JPH09506611A

JPH09506611A - 組合わせライブラリーおよびその使用法

Info

Publication number: JPH09506611A
Application number: JP7516736A
Authority: JP
Inventors: ブレナー，シドニー
Original assignee: コンビケム，インコーポレイテッド
Priority date: 1993-12-15
Filing date: 1994-07-26
Publication date: 1997-06-30
Also published as: ATE160223T1; EP0734530B1; DE69406806D1; AU7552394A; EP0734530A1; WO1995016918A1; SG48166A1

Abstract

(57)【要約】各々が既知数のサブユニットから構成されている異なるポリサブユニットを含有する第１の複数の容器からなるキット、およびその使用および構成法。サブユニットの各々は１または２個以上の結合により結合されており、サブユニットおよび結合は、各々、同一または異なっているとすることができる。異なるポリサブユニットは、各々、異なる配列のサブユニットを有するが、一端で同一の公知のサブユニットを有する。各容器は一端で異なる公知のサブユニットを有するポリサブユニットを含有する。該キットは、さらに、各々が、前記した、既知数より１つ少ない数のサブユニットから構成されている異なるポリサブユニットからなる第２の複数の容器からなる。

Description

【発明の詳細な説明】組合わせライブラリーおよびその使用法本出願は１９９２年１１月１９日出願の米国特許出願番号０７／９７８,６４６の継続出願である、１９９３年１２月１５日出願の米国特許出願番号０８／１６８,９６６の一部継続出願である。発明の背景本発明はドラッグディスカバリーに有用な合成組合わせライブラリーおよびそのようなドラッグディスカバリーにおけるその使用法に関する。ハクテン（Houghten）らは、３５４ネイチャー（Nature）８４、１９９１およびＷＯ９２／０９３００（ＰＣＴ／ＵＳ９１／０８６９４）にて、基礎研究およびドラッグディスカバリーのための合成ペプチド組合わせライブラリーの形成および使用を記載する。これらのライブラリーは異種ライブラリーを形成する遊離ペプチドの混合物で構成されている。最適なペプチドリガンドの組織的同定は、ライブラリーをスクリーンに付し、つづいて繰返し選択および合成工程に付すことにより達成される。例えば、最初の２つの位置が特定され、最後の４つの位置が１８Ｌ−アミノ酸の無作為な混合物からなる一連６個のペプチド残基より構成されているライブラリーがある。このライブラリーをスクリーンに付し、限定されたペプチドのいずれの対が検定にて最適活性を有するかを決定した。ついで、その中に最適な対のペプチドを含み、各ペプチドの第３の位置が個々に合成され、最後の３個のペプチドが１８Ｌ−アミノ酸の無作為な混合物からなる別のライブラリーを合成した。このライブラリーを前記のようにスクリーンに付し、最適な６個のペプチド残基が同定されるまでその工程を繰り返した。ハクテンらは：「完全にＤ−アミノ酸からなるライブラリーのような他の多数のライブラリーは、総合的に数億のペプチドを組織的にスクリーンに付すことにより調製される。ＳＰＣＬ［合成ペプチド組合わせライブラリー］の基本的特徴は、遊離ペプチドを形成し、その検定に最適な各ペプチドの濃度で実質的にすべての存在する検定系における方法にて用いることができることである。この方法はまた、ラジオ−レセプター検定（オピオイドペプチド）およびプラーク阻害検定（ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ））にて用いるのに成功している。前記のＳＰＣＬは、ドラッグディスカバリーおよびペプチド関連の研究のあらゆる分野を著しく促進させるものである。」と主張する。ラム（Lam）らは、３５４ネイチャー８２、１９９１およびＷＯ９２／０００９１（ＰＣＴ／ＵＳ９１／０４６６６）にて、およびハクテンらは、３５４ネイチャー８４、１９９１およびＷＯ９２／０９３００（ＰＣＴ／ＵＳ９１／０８６９４）にて、限定された構造のペプチドおよび他のライブラリーの組織的合成およびスクリーンを記載する。ラムらによって用いられる方法は、数百万のビーズからなるラージペプチドライブラリーをスクリーンに付す一ビーズ一ペプチド法を基礎とする。