DE69614563T2 - Verfahren zur quantifizierung von biologischem material in einer probe - Google Patents

Description

Verwandte Anmeldungen
• Diese Anmeldung ist eine Continuation-in-Part von Croteau et al., U.S. Serial Nr. 08/606,229, angemeldet am 23. Februar 1996, die eine Continuation-in-Part von Croteau et al., U.S. Serial Nr. 08/557,529, angemeldet am 13. November 1995, ist, die beide den Titel "Verfahren zum Erfassen der Menge eines biologischen Materials in einer Probe" tragen und hierdurch einschließlich der Zeichnungen durch Bezug aufgenommen sind.
Bereich der Erfindung
• Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erfassen der Menge eines biologischen Materials in einer Probe.
Hintergrund der Erfindung
• Viele Industriebereiche müssen die Konzentration und den Gehalt von biologischem Material in einer Probe nachweisen und erfassen. Zum Beispiel ist die Bestimmung der bakteriellen Konzentration in Nahrung und Wasser ein wesentlicher Teil der Qualitätskontrolle von Nahrung und Wasser. Die EPA- Regulierungen erfordern, daß keine Coliformen, so wie Escherichia coli in trinkbarem Wasser vorhanden sein dürfen. Das "Anwesenheits-/Abwesenheits"-Format eines Testmediums, sowie das Colilert® chemische Gemisch (IDEXX Laboratories, ME), das, als ein Testmedium auf Escherichia coli und alle coliformen Bakterien verwendet wird, ist bei der Durchführung dieses Nachweises sehr brauchbar. Das Colilert® chemische Gemisch basiert auf der Definierten-Substrat-Technologie, die in Edberg, "Method and Medium for use in Detecting Target Mircorbes In Situ in a Specimen Sample of A Possibly Contaminated Material", US- Patente Nummern 4,925,789 und 5,492,933 beschrieben ist. Siehe ebenfalls Townsend et al., U.S. Serial Nr. 08/484,593, angemeldet am 7. Juni 1997, mit dem Titel "Method and Composition for Detecting Bacterial Contamination in Food Products", das hier durch Bezugnahme aufgenommen ist, beschreibt ein Medium zum Nachweis von Bakterien in Nahrungs- und Wasserproben.
• Jedoch gibt es Bereiche, in denen die Erfassung der Menge und nicht nur der Nachweis der bakteriellen Konzentration wichtig ist. Beispiele von solchen Bereichen schließen Abwasser, hereinkommendes Wasser in Wasserreinigungssystemen, Oberflächenwasser und Nahrungsmitteltests ein. Zum Beispiel werden zahlreiche Restaurantketten nur rohes Hackfleisch oder Hühnchenfleisch akzeptieren das weniger als eine bestimmte Konzentration von bakterieller Verunreinigung aufweist. Daher müssen Nahrungsmittel-verarbeitende Betriebe die nötigen mikrobiologischen Tests ausführen, um die bakterielle Konzentration dieser Nahrungsmittelgegenstände zu bestimmen, bevor sie an die Kunden ausgeliefert werden können.
• Die klassischen Verfahren zum Erfassen der Menge von biologischem Material sind das Standardplatten-Zählverfahren oder das multiple-tube-Fermentations (MTF)-Verfahren. Eine Menge von Probe, die auf mikrobielle Kontamimation getestet wird, wird zuerst in einer Petri-Schale verteilt. Dann werden 15 ml des geeigneten Mediums über die Probe gegossen. Die Petri-Schale wird dann verwirbelt, um die Probe in dem Medium zu mischen und die Petri-Schale wird bei Raumtemperatur ungefähr 20 Minuten lang stehengelassen, um auszuhärten. Das Medium wird dann bei einer bestimmten Temperatur für eine bestimmte Zeit inkubiert und jegliche so erhaltenen Kolonien werden gezählt.
• Das multiple-tube-Fermentationsverfahren ist beschrieben in Recles et al., "Most Probable Number Techniques", veröffentlicht in "Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods", 3rd ed. 1992, auf Seiten 105-199, und in Greenberg et al., "Standard Methods For the Examination of Water and Wastewater", Bth ed. 1992). Bei diesem Verfahren wird ein Volumen einer Probe in verschiedene Röhrchen, die diesen Verdünnungsbereich darstellen, verteilt. Die Röhrchen werden dann bei der geeigneten Temperatur inkubiert, so daß den Bakterien in jedem Röhrchen ermöglicht wird, zu wachsen. Nach Inkubation bei einer bestimmten Temperatur für eine bestimmte Zeit wird die Zahl von positiven Röhrchen gezählt. Die am meisten wahrscheinliche Zahl kann durch die in Recles et al., supra, beschriebene Formel bestimmt werden.
• Ein Testen von Wasser wird meistens durch Membranfiltration durchgeführt, wobei ein bestimmtes Volumen von Wasser durch die Membran passiert wird und die Membran in einem Medium für eine bestimmte Zeitdauer inkubiert wird. Nach geeigneter Inkubation werden die Kolonien gezählt.
Zusammenfassung der Erfindung
