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DE69610879T2 - Ein schneller mikrobiologischer test zum nachweis antibakterieller verbindungen - Google Patents

Ein schneller mikrobiologischer test zum nachweis antibakterieller verbindungen

Info

Publication number
DE69610879T2
DE69610879T2 DE69610879T DE69610879T DE69610879T2 DE 69610879 T2 DE69610879 T2 DE 69610879T2 DE 69610879 T DE69610879 T DE 69610879T DE 69610879 T DE69610879 T DE 69610879T DE 69610879 T2 DE69610879 T2 DE 69610879T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
test
agar medium
growth
sample
organism
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Revoked
Application number
DE69610879T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69610879D1 (de
Inventor
Robert Beukers
Wilhelmus Bommele
Cornelis Langeveld
Jacobus Stark
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
DSM IP Assets BV
Original Assignee
DSM NV
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Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=8219988&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=DE69610879(T2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by DSM NV filed Critical DSM NV
Publication of DE69610879D1 publication Critical patent/DE69610879D1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE69610879T2 publication Critical patent/DE69610879T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Revoked legal-status Critical Current

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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/18Testing for antimicrobial activity of a material

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  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)

Description

    GEBIET DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung bezieht sich auf ein neues mikrobiologisches Testverfahren zur Schnellbestimmung der An- oder Abwesenheit von antibakteriellen Verbindungen in Flüssigkeiten, wie Milch, Fleischsaft, Serum und Urin. Die Erfindung betrifft auch eine Einheit zum Nachweis von Rückständen antibakterieller Verbindungen in flüssigen Proben und die Verwendung der Einheit.
  • BESCHREIBUNG DES STANDES DER TECHNIK
  • Mikrobiologische Testverfahren zum Bestimmen von antibakteriellen Verbindungen, insbesondere von Rückständen, von Antibiotika und Chemotherapeutika, wie Sulfaverbindungen, in flüssigen Proben, zum Beispiel in Milch, Fleischsaft, Serum und Urin, sind seit langem bekannt. Beispiele für solche Tests sind in den Druckschriften GB-A-1467439, EP 0005891, DE 36 13 794, CA 2056581 und EP 0285792 beschrieben. Alle diese Beschreibungen befassen sich mit gebrauchsfertigen Tests, die einen Testorganismus benutzen und im allgemeinen innerhalb 2% bis 4% Stunden ein Ergebnis liefern, und zwar durch die Farbänderung eines Säure-Base- oder Redoxindikators, der dem Testsystem zugegeben wird. Das Prinzip besteht darin, daß dann, wenn eine antibakterielle Verbindung in der Probe in einer Konzentration vorliegt, die ausreicht, um das Wachstum des Testorganismus zu hemmen, die Farbe des Indikators gleich bleibt, während dann, wenn keine Hemmung stattfindet, das Wachstum des Testorganismus von der Bildung einer Säure oder von reduzierten Metaboliten begleitet ist, welche die Farbe des Indikators ändern.
  • Die erwähnten bekannten Testeinheiten können ein Agarmedium beinhalten, das mit einem geeigneten Testorganismus, vorzugsweise mit einem Bacillus- oder Streptococcus-Stamm, und einem Säure-Base- oder einem Redox-Indikator inokuliert wurde. Der geeignete Testorganismus und der Indikator werden in eine gegebenenfalls gepufferte Agarlösung eingegeben. Gegebenenfalls werden der Lösung Nährstoffe und Stoffe zur Änderung der Empfindlichkeit gegenüber gewissen antimikrobiellen Verbindungen in positiver oder negativer Richtung zugegeben. Schließlich läßt man die Agarlösung sich verfestigen, und zwar in einer solchen Weise, daß die Testorganismen am Leben bleiben, sich aber aus Mangel an Nährstoffen und/oder wegen der niedrigen Temperatur nicht vermehren. Gegebenenfalls können dem Agarmedium Verbindungen zugegeben werden, z. B. die Nährstoffe oder der bzw. die Indikatoren als gesonderte Quelle, beispielsweise als Tablette oder Papierscheibe.
  • Eine bevorzugte Streptococcus-Art für den Einsatz in üblichen mikrobiologischen Tests auf antibakterielle Verbindungen ist Streptococcus thermophilus. Eine bevorzugte Bacillus-Art zu Verwendungen in solchen Tests ist Bacillus stearothermophilus. Diese Arten können für diesen Zweck in Form von Sporen eingesetzt werden.
  • In den meisten Veröffentlichungen, die mikrobiologische Tests für antibakterielle Verbindungen betreffen, wird eine sehr breite Konzentration des Testorganismus von 10&sup5; bis 10&sup8;-10&sup9; koloniebildenden Einheiten (CFU) pro ml erwähnt. Beispiele für solche Veröffentlichungen sind die GB-A-1467439, EP 000581, EP 0611001, DE 34 29 823, US 3941658, US 4946777 und EP 0285792. Jedoch beinhaltet keine dieser Veröffentlichungen ein Beispiel, in dem eine Konzentration des Testorganismus von über 10&sup7; CFU/ml angegeben ist. Dies spiegelt die Tatsache wieder, daß in der Praxis mikrobiologische Tests auf antibakterielle Verbindungen bisher routinemäßig mit einer Konzentration des Testorganismus von unter 10&sup7; CFU/ml durchgeführt wurden. In der CA 2056581 (Seite 11, Zeile 27) ist speziell aufgeführt, daß die Konzentration des Testorganismus - in diesem besonderen Fall die Konzentration der Sporen von Bacillus stearothermophilus - variieren kann, aber nie eine Konzentration von 10&sup7; CFU pro ml Agarmedium übersteigt.
