DE69534745T2

DE69534745T2 - Immunopotenzierende 5'-nucleotidase-resistente inosinmonophosphat-derivate und ihre verwendung

Info

Publication number: DE69534745T2
Application number: DE69534745T
Authority: DE
Inventors: W. John Tampa HADDEN; Alfredo Tampa GINER-SOROLLA; Noel K. MASIHI
Original assignee: University of South Florida
Current assignee: University of South Florida
Priority date: 1995-04-21
Filing date: 1995-04-21
Publication date: 2006-10-05
Anticipated expiration: 2015-04-22
Also published as: ES2256845T3; DE69534745D1; EP0821692A1; JPH11503751A; CA2675757C; CA2218701A1; WO1996033203A1; EP0821692B1; CA2218701C; CA2675757A1; JP4313847B2; DK0821692T3

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf Mittel und Verfahren zur Verstärkung der Immunantwort durch Erhöhung der Wirksamkeit eines immunpotenzierenden Mittels, Inosin-5'-monophosphat, und Verwendungen des verstärkten Mittels. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Behandlung von Patienten mit Tumoren, viralen und intrazellulären bakteriellen Pathogenen, und ein Impfadjuvans.
Technischer Hintergrund der Erfindung
Sekundäre Immundefekte sind bei Krebs, Alterung, Autoimmunerkrankungen, AIDS und anderen viralen und bakteriellen Erkrankungen, verbreitet. Man glaubte lange, dass eine Behandlung dieser sekundären Immundefekte zu verbesserter Prognose dieser Krankheiten führe. Trotz großer Versuchsanstrengungen wurden bisher nur Levamisol und Isoprinosin umfangreich zugelassen und klinisch zu solcher Behandlung eingesetzt. Es besteht Bedarf nach wirksameren Arzneimitteln dieses Typs.
Die Immunfunktion umfasst den humoralen und zellulären Zweig des Immunsystems sowie die auf Makrophagen und Granulozyten beruhenden Aspekte. Die unterschiedlichen Aspekte der Immunfunktion können durch verschiedene Mittel, die allgemein als Immunpotenzierer bezeichnet werden können, verstärkt oder abge wandelt werden. Immunpotenzierer, darunter Arzneimittel und biologische Substanzen, fanden ausgedehnte Anwendung zur Vorbeugung und Behandlung von Humanerkrankungen.
Neuere Arbeiten legen jedoch nahe (Sad und Mosman, 1994; Sieling et al., 1994, Chakkalath und Titus, 1994; Tripp et al. 1994; Bogdan et al. 1991; Fioretino et al. 1989), dass eine falsche Anregung der Immunantwort den Krankheitsprozeß tatsächlich fördern kann. Sowohl im Maus- als auch im Humanmodell scheint das Zytokinprofil der Immunantwort durch diejenige Subklasse Th1 oder Th2 der T-Helfer(Th)-Zellen, die als Antwort auf das Pathogen aktiviert wird. Th1-Zellen haben im Allgemeinen ein Sekretionsmuster von IL-2, IFN-γ und Lymphotoxin, wogegen das allgemeine Sekretionsmuster von Th2 IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 und IL-13 ist. Die Profile der Th1-Zell-Zytokine werden allgemein mit der Widerstandsfähigkeit gegen Krankheit und die der Th2-Zell-Zytokine mit dem Krankheitsfortschritt in Verbindung gebracht. Insbesondere wurde für intrazelluläre Pathogene wie Mycobacterium leprae, Listeria monocytogenes und Leishmania major, gezeigt, dass das Zytokinprofil der Th1-Zellen zur Beschränkung des Pathogenwachstums notwendig ist. Welche Subpopulation der T-Zellen während der Immunantwort aktiviert wird, wird von vielen Faktoren beeinflusst und es scheint, dass eine Faktorkombination, darunter IL-12 von aktivierten Makrophagen, zur Th1-Antwort führt. Bei diesen Krankheiten wäre ein Mittel zur Steigerung oder Anregung der Th1-Antwort nützlich. Beispielsweise exprimieren Leprapatienten keine Typ-1-Antwort, dagegen exprimieren ihre Wunden Typ-2-Zytokine, welche für die humorale Antwort und die für die Immunsuppression der für die Widerstandsfähigkeit gegen intrazelluläre Pathogene benötigte zellvermittelte Immunität typisch sind.