• Die vorliegende Erfindung stellt ein einfaches Verfahren zur genaueren Quantifizierung der Zahl von Mikroorganismen in einer Probe oder zur, Quantifizierung von jedem anderen Typ von diskreten partikulären biologischen Material innerhalb einer Probe zur Verfügung. Solche biologischen Materialien schließen Pilze oder andere lebende Organismen sowie Aggregate von Proteinen, sowie Enzyme oder sogar Co-Faktoren ein, wobei Reaktionsgemische verwendet werden, die dem. Durchschnittsfachmann gut bekannt sind. Die Erfindung verwendet im allgemeinen einen neuen Gegenstand, der so aufgebaut ist, daß er eine flüssige Probe hält, in der chemische und/oder mikrobiologische Reaktanten zur Verfügung gestellt werden. Zum Beispiel können solche chemischen Reaktanten ein spezifisches Wachstumsmedium für Bakterien sein. Die verwendete Vorrichtung weist allgemein die Form einer Inkubationsschale auf, die eine Vielzahl von Tüpfeln aufweist die in der Lage sind, verschiedenen Aliquots von Flüssigkeiten zu halten. Im allgemeinen ist die Vorrichtung so aufgebaut, daß zwischen 5 und 100 ml von Flüssigkeit insgesamt gehalten wird und die Tüpfel sind so aufgebaut, um getrennte Inkubationskammern für jedes Probenaliquot zu bilden. Die Tüpfel können von gleicher Stöße oder verschiedener Größe und Form sein, um den Zählbereich zu vergrößern und/oder Verdünnungseffekte zu simulieren. Siehe Naqui et al., U.S. Serial Nr. 08/201,110, angemeldet 23. Februar 1994 mit dem Titel "Apparatus and Method for Quantification of Biological Material in a Liquid Sample", die hier durch Bezugnahme aufgenommen wird.
• Daher betrifft die Erfindung in einem ersten Aspekt ein Verfahren zum Nachweis eines biologischen Materials in einer Probe gemäß Anspruch 1. Das Verfahren schließt die Schritte von Verflüssigen der Probe (falls nötig) und Gießen der verflüssigten Probe und Reagenz in die Inkubationsschale ein. Die Inkubationsschale weist eine im wesentlichen ebene horizontale Oberfläche auf und die Oberfläche ist in eine Vielzahl von wenigstens 20 vertieften Tüpfeln aufgeteilt. Jeder Tüpfel ist dazu geeignet, einen Aliquot von Flüssigkeit zu halten und ist von einer Größe und Form und aus einem geeigneten Material gebildet, um das Aliquot durch Oberflächenspannung innerhalb des Tüpfels zu halten. Jede überschüssige Flüssigkeit von der verflüssigten Probe wird von der Oberfläche der Platte aufgrund der Hydrophobizität des zur Bildung der Platte verwendeten Materials abgegossen. Das Verfahren schließt dann ein Inkubieren der Inkubationsschale ein, bis die Anwesenheit oder Abwesenheit von dem biologischen Material bestimmt wird. In bevorzugten Ausführungsformen sind die Tüpfel angefast, um ein Abgießen von Flüssigkeit zu erleichtern, die sich oberhalb der horizontalen Ebene befindet (siehe Figur. 3).
• Wie oben angegeben ist das biologische Material, das nachgewiesen werden kann, jedes Material das einen diskreten Partikel bildet, so wie ein Mikroorganismus, dessen Menge durch Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit von solch einem biologischen Material innerhalb jedes Tüpfels der Inkubationsschale quantifiziert werden kann. Die Probe kann jegliche biologische Probe oder aus der Umwelt stammende Probe, so wie Abwasser, Nahrung, ein Wischtest, oder Schwämmchen von anderen Oberflächen, so wie einem Rachen sein oder andere Proben, die dem Fachmann gut bekannt sind. Diese Probe kann eine flüssige Probe sein oder in einer Flüssigkeit gelöst werden, um die verflüssigte Probe zu bilden. Daher betrifft der Ausdruck "verflüssigen" in dem oben genannten Absatz ein zur Verfügung stellen der Probe in einer Flüssigkeit die, einmal mit einem mikrobiologischen Reagenz zusammengebracht, leicht in der Inkubationsschale aliquotiert werden kann. Die verflüssigte Probe kann als eine Flüssigkeit verbleiben oder in den Tüpfeln verfestigt werden.
• Die Inkubationsschale kann aus jedem gewünschten Material gebildet werden, aber ist insbesondere erwünscht, daß ein Plastik verwendet wird, das ein Halten der verschiedenen Aliquots der verflüssigten Probe durch Oberflächenspannung innerhalb jedes Tüpfels ohne Kreuzkontaminierung der Tüpfel erlaubt. Bevorzugterweise ist das Material hydrophob. Die Oberfläche kann unbehandelt oder chemisch oder physikalisch behandelt sein, um ein Zurückhalten der Flüssigkeit innerhalb der Tüpfel zu verstärken.
• Die Form der Inkubationsschale ist nicht von Bedeutung und in bevorzugten Ausführungsformen weist sie im allgemeinen eine kreisförmige Form auf (so wie die einer Petri-Schale). In der Tat kann die Inkubationsschale dazu verwendet werden, um den Platz einer Petri-Schale einzunehmen. Genauer kann das Verfahren dieser Erfindung dazu verwendet werden, um diejenigen existierenden Tests zu ersetzen, die im allgemeinen auf Petri- Schalen durchgeführt werden, um die Zahl von bakteriellen Kulturen zu ermitteln. Weil diskrete Aliquots der Probe in der Platte zur Verfügung gestellt werden, braucht der Durchschnittsfachmann nur die Zahl von positiven Tüpfeln in der Platte zu bestimmen, um die Menge des biologischen Materials innerhalb der originalen Probe zu definieren, so wie mit dem MPN-Test, der oben beschrieben ist.