  • Die EP-A-0702087, bei der es sich um eine Veröffentlichung gemäß Art. 54(3) und (4) EPU handelt, beschreibt den Einsatz von 5 · 10&sup6; bis 2 · 10&sup7; Sporen pro ml Testmedium.
  • Somit war es bisher allgemein üblich, daß die Konzentration eines Testorganismus von 10&sup7; CFU pro ml die Maximalkonzentration darstellte, die bei der Art von mikrobiologischen Test benutzt werden konnte, welche in dieser Veröffentlichung beschrieben sind.
  • Bis jetzt war man allgemein der Meinung, daß die Verwendung einer höheren Mikroorganismen-Konzentration in einem solchen Test zu einem Empfindlichkeitsverlust bezüglich relevanter antibakterieller Verbindungen führen würde.
  • Natürlich sollte ein geeigneter Schnelltest auf antibakterielle Verbindungen unter anderem die folgende Anforderung erfüllen:
  • - Eine hohe Empfindlichkeit für einen breiten Bereich von antibakteriellen Verbindungen, die in der Praxis eingesetzt werden.
  • Ein Test mit einer Bakterienkonzentration von 10&sup6; bis 10&sup7; CFU pro ml liefert im allgemeinen in 2¹/&sub4; bis 4¹/&sub2; Stunden oder sogar nach einer längeren Zeit ein Ergebnis. Obwohl manchmal eine Testdauer von mindestens 1¹/&sub4; Stunde erwähnt ist (z. B. in den Druckschriften EP 000581, GB-A-1467439, US 3941658, US 4946777), wurde ein solcher Test nie in einem Beispiel oder sonst wo gezeigt.
  • Bis jetzt wurde es nicht für möglich gehalten, einen mikrobiologischen Test auf antibakterielle Verbindungen mit einer Testdauer von weniger als 2¹/&sub2; Stunden unter Einsatz einer Konzentration des Testorganismus von über 10&sup7; pro ml durchzuführen, wobei auch eine gute Empfindlichkeit für einen breiten Bereich von antibakteriellen Verbindungen beibehalten wird. Die vorliegende Beschreibung lehrt nun, daß entgegen der Erwartung solche mikrobiologischen Tests möglich sind.
  • BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Gemäß einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis einer oder mehrerer antibakteriellen Verbindungen in einer flüssigen Probe, wie Milch, Fleischsaft, Serum oder Urin, zur Verfügung, das folgende Stufen umfaßt:
  • (i) Kontaktieren der genannten Probe mit einem Testorganismus, der aus thermophilen Stämmen des Bacillus stearothermophilus ausgewählt ist, wobei vor Zugabe dieser Probe eine Substanz zugeführt wird, welche die Empfindlichkeit des Testmikroorganismus gegenüber Sulfaverbindungen verbessert, wobei ein Wachstum des genannten Testmikroorganismus verhindert wird,
  • (ii) Einstellen von Bedingungen für den genannten Testmikroorganismus, wobei in Abwesenheit von antibakteriellen Verbindungen ein Wachstum des genannten Testorganismus eintreten und nachgewiesen werden kann, und
  • (iii) Nachweisen des Wachstums des genannten Testorganismus nach einer Zeit, welche für den Nachweis des Wachstums des Testmikroorganismus in Abwesenheit von antibakteriellen Verbindungen ausreicht, wobei aber während dieses Zeitraums eine nachweisbare Hemmung des Wachstums des Testmikroorganismus durch eine bekannte Menge einer antibakteriellen Verbindung in einer Testprobe aufrechterhalten wird, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Testorganismus in einer Menge von über 2 · 10&sup7; CFU/ml vorliegt.
  • Ein solches Testverfahren ermöglicht eine deutliche Verkürzung der Testdauer, verglichen mit üblichen mikrobiologischen Tests auf antibakterielle Verbindungen. Während übliche mikrobiologische Tests auf antibakterielle Verbindungen ein Ergebnis im allgemeinen nach 2¹/&sub4; bis 4¹/&sub2; Stunden liefern, ist dies bei einem in der vorliegenden Schrift beschriebenen Verfahren nach weniger als 2% Stunden, z. B. nach 70 Minuten oder möglicherweise nach weniger als 60 Minuten oder weniger, möglich. Dies ist für den Anwender von äußerster Wichtigkeit, weil dann die Qualität der Probenflüssigkeit schneller bekannt ist, was eine frühere Lieferung oder Verarbeitung erlaubt.
  • Darüber hinaus kann durch Anwenden eines mikrobiologischen Tests gemäß der Erfindung mit einer Konzentration des Testorganismus von mehr als 2 · 10&sup7; CFU pro ml ein Ergebnis in weniger als 150 Minuten ohne Empfindlichkeitsverlust erhalten werden. Somit hat es sich als möglich herausgestellt, einen mikrobiologischen Test gemäß der Erfindung anzuwenden, um nach deutlich weniger als 2³/&sub4; Stunden, z. B. nach nur 70 Minuten, Penicillin G mit 0,003 IU/ml in einer Milchprobe nachzuweisen (siehe Beispiele).
  • Der in dem Test vorliegende Testorganismus wird unter solchen Bedingungen aufbewahrt, daß er sogar noch nach einem Zeitraum von mindestens einem Jahr aktiviert wird, wenn man ihn mit der Testprobe in Kontakt bringt.