Eine Klasse Immunpotenzierer wurde aus Puringerüsten wie Inosin oder Hypoxanthin abgeleitet, z.B. Isoprinosin (ein synthetischer Arzneimittelkomplex aus Inosin und dem p-Acetamidobenzoat des N,N-Dimethylmino-2-propanols im Molverhältnis 1:3; DIP-Salz).
und NPT 15392 (9-Erythro-2-hydroxy-3-nonyl-hypoxanthin)
Diese Verbindungen wurden als "thymomimetische Arzneimittel" (Hadden 1985) klassifiziert, weil sie das Immunsystem hauptsächlich durch Einwirkung auf die thymusbasierten (T)-Lymphozyten anregen, obwohl sie auch auf andere bei der Immunantwort beteiligten Zellen einwirken. Isoprinosin ist ein Beispiel eines medizinisch brauchbaren thymomimetischen Arzneimittels, das zur Anwendung beim Menschen in mehreren Ländern weltweit zugelassen ist. Die Wirkung von Isoprinosin in vitro entspricht der des Inosins und wird potenziert durch den Komplex mit dem DIP-Salz (Hadden, 1978). Die in vivo-Wirkung des Isoprinosins wird mit Inosin oder DIP-Salz allein nicht erreicht (Wybran et al., 1982), weshalb die Anmelder glauben, dass Komplexbildung und Schutz des Inosins wesentlich für die in vivo-Aktivität sind.
Die Suche nach mehr immunologisch aktiven Molekülen dieses Typs für die klinische Anwendung hat eine beträchtliche Literatur erzeugt.
US 3,728,450 (Gordon) offenbart Komplexe aus Inosin und Aminoalkoholen mit pharmazeutischer Wirksamkeit bei der Bekämpfung der Influenza oder des Herpesvirus.
US 4,221,794 (Hadden et al.) offenbart Komplexe aus Purinderivaten (9-Hydroxyalkylpurine) mit Aminoalkoholsalzen der p-Acetaminobenzoesäure mit immunmoderierender und antiviraler Wirkung.
US 4,221,909 (Hadden et al.) offenbart Salze der p-Acetaminobezoesäure mit 9-Hydroxyalkylpurinen, die als Virizide, Immunregulatoren und Antileukämiemittel brauchbar sind.
US 4,340,726 (Giner-Sorolla et al.) offenbart Ester (Purinverbindungen) mit immunmodulatorischer, Antivirus-, Antitumor- und Enzyminhibitorwirkung.
US 4,221,910 (Giner-Sorolla et al.) offenbart 9-Hydroxyalkylpurine, die als Immunpotenzierer, Virizide und Antileukämiemittel brauchbar sind.
US 4,457,919 (Giner-Sorolla et al.) offenbart Purinderivate mit immunmodulierender, antiviraler und Antitumorwirkung.
US 4,510,144 und 4,387,226 (Giner-Sorolla et al.) offenbaren Dihydrothiazolpurinderivate mit immunmodulierender Wirkung.
JP 58-140100-A offenbart (Heptamin-1-ol)-5'-adenosinmonophosphat. Saha et al. (1988) offenbaren dessen Aktivität bei der Potenzierung der primären humoralen in vitro-Immunantwort gegenüber einem T-zellabhängigen Antigen (rote Blutkörperchen vom Schaf) bei Anwesenheit in der Frühphase der Milzzellkultur. Saha et al. (1987) offenbaren die Aktivität von HAA zur Steigerung der Anti-SRBC-PFC-Aktivität und der Antikörpertiter in männlichen ICR-Mäusen. Sie zeigen auch die steigernde Wirkung von HAA auf die Anti-SRBC-PFC-Aktivität und die Antikörpertiter in spontan hypertensiven Ratten.
Hadden et al. (1983) weisen darauf hin, dass Purinen, insbesondere inosinhaltigen oder inosinartigen Verbindungen, die Fähigkeit gemeinsam ist, die Wirkung des Thymushormons zur Einleitung der Differenzierung der T-Vorläuferzellen nachzuahmen und die funktionellen Antworten von reifen T-Zellen, insbesondere der Th1-Zellen auf Infektionen intrazellulärer Pathogene, zu potenzieren. Für ein Beispiel für ein solches Molekül, den Transferfaktor, wurde hypothetisch angenommen, dass er in seiner ausgedehnteren Struktur Inosin-5'-monophosphat (IMP) enthält (Wilson und Fudenberg, 1983).
