DE69604775T2

DE69604775T2 - Genexpressionuntersuchung durch aufzeigen von cdna 3'-restriktionsfragmenten

Info

Publication number: DE69604775T2
Application number: DE69604775T
Authority: DE
Inventors: Yatindra Prashar; Sherman Weissman
Original assignee: Yale University
Current assignee: Yale University
Priority date: 1995-08-01
Filing date: 1996-07-30
Publication date: 2000-05-18
Anticipated expiration: 2016-07-31
Also published as: CA2201468A1; CA2201468C; IL120582A0; AU6763696A; ATE185844T1; EP0797685B1; DE69604775D1; AU692403B2; EP0797685A4; US6010850A; EP0955379A2; EP0955379A3; JPH10509329A; EP0797685A1; WO1997005286A1; US5712126A

Description

Die Identifizierung von Genen, die mit Entwicklung, Differenzierung, Krankheitszuständen und der Antwort auf die zelluläre Umgebung assoziiert sind, ist ein wichtiger Schritt zum fortgeschrittenen Verständnis dieser Phänomene. Insbesondere werden wirksame Verfahren zum Durchführen von genetischer Analyse benötigt, um die Gene zu identifizieren und isolieren, die in verschiedenen Zellen oder unter veränderten Zellumgebungen differenziell exprimiert werden.
Frühe Verfahren, die entwickelt worden sind, um solche Gene zu identifizieren und zu klonieren, beruhten hauptsächlich auf dem Prinzip differenzieller oder subtraktiver Hybridisierung [siehe Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2825 (1991); Nature 308: 149 (1984); Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 1609 (1987); und Mol. Cell Biol. 9: 1041 (1989)]. Trotz der Nützlichkeit dieser Verfahren können sie nur einen Bruchteil der gesamten Veränderungen hinsichtlich der Genexpression analysieren, erfordern große Mengen an Ribonukleinsäure (RNA) und sind langwierig und arbeitsintensiv.
Vor kurzem entwickelten Liang und Pardee [siehe Science 257: 967 (1992)] eine Technik auf Gelbasis, die eine schnelle und umfangreiche Analyse differenziell exprimierter Messenger- RNA (mRNAs) erleichtert. Kurz gesagt, richtete sich diese Technik auf die Identifizierung differenziell exprimierter Gene unter den näherungsweise 15.000 einzelnen mRNA-Spezies in ein paar Säugetier-Zellpopulationen und dann auf das Gewinnen ihrer komplementären Desoxyribonukleinsäure (cDNA) und genomischer Klone. Die allgemeine Strategie war, partielle, komplementäre cDNA-Sequenzen aus Teilmengen von mRNAs durch reverse Transkription und die Polymerase-Kettenreaktion zu amplifizieren. Diese kurzen Sequenzen wurden dann gewöhnlich auf einem Sequenziergel aufgezeigt. Bei dieser Technik wurden Paare von 10-mer-Primern so ausgewählt, daß jedes aus ungefähr 50 bis 100 mRNAs DNA amplifizieren würde, da diese Zahl bei dieser Technik zum Aufzeigen auf dem Gel optimal war [Science 257: 967 (1992); und siehe ebenso United States Patent 5,262,311, dessen Offenbarung in toto hierin einbezogen wird].
Mehrere Gruppen haben die Technik von Liang und Pardee erfolgreich angewendet, um differenziell exprimierte Gene zu identifizieren [siehe Trends Genet. 11: 242 (1995); Curr. Opinion Immunol. 7: 274 (1994); und Nucleic Acids Res. 19: 4009 (1994)]. Jedoch haben Beschränkungen, die mit dieser Technik assoziiert sind - Beschränkungen, wie etwa der Mangel an quantitativer Korrelation mit mRNA-Mengen, einem signifikanten Auftreten (bis zu 80%) falscher positiver Signale, variabler Reproduzierbarkeit der Aufzeigemuster, multiple Sequenzen, die im Gel wandern, um ein einziges Signal zu produzieren, und Unter- Repräsentierung und Redundanz von mRNA-Signalen [siehe Trends Genet. 11: 242 (1995); Nucleic Acid Res. 22: 5763 (1994); und FEBS Let. 351: 231 (1994)] - es schwierig gemacht, differenzielle Genexpression vollständig und korrekt zu evaluieren. Wichtiger, die Größe von Banden ist nicht immer aus der mRNA-Sequenz leicht vorhersagbar.
Amplifizierung von cDNAs bei der niedrigen Primer-Annealing-Temperatur von 40º bis 42ºC, einer nicht-stringenten PCR-Bedingung, wie bei der Technik von Liang und Pardee verwendet, wird jetzt als eine Hauptbeschränkung gegenwärtiger Gel-Aufzeigeprotokolle angesehen [siehe Trends Genet. II: 242 (1995); Biotechniques 18: 842 (1995); und Biochem. Biophy. Res. Commun. 199: 564 (1994)]. Über Anpassungen des ursprünglichen Protokolls ist berichtet worden, um einige dieser Beschränkungen zu überwinden, wie etwa die Verwendung von mit einer Base verankertem Oligo(dT)-Primer zur erhöhten Repräsentation von mRNA [siehe Nucl. Acid. Res. 22: 5763 (1994)] sowie die Verwendung von langen zusammengesetzten Primern, um reproduzierbare Muster unter stringenteren PCR-Bedingungen zu erreichen [siehe Nucl. Acid. Res. 2: 5763 (1994); und FEBS Let. 351: 231 (1994)]. Jedoch beinhalten alle diese Modifikationen fortwährend das Annealing von willkürlichen Primern bei näherungsweise 40º bis 42ºC zur cDNA-Amplifizierung bei den ersten wenigen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein alternativer Ansatz zum Aufzeigen von cDNA auf Gelen gegenüber denjenigen präsentiert, die von Liang und Pardee beschrieben sind, oder gegenüber denjenigen, die durch subtraktive oder differenzielle Hybridisierungtechniken beschrieben sind. Aufzeigemuster werden erzeugt, wenn Restriktionsenzym-verdaute, doppelsträngige (ds) cDNA an einen Adapter ligiert wird, der selektive PCR-Amplifizierung von 3'- End-Fragmenten von cDNAs unter PCR-Bedingungen hoher Stringenz vermittelt, anstelle von nicht-stringenter, willkürlicher cDNA-Amplifizierung, wie von Liang und Pardee gelehrt.
Bei der vorliegenden Erfindung wird eine Diversität an Mustern erzeugt durch die Auswahl verschiedener Gruppen von Restriktionsenzymen und verankerten Oligo(dT)-Primern. Da alle cDNAs in einer Probe einen gemeinsamen Absatz erhalten (ein "Absatz" ist eine DNA- Sequenz, die in der DNA, welche synthetisiert wird, nicht präsentiert wird) aus dem Oligo(dT)-Primer während der Synthese, können die meisten cDNA-Moleküle in einer Untergruppe (bestimmt durch die Anker-Nukleotide des Oligo(dT) durch Auswahl einer Kombination von Restriktionsenzymen aufgezeigt werden, während gleichzeitig Unter- Repräsentierung oder Redundanz-Repräsentierung von mRNAs minimiert wird. Dieser Ansatz stellt nahezu quantitative Information über die Niveaus der Genexpression bereit, kann versteckte Unterschiede in dem Aufzeigegel auflösen, produziert eine einzelne Bande für jede mRNA-Spezies und produziert Banden vorhersagbarer Größe für bekannte Gensequenzen. Am wichtigsten, das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung produziert konsistent reproduzierbare Aufzeigemuster.
Entsprechend ist der Aspekt der vorliegenden Erfindung, ein Assay-Verfahren zu beschreiben, das, im Vergleich mit gegenwärtig verwendeten Verfahren für solche Assays, eine Abnahme an falsch-positiven Signalen erreicht; eine reproduzierbare Technik zum Identifizieren und Aufzeigen von Gelmustern von DNA bereitstellt; ein Mittel zum Unterscheiden von multiplen Sequenzsignalen für Sequenzen bereitstellt, die zu einer einzelnen Bande bei herkömmlichen Techniken ko-migrieren; Unter-Repräsentierung und Redundanz von RNA vermeidet; und stringente Bedingungen für PCR-Annealing verwendet.
Dieser und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden durch Bezugnahme auf die folgenden Figuren, Beispiele und Beschreibung der Erfindung klar verstanden werden.