  • Der Testorganismus kann in dispergierter Form in einem verfestigten Medium, z. B. in einem verfestigten Agarmedium, aufbewahrt werden.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform wird der Testorganismus in konzentrierter Form, z. B. in getrockneter Form, aufbewahrt. Für den Fall, daß der Mikroorganismus in einem verfestigten Medium dispergiert ist, wird die Menge oder Anwesenheit des Mikroorganismus als CFU des Mikroorganismus pro ml des genannten Mediums (CFU/ml) definiert. Für den Fall, daß der Mikroorganismus in anderen Formen (z. B. in gefriergetrockneter Form) vorliegt, wird die Menge oder die Anwesenheit des Mikroorganismus in CFU des Mikroorganismus pro ml Testprobe (z. B. Milch), die während des Nachweisverfahrens zugegeben wurde (CFU/ml), definiert.
  • Antibakterielle Verbindungen, die gemäß der vorliegenden Erfindung nachgewiesen werden können, sind Antibiotika und Chemotherapeutika, wie Sulfaverbindungen. Ein Testverfahren gemäß der Erfindung kann für den Nachweis von antibakteriellen Verbindungen in einem weiten Bereich von flüssigen Proben eingesetzt werden, z. B. für Milch, Milchprodukte, Fleischsäfte, Serum, Urin, Eier, Honig, Wasser und Fleisch-, Eier- oder Honigextrakten.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine Testeinheit zum Ausführen eines Verfahrens entsprechend der Erfindung zur Verfügung, wobei die Einheit einen Behälter aufweist, der ein verfestigtes Agarmedium enthält, in dem ein Testorganismus, der aus thermophilen Bacillus-Stämmen ausgewählt ist, in einer Menge von über 2 · 10&sup7; CFU/ml dispersiert ist, wobei das Agarmedium gegebenenfalls zusätzlich Nährstoffe für das Wachstum des genannten Testorganismus und/oder eine oder mehrere Komponenten für den Nachweis des erwähnten Wachstums enthält. Beispiele für Behälter, die für den Zweck der Erfindung nützlich sind, sind Röhrchen oder Blocks mit röhrenförmigen Vertiefungen, z. B. durchsichtige Röhrchen, einzeln oder in einem Satz oder miteinander verbunden in Form eines Blocks aus einem durchsichtigen Material mit einer Anzahl von darin ausgebildeten Löchern, z. B. Mikrotiterplatten.
  • Das Agarmedium in einer solchen Einheit kann ein gegebenenfalls gepuffertes Agarmedium sein, dem ein Testorganismus, eine Nährstoffquelle mit ausreichenden Nährstoffen zur Unterstützung des Wachstums des Testorganismus, ein Säure-Base-Indikator oder ein oder mehrere Redox-Indikatoren und gegebenenfalls Stoffe zur Änderung der Empfindlichkeit gegenüber gewissen antimikrobiellen Verbindungen in einer positiven oder einer negativen Richtung zugegeben werden. Alle Testkomponenten können in die anfängliche Agarlösung eingearbeitet werden, die für die Herstellung der Testeinheit benutzt wird, oder es können mindestens einige dem Agarmedium getrennt zugefügt werden.
  • Somit kann gegebenenfalls mindestens ein Teil der Nährstoffe nachträglich dem Agarmedium in der Testeinheit aus einer gesondert benutzten Quelle zugeführt werden, z. B. einer Tablette oder einer Papierscheibe, die vor der Ausführung des Tests auf dem Agarmedium angeordnet wird. Auch kann mindestens eine Indikatorkomponente dem Agarmedium getrennt zugegeben werden, z. B. durch einschließen in eine getrennte Nährstoffquelle. Auch ein Puffer und der Testorganismus können als gesonderte Quelle bereitgestellt werden. Die Nährstoffquelle und/oder eine oder mehrere Indikatorkomponenten, z. B. Redox-Indikatoren, können der Testprobe zugefügt werden.
  • Wenn Nährstoffe und/oder der Indikator oder die Indikatoren und/oder der Testorganismus dem Agarmedium oder der Testprobe aus einer gesonderten Quelle, z. B. einer Tablette, zugegeben werden, ergreift man vorzugsweise Maßnahmen zur Vermeidung eines Feuchtigkeitstransports aus dem Agarmedium in die Quelle des benutzten Additives. Wenn zu diesem Zweck eine Tablette verwendet wird, kann dies durch Beschichten der Tablette mit einer feuchtigkeitsbeständigen Schicht, z. B. mit einem Wachs, geschehen, wobei die Beschichtung während des Testverfahrens abgebaut werden oder schmelzen muß. Ein Wachs mit einer Schmelztemperatur von 35 bis 55ºC, vorzugsweise von 40 bis 45ºC, ist geeignet.
  • Die Nährstoffe werden zugegeben, um die Vermehrung des Testorganismus in Abwesenheit antibakterieller Verbindungen zu ermöglichen. Geeignete Nährstoffe sind z. B. assimilierbare Kohlenstoffquellen (z. B. Lactose, Glucose oder Dextrose), assimilierbare Stickstoffquellen (z. B. Pepton) sowie Quellen von Wachstumsfaktoren und Mineralien (z. B. Hefeextrakt).
  • Das Wachstum des Testorganismus kann durch eine Farbänderung des Agarmediums oder der Testprobe aufgrund der Anwesenheit eines Säure-Base-Indikators oder eines Redox-Indikators festgestellt werden.
  • Wenn der verwendete Indicator ein Säure-Base-Indikator ist, eignet sich ein Indikator für einen pH-Wert von etwa 5,5, vorzugsweise Bromkresolpurpur oder Phenolrot. Jedoch können ebenso auch andere Säure-Base-Indikatoren benutzt werden.