Es wäre hilfreich, diese immunmodulierenden/immunpotenzierenden Verbindungen zur Verwendung wie hierin besprochen verfügbar zu haben.
Virale Infektionen und intrazelluläre bakterielle Pathogene sind ein Hauptanliegen der öffentlichen Gesundheit. In beiden Kategorien umgehen bakterielle und virale Pathogene das Immunsystem des Wirts, weil sie in dessen Zellen wachsen. Nach einer Infektion ist eine zellvermittelte Immunantwort (CMI) durch Th1, ausgelöst durch Makrophagen, die allgemeine Art der Verteidigung oder des Widerstands des Wirts gegen intrazelluläre Pathogene. Eine wirkungsvolle Antikörperreaktion auf die Impfung kann Immunität verleihen.
Während bakterielle Erkrankungen über Antibiotika behandelbar sind, erfordert die wachsende Arzneistoffresistenz der Bakterien einen Blick auf andere Wege der Behandlung. Ein Weg zur Behandlung infizierter Personen ist die Steigerung der Effizienz ihres Immunsystems. Bei diesen Krankheiten ist der Schlüsselfaktor der Immunität die Anwesenheit sensibilisierter T-Lymphozyten und aktivierter Makrophagen. Daher muss wirksame Behandlung dieser Krankheiten die Makrophagen aktivieren und die geeigneten T-Lymphozyten sensibilisieren (Ryan in Stites und Terr, Seiten 637-645, und Mills in Stites und Terr, Seiten 646-6569.
Intrazelluläre bakterielle Pathogene umfassen Salmonella, Legionella, Listeria, Mycobactieria und Brucella. Salmonella-Arten gehören zu den Enterobakterien und verursachen einen beträchtlichen Anteil von Darmerkrankungen, darunter Typhus. Die Kapsel von S. typhi hat ein Kapseloberflächenantigen und Antikörper gegen das Kapselantigen schützt nicht. Tatsächlich haben viele Typhusträger hohe Gehalte an Antikörper gegen das Pathogen.
Untersuchungen an Legionella zeigen, dass es ein obligater intrazellulärer Parasit von Makrophagen ist. Listeria ist grampositiv und verursacht Hirninfektionen und Sepsis bei Erwachsenen und eine Reihe von Infektionen bei Neugeborenen. Als Hauptverteidigungslinie gegen diese Pathogene wurde die Makrophagenaktivierung durch T-Lymphozyten gezeigt. Untersuchungen von mit Brucella zusammenhängender Krankheit haben ebenfalls gezeigt, dass der Antikörper keinen Schutz gewährt, während von spezifisch sensibilisierten T-Lymphozyten erzeugte Makrophagen schützen.
Es wäre nützlich, wirksame Arzneistoffe für diese Krankheiten zu haben, welche Makrophagen aktivieren und die dem Pathogen entsprechenden T-Lymphozyten sensibilisieren.
Allgemein gibt es wenige oder keine wirksamen Antivirusarzneistoffe und daher bleibt der Schutz von viralen Pathogenen auch ein Hauptziel der öffentlichen Gesundheitsfürsorge. Impfung bleibt die beste Schutzquelle für Viruserkrankungen. Oft verleihen Impfungen jedoch keine Immunität wegen (1) eines kaum immunogenen viralen Antigens, (2) Fehlens von Zeit zwischen Impfung und Exposition oder (3) Unfähigkeit der geimpften Person zur Reaktion.
Beispielsweise müssen Influenzaviren fortlaufend aktualisiert werden, weil des Virus Antigenveränderungen eingeht. Oft ist der neueste Impfstoff am Beginn der Wintermonate, welches die Spitzenmonate der Epidemie sind, nicht oder nicht in vollem Maßstab verfügbar. Daher können jene, die geimpft werden, in der Umwelt auf das Virus stoßen, bevor sie über Antikörpertiter verfügen. Ferner ist bei Patienten mit höherem Risiko, d. h. ältere und junge, oft vor Ausbruch der Epidemie die Compliance vermindert. Zusätzlich schlägt Influenza besonders hart in den jüngeren und älteren Populationen und auch bei Personen mit zugrunde liegender Herzlungenkrankheit zu. Diese speziellen Gruppen haben oft eine weniger kräftige Immunantwort auf den Impfstoff.
