acetyl; DANZ, Dansylaziridin; DDPM, N-(4-Dimethylamino-3-5-dinitrophenyl)maleimid; DACM, Di-Methylamino-4-maleimidostilben; DMSM, N-(2,5- Dimethoxystiben-4-yl)-maleimid; DNP, 2,4-Dinitrophenyl; E- A, 1,N&sup6;-Ethenoadenosin; EIA, 5-(Iodoacetetamido)eosin, EITC, Eosin-5-isothiocyanat; ENAJ, Eosin-N-acetylimidazol; EM, Eosinmaleimid; ErTTC, Erythrosin-5'-isothiocyanat; ETSC, Eosinthiosemicarbazid; F&sub2;DPB, 1,5-Difluor- 2,4'dinitrobenzol; F&sub2;DPS, 4,4'-Difluro- 3,3'dinitropheylsulfon[*4]; FITC, Fluorescein-N- acetylimidazol; FTS, Fluorescein-Thiosemicarbazid; IAANS, 2-((4'-Iodoacetamido)anilino)naphthalen-6-sulfonsäure; IAEDANS, 5-(2-((iodoacetyl)amino)ethylamino)-naphthlen-1- sulfonsäure; IAF, 5-Iodoacetamidofluorescein; IANBD, N-((2- Iodoacetoxy)ethyl)-N-methyl)amino-7-nitrobenz-2 - oxal,3,diazol; IPM, 3(4-Isothiocyanatophenyl)7-diethyl-4- methylcumann; ISA, 4-(Iodoacetamido)salicylsäure; LRH, Lissaminerho-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl; NCP, N-Cyclohexyl- N'-(1-pyrenyl)carbodiimid; ODR, Octadecylrhodamin; PM, N- (1-Pyren)-maleimid; SRH, Schwefelhodamin; TMR, Tetramethylrhodamin; TNP, Trinitrophenyl; TR, Texas-Rot. Aus: Wu, P. and Brand, L. 1994, Anal. Biochem. 218, 1-13.
  • Es wurde die Spezifität löslicher Peptidbibliotheken bestimmt.15,16 Berman et al beschrieben¹&sup6; eine HPLC- Massenspektrometrietechnik, bei der 6 Gemische von 128 Peptiden synthetisiert wurden, die N-terminal mit der Dnp- Gruppe markiert wurden, um eine W-Überwachung im Rahmen der HPLC zu ermöglichen. Der Nachteil dieses Ansatzes besteht darin, dass jedes Testgemisch individuell analysiert werden muss, da kein fluorogenes Substrat zum Vorschein kommt, und dass die wirksame Konzentration jeder separaten Komponente durch die Größe des Gemischs aufgrund von Gesamtlöslichkeitsfaktoren begrenzt ist.
  • Drevin et al.¹&sup7; haben die Verwendung individuell synthetisierter fluorogener Substrate zur Bestimmung von Enzymaktivität unter Verwendung eines Chromophors vorgeschlagen, der Lanthanoidionen chelatisiert. Garmann und Phillips haben die Verwendung von FRET-Substraten vorgeschlagen, bei denen fluorogene Anteile und Löscheranteile über thiol- oder aminofunktionelle Gruppen angelagert werden, nachdem das Peptid synthetisiert wurde. Dies hat jedoch den Nachteil, dass sie keine Bibliothekenform aufweisen und dass diese funktionellen Amino- und Thiolgruppen selektiv zum Vorschein gebracht werden müssen, nachdem das Peptid synthetisiert wurde. Wang et al. haben die Verwendung der EDANS- und DABCYL- Fluoreszor[*5]- und Löscherpaarung für die individuelle Synthese von Substraten für proteolytische Enzyme vorgeschlagen.
  • Die obigen Verfahren, die FRET-Techniken zum Kartieren der Wirkstelle um eine bestimmte Protease herum eingesetzt haben, weisen einen oder mehrere der folgenden Nachteile auf:
  • 1. aufgrund einer allgemeinen Wasserunlöslichkeit produzieren sie keine Gemische von Verbindungen in einer Form, die sich für Screening-Verfahren mit hohem Durchsatz in wässriger Lösung eignen;
  • ii. die derivatisierten Verbindungen können nicht in kombinatorischer Bibliothekform unter Anwendung von Festphasentechniken hergestellt werden;
  • iii. die verwendeten Gemische8,9 waren nicht selbstentschlüsselnd und erforderten eine zeitaufwendige Entwindungsresynthese zur Identifizerung der aktiven Moleküle.
    • Beschreibung der Zeichnungen
  • Die Fig. 1 bis einschließlich 14 veranschaulichen Komponentenverteilungen in den Platten einer Bibliothekenmatrix;
  • Fig. 15 zeigt ein Reaktionsschema zur Produktion der Verbindung Nummer 4: Boc-Val-Ala-Leu-H, wobei
  • i. Isobutylchlorameisensäureester, N-Methylmorpholin, dann N,O-Dimethylhydroxylamin HCl, THF.
  • ii. HCl, Dioxan. iii. Isobutylchlorameisensäureester, N- Methylmorphlin[*6], dann Boc-Ala-OH, THF.
  • iv. HCl, Dioxan. V. Boc-Val-Osuc, N-Methylmorpholin, DMF. Vi. LAB;
  • Fig. 16 zeigt ein Reaktionsschema zur Produktion aktiver Inhibitoren von Der PI.
    • Kurze Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft:
  • i. komplementäre Paare von Verbindungsbibliotheken, die Substrate oder Inhibitoren proteolytischer Enzyme beinhalten;
  • ii. Vorrichtungen und Verfahrens die eine schnelle Erzeugung von Struktur-Aktivitäts-Beziehungen unter Verwendung kombinatorischer Selbstentwindungsbibliotheken ermöglichen, wodurch die Erfindung neuartiger Inhibitoren proteolytischer Enzyme erleichtert wird;
  • iii. Vorrichtungen und Verfahren, die die Erfassung und Messung proteolytischer Enzymaktivität unter Verwendung kombinatorischer FRET-(Fluoreszenz- Resonanzenergietransfer)-Bibliotheken von Molekülen ermöglichen;
  • iv. Vorrichtungen und Verfahren, die die Einrichtung biologischer Tests für proteolytische Enzyme durch eine schnelle Entdeckung hochaktiver Substrate für proteolytische Enzyme vorsehen.
  • Wir beschreiben hierin eine Vorrichtung und ein Verfahren, die für eine schnelle Erzeugung von Struktur- Aktivitäts-Beziehungs-(SAR)-Daten und folglich für eine Charakterisierung des Bindungsmotivs irgendeiner Protease eingesetzt werden kann/können und daher folgendes erleichtert/erleichtern:
  • i. die Entwicklung eines empfindlichen Enzymhemmtests durch die Verwendung der besten Verbindung in der Bibliothek als fluorogenes Substrat für das untersuchte proteolytische Enzym;
  • ii. die Erfindung neuartiger Verbindungen, die Inhibitoren für proteolytische Enzyme sind, durch eine schnelle Charakterisierung des besten Bindungsmotivs;
  • iii. rechnergesteuerte Arzneimittelentwicklung, um potente Inhibitoren unter Anwendung bekannter Methodik zu entwickeln, sowie die Ermittlung von vorsynthetisierten Verbindungen in betriebsinternen und kommerziell verfügbaren Datenbanken, deren Untersuchung Vorrang erhält.
  • Gemäß einem ersten Aspekt stellt die Erfindung ein komplementäres Paar Verbindungsbibliotheken L1 und L2 bereit, die einen Satz bilden, der kombinatorische FRET- Verbindungen der folgenden Formel enthält:
  • Aa-Bb-Cc-Dd-n(Ee)-Ff-Gg
  • wobei:
  • A einen durch F intern gelöschten Fluoreszor repräsentiert;
  • B, C, D und E Gruppen repräsentieren, so dass die leicht spaltbare Bindung zwischen zwei von diesen Gruppen eine geeignete Bindung ist;
  • F einen Löscher repräsentiert, der den Fluoreszor A intern löschen kann; und wobei alle Verbindungen in wässriger Lösung vorliegen; und
  • n eine ganze Zahl zwischen 1 und 4, einschließlich, repräsentiert;
  • so dass a x b x c x d x e x f x g = Mn Verbindungen in jeder Bibliothek entstehen, wobei eine vorbestimmte Anzahl (P1, P2) an Gemischen vorhanden ist, die jeweils aus einer vorbestimmten Anzahl (Q1, Q2) individueller identifizierbarer Verbindungen in jeder Bibliothek bestehen, wobei sowohl L1 als auch L2 dieselben Mn Verbindungen enthalten, wobei jedoch zwei beliebige Verbindungen, die zusammen in einem Gemisch von Q1
  • Verbindungen von L1 zu finden sind, nicht zusammen in irgendeinem der P2 Gemische von L2 zu finden sind.
  • In einigen Ausgestaltungen ist die geeignete Bindung eine nichtsubstituierte Amidbindung (siehe Beispiel 1); in anderen Ausgestaltungen ist die geeignete Bindung eine Esterbindung (siehe Beispiel 2).
  • In bevorzugten Ausgestaltungen sind B, C, D, E Aminosäuren oder Hydroxysäuren. Das ist ein Molekül mit einem Amin- oder Hydroxyterminus und einem Carbonsäureterminus. Die Amin-/Hydroxygruppe kann auf demselben Kohlenstoffatom positioniert oder durch eine Anzahl Atome und Atomtypen getrennt sein.
  • Die Moleküle können cyclisch oder alicyclisch sein.
  • Sie können linear oder cyclisch auf der gleichen Struktur sein
  • B-C-D-E oder
  • oder BCDE kann sich auf einem zentralen Gerüst (linear oder cyclisch) befinden.
  • oder
  • oder einer der Reste kann die Hauptkette sein
  • Wenn das Symbol -B-C-D-E- oder -B-C-D-nE- hierin verwendet wird, dann ist es so zu verstehen, dass es alle diese linearen und cyclischen
  • Varianten im Rahmen seiner Definition
  • beinhaltet.
  • Wenigstens eine, aber nicht alle der Bindungen zwischen B, C, D, E muss/müssen leicht spaltbar sein.
  • Bindungen, die nicht leicht spaltbar sind, können u. a. Sulfonamid Harnstoff,
  • Aminomethylen sein.
  • Mehrere nicht beschränkende Beispiele von "Gerüst"-Molekülen sind in Tabelle 2 aufgeführt, in der die Substituenten R&sub1;-R&sub4; möglichen variablen Gruppen B, C, D und E entsprechen.
  • Die Erfindung sieht die Verwendung einer solchen kombinatorischen FRET-Bibliothek in einem Verfahren zum schnellen Erzeugen von Struktur-Aktivitäts-Beziehungen (SAR) vor, umfassend das Erfassen und Messen proteolytischer Enzymaktivität, indem mit einer Bibliothek kombinatorischer FRET- (Fluoreszenz- Resonanzenergietransfer) Moleküle ein Test durchgeführt wird, um (ein) Substrat(e) für das Enzym zu finden. Gemäß diesem Verfahren kann ein identifiziertes Substrat synthetisiert und in einem biologischen Test für proteolytische Enzyme eingesetzt werden.
  • Die Erfindung sieht die Verwendung einer solchen kombinatorischen FRET-Bibliothek in einem Verfahren zum Erfassen und Messen proteolytischer Enzymaktivität anhand Verbindungen der Bibliothek vor.
  • Die Erfindung stellt ein Verfahren bereit; umfassend das Identifizieren von (einem) Enzyminhibitor oder - inhibitoren, wobei eine FRET-Verbindung, die Tabelle 2
  • als ein Substrat identifiziert wurde, in einem Hemmtest mit dem Enzym separat anhand einer Liste möglicher Inhibitoren verwendet wird.
  • Ein Satz Verbindungen, der zwei komplementäre FRET- Verbindungsbibliotheken umfasst, wird nachfolgend als "Vorrichtung" bezeichnet, da er das Screening- bzw. Testverfahren zum Identifizieren von Substraten oder Inhibitoren proteolytischer Enzyme ermöglicht. Dieser Satz Verbindungen, der eine Vorrichtung darstellt, kann eine kombinatorische Selbstentwindungsbibliothek bereitstellen, wie nachfolgend beschrieben wird.
  • Die Erfindung stellt ein Verfahren zum Identifizieren und Synthetisieren eines Inhibitors eines proteolytischen Enzyms bereit, das die folgenden Schritte umfasst: Erfassen und Messen proteolytischer Enzymaktivität, indem mit einem komplementären Bibliothekenpaar kombinatorischer FRET- (Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer)-Moleküle ein Test durchgeführt wird, Entwinden der Bibliothek, um ein Substrat oder Substrate für das Enzym zu finden, und Synthetisieren eines Inhibitors auf der Basis des Substrats bzw. der Substrate. Das direkte Produkt aus diesem Verfahren sind ein oder mehrere neuartige Inhibitoren für proteolytisches Enzym.
  • Die Erfindung stellt einen Hemmtest unter Verwendung eines FRET-Moleküls bereit, das als ein Substrat für das Enzym identifiziert wurde, wobei das Molekül mit dem Enzym separat anhand einer Liste möglicher Inhibitoren getestet wird.
  • Die Erfindung stellt ein Verfahren zum Screenen nach Enzymaktivität bereit, unter Verwendung der oben beschriebenen Bibliotheken L1, L2, wobei die P1 Gemische von L1 und die P2 Gemische von L2 jeweils getrennt in individuelle Mulden von Muldenplatten gegeben werden, wobei die Muldenplatten Mulden haben, die in einem Format angeordnet sind, das so ausgestaltet ist, dass es die Ableitung einer einzigartigen aktiven Verbindungsformel vom Vorliegen von Aktivität in einer Mulde von L1 und einer Mulde von L2 ermöglicht.
  • Die erfindungsgemäße Vorrichtung umfasst vorzugsweise zwei komplementäre Verbindungsbibliotheken, L1 und L2, die jeweils n · 1600 Verbindungen der Erfindung enthalten, des Typs A-B&sub1;&submin;&sub1;&sub0; - C&sub1;-&sub1;&sub0; - D&sub1;&submin;&sub8; - n (E&sub1;&submin;&sub2;) - F-G [II], wobei:
  • A ein intern durch F gelöschter Fluoreszor ist, vorzugsweise ein nichtsubstituiertes oder substituiertes Anthranilsäurederivat, das durch eine Amidbindung mit B verbunden ist;
  • B, C, D, E natürliche oder unnatürliche Aminosäurereste sind, die durch geeignete Bindungen miteinander verbunden sind; allerdings können B, C, D und E irgendein Satz Gruppen sein, vorausgesetzt, die leicht spaltbare Bindung zwischen D-E ist eine nichtsubstituierte Bindung;
  • F ein Löscher ist, der den Fluoreszor A intern löschen kann, vorzugsweise ein nichtsubstituiertes oder substituiertes 3-Nitrotyrosin-Derivat.
  • G optional anwesend und ein hydrophiler Anteil ist, vorzugsweise ein Aspartylamidanteil. Wenn anwesend, stellt G vorteilhafterweise sicher, dass alle Verbindungen in der Bibliothek wasserlöslich sind. Außerdem sollte G kein Substrat für irgendeinen Enzymtyp sein;
  • n eine ganze Zahl zwischen 1 und 4, einschließlich, ist.
  • Alternativ könnte die leicht spaltbare Bindung zwischen B-C oder C-D vorliegen.
  • (Es ist zu beachten, dass A und F hierin im Allgemeinen und jeweils den Anteilen F und Q des zuvor erwähnten Standes der Technik entsprechen).