  • Wenn es erwünscht ist, einen Redox-Indikator oder eine Kombination aus zwei oder mehr Redox-Indikatoren anzuwenden, sind geeignete Indikatoren z. B. Brillantschwarz, Methylenblau, Toluidinblau, Nilblau A, 2,3,5-Triphenyltetrazolium, Safranin O, Indigocarmin, Thionin, Gallocyanin, Brillantcrocein MOO, Säuregelb 38, Säureorange 51, Säureblau 120, Basischblau 3, Azur A, Azur B, Kongorot, 1-10 Phenanthrolin, Janusgrün B, Brillantkresylblau. Andere Redox-Indikatoren (Redox-Mediatoren, Redox-Katalysatoren und Elektronenträger) können ebenso verwendet werden. Bevorzugte Redox-Indikatoren sind Brillantschwarz, Methylenblau, Toluidinblau und Nilblau A oder Kombinationen hiervon, z. B. eine Kombination aus Brillantschwarz und Toluidinblau.
  • Bacillus stearothermophilus kann alternativ eingesetzt werden. In einem Verfahren gemäß der Erfindung ist die Verwendung von Bacillus stearothermophilus var. calidolactis C953 besonders bevorzugt. Der Stamm C953 von Bacillus stearothermophilus var. calidolactis wurde 1974 beim Mikrobiologielabor der Technischen Universität Delft unter der Zugangs-Nr. LMD 74.1 und 1983 beim Centraal Bureau voor Schimmelcultures (CBS), Baarn, unter der Zugangs-Nr. CBS 760.83 hinterlegt, wo der Stamm der Öffentlichkeit zugänglich ist.
  • Der Bacillus stearothermophilus var. calidolactis C953 ist gegenüber antibakteriellen Verbindungen, insbesondere gegenüber Antibiotika, wie Penicillinen und Chemotherapeutika, z. B. Sulfaverbindungen, sehr empfindlich. Diese Mikroorganismen sind schnellwachsende Organismen und haben den zusätzlichen Vorteil, daß ihre optimale Wachstumstemperatur hoch ist (Bacillus stearothermophilus: zwischen 50 und 70ºC). Das macht diese Mikroorganismen für einen Test gemäß der Erfindung sehr geeignet, da sie bei der Aufbewahrungstemperatur (z. B. bei Raumtemperatur) nicht wachsen können und es kaum eine Möglichkeit gibt, daß Organismen, die möglicherweise in der Testflüssigkeit vorliegen oder in anderer Weise in das Testsystem geraten sind, das Testergebnis beeinträchtigen.
  • Wenn der Testorganismus ein Bacillus-Stamm ist, wird er vorzugsweise in das Agarmedium in Form einer Sporensuspension eingeführt, die nach bekannten Methoden (siehe z. B. GB-A-1467439) hergestellt und vor der Verfestigung in das Agarmedium eingebracht wird. Wie oben angegeben ist, kann alternativ der Testorganismus als gesonderte Quelle zugegeben werden, z. B. durch Aufbringen einer Tablette oder einer Papierscheibe auf das Agarmedium.
  • Wenn der Testorganismus in konzentrierter Form (z. B. in gefriergetrockneter Form, als Tablette, als Papierscheibe, usw.) vorliegt, wird das Konzentrat in einen Behälter hinein abgemessen, der eine übliche Ampulle, ein versiegelbares Teströhrchen, ein Probenkolben, ein Loch eines Blocks, z. B. eine Mikrotiterplatte, oder ähnliches sein kann (z. B. EP-0285792).
  • Die Konzentration des Testorganismus in dem Agarmedium beträgt zweckmäßigerweise über 2 · 10&sup7; CFU/ml, übersteigt aber vorzugsweise nicht 10¹&sup0; CFU/ml. Beispielsweise kann eine Konzentration des Testorganismus zwischen über. 2 · 10&sup7; und 10&sup9; CFU/ml, insbesondere von über 2 · 10&sup7; bis 3 · 10&sup8; CFU/ml, angewandt werden. Am meisten bevorzugt ist es, daß die Konzentration des Testorganismus in dem Agarmedium zwischen 3 · 10&sup7; und 2 · 10&sup8; CFU/ml liegt.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Empfindlichkeit des Testorganismus einstellbar. Die Empfindlichkeit kann durch verschiedene Mittel geändert werden, z. B. durch Zugabe bestimmter Stoffe, durch Ändern der Testbedingungen, wie des pH-Werts oder der Konzentration von Puffersubstanzen oder des Agars oder durch Verändern des Volumenverhältnisses von Agar und Testflüssigkeit.
  • Beispiel für Stoffe, die dem Testsystem zugefügt werden können, um die Empfindlichkeit zu verändern, sind Nucleoside, wie Adenoside, und Antifolate, wie Trimethoprim, Ormethoprim und Tetroxoprim, welche die Empfindlichkeit des Testorganismus gegenüber Sulfaverbindungen verbessern. Salze der Oxalsäure oder der Fluorwasserstoffsäure können zugefügt werden, um die Empfindlichkeit gegenüber Tetracyclinen zu erhöhen. Cystein kann zugegeben werden, um die Empfindlichkeit gegenüber Penicillinen zu vermindern.
  • Nachfolgend wird die Erfindung im einzelnen für einen Test erläutert, der mit dem Agarmedium durchgeführt wird. Jedoch ist es für einen Fachmann selbstverständlich, daß diese Lehre auch für Tests ohne ein Agarmedium gilt.