Die Influenza-Virusinfektion unterdrückt die normale antibakterielle Verteidigung der Lunge, so dass Patienten nach Überstehen der Influenza ein stark erhöhtes Risiko besitzen, an bakterieller Lungenentzündung zu erkranken. Scheinbar gibt es während einer Virusinfluenza ein Ungleichgewicht der alveolaren Makrophagen oder Neutrophilen.
Daher wäre ein Mittel zur Steigerung der Immunantwort auf virale Influenzainfektion oder zur Steigerung des Widerstands gegenüber Lungenentzündung für die Behandlung dieser Erkrankungen nützlich. Ein möglicher Weg, die Wirksamkeit der Behandlung zu steigern, ist die Behandlung mit immunpotenzierenden Substanzen. (Hadden et al., 1976 Hadden, 1987).
Ein Hauptanliegen der öffentlichen Gesundheit ist die chronische Infektion mit Hepatitis B. Das Hepatitis B-Virus ist Ursache der akuten und chronischen Hepatitis und des Leberkarzinoms. Die akute Krankheit ist selbstbegrenzend, während die chronische Infektion das ganze Leben des Wirts andauert. Chronische Träger bleiben lebenslang infektiös. Man schätzt, dass es weltweit über 100 Millionen Träger gibt.
Es gibt keine wirksamen Behandlungsmöglichkeiten für die Krank heit. Vorbeugung über Schutzimpfung bleibt die einzige Lösung. Impfung für Risikogruppen ist kritisch (James et al., 1991; Mills, 1991). Bei Impfung mit Hepatitis B-Virusoberflächenantigen (HBsAg) fand man, dass fast 2% bis 15% der Geimpften keine Antikörper für Hepatitis B-Virusoberflächenantigen (anti-HBs) hervorbringen und daher nicht gegen diese Infektion geschützt sind. Mit anderen Worten, sie sind Nonresponder (Deinhardt, 1983). Es werden unterschiedliche Schemata zur Mehrfachverabreichung der Antigenzubereitung empfohlen, um intensive Immunität gegen Hepatitis B hervorzurufen (Grossman und Cohen 1991). Es gibt aber stets einen Pool von Nonrespondern. Daher wird ein alternatives Mittel zur Steigerung der Immunogenizität von Impfzubereitungen gegen Hepatitis B gebraucht, um dieses wichtigen Bedürfnis der öffentlichen Gesundheit zu befriedigen.
Personen mit hohem Infektionsrisiko finden sich meist unter Hämodialysepatienten (Ferguson, 1990; Walz et al., 1989), unter Patienten mit HIV-Infektion und anderen immungeschwächten Patienten (Hess et al., 1989). Wer mit diesen Gruppen in Kontakt kommt und zuvor nicht mit Hepatitis B Berührung hatte, trägt das höchste Infektionsrisiko und braucht daher schnellen und maximalen Schutz vor Infektion: Dies gilt besonders bei Erbringern von Gesundheitsleistungen (Grossman uns Cohen, 1991). Daher ist für Nonresponder gegen den derzeit verfügbaren Hepatitis B-Impfstoff in diesen Gruppen das Infektionsrisiko noch höher.
Es wäre nützlich, wenn man die Impfeffizienz in den Nonrespondergruppen steigern könnte. Ein möglicher Weg zur Steigerung der Prophylaxeeffizienz ist die Verstärkung der Immunogenizität der verfügbaren Impfstoffe durch Anwendung biologisch aktiver Substanzen mit Adjuvanseigenschaften.
Es ist bekannt, dass Adjuvantien die Antikörperbildung auf heterologe Antigene anregen können. Adjuvantien sind als Verbindungen definiert, die eine Immunreaktion potenzieren können und sind daher eine Klasse von Immunpotenzierern (Stites und Terr, 1991). Adjuvantien werden zur Steigerung der Immunantwort beim Impfen verwendet (Seaman, 1991). Beispielsweise wird HBsAg in Hepatitis B-Impfzubereitungen im Allgemeinen an Aluminiumhydroxid adsorbiert, um die immunogene Wirkung zu steigern und einen Schutztiter von anti-HBs (>10 IU/l) zu erzielen, der Infektionen verhindert.