• Die im allgemeinen ebenen horizontale Oberfläche ist so aufgebaut, um ein aliquotieren der Flüssigkeit zwischen den Tüpfeln leicht zu ermöglichen und dann überschüssige Flüssigkeit von der Schale abzugießen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Lippe oder ein Gießschnabel für die Schale zur Verfügung gestellt. Der Fachmann wird erkennen, daß die Tiefe und Form der Tüpfel, sowie das Material, das verwendet wird um die Tüpfel und die Schale herzustellen, so ausgewählt sind, daß die Oberflächenspannung verwendet werden kann, um die Aliquots innerhalb jedes Tüpfels in Abhängigkeit von dem Typ der in der verflüssigten Probe verwendeten Flüssigkeit zu halten.
• In anderen bevorzugten Ausführungsformen definiert die Oberfläche mindestens 40, 60, 80 oder sogar 200 oder mehr vertiefte Tüpfel; die Platte ist aus jedem formbaren Plastik gebildet; ein Deckel wird ebenfalls zur Verfügung gestellt, um eine Verunreinigung der Flüssigkeit innerhalb der Tüpfel zu vermeiden; und die Platte wird in einer sterilen Form zur Verfügung gestellt, so daß keine positiven Aliquots beobachtet werden können, bevor nicht wenigstens ein Partikel aus biologischem Material in der Probe vorhanden ist.
• In noch anderen bevorzugten Ausführungsformen ist die Inkubationsschale durchsichtig oder gefärbt, zum Beispiel weiß oder gelb (um das Auftreten von Farbe (z. B. blau) innerhalb der Inkubationsschale zu verstärken) und der Tüpfel weist einen Durchmesser von ungefähr 3,8 mm (0,15 inch) auf und die Schale weist einen Durchmesser von ungefähr 76,2 oder 127 mm (3 oder 5 inch) auf.
• In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist die Inkubationsschale eine "Abgießvertiefung" auf, die an die Oberfläche der Schale anschließt. Die Vertiefung hat eine ausreichende Kapazität um die überschüssige Flüssigkeit, die von der Schalenoberfläche entfernt wird, zu enthalten. Als ein Hilfsmittel um zu vermeiden, daß die überschüssige Flüssigkeit zurück auf die Schalenoberfläche spritzt, ist es bevorzugt, daß die Vertiefung ein absorbierendes Material enthält, z. B. ein Gaze-ähnliches Material. In einer bestimmten Ausführungsform weist die Platte sowohl eine Abgießvertiefung als auch eine "Aufgießfläche" auf. Die "Aufgießfläche" ist im folgenden beschrieben.
• In einem verwandten Aspekt stellt die Erfindung eine sterile Inkubationsschale zur Verfügung, die eine im allgemeinen ebene horizontale Oberfläche aufweist, wie im Anspruch 27 definiert. Die Oberfläche definiert eine Vielzahl von mindestens 20 vertieften Tüpfeln (in bevorzugten Ausführungsformen sind mindestens 40, 60, 90 oder sogar 200 vertiefte Tüpfel zur Verfügung gestellt) und jeder Tüpfel ist wie oben beschrieben dazu geeignet, Aliquots von Flüssigkeit durch Oberflächenspannung zu halten.
• In bevorzugten Ausführungsformen stellt die Erfindung die sterile Inkubationsschale im wesentlichen wie oben beschrieben zur Verfügung, aber darin enthalten eine "Aufgießfläche", die eine im allgemeinen mittiger Bereich der Schale ist, dem Tüpfel fehlen, der die Probe vor der Verdünnung der Probe in, zum Beispiel, einem Inkubationsmedium aufnehmen kann. Daher kann ein Volumen von 0,01 bis 5 ml von Probenflüssigkeit in dem "Aufgießfläche"-Bereich (Abhängig von seiner Größe und Form) aufgetragen werden und dann diese Flüssigkeit in jedem Tüpfel verteilt werden, indem das verdünnende und Wachstumsunterstüzende Medium hinzugefügt wird (z. B. das oben angegebene ColilertTM chemische Gemisch) und diese Flüssigkeit wird gleichzeitig die Probe verdünnen und ein Verteilen der Probe in die Tüpfel ermöglichen.
• Zusätzlich kann in der Inkubationsschale ein Gießschnabel zur Verfügung gestellt werden, um ein Abgießen von überschüssiger Flüssigkeit innerhalb der Platte zu ermöglichen. Solch ein Gießschnabel kann mit einem geeigneten Deckel versehen werden, der einen Schlitz aufweist, der es der Flüssigkeit in der Inkubationsschale nur dann erlaubt, von der Inkubationsschale abgegossen zu werden, wenn der Schlitz mit dem Ausgießschnabel wie im folgenden beschrieben in einer Linie liegt.
• Wie für das obige Verfahren gesagt, kann die Inkubationsschale ebenfalls eine "Abgießvertiefung" im Anschluß an die Oberfläche der Schale aufweisen. Die Vertiefung weist genügend Kapazität auf, um die überschüssige Flüssigkeit, die von der Schalenoberfläche entfernt werden soll, aufzunehmen und bevorzugterweise enthält die Vertiefung ein absorbierendes Material, z. B. ein Gaze-ähnliches Material. In einer besonderen Ausführungsform weist die Schale sowohl eine "Abgießvertiefung" und eine "Aufgießfläche" auf.