各ビーズは単一のペプチドを含有する。ラムらは：「異なるアミノ酸の広範に異なるカップリング速度は不等な表現をもたらし、各ビーズは異なるペプチドの混合物を含有するであろうから、ペプチド合成プロトコルにて活性化アミノ酸の無作為な混合物を使用することが十分でないことは明らかである。我々の方法は、’分割合成’（split synthesis）法を用いることであった。第１のサイクルは、樹脂ビーズのプールを各々単一のアミノ酸を有する別々の反応容器に分散させ、カップリング反応を終結させ、ついでビーズを再びプールすることからなる。該サイクルを数回繰り返し、ペプチド鎖を拡張させた。この方法にて、各ビーズは、単一のペプチド種だけを含有する。」と主張する。ビーズのライブラリーを染色操作によりスクリーンに付し、染色ビーズを顕微鏡を用いて視覚化し、取り出した。ペプチドの構造は、単一ビーズ上の物質を化学分析することにより得られる。ラムらは：「加えて、我々の方法は、豊富な十分に確立されたペプチド化学を適用し、Ｄ −アミノ酸または非天然アミノ酸ならびに環状ペプチドを包含する特異的な２次構造を組み入れたライブラリーを合成することについて非常に大きな可能性がある。我々の興味はアクセプターとの強い相互作用のシグナルを提供するペプチドに集中してあるため、合成生成物の記録を保持する必要がなく、このすべてを達成することができる。」と示唆する。発明の要約本発明は、組合わせライブラリーの効果的な構成および分解法であって、有用なポリサブユニット化合物（同一または異なっていてもよく、時に、ポリマーと称せられる２個または３個以上のサブユニットからできている）の同定を可能とする方法を提供する。該方法はポリペプチドの同定に限定されるものではなく；一のポリサブユニット化合物の中の種々のサブユニット（時に、モノマー化合物と称される）でできているいずれの組み合わせの化合物にも応用できる。このようなポリサブユニットの合成は、化学的に、または酵素を包含する触媒を用いて行うことができる。例えば、サブユニットは、アミノ酸、ヌクレオチド、シュガー、脂質および炭水化物を含む、天然または非天然の物質より選択できる。加えて、各サブユニットをその前のサブユニットに付着させるのに用いられる結合は、いずれの所望の型の結合とすることもでき、共有結合、イオン結合および配位結合を包含してもよい。該結合は、所望により、酵素または化学処理により選択的に切断することができる。かかる結合の例は：ペプチド［Ｒ¹ＣＯＮＨＲ²］、エステル［Ｒ¹ＣＯＯＲ²］、スルホンアミド［Ｒ¹ＳＯ₂ＮＲ²］、チオエステル［Ｒ¹ＣＯＳＲ²］、ホスホジエステル［Ｒ¹ＯＰＯＲ²］、エーテル［Ｒ¹ＣＯＣＲ²］、チオエーテル［Ｒ¹ＣＳＣＲ²］、ホスファミド［Ｒ¹ＰＯＮＨ−］、アミン［−ＣＨ₂ＮＨＣ−］およびアゾ［−ＣＮＮＣ−］（ここに、Ｒ¹およびＲ²は、各々、同一または異なっていてもよく、環状または非環状であってもよい）を包含する。該方法において、遊離または固相結合したポリサブユニットを、いずれか所望の試験または検定系にて、合成されたポリサブユニットを迅速にスクリーンするのに用いることができる。本発明の有意な利点は、いずれか選択された検定にて、かなり多数の望ましい特性についてスクリーンするために再生することのできる一連のポリサブユニットのライブラリーまたはコレクションを提供することにある。本発明の方法は、数種の異なるサブユニットをーの容器内で化学的に組み入れる混合合成を用いるのではなく、むしろ単一のサブユニットを各工程で組み入れる合成を用いるものである。図１参照のこと。すなわち、一例にて、本発明は、１０個の異なるサブユニットＡ、Ｂ、Ｃ．．．Ｊを１０個の別々の容器またはカラム中の固体支持体に付着させる第１工程を包含する。第２工程において、第１工程で合成した物質の一部またはアリコートを別のカラムに確保し、残り（まだ、個々の固体支持体に付着している）を混合するかまたはプールし、１０個の新しい別のカラムに分け、さらに１０回の同様な合成を行い、ダイマーＸＡ¹、ＸＢ¹、ＸＣ¹．．．ＸＪ¹（ここに、ＸはＡ−Ｊのうちのいずれかであり、Ａ¹、Ｂ¹、Ｃ¹．．．Ｊ¹は、Ａ−Ｊと同一または異なっていてもよい１０個の異なるサブユニットである）を得る。もちろん、１０回より少ないまたは多い合成をこの第２工程にて用いることができる。第３工程にて、第２工程の新たに合成した物質の一部を再び別のカラムに確保し、所望のサブユニットの全長が合成されるまで、合成操作を繰り返すことができるように、残りを混合し、１０個のさらなるカラムに分ける。