Wie oben festgestellt, gibt es jedoch die Gruppe der Nonresponder, die selbst auf den so verstärkten Impfstoff nicht ansprechen. (Celis et al., 1987; Meuer et al., 1989). Dieses Fehlen schützender Immunität durch Impfen scheint teilweise an Teilen der Immunantwort zu liegen, die auf dem Niveau des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) bestimmt werden (Alper et al., 1989; Walker et al., 1981). Es wurde vorgeschlagen, dass "Nonrespondern" ein dominantes Gen der Immunantwort im MHC fehlt und dadurch die Synthese der anti-HBs höchstens mit niedrigen Spiegeln erfolgt, die mit den gegenwärtig angewendeten Nachweismethoden kaum zu erfassen sind. (Thomson et al., 1977). Ähnlich wurde gezeigt, dass die mit dem Haupthistokompatibilitätskomplex der Maus (H-2) verbundenen Immunantwortgene die zelluläre und humorale Antwort auf Determinanten auf zahlreichen T-zellabhängigen, einschließlich HBsAg, steuern.
Die bei der kombinierten Anwendung von Hepatitis B-Impfstoff und verschiedenen Immunmodulatoren erhaltenen Ergebnisse deuten auf die Zweckdienlichkeit dieses Wegs hin, weil die Kombinationsbehandlung die Anzahl der Personen, die entweder nicht vollständig oder mit niedrigem anti-HBs-Titer reagieren, vermindert (Celis et al., 1987; Meuer et al., 1989). Obwohl die Daten ermutigend sind, gibt es immer noch Personen, die auf diese Behandlung nicht reagieren und für die ein adjuvansverstärkter Hepatitis B-Impfstoff nützlich wäre, der eine schnelle Entstehung maximaler Titer spezifischer Antikörper fördert und den Schutz der Nonresponderpopulation verstärkt.
Hadden et al. (1983) weisen darauf hin, dass Purinen, insbeson dere inosinhaltigen oder inosinartigen Verbindungen, soweit untersucht, die Fähigkeit gemeinsam ist, die Wirkung des Thymushormons zur Einleitung der Differenzierung der T-Vorläuferzellen nachzuahmen und die funktionellen Antworten von reifen T-Zellen zu potenzieren.
Isoprinosin zeigte einige Wirksamkeit bei der Behandlung der letalen Influenza-Belastungsinfektion bei Mäusen, und bei Verabreichung mit einer subinfektiösen Virusdosis verhinderte es die Mortalität bei nachfolgender Belastung mit Virus (Glasky, 1985). Isoprinosin ist in mehreren Ländern für die Anwendung beim Menschen zur Influenzatherapie wegen seiner klinischen Aktivität beim Menschen zugelassen (Glasky, 1985). Die Halbwertszeit von Isoprinosin in Menschen ist jedoch weniger als 4 h und es ist daher nicht sehr wirksam zur in vivo-Behandlung. Isoprinosin wird rasche hydrolysiert, was die kurze in vivo-Halbwertszeit verursacht. Inosin in vitro (Hadden, 1978) hat ähnliche Eigenschaften wie Isoprinosin, wird in vivo jedoch rasch abgebaut, so dass seine Halbwertszeit noch kürzer ist und daher hat es in vivo keine Wirkung (Wybran et al., 1982). Es wäre nützlich, stabilere inosinartige Verbindungen mit größeren immunpotenzierenden Fähigkeiten zu haben.
Hadden et al., Inf. J. Immunopharmac. Vol. 13, Suppl. 1, Seiten 49-54, 1991, beschreiben Methylinosinmonophosphat, ein Purinimmunmodulator für die HIV-Infektion.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein immunpotenzierendes Derivat des Inosin-5'-monophosphats gemäß Anspruch 1 bereit. In einer Ausführungsform richtet sich die Immunpotenzierung auf eine T-Zell-immunpotenzierende Zusammensetzung und in einer spezifischeren Ausführungsform auf Zellen der Subpopulation 1 der T-Helferzellen (Th 1).
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Andere Vorteile der vorliegenden Erfindung sind leicht zu wür digen, da sie mit Bezug auf die folgende eingehende Beschreibung bei Betrachtung in Verbindung mit den beigegebenen Zeichnungen besser verständlich werden, worin:
1 ist ein Graph, der die Reaktion (d. h. die Bereitstellung humaner Lymphozyten des peripheren Bluts) in Prozent einer Vergleichsreaktion humaner Lymphozyten des peripheren Bluts auf das Lymphozytenmitogen Hämagglutinin über dem Gehalt von Mp-IMP
Me-IMP (-Δ-), IMP (--♢--), E-IMP (--♦--), Arg-IMP (--☐-und Ha-IMP (-•-) im Kulturmedium aufträgt.