  • Die tiefgestellten Zahlen hinter den Resten B, C, D und E geben die Anzahl der Möglichkeiten an, aus denen solche Reste ausgewählt werden. Anhand eines illustrativen Beispiels repräsentiert A-B&sub1;&submin;&sub5;-C-D-E&sub1;&submin;&sub2;-F-G folglich ein Gemisch aus den folgenden zehn Verbindungen:
  • A-B&sub1;-C-D-E&sub1;-F-G
  • A-B&sub2;-C-D-E&sub1;-F-G
  • A-B&sub3;-C-D-E&sub1;-F-G
  • A-B&sub4;-C-D-E&sub1;-F-G
  • A-B&sub5;-C-D-E&sub1;-F-G
  • A-B&sub1;-C-D-E&sub2;-F-G
  • A-B&sub1;[*18]-C-D-E&sub2;-F-G
  • A-B&sub3;-C-D-E&sub2;-F-G
  • A-B&sub5;-C-D-E&sub2;-F-G
  • A-B&sub5;-C-D-E&sub2;-F-G
  • Die allgemeine kombinatorische Formel zu jeder Bibliothek kann wie folgt ausgedrückt werden:
  • A&sub1;-B&sub1;&sub0;-C&sub1;&sub0;-D&sub8;-n(E&sub2;)-F&sub1;-G&sub1; [III]
  • so dass 1 · 10 · 10 · 8 · n · 2 · 1 · 1 = 1600n Verbindungen bereitgestellt werden.
  • Beide Verbindungsbibliotheken, L1 und L2, des obigen Typs werden anhand Festphasentechniken unter Anwendung des Multipin-(Mehrnadel)-Ansatzes²&sup4; synthetisiert, so dass jede Bibliothek 1600n Verbindungen als 80n Gemische aus 20 verschiedenen, identifizierbaren Verbindungen enthält. Diese 20-Komponenten-Gemische werden dann getrennt in jeweils 80 Mulden einer 96-Mulden-Platte gegeben (die beiden anderen Bahnen werden für Kontrollversuche verwendet) und anschließend anhand einer bekannten Proteasequantität gescreent.
  • Es ist somit ein wichtiger Bestandteil der Erfindung, dass, ungeachtet der Anzahl von Verbindungen, die in den beiden Bibliotheken L1 und L2 enthalten sind (z. B. in der bevorzugten Ausgestaltung: 1600n, wobei n eine beliebige ganze Zahl zwischen 1 und 4 ist), die Bibliotheken selbst komplementär sind und entwunden werden können, ohne dass auf eine Resynthese durchgeführt werden muss. Es ist ebenfalls ein wichtiger Bestandteil der Erfindung, dass die Bibliothekenmatrix speziell so formatiert wurde, dass die wichtigsten Ortspaarungen P&sub2; und P&sub1; für proteolytische Enzyme unmittelbar identifiziert werden können, ohne Rückgriff auf Resynthese.
  • Solche Verbindungen des Typs A-B-C-D-E-F-G, die die besseren Substrate für die Protease sind, werden gespalten und können problemlos identifiziert werden, da der Fluoreszor A von seinem nahe gelegenen Löscher F auf zeitabhängige Weise gespalten wird, was leicht quantifizierbar ist. Die Fluoreszenzlöschung von A durch F tritt nur dann auf, wenn sich die beiden in einer Nähe von normalerweise bis zu 30 Angström zueinander befinden. Die Spaltung einer leicht spaltbaren Bindung (z. B. die leicht spaltbare Bindung D-E) lässt F folglich weiter von A weggehen und lässt A somit fluoreszieren, wenn es durch Licht mit der korrekten Wellenlänge angeregt wird.
  • 1. Auf diese Weise kann die aktivste Verbindung schnell identifiziert werden, ohne dass eine weitere Resynthese und Entwindung erforderlich sind. Ferner können die Mulden, die die schnellste Entwicklung von Fluoreszenz aufweisen, auch durch Massenspektrometrie analysiert werden, da durch einen Vergleich mit dem Ausgangsgemisch die Identität des wirksamsten Substrats durch seinen Zerfall in seine beiden Komponententeile, z. B. A-B-C-D und E-F-G, aufgedeckt werden kann.
  • Das Problem der Bibliothekentwindung kann folglich umgangen und das aktivste Substrat für das Enzym schnell identifiziert werden.
  • Darüber hinaus kann die enzymatische Restaktivität in jeder Mulde nach der Ausgangsbehandlung des proteolytischen Enzyms mit den Bibliothekengemischen L1 und L2 durch die Zugabe des potentesten fluorogenen Substrats S1 für das Enzym quantifiziert werden, das in der 1600n Verbindungsbibliothek gefunden wird. Aufgrund der Konstruktionsart der Bibliothek ist eine schnelle Präparation und Reinigung möglich. Ist keine erhöhte Fluoreszenz mit dem bekannten Substrat S1 erkennbar, dann kann daraus die Anwesenheit eines Enzyminhibitors gefolgert werden, der wiederum schnell identifizierbar ist, ohne dass eine Resynthese benötigt wird.
  • Es folgt eine allgemeine Beschreibung des Bibliothekenlayouts unter Bezugnahme auf die Fig. 1 bis 14.
  • Ist beispielsweise n = 1 und die Bibliothek enthält 1600 Verbindungen, dann sind in der ersten Spalte der ersten Reihe (A1) (Fig. 1) der ersten Platte (P1) der Bibliothek L1 (nachfolgend als Ort A1, P1, L1 bezeichnet) eine C Komponente, C&sub1;, eine D Komponente, D&sub1;, die zehn B Komponenten und die beiden E Komponenten (E&sub1; und E&sub2;) (Fig. 2) enthalten. In der zehnten Spalte der ersten Reihe (A10) der ersten Platte (P1) der Bibliothek L1 (nachfolgend als Ort A10, P1, L1 bezeichnet) sind eine C Komponente, C&sub1;&sub0;, eine D Komponente, D&sub1;, die zehn B Komponenten und die beiden E Komponenten (E&sub1; und E&sub2;) enthalten. In der zehnten Spalte der achten Reihe (H10) der ersten Platte (P1) der Bibliothek L1 (nachfolgend als Ort H10, P1, L1 bezeichnet) sind eine C Komponente, C&sub1;&sub0;, eine D Komponente, D&sub8;, die zehn B Komponenten und die beiden E Komponenten (E&sub1; und E&sub2;) enthalten. Folglich sind alle 1600 Komponenten in der einen Platte anwesend, da die 80 Mulden jeweils 20 Komponenten enthalten.
  • Eine zweite komplementäre Bibliothek wird wie folgt synthetisiert (Fig. 3). In der ersten Spalte der ersten Reihe (A1) der ersten Platte (P1) der Bibliothek L2 (nachfolgend als Ort A1, P1, L2 bezeichnet) sind zehn C Komponenten, zwei D Komponenten (D&sub1; und D&sub2;), eine B Komponente, B&sub1;, und eine E Komponente, E&sub1;, vorhanden. In der zehnten Spalte der ersten Reihe (A10) der ersten Platte (P1) der Bibliothek L2 (nachfolgend als Ort A10, P1, L2 bezeichnet) sind zehn C Komponenten, zwei D Komponenten (D&sub1; und D&sub2;), eine B Komponente, B&sub1;&sub0;, und eine E Komponente, E&sub1;, vorhanden. In der ersten Spalte der zweiten Reihe (B1) der ersten Platte (P1) der Bibliothek L2 (nachfolgend als Ort B1, P1, L2 bezeichnet) sind zehn C Komponenten, zwei D Komponenten (D&sub1; und D&sub2;), eine B Komponente, B&sub1;, und eine E Komponente, E&sub2;, enthalten. In der zehnten Spalte der zweiten Reihe (B&sub1;&sub0;) der ersten Platte (P1) der Bibliothek L2 (B10, P1, L2) sind zehn C Komponenten, zwei D Komponenten (D&sub1; und D&sub2;); eine B Komponente, B&sub1;&sub0;, und eine E Komponente, E&sub2;, vorhanden. Folglich werden nur die ersten beiden Reihen zur Unterbringung von insgesamt 400 Verbindungen verwendet.
  • In der ersten Spalte der ersten Reihe (A1) der zweiten Platte (P2) der Bibliothek L2 (nachfolgend als Ort A1, P2, L2 bezeichnet), sind zehn C Komponenten, zwei D Komponenten (D&sub3; und D&sub4;), eine B Komponente, B&sub1;, und eine E Komponente, E&sub1;, vorhanden (Fig. 4). In der zehnten Spalte der ersten Reihe (A10) der zweiten Platte (P2) der Bibliothek L2 (nachfolgend als Ort A10, P2, L2 bezeichnet) sind zehn C Komponenten, zwei D Komponenten (D&sub3; und D&sub4;), eine B Komponente, B&sub1;&sub0;, und eine E Komponente, E&sub1;, enthalten. In der ersten Spalte der zweiten Reihe (B1) der zweiten Platte (P2) der Bibliothek L2 (nachfolgend als Ort B1, P2, L2 bezeichnet) sind zehn C Komponenten, zwei D Komponenten (D&sub3; und D&sub4;), eine B Komponente, B&sub1;, und eine E Komponente, E&sub2;, enthalten. In der zehnten Spalte der zweiten Reihe (B10) der zweiten Platte (P2) der Bibliothek L2 (B10, P2, L2) sind zehn C Komponenten, zwei D Komponenten (D&sub3; und D&sub4;), eine B Komponente, B&sub1;&sub0;, und eine E Komponente, E&sub2;, enthalten. Folglich werden nur die ersten beiden Reihen zur Unterbringung von insgesamt 400 Verbindungen verwendet.
  • In der ersten Spalte der ersten Reihe (A1) der dritten Platte (P3) der Bibliothek L2 (nachfolgend als Ort A1, P3, L2 bezeichnet) sind zehn C Komponenten, zwei D Komponenten (D&sub5; und D&sub6;), eine B Komponente, B&sub1;, und eine E Komponente, E&sub1;, enthalten (Fig. 5). In der zehnten Spalte der ersten Reihe (A10) der dritten Platte (P3) der Bibliothek L2 (nachfolgend als Ort A10, P3, L2 bezeichnet) sind zehn C Komponenten, zwei D Komponenten (D&sub5; und D&sub6;), eine B Komponente, B&sub1;&sub0;, und eine E Komponente, E&sub1;, vorhanden. In der ersten Spalte der zweiten Reihe (B1) der dritten Platte (P3) der Bibliothek L2 (nachfolgend als Ort B1, P3, L2 bezeichnet) sind zehn C Komponenten, zwei D Komponenten (D&sub5; und D&sub6;), eine B Komponente, B1, und eine E Komponente, E&sub2;, enthalten. In der zehnten Spalte der zweiten Reihe (B10) der dritten Platte (P3) der Bibliothek L2 (B10, P3, L2) sind zehn C Komponenten, zwei D Komponenten (D&sub5; und D&sub6;), eine B Komponente, B&sub1;&sub0;, und eine E Komponente, E&sub2;, enthalten. Folglich werden nur die ersten beiden Reihen zur Unterbringung von insgesamt 400 Verbindungen verwendet.
  • In der ersten Spalte der ersten Reihe (A1) der vierten Platte (P4) der Bibliothek L2 (nachfolgend als Ort A1, P4, L2 bezeichnet) sind zehn C Komponenten, zwei D Komponenten (D&sub7; und D&sub8;), eine B Komponente, B&sub1;, und eine E Komponente, E&sub1;, enthalten (Fig. 6). In der zehnten Spalte der ersten Reihe (A10) der vierten Platte (P4) der Bibliothek L2 (nachfolgend als Ort A10, P4, L2 bezeichnet) sind zehn C Komponenten, zwei D Komponenten (D&sub7; und D&sub8;), eine B Komponente, B&sub1;&sub0;, und eine E Komponente, E&sub1;, enthalten. In der ersten Spalte der zweiten Reihe (B1) der vierten Platte (P4) der Bibliothek L2 (nachfolgend als Ort B1, P4, L2) bezeichnet, sind zehn C Komponenten, zwei D Komponenten (D&sub7; und D&sub8;), eine B Komponente, B&sub1;, und eine E Komponente, E&sub1;, enthalten. In der zehnten Spalte der zweiten Reihe (B10) der vierten Platte (P4) der Bibliothek L2 (B10, P4, L2) sind zehn C Komponenten, zwei D Komponenten (D&sub7; und D&sub8;), eine B Komponente, B&sub1;&sub0;, und eine E Komponente, E&sub2;, vorhanden. Folglich werden nur die ersten beiden Reihen zur Unterbringung von insgesamt 400 Verbindungen verwendet.
  • Auf diese Weise werden zwei komplementäre Bibliotheken, L1 und L2, hergestellt. In der Bibliothek L1 enthält jede der 80 Mulden ein Gemisch aus 20 Komponenten, die 1600 Verbindungen zum Screenen bereitstellen. In der Bibliothek L2 werden vier Platten verwendet, bei denen nur die ersten beiden Reihen eingesetzt werden, die 20 Mulden mit 20 Komponenten pro Mulde und Platte bereitstellen und die gleichen 1600 Verbindungen liefern, die in der Bibliothek L1 vorhanden sind, allerdings in einem Format, nach dem zwei Verbindungen, die in der Bibliothek L1 zusammen vorhanden sind, in der Bibliothek L2 nicht zusammen vorhanden sind.
  • Es ist somit ein wichtiger Bestandteil der Erfindung, dass die in den beiden Bibliotheken L1 und L2 enthaltenen Verbindungen an sich dahingehend komplementär sind, dass zwei Verbindungen, die in einem 20-Komponenten-Gemisch am selben Ort (z. B. A1P1L1) in Bibliothek L1 zusammen vorhanden sind, in irgendeinem der 20-Komponenten-Gemische an irgendeinem Ort der Bibliothek L2 nicht zusammen vorhanden sind.
  • Folglich ist es unter Bezugnahme auf die Primärbibliothek P1 L1 aus Fig. 2 und die Sekundärbibliotheken P1 L2, P2 L2, P3 L2 und P4 L2 aus den Fig. 3-6 beispielsweise möglich, eine Beispielsequenz zu entwinden:
  • -B&sub2;-C&sub3;-D&sub4;-E&sub1;-
  • Ist diese Sequenz ein Substrat, dann tritt Fluoreszenz in P1 L1 bei C&sub3;D&sub4; auf. Dadurch wird die folgende Information über das Substrat erhalten:
  • -?-C&sub3;-D&sub4;-?-
  • Tritt Fluoreszenz in P2 L2 bei B&sub2;E&sub1; auf, dann wird auf das folgende Substrat hingewiesen:
  • -B&sub2;-?-?-E&sub1;-
  • Eine Bestätigung des folgenden Substrats
  • -B&sub2;-C&sub3;-D&sub4;-E&sub1;-
  • müsste durch eine Nicht-Fluoreszenz von P1 L2, P3 L2 und P4 L2 gegeben werden, die alle -B&sub2;-C&sub3;-x-E&sub1; enthalten, wobei X nicht D&sub4; ist.
  • In der Praxis resultiert wahrscheinlich mehr als eine Sequenz in einem Substrat. Informationen darüber, welche Positionen B-C-D-E- gegenüber einer Veränderung empfindlich sind (d. h. eine spezifische Gruppe benötigen) und welche unempfindlich sind (d. h. können mehr als eine Gruppenauswahl tolerieren) im Kontext der gesamten Sequenz, stellen wertvolle SAR-Daten bereit, die dazu verwendet werden können, verwandte Verbindungen zu modellieren und/oder synthetisieren.
  • In analogen Beispielen, in denen, separat, n = 2, 3 oder 4, werden zusätzliche Platten im Bibliothek-L1-Format konstruiert, um jeweils die Komponentenpaare E&sub3; und E&sub4; (n = 2), E&sub5; und E&sub6; (n = 3) und E&sub7; und E&sub8; (n = 4) unterzubringen. Für die jeweiligen Entwindungsbibliotheken des Typs L2 werden die jeweiligen Reihen in den Platten P1, P2, P3 und P4 zunehmend mit jeweils den gepaarten Komponenten D&sub1; und D2, D&sub3; und D&sub4;, D&sub5; und D&sub6; sowie D&sub7; und D&sub5; gefüllt.