このようにして、エキストラサブユニットの存在により前工程の容器と異なる、一連の容器が各工程にて形成される。前記した例における最終の１０個のカラム（各々、その末端に公知なサブユニットを有する種々の異なるポリサブユニットを有する）は、いずれかの標準検定フォーマットを用いて検定できる。すなわち、その１０個の混合物を、各々、検定し、どの混合物が１種または２種以上の活性化合物を有するかを測定する。活性化合物を含有すると認められるカラムは、ポリサブユニット末端で必要とされるサブユニットが該検定にて活性であると同定する。例えば、配列ＸＸＸＸＪ¹ のポリサブユニットを含有するカラムが該検定にて活性であるとする。これは、この検定にてＪ¹がポリサブユニットの末端で必要とされることを示す。次に、このサブユニットを、前の合成工程にて確保されている各カラム（該例においては、カラムＸＸＸＡ、ＸＸＸＢ．．．ＸＸＸＪ）に結合させる。ついで、これらの１０個の新たに合成された一連の化合物を検定し、最終のポリサブユニット配列がわかるまで、この工程を繰り返すことができる。図２および図３参照のこと。かくして、本発明の方法は、従来のライブラリーよりも多くのあるサブユニットを含有する各ライブラリーを有する部分的組合わせライブラリーのセットまたはキットを提供する。最終ライブラリーを、末端のサブユニットで出発して、段階的に分解する。この逆戻り分析または演鐸の形態は、最終の分析工程にて達成される、所望の生成物の合成を明確にする。構成されると、ライブラリーの全セットを多くの種々のプロジェクトについて用いることができる。かくして、第１の態様にて、本発明は、その各々が既知数のサブユニットより構成されている種々のポリサブユニットを含有する第１の複数の容器からなるキットを提供する。各サブユニットを１または２以上の結合によって結合させる；サブユニットおよび結合は、各々、同一または異なるものとすることができる。種々のポリサブユニットの各々は、異なる配列のサブユニットを有するが、一末端にて同一の公知サブユニットを有する。容器は、各々、その末端で異なる公知サブユニットを有するポリサブユニットを含有する。該キットは、さらには、その各々が、前記した、既知の数より１少ないサブユニットから構成されている種々のポリサブユニットを有する第２の複数の容器からなる。このキットは、前記したように、スクリーンし、分解することができる組合わせライブラリーを形成する。第１および第２の複数の容器の数は同一または異なっていてもよく、一般に、サブユニットを加えるポリサブユニットの末端は、各セットの容器にて同一である。好ましい具体例にて、該キットは、ポリサブユニット中に存在するサブユニットの数が、既知の数から２または３あるいはそれ以上を減じた数である、さらなる複数の容器からなっていてもよい。かくして、複数の容器は、各々、ポリサブユニット中にあるサブユニットの数にて他の複数の容器と区別される。最も好ましくは、複数の容器の各々のサブユニットの数は、１個づつ異なり、１個から既知の数まである。前記したように、このようなキットは、逆戻り分析法を用い、所望のポリサブユニットの配列を組織的に同定するのに有用である。前記したように、該ポリサブユニットは所望の一連のサブユニットより形成され、各工程でのこれらのポリサブユニットを含有する容器の数は、加えられる各サブユニットと異なるようにすることができる。したがって、前記したように、一の工程にて１０個のアミノ酸を組み入れ、別の工程にて２または３個の炭水化物を、次の工程にて２０個のアミノ酸を組み入れてもよい。サブユニットの添加工程についても、また各工程で加えることのできるサブユニットの選択についても何ら制限はない。キットが有用であるために必要なことは、そのキットがそれらのポリサブユニット中に存在するサブユニットの数の配列的に異なっているポリサブユニットを含有する一連の容器からなることである。該キットにおける最終の複数の容器は、溶液中に遊離しているか、または固体支持体に結合した第１のサブユニットだけを含有するであろう。関連する態様において、本発明は、前記の工程に従うキットの構成方法、および前記したキットのスクリーン法を提供する。