• Der Anmelder stellt ein extrem brauchbares Verfahren zu Verfügung, das es ungelerntem Personal ermöglicht, schnell die Menge eines biologischen Material in einer Probe zu bestimmen. Weil die Probe leicht durch Personen ohne wesentliche Schulung in Mikrobiologie verflüssigt werden kann und die Materialien für jeden spezifischen Test vom Hersteller zur Verfügung gestellt werden können, können solche Personen leicht die Tests mit Genauigkeit durchführen. Die Inkubationsschale wird im allgemeinen in einer sterilen Form zur Verfügung gestellt, so daß kein ungeeigneter Nachweis von biologischem Material auftreten kann.
• Während es bekannt ist, Plastikbehälter zur Verfügung zu stellen, die Flüssigkeiten innerhalb einer Vielzahl von Aufnahmen halten könnnen, glaubt der Anmelder, daß diese Vorrichtung ein neues automatisches Aliquotierungsverfahren zur Verfügung stellt. Dies stellt eine Verbesserung über die bestehenden Produkte dar die verwendet werden, um Mikroorganismen nachzuweisen und zu quantifizieren, weil sich die Flüssigkeit ohne eine individuelle Verteilung auf die einzelnen Tüpfeln verteilt.
• Die vorliegende Vorrichtung kann die Verwendung einer Petri- Schale ersetzen und kann insbesondere bei der Nahrungsmittel- Analyse und beim Testen von klinischen Proben verwendet werden. Die Trennung der Tüpfel der vorliegenden Vorrichtung beugt einem Cross-Talk oder einer Kontaminierung zwischen jedem Aliquot vor. Daher können viele der Tests durch Beobachtung von Fluoreszenz durchgeführt werden (was nicht einfach in einer Agar-enthaltenden Petri-Schale durchgeführt werden kann). Die Vorrichtung ist insbesondere brauchbar, wenn eine große Menge von Mikroorganismen in einer Probe vorhanden sind, so wie mehr als ein Organismus pro einem ml oder pro zehn ml.
• Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung ihrer bevorzugten Ausführungsformen und aus den Ansprüchen deutlich werden.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform
• Zuerst wird die Zeichnung kurz beschrieben werden.
Zeichnungen
• Fig. 1 und 2 sind Diagramm-artige Darstellungen einer geformten Plastik-Inkubationsschale.
• Fig. 3 zeigt eine Querschnitt eines Tüpfels, mit oder ohne einer Fasung.
• Fig. 4 zeigt eine Diagramm-artige Darstellung einer geformten Plastik-Inkubationsschale, die einen Ausgießschnabel und einen entsprechenden Schlitz, sowie eine "Aufgießfläche" aufweist.
• Fig. 5 zeigt eine Diagramm-artige Darstellung einer geformten Plastik-Inkubationsschale, die eine "Aufgießfläche" und "Abgießvertiefung" aufweist.
Struktur
• Mit Bezug auf Fig. 1 und 2 wird eine Inkubationsschale 10 gezeigt, die eine Vielzahl von Tüpfeln 12 aufweist, die jeder einen Durchmesser von ungefähr 4,1 mm (0,16 inch) aufweisen. Die Inkubtionsschale 10 hat einen Durchmesser von ungefähr 127 mm (5 inch). Die Inkubationsschale ist aus geformtem Plastik hergestellt. Die Tüpfel 12 sind ausreichend von einander beabstandet, um einem Cross-Talk zwischen den Tüpfeln vorzubeugen. Diese Tüpfel können eine Fasung (Fig. 3), wenn gewünscht, aufweisen, um einem Verbleiben von Flüssigkeit an der oberen Kante des Tüpfels vorzubeugen. Der Fachmann wird erkennen, daß die Inkubationsschale 10 leicht durch Standardverfahren geformt werden kann und in der generellen Form einer Petri- Schale hergestellt werden kann, mit oder ohne einer Lippe oder einem Ausgießschnabel und mit oder ohne einem Deckel 14. Dieser Deckel wird mit einer Vertiefung 16 vorgesehen, um einem Kontakt des Deckels mit der Schale 10 vorzubeugen.
• Mit Bezug auf Fig. 4 wird eine Inkubationsschale 10 gezeigt, die eine Vielzahl von Tüpfeln, ähnlich wie oben beschrieben aufweist. Die Inkubationsschale schließt ebenfalls eine "Aufgießfläche" 22 mit einer Größe von ungefähr 38,1 mm (ein und ein halber inch) Durchmesser ein, die einfach ein Bereich ist, der in der Lage ist ein definiertes Volumen von Flüssigkeit zu halten. Innerhalb der Inkubationsschale ist ebenfalls ein Ausgießschnabel 24 vorgesehen der es erlaubt, überschüssige Flüssigkeit von der Inkubationsschale zu entfernen. Ebenfalls wird ein entsprechender Deckel 14 vorgesehen, der einen Schlitz aufweist, der mit dem Ausgießschnabel in Übereinstimmung gebracht werden kann, um es zu erlauben, Flüssigkeit von der Inkubationsschale zu entfernen. Wenn der Schlitz nicht mit dem Ausgießschnabel in einer Linie ist, wird ein Verdunsten von Flüssigkeit innerhalb der Platte durch eine Reduktion des Luftstroms über die Flüssigkeit in den Tüpfeln verringert. Eine Vertiefung 16 kann ebenfalls in dem Deckel vorgesehen sein, um ein in Kontakt kommen der Deckeloberfläche mit den Tüpfeln zu vermeiden und daher Kreuz-Kontamination zwischen den Tüpfeln vorzubeugen.