  • Ist beispielsweise n = 3 und die Bibliothek enthält 4800 Verbindungen, dann sind in der ersten Spalte der ersten Reihe (A1) der ersten Platte (P1) der Bibliothek L1 (nachfolgend als Ort A1, P1, L1 bezeichnet) eine C Komponente, C&sub1;, eine D Komponente, D&sub1;, die zehn B Komponenten und die beiden E Komponenten (E&sub1; und E&sub2;) enthalten. In der zehnten Spalte der ersten Reihe (A10) der ersten Platte (P1) der Bibliothek L1 (nachfolgend als Ort A10, P1, L1 bezeichnet) sind eine C Komponente, C&sub1;&sub0;, eine D Komponente, D&sub1;, die zehn B Komponenten und die beiden E Komponenten (E&sub1; und E&sub2;) enthalten. In der zehnten Spalte der achten Reihe (H10) der ersten Platte (P1) der Bibliothek L1 (nachfolgend als Ort H10, P1, L1 bezeichnet) sind eine C Komponente, C&sub1;&sub0;, eine D Komponente, D&sub8;, die zehn B Komponenten und die beiden E Komponenten (E&sub1; und E&sub2;) enthalten. Folglich sind alle 1600 Komponenten in der einen Platte anwesend, da die 80 Mulden jeweils 20 Komponenten enthalten.
  • In der ersten Spalte der ersten Reihe (A1) der zweiten Platte (P2) der Bibliothek L1 (nachfolgend als Ort A1, P2, L1 bezeichnet) sind eine C Komponente, C&sub1;, eine D Komponente, D&sub1;, die zehn B Komponenten und die beiden E Komponenten (E&sub3; und E&sub4;) vorhanden. In der zehnten Spalte der ersten Reihe (A10) der zweiten Platte (P2) der Bibliothek L1 (nachfolgend als Ort A10, P2, L1 bezeichnet) sind eine C Komponente, C&sub1;&sub0;, eine D Komponente D&sub1;, die zehn B Komponenten und die beiden E Komponenten (E&sub3; und E&sub4;) enthalten. In der zehnten Spalte der achten Reihe (H10) der zweiten Platte (P2) der Bibliothek L1 (nachfolgend als Ort H10, P1[*7], L1 bezeichnet) sind eine C Komponente, C&sub1;&sub0;, eine D Komponente, D&sub8;, die zehn B Komponenten und die beiden E Komponenten (E&sub3; und E&sub4;) enthalten. Folglich sind 1600 Komponenten in der einen Platte anwesend, da die 80 Mulden jeweils 20 Komponenten enthalten.
  • In der ersten Spalte der ersten Reihe (A1) der dritten Platte (P3) der Bibliothek L2 (nachfolgend als Ort A1, P3, L1 bezeichnet) sind eine C Komponente, C&sub1;, eine D Komponente, D&sub1;, die zehn B Komponenten und die beiden E Komponenten (E&sub5; und E&sub6;) vorhanden. In der zehnten Spalte der ersten Reihe (A10) der dritten Platte (P3) der Bibliothek L1 (nachfolgend als Ort A10, P3, L1 bezeichnet) sind eine C Komponente, C&sub1;&sub0;, eine D Komponente D&sub1;, die zehn B Komponenten und die beiden E Komponenten (E&sub5; und E&sub6;) enthalten. In der zehnten Spalte der achten Reihe (H10) der dritten Platte (P3) der Bibliothek L1 (nachfolgend als Ort H10, P3, L1 bezeichnet) sind eine C Komponente, C&sub1;&sub0;, eine C Komponente [*8], C&sub8; [*9], die zehn B Komponenten und die beiden E Komponenten (E&sub5; und E&sub6;) enthalten. Folglich sind 1600 Komponenten in der einen Platte anwesend, da die 80 Mulden jeweils 20 Komponenten enthalten. Insgesamt enthalten die drei Platten P1, P2 und P3 1600 Verbindungen/Platte; insgesamt 4800 Verbindungen.
  • Ist beispielsweise n = 4 und die Bibliothek enthält 6400 Verbindungen, dann sind in der ersten Spalte der ersten Reihe (A1) der ersten Platte (P1) der Bibliothek L1 (nachfolgend als Ort A1, P1, L1 bezeichnet) eine C Komponente, C&sub1;, eine D Komponente, D&sub1;, die zehn B Komponenten und die beiden E Komponenten (E&sub1; und E&sub2;) enthalten (Fig. 7). In der zehnten Spalte der ersten Reihe (A10) der ersten Platte (P1) der Bibliothek L1 (nachfolgend als Ort A10, P1, L1 bezeichnet) sind eine C Komponente, C&sub1;&sub0;, eine D Komponente, D&sub1;, die zehn B Komponenten und die beiden E Komponenten (E&sub1; und E&sub2;) vorhanden. In der zehnten Spalte der achten Reihe (H10) der ersten Platte (P1) der Bibliothek L1 (nachfolgend als Ort. H10, P1, L1 bezeichnet) sind eine C Komponente, C10, eine D Komponente, D&sub8;, die zehn B Komponenten und die beiden E Komponenten (E&sub1; und E&sub2;) enthalten. Folglich sind alle 1600 Komponenten in der einen Platte anwesend, da die 80 Mulden jeweils 20 Komponenten enthalten.
  • In der ersten Spalte der ersten Reihe (A1) der zweiten Platte (P2) der Bibliothek L1 (nachfolgend als Ort A1, P2, L1 bezeichnet) sind eine C Komponente, C&sub1;, eine D Komponente, D&sub1;, die zehn B Komponenten und die beiden E Komponenten (E&sub3; und E&sub4;) enthalten (Fig. 8). In der zehnten Spalte der ersten Reihe (A10) der zweiten Platte (P2) der Bibliothek L1 (nachfolgend als Ort A10, P2, L1 bezeichnet) sind eine C Komponente, C&sub1;&sub0;, eine D Komponente, D&sub5;, die zehn B Komponenten und die beiden E Komponenten (E&sub3; und E&sub4;) enthalten. In der zehnten Spalte der achten Reihe (H10) der zweiten Platte (P2) der Bibliothek L1 (nachfolgend als Ort H10, P2, L1 bezeichnet) sind eine C Komponente, %, eine D Komponente, Da, die zehn B Komponenten und die beiden E Komponenten (E&sub3; und E&sub4;) enthalten.
  • In der ersten Spalte der ersten Reihe (A1) der dritten Platte (P3) der Bibliothek L1 (nachfolgend als Ort A1, P3, L1 bezeichnet) sind eine C Komponente, C&sub1;, eine D Komponente, D&sub1;, die zehn B Komponenten und die beiden E Komponenten (E&sub5; und E&sub6;) enthalten (Fig. 9). In der zehnten Spalte der ersten Reihe (A10) der dritten Platte (P3) der Bibliothek L1 (nachfolgend als Ort A10, P3, L1 bezeichnet) sind eine C Komponente, C&sub1;&sub0;, eine D Komponente, D&sub1;, die zehn B Komponenten und die beiden E Komponenten (E&sub5; und E&sub6;) enthalten. In der zehnten Spalte der achten Reihe (H10) der dritten Platte (P3) der Bibliothek L1 (nachfolgend als Ort H10, P3, L1 bezeichnet) sind eine C Komponente, C&sub1;&sub0;, eine D Komponente, D&sub8;, die zehn B Komponenten und die beiden E Komponenten (E&sub5; und E&sub6;) enthalten.
  • In der ersten Spalte der ersten Reihe (A1) der vierten Platte (P4) der Bibliothek L1 (nachfolgend als Ort Al, P4, L1 bezeichnet) sind eine C Komponente, C&sub1;, eine D Komponente, D&sub1;, die zehn B Komponenten und die beiden E Komponenten (E&sub7; und E&sub8;) enthalten (Fig. 10). Auf ähnliche Weise sind in der zehnten Spalte der ersten Reihe (A10) der vierten Platte (P4) der Bibliothek L1 (nachfolgend als Ort A10, P4, L1 bezeichnet) eine C Komponente, C&sub1;&sub0;, eine D Komponente, D&sub1;, die zehn B Komponenten und die beiden E Komponenten (E&sub7; und E&sub8;) enthalten. In der zehnten Spalte der achten Reihe (H10) der vierten Platte (P4) der Bibliothek L1 (nachfolgen als Ort H10, P4, L1 bezeichnet) sind eine C Komponente, C&sub1;&sub0;, eine D Komponente, D&sub8;, die zehn B Komponenten und die beiden E Komponenten (E&sub7; und E&sub8;) vorhanden.
  • Eine zweite komplementäre Bibliothek wird wie folgt synthetisiert. In der ersten Spalte der ersten Reihe (A1) der ersten Platte (P1) der Bibliothek L2 (nachfolgend als Ort A1, P1, L2 bezeichnet) sind zehn C Komponenten, zwei D Komponenten (D&sub1; und D&sub2;), eine B Komponente, B&sub1;, und eine E Komponente, E&sub1;, enthalten (Fig. 11). In der zehnten Spalte der ersten Reihe (A10) der ersten Platte (P1) der Bibliothek L2 (nachfolgend als Ort A10, P1, L2 bezeichnet) sind zehn C Komponenten, zwei D Komponenten (D&sub1; und D&sub2;), eine B Komponente, B&sub1;&sub0;, eine E Komponente, Es, enthalten. In der ersten Spalte der achten Reihe (H&sub1;) der ersten Platte (P1) der Bibliothek L2 (nachfolgend als Ort H&sub1;, P1, L2 bezeichnet) sind zehn C Komponenten, zwei D Komponenten (D&sub1; und D&sub2;), eine B Komponente, B&sub1;, und eine E Komponente, Es, enthalten. In der zehnten Spalte der achten Reihe (H10) der ersten Platte (P1) der Bibliothek L2 (H10, P1, L2) sind zehn C Komponenten, zwei D Komponenten (D&sub1; und D&sub2;), eine B Komponente, B&sub1;&sub0;, und eine E Komponente, Es, enthalten. Folglich wird die Matrix, die alle zehn Spalten und alle acht Reihen enthält, zur Unterbringung von insgesamt 1600 Verbindungen verwendet.
  • In der ersten Spalte der ersten Reihe (A1) der zweiten Platte (P2) der Bibliothek L2 (nachfolgend als Ort A1, P2, L2 bezeichnet) sind zehn C Komponenten, zwei D Komponenten (D&sub3; und D&sub4;), eine B Komponente, B1, und eine E Komponente, E&sub1;, enthalten (Fig. 12). In der zehnten Spalte der ersten Reihe (A10) der zweiten Platte (P2) der Bibliothek L2 (nachfolgend als Ort A10, P2, L2 bezeichnet) sind zehn C Komponenten, zwei D Komponenten (D&sub3; und D&sub4;), eine B Komponente, B&sub1;&sub0;, und eine E Komponente, E&sub1;, enthalten. In der ersten Spalte der zweiten Reihe (B1) der zweiten Platte (P2) der Bibliothek L2 (nachfolgend als Ort B1, P2, L2 bezeichnet) sind zehn C Komponenten, zwei D Komponenten (D&sub3; und D&sub4;), eine B Komponente, B1, und eine E Komponente, E&sub2;, enthalten. In der zehnten Spalte der achten Reihe (H10) der zweiten Platte (P2) der Bibliothek L2 (H10, P2, L2) sind zehn C Komponenten, zwei D Komponenten (D&sub3; und D&sub4;), eine B Komponente, B&sub1;&sub0;, und eine E Komponente, E&sub8;, enthalten.
  • In der ersten Spalte der ersten Reihe (A1) der dritten Platte (P3) der Bibliothek L2 (nachfolgend als Ort A1, P3, L2 bezeichnet) sind zehn C Komponenten, zwei D Komponenten (D&sub5; und D&sub6;), eine B Komponente, B1, und eine E Komponente, E&sub1;, enthalten (Fig. 13). In der zehnten Spalte der ersten Reihe (A10) der dritten Platte (P3) der Bibliothek L2 (nachfolgend als Ort A10, P3, L2 bezeichnet) sind zehn C Komponenten, zwei D Komponenten (D&sub5; und D&sub6;), eine B Komponente, B&sub1;&sub0;, und eine E Komponente, E&sub1;, enthalten. In der ersten Spalte der zweiten Reihe (B1) der dritten Platte (P3) der Bibliothek L2 (nachfolgend als Ort B1, P3, L2 bezeichnet) sind zehn C Komponenten, zwei D Komponenten (D&sub5; und D&sub6;), eine B Komponente, B&sub1;, und eine E Komponente, E&sub2;, enthalten. In der zehnten Spalte der achten Reihe (H10) der dritten Platte (P3) der Bibliothek L2 (H10, P3, L2) sind zehn C Komponenten, zwei D Komponenten (D&sub5; und D&sub6;), eine B Komponente, B&sub1;&sub0;, und eine E Komponente, E&sub8;, enthalten. In der ersten Spalte der ersten Reihe (A1) der vierten Platte (P4) der Bibliothek L2 (nachfolgend als Ort A1, P4, L2 bezeichnet) sind zehn C Komponenten, zwei D Komponenten (D&sub7; und D&sub8;), eine B Komponente, B&sub1;, und eine E Komponente, E&sub1;, enthalten (Fig. 14). In der zehnten Spalte der ersten Reihe (A10) der vierten Platte (P4) der Bibliothek L2 (nachfolgend als Ort A10, P4, L2 bezeichnet) sind zehn C Komponenten, zwei D Komponenten (D-, und Da), eine B Komponente, B&sub1;&sub0;, und eine E Komponente, E&sub1;, enthalten. In der ersten Spalte der zweiten Reihe (B1) der vierten Platte. (P4) der Bibliothek L2 (nachfolgend als Ort B1, P4, L2 bezeichnet) sind zehn C Komponenten, zwei D Komponenten (D, und Da), e ine B Komponente, B&sub1;, und e ine E Komponente, E&sub2;, enthalten. In der zehnten Spalte der achten Reihe (H10) der vierten Platte (P4) der Bibliothek L2 (H10, P4, L2) sind zehn C Komponenten, zwei D Komponenten (D&sub7;, und D&sub8;), eine B Komponente, Blo, und eine E Komponente, E&sub8;, enthalten.
  • Für den Fachkundigen wird es offensichtlich sein, dass die Synthese von zwei orthogonalen Sätzen von Lösungsgemischen, die zwei komplementäre FRET-Bibliotheken bereitstellen, indexiert in zwei Dimensionen zur Selbstentwindung, nicht die zurzeit bevorzugte Anordnung - B&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-D&sub1;&submin;&sub8;-E&sub1;&submin;&sub8;- erfordert.
  • Das allgemeine Konzept von zwei orthogonalen Gemischsätzen, indexiert in zwei Dimensionen, kann auf verschiedene Permutationen von Muldenzahlen, Plattenlayout, Anzahl von Permutationen pro Gemisch usw. angewendet werden.
  • Eine numerische Wechselbeziehung kann wie folgt definiert werden:
    • Allgemeine Entwindungsformel -Bb-Cc-Dd-n(Ee)- (I)
  • 1) Primär- und Sekundärplatten haben vorzugsweise die gleiche Anzahl von Verbindungen pro Mulde [X]: ansonsten gibt es zwei Werte mit jeweils Xp und X&sub5;.
  • 2) Die Primärbibliothek umfasst (np) Platten. Wenn Rp·Cp = Rs·Cs, dann beträgt die Anzahl der Platten in der Sekundärbibliothek auch [np]. Wenn nicht, beträgt die Anzahl der Platten in der Sekundärbibliothek [ns]:
  • z. B.: Eine Primärbibliothek mit np = 4, Rp = 8, Cp = 10 kann in einer Rs = 4, Cs = 5 Sekundärbibliothek so dargelegt werden, dass die Anzahl der Platten folgendem entspricht:
  • Anzahl der Verbindungen pro Mulde
  • - Bb-Cc-Dd-np(Ee)- (1)
  • Anzahl der möglichen Kombinationen [k]:
  • k = b.c.d.np.e (2)
  • Wenn die Anzahl der Mulden auf einer Platte = [N], die Anzahl der Verbindungen pro Mulde = [X] und Anzahl der Platten = [np]:
  • k = X.N.np (3)
  • Die; Anzahl der Mulden [N] wird jedoch auch durch die Anzahl der Reihen [Rp] und die Anzahl der Spalten [Cp] definiert:
  • N = Rp.Cp (4)
  • (3) und (4) in Kombination:
  • k = X.Rp.Cp.np (5)
  • (2) und (5) in Kombination:
  • b.c.d.np.e = X.Rp.Cp.np (6)
  • Streichen von [np] von beiden Seiten der Gleichung:
  • b.c.d.e = X.Rp.Cp (7)
  • Zwei der Variablen (z.B. b.c) auf der linken Seite der Gleichung müssen zahlenmäßig jeweils der Anzahl der Spalten [Cp] entsprechen, während eine verbleibende Variable (z. B. d) auf der linken Seite zahlenmäßig der Anzahl der Reihen [Rp] entsprechen muss. Also:
  • [Cp]². Rp.e = X.Rp.Cp (8)
  • Streichen von [Cp] und [Rp] von beiden Seiten der Gleichung:
  • Cp.e = X (9)
  • wobei [e] die Anzahl der Varianten entlang einer festen Reihe ist; und
  • wenn Rp = Cp, dann ist Rp.e = X.