Hinsichtlich der Figuren

ist Fig. 1 eine schematische Darlegung des Verfahrens für 3'-End-cDNA-Amplifizierung gemäß der vorliegenden Erfindung;
ist Fig. 2 ein Photomikrograph, das die Vorhersagbarkeit der Bandengröße bekannter cDNAs auf dem Aufzeigegel gemäß der vorliegenden Erfindung demonstriert;
ist Fig. 3 ein Photomikrograph, das die Reproduzierbarkeitsmuster und ihre Diversität demonstriert, die durch verschiedene Restriktionsenzyme und Anker bei Oligo(dT)-Primern mit Absatz gemäß der vorliegenden Erfindung erzeugt wird;
ist Fig. 4 ein Photomikrograph, das eine Verifizierung von Unterschieden aus einem Aufzeigegel durch RT-PCR einer ursprünglichen Gesamt-RNA-Probe gemäß der vorliegenden Erfindung demonstriert;
ist Fig. 5 ein Photomikrograph, das den Nutzen zeigt, wenn man eine geringe Menge cDNA zum Aufzeigen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet;
ist Fig. 6 ein Photomikrograph, das das Aufzeigen zeigt, das aus cDNA-Expressionsmustern in einer sehr kleinen Zahl Stammzellen gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten wird;
ist Fig. 7 ein Photomikrograph, das die Veränderungen in Genexpressionsmustern, die bei alternden IMR-90-Zellen zeigt und das Restriktionsenzym BglII gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet;
ist Fig. 8 ein Photomikrograph, das das Aufzeigen zeigt, das aus cDNA-Expressionsmustern aus menschlichen Osteoblasten erhalten wird, die mit und ohne Östrogen gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt worden sind;
ist Fig. 9 ein Photomikrograph, das die Veränderungen in Genexpressionsmustern zeigt, die bei alternden IMR-90-Zellen und unter Verwendung des Restriktionsenzyms PstI gemäß der vorliegenden Erfindung gefunden werden;
ist Fig. 10 ein Photomikrograph, das das Aufzeigen von cDNA-Expressionsmustern von Jurkat T-Zellen nach Transfektion mit dem HOX11-Gen gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt.
Interessanterweise wurde während des Machens der vorliegenden Erfindung RNA-Expression während der frühen T-Zell-Aktivierung, einem weitgehend studierten Phänomen, das mit der Induktion einer Vielzahl von Genen innerhalb einer relativ kurzen Zeitperiode verbunden ist [siehe Annu. Rev. Immunol. 8: 421 (1990); und Curr. Opinion Immunol. 7: 327 (1995)] als das Testsystem studiert. Interessanterweise gibt es eine beschränkte Beschreibung von Genen, die nach der T-Zell-Aktivierung herrunterreguliert werden [siehe Nucleic Acids Res. 19: 4655 (1991); und Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10260 (1993)], und der vorliegende Ansatz bot ein angenehmes Verfahren zum Suchen nach solchen Produkten an.
Ein Schema zum 3'-End-Restriktionsfragment-Aufzeigen von cDNAs gemäß der vorliegenden Erfindung kann durch einen allgemeinen 5-Schritt- oder, genauer, 7-Schritt-Prozess beschrieben werden.
Bei dem allgemeinen 5-Schritt-Schema für das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung beinhaltet Schritt 1 die Verwendung eines mit zwei Basen verankerten Oligo(dT)-Primers mit einem Absatz für die Synthese eines ersten Stranges cDNA aus Gesamt-RNA unter Verwendung von reverser Transkriptase. Bei diesem Schritt werden alle Reagenzien der Reaktion außer der reversen Transkriptase vermischt, mit Mineralöl überschichtet und bei 65ºC für 7 Minuten erhitzt, um das Öffnen von allen Sekundärstrukturen zu ermöglichen, die sich in der mRNA gebildet haben. Danach wird die Temperatur auf 50ºC für 7 Minuten verringert, um es dem verankerten Oligo(dT)-Primer zu ermöglichen, mit den mRNAs zu annealen. An diesem Punkt werden 2 ul Superscript II reverse Transkriptase (Gibco BRL) der Reaktionsmischung hinzugefügt, durch Pipettieren vermischt, und die Reaktion wird bei 50ºC für 1 Stunde durchgeführt.
Im zweiten Schritt wird die Reaktionsmischung aus dem vorherigen Schritt als das Substrat für die Synthese eines zweiten Stranges cDNA durch die Gubler-Hoffman-Methode bei 16ºC für 2 Stunden verwendet. Alle so synthetisierten cDNA-Moleküle erhalten einen gemeinsamen 3'-Absatz, wie in Fig. 1 gezeigt. Synthetisierte doppelsträngige cDNAs werden durch Phenol-Chloroform-Extraktion der Reaktionsmischung gewonnen, mit Ammoniumacetat und Ethylalkohol gefällt und in Wasser aufgelöst. Beim dritten Schritt werden cDNAs aus Schritt 2 mit einem Restriktionsenzym verdaut.
In dem vierten Schritt werden die Restriktionsenzym-verdauten cDNAs an einen "Y"- geformten Adapter ligiert, wie in Fig. 1 gezeigt. Dieser Adapter hat einen Überhang an seinem 3'-Ende zur Ligation, und an dem 5'-Ende hat er einen Bereich nicht-komplementärer Sequenz auf den gegenüberliegenden Strängen, was seine "Y"-Form verursacht. Als ein Resultat der Ligation werden die 3'-End-Restriktionsfragmente einen Adapter nur an ihrem 5'- Ende haben, während interne Restriktionsfragmente der cDNAs den Adapter an ihre 5'- und 3'-Enden ligiert haben werden.
Im fünften Schritt werden die 3'-End-Restriktionsfragmente der cDNAs, die an den Y- geformten Adapter ligiert sind, selektiv amplifiziert. Der verwendete 5'-PCR-Primer wird aus der Y-Region des Adapters gemacht, die nicht die komplementäre Sequenz an dem gegenüberliegenden Strang hat und deshalb nicht an den Adapter selbst annealen kann. Die stromaufwärts befindlichen Fragmente der verdauten cDNA mit Adapter, der an beiden Enden oder nur einem Ende in dem 5'-terminalen Stück ligiert ist, werden deshalb nicht PCR-amplifiziert werden. Jedoch annealt der 3'-PCR-Primer (aus der 3'-End-Absatz-Sequenz gemacht) an den Absatz der 3'-End-Fragmente cDNA während des ersten PCR-Zyklus und weitet die DNA- Synthese in die Y-Region des ligierten Adapters aus, wodurch komplementäre Sequenzen synthetisiert werden, an die der 5'-PCR-Primer jetzt annealen kann. Die zwei PCR-Primer können dann selektiv die 3'-End-Fragmente der cDNA unter stringenten Bedingungen amplifizieren.
Das genauer beschriebene allgemeine 7-Schritt-Schema für das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wird ebenso in Fig. 1 gezeigt. Ein mit zwei Basen verankerter Oligo(dT)- Primer mit einem 3'-Absatz wird verwendet zur Synthese des ersten Stranges mit der Gubler- Hoffman-Methode [siehe Gene 25: 263 (1983)]. Alle cDNA-Moleküle erwerben somit einen gemeinsamen 3'-Absatz. Diese cDNA wird mit einem Restriktionsenzym verdaut und an einen Y-geformten Adapter ligiert, der im wesentlichen dem Bubble-Adapter ähnlich ist [siehe Nucleic Acid Res. 18: 2887 (1990)]. Der "Y"-Adapter wird mit einem Überhang an seinem 3'- Ende zur Ligation synthetisiert, und an seinem 5'-Ende hat er einen Bereich nichtkomplementärer Sequenz auf den gegenüberliegenden Strängen, der für seine "Y"-Form sorgt. Der 5'-PCR-Primer wird aus dieser Y-Region synthetisiert und kann nicht an den Adapter selbst annealen. Die stromaufwärts befindlichen Fragmente der verdauten cDNA mit Adapter, der an beiden Enden oder nur an einem Ende in dem 5'-terminalen Stück ligiert ist, werden deshalb nicht PCR-amplifiziert werden. Jedoch annealt der 3'-Primer an den Absatz der 3'-End-Fragmente cDNA während des ersten PCR-Zyklus und weitet die DNA-Synthese in die Y-Region des ligierten Adapters aus, wodurch komplementäre Sequenzen synthetisiert werden, an die der 5'-PCR-Primer jetzt annealen kann. Die zwei PCR-Primer können dann selektiv die 3'-End-Fragmente der cDNA unter stringenten PCR-Bedingungen amplifizieren.
Genauer gesagt, wird in Fig. 1 ein Verfahren gezeigt, in dem ein mit zwei Basen verankerter Oligo(dT)-Primer mit einem angefügten Absatz zur Synthese eines ersten Stranges cDNA aus Gesamt-RNA unter Verwendung von reverser Transkriptase verwendet wird (Schritt 1). Dies wird von der Synthese eines zweiten Stranges unter Verwendung der Gubler-Hoffman- Methode gefolgt (Schritt 2). Alle cDNA-Moleküle, die gemäß diesen beiden Schritten synthetisiert werden, werden somit einen gemeinsamen 3'-Absatz erlangen. Als nächstes wird die cDNA verdaut (Schritt 3) mit einem ausgewählten Restriktionsenzym (an diesem Punkt können Restriktionsenzyme verwendet werden, die entweder stumpfe Enden oder überlappende Enden produzieren, jedoch ist in den folgenden Beispielen das Enzym BstY1 dargestellt, das überhängende Enden produzierte) und an einen zuvor synthetisierten Y-geformten Adapter ligiert (Schritt 4). Der Adapter hat einen Überhang an seinem 3'-Ende zur Ligation und an seinem 5'-Ende trägt er einen Bereich nicht-komplementärer Sequenzen, die für seine Form sorgen. Der 5'-PCR-Primer wird aus dieser Y-Region gemacht (Schritt 4) und kann somit nicht an den Adapter selbst annealen. Die stromaufwärts befindlichen Fragmente der verdauten cDNA mit Adapter, der an beiden Enden (Schritt S) oder nur einem Ende in dem 5'- terminalen Stück ligiert ist, werden deshalb nicht PCR-amplifiziert werden. Jedoch wird der 3'-Primer an den Absatz der 3'-End-Fragmente cDNA annealen (Schritt S) während des ersten PCR-Zyklus und die DNA-Synthese in die Y-Region des ligierten Adapter ausweiten, wodurch komplementäre Sequenzen synthetisiert werden, an die der 5'-PCR-Primer jetzt annealen kann (Schritt 6). Die zwei PCR-Primer können dann selektiv die 3'-End-Fragmente der cDNA unter stringenten Bedingungen selektiv amplifizieren (Schritt 7).
Alternativ können Oligo(dU)-Primer anstelle der Oligo(dT)-Primer für die Synthese eines ersten Stranges cDNA in Schritt 1 verwendet werden. Das Binden von Oligo(dU) an den Poly(A)-Bereich ist bekannterweise schwächer im Vergleich zum Binden durch Oligo(dT). Deshalb sollte die Verwendung von Oligo(dU)-Primern für eine Synthese eines ersten Stranges cDNA das Annealen des Oligo(dU) an irgendwelche kürzeren internen Poly(A)-Bereiche, die in dem mRNA-Polymer vorliegen, minimieren. Die vorläufigen Resultate aus einem Satz Experimente, bei denen Oligo(dU) verwendet wurde, zeigten typische Aufzeigemuster mit einer bekannte Probe RNA. Diese Muster waren denjenigen ähnlich, die unter Verwendung von Oligo(dT) erhalten wurden, jedoch werden bei der Verwendung von Oligo(dU) die Chancen, daß der Primer eine cDNA-Synthese aus internen Poly(A)-Bereichen in dem mRNA-Polymer startet, minimiert.
Wir haben ebenso entdeckt, daß PCR-Primer, die über Gelelektrophorese oder mit HPLC aufgereinigt worden sind, bessere Aufzeigemuster als nicht-aufgereinigte Primer ergeben. Während der Oligonukleotidsynthese akkumuliert ein signifikanter Bruchteil kürzerer Oligonu kleotide, die sich als ein Resultat mißlungener Synthese-Zyklen bilden, zusammen mit dem vollständigen Oligonukleotid. Diese kürzeren Sequenzen sind auf dem Gebiet als "Fehler- Sequenzen" bekannt, und obwohl ein kleiner Bruchteil des ursprünglichen Oligonukleotids immer noch bei der Amplifizierung während der PCR teilnehmen kann, indem diese kleiner als die normalen, amplifizierten Produkte gemacht werden, wird ein Produkt erhalten, das zu den Schmierspuren zwischen den Banden beiträgt. Entsprechend wird bevorzugt und stark empfohlen, daß die bei der hierin beschriebenen Erfindung verwendeten Primer aufgereinigt werden, um die Anzahl an Fehler-Sequenzen zu verringern.
Jedes Restriktionsenzym mit Sechs-Basen-Schnittstelle schneidet näherungsweise 8% der cDNAs an Positionen zwischen 50 und 400 Basen von dem Poly(A)-Bereich aus, so daß mehr als 12 Sechs-Basen-Schneider benötigt werden, um an eine vollständige Repräsentation der cDNAs heranzukommen, wobei jeder mit mehreren verschiedenen verankerten Oligo(dT)- Primern verwendet wird. Ebenso schätzen wir, daß im Idealfall ungefähr 100-150 diskrete Banden auf einer einzelnen Gelspur nachgewiesen werden können. Deshalb müssen wenigstens 100 Spuren laufen gelassen werden unter verschiedenen Bedingungen, um das Gesamtmuster der Genexpression in irgendeinem einzelnen Zelltypus zu studieren. Unter Verwendung von 30 Restriktionsenzymen, um eine aus einer Zelle stammende cDNA zu schneiden, ist es möglich gewesen, gemäß der vorliegenden Erfindung näherungsweise 97% der cDNAs aus einer einzelnen Zelle abzudecken.
Ein Hauptvorteil des vorliegenden Ansatzes ist es, daß die Größe eines bekannten cDNA- Produkts und damit seine Position auf dem Aufzeigegel vorhersagbar ist. Interleukin-2 (IL-2) ist ein gut-studiertes Cytokin, das nur in aktivierten und nicht-ruhenden T-Zellen exprimiert wird (siehe Annul. Rev. Immunol. 8: 421 (1990)), und sollte als eine Bande vorhersagbarer Größe aufgezeigt werden. Um dies zu bestätigen und um die Fähigkeit des Verfahrens zu testen, Unterschiede aufzuzeigen, wurde cDNA aus RNA von ruhenden und hr-aktivierten menschlichen Peripheral-Blut-T-Lymphozyten gemacht, unter Verwendung eines Oligo(dT)- Primers mit einem Absatz und 3'-Anker-Resten TA, die zu dem AT-Dinukleotid in der IL-2- mRNA-Sequenz komplementär sind, welches unmittelbar dem Poly(A)-Schwanz vorangeht. Restriktionsverdau mit BstY1 sollte erzeugen, und hat, wenn getestet, ein 146-bp-3'-End- Fragment IL-2-cDNA erzeugt [siehe Natl. Acad. Sci. USA 81: 2541 (1984)]. Wenn zu den Größen des 3'-Oligo(dT) und 5'-Adapter hinzuaddiert, sollte dies erzeugen, und hat, eine Bande von 209 bp auf dem Aufzeigegel erzeugt. Eine bestimmte Bande der vorhergesagten Größe wurde bei der aktivierten, nicht aber bei der ruhenden T-Zell-Probe beim Aufzeigen von BstY1-geschnittener cDNA erzeugt (Fig. 2, Spur 2). Sequenzieren dieses Fragments bestätigte das Vorhandensein des 5'-Adapters, gefolgt von einer BstY1-Stelle, IL-2-3'-End- Sequenzen, dem Polyadenylierungssignal AATAAAA (SEQ. NO. 1), dem stromabwärts befindlichen Oligo(A)-Abschnitts und dem Absatz-Primer