詳細には、本発明は、所望の化合物を同定するのに有用なキットの構成方法であって、（ａ）その各々が１または２以上の結合により結合された既知数のサブユニットより構成されている異なるポリサブユニットを含有する第１の複数の容器を得る工程；サブユニットおよび結合は、各々、同一または異なるものとすることができ、異なるポリサブユニットは、各々、異なる配列のサブユニットを有するが、ポリサブユニットの一端で同一の公知のサブユニットを有する；容器は、各々、その末端で異なる公知のサブユニットを有するポリサブユニットを含む；（ｂ）各容器からの異なるポリサブユニットのアリコートを合して混合物を形成させる工程；この場合、アリコートは各容器中の全含量よりも少量である；（ｃ）その混合物を第２の複数の容器に分ける工程；および（ｄ）さらなるサブユニットを、第２の複数の容器中の各ポリサブユニットに結合させる工程；この場合、該サブユニットは第２の複数の容器の各々について異なることからなる方法を提供する。好ましい具体例において、該方法はさらに、第２の複数の容器について、工程（ａ）ないし（ｄ）を繰り返すか；または工程（ａ）ないし（ｄ）を複数回を繰り返すことからなる。関連する態様において、本発明は、所望の化合物の同定方法であって、（ａ）前記のキットを得、第１の複数の容器をスクリーンして検定にて所望の活性を有する容器を同定し、それにより第１の公知のサブユニットを同定し；および（ｂ）第１の公知のサブユニットを第２の複数の容器中の異なるポリサブユニットの各々の内容物のアリコートの末端に結合させる工程からなる。好ましい具体例において、該方法は、さらには、検定にて所望の活性に対する第１の公知のサブユニットを有する異なるポリサブユニットをスクリーンし、それにより第２の公知のサブユニットを同定するか；または工程（ａ）ないし（ｂ）を数回繰り返すことからなる。本発明の他の特徴および利点は、その好ましい具体例の以下の記載および請求の範囲より明らかである。好ましい具体例の記載第１に図面を簡単に説明する。図面：図１は組合わせライブラリーの分割プール合成を示す。図２は組合わせライブラリーのメンバーの配列を決定するための解明（de-con volution）経路の利用を示す。図３はペンタペプチドライブラリーの解明を示す。図４はβ−エンドルフィン抗体に最も強く結合したペンタペプチドの配列を決定するための、β−エンドルフィン抗体と反応するライブラリー産物のプールの修正した吸光度を示す。出願人は、ライブラリーの有用なシリーズまたはキットが、ポリサブユニットを種々のサブユニットから段階的に合成することにより構成されうることを決定した。これらのライブラリーならびにその合成法および使用法は、通常、標準Ｌ −またはＤ−アミノ酸より形成されるペプチドを用いる使用に適しているが、当業者であれば他のサブユニットおよび共有結合、イオン結合または配位結合以外の結合を用いて最終ポリサブユニットを形成させることができ、それをどのような標準検定においてもスクリーンしうることを認識するであろう。これらの合成プロトコルおよび検定は当業者にとって周知であり、本明細書にて繰り返して記載することを要しない。ラムらの前掲書類、およびハクテンらの前掲書類を参照し、そのすべてを出典明示により本明細書の一部とする。本発明の方法およびキットの一例を以下に示す。この例は本発明を限定するものではなく、当業者であれば（前記したように）他の均等な方法、合成および分析を用いることができることを容易に認識するであろう。実施例本明細書中に提案されている方法は、組合わせ合成を基礎とし、あらゆる物質の利用を効果的にする。第１工程は、１０個のサブユニット、Ａ〜Ｊを１０個のカラム中の固体支持体に付着させることである。この物質の６分の１を、Ａ、Ｂ、．．．Ｊで示される形態にて確保し；まだ固体支持体に付着している残りをプールし、１０個のカラムに分け、１０の同種の合成を行い、ＸＡ、ＸＢ、．．．ＸＪを得る。この物質の５分の１をこの形態にて確保し、組合わせ合成を繰り返し、１０個のポリサブユニットＸＸＡ、ＸＸＢ、．．．ＸＸＪを得る。４分の１を確保し、４回目の残りを組合わせ合成によってその残りに加え、ポリサブユニットＸＸＸＡ、ＸＸＸＢ、．．．ＸＸＸＪを得る。これらのポリサブユニットの３分の１を確保した後、合成の最終組合わせ工程を終了し、その物質をカラムから取り出し、ＸＸＸＸＡ、ＸＸＸＸＢ、．．．ＸＸＸＸＪを含有する１０個の溶液を得る。これらの物質を検定する。陽性の検定結果が、構造ＸＸＸＸＣのポリサブユニットを含有するーの容器で得られる（すなわち、Ｃがペンタサブユニットにおいける５番目の位置での臨界的サブユニットである）ならば、実験者は前の工程で確保したカラムに戻り、各アリコートにＣを添加し、１０個の溶液、ＸＸＸＡＣ、ＸＸＸＢＣ、．．．