    • Beispiel
  • für ein 10 · 10 · 8 · 8 Format über 4 Platten:
  • np.e = 8 => e = 2
  • 10 · 2 = X
  • X = 20.
  • Anhand der oben dargestellten allgemeinen Entwindungsformel wird der Fachkundige ohne weiteres nachvollziehen können, dass die vorteilhaften Resultate der Selbstentwindung gemäß der Erfindung unter Verwendung einer Reihe verschiedener Muldenanordnungen, Plattenlayouts, Gemische usw. erreicht werden können, und dass es beabsichtigt ist, dass solche Varianten zur hierin illustrierten bevorzugten Ausgestaltung innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung liegen.
  • Die FRET-Strategie basiert auf der Synthese von zwei orthogonalen Sätzen von Lösungsgemischen. Diese Lösungen werden jeweils in zwei Dimensionen indexiert. Folglich identifizieren zum Beispiel die Daten aus einer Protease- Abtastung die aktivsten Verbindungen, ohne dass eine Entschlüsselung oder Resynthese erforderlich ist. Die Positionspräferenzen von Untereinheiten (in diesem Fall Aminosäuren) werden in Bezug auf alle anderen Variantenpositionen simultan optimiert. Die synergistische Beziehung zwischen allen vier Positionen wird realisiert, und es werden sowohl positive, d. h. vorteilhafte, als auch negative, d. h. deaktivierende Daten erzeugt. Dies führt zu Familien (Unterpopulationen) von Substraten mit ihren Untereinheitspräferenzen. Die Daten können in Molekülmodellierungsprogramme eingespeist werden, um pharmakophorische Deskriptoren zu erzeugen, die sowohl die erwünschten Merkmale (von den positiven Daten) als auch die unerwünschten Interaktionen (von den negativen Datensätzen) einschließen. Es ist zu beachten, dass eine Dimensionsabtastung stets nur auf eine "aktivste" Position hinweist und nicht die synergistische Beziehung zwischen Positionen erforscht.
  • Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben.
    • 1. Beispiel:
  • In diesem Beispiel ist das interessante proteolytische Enzym Der P1, das in Kot von Hausstaubmilben zu finden ist. Das Beispiel veranschaulicht die Synthese einer Reihe von FRET-Verbindungen, bei denen die geeignete Bindung eine nichtsubstituierte Amidbindung ist, ihre Verwendung als Bibliothek zum Screenen nach potentiellen Substraten von Der P1 und die folgende Identifizierung und Synthese aktiver Inhibitoren des Enzyms.
    • Reinigung von Der pI
  • Milben-Rohextrakt (~100 mg, SmithKline-Beecham, UK) wurde in 5 ml phosphatgepufferter Salzlösung aufgelöst (PBS; 50 mM Kaliumphosphat, pH 7,4, mit 150 mM NaCl Der pI, wurden durch Affinitätssäulenchromatographie unter Verwendung von 4Cl Antikörper gereinigt (indoor Biotechnology, Deeside, UK)). Das Rohpräparat wurde mit ~2 ml Affinitätsharz 2 Stunden lang bei 4ºC vermischt und dann mit 2-3 Volumen PBS (phosphatgepufferte Salzlösung) gewaschen. Die Elution von gebundenem Protein wurde mit 5 mM Glycin durchgeführt, das 50% (v/v) Ethylenglykol enthielt. Fraktionen (2,2 ml) wurden aufgefangen und mit 0,8 ml von 0,2 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, neutralisiert. Die Fraktionen wurden zusammengefasst und über Nacht mit 4l PBS dialysiert und anschließend mit 2 l PBS 2-3 Stunden lang ein zweites Mal dialysiert. Das gesamte Protein wurde nach Bedarf durch Ultrafiltration konzentriert (MacroSep; Flowgen, UK).
    • Synthese der Verbindungen
  • Die Verbindungen wurden mit dem Multipin-Ansatz25,26 unter Verwendung von Fmoc-Rink-Amid-Makrokronen (Chiron Mimotypes Pty., Ltd., 11 Duerdin Street, Clayton Victoria 3168, Australien) mit einer Ladung von 7 uMol synthetisiert.
  • Die Aminosäurereste der jeweiligen Verbindungen wurden mit Amidbindungen in einer geeigneten Form verknüpft. Die angewendete Kopplungschemie ist der ähnlich, über die in der Literatur²&sup7; in Verbindung mit fluorenylmethoxycarbonylgeschützten Aminosäuren und aktivierten Pentafluorphenylester berichtet wird, bei denen die Seitenketten mit säureunbeständigen Schutzgruppen geschützt sind, die dem Fachkundigen bekannt sein werden, wie z. B. Boc-(für das -NH&sub2; von Lysin, -NH&sub2; von Anthranilsäure und Guanidino von Arginin), tBu- (für die -OH Gruppen von Serin, Threonin und Tyrosin), t-Bu für die -COOH Gruppe von Asparaginsäure und Glutaminsäure, Trityl- (für das Amid von Asparagin und Glutamin und die Amin-Funktionalität des Histidin-Rings)
  • Die N-α-Fluorenylmethoxycarbonyl-Schutzgruppe der gekoppelten Reste wurde mit 20%igem Piperidin in Dimethylformamid (DMF) 30 Minuten lang bei 20ºC gespalten. Die Kopplungsreaktionen für die freien Säuren wie Boc-ABz- OH (Boc-2-aminobenzoesäure) und Fmoc-(3-nitro)tyrosin-OH wurden unter Verwendung von 10 Äquivalenten eines Gemischs der freien Säure (1 Äq.). TBTU (0,98 Äq:). HOBt (0,98 Äq.) : N-Methylmorpholin (1,96 Äq.) in Dimethylformamid (500 ul) als Lösungsmittel über einen Zeitraum von 5 Stunden bei 20ºC erreicht. Die anderen Aminosäuren wurden als ihre Pentafluorphenylester²&sup6; 2-6 Stunden lang gekoppelt.
  • Um in etwa gleiche Anteile jeder Komponente in dem Gemisch der derivatisierten Aminosäuren als ihre Pentafluorphenylester zu koppeln, wurde folglich eine Lösung von insgesamt 0,98 Äquivalenten (relativ zur Aminogruppenladung auf der Krone) des Gemischs aus Aminosäure-Pentafluorphenylester : HOBT (1 Äg.) in DMF (500 ul) 16 Stunden lang bei 20ºC gekoppelt. Die Nadeln wurden anschließend gut mit DMF gewaschen und dann mit dem gleichen Gemisch unter den gleichen Bedingungen erneut gekoppelt. Eine dritte Kopplung von 10 Äquivalenten (relativ zur Aminogruppenladung der Krone) über einen Zeitraum von 2 Stunden in DMF wurde unter Verwendung dieses Kopplungsprotokolls mit äquimolaren Gemischen der derivatisierten Pentafluorphenylester der Aminosäuren in etwas weniger als 1 Äquivalent durchgeführt, es ist möglich, in etwa gleiche Mengen der gekoppelten Produkte an der Krone zu erhalten[*10]. Auf diese Weise werden die Bibliotheken mit 20 Verbindungen auf jeder Krone konstruiert. Die Verbindungen wurden von den Kronen direkt in die 80 vorgesehenen Mulden der gewünschten 96-Mulden- Platte gespaltet. Im Spaltungsprotokoll wurde jede Krone mit einem Gemisch (600 ul) aus Trifluoressigsäure (95%) und Triethylsilan (5%) 2 Stunden lang bei 20ºC behandelt. Die Kronen wurden dann mit Trifluoressigsäure (500 ul) gewaschen und anschließend mit der Spaltungslösung kombiniert.
  • Die Fmoc-Rink-Amid-Makrokronen (Chiron Mimotypes Pty., Ltd., 11 Duerdin Street, Clayton Victoria 3168, Australien) wurden mit einer Ladung von 7 uMol pro Krone mit einem 10- fachen Überschuss eines Gemischs aus L-Fmoc-Asp(O-t-Bu)-OH (1 Äq.) unter Verwendung von TBTU (0,98 Äq.) und N- Methylmorpholin (1,96 Äq.) in Anwesenheit von HOBt (0,98 Äq.) in DMF mit einer Konzentration von 0,14 M gekoppelt. Nach dem Entblockieren der Fmoc-Gruppe mit 20%igem Piperidin in DMF über einen Zeitraum von 30 Minuten und einer anschließenden Wäsche mit DMF und dann Methanol fand eine Kopplung von Fmoc-(3-nitro)tyrosin-OH unter Verwendung von 10 Äquivalenten eines Gemischs aus Fmoc-(3- nitro)tyrosin-OH (1 Äg.). TBTU (0,98 Äq.) : HOBt (0,98 Äq.). N-Methylmorpholin (1,96 Äq.) in Dimethylformamid als Lösungsmittel mit einer Konzentration von 0,14 M über einen Zeitraum von 5 Stunden bei 20ºC statt. Der Beseitigung der Fmoc-Gruppe (vide infra) folgte eine Kopplung der Aminosäuregemische in den dargelegten Verhältnissen und unter den beschriebenen Bedingungen (vide infra).
  • In einem speziellen Beispiel beinhaltet die Aminosäuregruppe B Ala, Val, Leu, Ser, Asn, Gln, Glu, Lys, Phe, Pro. Die Aminosäuregruppe C beinhaltet Ala, Val, Leu, Ser, Asn, Gln, Glu, Lys, Phe, Pro. Die Aminosäuregruppe D beinhaltet Ala, Val, Ile, Leu, Nle, Ser, Glu, Phe. Bei n = 4 beinhaltet die Aminosäuregruppe E Ala, Val, Ile, Leu, Nle, Ser, Glu, Phe. Ansonsten kann jede Auswahl aus den Aminosäuren für N = 1, 2 oder 3 getroffen werden.
  • Die Platten, die die kombinierten Spaltungslösungen enthielten, wurden dann zur Trockne eingedampft und die Komponentengemische wurden unter Verwendung einer Rotationszentrifuge ("SPEEDVAC", Savant Instruments Inc., Farmingdale, NY) mit 800 UPM für 1 Stunde bei 20ºC unter reduziertem Druck von 10&supmin;² mmHg erzeugt. Die einzelnen Komponenten wurden dann zur letzten Mutterplatte mit einem Acetonitril-/Wasser-/Essigsäure-Gemisch (50% : 45% : 5%) übertragen. Die Platten wurden anschließend bei 20ºC unter reduziertem Druck von 102 mmHg zur Trockne lyophilisiert und dann bei -20ºC gelagert. Auf diese Weise wurden Bibliotheken des in den Fig. 2-14 gezeigten Typs präpariert.
  • Das angewendete Multipin-Verfahren wird nachfolgend ausführlich beschrieben:
    • Multipin-Synthese potentieller Substrate von Der pI
  • Der 'Chiron'-Multipin-Kit besteht aus einer standardmäßigen 8 · 12 Nadelhalterung mit 96 'Nadelstielen', an denen 'Kronen' reversibel befestigt sind. Die 'Kronen' stellen eine reaktive Polymeroberfläche bereit, auf der ein wachsendes Peptid während der Festphasen-Peptidsynthese verankert wird. Jede Krone (das Äquivalent des Peptidharzes in der standardmäßigen Festphasensynthese) kann als ein unabhängiger Reaktor angesehen werden, indem eine simultane Synthese in individuellen 1-ml-Mulden von 96-Mulden-Platten nach Industrienorm durchgeführt wird. Jede Mulde, und folglich jede Krone, kann mit einem einzigartigen Satz Reagenzien gefüllt werden, die jeder Krone einzigartige Sequenzen liefern. Allgemeine Maßnahmen wie Waschen oder Beseitigen des Nα-Schutzes können gleichzeitig durchgeführt werden.
  • Die Synthese basiert auf der Verwendung von Nα- fluorenylmethyloxycarbonyl-(Fmoc)-geschützten Aminosäuren. Seitenketten trifunktioneller Aminosäuren werden mit säureunbeständigen Gruppen wie Trityl oder Tert-Butyl geschützt. Die Zugabe von Aminosäureresten zur wachsenden Peptidkette, ein als 'Kopplung' bezeichneter Prozess, geht durch den Einsatz vorgeformt er Pentafluorphenyl- (pfp) -Ester oder die Aktivierung der freien Säure vonstatten, wobei die Reagenzien HBTU oder BOP in Anwesenheit von einer tertiären Base (NMM) und HOBt als Katalysator verwendet werden.
  • Die angewendeten Versuchstechniken sind ausführlich dokumentiert (Maeji, N. J. Bray, A. M. Valerio, R. M. und Wang, W., Peptide Research, 8(I), 33-38, 1995 und Valerio, R. M. Bray, A. M. und Maeji, N. J. Int. J. Pept. Prot. Res, 44, 158-165, 1994). Es folgt eine kurze Beschreibung der Hauptschritte.
    • Allgemeine Verfahren Präparation einer Multipin-Anordnung
  • Herkömmliche Plastikhandschuhe tragend werden die mit Fmoc-Rink Amid derivatisierten[*11] Makrokronen auf Stielen montiert (einfach angeklemmt) und in dem gewünschten Muster für die Synthese in die 8 · 12 Stielhalterung gesteckt.
    • Aufhebung des Nα-Fmoc-Schutzes
  • In ein lösungsmittelbeständiges 250-ml-Bad werden 200 ml einer 20%igen Piperidin/DMF-Lösung gegeben. Die Multipin-Anordnung wird zugegeben, und über einen Zeitraum von 30 Minuten findet eine Schutzaufhebung statt. Anschließend wird die Anordnung herausgenommen und überschüssige s Lösungsmittel durch kurzes Schütteln entfernt. Die Anordnung wird dann nacheinander mit (jeweils 200 ml) DMF (5 Minuten) und MeOH (5 Minuten, 2 Minuten, 2 Minuten) gewaschen und 15 Minuten lang an der Luft trocknen gelassen.
    • Quantitative UV-Messung der Fmoc-Chromopor-Freisetzung
  • Eine UV-Zelle mit einer Dicke von 1 cm wird mit 1,2 ml einer 20%igen Piperidin/DMF-Lösung gefüllt und dazu verwendet, die Absorbanz des UV-Spektrometers bei einer Wellenlänge von 290 nm auf Null einzustellen. Anschließend wird ein UV-Standard hergestellt, der aus 5,0 mg Fmoc- Asp(OBut)-Pepsyn KA (0,08 mmol/g) in 3,2 ml einer 20%igen Piperidin/DMF-Lösung besteht. Dieser Standard ergibt Abs&sub2;&sub9;&sub0; = 0,55-0,65 (bei Raumtemperatur). Eine Aliquote der Multipin-Schutzaufhebungslösung wird dann bei Bedarf verdünnt, um einen theoretischen Wert von Abs&sub2;&sub9;&sub0; = 0,6 zu erhalten, wobei dieser Wert im Vergleich zur tatsächlich experimentell gemessenen Absorbanz die Effizienz der vorherigen Kopplungsreaktion zeigt.
    • Kopplung von Aminosäureresten
  • Während die Multipin-Anordnung trocknet, werden die entsprechenden Na-Fmoc-Aminosäure-pfp-Ester (10 Äquivalente, errechnet von der Ladung jeder Krone) und HOBt (10 Äquivalente), die für den bestimmten Kopplungsgang erforderlich sind, akkurat in geeignete Behälter abgewogen. Alternativ werden die entsprechenden Nα-Fmoc-Aminosäuren (10 Äquivalente, errechnet von der Ladung jeder Krone), ein gewünschtes Kopplungsmittel wie z. B. HBTU (9,9 Äquivalente, errechnet von der Ladung jeder Krone) und ein Aktivierungsmittel wie z. B. HOBt (9,9 Äquivalente, errechnet von der Ladung jeder Krone), NMM (19,9 Äquivalente, errechnet von der Ladung jeder Krone) akkurat in geeignete Behälter abgewogen.