• Mit Bezug auf Fig. 5 wird eine Inkubationsschale 10 gezeigt, die eine Vielzahl von Tüpfeln im wesentlichen wie oben beschrieben aufweist, die ebenfalls eine "Aufgießfläche" 22 von der Größe von 25,4 mm (ungefähr 1 inch) Durchmesser einschließt. Innerhalb der Inkubationsschale wird ebenfalls eine "Abgießvertiefung" 26 angrenzend an die Oberfläche der Schale vorgesehen, die ein Entfernen überschüssiger Flüssigkeit von der Inkubationsschale erlaubt. Wie in der Querschnittsansicht gezeigt, wird die "Abgießvertiefung" durch eine erhöhte Barriere 28 zwischen der Vertiefung und der Schalenoberfläche gebildet. Die Barriere hat einen unteren Barriereteil 30, der als ein Kanal dient, durch den überschüssige Flüssigkeit von der Schalenoberfläche in die Vertiefung hineingegossen werden kann. Typischerweise wird die Vertiefung ein absorbierendes Material enthalten, das die Flüssigkeit innerhalb der Vertiefung zurückhalten wird, was einem Zurückspritzen auf die Schalenoberfläche vorbeugt.
Verwendung
• Bei der Verwendung kann ein zum Nachweis eines biologischen Materials geeignetes Reagenzpulver mit einer geeigneten Menge von steriler Flüssigkeit rehydriert werden und dann mit einem bekannten Volumen einer Testprobe beimpft werden. Zum Beispiel können 20 ml steriles Wasser mit zwischen 10 und 1000 ul Probe beimpft werden. Das beimpfte Reagenz kann dann zu der Inkubationsschale 10 hinzugefügt werden und die Flüssigkeit innerhalb der Inkubationsschale 10 verwirbelt werden, um das beimpte flüssige Reagenz auf jedes der Tüpfel 12 zu verteilen. Die Inkubationsschale 10 wird dann bei einem Winkel von ungefähr 90º gehalten, um zu erlauben, daß überschüssiges beimpftes Reagenz von der Schale entfernt wird. Ein Deckel kann dann auf die Inkubationsschale aufgebracht werden und die Platte in einem Inkubator für die geeignete Zeitdauer, zum Beispiel 18-48 Stunden, gehalten werden. Nach dieser Zeit kann die Anwesenheit oder Abwesenheit eines positiven Ergebnisses in jedem der Tüpfel 12 der Schale ermittelt werden. Zusätzlich kann für Schalen, die eine "Abgießvertiefung" aufweisen, aufgrund des größeren Volumens von Flüssigkeit das in der Vertiefung enthalten ist, ein positives Ergebnis in der Vertiefung als ein früher Hinweis von hohen bakteriellen Werten dienen.
Beispiel 1: Verwendung der Inkubationsschale für Rohmassentest
• Zur Gesamtschalenzählung wurde eine wie oben beschriebene Schale zum Nachweis und der Quantifizierung der gesamt bakteriellen Konzentration von Nahrung verwendet. Sie basierte auf einer multiple-Enzym-Technologie (Townsend and Chen, Method and Composition for Detecting Bacterial Contamination in Food Products, U.S. Serial No. 08/484,593, hierdurch durch Bezugnahme aufgenommen), die Enzymaktivität mit der Anwesenheit von lebensfähigen Bakterien in Nahrungsmitteln korreliert. Sie verwendet multiple Enzymsubstrate, die eine blau fluoreszierende Farbe produzieren wenn sie durch Bakterien metabolisiert werden. Wenn das flüssige Reagenz mit einer präparierten Nahrungsmittelprobe beimpft wird und in einer Schale wie hier beschrieben verteilt wird, kann die Gesamtkonzentration lebebensfähiger Bakterien jedes Nahrungsmittels nach 24 Stunden Inkubation bestimmt werden. Das hier aktuell verwendete Medium ist für die Erfindung nicht wichtig, und ist nur für verdeutlichende Zwecke angegeben.
Lagerung und Entsorgung
• Rohmassenpulver und nicht verwendete Inkubationsschalen der Erfindung (Simplate) werden bei Raumtemperatur (4-25ºC) unter Lichtausschluß gelagert. Nach der Verwendung wird die Inkubationsschale der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung (Simplat) lebensfähige Bakterien enthalten, die geeignet gehandhabt und entsorgt werden müssen. Wenn das Pulver einmal rehydriert ist, ist es für bis zu 24 Stunden stabil, wenn bei 4- 25ºC gelagert.
Testverfahren
• 1. Gieße eine geeignete Menge von Vorratspulver in einen Behälter mit sterilem deionisiertem Wasser. Ein Gefäß enthält genug Pulver für 10 Tests. Jeder Test weist ein finales Volumen von 10 ml auf. Zum Beispiel: Füge 1 Gefäß Pulver zu 100 ml sterilem Wasser, um ausreichend Medium für 10 Tests herzustellen.
• 2. Plaziere Testprobe auf die mittige "Aufgießfläche" 22 der Schale 10, gezeigt in Fig. 4. Nach Abschluß dieses Vorgangs wird die Hälfte der Testprobe abgegossen und entsorgt werden, daher muß die Größe des Inokulums dies berücksichtigen. Zum Beispiel, wenn man die bakterielle Konzentration von 0,1 ml Testprobe messen möchte, dann müssen 0,2 ml Testprobe auf der "Aufgießfläche" aufgebracht werden. Bringe nicht mehr als 2 ml auf der mittigen "Aufgießfläche" auf.
• 3. Entferne den Deckel von der Schale und verteile 10 ml TPC- Medium in der Schale, wobei sichergestellt werden muß, daß die Flüssigkeit über die Testprobe auf der mittigen "Aufgießfläche" geleitet wird. Wenn die Testprobe größer als 0,1 ml ist, füge ausreichend TPC hinzu, um ein Gesamtvolumen von 10 ml in der Schale zu erhalten. Beachte, wenn die Flüssigkeit nicht auf der "Aufgießfläche" verteilt wird, kann sie verspritzen.
• 4. Bringe den Deckel wieder auf der Schale an. Beachte, um sicherzustellen, daß die Flüssigkeit in der Inkubationsschale der vorliegenden Erfindung (Simplat) verbleibt, stelle sicher, daß der Schlitz auf dem Deckel sich nicht in einer Linie mit dem Ausgießschnabel befindet.