ＸＸＸＪＣを得る。再度、これらを試験する。陽性の検定結果が、ＸＸＸＥＣで得られる（すなわち、Ｅがペンタサブユニットにおける４位での臨界的サブユニットである）ならば、実験者は前の部分ライブラリーに戻り、Ｅ＋Ｃを１０個すべてに添加し、ＸＸＡＥＣ、ＸＸＢＥＣ、．．．ＸＸＪＥＣを得ることによりその工程を終える。すべての位置が特定されるまで、これらの工程を繰り返す。すなわち、本質的に、各々がその最終ライブラリーよりも残基が一つ長い、一連の部分組合わせライブラリーを製造する。最終ライブラリーを、末端の残基で出発して段階的に分解する。この逆戻り一分析の形態は、所望の生成物の合成を明確にすることができ、それは、実際には、だいたい最終工程にて達成される。構成されると、ライブラリーの完全なセットを再び異なるプロジェクトに用いることができる。最終の合成工程がまた、所望の生成物の合成法を提供することは注目に値する。物質および方法溶媒．ＤＭＦ（ＨＰＬＣグレード）をバクスター（Baxter）より購入し、さらに精製することなく用いる。ＣＨ₂Ｃl₂をフィッシャー・サイエンティッフィック（Fisher Scientific）より購入し、使用前にＣaＨ₂で蒸留した。操作．ＵＶ吸光度をヒューレット・パッカード（Hewlett−Packard）８４５２Ａダイオード・アレイ・スペクトロフォトメーターで測定した。遠心分離操作はすべてエッペンドルフ（Eppendorf）５４１５Ｃ分離機で、１０,０００rpm で１分間行った。ペンタペプチドライブラリーの形成．ペプチドライブラリーを固相法により手で合成した。すべての合成について、テンタゲル（tentagel）（ＴＧ）樹脂が固体支持体であり、直径が９０μｍであった。ライブラリーを形成するのに用いたアミノ酸は、Ｇly−ＦＭＯＣ、Ｌeu−ＦＭＯＣ、Ｐhe−ＦＭＯＣおよびＴyr （tＢu）−ＦＭＯＣであった。アミノ酸はすべてＨＢＴＵおよびＤＩＰＥＡの援助によって結合させた。用いたテンタゲル、ＨＢＴＵ、ＤＩＰＥＡおよびアミノ酸はノババイオケム（NovaBiochem）より購入した。テンタゲルを４個のガラス製のフリット化フィルターバイアルに加え、ＤＭＦと一緒に振盪し、濾過した。各バイアルに、ライブラリーのＦＭＯＣ保護アミノ酸成分の一つ、ＨＢＴＵ、ＤＭＦおよび２０μｌのＤＩＰＥＡを加えた。４個のすべてのバイアルを１時間振盪し、濾過し、ＤＭＦで洗浄した。無水酢酸のＤＭＦ中５％溶液（ｖ／ｖ）を各バイアルに加え、２０分間振盪し、結合していないいずれの遊離アミノ酸基にもキャップを付した。ついで、そのビーズを濾過し、ＤＭＦ（２ｘ）およびＣＨ₂ Ｃl₂（２ｘ）で洗浄し、真空オーブン（２０ｍｍＨｇ、５５℃）にて２時間乾燥させた。およそ、７５ｍｇ部のアミノ酸結合テンタゲルビーズを各バイアルより取り出し、ペプチド長および結合した最後のアミノ酸の同一性を明示するように標識化した。また、約５ｍｇ部の樹脂を取り、前記のアミノ酸結合工程の完成度を測定するためにＦＭＯＣ脱保護試験を行った。残りの樹脂を合し、３：１（ｖ／ｖ）のＤＭＦ／ＣＨ₂Ｃl₂中で３０分間振盪し、ビーズを無作為化した。ビーズを等量（したがって、等モル）に４分割し、４つのガラス製のフリット化フィルターバイアルに入れ、Ｎ−末端ＦＭＯＣ保護基を切断するために、ＤＭＦ中２０％ピペリジン（ｖ／ｖ）と一緒に１０分間の振盪に２回付した。ビーズを濾過し、ＤＭＦ（３ｘ）で洗浄し、ライブラリーの４個のアミノ酸成分の一と結合させ、４個のジペプチドのプール、ＴＧ−Ｘａａ−Ｇly−ＦＭＯＣ、ＴＧ−Ｘａａ −Ｌeｕ−ＦＭＯＣ、ＴＧ−Ｘａａ−Ｐhe−ＦＭＯＣおよびＴＧ−Ｘａａ−Ｔyr （tＢu）−ＦＭＯＣを得た。次の工程；１）ペプチドを無水酢酸でキャップし、２）７５ｍｇ部の樹脂を貯蔵かつ標識化し、３）該ビーズを合し、無作為化し、均等に分け、および４）その分けたものを、各々、ＦＭＯＣ保護アミノ酸と結合させる工程を、第５の結合が形成されるまで繰り返した。この時点で、４個のペンタペプチドライブラリーがある。これらのペンタペプチドライブラリーを、該樹脂をＴＦＡ（ピアース（Pierce））と２時間混合することによりチロシン上のｔ−ブチル保護基を切断した。該ビーズを濾過し、エタノール（２ｘ）およびＤＭＦ（２ｘ）で洗浄した。ついで、該ビーズをＤＭＦ中２０％ピペリジン（ｖ／ｖ）と一緒に１０分間で２回振盪し、Ｎ−末端ＦＭＯＣ基を切断した。ついで、脱保護したビーズをＤＭＦ（３ｘ）、ＣＨ₂Ｃl₂（２ｘ）で洗浄し、真空オーブン（２０ｍｍＨｇ、５５℃）中に一夜置き、残りの溶媒を蒸発させた。