BEISPIEL 1

Bedingungen zum Wachstum und zur Aktivierung von Jurkat- (Jurkat-T-Zellen wachsen schnell in Kultur, können durch Serum-Hungerbedingungen synchronisiert werden und können dazu stimuliert werden, Interleukin-2 zu erzeugen, einem frühen Ereignis bei der Differenzierung von Peripheral-Blut-T-Zellen in vivo; als ein Resultat sind sie ein anerkanntes Modellsystem zur umfassenden Identifizierung und Klonierung aller DNA-Stellen geworden, die spezifisch von Proteinfaktoren erkannt werden, die bei diesen Zellen vorhanden sind; die Verwendung von Jurkat-T-Zellen als ein Modell ist gut akzeptiert, und die Resultate unter Verwendung dieses Testsystems können leicht auf andere Testsysteme unter Verwendung anderer Zelltypen extrapoliert werden; in Kürze, es ist wissenschaftlich vernünftig, Jurkat-T- Zellen als einen Standard für die umfassende Identifizierung und Klonierung aller DNA- Stellen zu akzeptieren, die spezifisch von Proteinfaktoren erkannt werden, welche in diesen Zellen vorhanden sind, und dies kann zur umfassenden Identifizierung und Klonierung aller DNA-Stellen extrapoliert werden, die spezifisch von Protein-Faktoren erkannt werden, die in anderen Zelltypen vorhanden sind) bzw. Peripheral-Blut-T-Zellen sind zuvor beschrieben worden [siehe Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10260 (1993); und J. Exp. Med. 174: 1259 (1991), deren Offenbarungen hierin in toto einbezogen sind]. Gesamt-Zell-RNA wurde aus nicht-behandelten (JO) und aus Jurkat-Zellen (JTP), die für 4 Stunden mit Phorbol-12- Myristat-13-Acetat (PMA) plus Phytohemagglutinin (PHA) aktiviert worden waren, unter Verwendung von RNAzol (Bibco-BRL) hergestellt. Die Synthese der cDNA wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt (Gibco-BRL-Kit für die cDNA-Synthese). Das Reaktionsgemisch für die Synthese des ersten Stranges schloß ein: 10 ug Gesamt-RNA, 2 pmol eines der folgenden mit drei Nukleotiden verankerten, mit Absatz versehenen Oligo(dT)-Primern (wobei T18 sich auf einen Strang von 18 Nukleotiden auf Thymin-Basis bezieht):
RP5.0 CTCTCAAGGA TCTTACCGCTT&sub1;&sub8;AT 40 (SEQ. NO. 2);
RP6.0 TAATACCGCG CCACATAGCAT&sub1;&sub8;CG 40 (SEQ. NO. 3); oder
RP9.2 CAGGGTAGAC GACGCTACGCT&sub1;&sub8;GA 40 (SEQ. NO. 4)
zusammen mit anderen herkömmlichen Reagenzien für die Synthesereaktion des ersten Stranges außer reverser Transkriptase. Bei diesen drei Sequenzen soll der "wahre" Absatz die ersten 20 Nukleotide sein (d. h. das Molekül ohne den T&sub1;&sub8;AT-, T&sub1;&sub8;CG- oder den T&sub1;&sub8;GA- Anteil. Damit sind die "wahren" Absätze
CTCTCAAGGA TCTTACCGCT 20 (SEQ. NO. 10);
TAATACCGCG CCACATAGCA 20 (SEQ. NO. 11); und
CAGGGTAGAC GACGCTACGC 20 (SEQ. NO. 12).
Die Reaktionsmischung wurde mit Mineralöl überschichtet, bei 65ºC für 7 Minuten inkubiert, gefolgt von 50ºC für weitere 7 Minuten. In diesem Stadium wurden 2 ul Superscript reverser Transkriptase (200 u/ul, Gibco-BRL) schnell zugegeben, gemischt und die Reaktion fortgeführt für eine zusätzliche Stunde bei 50ºC. Die Synthese des zweiten Stranges wurde bei 16ºC für zwei Stunden durchgeführt. Am Ende der Reaktion wurden die cDNAs mit Ethanol gefällt, und die Ausbeute (näherungsweise 100 ng) cDNA wurde berechnet.
Der Adapter der folgenden A1- und A2-Nukleotid-Moleküle wurde als nächstes synthetisiert mit den folgenden Sequenzen:
A1 TAGCGTCCGG CGCAGCGACG GCCAG 25 (SEQ. NO. 5); und
A2 GATCCTGGCC GTCGGCTGTC TGTCGGCGC 29 (SEQ. NO. 6)
Ein ug Oligonukleotid A1 wurde zuerst am 5'-Ende einer Kinasebehandlung in einem Endreaktionsvolumen von 10 ul unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase (PNK) mit herkömmlichen Techniken behandelt. Nach der Phosphorylierung wurde die PNK hitzedenaturiert, und 1 ug des Oligo A2 wurde zusammen mit 10X-Annealing-Puffer (1M NaCl, 100 mM Tris, HCl pH 8,0 und 10 mM EDTA pH 8,0) zugegeben in einem Endarbeitsvolumen von 20 ul. Diese Mischung wurde dann bei 65ºC für 10 Minuten erhitzt, gefolgt von langsamem Abkühlen auf Zimmertemperatur für 30 Minuten. Dies führt zu der Bildung des "Y"-Adapters in einer Endkonzentration von 100 ng/ul. Ungefähr 20 ng der cDNA wurden mit 4 Einheiten Bgl II in einer 10 ul-Reaktion für 30 Minuten verdaut. Zwei ul (~ 4 ng verdaute cDNA) aus dieser Reaktionsmischung wurden dann zur Ligation an 100 ng (~ 50-fach) des Y-geformten Adapters verwendet. Die Ligation wurde für 16 Stunden bei 15ºC in einem Endvolumen von 5 ul (2 ul verdaute cDNA, 1 ul Adapter und 2 ul einer Lösung, die 5 ul 10 mM ATP, 5 ul 10X Ligationspuffer und 10 ul (4 Einheiten) T4-DNA-Ligase enthält) durchgeführt. Im Anschluß an die Ligation wurde die Reaktionsmischung auf ein Endvolumen von 80 ul (Adapaterligierte cDNA-Konzentration ~50 pg/ul) verdünnt und bei 65ºC für 10 Minuten erhitzt, um die T4-DNA-Ligase zu denaturieren, und 2 ul Aliquots (mit ~100 pg cDNA) wurden zur PCR verwendet.
Die folgenden Sätze an Primern wurden zur PCR-Amplifizierung der Adapter-ligierten 3'- End-cDNAs verwendet. Die RP5.0, RP6.0 oder RP9.2 wurden als der 3'-Primer verwendet, während der folgende:
A1.1 TAGCGTCCGG CGCAGCGAC 19 (SEQ. NO. 7)
als der 5'-Primer diente. Um die PCR-Produkte auf dem Aufzeigegel nachzuweisen, wurde das Oligo A1.1 5'-End-markiert für 30 Minuten in einem Endreaktionsvolumen von 20 ul, das 24 umol dieses Oligos, 10 Einheiten PNK und 48 umol, d. h. 15 γ³²P-ATP (Amersham) enthielt. PNK wurde bei 65ºC für 20 Minuten hitzedenaturiert, und das markierte Oligo wurde mit 60 ul 2 uM unmarkiertem Oligo 1.1 (in einer 1 4-Verdünnung, Oligo- Endkonzentration ~2 uM) vermischt. Die PCR-Reaktionsmischung (20 ul) umfaßte 2 ul (- 100 pg) der Matrize, 2 ul 10X PCR-Puffer (100 mM Tris·HCl und 500 mM KCl), 2 ul 15 mM MgCl&sub2;, um 1,5 mM Mg&spplus;²-Endkonzentration zu ergeben, die für die Reaktion optimal ist, 200 uM dNTPs, 200 nM jedes 5'- und 3'-PCR-Primers und 1 Einheit Amplitaq. Primer und dNTPs wurden zugegeben nach vorherigem Erhitzen der Reaktionsmischung auf 85ºC, die den Rest der Bestandteile enthielt. Diese "Warmstart"-PCR wurde gemacht, um Artefakt- Amplifizierung zu vermeiden, die aus willkürlichem Annealing von PCR-Primern bei niedrigerer Temperatur während des Übergangs von Zimmertemperatur auf 94ºC im ersten PCR- Zyklus resultiert. Die PCR umfaßte 28 bis 30 Zyklen unter stringenten Bedingungen von 94ºC für 30 Sekunden, 56ºC für 2 Minuten und 72ºC für 30 Sekunden. Eine höhere Anzahl an Zyklen resultierte in verschmierten Gelmustern.
Alternativ können die PCR-Amplifizierungsbedinungen modifiziert werden, um eine noch höhere Stringenz zum Primer-Annealing zu erreichen, indem Streck-PCR-Bedingungen verwendet werden. Zu diesem Zweck haben wir routinemäßig radioaktiv-markierten Primer A1 (d. h. Sequenz No. 5) als den 5'-PCR-Primer anstelle des oben beschriebenen Primers A1.1 verwendet. Die PCR-Bedingungen für diese Streck-PCR-Prozedur sind 94ºC für 30 Sekunden, 68ºC für zwei Minuten und 45 Sekunden für 30 Zyklen. Die unter Verwendung dieses Protokolls erhaltenen Resultate zeigten verbesserte Schärfe der Banden auf den Aufzeigegelen.
Die PCR-Produkte (2,5 ul) wurden auf einem 6% Polyacrylamid-Sequenziergel analysiert. Für Doppel- oder Vielfach-Verdau nach der Adapter-Ligation wurden 13, 2 ul der ligierten cDNA-Probe mit sekundären Restriktionsenzymen in einem Endvolumen von 20 ul verdaut. Aus dieser Lösung wurden 3 ul als die Matrize zur PCR verwendet. Dieses Matrizenvolumen von 3 ul trug ~100 pg der cDNA und 10 mM MGCl&sub2; (aus dem 10X Enzympuffer), was auf das Optimum von 1,5 mM im PCR-Endvolumen von 20 ul verdünnte. Da das gesamte Mg&spplus;² aus dem Restriktionsenzym-Puffer kommt, wurde es beim Amplifizieren von sekundärgeschnittener cDNA in der Reaktionsmischung nicht eingeschlossen.
In beiden Fällen, d. h. beim Schneiden mit einem einzelnen oder mit vielfachen Restriktionsenzymen wurden die Banden aus den Aufzeigegelen extrahiert, unter Verwendung der 5'- und 3'-Primer reamplifiziert und in pCRscript mit hoher Effizienz unter Verwendung des PCR-Script-Klonier-Kits (Stratagene) und unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers subkloniert. Die resultierenden Plasmide wurden durch Zyklus-Sequenzieren auf einem Applied Biosystems automatisierten Sequenzierer sequenziert.
Eine Verbesserung in diesem Protokoll kann stattfinden, wenn ³³P als das radioaktivmarkierende Isotop anstelle des ³²P, wie oben beschrieben, ausgetauscht wird. Das Isotop ³³P emittiert schwache Beta-Partikel und hat eine längere Halbwertszeit als ³²P. Wenn die Verwendung von ³³P zum Markieren der PCR-Primer anstelle des ³²P getestet wurde, zeigten die resultierenden Aufzeigemuster sehr scharfe Banden im Vergleich mit ihren ³²P-Gegenstücken. Aufgrund dieser Vergleichsreihen sollte ³³P-Markierung eine bessere Auflösung feinerer Banden ermöglichen, die normalerweise versteckt oder nicht unterscheidbar wären als eine Resultat des Verschmierens, wenn ³²P verwendet wird.
Wie in Fig. 2 gezeigt, produzierte das Aufzeigen von BstY1-verdauter cDNA, die aus ruhenden und aktivierten T-Zellen hergestellt worden war, die vorhergesagte 209-Nukleotid- Bande, die der IL-2-mRNA-3'-End-Sequenz entspricht, in aktivierten T-Zellen (Spur 2), aber nicht in ruhenden T-Zellen (Spur 1). Dies ist aufgrund der Tatsache, daß das IL-2-Gen die entsprechende mRNA in den aktivierten, nicht aber in den ruhenden T-Zellen exprimieren wird.
Die gesamte cDNA für die 209-Nukleotid-Sequenz ist:
TAGCGTCCGG CGCAGCGACG GCCAGGATCT TTTATGATTC TTTTTGTAAG 50
CCCTAGGGGC TCTAAAATGG TTTCACTTAT TTATCCCAAA ATATTTATTA 100
TTATGTTGAA TGTTAAATAT AGTATCTATG TAGATTGGTT AGTAAAACTA 150
TTTAATAAAT TTGATAAATA TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT CGCCATTCTA 200
GGAACTCTC 209 (SEQ. NO. 8)
In dieser Sequenz entsprechen Nukleotide 1 bis 25 A1, Nukleotide 26 bis 171 entsprechen der 146-Nukleotid-Sequenz von IL-2, wie in der Literatur berichtet, Nukleotide 172 bis 209 entsprechen den Nukleotiden von RP5, beginnend mit der T18-Bezeichnung.
Nach Extrahieren der Bande aus dem Gel wurde durch Sequenzieren bestätigt, daß sie IL-2 ist. Vor der PCR-Amplifizierung wurde die Adapter-ligierte cDNA wieder mit Alu1, Rsa1 und Msp1 geschnitten, da ohne erneutes Schneiden schmierige Muster resultierten, da BstY1 ein häufiger schneidendes Restriktionsenzym ist.
RNA aus ruhenden und für 4 Stunden aktivierten Jurkat-Zellen wurde als nächstes verglichen und in Fig. 3 aufgezeigt, die die Reproduzierbarkeit der Aufzeigemuster und ihre durch verschiedene Restriktionsenzyme und Anker bei Oligo(dT)-Primern mit Absatz erzeugte Vielfalt beschreibt.
Fig. 3 zeigt drei verschiedene Tafeln (A, B und C). In Tafel A sind Spuren 1 und 2 dasselbe Experiment, das zu verschiedenen Zeiten unter Verwendung ruhender Zellen gefahren wurde; Spuren 3 und 4 sind das selbe Experiment, das unter Verwendung aktivierter Zellen zu verschiedenen Zeiten gefahren wurde.
In beiden Tafeln B und C aus Fig. 3 sind die geradzahligen Spuren die Resultate von Experimenten unter Verwendung von Material aus aktivierten T-Zellen, und die ungeradzahligen Spuren sind die Resultate von Experimenten unter Verwendung von Material aus ruhenden T- Zellen.
In Tafel B aus Fig. 3 sind die Spuren 1 und 2 Resultate aus einem Experiment unter Verwendung eines ersten Anker-Primers; Spuren 3 und 4 sind Resultate desselben Experiments unter Verwendung eines unterschiedlichen Primers. In Spuren 1 bis 4 ist es auf leichte Weise offensichtlich, daß unter Verwendung desselben Restriktionsenzyms, aber verschiedenen Anker-Primern, man Banden von verschiedenen Proteinen erhalten wird.
In Tafel B aus Fig. 3 sind die Spuren 5 und 6, und 7 und 8 Resultate derselben Experimente und zeigen an, daß mit derselben cDNA, aber mit unterschiedlichen Restriktionsenzymen man unterschiedliche Gelmuster erhalten wird.
In Tafel B aus Fig. 3, sind die Spuren 9 und 10 Kontrollspuren, in denen die cDNA mit Restriktionsenzymen geschnitten wurde, aber kein Adapter oder Adapter-Ligation fand statt. Daher sind Spuren 9 und 10 leer, wie man es von solchen Kontrollen erwarten würde.
In Tafel C aus Fig. 3 wurde gefunden, daß es zum ersten Mal möglich ist, Sequenzen aufzulösen, die, da sie ein gemeinsames Gewicht, nicht aber eine gemeinsame Sequenz miteinander teilen, zusammen in dem Gel wandern. Kurz gesagt, wurde dies erreicht durch Zufallseinführung eines zweiten Restriktionsenzyms in die Reaktionsmischung nach der Ligation und vor der Amplifizierung durch PCR. Dies wird, statistisch gesehen, die Stränge nicht an demselben Punkt in beiden cDNA-Spezies schneiden. Somit wird, statistisch gesehen, das 3'- Ende, das in beiden Spezies erhalten wird, hinsichtlich der Anzahl an Nukleotiden unterschiedlich sein. Wie oben beschrieben, wird, wenn einer PCR-Amplifizierung unterworfen, nur das 3'-Ende amplifiziert werden (da die 5'-Enden nicht den Primer enthalten werden; siehe Fig. 1, Schritte 5 und 6). Insbesondere in Tafel C wurde das Material in Spuren 1 und 2 unter Verwendung von BglII als Restriktionsenzym geschnitten; das Material in den Spuren 3 und 4 wurde unter Verwendung eines zweiten Restriktionsenzyms, HinF1 geschnitten.
Die Banden, die auf dem Gel für Experimente unter Verwendung verschiedener Restriktionsenzyme gesehen werden, können, wie oben beschrieben, verwendet werden, um die verschiedenen Gene zu bestimmen, die herauf oder herunterreguliert werden. Zum Beispiel ist die Bande, die als JkA5 auf Tafel C identifiziert worden ist, in allen Spuren vorhanden, was anzeigt, daß das Gen in allen getesteten Zubereitungen aktiver oder ruhender Zellen aktiv ist. Die Bande, die als JkA6 identifiziert worden ist, ist in Spur 4, nicht aber Spur 3 vorhanden, was anzeigt, daß dieses Gen in aktivierten Zellen aktiv ist, aber nicht in ruhenden Zellen aktiv ist, wodurch ein Mittel bereitgestellt wird, den Status der Zelle zu bestimmen. Die als JkA7 identifizierte Bande ist dieselbe in Spuren 1, 2 und 4, ist aber nicht in Spur 3 vorhanden; wiederum wird ein Mittel zum Unterscheiden des Status der Zellen bereitgestellt, das auf dem verwendeten Restriktionsenzym beruht. Die als JkA7 identifizierte Bande ist in Spuren 1 und 3, den ruhenden Zellen, vorhanden, aber nicht in den aktivierten Zellen, was ein Mittel zum Bestimmen des Status der zu untersuchenden Zelle bereitstellt.
Deshalb zeigt Tafel A, daß reproduzierbare Muster beim Aufzeigen von BglII-verdauten cDNAs beobachtet wurden, die unter Verwendung von Oligo(dT)-Primer RP6.0 aus unbehandelten (Spuren 1, 2) und aktivierten (Spuren 3, 4) Jurkat-RNA-Proben hergestellt wurden, die in zwei separaten Experimenten isoliert wurden. Tafel B zeigt Spuren 1, 3, 5, 7 und 9 als Repräsentationen von cDNA-Proben aus unbehandelten, und Spuren 2, 4, 6, 8 und 10 aus aktivierten Jurkat-Zellen. Obwohl mit demselben Restriktionsenzym (BglII) verdaut, produzieren verschiedene cDNAs, die aus einer RNA-Probe unter Verwendung von Oligo(dT)- Primern mit unterschiedlichen Anker-Basen gemacht worden waren, unterschiedliche Aufzeigemuster (RP9.2 in Spuren 1 und 2 und RP 6.0 in Spuren 3 und 4). Wenn mit verschiedenen Restriktionsenzymen verdaut (BglII in Spuren 3 und 4 und BamHl Spuren 5 und 6), produziert cDNA, die aus einem Oligo(dT)-Primer RP6.0 gemacht worden ist, unterschiedliche Aufzeigemuster. Reproduzierbare Aufzeigemuster wurden beobachtet zwischen Spuren 5 und 6 und 7 und 8, wenn jede cDNA-Probe aus unbehandelten (Spuren 5, 7) und aktivierten (Spuren 6, 8) Jurkat-Zellen BamH1 in getrennten Röhrchen verdaut und separat vor der PCR- Amplifizierung ligiert wurden. Wenn Aliquots von Restriktionsenzym-verdauten cDNAs separat an den Adapter zu verschiedenen Zeiten ligiert wurden, wurden identische Muster bei der PCR-Amplifizierung beobachtet. Spuren 9 und 10 repräsentieren nicht-ligierte Kontrollen, wobei Restriktionsenzym-verdaute cDNA zur PCR verwendet wird, ohne den Adapter zu ligieren. Jedoch können Banden in diesen Kontrollspuren erscheinen, wenn es eine Kontaminierung von Lösungen oder Proben mit Adapter-ligierter cDNA gibt. Alle Proben in Tafeln A und B wurden auf demselben Gel laufen gelassen, jedoch wurden Spuren 1-4 in Tafel A, 1 und 2 und 3-10 auf Tafel B in angrenzenden Spuren auf dem Gel laufen gelassen. Bezüglich Tafel C repräsentieren Spuren 1 und 3 unbehandelte, und Spuren 2 und 4 repräsentieren aktivierte Jurkat-cDNAs die unter Verwendung von Oligo(dT)-Primer RP6.0 hergestellt worden sind. In Spuren 1 und 2 wurde die cDNA mit BglII verdaut, während in Spuren 3 und 4 BglII- verdaute und Adapter-ligierte cDNA mit einem häufiger schneidenden Restriktionsenzym, HinF1, vor der PCR-Amplifizierung erneut verdaut wurde. Pfeile deuten auf die Banden, die extrahiert wurden, und von denen gefunden wurde, daß sie wahre Unterschiede sind. JkA6 und JkA7 in Spur 4 wurden als Unterschiede auf dem Aufzeigegel offenbart, nur nachdem die Bgl II-verdaute cDNA aus Spuren 1 und 2 mit HinF1 vor der PCR-Amplifizierung erneut geschnitten wurde.
Anfänglich wurden 3'-cDNA-Fragmente, die durch die Restriktionsenzyme BglII, Bcl1 erzeugt wurden, beim Machen der vorliegenden Erfindung aufgezeigt, und BamH1, da sie GATC(SEQ. No. 9)-Überhänge produzieren, die mit demselben Adapter kompatibel sind. Diese Enzyme produzierten unterschiedliche Aufzeigemuster mit demselben Pool von cDNAs (siehe Fig. 3, Tafel B). Darüberhinaus waren diese Muster konsistent reproduzierbar bei mehreren verschiedenen Sätzen experimenteller Bedingungen, wie oben beschrieben. Die Reproduzierbarkeit des Verfahrens wurde ebenso durch die große Anzahl an gemeinsamen Banden zwischen unbehandelten und aktivierten Jurkat-cDNAs illustriert (siehe Fig. 2 und 3). Um die Gültigkeit des Verfahrens, gemäß der vorliegenden Erfindung der auf den Aufzeigegelen gesehenen Unterschiede zu untersuchen, wurden Banden subkloniert, sequenziert, und spezifische Paare von Oligonukleotidprimern auf der Grundlage dieser Sequenzen wurden zur RT-PCR [siehe J. Exp. Med. 174: 1259 (1991)] mit Gesamt-RNA aus unbehandelten und aktivierten normalen T-Zellen und Jurkat-Zellen verwendet. Es wurde verifiziert, daß zwei Unterschiede bei BglII-verdauter cDNA (Fig. 3, Tafel C, Spuren 1 und 2) echt sind.
Überlappende Banden, die die echten Unterschiede maskieren, können gemäß der vorliegenden Erfindung durch erneutes Schneiden der Adapter-ligierten 3'-End-cDNA-Fragmente (gezeigt in Schritt S aus Fig. 1) vor der PCR-Amplifizierung aufgelöst werden. Wenn eine Stelle eines zum erneuten Schneiden verwendeten Restriktionsenzyms in einer der beiden zusammen-wandernden Banden vorhanden ist, wird in sie in einen Teil mit dem Adapter und den anderen mit der Absatz-Sequenz geschnitten werden, von denen keiner mit PCR amplifizert werden kann und deswegen eliminiert werden wird. Unter Verwendung dieses Ansatzes entdeckten wir mit Erfolg zusätzliche Unterschiede zwischen unbehandelten und für vier Stunden aktivierten Jurkat-Zellen, wenn Bgl II-geschnittene und Adapter-ligierte cDNA weiter mit Hinf1 verdaut wurde (Fig. 3, Tafel C, Spuren 3 und 4).