  • Wie oben angegeben, können die notwendigen oder gegebenenfalls wünschenswerten Komponenten in dem Agarmedium, einschließlich eventueller Stoffe zur Änderung der Empfindlichkeit gegenüber gewissen antibakteriellen Verbindungen, einer gegebenenfalls gepufferten Agarlösung zugegeben werden. Man läßt die Agarlösung in den Testeinheiten sich verfestigen, um das Agarmedium in einer solchen Weise auszubilden, daß der Testorganismus am Leben bleibt, sich aber aus Mangel an Nährstoffen und/oder wegen der niedrigen Temperatur nicht vermehren kann. Die notwendigen Komponenten, die vor der Verfestigung der Agarlösung nicht zugegeben worden sind, müssen aus einer gesonderten Quelle zugefügt werden, beispielsweise mittels einer Tablette oder einer Papierscheibe.
  • Notwendige Komponenten sind der Testorganismus, ein oder mehrere Indikatoren und die Nährstoffe. Andere Verbindungen, z. B. Stoffe zum Erhöhen oder Erniedrigen der Empfindlichkeit gegenüber bestimmten antibakteriellen Verbindungen sowie Pufferlösungen, sind fakultativ.
  • Es ist bevorzugt, das erfindungsgemäße Verfahren in einer solchen Weise durchzuführen, daß der Testorganismus in Gegenwart einer bekannten minimalen Menge einer nachzuweisenden antibakteriellen Verbindung in dem Agarmedium nicht wächst oder sich vermehrt. Auch die Testeinheiten, z. B. die das Agarmedium enthaltenden Teströhrchen, müssen in einer solchen Weise gelagert werden, daß sich der Testorganismus in dem Agarmedium nicht vermehrt. Dies wird im allgemeinen dadurch erreicht, daß man dem Organismus die Nährstoffe entzieht, bis der Test ausgeführt wird, oder durch Halten der Kultur (während des Herstellungsverfahrens) und der Testeinheiten (während der Lagerung) auf einer ausreichend niedrigen Temperatur, vorzugsweise auf 4 bis 30ºC, insbesondere auf 4 bis 15ºC, oder durch beide Maßnahmen.
  • Die Testeinheiten befinden sich während der Aufbewahrung vorzugsweise unter Luftabschluß, wodurch sie mindestens für mehrere Monate gelagert werden können.
  • Das gegebenenfalls gepufferte Agarmedium, das den Testorganismus und/oder den oder die Indikatoren und/oder die Nährstoffe und/oder bestimmte Stoffe zum Ändern der Testempfindlichkeit enthält, läßt man in aufrechtstehenden Testeinheiten, z. B. in Röhrchen, sich verfestigen.
  • Die Einheiten haben vorzugsweise vorgegebene Größen. Dies ist wegen der Zuverlässigkeit des Tests der Fall. Die Höhe des Agarmediums in den Testeinheiten ist von großer Bedeutung. Wenn in der Testprobe ein Antibiotikum vorliegt, diffundiert es in den Agar. Die Testempfindlichkeit wird deshalb vorzugsweise durch Verändern der Höhe des verfestigten Agars in der Testeinheit festgelegt.
  • Vorzugsweise wird die Höhe des Agarmediums in der Testeinheit in einer solchen Weise gewählt, daß der Indikator seine Farbe ändert, wenn die nachzuweisende antibakterielle Verbindung in einer Konzentration unterhalb eines gewissen Werts liegt, jedoch seine Farbe nicht ändert, wenn die Konzentration diesen Wert übersteigt. Vorzugsweise wird der Test als ein Test angewandt, aus dem entnommen werden kann, ob eine bestimmte Konzentration einer antibakteriellen Verbindung anwesend ist oder nicht. Zu diesem Zweck ist die Höhe der Testeinheit vorzugsweise hoch genug, um eine Menge an Agarmedium und Probe zu enthalten, die einer Höhe von 3-30 mm, insbesondere von 5-15 mm, entspricht. Die Abmessung des Innenquerschnitts der Testeinheiten liegt bei vorzugsweise 1-20 mm, insbesondere bei 1-14 mm.
  • Das Volumen des Agarmediums in der Testeinheit wird von der Höhe der Testeinheit, dem Innenquerschnitt der Testeinheit und dem Prozentsatz des Volumens der Testeinheit, die mit dem Agarmedium gefüllt ist, bestimmt. Das Volumen des Agarmediums beträgt vorzugsweise 10 ul-3 ml, insbesondere 15 ul-1 ml, besonders bevorzugt 20 ul-500 ul.
  • Ein geeignetes Volumen der flüssigen Testprobe beträgt beispielsweise 0,01-0,5 ml. Somit wurde beispielsweise gefunden, daß eine erfindungsgemäßen Testeinheit, die durch Verfestigen von 0,3 ml Agarlösung in einem aufrechtstehenden sterilen Teströhrchen mit einem Innendurchmesser von 9 mm gebildet worden ist, für den Nachweis von 0,003 IU/ml Penicillin G in einer Milchprobe geeignet ist.
  • Wenn Sporen von Bacillus stearothermophilus var. calidolactis verwendet werden, liegen geeignete Inkubationstemperaturen zwischen 55 und 70ºC, vorzugsweise zwischen 60 und 66ºC. Die Inkubation kann in irgend einer üblichen Form eines Inkubators, z. B. in einem Wasserbad, einem Blockerhitzer, einem Ofen oder einem Trockeninkubator, durchgeführt werden.
  • Wie oben angegeben, ist eine Inkubationszeit von weniger als 150 Minuten, z. B. von 70 Minuten, aber auch von nur 60 Minuten oder sogar 30 Minuten, möglich. Eine derartige Inkubationszeit ist deutlich kürzer als jene von anderen üblichen mikrobiologischen Testsystemen für antibakterielle Verbindungen mit einem Einsatz von weniger als 2 · 10&sup7; CFU/ml.