エライザ操作．テンタゲル樹脂（〜３ｍｇ）含有のライブラリーをポリプロピレン管に加えた。該管をＰＢＳ中３％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）およびＰＢＳ中０. ０５％ツウィーン−２０（シグマ（Sigma））（ｖ／ｖ）の１：１（ｖ／ｖ）遮断溶液で被覆した。該管をＰＢＳ中１μｇ／ｍｌのマウス抗−β−エンドルフィンモノクローナル抗体（ベーリンガー・マンハイム（Boehringer Mannheim））、ＰＢＳ中３％ＢＳＡおよびＰＢＳ中０.０５％ツウィーン−２０からなる５００μｌの１：１：１（ｖ／ｖ／ｖ）溶液と一緒に３７℃で１時間インキュベートした。管を遠心分離に付し、上澄をデカントした。該管を、繰り返し、ＰＢＳ中０.０５％ツウィーン−２０を添加し、該管を遠心分離に付し、上澄をデカントすることにより３回洗浄した。ついで、該管を、グルコースオキシダーゼ（カッペル（Cappel）、ＰＢＳ中３％ＢＳＡおよびＰＢＳ中０.０５％ツウィーン−２０の１：１（ｖ／ｖ）溶液で１０００のファクターまで弱めた）に接合したヤギ抗−マウス抗体（５００μｌ）と一緒にインキュベートした。該管を、繰り返し、ＰＢＳ中０.０５％ツウィーン−２０を添加し、該管を遠心分離に付し、上澄をデカントすることにより３回、そしてＰＢＳを添加し、該管を遠心分離に付し、上澄をデカントすることにより２回洗浄した。２５ｍｌの０.１ＭＮa₃ＰＯ₄（pＨ６.０）、３ｍｌのＨ₂Ｏ中２０％グルコース、２００μｌのホースラディッシュペルオキシダーゼ（０.１ＭＮa₃ＰＯ₄中０.１％、pＨ６.０）および２００μｌのＡＢＴＳ色素（０.１ＭＮa₃ＰＯ₄中４５ｍｇ／ｍｌ、pＨ６.０）を含有する顕色溶液を調製した。５００μｌ部の顕色溶液を該管に加え、ＵＶの読み取りを行う前に、ペプチドライブラリーと１時間反応させた。検定のＵＶ測定では、９００μｌの０.１ＭＮa₃ＰＯ₄（pＨ６.０）をキュベットに入れ、ブランクとして測定し、ついで、１００μｌの顕色させた溶液を該キュベットに入れ、４１６ｎｍでのＵＶ吸光度をモニターした。データ分析．ペンタペプチドライブラリーを検定する以外に、各エライザについて、さらに陽性および陰性対照も同時に検定した。陽性対照は、独立して合成したペンタペプチド、ＴＧ−Ｌeu−Ｐhe−Ｇly−Ｇly−Ｔyr−ＮＨ₂であった。陰性対照は、アセチル化テンタゲル（ＴＧ−Ａc）であった。測定したＵＶ吸光度を、各検定管におけるＴＧ−樹脂の重量差を考慮して標準化し、標準吸光度を得た。４１６ｎｍで測定された吸光度にＴＧ−Ａc（陰性対照）検定管における物質の質量を掛けることにより標準値を算定した。この値をペンタペプチドライブラリー管におけるＴＧ−樹脂の質量で割り、標準吸光度を得た。陰性対照の吸光度を標準吸光度より減じ、修正した吸光度を得た。解明の初期の段階にて、陰性対照は、ライブラリーの読みよりもより高い吸光度の読みを示した。このことはグラフ上に見られる零以下の吸光度の説明となる。ライブラリーが限定されていくにつれて、負の修正吸光度は少なくなる。アミノ酸結合の定量．ＤＭＦを既知量のＧly−ＦＭＯＣに１００ｍｌの容量まで添加することにより、標準溶液を調製した。９８０μｌのＤＭＦ中２０％ピペリジン（ｖ／ｖ）をブランクとしてスキャンした。２０μｌのＧly−ＦＭＯＣ溶液を該ブランクに加え、５分間撹拌し、スキャンした。ピペリジンによりＦＭＯＣ基を切断して形成されるピペリジン−ベンゾフルベン複合体は、３０２ｎｍに特徴的なＵＶ吸光度のピークを有する。組合わせライブラリー合成の結合、キャップおよび乾燥工程に付した後、各結合の終了度の測定を、既知量のテンタゲル樹脂（通常、〜５ｍｇ）を各反応バイアルから取り、その試料を１ドラムバイアルに置くことにより行った。樹脂試料含有のバイアルを１０００μｌのＤＭＦ中２０％ピペリジンと一緒に１５分間振盪した。該樹脂を底部に沈殿させ、１００μｌのピペリジン処理樹脂溶液を、予めキュベットに加え、ブランクとしてスキャンさせた、９００μｌのＤＭＦ中２０％ピペリジンに加えた。３０２ｎｍでのＵＶ吸光度を標準対照と比較し、アミノ酸の結合度を定量した。解明操作の簡単な試験として、市販の抗−β−エンドルフィンモノクローナル抗体に対してナノモル結合を示す、十分に研究されたペンタペプチド配列、Ｌeu −Ｐhe−Ｇly−Ｇly−Ｔyr−ＮＨ₂を含有するライブラリーをスクリーンに付す実験が工夫された。