Die Auswahl an Enzymen für primäres oder sekundäres Schneiden war willkürlich, obwohl eine Kombination von mehr als einem Enzym zum erneuten Schneiden verwendet werden kann. Ein anderer Vorteil des erneuten Schneidens ist, daß der Erhalt von cDNAs niedrigen Vorkommens verstärkt wird, da das Entfernen von Banden hohen Vorkommens vermittels erneutem Schneiden Zugang zu diesen Fragmenten für die PCR-Primer ermöglicht (Fig. 3, Tafel C, Spuren 3 und 4). Zusätzlich kann erneutes Schneiden verwendet werden, um Redundanz zwischen Fragmenten in unterschiedlichen Spuren zu minimieren. Zum Beispiel können BglII-geschnittene cDNA-Fragmente mit BamHI erneut geschnitten werden und umgekehrt, so daß die zwei Proben keine amplifizierten Produkte miteinander teilen. Eine große Anzahl an Variationen der Aufzeigemuster kann deshalb mit dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung produziert werden, um nach differenziell exprimierten Genen zu suchen vermittels (i) einer Kombination einer Anzahl verschiedener mit zwei Basen verankerten, mit Absatz versehenen Oligo(dT)s zum Machen von cDNAs, (ii) einer Anzahl unterschiedlicher Restriktionsenzyme, die zum primären Schneiden dieser cDNAs verwendet werden können, und (iii) der Anzahl an Restriktionsenzymen, die zum sekundären Schneiden verwendet werden für jedes primäre Schneiden.
In Übereinstimmung mit der Reproduzierbarkeit der Gelmuster entsprachen die meisten Unterschiede hinsichtlich der Intensität der cDNA-Amplifizierungsprodukte den Unterschieden hinsichtlich der mRNA-Konzentrationen. Zum Beispiel wurden insgesamt 15 Banden subkloniert, sequenziert und mit RT-PCR untersucht. Von diesen Banden zeigten vierzehn Veränderungen hinsichtlich der Expressions-Niveaus, die aus dem Gelmuster vorhergesagt worden waren (Fig. 4, in der die linke Spur Material aus ruhenden Zellen repräsentiert und die rechte Spur Material aus aktiven Zellen repräsentiert, zusätzlich repräsentiert Sequenz 7 eine Bande aus einer normalen T-Zelle und Sequenz 7A repräsentiert eine Bande aus einer cancerösen T- Zelle). Von den vierzehn Sequenzen war eine myc, eine IL-2, und der Rest waren neue Sequenzen, die nicht in den herkömmlichen Sequenz-Datenbasen repräsentiert waren. Jedes Produkt enthielt ein Polyadenylierungssignal, stromaufwärts vom Oligo(dT)-Bereich. Am anderen Ende jedes Produktes wurde der erwartete Vierbasen-Überhang des Adapters gesehen, gefolgt von der aus der Spezifität des zum anfänglichen Schneiden der cDNA verwendeten Enzyms vorhergesagten Base. Zum Beispiel hatten Banden aus Aufzeigemustern, die mit dem Enzym Bgl II erzeugt worden waren, alle die Sequenz des Adapters, einschließlich des GATC (SEQ. NO. 9) des Adapter-Überhangs, gefolgt von einem T, das erwartet werden würde, wenn das 5'-Ende der angehängten cDNA mit Bgl II erzeugt worden wäre. In jedem Fall fehlten den Banden, die aus dem Gel gewonnen wurden, die interne Spaltungsstelle für die Restriktionsenzyme, die zum primären oder sekundären Schneiden verwendet worden waren. Die Niveaus der PCR-Produkte der zwölf induzierten und der einen herunterregulierten cDNA, und vermutlich ihrer mRNAs, variieren im Hinblick auf IL-2 und β-Actin (Fig. 4). Deshalb stellt der Ansatz gemäß der vorliegenden Erfindung, während es leichter ist, cDNA-Fragmente entsprechend den häufiger vorkommenden mRNAs nachzuweisen und zu isolieren, die Fähigkeit bereit, Proben von ziemlich seltenen mRNAs nachzuweisen und zu subklonieren.
Genauer im Hinblick auf Fig. 4 wird die Verifizierung von Unterschieden aus dem Aufzeigegel mit RT-PCR der ursprünglichen Gesamt-RNA-Probe gezeigt. In jeder der Tafeln 1-15 repräsentiert die linke Spur unbehandelte, während die rechte Spur aktivierte Jurkat-cDNA repräsentiert (In Tafel 7 wurde jedoch Peripheral-Blut-T-Zell-RNA zur RT-PCR verwendet). Interessierende Banden wurden aus dem Aufzeigegel extrahiert, subkloniert, sequenziert, und spezifische PCR-Primer wurden gemacht. Das Verfahren, um RNA und RT-PCR zuzubereiten, ist beschrieben worden [siehe J. Exp. Med. 174: 1259 (1991)]. Kurz gesagt, wurde 1 ug Gesamt-RNA revers-transkribiert unter Verwendung von 100 ng Zufalls-Hexamer-Primer in einem Gesamtvolumen von 20 ul. Nach Hitzeinaktivierung der reversen Transkriptase wurde das Endvolumen der Reaktionsmischung auf 50 ul mit Wasser eingestellt, 2 ul dieser verdünnten Probe wurden in die endgültige PCR-Reaktionsmischung aufgenommen, die 5 ul 10X PCR-Puffer (100 mM Tris·HCl und 500 mM KCl), 200 nM jedes der 5'- und 3'-Primer, 200 uM dNTPs, 1 Einheit Amplitaq und 1,5 mM MgCl&sub2; enthielt. Die PCR umfaßte 30 Zyklen von 94ºC für 30 Sekunden, 55ºC für 1 Minute und 72ºC für 30 Sekunden. PCR-Proben wurden auf einem 1,5%-Agarosegel analysiert und mit Ethidiumbromid gefärbt. Proben in Spuren 1-15 wurden separat analysiert, jedoch zeigte IL-2 und β-Actin immer dieselben Muster in jedem Experiment, wie in Tafeln 14 bzw. 15 gesehen wird.
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung, wie in Fig. 5 gezeigt, ist, daß niedrigere Mengen an cDNA, niedriger als normalerweise erforderlich bei Aufzeigeprotokollen, sehr zufriedenstellende Resultate bereitstellen werden, wenn mit den in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Protokollen verwendet. Die, wie in Fig. 5 gezeigt, dargestellten Daten wurden aus einer Reihe von Experimenten abgeleitet, um den Effekt der Verwendung einer cDNA- Konzentration zu studieren, die ungefähr 1/4 der Menge an cDNA ist, die normalerweise bei Aufzeigeprotokollen erforderlich ist. Dies stellt Mittel bereit zum erfolgreichen Durchführen einer Aufzeigestudie unter Verwendung einer kleiner als gegenwärtig erforderlichen Menge von Zellen, aus denen das Probenmaterial erhalten werden soll; diese Anwendung wird helfen, die vorliegende Erfindung zum Aufzeigen von cDNAs, die für 10 ug Gesamt-RNA erhalten werden, auf 30 Restriktionsenzyme auszuweiten, in anderen Worten, unter Verwendung der vorliegenden Erfindung können 30 unterschiedliche Restriktionsenzyme verwendet werden, um erfolgreich die aus 10 ug Gesamt-RNA hergestellte cDNA aufzuzeigen. Spuren 1 und 2 in Fig. 5 zeigen die Aufzeigemuster, wenn eine normale Menge an cDNA genommen wird (d. h. die in gegenwärtigen Aufzeigeprotokollen benötigte Menge) und dem Protokoll gemäß der vorliegenden Erfindung unterzogen wird; Spuren 3 und 4 zeigen die Aufzeigemuster, wenn 1/4 der Menge an cDNA, die in Spuren 1 und 2 verwendet wurde, Restriktionsenzym-verdaut, an den Y-geformten Adapter ligiert, aber 1/4 weniger verdünnt wurde als die Verdünnung, die in Spuren 1 und 2 nach der Ligation verwendet wurde, um die äquivalente Konzentration der cDNA zu erhalten, als wenn eine normale Menge an cDNA genommen wird, wie in Spuren 1 und 2; Spuren 5 und 6 zeigen die Aufzeigemuster von cDNA, die verdaut wurde wie die Proben, die in Spuren 1 und 2 laufen gelassen wurden, aber nur 1 /4 der cDNA wurde zur Ligation genommen und aufgezeigt; und Spuren 7 und 8 zeigen das Aufzeigen, wenn ein Viertel der Menge an ligierter cDNA, die in Spuren 1 und 2 verwendet wurde, zur PCR-Amplifizierung genommen wurde. Die Resultate zeigen deutlich, daß die Aufzeigemuster, identisch zu denjenigen, die mit Mengen an cDNA erhalten werden, welche für gegenwärtige Protokolle benötigt werden, sogar mit niedrigen Quantitäten an cDNAs erhalten werden. Damit kann die vorliegende Erfindung mit kleineren cDNA-Probemengen verwendet werden, als bei herkömmlichen Techniken erforderlich.
Im Hinblick auf Fig. 6 wird ein Aufzeigemuster von cDNA gezeigt, das aus einer sehr kleinen Anzahl an Probenzellen erhalten wird. Genauer zeigt die Fig. Vergleiche des cDNA- Expressionsmusters in Stammzellen zu verschiedenen Stadien der Reifung. Zum Erhalt dieser Daten wurde die Gesamt-RNA aus 5000 Stammzellen extrahiert. Unter Verwendung eines Oligo(dT)-Primer wurde eine doppelsträngige cDNA synthetisiert, gereinigt und an einen Adapter in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung ligiert. Unter Verwendung der Adapter-Primer wurde die cDNA PCR-amplifiziert unter Verwendung des Protokolls von Baskaran und Weissmann [siehe Genome Research 6(7): 633 (1996)], dessen Offenbarung in toto hierin miteinbezogen ist. Die ursprüngliche cDNA wurde deshalb mehrfach amplifiziert, so daß eine große Menge dieser cDNA zur Verwendung bei dem Aufzeigeprotokoll gemäß der vorliegenden Erfindung zur Verfügung stand. Zum Aufzeigen wurde ein Aliquot dieser cDNA mit dem verankerten Oligo(dT)-Primer inkubiert. Diese Mischung wurde zuerst hitzedenaturiert, und dann ließ man sie bei 50ºC für 5 Minuten verbleiben, um den Anker- Nukleotiden der Oligo(dT)-Primer das Annealen zu ermöglichen. Dies sorgt für die Synthese von cDNA unter Verwendung einer Klenow-DNA-Polymerase. Die 3'-End-Region der Ausgangs-cDNA (hauptsächlich die Poly(A)-Region), die einzelsträngig verbleibt aufgrund des Paarens und der darauffolgenden Synthese von cDNA durch den verankerten Oligo(dT)- Primer am Beginn der Poly(A)-Region, wird durch die 5'-3'-Exonuklease-Aktivität der T4- DNA-Polymerase entfernt. Nach der Inkubation der cDNA mit einer T4-DNA-Polymerase zu diesem Zweck wurden dNTPs in die Reaktionsmischung zugegeben, so daß die T4-DNA- Polymerase die Synthese der DNA über den verankerten Oligo(dT)-Primer, der den Absatz trägt, initiiert. Das Netto-Resultat dieses Protokolls ist, daß die cDNA mit dem 3'-Absatz zum Aufzeigen von der doppelsträngigen cDNA als Ausgangsmaterial synthetisiert wird, eher als RNA als das Ausgangsmaterial, wie es bei herkömmlichen 3'-End-cDNA- Aufzeigeprotokollen stattfindet. Die cDNA, die den 3-End-Absatz trägt, wird dann Restriktionsenzym-Verdau, Ligation und PCR-Amplifizierung unterworfen, gefolgt von einem Lauf der PCR-amplifizierten 3'-End-Restriktionsfragmente mit dem Y-geformten Adapter auf dem Aufzeigegel.