  • Ein erfindungsgemäßer Test ist sehr einfach ausführbar, so daß Personen, welche den Test durchführen, keine spezielle Ausbildung haben müssen. Das Ergebnis ist sehr einfach bestimmbar. Nach der Inkubationszeit zeigt die Farbe des den Indikator enthaltenden Agarmediums, ob ein Wachstum des Organismus stattfand oder nicht.
  • LEGENDE ZU DEN FIGUREN
  • Fig. 1 zeigt die Testdauer als Funktion der Sporenkonzentration für Testeinheiten des Typs A, wie sie im Beispiel IV eingesetzt wurden.
  • Fig. 2 zeigt die Testdauer als Funktion der Sporenkonzentration für Testeinheiten des Typs B, wie sie im Beispiel V eingesetzt wurden.
  • BEISPIEL I Herstellung von Teströhrchen des Typs A zum Nachweis von Antibiotika
  • Es wurden Teströhrchen des Typs A, die ein Agarmedium enthielten, wie folgt hergestellt:
  • Es wurde eine Lösung aus 12 g Agar, 9 g Natriumchlorid und 50 ml 0,1 m Triethanolaminpufferlösung (pH = 8,0) in 1000 ml destilliertem Wasser zubereitet. Es wurde auch eine solche Menge einer Lösung von Bromkresolpurpur zugegeben, daß eine Endkonzentration von 20 mg pro 1000 ml erreicht wurde. Die endgültige Lösung wurde 20 Minuten bei 121ºC sterilisiert und auf etwa 60ºC abgekühlt.
  • Zu dieser Lösung wurden verschiedene Mengen einer Suspension von Sporen des Bacillus stearothermophilus var. calidolactis C953 in destilliertem Wasser gegeben, so daß Endkonzentrationen zwischen 10&sup6; und 10¹&sup0; Sporen pro ml erhalten wurden.
  • Sterile Röhrchen mit einem Durchmesser von etwa 9 mm wurden mit 0,3 ml der Agarlösung unter aseptischen Bedingungen gefüllt und unmittelbar anschließend verschlossen, z. B. mit einer Aluminiumfolie. Man ließ die Agarlösung in den Teströhrchen sich verfestigen, während sich diese in aufrechter Position befanden.
  • Die Röhrchen wurden bei einer Temperatur zwischen 5 und 15ºC gelagert.
  • BEISPIEL II Herstellung von Teströhrchen des Typs B zum Nachweis von Antibiotika
  • Es wurden Teströhrchen des Typs B, die ein Agarmedium enthielten, wie folgt hergestellt:
  • Es wurde eine Lösung aus 10 g Agar, 9 g Natriumchlorid, 2 g Glucose, 2 g Pepton, 2 g Trypton, 4 g Hefeextrakt und 50 ml 0,1 m Triethanolaminpufferlösung (pH = 8,0) in 1000 ml destilliertem Wasser gebildet. Die endgültige Lösung wurde 20 Minuten bei 121ºC sterilisiert und auf etwa 60ºC abgekühlt.
  • Es wurde auch eine solche Menge einer Lösung von Brillantschwarz zugegeben, daß eine Endkonzentration von 80 mg pro 1000 ml erreicht wurde, und eine solche Menge einer Lösung von Toluidinblau zugefügt, daß sich eine Endkonzentration von 3 mg pro 1000 ml ergab.
  • Diese Lösung wurde mit verschiedenen Mengen einer Sporensuspension von Bacillus stearothermophilus var. calidolactis C953 in destilliertem Wasser versetzt, so daß Endkonzentrationen zwischen 106 und 1010 Sporen pro ml entstanden.
  • Sterile Röhrchen mit einem Durchmesser von etwa 9 mm wurden mit 0,3 ml der Agarlösung unter aseptischen Bedingungen gefüllt und unmittelbar darauf verschlossen, z. B. mit einer Aluminiumfolie. Man ließ die Agarlösung in den Teströhrchen sich verfestigen, während diese in einer aufrechten Stellung gehalten wurden. Die Röhrchen wurden bei einer Temperatur zwischen 5 und 15ºC gelagert.
  • BEISPIEL III Herstellung von Nährstofftabletten
  • Es wurde ein Gemisch aus 100 g Dextrose, 160 g Avicel PH101, 50 g Tryptose, 14 g Hefeextrakt und 15 g Precirol hergestellt. Dieses Gemisch reichte aus, um etwa 18.000 Tabletten mit einem Durchmesser von etwa 3 mm und eine Dicke von etwa 1,9 mm herzustellen.
  • BEISPIEL IV Durchführung des Tests Typ A
  • Es wurde jeweils eines der im Beispiel I beschriebenen Teströhrchen des Typs A mit verschiedenen Konzentrationen an Sporen des Bacillus stearothermophilus var. calidolactis durch Entfernen des Verschlusses geöffnet. Jedes der Teströhrchen wurde mit einer Nährstofftablette versehen, wie sie im Beispiel III beschrieben ist. Dann wurden in jedes der Teströhrchen 0,1 ml einer frischen Kuhmilch gegeben, und die Teströhrchen wurden sofort in ein Wasserbad gebracht, das auf 64ºC gehalten wurde.
  • Nach 30 Minuten bis 2 Stunden und 30 Minuten wurde eine Überprüfung durchgeführt. Es wurde die Zeit bestimmt, zu der die Farbe des Agarmediums gelb wurde. Wie in Fig. 1 dargestellt ist, korrelierte die Testdauer mit der Anzahl der dem Agarmedium zugegebenen Sporen.