５つの段階と、ロイシン、グリシン、フェニルアラニンおよびチロシンからなるアルファベットを有する合成組合わせペプチドライブラリーをテンタゲル固体支持体に合成した。このライブラリーにおける分子の総数は４⁵ （１０２４数）である。ＦＭＯＣ保護アミノ酸のＨＢＴＵを有する固体支持体への結合は、各結合後になされるＦＭＯＣ切断測定によれば、円滑かつ定量的に進行した。負荷容量（すなわち、樹脂１グラム当たりのモル数）が略一定であり、ライブラリーの合成または解明にあるいかなる段階であっても、問題はないと仮定できるため、結合が定量であることは有利なことである。 β−エンドルフィン抗体に対する結合検定を、テンタゲル樹脂に結合して残っているペプチドライブラリーを用いて行った。解明の順序はスキーム３を示す図３にて図面で理解することができ、各ラウンドに対する修正された吸光度を図４に示す。ペンタペプチドライブラリーの４つのプール（Ｎ−末端アミノ酸だけが限定されている）にて、ＴＧ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｔyrが明らかに最も強い吸光度を示した。これより、ペンタペプチド組合わせライブラリーを形成する間に貯蔵され、かつ標識化された、４個のテトラペプチドライブラリー、ＴＧ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｇly−ＦＭＯＣ、ＴＧ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｌeu−ＦＭＯＣ、ＴＧ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｐhe−ＦＭＯＣおよびＴＧ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｔyr−ＦＭＯＣをＴyr−ＦＭＯＣと結合させた。ＴＧ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｇly−Ｔyr、ＴＧ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ −Ｌeu−Ｔyr、ＴＧ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｐhe−ＴyrおよびＴＧ−Ｘａａ −Ｘａａ−Ｘａａ−Ｔyr−Ｔyrのプールのうち、ＴＧ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ −Ｇly−Ｔyrが明らかに最も強い結合を示した。この解明法を繰り返し、ＴＧ− Ｘａａ−Ｘａａ−Ｇly−Ｇly−Ｔyrがβ−エンドルフィン抗体への最も優れた結合体であると推論した。第４のアミノ酸について試験した場合、明らかに優れたアミノ酸は得られなかった。天然エピトープを抗体に結合させる配列、ＴＧ−Ｘａａ−Ｐhe−Ｇly−Ｇly−Ｔyrが最も強い結合体であった。しかし、ＴＧ−Ｘａａ−Ｌeu−Ｇly−Ｇly−Ｔyrもまた抗体に対して有意な結合を示した。事実、Ｌ eu−Ｇly−Ｇly−ＴyrならびにＰhe−Ｇly−Ｇly−Ｔyrは、組合わせ合成の第１工程より貯蔵された単結合テンタゲルライブラリーへの結合を保証するのに十分であった。最終の分析において、ＴＧ−Ｌeu−Ｐhe−Ｇly−Ｇly−Ｔyrである天然のエピトープが最も強力な結合体であった。さらに、他のより弱い結合体が推論され、ＴＧ−Ｐhe−Ｐhe−Ｇly−Ｇly−ＴyrおよびＴＧ−Ｌeu−Ｌeu−Ｇly−Ｇly−Ｔ yrもまたβ−エンドルフィン抗体に対して有意な結合を示した。解明の繰り返し法は多くの利点を有する。単にペプチドまたはオリゴヌクレオチドライブラリーだけでなく、種々の化学ライブラリーも繰り返して特定することができる。コードしたライブラリーに対する繰り返し解明の利点は、脱コード標識（decoding tag）の使用を回避できることである。このことは、脱コード標識がライブラリー構成員のレセプターへの結合に関与しているのではないかという問題を回避する。さらに、繰り返し法は、レセプターに結合したライブラリー構成員の配列決定または脱コードに依存していないため、該方法は、ライブラリーの活性構成員を特定する感受性の問題も回避する。分割プール（split pool）法による組合わせライブラリーの製造は煩わしい工程である。組合わせ合成の各工程に沿ってサブライブラリーを標識化することにより、一のライブラリーだけを分割プール法により製造させる必要がある。