In Fig. 7 werden die Aufzeige-Veränderungen gezeigt, die bei den Genexpressions-Mustern der alternden humanen IMR 90-Fibroblasten-Zell-Linie stattfinden. Um die in Fig. 7 gezeigten Resultate zu erreichen, ließ man die menschliche Fibroblasten-Zell-Linie IMR 90 durch Passagen 7, 13 und 22 wachsen, wonach die Zellen geerntet wurden und die Gesamt- RNA wie oben beschrieben isoliert wurde. Diese RNA-Proben wurden dann für das Aufzeigeprotokoll gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet. Die cDNA, die diesem Protokoll folgend synthetisiert wurde, wurde mit dem Restriktionsenzym Bgl II verdaut und auf Aufzeigegelen laufengelassen, die in der Figur gezeigt werden. Die Pfeile auf dem Aufzeigemuster, gezeigt in Fig. 7, zeigen die Position des 3'-End-Bgl II-Fragments von P21- und L7- cDNAs, von denen bekannt ist, daß sie sich während der Alterung verändern. Die Sequenz (SEQ. NO 13) für RP9.3 ist: Die Sequenz (SEQ. NO. 14) für RRP 10.3 ist:
Beide Absatz-Sequenzen wurden aus der viralen DNA-Sequenz ausgewählt, so daß die PCR- Primer auf der Grundlage der Absatz-Sequenz keine humane DNA amplifizieren.
Fig. 9 ist Fig. 7 ähnlich mit der Ausnahme, daß das in der Figur gezeigte Gel mit einer cDNA laufengelassen wurde, die mit dem Restriktionsenzym Pst I verdaut wurde. In diesem Fall zeigen die Pfeile die Position der Banden in dem Aufzeigemuster, die sich während der Alterung verändern. Sowohl Fig. 7 als auch 9 unterstützen damit die Verwendung der vorliegenden Erfindung für Studien, die sich mit den Veränderungen beschäftigen, welche in der Genexpression während des Reifens oder der Alterung von Zellen stattfinden.
Fig. 8 zeigt die Veränderungen der Genexpression, die in Zellen stattfinden, welche exogenen Molekülen, wie dem Hormon Östrogen, ausgesetzt worden sind. In Fig. 8 wurden Osteoblasten von einem 17 Jahre alten weiblichen Patienten aus Rückgrat-Knochensplittern erhalten, indem man die Zellen aus den Splittern auf Plastik-Kulturschalen wachsen ließ, wonach die Zellen zweimal passagiert und bis zur Konfluenz in den Schalen wachsen gelassen wurden. Nach 48 Stunden in der Abwesenheit von Östrogen wurden 10 mN 17-β-Östradiol der Zellkultur zugegeben. Kontrollzellen verblieben in Östrogen-freiem Medium. 24 Stunden später wurde die RNA isoliert und gemäß dem Aufzeigeprotokoll der vorliegenden Erfindung analysiert. cDNA wurde aus Kontroll-RNA(-) oder östrogenbehandelten RNA(+)-Zellen hergestellt, die mit Bgl II oder Pst I-Restriktionsenzymen verdaut und auf dem Aufzeigegel, wie oben beschrieben, laufengelassen wurden. Wie von dem Pfeil in der Figur angezeigt, resultiert dieses Protokoll in einem Gel, das die Position einer Bande zeigt, die bei den behandelten Zellen vorhanden (d. h. RNA(+)), aber bei den Kontrollzellen abwesend ist. Damit kann das Protokoll der vorliegenden Erfindung ebenso verwendet werden, um den Effekt zu unterscheiden, den ein exogenes Molekül auf verschiedene Zelltypen haben kann.
Das Aufzeigen eines cDNA-Expressionsmusters von Jurkat-T-Zellen nach Transfektion mit dem HOX11-Gen wird in Fig. 10 gezeigt. Es ist bekannt, daß die Überexpression des HOX11-Gens in T-Zellen zu Leukämie führt [siehe Blood (Suppl.) 80: 355a (1992)]. Um zu studieren, welche cDNA in T-Zellen als ein Resultat der HOX11-Überexpression induziert worden sein könnten, wurde die cDNA für HOX11 in Jurkat-Zellen gemäß einem standardisierten Protokoll in einem tet-Expressionsvektor transfiziert [siehe z. B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6522 (1995)], und die cDNA-Expressionsmuster zwischen nicht-transfizierten und HOX11-transfizierten Jurkat-T-Zellen wurden auf Aufzeigegelen verglichen, die wie oben beschrieben hergestellt worden waren. Wie in Fig. 10 gezeigt, enthielt Spur 1 einen 1 kb- Marker; 2 enthielt cDNA-Proben, die aus Jurkat-T-Zellen entnommen worden waren, die mit dem Vektorplasmid ptet-tak transfiziert worden waren (tak ist der Plasmidvektor, der das tet- VPIG-Fusionsgen enthält, das zur Transaktivierung und unter tet-Kontrolle verwendet wird; eine Kontrolle); Spur 3 enthielt cDNA-Proben, die Jurkat-T-Zellen entnommen worden waren, welche mit dem Vektorplasmid ptet-splice transfiziert worden waren (eine Kontrolle); Spur 4 enthielt cDNA-Proben, die Jurkat-T-Zellen entnommen worden waren, die mit dem Vektorplasmid ptet-HOX11 transfiziert worden waren (eine Kontrolle); Spur 6 enthielt cDNA-Proben, die Jurkat-T-Zellen entnommen worden waren, die mit dem Vektorplasmid ptet-tak + ptet-HOX11 transfiziert worden waren, d. h. einer Mischung aus beiden Plasmiden, entnommen bei 0 Stunden nach der Transfektion; und Spur 6 enthielt cDNA-Proben, die Jurkat-T-Zellen entnommen worden waren, die mit dem Vektorplasmid ptet-tak + ptet-HOX11 transfiziert worden waren, entnommen eine Stunde nach der Transfektion. Die Pfeile in Fig. 10 zeigen einige der cDNA-Banden an, die als ein Resultat der HOX11-cDNA- Überexpression induziert worden sind, und unterstützen wiederum die Verwendung der vorliegenden Erfindung als ein Mittel, um die Initiation der Genexpression in Zellen zu lokalisieren und zu identifizieren, die eine Veränderung aus einem ruhenden, stabilen und normalen Existenzzustand durchlaufen haben.
Einer der wichtigsten Faktoren, die die Klarheit der Aufzeigemuster beeinflussen, ist die Quantität an Matrize für die PCR und die Anzahl der PCR-Zyklen. Wir fanden, ~ 100 pg cDNA-Matrize ist für die PCR-Amplifizierung angemessen. Jedoch, PCR-amplifizierten wir routinemäßig vor dem Versuch, Unterschiede in Aufzeigegelen zu analysieren, serielle Verdünnungen der Matrize, um eine Konzentration zu wählen, die klare und reproduzierbare Muster in 28-30 PCR-Zyklen erzeugen würde. Hohe Matrizen-Konzentrationen produzierten verwischte Muster, während Banden bei sehr niedriger Matrizen-Konzentration anfingen, herauszufallen, was Artefakt-Unterschiede auf dem Gel produzierte. Gute Qualität der RNA ist ebenso eine Voraussetzung für saubere Aufzeigemuster. Replikate von PCR-amplifizierten Proben wurden auf dem Gel laufengelassen, um die Konsistenz hinsichtlich des Intensitätsunterschieds der betrachteten Bande zu untersuchen, und unligierte cDNAs wurden als Kontrollen PCR-amplifiziert, die Banden nur dann zeigten, wenn es eine Kontaminierung von Adapter-ligierter cDNA in den Lösungen oder der Probe gab. Wir fanden die Subklonierung einer interessierenden Bande besser als die direkte Analyse der reamplifizierten Bande, die aus dem Gel gewonnen worden war, und es ist notwendig, zu untersuchen, daß die gewonnene Bande die korrekte Größe hat.
Ein Erhöhen der Anzahl an 3'-cDNA-End-Fragmenten in einer Probe kann unscharfe Muster verursachen. Sau3A1 (ein Vier-Basen-Schneider) produzierte verwischte Muster, obwohl dieselbe Menge an cDNA, verdaut mit Bgl II oder BamH1 (Sechs-Basen-Schneider) klare Gelmuster produzierte. Sau3A1 ist ein häufiger Schneider und produziert amplifizierbarere 3'- Enden aus einer cDNA-Population, die sich dann auf dem Gel zusammenscharen. RNA, die mit Oligo(dT)-Primern geprimed worden war, welche eine Mischung an Basen in der subterminalen Anker-Position enthielten, produzierte überfüllte Muster, weil eine größere Anzahl an cDNA-Molekülen synthetisiert wurde.
Das Ausmaß, in dem verankerte Oligo(dT)-Primer cDNA-Synthese von mRNAs primen, deren Sequenz nicht mit den Anker-Basen perfekt übereinstimmen, ist eine Hauptbeschränkung der cDNA-Aufzeigeverfahren gewesen. Bei der vorliegenden Erfindung wurde eine Vielzahl von Bedingungen zum Erhöhen der Spezifität dieses Primings untersucht, und es wurde gefunden, daß die Primer-Extension mit reverser Transkriptase bei 50ºC optimal war. Jedoch entstanden sogar unter diesen optimierten Bedingungen einige bekannte cDNA-Produkte aufgrund von falscher Paarbildung oder Schleifenbildung aus der subterminalen Anker-Base heraus. Nichtsdestotrotz wurden unterschiedliche, jedoch konsistente und reproduzierbare Muster mit cDNAs erhalten, die aus Oligo(dT)-Primern mit unterschiedlichen Anker-Basen gemacht worden waren.
Insgesamt konnten aus vier Paaren von Spuren, die unbehandelte und aktivierte Jurkat-ZellmRNAs repräsentierten, ungefähr 700 Banden bewertet werden. Von diesen schienen ungefähr 4% Spezies zu repräsentieren, die bei der Aktivierung anwachsen (heraufreguliert), und so viele wie 2% nahmen bei der Aktivierung signifikant ab (herunterreguliert). T-Zell- Aktivierung ist ein in großem Umfang studiertes Phänomen, und ungefähr 80 Gene, deren Expression in der frühen Phase der Aktivierung erhöht ist, sind erkannt worden [siehe Annul. Rev. Immunol. 8: 421 (1990)]. Bei den vorliegenden Experimenten ist die geschätzte Anzahl an 3'-End-mRNA-Sequenzen, deren Expression innerhalb von vier Stunden nach der T-Zell- Aktivierung verändert wurde, eine Größenordnung höher als aus früheren Studien angenommen werden könnte [siehe Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 1609 (1987); Nature 308: 149 (1984); und Mol, Cell Biol. 9: 1041 (1989)]. Jedoch ist eine Beschränkung, die allen Verfahren des 3'-End cDNA-Aufzeigens gemeinsam ist, daß offensichtliche Unterschiede in der Expression entstehen können, wenn sich Polyadenylierungsstellen einer einzelnen mRNA-Spezies nach der Aktivierung veränderten.