2 (Vergleich) ist ein Graph, der die Dosisantwortkurve normaler humaner Lymphozyten gegen MIMP (-o-) und IMP (-•-) von 1 bis 1000 μg/ml in Gegenwart von 0,5 μg/ml PHA angibt, wobei die Ergebnisse als Verhältnis zum Vergleich zweier Spender ausgedrückt ist.
3 (Vergleich)ist ein Graph, der die Dosisantwortkurve von mit CD4⁺ (-o-) und CD8⁺ (-•-) angereicherten humanen Vergleichs-Lymphozyten von 3 Spendern gegen MIMP (1–200 μg/ml) in Gegenwart von PHA zeigt.
4 (Vergleich) ist ein Säulendiagramm der Dosisantwort humaner Vergleichslymphozyten auf das Peptid gp41 bei 12,5 μmol/l (offene Säule), 25 μmol/l (gekreuzt schraffiert), 50 μmol/l (gefüllt) und 100 μmol/l (getüpfelt, kürzeste Säule) in Gegenwart unterschiedlicher Konzentrationen von MIMP (0,1–100 μg/ml). Der Vergleichswert ohne Peptid ist durch die Horizontale ------ angezeigt und die Ergebnisse stellen die mittlere Zählrate (counts per minute, CPM) ± Standardabweichung (SEM) für einen repräsentativen der 5 getesteten Spender dar.
5 (Vergleich) ist ein Säulendiagramm der Dosisantwwort von humanen Vergleichslymphozyten gegenüber dem suppressiven Einfluss von rekombinantem Interferon α bei 10 (kreuzschraffierte Säule), 100 (schräg schraffiert) und 100 (gefüllt) Einheiten/ml in Gegenwart von MIMP 1–100 μg/ml. Der Vergleich (offene Säule) ist die Antwort gegenüber PHA allein und die Ergebnisse sind als CPM ± SEM ausgedrückt.
6 (Vergleich) ist ein Säulendiagramm der Hemmungswirkung von PGE₂ (10-⁵ mol/l) auf die proliferative Antwort (gefüllte Säule) und die Hemmungsumkehr durch MIMP bei 1, 10 und 100 μg/ml (kreuzschraffiert). Der Vergleich (offene Säule) ist die PHA-Antwort in Abwesenheit von MIMP und die Ergebnisse sind als CPM ± SEM ausgedrückt.
7 (Vergleich) ist ein Säulendiagramm der Wirkung von MIMP bei 100 μg/ml (gefüllte Säule) auf die PHA-Antwort (offene Säule) von Vergleichen (c), 15 normalen älteren Personen (Ag+), 9 älteren Personen mit herabgesetzter PHR-Antwort (Ag-), 8 ARC-Patienten und 8 AIDS-Patienten.
8 ist ein Graph, der die Antwort (d. h. die Proliferation von Mausmilzlymphozyten) als Prozent einer Vergleichsantwort von Mausmilzlymphozyten auf das Lymphozytenmitogen Concanavalin A über dem Gehalt von IMP (-☐-), Me-IMP (-Δ-), E-IMP (-•-), Arg-IMP (--♦--), Ha-IMP (--♢--) und Mp-IMP
im Kulturmedium aufträgt.
9 ist ein Säulendiagramm, das die Anzahl der erzeugten Plaque antikörperbildenden Milzzellen (PFC) (Mittel ± SEM) aufträgt, wenn von Mäusen geerntete Milzzellen, die gegen Schaferythrozyten (SRBC) immunisiert waren, mit SRBC belastet werden, wobei die Immunisierung der Mäuse in Verbindung mit intraperitonealer Verabreichung von Ha-IMP, Arg-IMP, Me-IMP erfolgte.
10A–C ist ein Dosis-Wirkung-Säulendiagramm und trägt die Anzahl der erzeugten Milz-PFC (Mittel ± SEM) auf, wenn von Mäusen, die gegen SRBC immunisiert waren, geerntete Milzzellen mit SRBC belastet werden, wobei die Immunisierung der Mäuse in Verbindung mit intraperitonealer Verabreichung unterschiedlicher Dosen von (A) Heptamin-1-ol-5'-inosinmonophosphat, (B) Arginin-5'-inosinmonophosphat und (C) Methyl-5'-inosinmonophosphat erfolgte.