このことは、オリゴヌクレオチドライブラリーのような高度に自動化された方法にて合成されるライブラリーの製造では、大きな利点があるわけではないが、スモール分子のライブラリーのような未だ自動操作されていない他のライブラリーの合成において、本発明の繰り返し法は、今までの繰り返し法についての分割プールライブラリーの製造に関与する多くの時間および労働を回避するものである。他の具体例も後記する請求の範囲の範囲内にある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．各々が１または２以上の結合により結合された既知数のサブユニットから構成されている異なるポリサブユニットからなる第１の複数の容器であって、該サブユニットおよび結合が、各々、同一または異なっていてもよく、該異なるポリサブユニットが、各々、異なる配列のサブユニットからなるが、ポリサブユニットの一端で同一の公知のサブユニットを有し、該第１の複数の容器の各々が該末端で異なる公知のサブユニットを有するポリサブユニットからなる、第１の複数の容器と、各々が１または２以上の結合により結合されたその既知数より１つ少ない数のサブユニットから構成されている異なるポリサブユニットからなる第２の複数の容器であって、該サブユニットおよび結合が、各々、同一または異なっていてもよく、該異なるポリサブユニットが、各々、異なる配列のサブユニットからなるが、該ポリサブユニットの一端で同一の公知のサブユニットを有し、該第２の複数の容器の各々が該末端で異なる公知のサブユニットを有するポリサブユニットからなる、第２の複数の容器とからなることを特徴とするキット。２．該キットがさらにその既知数より２つ少ないサブユニットから構成される異なるポリサブユニットからなる第３の複数の容器からなる請求項１記載のキット。３．該キットがさらにその既知数より３つ少ないサブユニットから構成される異なるポリサブユニットからなる第４の複数の容器からなる請求項１記載のキット。４．該キットが異なるポリサブユニットからなるさらなる複数の容器からなり、該複数の容器が、各々、一の該ポリサブユニット中に存在するサブユニットの数にて該別の複数の容器と区別される請求項１記載のキット。５．該さらなる複数の容器が、その既知数より２つ少ないサブユニットから１個のサブユニットまでを有することにより、別の複数の容器と異なるポリサブユニットを有する請求項４記載のキット。６．所望の化合物を同定するのに有用なキットの構成方法であって、（ａ）その各々が１または２以上の結合により結合された既知数のサブユニットより構成されている異なるポリサブユニットからなる第１の複数の容器を得る工程であって、該サブユニットおよび結合が、各々、同一または異なるものとすることができ、該異なるポリサブユニットが、各々、異なる配列のサブユニットを有するが、ポリサブユニットの一端で同一の公知のサブユニットを有し、該容器が、各々、その末端で異なる公知のサブユニットを有するポリサブユニットからなる工程、（ｂ）該容器の各々からの該異なるポリサブユニットのアリコートを合して混合物を形成させ、ここにアリコートは各容器中の全含量よりも少量である工程、（ｃ）該混合物を第２の複数の容器に分ける工程、および（ｄ）さらなるサブユニットを、該第２の複数の容器中の各々の該ポリサブユニットに結合させ、ここに該サブユニットは該第２の複数の容器の各々について異なることからなる工程からなることを特徴とする方法。７．さらに、該第２の複数の容器について該工程（ａ）ないし（ｄ）を繰り返すことからなる請求項６記載の方法。８．工程（ａ）ないし（ｄ）を数回繰り返すことからなる請求項７記載の方法。９．所望の化合物の同定方法であって、（ａ）請求項１に記載のキットを得、第１の複数の容器をスクリーンして検定にて所望の活性を有する容器を同定し、それにより第１の公知のサブユニットを同定する工程；および（ｂ）該第１の公知のサブユニットを該第２の複数の容器中の該異なるポリサブユニットの各々の内容物のアリコートの末端に結合させる工程からなることを特徴とする方法。１０．さらに、該検定にて所望の活性に対する該第１の公知のサブユニットからなるその異なるポリサブユニットをスクリーンし、それにより第２の公知のサブユニットを同定することからなる請求項９記載の方法。１１．工程（ａ）および（ｂ）を数回繰り返すことからなる請求項９記載の方法。１２．工程（ａ）および（ｂ）を数回繰り返すことからなる請求項１０記載の方法。