  • Die geschützten und aktivierten Fmoc- Aminosäurederivate werden dann in DMF aufgelöst (500 ul für jede Makrokrone; für 20 Makrokronen würden z. B. 20 · 10 Äq. · 7 mmol Derivat in 10.000 ul DMF aufgelöst). Die entsprechenden Derivate werden dann in die entsprechenden Mulden gegeben, die für die Aufnahme des 'Kopplungszyklus' bereit sind. Gewöhnlich lässt man Kopplungsreaktionen 2 bis 6 Stunden lang ablaufen (je nach der Art der Kopplung, z. B. Ala an Ala - 2 Stunden, Val an Leu - 6 Stunden).
  • Beim Koppeln von Fmoc-Aminosäüre-Pentafluorphenylester werden 10 Äq. Derivat in DMF (400 ul) mit Bromphenolblau- Vorratslösung (100 ul) für jede Makrokrone verwendet. Dadurch ist eine Überwachung des Fortschritts der Acylierungsreaktion anhand des Übergangs der tiefblauen Färbung von Bromphenolblau in Anwesenheit von nicht umgesetztem Amin in ein Blassgelb nach Abschluss der Acylierung möglich.
    • Herstellung einer Bromphenolblau-Vorratslösung
  • Bromphenolblau (20 mg) wird in DMF (50 ml) aufgelöst und HOBt (10 mg) hinzugegeben.
    • Wäsche nach der Kopplung
  • Wenn unmittelbar nach dem Kopplungszyklus eine Schutzaufhebung mit 20%igem Piperidin/DMF stattfinden soll, dann wird die Multipin-Anordnung kurz geschüttelt, um überschüssiges Lösungsmittel zu entfernen, und nacheinander mit (jeweils 200 ml) MeOH (5 Minuten) und DMF (5 Minuten) gewaschen und entschützt (siehe oben). Wenn die Multipin- Anordnung gelagert werden soll, wird ein kompletter Waschzyklus durchgeführt, der aus einem kurzen Schüttelvorgang und der anschließenden Wäsche mit (jeweils 200 ml) DMF (5 Minuten) und MeOH (5 Minuten, 2 Minuten, 2 Minuten) besteht.
    • Acidolytisch vermittelte Spaltung einer Peptid- Nadelanordnung
  • Säurevermittelte Spaltungsprotokolle werden strikt in einem Abzugsschrank durchgeführt. Eine Polystyrolplatte mit 96 Mulden (1 ml/Mulde) wird markiert und anschließend wird das Leergewicht auf den nächsten mg-Wert gemessen. Angemessene Mulden werden dann mit einer Trifluoressigsäure/Triethylsilan-Spaltungslösung (95 : 5, v/v, 600 ul) in einem Muster gefüllt, das dem der zu spaltenden Multipin-Anordnung entspricht.
  • Die Multipin-Anordnung wird zugegeben und das gesamte Konstrukt mit Stanniol abgedeckt und 2 Stunden lang stehen gelassen. Die Multipin-Anordnung wird dann 5 Minuten lang in eine andere 96-Mulden-Polystyrolplatte (1 ml/Mulde) gegeben, die Trifluoressigsäure/Triethylsilan (95 : 5, v/v, 600 ul) (wie oben) enthält.
  • Die gespaltene Anordnung wird mit DMF (200 ul, 5 Minuten), MeOH (200 ul, 5 Minuten) gewaschen, die verbrauchten Kronen werden entfernt und entsorgt, die Stiele werden entfernt und durch Beschallung in Methanol (1 Std. bei Raumtemperatur) gewaschen.
    • Aufarbeitung von gespaltenen Peptiden
  • Die primäre Polystyrol-Spaltungsplatte (2 Std. Spaltung) und die sekundäre Polystyrolplatte (5 Min. Wäsche) (siehe oben) werden dann in den SpeedVac gegeben und die Lösungsmittel über einen Zeitraum von 90 Minuten (Mindesttrocknungsrate) entfernt.
  • Der Inhalt der sekundären Polystyrolplatte (siehe oben) wird in die entsprechenden Mulden auf der Primärplatte unter Verwendung einer Lösung aus Acetonitril/Wasser/Essigsäure (50 : 45 : 5, v/v/v) (3 · 150 ul) gegeben, und die verbrauchte Sekundärplatte wird entsorgt.
    • Produktanalyse
  • 1,0 ul jeder Mulde (siehe oben) wird mit 0,1%iger wssr. TFA auf 400 ul verdünnt und anhand HPLC-MS analysiert. Säule: Vydac C4 (214TP52, eng, 21 · 250 mm). Elutionsmittel: Lösungsmittel A = 0,1%ige wssr. Trifluoressigsäure, Lösungsmittel B = Acetonitril/10% A. Gradient: 10-90% B in A über 27 Min., 250 ml/Min., 215 nm UV-Nachweis. Die nachfolgend beschriebenen individuellen Substrate wurden anhand der obigen Verfahren hergestellt, und anhand HPLC-MS wurde ein Wert von > 95% mit der korrekten Masse ermittelt.
    • Letzte Lyophilisierung von Peptiden
  • Die Primärpolystyrolplatte (plus Waschflüssigkeit von der Sekundärplatte) wird mit Stanniolfolie bedeckt, die mit einem Elastikband an der Platte festgehalten wird. Ein Nadeleinstich wird in die Folie direkt über den einzelnen Mulden gemacht, und die Platte wird 30 Minuten lang bei -80ºC gehalten. Die Platte wird dann auf dem "Heto- Gefriertrockner" über Nacht lyophilisiert. Bei Bedarf werden individuelle Peptide dann gewogen und zu 10 mM Vorratslösungen in DMSO vor dem biologischen Screening aufgelöst. Alternativ wird das 20-Komponenten-Gemisch gewogen und das Verhältnis zwischen Peptid und 20- Komponenten-Gemisch berechnet.
  • Eine weitere Kopplung der Aminosäurereste wurde gemäß dem oben beschriebenen Multipin-Ansatz durchgeführt. Während die Multipin-Anordnung trocknete, wurden die entsprechenden Nα-Fmoc-Aminosäuren (10 Äquivalente, errechnet von der Ladung jeder Krone), HATU Kopplungsmittel (9,9 Äquivalente, errechnet von der Ladung jeder Krone), HOAt Katalysator (9,9 Äquivalente, errechnet von der Ladung jeder Krone) und DIPEA (19,9 Äquivalente, errechnet von der Ladung jeder Krone) akkurat in geeignete Behälter abgewogen.
  • Die geschützten Nα-Fmoc-Aminosäuren und Kopplungsmittel wurden anschließend in DMF aufgelöst (500 4 für jede Makrokrone) und durch die Zugabe von DIPEA aktiviert. Die entsprechenden Derivate wurden dann in ihre entsprechenden Mulden abgegeben, und eine [*12] Standardkopplung an die jeweiligen Makrokronen fand über einen Zeitraum von 2 Stunden statt.
  • Wenn die Kopplung insbesondere Aminosäurereste wie N- Methyl, Cα-Methyl oder unübliche Aminosäuren (deren Kopplungseffizienz unbekannt ist) behinderte, dann wurde die Kopplungsreaktion gewöhnlich über einen Zeitraum von weiteren 2 Stunden wiederholt.
    • Substrate für Der pI
  • Anhand der allgemeinen Techniken, die zuvor beschrieben wurden, wurden die folgenden Verbindungen präpariert und als potentielle Substrate mit wie zuvor beschrieben gereinigtem Der pI untersucht.
  • NS weist darauf hin, dass das Peptid nicht durch Der pI hydrolysiert wurde.
  • NM weist darauf hin, dass das Peptid ein Substrat für Der pI war, allerdings wurde der Km-Wert nicht gemessen.
  • NM² weist darauf hin, dass das Peptid ein Substrat für Der pI war und seiner Spaltung eine HPLC-MS folgte, die ergab, dass eine Hydrolyse zwischen -Nle-Ser- stattfand.
  • Nach Spaltungsgeschwindigkeit geordnet: -B2 > n-But > Piv > Bz(2-carboxy) > Abz.
  • Die Kopplung von Aminosäureresten wurde gemäß dem oben beschriebenen Multipin-Verfahren durchgeführt. Während die Multipin-Anordnung trocknete, wurden die entsprechenden Nec- Fmoc-Aminosäuren (10 Äquivalente, errechnet von der Ladung jeder Krone), HATU Kopplungsmittel. (9,9 Äquivalente, errechnet von der Ladung jeder Krone), HOAt Katalysator (9,9 Äquivalente, errechnet von der Ladung jeder Krone) und DIPEA (19,9 Äquivalente, errechnet von der Ladung jeder Krone) akkurat in geeignete Behälter abgewogen.
  • Die geschützten Nα-Fmoc-Aminosäuren und Kopplungsmittel wurden anschließend in DMF aufgelöst (500 ul für jede Makrokrone) und durch die Zugabe von DIPEA aktiviert. Die entsprechenden Derivate wurden dann in ihre entsprechenden Mulden abgegeben, und eine Standardkopplung an die jeweiligen Makrokronen fand über einen Zeitraum von 2 Stunden statt.
  • Wenn die Kopplung insbesondere Aminosäurereste wie N- Methyl, Cα-Methyl oder unübliche Aminosäuren (deren Kopplungseffizienz unbekannt ist) behinderte, dann wurde die Kopplungsreaktion gewöhnlich über einen Zeitraum von weiteren 2 Stunden wiederholt.
  • Die folgenden Sequenzen wurden auf diese Weise synthetisiert:
  • NS - Kein Substrat: nicht durch Der pI hydrolysiert
  • NM - Substrat, aber nicht gemessen: Substrat für Der pI, aber nicht gemessen.
    • Testverfahren
  • Jedes Gemisch aus 20 Verbindungen in den Bibliotheken der hierin beschriebenen Vorrichtung wurde bei einer Konzentration von 1,0 uM pro Verbindung in einem Test mit der Cysteinylprotease Der pI gescreent. Die aktivsten Mulden wurden anhand der Emissionsrate von Fluoreszenz bei 420 nm identifiziert, wenn die Proben mit 320 nm bestrahlt wurden. Eine Analyse der beiden komplementären Bibliotheken ergab, dass die besten Substrate für das Enzym die folgenden waren:
  • Abz-B-C-D-E-Tyr(NO2)-Asp-NH2
  • wobei
  • B = Valin> Alanin, Glutamin, Leucin, Phenylalanin
  • C = Alanin> > Glutamin, oder Lysin.
  • D = Leucin, Norleucin oder Alanin> Serin
  • E = Serin
  • Die besten Substrate waren:
  • [SEQ ID Nr. 1] Abz-Val-Ala-Nle-Ser-Tyr(NO&sub2;)-Asp-NH&sub2;
  • Diese Verbindung wurde dann als eine Einzelkomponente anhand der hierin beschriebenen Peptidsynthesemethodik resynthetisiert. Der kcat/Km-Messwert für das reine Substrat im Der pI Test lag bei 3,5 · 10&sup4;N&supmin;¹s&supmin;¹ und wurde für den Einsatz in einem Test mit hohem Durchsatz zum allgemeinen Screenen der Inhibitoren von Der pI als angemessen hoch befunden.
    • Entwicklung eines Tests mit hohem Durchsatz
  • Es wurden Plattentests im 96-Mulden-Plattenformat unter Verwendung von 0,1 ug Der pI pro 100-ul-Testvolumen in jeder Mulde und unter Verwendung von 20 uM des Substrats durchgeführt. Alle Tests wurden in Testpuffer (AB; 50 mM Kaliumphosphat, pH 8,25, mit 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 1 mM Dithiothreitol (DTT)) durchgeführt. Das Der pI Enzym wird durch Zugabe von DTT voraktiviert und dann bei Raumtemperatur 5 Minuten lang inkubiert, bevor der Test eingeleitet wird. Im Rahmen der Screening-Methodik enthält beispielsweise jede Mulde 5 jzl einer 20-UM-Lösung der Testverbindung in DMSO, 10 ul einer wässrigen 200-uM-Lösung des Substrats, 2, und 85 ul von Der pI in AB werden zum Einleiten der Reaktion zugegeben. Die Enzymaktivität wird anhand der Fluoreszenz unter Verwendung von 320 nm zur Anregung und 420 nm für die Emissionswellenlängen mit einer Labsystems Fluroskan- Ascent-Maschine überwacht. Kinetische Messungen wurden mit einem F-4500 Fluoreszenz-Spektrophotometer von Hitachi durchgeführt.
    • Synthese der Inhibitoren von Der pI
  • Per HPLC-Massenspektrometrie der Enzym-/Testlösung wurde gezeigt, dass das oben beschriebene beste Substrat zwischen der Norleucin-Serin-Amidbindung gespalten war. Durch einen Ersatz der Abz-Endgruppe mit einer Serie von Derivaten (z. B. Boc-, Pivaloyl, Benzoyl und 2-Carboxy- Benzoyl) wurde die Substrataktivität und Spezifität für das Der pI Enzym beeinflusst. Mit dieser Kenntnis des P&sub1;-P1'- Spaltungsortes und für [*13] das P&sub4;-P&sub3;-P&sub2;-P&sub1;-Motivs wurde die Verbindung Boc-Val-Ala-Leu-H, 4, wie im Schema 1a, Fig. 15 gezeigt, synthetisiert.
  • Die Anlagerung eines geeigneten Michael-Akzeptors wie CH=CH-CO2Et und -CH=CH-SO&sub2; Ph an das Motiv (Schema 2, Fig. 16) ergab aktive Inhibitoren des Enzyms mit den scheinbaren IC&sub5;&sub0;-Werten von jeweils 50 nM, 1000 nM und 100 nM.
    • Präparation einer Acyloxymethylketon-Serie
  • Eine Serie von Acyloxymethylketon-Verbindungen mit aktiver Der PI Inhibitoraktivität wurde anhand der folgenden Verfahren präpariert:
    • N-Benzoyl-L-valyl-L-alanyl-L-norleucin
  • N-Benzoyl-L-valyl-L-alanyl-L-norleucin wurde anhand einer Festphasensynthese eines benzoylierten Peptids wie folgt präpariert:
    • Harzladung (1. Schritt)
  • 2-Chlortritylchloridharz (4,9 g, 1,05 mmol/g, Novabiochem) wurde in Dichlormethan (40 ml) zum Quellen gebracht, und es wurde eine Suspension von Fmoc-L-Norleucin zugegeben und 5 Minuten lang gerührt. Eine Lösung aus Diisopropylethylamin in DCM (10 ml, 57 mmol in 30 ml) wurde über einen Zeitraum von 5 Minuten zugegeben, und das resultierende Gemisch wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden lang gerührt. Es wurde Methanol (5 ml) zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde weitere 10 Minuten gerührt, wonach das Harz filtriert und mit 3x DCM, 2x DMF, 2x 2-Propanol, 2x DMF, 2x 2-Propanol, Methahol, 2x Ether gewaschen und unter Vakuum 24 Stunden lang getrocknet wurde.
    • Aminosäure-Schutzaufhebung (2. Schritt)
  • Mit Fmoc-L-Norleucin beladenes Harz wurde durch eine Behandlung mit 20%igem Piperidin in DMF über einen Zeitraum von 4 Stunden einer Schutzaufhebung unterzogen. Das aufgequollene Harz wurde filtriert, mit 5x DMF, 2x Ether gewaschen und unter Vakuum 24 Stunden lang getrocknet.
    • Peptidkettenerweiterung (3. Schritt)
  • L-Norleucin-beladenes Harz (5 mmol) wurde in eine Lösung aus Fmoc-L-Alanin (6,23 g, 20 mmol), Hydroxybenzotriazol (3,0 g, 20 mmol), 2-(1-H-benzotriazol- 1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-hexafluorphosphat (7,59 g, 20 mmol) und Diisopropylethylamin (6,97 ml, 40 mmol) in DMF (20 ml) gegeben und über einen Zeitraum von 4 Stunden unter sanftem Rühren zum Quellen gebracht. Das Harz wurde filtriert und mit 4x DMF, 2x Ether gewaschen und unter Vakuum über Nacht getrocknet.