  • Wenn zu dieser speziellen Zeit die Farbe des Agarmediums blau war, wußte man, daß die Probe eine nachweisbare Menge einer antibakteriellen Verbindung enthielt (z. B. 0,003 I.U. pro ml oder mehr Penicillin G). Fig. 1 zeigt, daß eine Verkürzung der Testdauer auf mindestens 60 Minuten realisierbar ist.
  • BEISPIEL V Durchführung des Tests Typ B
  • Es wurde das im Beispiel IV beschriebene Verfahren durchgeführt, mit der Ausnahme, daß Teströhrchen des Typs B benutzt wurden und keine Tablette dem Teströhrchen zugefügt wurde.
  • Fig. 2 zeigt, daß eine Verkürzung der Testdauer auf mindestens 70 Minuten realisierbar ist.
  • BEISPIEL VI Durchführung des Tests Typ B
  • Frische Kuhmilch wurde mit Penicillin G in einer Menge von 0,003 I.U. pro ml versetzt. Die Kontrollprobe enthielt kein Penicillin G.
  • Durch Entfernen des Verschlusses wurden jeweils zwei der Teströhrchen des Typs B mit Konzentrationen an Sporen des Bacillus stearothermophilus var. calidolactis, wie im Beispiel II beschrieben wurde, geöffnet. Dann wurden 0,1 ml von jeder der zwei Milchproben jedem der Teströhrchen zugesetzt und diese wurden sofort in ein Wasserbad gegeben, das auf 64ºC gehalten wurde.
  • Nach 30 Minuten bis 3 Stunden wurden Überprüfungen durchgeführt. Es wurde die Zeit bestimmt, bei der die Farbe des Agarmediums gelb wurde. Wie in der Tabelle I gezeigt wird, korrelierte die Testdauer mit der dem Agarmedium zugegebenen Sporenmenge, ohne die Testempfindlichkeit in negativer Weise zu beeinflussen.
  • Die Tabelle 1 zeigt eine abnehmende Testdauer bis herunter auf mindestens 70 Minuten. Selbst bei einer Testdauer von 70 Minuten kann eine Konzentration von 0,003 I.U. pro ml Penicillin G nachgewiesen werden. Selbstverständlich können auch höhere Konzentrationen von Penicillin G gefunden werden. Tabelle 1: Empfindlichkeit des Tests B bei verschiedenen Sporenkonzentrationen
  • BEISPIEL VII Nachweis von Antibiotika und Sulfaverbindungen in Mikrotiterplatten (Test Typ C)
  • Für die Herstellung der Testplatten (Test Typ C) wurde nach dem im Beispiel I beschriebenen Verfahren vorgegangen, mit der Ausnahme, daß die im Beispiel III beschriebenen Nährstoffe (Dextrose, Tryptose und Hefeextrakt) nicht getrennt zugegeben sondern dem anfänglichen Agarmedium in der gleichen Konzentration, wie sie im Beispiel I beschrieben ist, zugefügt wurden. Auch wurde zusammen mit der Pufferlösung eine solche Menge an Trimethoprimlösung zugefügt, daß eine Endkonzentration von 60 ug pro Liter erreicht wurde.
  • In die Vertiefungen von sterilen Mikrotiterplatten wurden unter aseptischen Bedingungen 20 ul der Agarlösung eingebracht. Die Platten wurden dann sofort mit einer Aluminiumfolie verschlossen.
  • Die Platten wurden bei einer Temperatur zwischen 5 und 15ºC gelagert.
  • Frische Kuhmilch wurde mit Penicillin G in einer Menge von 3 ppb versetzt. Auch wurde eine Milchprobe hergestellt, die eine Menge von 100 ppb Sulfadiazin enthielt.
  • Die Kontrollprobe enthält kein Penicillin G oder Sulfadiazin.
  • Die Mikrotiterplatten wurden durch Entfernen des Verschlusses geöffnet. Dann wurden 20 ul von jeder der drei Milchproben auf jede der Testplatten (duplo) gegeben, die verschiedene Sporenkonzentrationen von Bacillus stearothermophilus var. calidolactis C953 aufwiesen. Die Platten wurden sofort in ein Wasserbad gegeben, das auf 64ºC gehalten wurde.
  • Nach 30 Minuten bis 150 Minuten wurden Überprüfungen vorgenommen. Es wurde die Zeit bestimmt, bei der die Farbe des Agarmediums gelb wurde. Wie im Tabelle 2 gezeigt wird, korrelierte die Testdauer mit der dem Agarmedium zugegebene Sporenmenge, ohne die Testempfindlichkeit in negativer Weise zu beeinflussen.
  • Selbst bei einer Testdauer von 90 Minuten können Penicillin G und Sulfadiazin bei Konzentrationen von 3 ppb Penicillin G bzw. 100 ppb Sulfadiazin nachgewiesen werden. Penicillin G (3 ppb) kann sogar bei einer Testdauer von 80 Minuten aufgefunden werden.
  • Selbstverständlich können auch höhere Konzentrationen von sowohl Penicillin G als auch von Sulfadiazin nachgewiesen werden. Tabelle 2: Empfindlichkeit des Tests C bei verschiedenen Konzentrationen
  • VERGLEICHSBEISPIEL VIII Nachweis von Antibiotika in Milch (Test Typ D)
  • In diesem Versuch wurde für die Bestimmung von Antibiotika in Milch Streptococcus thermophilus T101 (DSM 4022) verwendet.
  • Streptococcus thermophilus T101 wurde unter Anwendung von an sich bekannten Methoden gezüchtet.
  • Frische Kuhmilch wurde mit einer solchen Menge einer Lösung von Bromkresolpurpur versetzt, daß eine Endkonzentration von 45 mg pro 1000 ml erreicht wurde.