• 5. Verteile die Flüssigkeit durch verwirbeln der Schale in die Tüpfel, wie dies bei einer Standardgießschale getan würde.
• 6. Bringe den Schlitz auf dem Deckel mit dem Ausgießschnabel in eine Linie und gieße vorsichtig die überschüssige Flüssigkeit ab, die nicht in den Tüpfeln verblieben ist. Ein Halten der Schale in einem Winkel von ungefähr 90º in Bezug auf die Laborbank stellt ein geeignetes Abgießen von überschüssiger Flüssigkeit sicher. Stelle sicher, daß alle Flüssigkeit "Querbrücken" zwischen den Tüpfeln durch sanftes Klopfen der Schale entfernt sind. Entsorge überschüssige Flüssigkeit auf geeignete Weise.
• 7. Drehe den Deckel weg von dem Gießschnabel, um ein Austrocken der Flüssigkeit in den Tüpfeln während der Inkubation zu vermeiden und um eine Kontamination von außen durch die Öffnung zu vermeiden.
• 8. Plaziere die Schale in einem Inkubator für 24 Stunden. Die Schalen können umgedreht werden, falls gewünscht. Inkubationstemperaturen von mehr als 37ºC werden nicht empfohlen.
• 9. Zähle die Zahl von fluoreszenten Tüpfeln nach 24 Stunden durch Plazieren eines 6 Watt 36 nm UV-Lichts innerhalb von fünf inch von der Platte. Lies die Platte nicht vor 24 Stunden. Die Ergebnisse sind bis zu 48 Stunden stabil.
• 10. Vergleiche die Zahl von fluoreszenten Tüpfeln mit einem MPN-Chart, um die wahrscheinlichste Zahl von in der Schale anwesenden Bakterien zu bestimmen.
Testverfahren unter der Verwendung einer Schale, die eine "Abgießvertiefung" aufweist
• 1. Gieße eine geeignete Menge von Rohmassenpulver in einen Behälter mit sterilem deionisiertem Wasser. Ein Gefäß enthält genug Pulver für 10 Tests. Jeder Test weist ein finales Volumen von 10 ml auf. Zum Beispiel: Füge ein Gefäß Pulver zu 100 ml sterilem Wasser, um ausreichend Medium für 10 Tests herzustellen.
• 2. Plaziere die Testprobe auf der mittigen "Aufgießfläche" 22 der Schale 10, gezeigt in Fig. 5. Bei der Beendigung dieses Verfahrens wird die Hälfte der Testprobe in die Vertiefung abgegossen werden, daher muß die Größe des Inokulums dies berücksichtigen. Zum Beispiel, wenn gewünscht ist, die bakterielle Konzentration von 0,1 ml Testprobe zu messen, muß man 0,2 ml Testprobe auf der "Aufgießfläche" plazieren. Bringe nicht mehr als 2 ml auf der "Aufgießfläche" an.
• 3. Entferne den Deckel von der Schale und verteile 10 ml Medium in der Schale, wobei sichergestellt werden muß, daß die Flüssigkeit über die Testprobe in der mittigen "Aufgießfläche" geleitet wird. Wenn die Testprobe größer als 0,1 ml ist, füge ausreichend Medium hinzu um ein gesamtes Volumen von 10 ml in der Platte zu erhalten. Bemerke, wenn die Flüssigkeit nicht auf der "Aufgießfläche" verteilt wird, kann sie verspritzen.
• 4. Verteile die Flüssigkeit durch verwirbeln der Schale in die Tüpfel, wie dies bei einer Standardgießschale geschehen würde, wobei achtgegeben werden muß, daß die Flüssigkeit nicht in die "Abgießvertiefung" eindringt.
• 5. Gieße die überschüssige Flüssigkeit, die nicht in den Tüpfeln verblieben ist, durch die den "Abgießvertiefungs"- Barrierenkanal sorgfältig ab. Ein Halten der Schale bei einem Winkel von ungefähr 90º in Bezug auf die Laborbank stellt ein geeignetes Abgießen von überschüssiger Flüsssigkeit sicher. Stelle durch sanftes Klopfen der Schale sicher, daß alle Flüssigkeit "Querbrücken" zwischen den Tüpfeln entfernt werden.
• 6. Plaziere die Schale für 24 Stunden in einem Inkubator. Die Schalen können, wenn gewünscht, umgedreht werden, wenn die "Abgießvertiefung" ein absorbierendes Material enthält.
• 7. Zähle die Zahl von fluoreszenten Tüpfeln nach 24 Stunden durch Plazieren eines 6 Watt 36 nm UV-Lichts innerhalb von fünf inch von der Platte. Lese die Platte nicht vor 24 Stunden ab. Die Ergebnisse sind bis zu 48 Stunden stabil.
• 8. Vergleiche die Zahl von fluoreszenten Tüpfeln mit einem MPN-Chart, um die wahrscheinlichste Zahl von in der Schale vorhandenen Bakterien zu bestimmen.
Beispiel 2: Verwendung der Inkubationsschale für Testen von Doseneinheiten
• Die in Beispiel 1 beschriebenen Schale und Medien werden für diesen Test verwendet.
Testablauf
• 1. Gebe 10 ml steriles Wasser zu dem Röhrchen mit vorverteiltem Pulver. Wenn mehr als 0,1 ml Nahrungsmittelprobe in dem Test inokuliert werden soll, reduziere das Volumen von sterilem Wasser geeignet, um ein Gesamtvolumen von 10 ml in dem Röhrchen zu erhalten.
• 2. Inokuliere das flüssige Reagenz mit der Nahrungsmittelprobe, die getestet wird.
• 3. Schüttle das Röhrchen mehrere Male, um das Pulver und die inokulierte Nahrungsmittelprobe vollständig zu mischen. Vermeide ein übermäßiges Mixen das dazu führt das flüssige Reagenz aufzuschäumen. Zuviel Schaum kann die Verteilung der Flüssigkeit in der Schale verkomplizieren. Der Rest des Verfahrens ist wie in Beispiel 1.
• Andere Ausführungsformen liegen innerhalb der folgenden Ansprüche.