11 (Vergleich) ist ein Dosis-Wirkung-Säulendiagramm und trägt die Anzahl der erzeugten Milz-PFC (Mittel ± SEM) auf, wenn von Mäusen, die gegen SRBC immunisiert waren, geerntete Milzzellen mit SRBC belastet werden, wobei die Immunisierung der Mäuse in Verbindung mit oraler Verabreichung unterschiedlicher Dosen von Methyl-5'-inosinmonophosphat erfolgte.
12 (Vergleich) ist ein Graph, der die Antwort (d. h. die Bereitstellung von Mausmilzlymphozyten) als Prozent einer Vergleichsantwort von Mausmilzlymphozyten auf die Lymphozytenmitogene Phytohämagglutinin (--∎--) und Concanavalin A (--•--) über der Dosis Methyl-5'-inosinmonophosphat aufträgt.
13 (Vergleich) ist ein Dosis-Wirkung-Säulendiagramm, das die Hypersensitivitätsantwort vom verzögerten Typ (d. h. die mittlere Fußsohlen-Dickenzunahme ± SEM) bei Belastung gegen die Dosis des zur Zeit der Immunisierung verabreichten Methyl-5'-inosinmonophosphats aufträgt.
14 (Vergleich) ist ein Säulendiagramm und vergleicht die Hypersensitivitätsantwort vom verzögerten Typ (d. h. die mittlere Fußsohlen-Dickenzunahme ± SEM) bei Belastung zur Verabreichung des Vergleichs oder Methyl-5'-inosinmonophosphat (Me-IMP) zur Zeit der Immunisierung mit Verabreichung des Vergleichs und Me-IMP zur Zeit der Belastung.
15 (Vergleich) ist ein Liniendiagramm und vergleicht das Überleben von Vergleichs- (---) und Me-IMP-behandelten Mäusen, die mit Friend's Leukämievirus (FLV) infiziert waren.
16 (Vergleich) ist ein Liniendiagramm und vergleicht das prozentuale Überleben nach Aerosolinfektion mit Influenza und Behandlung mit Vergleich (PBS am Tag -1, -•-), MIMP (100 μg am Tag -1, -Δ-), MIMP (100 μg zur Stunde -1, -o-), MIMP (100 μg zur Stunde +1, -♦-), MIMP (200 μg am Tag -1, -☐-), MIMP (200 μg zur Stunde -1, -♢-) und MIMP (200 μg zur Stunde +1, -Δ-).
17 (Vergleich) ist ein Liniendiagramm und vergleicht das prozentuale Überleben nach Aerosolinfektion mit Influenza und Behandlung mit Vergleich (PBS am Tag -1, -•-), Vergleich (PBS zur Stunde +1, -o-), MIMP (200 μg am Tag -1, -Δ-), MIMP (200 μg zur Stunde +1, -Δ-), MIMP (200 μg + Squalan am Tag -1, -♢-), MIMP (200 μg + Squalan zur Stunde +1, -♦-).
EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Inosin-5'-monophosphatderivaten, die 5'-nucleotidaseresistent sind (geschützte IMP) zur Verwendung als Immunpotenzierer. Das Verfahren bewirkt chemische Modifikation des Inosin-5'-monophosphats oder der Derivate so dass sie 5'-nucleotidassresistent sind, aber biologische Aktivität/Profil des Inosin-5'-monophosphats in vitro behalten und die biologische Aktivität auf in vivo-Anwendungen ausdehnen, welche Immunpotenzierung/Immunstimulation benötigen. Die Herstellungsverfahren sind in den Synthesebeispielen 1–5 ausgeführt. Das chemische Verfahren ist im Allgemeinen eine Kondensationsreaktion zwischen Inosin-5'-monophosphat oder Derivaten und einem Alkohol, Ether oder sekundärem Amin unter Bildung der 5'-nucleotidasresistenten Verbindung, die in vivo aktiv ist.
Die vorliegende Erfindung liefert ein Mittel zur Stimulation von T-Zellen. Ferner kann das 5'-nucleotidasresistente Inosin-5'-monophosphatderivat als Adjuvans in Impfstoff dienen, um die Wirkung anderer Impfstoffbestandteile zu verstärken. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Impfstoff einer für Hepatitis B.