  • Die Schritte (2) und (3) wurden wiederholt mit Fmoc-L- Alanin und Fmoc-L-Valin durchgeführt, um harzgebundenes Tripeptid-H-L-valyl-L-alanyl-L-norleucin zu erzeugen.
    • Peptidkettenbenzoylierung (4. Schritt)
  • Mit L-Valyl-L-alanyl-L-norleucin beladenes Harz (1 g, etwa 1 mmol) wurde in eine Lösung aus Benzoesäure (0,488 g, 4 mmol), Hydroxybenzotriazol (0,6 g, 4 mmol), 2-(1-H- Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat (1,52 g, 4 mmol) und Diisopropylethylamin (1,40 ml, 8 mmol) in DMF (5 ml) gegeben und 6 Stunden lang unter sanftem Rühren zum Quellen gebracht. Das Harz wurde filtriert und mit 4x DMF, 2x Ether gewaschen und unter Vakuum über Nacht getrocknet.
    • Harzspaltung (5. Schritt)
  • Mit N-Benzoyl-L-valyl-L-alanyl-L-norleucin beladenes Harz (1,0 g, etwa 1 mmol) wurde mit einer 1%igen Lösung aus Trifluoressigsäure in Dichlormethan (20 ml), die Triethylsilan (320 ml, 2 mmol) enthielt, 1 Stunde lang behandelt. Das Harz wurde durch Filtration entfernt und mit Dichlormethan (3 · 10 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde aufgefangen, verdampft und mit Ether titriert, um N- Benzoyl-L-valyl-L-alanyl-L-norleucin (285 mg) zu erzeugen. Elektrospray-MS m/z 407 [MH&spplus;].
    • Brommethylketonbildung (6. Schritt) N-Benzoyl-L-valyl-L-alanyl-L-norleucin-brozmuethylketon
  • N-Benzoyl-L-valyl-L-alanyl-L-norleucin (140 mg, 0,34 mmol) wurde in trockenem THF (3 ml) suspendiert und trockenes DMF wurde tropfenweise zugegeben, um Homogenität zu erzielen. Das Reaktionsgemisch wurde auf -10ºC abgekühlt, und Isobutylchlorameisensäureester (129 ml, 1,0 mmol) und N-Methylmorpholin (109 ml, 1,0 mmol) wurden unter Rühren unter Argon zugegeben. Das Gemisch wurde 30 Minuten lang gerührt und anschließend wurde eine Lösung aus Diazomethan in Ether (5 ml, etwa 2 mmol) zugegeben. Man ließ das Reaktionsgemisch 1 Stunde lang auf Raumtemperatur erwärmen; anschließend wurde eine 1 : 1-Lösung aus Essigsäure und 50%igem HBr (1 ml, 3,0 mmol HBr) tropfenweise zugegeben und es fand ein 15-minütiger Rührvorgang statt. Die organische Phase wurde mit Ethylacetat (40 ml) verdünnt, mit Wasser (10 ml), Salzlake (10 ml) und Natriumbicarbonat (2 · 10 ml) gewaschen, getrocknet über MgSO&sub4; Lösungsmittel unter Vakuum entfernt [*14]. Hieraus ging ein gebrochen weißer Feststoff (152 mg) hervor, der bei Bedarf durch präp. HPLC weiter gereinigt werden konnte. Elektrospray-MS m/z 482 [MH&spplus;] und 484 [MH&spplus;].
    • Acyloxymethylketonbildung (7. Schritt) N-Benzoyl-L-valyl-L-alanyl-L-norleucin-2,6- bis(trifluormethyl)benzoyloxymethylketon
  • Ein Gemisch aus Kaliumfluorid (0.1 mmol, 6 mg). und 2,6-Bis(trifluormethyl)benzoesäure (0,066 mmol, 17 mg) in trockenem DMF (500 ml) wurde 5 Minuten lang über Molekularsieben bei Raumtemperatur gerührt. Eine Lösung aus N-Benzoyl-L-valyl-L-alanyl-L-norleucin-brommethylketon (0,033 mmol, 16 mg) in trockenem DMF (500 ml) wurde zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde durch einen kurzen Silica-Stopfen geleitet und mit 5%igem Methanol in Dichlormethan gewaschen. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum beseitigt und der Rest unter Anwendung von präp. HPLC gereinigt. Aus einer Gefriertrocknung ging ein weißes Lyophilisat (6,4 mg) hervor. Elektrospray-MS m/z 660 [MH&spplus;].
  • Die folgenden Verbindungen wurden auf ähnliche Weise präpariert:
  • N-Benzoyl-L-valyl-L-alanyl-L-norleucin-2,6- dimethylbenzoyloxymethylketon (Elektrospray-MS m/z 552 [MH&spplus;]) von N-Benzoyl-L-valyl-L-alanyl-L-norleucinbrommethylketon und 2,6-Dimethylbenzoesäure.
  • N-Benzoyl-L-valyl-L-alanyl-L-norleucin-2,6- hydroxybenzoyloxymethylketon (Elektrospray-MS m/z 550 [MH&spplus;]) von N-Benzoyl-L-valyl-L-alanyl-L-norleucinbrommethylketon und 2-Hydroxybenzoesäure.
  • N-Benzoyl-L-valyl-L-alanyl-L-norleucin-2,6- dichlorbenzoyloxymethylketon (Elektrospray-MS m/z 592 [MH&spplus;] und 594 [MH&spplus;]) von N-Benzoyl-L-valyl-L-alanyl-L-norleucinbrommethylketon und 2,6-Dichlorbenzoesäure.
  • N-Benzoyl-L-valyl-L-alanyl-L-norleucinbenzoyloxymethylketon (Elektrospray-MS m/z 524 [MH&spplus;]) von N-Benzoyl-L-valyl-L-alanyl-L-norleucin-brommethylketon und Benzoesäure.
  • N-Benzoyl-L-valyl-L-alanyl-L-norleucin-2,3,4,5,6- pentafluorbenzoyloxymethylketon (Elektrospray-MS m/z 614 [MH&spplus;]) von N-Benzoyl-L-valyl-L-alanyl-L-norleucinbrommethylketon und 2,3,4,5,6-Pentafluorbenzoesäure.
  • N-Benzoyl-L-valyl-L-alanyl-L-norleucin-1,1- dimethylpropyloxymethylketon (Elektrospray-MS m/z 504 [MH&spplus;]) von N-Benzoyl-L-valyl-L-alanyl-L-norleucinbrommethylketon und 1,1-Dimethylpropionsäure.
  • N-Benzoyl-L-valyl-L-alanyl-L-norleucin-N(- benzyloxycarbonyl)-Dserinyl-(O-tert-butyl)oxymethylketon (Elektrospray-MS m/z 697 [MH&spplus;]) von N-Benzoyl-L-valyl-L- alanyl-L-norleucin-brommethylketon und N-Benzyloxycarbonyl- D-serin-O-tert-butylether.
  • N-Benzoyl-L-valyl-L-alanyl-L-norleucin-N(- benzyloxycarbonyl)-Dserinoxymethylketon (Elektrospray-MS m/z 641 [MH&spplus;]) von N-Benzoyl-L-valyl-L-alanyl-L-norleucinbrommethylketon und N-Benzyloxycarbonyl-D-serin.
  • N-Benzoyl-L-valyl-L-alanyl-L-norleucin-2- furanoxymethylketon (Elektrospray-MS m/z 514 [MH&spplus;]) von N- Benzoyl-L-valyl-L-alanyl-L-norleucin-brommethylketon und 2- Furancarbonsäure.
  • N-Benzoyl-L-valyl-L-alanyl-L-norleucin-2,6- dichlorphenylacyloxymethylketon (Elektrospray-MS m/z 606 [MH&spplus;], 608 [MH&spplus;]) von N-Benzoyl-L-valyl-L-alanyl-L- norleucin-brommethylketon und 2,6-Dichlorphenylessigsäure.
  • Präp. HPLC-Standardbedingungen waren wie folgt: präparatives C4-HPLC-System (Vydac, 22 · 250 mm); Elution von 10 ml pro Minute mit einem Gradienten von 5-95% (90% Acetonitril (0,1% TFA)) über einen Zeitraum von 30 Minuten.
  • Die folgenden Verbindungen wurden mit den unter den jeweiligen genannten Verbindungen beschriebenen Techniken und Verfahren präpariert.
    • Präparation von Ethyl-(S)-(E)-3-((tert-butoxy-carbonylamino-valyl-alanyl)amino-6-methyl-hept-2-enoat
  • In eine Suspension von Natriumhydrid (46 mg, 1,9 mmol) in wasserfreiem THF (4 ml), die auf 0ºC abgekühlt war, wurde tropfenweise eine Lösung aus Triethylphosphonoacetat (420 mg, 1,9 mmol) in THF (2 ml) über einen Zeitraum von 5 Minuten gegeben, und das Gemisch wurde gerührt, bis die Gasentwicklung aufhörte. Die Lösung wurde tropfenweise in eine Lösung aus BocVAL-CHO (600 mg, 1,56 mmol) in trockenem THF gegeben, die auf -10ºC abgekühlt war. Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde lang gerührt, und es wurde gesättigtes Ammoniumchlorid (10 ml) zugegeben. Ein weißer Feststoff präzipitierte, der durch Filtration entfernt wurde, und das Filtrat wurde zwischen Ethylacetat und Wasser aufgeteilt. Die organische Schicht wurde mit Magnesiumsulfat getrocknet und verdampft, um ein Öl zu erzeugen, das von Acetonitril-Wasser kristallisiert wurde, um die Titelverbindung zu erhalten (640 mg, 91%).
  • MS (EI pos.); errechnet (M&spplus;(C&sub2;&sub3;H&sub4;&sub1;N&sub3;O&sub6;)+1) = 456; gefunden (M&spplus; + H) = 456, ((M&spplus;-tBOC)+1) = 356 (100%).
    • Präparation von (S)-(E)-3-((tert-butoxy-carbonyl-aminovalyl-alanyl)amino-6-methyl-hept-2-enoicsäure[*15]
  • Der Ethylester (455 mg, 1 mmol) wurde in Dioxan (10 ml) aufgelöst, und es wurde Wasser, gefolgt von Lithiumhydroxid (126 mg, 3 mmol) zugegeben. Die Lösung wurde 3 Stunden lang gerührt, und es wurde 1 M wssr. HCl zugegeben, bis der pH-Wert Neutralität erreichte. Das Dioxan wurde durch Rotationsverdampfung entfernt und der pH-Wert mit 1 M wssr. HCl auf 4 eingestellt. Die Titelverbindung präzipitierte, wurde filtriert und mit Wasser gewaschen, um einen Ertrag von 420 mg, 98% zu erhalten.
  • MS (E&sub1; pos.) errechnet (M+(C&sub2;&sub1;H&sub3;&sub7;N&sub3;O&sub6;)+1 = 428; gefunden (M&spplus; + H) = 428 (100%).
    • Präparation von 1,1,1-Trifluorethyl-(S)-(E)-3-((tertbutoxycarbonylamino-valyl-alanyl)amino-6-methyl-hept-2- enoat
  • Die Säure (BocVAL-CO&sub2;H) (50 mg, 0,117 mmol) und Dimethylaminopyridin (29 mg, 0,24 mmol) wurden in trockenem Dichlormethan (1 ml) aufgelöst und auf 0ºC abgekühlt. Es wurde wasserlösliches Carbodiimidhydrochloridsalz (26 mg, 0,13 mmol) in 0,5 ml Dichlormethan zugegeben, und die Lösung wurde 5 Minuten lang gerührt. Es wurde 1,1,1- Trifluorethanol (0,017 ml, 0,23 mmol) in 0,5 ml Dichlormethan zugegeben; män ließ das Reaktionsgemisch nach 1 Stunde auf Raumtemperatur erwärmen, und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde gewaschen (2 · 2 ml 0,5 M Citronensäurelösung, 1 · 2 ml Wasser, 1 · 2 ml gesättigte Natriumbicarbonatlösung, 1 · 2 ml Wasser), mit Magnesiumsulfat getrocknet und zur Trockne eingedampft, um die Titelverbindung zu erzeugen.
  • MS (EI pos.) errechnet (M+(C&sub2;&sub3;H&sub3;&sub8;N&sub3;O&sub6;F&sub3;)+1) = 510; gefunden (M&spplus; + H) = 510, ((M&spplus;-tBOC)+1) = 410, ((M&spplus; - tBu)+1) = 454 (100%).
    • Präparation von Ethyl-(S)-(E)-3-(N-benzoyl-valylalanyl)amino-6-methyl-hept-2-enoat
  • Der mit Tert-Butoxycarbonyl geschützte Ethylester (16,6 mg, 0,036 mmol) wurde in 4,0 M HCl in Dioxan (2 ml) aufgelöst, bei Raumtemperatur 30 Minuten lang gerührt und zur Trockne eingedampft. Der Rest wurde in DMF (0,5 ml) aufgelöst, und es wurde N-Methylmorpholin (7,36 mg, 0,073 mmol) zugegeben, gefolgt von Benzoylchlorid (5,4 mg, 0,038 mmol) in DMF (0,5 ml). Das Reaktionsgemisch wurde 2 Stunden lang gerührt, mit 0,1%iger Trifluoressigsäurelösung (4 ml) und Acetonitril (2 ml) verdünnt und auf ein präparatives C4-HPLC-System (22 · 250 mm) injiziert, mit einer Elution von 10 ml pro Minute, einer Überwachung bei 215 nm und einem Gradienten von 10-90% System B über einen Zeitraum von 25 Minuten und einem 15-minütigen Aufenthalt bei 90%. System A = 0,1% TFA in Wasser, System B = 90% Acetonitril, 10% System A. Der bei 26-28 Minuten eluierende Peak wurde aufgefangen und lyophilisiert, so dass ein weißer Feststoff mit einem Ertrag von 4,5 mg, 27% entstand.
  • Analyse durch MS (EI pos.); errechnet (M&spplus;(C&sub2;&sub5;H&sub3;&sub7;N&sub3;O&sub5;)+1) = 460; gefunden (M&spplus; + H) = 460.
    • Präparation von Diethylphenylsulfonylmethylphosphonat
  • Das Diethylphenylsulfonylmethylphosphonat wurde mit einem Verfahren von I. Shahak und J. Almog präpariert (Synthesis, 145, 1970).
  • Handelsübliches Diethylphenylthiomethylphosphonat (1,0 ml, 4,1 mmol) wurde in Dichlormethan (10 ml) aufgelöst. Schwefelsäure (10 ml, 25%) wurde zugegeben und das Gemisch auf Eis gekühlt. Festes Kaliumpermanganat wurde dann in drei Aliquoten von 0,5 g unter Rühren hinzugegeben. Nach den Zugaben schien die Reaktion komplett. Festes Natriummetabisulfit wurde langsam zugegeben, bis das Gemisch farblos wurde. Anschließend fand eine Extraktion mit Ethylacetat (x3) statt, und die kombinierten organischen Waschflüssigkeiten wurden mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung und danach mit Salzlake gewaschen; anschließend fand eine Trocknung über Natriumsulfat statt. Die flüchtigen Substanzen wurden in vacuo entfernt. Der Rest wurde durch Flash-Chromatographie auf Silika gereinigt, wobei zunächst eine Elution mit Ethylacetat/Hexan 8/2 und anschließend mit reinem Ethylacetat stattfand.
  • Auf diese Weise wurde das gewünschte Produkt Diethylphenylsulfonylmethylphosphonat (1,0 g, Quant) als farbloser Feststoff erzeugt.