  • Zu einem Teil der frischen Kuhmilch wurde auch Penicillin G in einer Menge von 4 ppb gegeben.
  • Die Kontrollprobe enthielt kein Penicillin G.
  • Zu den Milchproben wurden verschiedene Mengen von Streptococcus thermophilus T101 gegeben, so daß Endkonzentrationen zwischen 10&sup7; und 10&sup9; CFU pro ml erhalten wurden.
  • Unmittelbar nach dem Herstellen der Proben wurden sterile Röhrchen, die einen Durchmesser von etwa 9 mm aufwiesen, mit 0,3 ml jeder Milchprobe (duplo) gefüllt. Die Röhrchen wurden sofort in ein Wasserbad gegeben, das auf 42ºC gehalten wurde.
  • Nach 30 Minuten bis 2 Stunden und 30 Minuten wurden Überprüfungen durchgeführt.
  • Es wurde die Zeit bestimmt, zu der die Farbe des Agarmediums gelb wurde. Wie in Tabelle 3 gezeigt wird, korrelierte die Testdauer mit der der Milch zugegebenen Zellmenge, ohne die Testempfindlichkeit in negativer Weise zu beeinflussen.
  • Selbst nach einer Testdauer von 80 Minuten kann Penicillin G mit einer Konzentration von 4 ppb oder mehr nachgewiesen werden. Tabelle 3: Empfindlichkeit des Tests D bei verschiedenen Zellkonzentrationen

Claims (13)

1. Verfahren zum Nachweisen einer oder mehrerer antibakterieller Verbindungen in einer flüssigen Probe, mit den folgenden Stufen:
(i) Kontaktieren der genannten Probe mit einem Testorganismus, der aus einem thermophilen Stamm des Bacillus stearothermophilus ausgewählt ist, wobei vor der Zugabe dieser Probe eine Substanz zugeführt wird, welche die Empfindlichkeit des Testmikroorganismus gegenüber Sulfaverbindungen verbessert, wobei ein Wachstum des genannten Testorganismus verhindert wird;
(ii) Einstellen von Bedingungen für den genannten Testmikroorganismus, wobei in Abwesenheit von antibakteriellen Verbindungen ein Wachstum des genannten Testorganismus eintreten und nachgewiesen werden kann; und
(iii) Nachweisen des Wachstums des genannten Testmikroorganismus nach einer Zeit, welche für den Nachweis des Wachstums des Testmikroorganismus in Abwesenheit von antibakteriellen Verbindungen ausreicht, wobei aber während dieses Zeitraums eine nachweisbare Hemmung des Wachstums des Testmikroorganismus durch eine bekannte Menge einer antibakteriellen Verbindung in einer Testprobe aufrechterhalten wird,
wobei der genannte Testorganismus in einer Menge von über 2 · 10&sup7; koloniebildenden Einheiten (CFU/ml) vorliegt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Testmikroorganismus in einem verfestigten Medium, vorzugsweise in einem verfestigten Agarmedium, dispergiert ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Testmikroorganismus vor der Zugabe der Testprobe in einer konzentrierten Form, vorzugsweise in getrockneter Form, vorliegt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das für den Nachweis von Penicillin G bei 0,003 I.U. pro ml in weniger als 2,5 Stunden geeignet ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin vor der Zugabe der Probe der genannte Testmikroorganismus in dem erwähnten Agarmedium in einer Menge von über 2 · 10&sup7; bis 3 · 10&sup8; CFU/ml vorliegt oder für den Fall, daß der Testmikroorganismus in dem genannten Medium nicht vorhanden ist, der Testmikroorganismus nach der Zugabe der Probe in einer Menge von über 2 · 10&sup7; bis 3 · 10&sup8; CFU/ml der Probe vorliegt.
6. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Wachstum des genannten Testmikroorganismus durch eine Farbänderung des Agarmediums nachgewiesen wird, die aus der Anwesenheit eines Säure-Base- oder eines Redox-Indikators resultiert.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin der eingesetzte Testmikroorganismus Bacillus stearothermophilus var. calidolactis C953 ist.
8. Verfahren nach Anspruch 2, worin das Agarmedium aus einer Agarlösung gebildet worden ist, die ausreichende Nährstoffe enthält, um das Wachstum des genannten Testorganismus zu unterstützen.
9. Verfahren nach Anspruch 2, worin die Nährstoffquelle für den genannten Testorganismus oder ein Teil hiervon dem verfestigten Agarmedium zugegeben wird.
10. Verfahren nach Anspruch 2, worin das Agarmedium Trimethoprim, Ormethoprim oder Tetroxoprim enthält, um die Empfindlichkeit des Testorganismus gegenüber Sulfaverbindungen zu verbessern.
11. Verfahren nach Anspruch 2, worin 10 bis 3 ml Agarmedium eingesetzt werden.
12. Testeinheit zur Durchführung eines Verfahrens nach Anspruch 2, mit einem Behälter, der ein verfestigtes Agarmedium enthält, in dem ein Testorganismus, der aus einem thermophilen Stamm des Bacillus stearothermophilus 7 ausgewählt ist, in einer Menge von über 2 · 10&sup7; CFU/ml dispergiert ist, wobei das Agarmedium gegebenenfalls zusätzlich Nährstoffe für das Wachstum des genannten Testorganismus und/oder eine oder mehrere Komponenten für den Nachweis des erwähnten Wachstums enthält.
13. Testeinheit nach Anspruch 12, worin der genannte Behälter ein Röhrchen oder ein Block mit röhrenförmigen Vertiefungen ist.
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