Eine cDNA, JkR1, die bei der Aktivierung in sowohl Peripheral-Blut-T-Zellen und Jurkat- Zellen herunterreguliert worden war, wurde für weitere Studien ausgewählt. Herunterregulierung von JkR1 in Peripheral-Blut-T-Zellen war vier Stunden nach der Aktivierung durch Zugabe von Ionomycin und Diacylglycerol offensichtlich. Wenn ruhende T-Zellen Actinomycin D ausgesetzt wurden, war JkR1-mRNA relativ stabil für bis zu 3 Stunden. Dies gibt der Möglichkeit Vorschub, daß ein Teil der Herunterregulierung durch eine mRNA-Destabilisierung aktiviert sein könnte. Phillipson hat eine kleine Gruppe von GAS-Genen studiert, deren mRNA beim erneuten Füttern der Zellen mit Serum abnimmt [siehe Cell 54: 787 (1988)], und mehrere dieser mRNAs wurden ebenso herunterreguliert durch Destabilisierung [siehe Mol. Cell Biol. 6: 2924 (1990)]. Jedoch ist JkRI von den GAS-Genen verschieden hinsichtlich sowohl der Sequenz als auch der Tatsache, daß das Niveau seiner mRNA nicht einfach durch erneutes Füttern, sondern nur nach spezifischer Aktivierung der T-Zellen gedrückt wurde.
Auffallenderweise gibt es sehr wenige Verweise in der Literatur auf Gene, deren Expression nach T-Zell-Aktivierung herunterreguliert wird [siehe Nucleic Acids Res. 19: 4655 (1991); und Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10260 (1993)]. Dies legt nahe, daß Veränderungen in der intrazellulären Umgebung nach der T-Zell-Aktivierung ein kombiniertes Resultat aus der Herunterregulierung eines Satzes an Genen zusätzlich zur Induktion von Genexpression ist.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung hat die Fähigkeit gezeigt, vielfache Unterschiede zwischen ziemlich ähnlichen Proben von unbehandelten und für vier Stunden aktivierten Jurkat-T-Zellen zu entdecken. Die Reproduzierbarkeit und weitreichende Darstellung, die mit diesem Verfahren erhalten wird, erlaubt eine systematische Analyse einer Probe, wobei Sequenzdatenbanken voll ausgenutzt werden. Da die Spur und Größe der Bande eines bekannten Gens auf leichte Weise vorhergesagt werden kann, können Gelmuster verwendet werden, um Veränderungen hinsichtlich des Expressionsniveaus bekannter mRNAs zu bewerten, ohne auf Klonieren oder weitere Analyse zurückzugreifen. Da ein großer Bruchteil cDNAs in den Datenbanken als 3' ESTs repräsentiert werden, kann man Datenbanksuchen verwenden, um Kandidatengene einzugrenzen oder zu definieren, die jeder beliebigen Bande entsprechen, deren Vorkommen sich verändert. Dies wird ein zunehmend leistungsfähiger Ansatz werden, da mehr cDNA- und genomische Sequenzen angehäuft werden. Darüberhinaus kann automatisierte Analyse der Kontroll- und Test-Proben unter Verwendung von Fluoreszenz-Primern in einer einzelnen Spur durchgeführt werden. Und schließlich kann die Verwendung zweier verschiedener Restriktionsstellen, eine für den Adapter und die andere für den Absatz-Primer, das Klonieren beschleunigen und orientieren. Wegen seiner Empfindlichkeit könnte dieser Ansatz verwendet werden, um den Zeitverlauf des Erscheinens oder Verschwindens eines Satzes an mRNAs in einer Vielfalt eukaryotischer Systeme zu studieren und zurück auf kürzere Zeitintervalle zu extrapolieren, nachdem der initiierende Reiz angebracht worden ist.
Zusammenfassend betrifft die vorliegende Erfindung einen Ansatz, Veränderungen hinsichtlich der Genexpression mit selektiver PCR-Amplifizierung und dem Aufzeigen von 3'-End- Restriktionsfragmenten doppelsträngiger cDNAs zu studieren. Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung produziert sehr konsistente und reproduzierbare Muster, kann beinahe alle mRNAs in einer Probe nachweisen und kann versteckte Unterschiede, wie etwa Banden, die sich in ihrer Sequenz unterscheiden, aber auf dem Gel zusammen wandern, auflösen. Banden, die bekannten cDNAs entsprechen, bewegen sich auf vorhersagbare Positionen auf dem Gel, was dies zu einem leistungsfähigen Ansatz macht, Gelmuster mit cDNA- Datenbanken zu korrelieren. Unter Anwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung haben wir Unterschiede hinsichtlich Genexpressions-Mustern während der T-Zell- Aktivierung untersucht. Von insgesamt 700 Banden, die bei den T-Zell-Aktivierungsstudien während des Machens der vorliegenden Erfindung bewertet und hierin beschrieben wurden, repräsentierten soviel wie 3-4% mRNAs, die heraufreguliert werden, während ungefähr 2 % innerhalb von 4 Stunden der Aktivierung von Jurkat-T-Zellen herunterreguliert wurden. Diese Resultate legen nahe, daß das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung für die systematische, rasche und nahezu erschöpfende Aufklärung subtiler Veränderungen in den Mustern der Genexpression in Zellen mit veränderten physiologischen Zuständen geeignet ist.
Somit sollte verstanden werden, daß, während wir die bevorzugte Ausführungsform unserer Erfindung erläutert und beschrieben haben, diese Erfindung zur Variation und Modifizierung fähig ist und wir deshalb nicht wünschen, auf die dargelegten, genauen Grenzen beschränkt zu werden, sondern es anstreben, uns solche Wechsel und Veränderungen zunutze zu machen, die zum Anpassen der Erfindung auf verschiedene Verwendungen und Bedingungen gemacht werden können. Z. B. können, während die hergestellten und in den Figuren gezeigten Gele in Übereinstimmung mit herkömmlicher Gel-Technologie hergestellt worden sind, die Frag mente, die auf diesen Gelen laufengelassen werden, alternativ mit fluoreszenten Markierungen markiert sein und das Lesen der Gele mit automatisierten Mitteln durchgeführt werden. Ebenso kann, während Oligonukleotidprimer mit spezifischer Größe in den hierin beschriebenen Ausführungsformen gezeigt werden, die exakte Länge und Nukleotidsequenz dieser Primer variiert werden, während immer noch die Erfordernisse beibehalten werden, die diese Primer, wie hierin beschrieben, haben müssen. Ebenso, während die hierin beschriebene Ausführungsform sich hauptsächlich auf den Assay von Veränderungen richtet, der in aktivierten und ruhenden Zellen geschieht, sollte es verstanden werden, daß, wann immer eine Zelle mit einem exogenen Material, wie z. B. einer pharmazeutischen oder toxischen Verbindung, in Kontakt gebracht wird, die Zelle unveränderlich für eine genetische Antwort auf das Material sorgen wird, was in der Herauf oder Herunterregulierung genetischer Expression resultiert; diese Veränderungen können ebenso bemerkt werden unter Verwendung des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung mit sehr geringer Veränderung des allgemeinen Schemas des Verfahrens, das in Fig. 1 gezeigt wird, und diese Veränderungen können benützt werden, um den Effekt zu bewerten, die solche Materialien auf die Wirtszelle haben, die dem Material ausgesetzt worden ist.
Zusätzlich zu den obigen würden andere Anwendungen der 3'-End-cDNA-Differenzial- Aufzeigeprotokolle gemäß der vorliegenden Erfindung einschließen: die Aufklärung des Mechanismus von Arzneiwirkung (mit der Fähigkeit, frühe Veränderungen in der Zelle nach Arzneibehandlung zu überwachen, kann der Mechanismus einer Arzneiwirkung studiert werden, indem die hierin beschriebenen 3'-End-cDNA-Techniken angewendet werden, ebenso kann ein Vergleich der Antworten unterschiedlicher Individuen gegenüber einer Arzneibehandlung überwacht werden); einen Vergleich der frühen Nebenwirkungen auf molekularem Niveau in Antwort auf die Behandlung mit unterschiedlichen Arzneien für eine gemeinsame Heilung (es ist bekannt, daß bestimmte Arzneien mehr Nebenwirkungen oder Toxizität haben als andere, die verwendet werden, um dieselbe Störung zu behandeln, und die hierin beschriebenen Aufzeigetechniken werden bei der schnellen Bewertung unterschiedlicher Arzneitherapien im Hinblick auf ihre Nebenwirkungen nützlich sein); und die Fähigkeit, Unterschiede in Target-Zellen aufzuzeigen, die gering in der Anzahl sind (diese Verwendung wird besonders bei den Fällen hilfreich sein, wo Stammzellen studiert werden, oder im Fall von Biopsien, wo nur eine geringe Menge an Gewebe erhältlich ist). Noch zusätzlich zu dem obigen wird es ebenso mit einer Variation der vorliegenden Erfindung, wie oben beschrieben, möglich sein, sowohl das 5'-Ende einer Nukleinsäuresequenz als auch interne cDNA-Fragmente aufzuzei gen, was, zusammen mit dem 3'-End-Aufzeigen, wie hierin vollständig beschrieben, den Nachweis von z. B. Mutationen bei normalen und vererblichen Störungen ermöglichen wird. Was die vorliegende Erfindung auf jede dieser möglichen Verwendungen anwendbar macht, ist, daß sie alle zu subtilen Veränderungen hinsichtlich der Genexpression führen, wofür die vorliegende Erfindung ein Mittel bereitstellt, um solche Veränderungen zu studieren und zu bemerken.
Entsprechend sollen solche Veränderungen, Modifizierungen, Abänderungen und Verwendungen, wie hierin beschrieben, oder wie sie für Fachleute auf leichte Weise offensichtlich würden, innerhalb des vollen Bereichs von Äquivalenten und deshalb innerhalb des Bereichs der folgenden Ansprüche sein.
Eine komplettes Protokoll aller Nukleotidsequenzen, die in der obigen Beschreibung der vorliegenden Erfindung beschrieben sind, folgt:

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:

(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 14

(2) ANGABEN ZU SEQ. ID NO: 1:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 6 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1

(2) ANGABEN ZU SEQ. ID. NO: 2:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 40 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:

(2) ANGABEN ZU SEQ. ID. NO: 3:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 40 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3

(2) ANGABEN ZU SEQ. ID. NO: 4:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 40 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einfach
(D) TOPOLOGIE Einzelstrang
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:

(2) ANGABEN ZU SEQ. ID. NO: 5:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 25 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:

(2) ANGABEN ZU SEQ. ID. NO: 6:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 29 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:

(2) ANGABEN ZU SEQ. ID. NO: 7:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 19 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:

(2) ANGABEN ZU SEQ. ID. NO: 8:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 209 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:

(2) ANGABEN ZU SEQ. ID. NO: 9:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 4 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:
GATC 4

(2) ANGABEN ZU SEQ. ID. NO: 10:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:

(2) ANGABEN ZU SEQ. ID. NO: 11:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:
TAATACCGCG CCACATAGCA 20

(2) ANGABEN ZU SEQ. ID. NO: 12:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:
CAGGGTAGAC GACGCTACGC 20

(2) ANGABEN ZU SEQ. ID. NO: 13:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 40 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:

(2) ANGABEN ZU SEQ. ID. NO: 14:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 40 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:
Nachdem somit unsere Erfindung und die Weise und der Prozess, wie sie gemacht wurde und verwendet wird, in so vollständigen, klaren, genauen und exakten Begriffen beschrieben wurde, um es jedem Fachmann, den es betrifft, oder der damit am nächsten verbunden ist, zu ermöglichen, dieselbe zu machen und zu verwenden, ist das, was beansprucht wird:

Claims

1. Ein Verfahren zum selektiven Amplifizieren eines DNA-Fragments, das eine Sequenz hat, die zu einem 3'-Ende einer mRNA komplementär ist, in einer Nukleinsäureprobe, das die Schritte umfaßt:

(a) In-Kontakt-Bringen der mRNA mit einem Oligonukleotidprimer, der eine 5'- Sequenz, die nicht in der Lage ist, an den Poly(A)-Schwanz der mRNA zu binden, und eine 3'-Sequenz umfaßt, die mit einem Teil des Poly(A)-Schwanzes der mRNA und wenigstens einem nicht-Poly(A)-Nukleotid unmittelbar stromaufwärts vom Poly(A)-Schwanz hybridisiert;

(b) Transkribieren der mRNA unter Verwendung einer reversen Transkriptase, um einen ersten, zur mRNA komplementären Strang cDNA zu erzeugen, der den Oligonukleotidprimer einschließt;

(c) Synthetisieren eines zweiten, zum ersten Strang cDNA komplementären DNA- Stranges, um einen Duplex zu bilden;

(d) Verdauen des Duplex mit wenigstens einem Restriktionsenzym, um eine Anzahl von Restriktionsfragmenten bereitzustellen;

(e) Ligieren eines Adapter an die Restriktionsfragmente, wobei der Adapter zwei partiell hybridisierte Nukleinsäurestränge hat, von denen wenigstens ein Teil nicht-komplementär ist, wobei der Adapter selektive Amplifizierung eines ersten Fragments, das den Adapter und das Oligonukleotid hat, gegenüber einem zweiten Fragment erleichtert, das nur den Adapter hat; und

(f) Amplifizieren des ersten Fragments auf eine selektive Weise.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die 5'-Sequenz des Oligonukleotidprimer eine Sequenz einer Restriktionsstelle umfaßt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die 3'-Sequenz des Oligonukleotidprimer Oligo(dT) ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der partiell hybridisierte Adapter Y-geformt ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das nicht-komplementäre 5'-Ende eine Erkennungssequenz für ein Restriktionsenzym umfaßt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei wenigstens einer der Primer zur Amplifizierung markiert ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Markierung eine radioaktive Markierung oder fluoreszierende Markierung ist.

8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Amplifizierungsschritt eine erste Primersequenz, die eine Sequenz hat, die wenigstens Teil eines Stranges des nicht-komplementären Teils des Adapter ist, und eine zweite Primersequenz benützt, die wenigstens Teil der 5'-Sequenz des Oligonukleotidprimer aus Schritt (a) hat.

9. Verfahren nach Anspruch 1, das weiterhin umfaßt: (g) Isolieren des amplifizierten Fragments.

10. Verfahren nach Anspruch 9, das weiterhin umfaßt: (h) Klonieren des isolierten Fragments.

11. Verfahren nach Anspruch 10, das weiterhin umfaßt: (i) Analysieren des klonierten Fragments durch DNA-Sequenzanalyse.

12. Verfahren nach Anspruch 1, das weiterhin umfaßt: (g) Nachweisen des amplifizierten Fragments.

13. Verfahren nach Anspruch 1, das weiterhin umfaßt nach Schritt (e): Verdauen des ligierten Duplex mit wenigstens einem Restriktionsenzym.

14. Ein Verfahren zum Vergleichen der Niveaus der mRNA-Expression in zwei Zellpopulationen, welches umfaßt:

selektives Amplifizieren einer Nukleinsäureprobe aus jeder Zellpopulation gemäß dem Verfahren nach Anspruch 1; und

Vergleichen der Menge an amplifizierten Fragmenten, die in Schritt (f) von Anspruch 1 erhalten worden sind.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei wenigstens einer der Primer zur Amplifizierung markiert ist.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Markierung eine radioaktive Markierung oder fluoreszierende Markierung ist.

17. Verfahren nach Anspruch 14, wobei eine der Zellpopulationen behandelt ist.

18. Ein Verfahren zum selektiven Amplifizieren eines DNA-Fragments, das eine Sequenz hat, die zu einem 3'-Ende einer mRNA komplementär ist, in einer Nukleinsäureprobe, das die Schritte umfaßt:

(a) In-Kontakt-Bringen der mRNA mit einem ersten Oligonukleotidprimer, der eine Sequenz umfaßt, die mit einem Teil des Poly(A)-Schwanzes der mRNA hybridisiert;

(b) Transkribieren der mRNA unter Verwendung einer reversen Transkriptase, um einen ersten, zur mRNA komplementären Strang cDNA zu erzeugen;

(c) Synthetisieren eines zweiten, zu dem ersten Strang cDNA und dem ersten Oligonukleotidprimer komplementären DNA-Stranges, um einen ersten Duplex zu bilden;

(d) Ligieren eines ersten Adapter an den ersten Duplex;

(e) Amplifizieren des ersten Duplex unter Verwendung einer ersten Primersequenz und einer zweiten Primersequenz, die wenigstens Teil der ersten Adaptersequenz hat, um einen amplifizierten ersten Duplex zu bilden;

(f) In-Kontakt-Bringen des amplifizierten ersten Duplex mit einem zweiten Oligonukleotidprimer, der eine 5'-Sequenz, die nicht in der Lage ist, an den Poly(A)- Schwanz der mRNA zu binden, und eine 3'-Sequenz umfaßt, die mit einem Teil des Poly(A)-Schwanzes der mRNA und wenigstens einem nicht-Poly(A)- Nukleotid unmittelbar stromaufwärts von dem Poly(A)-Schwanz hybridisiert;

(g) Synthetisieren eines ersten DNA-Stranges unter Verwendung einer DNA- Polymerase;

(h) Synthetisieren eines zweiten, zu dem ersten Strang komplementären Stranges DNA, um einen zweiten Duplex zu bilden;

(i) Verdauen des zweiten Duplex mit wenigstens einem Restriktionsenzym, um eine Anzahl von Restriktionsfragmenten bereitzustellen;

(j) Ligieren eines zweiten Adapter an die Restriktionsfragmente, wobei der zweite Adapter zwei Stränge hat, von denen wenigstens ein Teil nicht-komplementär ist, wobei der Adapter selektive Amplifizierung eines ersten Fragments, das den Adapter und das Oligonukleotid hat, gegenüber einem zweiten Fragment, das nur den Adapter hat, erleichtert; und

(k) Amplifizieren des ersten Fragments auf eine selektive Weise.

19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die 5'-Sequenz des zweiten Oligonukleotidprimer eine Sequenz einer Restriktionsstelle umfaßt.

20. Verfahren nach Anspruch 18, wobei der zweite Adapter Y-geformt ist.

21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei das nicht-komplementäre 5'-Ende eine Erkennungssequenz für ein Restriktionsenzym umfaßt.

22. Verfahren nach Anspruch 18, wobei wenigstens einer der Primer zur Amplifizierung markiert ist.

23. Verfahren nach Anspruch 18, wobei der Amplifizierungsschritt (k) eine erste Primersequenz, die wenigstens Teil eines Stranges des nicht-komplementären Teils des zweiten Adapter hat, und eine zweite Primersequenz benützt, die wenigstens Teil der 5'-Sequenz des Oligonukleotidprimer aus Schritt (f) hat.