Claims (52)

1. Verfahren zum Erfassen der Menge eines biologischen Materials in einer Probe, wobei zu dem Verfahren die Schritte gehören:

die Probe wird, falls sie nicht in flüssiger Phase vorliegt, verflüssigt und es wird die verflüssigte Probe in eine Inkubationsschale gegossen, die eine im wesentlichen ebene horizontale Oberfläche aufweist, wobei die Oberfläche eine Vielzahl von wenigstens zwanzig vertieften Tüpfeln aufweist, von denen jeder dazu dient, ein Aliquot der Flüssigkeit aufzunehmen, und die derart dimensioniert und gestaltet sowie aus einem geeigneten Material hergestellt sind, dass das Aliquot in jedem der Tüpfel durch Oberflächenspannung oder durch Gelieren der Flüssigkeit gehalten wird, ohne dass es zu Querkontamination zwischen den Aliquoten der Flüssigkeit kommt;

eventuell überschüssige Flüssigkeit aus der Inkubationsschale abgegossen wird, und

die Inkubationsschale solange inkubiert wird, bis das Vorhandensein oder die Abwesenheit des biologischen Materials in einem oder mehreren der Tüpfel festgestellt ist, um die Menge des biologischen Materials bestimmen zu können.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Oberfläche wenigstens 40 vertiefte Tüpfel bildet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Oberfläche wenigstens 60 vertiefte Tüpfel bildet.

4. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Oberfläche wenigstens 90 vertiefte Tüpfel bildet.

5. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Oberfläche wenigstens 200 vertiefte Tüpfel bildet.

6. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Schale aus Kunststoff hergestellt ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem der Kunststoff PVC ist.

8. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem der Kunststoff aus einem hydrophoben Material hergestellt ist.

9. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Schale im wesentlichen ringförmig ist.

10. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Schale mit einem Deckel ausgestattet ist, um Verunreinigung der Flüssigkeit in den Tüpfeln zu verhindern.

11. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Schale transparent ist.

12. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Schale farbig ist.

13. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem die Farbe gelb ist.

14. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem jeder der Tüpfel einen Durchmesser von ca. 3,8 mm (0,15 Zoll) aufweist.

15. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem jeder der Tüpfel angefaßt ist, um das Entfernen überschüssiger Flüssigkeit zu erleichtern.

16. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Schale einen Durchmesser von ca. 76,2 mm (drei Zoll) aufweist.

17. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Schale einen Durchmesser von ca. 127 mm (fünf Zoll) aufweist.

18. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Schale eine Lippe aufweist, um das Entfernen von überschüssiger, nicht in Tüpfeln befindlicher Flüssigkeit aus der Schäle zu erleichtern.

19. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Tüpfel insgesamt zwischen 5 und 100 ml fassen.

20. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Schale steril ist.

21. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem ferner die Schale eine der Oberfläche benachbarte Abgießvertiefung aufweist, wobei die Vertiefung dafür ausgelegt ist, die überschüssige Flüssigkeit aufzunehmen,

und bei dem vor dem Inkubieren die überschüssige Flüssigkeit von der Oberfläche der Inkubationsschale in die Abgießvertiefung weggegossen wird. ·

22. Verfahren nach Anspruch 21, bei dem sich in der Abgießvertiefung ein saugfähiges Material befindet.

23. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem zu der Schale eine "Aufgießfläche" (landing pad) gehört, die ausreichend dimensioniert ist, um die verflüssigte Probe vor ihrer Verteilung auf die Tüpfel aufzunehmen.

24. Verfahren nach Anspruch 23, bei dem es dazu gehört, dass die Probe auf die "Aufgießfläche" (landing pad) aufgegeben wird und dass anschließend eine weitere Flüssigkeit zugegeben wird, um die Probe gleichzeitig zu verdünnen und diese auf die Tüpfel zu verteilen.

25. Verfahren nach Anspruch 23, bei dem die Schale ferner eine an die Oberfläche anschließende Abgießvertiefung aufweist, wobei die Vertiefung dafür ausgelegt wird, die überschüssige Flüssigkeit aufzunehmen, und

bei dem vor dem Inkubieren die überschüssige Flüssigkeit von der Oberfläche der Inkubationsschale in die Abgießvertiefung weggegossen wird.

26. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Inkubationsschale einen Gießschnabel aufweist, und bei dem zu der Schale ferner ein Deckel gehört, der einen Schlitz enthält, der dazu ausgelegt ist, mit dem Gießschnabel in der Weise zusammenzuwirken, dass ein Abgießen überschüssiger Flüssigkeit aus der Inkubationsschale möglich ist, und dass sich der in dem Deckel befindliche Schlitz von dem Gießschnabel der Inkubationsschale separieren lässt, um dadurch eine Inkubation der Inkubationsschale ohne wesentliche Verdunstungsverluste von Flüssigkeit aus den Tüpfeln zu ermöglichen.