  • Das Produkt wurde anhand einer Massenspektrometrie (MS) (MALDI-TOF) analysiert: errechnet (M&spplus;(C&sub1;&sub1;H&sub1;&sub7;C&sub5;PS)+1) = 292; gefunden (M&spplus; + 1) = 292
    • Präparation von (S)-(E)-3-((tert-butoxycarbonylaminovalyl)alanyl)amino-1-phenylsulfonyl-5-methyl-1-hexen
  • Diethylphenylsulfonylmethylphosphonat (38 mg, 129 mmol) wurde in trockenem THF (10 ml) aufgelöst und dann auf 0ºC unter einer Stickstoffatmosphäre abgekühlt. Natriumhydrid (8 mg einer 60%igen Dispersion in Öl, 200 mmol) wurde zugegeben, und das Gemisch wurde 15 Minuten lang (aufschäumend) gerührt. Anschließend wurde der Aldehyd tBoczVal-Ala-Leu-CHO (50 mg, 129 mmol) in die resultierende Lösung gegeben, und das Gemisch wurde 60 Minuten lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Zugabe von verdünnter Chlorwasserstoffsäure (0,1 M) gelöscht; anschließend fand eine Extraktion mit Ethylacetat (x3) statt. Die separierte organische Phase wurde nacheinander mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung und Salzlake gewaschen und anschließend über Natriumsulfat getrocknet. Die flüchtigen Substanzen wurden in vacuo entfernt. Der Rest wurde durch Flash-Chromatographie auf Silika gereinigt und eluierte mit Ethylacetat/Hexan 4/6. Ein nicht identifiziertes Nebenprodukt eluierte zuerst (12 mg), gefolgt von dem gewünschten Produkt (S)-(E)-3-((tert- butoxycarbonylamino-valyl)alanyl)amino-phenylsulfonyl-S- methyl-1-hexen (22 mg, 32%) als Feststoff.
  • MS (Elektrospray); errechnet (M+(C&sub2;&sub6;H&sub4;&sub1;O&sub6;N&sub3;S)+1) = 523; gefunden (M&spplus; + Na) = 546, ((M-tBoc)+1) = 424 (100%).
    • Präparation von Diethylmethylsulfonylmethylphosphonat
  • Handelsübliches Diethylmethylthiomethylphosphonat wurde mit dem Verfahren von I. Shahak und J. Almog in die Titelverbindung umgewandelt (Synthesis, 171, 1969).
    • Präparation von (S)-(E)-3-((tert-butyoxycarbonylaminovalyl)alanyl)amino-1-methylsulfonyl-5-methyl-1-hexen
  • Diethylmethylsulfonylmethylphosphonat (30 mg, 130 mmol) wurde in trockenem THF (5 ml) aufgelöst und dann auf ot unter einer Stickstoffatmosphäre abgekühlt. Natriumhydrid (7 mg einer 60%igen Dispersion in Öl, 175 mmol) wurde zugegeben, und das Gemisch wurde 15 Minuten lang (aufschäumend) gerührt. Anschließend wurde der Aldehyd tEoc-Val-Ala-Leu-CHO (50 mg, 129 mmol) in die resultierende Lösung gegeben, und das Gemisch wurde 60 Minuten lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Zugabe von verdünnter Chlorwasserstoffsäure (0,1 M) gelöscht; anschließend fand eine Extraktion mit Ethylacetat (x3) statt. Die separierte organische Phase wurde nacheinander mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung und Salzlake gewaschen und anschließend über Natriumsulfat getrocknet. Die flüchtigen Substanzen wurde dann in vacuo entfernt. Der Rest wurde durch Flash-Chromatographie auf Silika gereinigt und eluierte mit Ethylacetat/Hexan 8/2. Zunächst eluierte ein nicht identifiziertes Nebenprodukt (4 mg), gefolgt von dem gewünschten Produkt (S)-(E)-3-((tertbutoxycarbonylamino-valyl)alanyl)amino-methylsulfonyl-5- methyl-1-hexen (24 mg, 40%) als Feststoff.
  • MS (Elektrospray); errechnet (M&spplus;(C&sub2;&sub1;H&sub3;&sub9;O&sub6;N&sub3;S)+1) = 462; gefunden (M&spplus; + Na) = 484, ((M - tEoc)+1) = 362 (100%).
  • Präparation von Ethyldiethylphosphorylmethylsulfonat Die Präparation fand wie im Verfahren B statt, das in L. Ghosez et al. beschrieben ist (Tetrahedron, 43, 5125, 1987).
  • Das Produkt wurde anhand MS (Elektrospray) analysiert: errechnet (M+(C&sub7;H&sub1;&sub7;O&sub6;PS)+1) = 261: gefunden (M&spplus; + H) = 261, (M&spplus; + Na) = 283.
    • Präparation von Diethyl(S)-(E)-3-((tertbutoxycarbonylamino-valyl))alanyl)amino-5- methylhexenylsuhfonat
  • Ethyldiethylphosporylmethansulfonat (36 ml, -138 mmol) wurde in trockenem THF (5 ml) aufgelöst und dann auf 0ºC unter einer Stickstoffatmosphäre abgekühlt. Natriumhydrid (8 mg einer 60%igen Dispersion in öl, 200 mmol) wurde zugegeben, und das Gemisch wurde 15 Minuten lang (aufschäumend) gerührt. Der Aldehyd tBoc-Val-Ala-Leu-CHO (50 mg, 129 mmol) wurde in die resultierende Lösung gegeben, und das Gemisch wurde 30 Minuten lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde durch die Zugabe verdünnter Chlorwasserstoffsäure (0,1 M) gelöscht; anschließend fand eine Extraktion mit Ethylacetat (x3) statt. Die separierte organische Phase wurde nacheinander mit Natriumbicarbonatlösung und Salzlake gewaschen und anschließend über Natriumsulfat getrocknet. Die flüchtigen Substanzen wurden dann in vacuo entfernt. Der Rest wurde durch Flash-Chromatographie auf Silika gereinigt und eluierte mit Ethylacetat/Hexan 1/l. Das gewünschte Produkt Diethyl(S)-(E)-3-((tert-butoxycarbonylaminovalyl)alanyl)amino-5-methylhexenylsulfonat (22 mg, 35%) wurde als Feststoff erhalten.
  • MS (Elektrospray); errechnet (M&spplus;(C&sub2;&sub2;H&sub4;&sub1;O&sub7;N&sub3;S)+1) = 492; gefunden (M&spplus; + 1) = 492, ((M&spplus;-tBoc)+1) = 392 (100%)
    • 2. Beispiel: Entwicklung von Depsipeptiden
  • Eine weitere geeignete Bindung in einer Verbindung der allgemeinen Formel (I), (II) oder (III) gemäß der Erfindung ist eine Esterbindung zur Bildung eines Depsipeptids. Der Einbau von Depsipeptidsubstraten unterstützte die Identifizierung von Substraten für Virusproteasen geringer Reaktivität, wie z. B. virale Serinproteasen.
  • Es wurden zum Beispiel Substrate der folgenden allgemeinen Formel produziert:
  • n[Abz-B&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-D&sub1;&submin;&sub8;Y[COO]-E&sub1;&submin;&sub8;-Tyr(NO2)-Asp-NH&sub2;]
  • Ein wesentlicher Teil Von Virusproteasen erkennt jedoch nur Substratsequenzen, die größer sind als solche, die von der oben genannten allgemeinen Struktur repräsentiert werden. Es ist durchaus anerkannt, dass alleine durch die Aktionsart einer viralen Protease (die Funktion ist es, unreife Virusproteine in das reife Amidbindungssubstitutionen oder Übergangszustands- Nachahmungen in das Molekül eingebaut werden, die vor allem für die Inhibition von Aspartyl- oder Metalloproteaseri von Nutzen wären.
  • Das beschriebene Verfahren erleichtert außerdem eine schnelle Entwicklung eines Screeningtests für neuartige Proteaseinhibitoren. Das anhand des Bibliothekscreening- Verfahrens entdeckte potenteste fluorogene Substrat kann anschließend für den Nachweis von Inhibitoren des bestimmten untersuchten proteolytischen Enzyms verwendet werden.
  • Die Anwesenheit eines Inhibitors in den beschriebenen Verbindungsbibliotheken wird problemlos durch eine Nachbehandlung des Testgemischs mit dem aktivsten fluorogenen Substrat nachgewiesen, wodurch eine sofortige Messung der restlichen proteolytischen Enzymaktivität möglich ist.
  • Die Erfindung stellt selbstentwindende, kombinatorische fluorogene Bibliotheken bereit und wird die Entwicklung und Erfindung neuartiger Proteaseinhibitoren um vieles erleichtern, da:
  • i. die Peptide der Bibliothek im Vergleich zu Peptiden, die ähnliche und andere fluorogene Gruppen und Löschergruppen enthalten, möglicherweise eine erhöhte Wasserlöslichkeit haben;
  • ii. die Peptide gegen kontaminierende Exopeptidasen beständig sind;
  • iii. das beschriebene Selbstentwindungsverfahren, gekoppelt mit der kontinuierlichen Analyse der Rate von Substratspaltungsdaten, eine sofortige Identifizierung des aktivsten Bindungsmotivs ermöglicht, das in der Substratbibliothek enthalten ist;
  • iv. das Verfahren eine schnelle Beurteilung des Enzymtestgemischs für alle beliebigen Verbindungen in der Bibliothek ermöglicht, die als Enzyminhibitoren wirken.
    • Abkürzungen
  • Es werden die folgenden Abkürzungen hierin verwendet:
  • Abkürzungen für Aminosäuren und die Nomenklatur der Peptidstrukturen folgen den Empfehlungen in: IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature, (J. Biol. Chem, 247, 997, 1971). Alle chiralen Aminosäuren entsprechen der L-Konfiguration, sofern nicht anders angegeben. Weitere hierin verwendeten Abkürzungen:
  • -Abu - b-Aminobuttersäure; Abz - 2-Aminobenzoyl; ACH - 1-Amino-1-carboxy-cyclohexan; ACP - 1-Amino-1-carboxycyclopropan; Bip - Biphenylalanin; n-Bu - n-Butoxycarbonyl; Bz - Benzoyl; Bz(2-carboxy) - 2-Carboxybenzoyl; ButGly - tert-Butylglycyl; BOP - Benzotriazoyl-oxy-tris- (dimethylamino)-phosphonium-hexafluorphosphat; Cha - Cyclohexylalanin; Chex - 1-Carboxycyclohexyl; eAHA - Gammaaminohexanoyl; HBTU - O-Benzotriazoyl-N,N,N',N'- Tetramethyluronium-hexafluorphosphat; HOBt - 1- Hydroxybenzotriazol; Hyp - Trans-4-hydroxyprolinyl; hLeu - Homoleucyl; 2Nal - 2-Napthylalanin; NMM - N- Methylmorpholin; Piv - Pivoyl; 3pyr - 3-Pyridylalanin; Tic - 2-Carboxytetrahydrochinolyl; Tyr (NO&sub2;) - 3-Nitrotyrosin. DMF - Dimethylformamid; Fmoc - Fluorenylmethoxycarbonyl; HPLC - Hochdruckflüssigkeitschromatographie; Pfp - Pentafluorphenyl; tBoc - Tert-Butoxycarbonyl; tBu - Tert- Butyl; TFA - Trifluoressigsäure; Pmc - Pentamethylchroman; Pbf - Pentamethylbenzofuran; TBTU - 2-(1H-Benztrotriazol-1- yl)-1,1,1,3,3-tetramethyluronium-tetrafluorborat; Trt - Trityl.
  • p.Aba - 4-Aminobenzoyl; Aib - Aminoisobuttersäure; Bip - Biphenylalanin; nEu - n-Butyl; Bz - Benzoyl; Cmpi - Carboxymethylpiperazin; Deg - Diethylglycin; DIPEA - N,N- Diisopropylethylamin; HATU - O-(7-azabezotriazol-1-yl) - 1,1,3,3-tetramethyluronium-hexafluorphosphat; HOAT - 1- Hydroxy-7-azabenzotriazol; Naph - Naphthylalanin; 3.Pyr - 3-Pyridiylalanin; Tyr(NO&sub2;) - 3-Nitrotyrosin.
    • Quellenangaben
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    • SEQUENZAUFLISTUNG
  • (1) ALLGEMEINE INFORMATIONEN:
  • (i) ANMELDERIN:
  • (A) NAME: PEPTIDE THERAPEUTICS LIMITED
  • (B) STRASSE: 321 CAMBRIDGE SCIENCE PARK
  • (C) STADT: CAMBRIDGE
  • (D) STAAT: CAMBRIDGE
  • (E) LAND: ENGLAND
  • (F) POSTLEITZAHL: CB44WG
  • (G) TELEFON: 01223 423333
  • (H) TELEFAX: 01223 423111
  • (ii) TITEL DER ERFINDUNG: Substrate und Inhibitoren proteolytischer Enzyme
  • (iii)ANZAHL DER SEQUENZEN: 52
  • (iv) MASCHINENLESBARES FORMULAR:
  • (A) MEDIENTYP: Diskette
  • (B) COMPUTER: IBM-kompatibler PC
  • (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
  • (D) SOFTWARE: PatentIn Release Nr. 1.0, Version Nr. 1.30 (EPO)
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 1:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRANGIGKEIT: einfach
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) ORT: 1
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "X bei Position 1 ist Abz"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) ORT: 4
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "X bei Position 4 ist Nle"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) ORT: 6
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "X bei Position 6 ist Tyr(NO2)" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 1:
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 2:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einfach
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 1
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 1 ist Abz"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 6
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 6 ist Tyr(NO2)" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 2:
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 3:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einfach
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 1
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 1 ist Abz"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 6
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 6 ist Tyr(NO2)" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 3:
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 4:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einfach
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 1
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 1 ist Abz"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 6
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 6 ist Tyr(NO2)" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 4:
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 5:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einfach
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (E) ORT: 1
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 1 ist Abz"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 4
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 4 ist hLeu"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 6
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 6 ist Tyr(NO2)" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 5.
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 6:
  • (I) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (H) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einfach
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 1
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN; /Hinweis = "Xaa bei Position 1 ist Abz"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 4
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 4 ist Cha"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) ORT: 6
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 6 ist Tyr(NO2)" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 6:
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 7:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einfach
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 1
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 1 ist Abz"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 6
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 6 ist Tyr(NO2)" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 7:
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 8:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (E) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einfach
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 1
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 1 ist Abz"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 4
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 4 ist 3pyr"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 6
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 6 ist Tyr(NO2)" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 8:
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 9:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einfach
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 1
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 1 ist Abz"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle.