27. Sterile Inkubationsschale für die Bestimmung der Menge eines biologischen Materials, mit einer im wesentlichen ebenen, horizontalen Oberfläche, wobei die Oberfläche eine Vielzahl von wenigstens zwanzig vertieften Tüpfel bildet, von denen jeder dazu dient, ein Aliquot der Flüssigkeit aufzunehmen, und die derart dimensioniert und gestaltet sowie aus einem geeigneten Material hergestellt sind, dass das Aliquot in jeder Tüpfel durch Oberflächenspannung gegen die Wirkung der Schwerkraft festgehalten wird und die Aliquote in den Tüpfel haften, ohne dass es zu Querkontamination zwischen den Aliquoten der Flüssigkeit kommt,

wobei die Inkubationsschale keinerlei positiven Antwort liefert, wenn das besagte biologische Material in einer in die Schale eingebrachten Probe für das biologische Material fehlt.

28. Schale nach Anspruch 27, bei der die Oberfläche wenigstens 40 vertiefte Tüpfel bildet.

29. Schale nach Anspruch 27, bei der die Oberfläche wenigstens 60 vertiefte Tüpfel bildet.

30. Schale nach Anspruch 27, bei der die Oberfläche wenigstens 90 vertiefte Tüpfel bildet.

31. Schale nach Anspruch 27, bei der die Oberfläche wenigstens 200 vertiefte Tüpfel bildet.

32. Schale nach Anspruch 27, die aus Kunststoff hergestellt ist.

33. Schale nach Anspruch 32, bei der der Kunststoff PVC ist.

34. Schale nach Anspruch 32, bei der der Kunststoff aus einem hydrophoben Material hergestellt ist.

35. Schale nach Anspruch 27, die im wesentlichen ringförmig ist.

36. Schale nach Anspruch 27, bei der die Inkubationsschale mit einem Deckel ausgestattet ist, um Verunreinigung der Flüssigkeit in den Tüpfeln zu verhindern.

37. Schale nach Anspruch 27, die transparent ist.

38. Schale nach Anspruch 27, die farbig ist.

39. Schale nach Anspruch 38, bei der die Farbe weiß oder gelb ist.

40. Schale nach Anspruch 27, bei der jeder der Tüpfel einen Durchmesser von ca. 3,8 mm (0,15 Zoll) aufweist.

41. Schale nach Anspruch 27, die einen Durchmesser von ca. 76,2 mm (drei Zoll) aufweist.

42. Schale nach Anspruch 27, die einen Durchmesser von ca. 127 mm (fünf Zoll) aufweist.

43. Schale nach Anspruch 27, die eine Lippe aufweist, um das Entfernen überschüssiger, nicht in Tüpfel festgehaltener Flüssigkeit aus der Schale zu ermöglichen.

44. Schale nach Anspruch 27, bei der die Tüpfel eine Gesamtmenge von 5 bis 100 ml fassen.

45. Sterile Inkubationsschale nach Anspruch 27, die ferner eine zu der Oberfläche der Schale benachbart angeordnete Abgießvertiefung aufweist, wobei die Vertiefung dazu ausgelegt ist, überschüssige, von der Oberfläche der Schale abgegossene Flüssigkeit aufzunehmen.

46. Sterile Inkubationsschale nach Anspruch 27, bei der zu der Schale ein "Aufgießbereich" (landing pad) gehört, der dazu ausgelegt ist, eine Probe vor deren Aliquotierung in die Tüpfel aufzunehmen.

47. Sterile Inkubationsschale nach Anspruch 46, bei der der "Aufgießbereich" (landing pad) einen Durchmesser von wenigstens 25,4 mm (ein Zoll) aufweist.

48. Sterile Inkubationsschale nach Anspruch 46, zu der ein Gießschnabel gehört.

49. Sterile Inkubationsschale nach Anspruch 48, zu der ferner ein Deckel gehört, der einen Schlitz aufweist, der geeignet ist, mit dem Gießschnabel zusammenzuwirken, um das Abgießen überschüssiger Flüssigkeit aus der Inkubationsschale zu ermöglichen.

50. Sterile Inkubationsschale nach Anspruch 46, die ferner eine der Oberfläche der Schale benachbarte Abgießvertiefung aufweist, wobei die Vertiefung dazu ausgelegt ist, überschüssige, von der Oberfläche der Schale abgegossene Flüssigkeit aufzunehmen.

51. Sterile Inkubationsschale nach Anspruch 50, wobei sich ferner in der Abgießvertiefung ein saugfähiges Material befindet.

52. Inkubationsschale zur Messung der Menge eines biologischen Materials, wobei zu der Inkubationsschale gehören:

eine im wesentlichen ebene, horizontale Oberfläche;

ein Staurand längs des Umfangs der Oberfläche; und

eine Anzahl von wenigstens zwanzig auf der Oberfläche gebildeter vertiefter Tüpfel, von denen jeder dafür ausgelegt ist, ein Aliquot der Flüssigkeit zu fassen, und die derart dimensioniert und gestaltet sowie aus einem geeigneten Material hergestellt sind, dass Flüssigkeit in die Tüpfel gelangen kann, und das Aliquot von Flüssigkeit in jeder der Tüpfel aufgrund von Oberflächenspannung gehalten wird, ohne dass es zu einer Querkontamination zwischen den Aliquoten der Flüssigkeit kommt,

wobei die Inkubationsschale keinerlei positiven Antwort liefert, wenn das besagte biologische Material in einer in die Schale eingebrachten Probe für das biologische Material fehlt.