  • (B) ORT: 4
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 4 ist hLeu"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 6
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 6 ist Tyr(NO2)" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 9:
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 10:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einfach
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 1
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 1 ist Abz"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 3
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 3 ist Met (O) "
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 4
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 4 ist hLeu"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 6
  • (C) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 6 ist Tyr(NO2)" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 10:
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 11:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einfach
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 1
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 1 ist Abz"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 4
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 4 ist hLeu"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 6
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 6 ist Tyr(NO2)" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 11:
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 12:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einfach
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 1
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 1 ist Abz"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 4
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 4 ist hLeu"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 6
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 6 ist Tyr(NO2)" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 12:
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 13:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einfach
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 1
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 1 ist Abz"
  • (ix) MERKMAL
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 2
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 2 ist Met (O) "
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 4
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 4 ist hLeu"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 6
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 6 ist Tyr(NO2)" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 13:
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 14:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LANGE: 7 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einfach
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 2
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 2 ist 3pyr"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 4
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 4 ist hLeu"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 6
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 6 ist Tyr(NO2)" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 14:
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 15:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einfach
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 1
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 1 ist Abz"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 2
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 2 ist 2Nal"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 4
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 4 ist hLeu"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 6
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 6 ist Tyr(NO2)" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 15:
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 16:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einfach
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 1
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 1 ist Abz"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (3) ORT: 4
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 4 ist hLeu"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 6
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 6 ist Tyr(NO2)" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 16:
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 17:
  • (I) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einfach
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 1
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 1 ist Abz"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 2
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 2 ist Cha"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 4
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 4 ist hLeu"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 6
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 6 ist Tyr(NO2)" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 17:
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 18:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einfach
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 1
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 1 ist Abz"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 2
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 2 ist Bip"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 4
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 4 ist hLeu"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 6
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 6 ist Tyr(NO2)" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 18:
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 19:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LANGE: 7 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einfach
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 1
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 1 ist Abz"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 2
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 2 ist Bip"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 4
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 4 ist hLeu"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 6
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 6 ist Tyr(NO2)" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 19:
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 20:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einfach
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 1
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 1 ist Abz"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 2
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 2 ist Bip"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 4
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 4 ist hLeu"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 6
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 6 ist Tyr(NO2)" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 20:
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 21:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einfach
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 1
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 1 ist Abz"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 2
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 2 ist Bip"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 4
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 4 ist hLeu"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 6
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 6 ist Tyr(NO2)" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 21:
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 22:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einfach
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) MERKMAL: 1
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT; 1
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 1 ist Abz"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 2
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 2 ist Bip"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 4
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 4 ist hLeu"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 6
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 6 ist Tyr(NO2)" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 22:
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 23:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einfach
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 1
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 1 ist Abz"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 2
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 2 ist Bip"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 4
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 4 ist hLeu"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 5
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 5 ist Abu"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 6
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 6 ist Tyr(NO2)" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 23:
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 24:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einfach
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 1
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 1 ist Abz"
  • (ix) MERKMAL;
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 2
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 2 ist Bip"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 4
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Produkt = "X" /Hinweis = "Xaa bei Position 4 ist hLeu"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 5
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 5 ist Cha"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 6
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 6 ist Tyr(NO2)" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 24:
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 25:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einfach
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 1
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 1 ist Abz"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 2
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 2 ist Bip"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 4
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 4 ist hLeu"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 5
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 5 ist Met(0)"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 6
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 6 ist Tyr(NO2)" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 25:
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 26:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einfach
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 1
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 1 ist Abz"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 2
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 2 ist Bip"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 4
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 4 ist hLeu"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 6
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 6 ist Tyr(NO2)" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 26:
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 27:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einfach
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 1
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 1 ist Abz"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 2
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 2 ist Bip"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 4
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 4 ist hLeu"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 5
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 5 ist 3pyr"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 6
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 6 ist Tyr(NO2)" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 27:
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 28:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einfach
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 1
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 1 ist Abz"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 2
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaä bei Position 2 ist Bip"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 4
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 4 ist hLeu"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 5
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 5 ist BuGly"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 6
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 6 ist Tyr(NO2)" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 28:
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 29:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einfach
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 1
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 1 ist Abz"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 2
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 2 ist Bip"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 4
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 4 ist hLeu"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 5
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 5 ist Hyp"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 6
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 6 ist Tyr(NO2)" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 29:
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 30:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einfach
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 1
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 1 ist Abz"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 2
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 2 ist Naph"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 5
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 5 ist Nle"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 7
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 7 ist Tyr(NO2)" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 30:
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 31:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LANGE: 8 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einfach
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: I
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 1 ist Abz"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 2
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 2 ist Bip"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: S
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 5 ist Nle"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 7
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 7 ist Tyr(NO2)" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 31:
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 32:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einfach
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 1
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 1 ist Abz"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 5
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 5 ist Nle"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 7
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 7 ist Tyr(NO2)" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 32:
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 33:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einfach
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 1
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 1 ist Abz"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 5
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 5 ist Nle"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 7
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 7 ist Tyr(NO2)" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 33:
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 34:
  • (I) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LANGE: 4 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einfach
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 1
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 1 ist N-benzoyl"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 4
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 4 ist 1-Norleucin-brommethylketon" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 34:
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 35:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LÄNGE: 4 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einfach
  • (D) TOPOLOGIE; unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 1
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 1 ist N-benzoyl"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 4
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 4 ist L-Norleucin-2,6- bis(trifluormethyl)benzoyloxomethylketon" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 35:
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 36:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LANGE: 4 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einfach
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) MERKMAL;
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 4
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 4 ist L-Norleucin-2,6- bimethylbenzyloxomethylketon" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 36:
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 37:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LANGE.: 4 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einfach
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) ME-R-KMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 4
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position [*16] ist L-Norleucin-2- hydroxybenzoyloxomethylketon" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 37:
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 38:
  • (I) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LÄNGE: 4 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einfach
  • D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 1
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 1 ist N-benzoyl"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 4
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaä bei Position 4 ist L-Norleucin-2,6- dichlorbenzoyloxomethylket..." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 38:
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 39:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LÄNGE: 4 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einfach
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 1
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 1 ist N-benzoyl"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 4
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 4 ist L-Norleucinbenzoyloxomethylketon" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 39:
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 40:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LÄNGE: 4 Aminosäuren 2
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einfach
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 1
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 1 ist N-benzoyl"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 4
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 4 ist 1-Norleucin-2,3,4,5,6- pentafluotbenzoyloxomethylketon" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 40:
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 41:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LÄNGE: 4 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einfach
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 1
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position I ist Benzoyl"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 4
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 4 ist L-Norleucin-1,1- dimethylpropyloxymethylketon" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 41:
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 42:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
  • (H) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einfach
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 1
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 1 ist N-benzoyl"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 4
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 4 ist L-Norleucin"
  • (ix) MERKMAL;
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 5
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 5 ist N(benzyloxycarbonyl)-D- serinyl-(0-tert-butyl)oxymethylketon" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 42:
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 43:
  • (I) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einfach
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 4
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 4 ist L-Norleucin"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 5
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 5 ist N(-benzyloxycarbonyl)-D- serinoxymethylketon" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 43:
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 44:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einfach
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 1
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 1 ist N-benzoyl"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 4
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 4 ist L-Norleucin"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT:. 5
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 5 ist 2-Furanoxymethylketon" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 44:
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 45:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LANGE: 4 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einfach
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 1
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 1 ist N-benzoyl"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 4
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 4 ist L-Norleucin-2,6- dichlorphenylacyloxymethylketon" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 45:
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 46:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LANGE: 4 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einfach
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 1
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 1 ist Etyhl-(s)-(e)-3-TERT- BUTOXY-CARBONYL"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 4
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 4 ist Amino-6-methyl-hept-2- enoat" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 46:
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 47:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LÄNGE: 4 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einfach
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 1
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 1 ist (S)-(E)-3- (tertbutoxycarbonyl)
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 4
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 4 ist Amino-6-methyl-hept-2- säure" [*15] (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 47:
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 48:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LÄNGE: 4 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einfach
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 1
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 1 ist 1,1,1-Trifluorethyl-(S)- (E)-3-(tertbutoxycarbonyl)"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 4
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 4 ist Amino-6-methyl-hept-2- enoat" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 48:
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 49:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LANGE: 4 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einfach
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 1
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 1 ist Ethyl-(S)-(E)-3-(N- benzoyl)"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 4
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 4 ist Amino-6-methyl-hept-2- enoat" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 49:
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 50:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LÄNGE: 4 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einfach
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 1
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 1 ist (S)-(E)- 3(Tertbutoxycarbonyl)"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 4
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 4 ist Amino-1-phenylsulfonyl-5- methyl-1-hexen" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 50:
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 51:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LÄNGE: 4 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einfach
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 1
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 1 ist (S)-(E)-3- tertbutöxycarbonyl"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 4
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 4 ist Amino-1-methylsulfonyl-5- methyl-1-hexen" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 51:
  • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 52:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LÄNGE: 4 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einfach
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 1
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 1 ist Diehtyl(S)-(E)-3((tertbutoxycarbonyl)) [*17]
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
  • (B) ORT: 4
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "Xaa bei Position 4 ist 5-Methylhexenylsulfonat" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 52:

Claims (27)

1. Komplementäres Paar Verbindungsbibliotheken L1 und L2, die einen Satz bilden, der kombinatorische FRET-Verbindungen der folgenden Formel enthält:
Aa-Bb-Cc-Dd-n(Ee)-Ff-Gg
wobei:
A einen durch F intern gelöschten Fluoreszor [*1] repräsentiert;
B, C, D und E Gruppen repräsentieren, so dass die leicht spaltbare Bindung zwischen zwei von diesen Gruppen eine geeignete Bindung ist;
F einen Löscher repräsentiert, der den Fluoreszor A intern löschen kann; und
wobei alle Verbindungen in wässriger Lösung vorliegen; und
n eine ganze Zahl zwischen 1 und 4, einschließlich, repräsentiert;
so dass a x b x c x d x e x f x g = Mn Verbindungen in jeder Bibliothek entstehen, wobei eine vorbestimmte Anzahl (P1, P2) an Gemischen vorhanden ist, die jeweils aus einer vorbestimmten Anzahl (Q1, Q2) individueller identifizierbarer Verbindungen in jeder Bibliothek bestehen, wobei sowohl L1 als auch L2 dieselben Mn Verbindungen enthalten, wobei jedoch zwei beliebige Verbindungen, die zusammen in einem Gemisch von Q1 Verbindungen von L1 zu finden sind, nicht zusammen in irgendeinem der P2 Gemische von L2 zu finden sind.
2. Verfahren zum Screenen nach Enzymaktivität, wobei die Aktivität die Interaktion von proteolytischem Enzym, das in eine Mulde gegeben wird, mit einer oder mehreren Verbindung(en) eines Gemischs in der Mulde ist, unter Verwendung der Bibliotheken L1, L2 gemäß Anspruch 1, wobei die P1 Gemische von L1 und die P2 Gemische von L2 jeweils getrennt in individuelle Mulden von Muldenplatten gegeben werden, wobei die Muldenplatten Mulden haben, die in einem Format angeordnet sind, das so ausgestaltet ist, dass es die Ableitung einer einzigartigen aktiven Verbindungsformel von dem Vorhandensein von Aktivität in einer Mulde von L1 und einer Mulde von L2 ermöglicht.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Format einer allgemeinen Entwindungsformel entspricht, wobei:
(ii) k = b.c.d.np.e
(iii) k = x.N.np
(iv) N = Rp.Cp
(v) K = X.Rp.Cp.np
(vi) b.c.d.e = X.Rp.Cp
(vii) Cp.e = X
(Viii) Rp.e = X, wenn Rp = Cp
und wobei
np = Anzahl von Primärplatten
ns = Anzahl von Sekundärplatten
Rp = Anzahl von Primärreihen
Rs = Anzahl von Sekundärreihen
Cp = Anzahl von Primärspalten
Cs = Anzahl von Sekundärspalten
K = Anzahl der Kombinationen von Verbindungen
N = Anzahl der Mulden auf einer Platte und
X = Anzahl der Verbindungen pro Mulde.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei
nP = 4
ns = 16
Rp = 8
Rs = 4
Cp = 10
C&sub5; = 5
K = 6400
N = 80
X = 20
5. Bibliothekenpaar nach Anspruch 1, wobei sich die leicht spaltbare Bindung zwischen D und E befindet.
6. Bibliothekenpaar nach Anspruch 1, wobei A ein nichtsubstituiertes oder substituiertes Anthranilsäure-Derivat repräsentiert.
7. Bibliothekenpaar nach Anspruch 1, wobei B, C, D und E unabhängig natürliche oder unnatürliche Aminosäurereste repräsentieren.
8. Bibliothekenpaar nach Anspruch 1, wobei F ein nichtsubstituiertes oder substituiertes 3-Nitrotyrosin-Derivat repräsentiert.
9. Bibliothekenpaar nach Anspruch 1, wobei die leicht spaltbare Bindung eine geeignete Bindung ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer nichtsubstituierten Amidbindung und einer Esterbindung.
10. Bibliothekenpaar nach Anspruch 1, wobei die Formel ferner G umfasst, das gewährleistet, dass die Verbindung wasserlöslich ist.
11. Bibliothekenpaar nach Anspruch 10, das durch die Formel A-B-C-D-n(E)-F-G repräsentiert ist, wobei A, B, C, D, E, F und n der Definition in Anspruch 1 entsprechen und G einen hydrophilen Anteil repräsentiert, der kein Enzymsubstrat ist.
12. Bibliothekenpaar nach Anspruch 10 oder 11 der allgemeinen Formel:
Abz-B-C-D-E-Tyr(NO2)-Asp-NH2
wobei
B = Valin> Alanin, Glutamin, Leucin, Phenylalanin
C = Alanin> > Glutamin oder Lysin
D = Leucin, Norleucin oder Alanin> Serin
E = Serin
13. Vorrichtung, umfassend einen Selbstentwindungssatz von Verbindungen nach Anspruch 1, der die Erfindung neuartiger Inhibitoren von proteolytischen Enzymen und eine schnelle Erzeugung von Struktur-Aktivitäts-Beziehungen (SAR) erleichtert, durch die Erfassung und Messung proteolytischer Enzymaktivität.
14. Vorrichtung nach Anspruch 13, wobei jede Bibliothek ein Gemisch aus Verbindungen umfasst, das durch die folgende Formel repräsentiert wird:
A-B&sub1;&submin;&sub1;&sub0; - C&sub1;&submin;&sub1;&sub0; - D&sub1;&submin;&sub8; - n(E&sub1;&submin;&sub2;) - F
15. Vorrichtung nach Anspruch 14, wobei die Formel ferner G umfasst, das gewährleistet, das Verbindungen in der Bibliothek wasserlöslich sind.
16. Vorrichtung nach Anspruch 15, wobei jede Bibliothek ein Gemisch aus Verbindungen umfasst, das durch die folgende Formel repräsentiert wird:
A-B&sub1;&submin;&sub1;&sub0; - C&sub1;&submin;&sub1;&sub0; - D&sub1;&submin;&sub8; - n(E&sub1;&submin;&sub2;) - F-G
wobei:
G einen hydrophilen Anteil repräsentiert, der kein Enzymsubstrat ist.
17. Vorrichtung nach Anspruch 15 oder 16, wobei G einen Aspartylamidanteil repräsentiert.
18. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13 bis 17, wobei die Bibliothek 1600n Verbindungen als 80n Gemische aus 20 verschiedenen, identifizierbaren Verbindungen umfasst.
19. Vorrichtung nach Anspruch 18, wobei die Gemische aus 20 verschiedenen, identifizierbaren Verbindungen getrennt in jeweils 80 Mulden einer Mikrotiterplatte gegeben werden.
20. Verwendung eines kombinatorischen FRET-Bibliothekenpaares nach Anspruch 1 in einem Verfahren zum schnellen Erzeugen von Struktur-Aktivitäts-Beziehungen (SAR), umfassend das Erfassen und Messen von proteolytischer Enzymaktivität, indem mit einem Bibliothekenpaar kombinatorischer FRET-(Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer)-Moleküle ein Test durchgeführt wird, um ein Substrat oder Substrate für das Enzym zu finden.
21. Verwendung eines kombinatorischen FRET-Bibliothekenpaares nach Anspruch 1 in einem Verfahren zum Erfassen und Messen proteolytischer Enzymaktivität mit Verbindungen der Bibliothek.
22. Verfahren zum Identifizieren und Synthetisieren eines Inhibitors für ein proteolytisches Enzym, das die folgenden Schritte umfasst: Erfassen und Messen proteolytischer Enzymaktivität, indem mit einem Bibliothekenpaar kombinatorischer FRET- (Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer-) Moleküle nach Anspruch 1 ein Test durchgeführt wird, Entwinden der Bibliothek, um ein Substrat oder Substrate für das Enzym zu finden, und Synthetisieren eines Inhibitors auf der Basis des Substrats bzw. der Substrate.
23. Hemmtest unter Verwendung eines FRET-Moleküls, das anhand des Verfahrens von Anspruch 2 als ein Substrat für das Enzym identifiziert wurde, wobei das Molekül mit dem Enzym separat anhand einer Liste möglicher inhibitoren getestet wird.
24. Verfahren zum schnellen Erzeugen von Struktur-Aktivitäts-Beziehungen (SAR), umfassend das Erfassen und Messen proteolytischer Enzymaktivität, indem mit einem Bibliothekenpaar kombinatorischer FRET- (Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer-) Moleküle nach Anspruch 1 ein Test durchgeführt wird, um ein Substrat oder Substrate für das Enzym zu finden.
25. Verfahren, umfassend das Identifizieren von (einem) Enzyminhibitor oder -inhibitoren, wobei eine FRET-Verbindung, die mit dem Verfahren von Anspruch 2 als ein Substrat identifiziert wurde, in einem Hemmtest mit dem Enzym separat anhand einer Liste möglicher Inhibitoren verwendet wird.
26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei der Test unter Verwendung der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13 bis 19 durchgeführt wird.
27. Verfahren nach einem der vorherigen Verfahrensansprüche, wobei die Verbindungen des Bibliothekenpaares unter Anwendung einer Festphasentechnik synthetisiert werden.
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