In noch einer weiteren erfindungsgemäßen Anwendung kann das geschützte IMP zur Behandlung von Tumoren, Virusinfektionen und intrazellulären bakteriellen Pathogenen verwendet werden. Es ist überraschend, eine einzelne Verbindung zu finden, die bei einer infizierten Person therapeutisch wirken kann, um die Immunreaktion auf Tumore, Pathogene zu steigern, und doch auch als Adjuvans für die Impfung wirken kann. (Der Begriff "therapeutisch", wie er hier benutzt wird, umfasst daher Behandlung und/oder Prophylaxe).
Durch Bereitstellung einer 5'-nucleotidaseresistenten Verbindung, geschütztes IMP, ermöglicht die vorliegende Erfindung der Verbindung eine in vivo-Halbwertszeit, die bei Behandlungen zur Steigerung der Immunantwort wirksam ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Herstellungsverfahren für Inosin-5'-monophosphat, das durch chemische Modifikation gegen 5'-Nucleotidase resistent ist, wie nachfolgend beschrieben, Inosin-5'-monophosphat der Formel
wobei R aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Alkyl, Alkoxy und sekundären Aminoverbindungen besteht. Alkyl oder Alkoxy kann von etwa 1 bis 6 Kohlenstoffatome haben und ist i einer Ausführungsform Methyl oder ein Methylester.
Die Grundlage der Erfindung ist der Schutz von Inosin-5'-monophosphat (IMP) vor Hydrolyse durch 5'-Nucleotidase, so dass IMP wirksam in vivo angewendet werden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das geschützte IMP Methyl-5'-inosinphosphonat (Mp-IMP).
Das Alkoxy in einem 5'-nucleotidaseresistenten Inosin-5'-monophosphat hat die Formel -OR', worin R' eine Alkylgruppe von etwa 2–6 Kohlenstoffatomen ist, in einer besonderen Ausführungsform Ethyl.
Die sekundären Aminoverbindungen in einem 5'-nucleotidaseresistenten Inosin-5'-monophosphat haben die Formel -NH-R²,
wobei R² eine substituierte normale Alkylgruppe mit insgesamt bis zu 16 Kohlenstoffatomen ist oder R² die Formel
hat, worin R³ aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Wasserstoff, niedrigem Alkyl C₁ bis C₉ und Carboxyl besteht. In einer Ausführungsform ist R³ Methyl.
Das R⁴ ist aus der Gruppe ausgewählt, die aus Hydroxyl, Amino, Carboxyl, sec-Alkyl, alkylsubstituiertes Hydroxymethyl, -NHC (NH)NH₂, -CONH₂,
besteht, und n ist eine ganze Zahl von 0 bis 4, bevorzugt 1 bis 3 und meist bevorzugt 3.
In der Ausführungsform, in der R⁴ die sekundäre Alkylgruppe ist, hat es bevorzugt die Formel -CH(R⁵)R⁶, worin R⁵ und R⁶, die gleich oder verschieden sein können, unabhängig von Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen ausgewählt werden können. Bevorzugt hat die sekundäre Alkylgruppe insgesamt 4 Kohlenstoffatome.
In der Ausführungsform, in der R⁴ das alkylsubstituierte Hydroxymethyl ist, hat es bevorzugt die Formel -C(R⁷)(R⁸)OH, worin R⁷ und R⁸, die gleich oder verschieden sein können, unabhängig aus Wasserstoff und Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen ausgewählt sind, wobei mindestens eines kein Wasserstoff ist. In einer Ausführungsform sind R⁷ und R⁸ beide Methyl.
Im 5'-nucleotidaseresistent Inosin-5'-monophosphat kann die sekundäre Aminoverbindung ein über sein N-Terminal an das Phosphoratom gebundenes Peptid sein, wobei das Peptid aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus ARG-PRO, ARG-PRO-LYS und ARG-PRO-LYS-THR besteht. Diese Formel ist eine bevorzugten Ausführungsform für pharmakologisch oder immunpharmakologisch aktive Peptide, wobei die Hydrolyse am Ende ein aktives Peptid, z.B. Tuftsin (ARG-PRO-LYS-THR) freisetzt.
Die hier beschriebenen geschützten Derivate von Inosin-5'-monophosphat können leicht hergestellt werden durch Kondensation eines gewünschten Alkohols oder primären Amins oder Peptids mit Inosin-5'-monophosphat in Gegenwart eines Kondensierungsmittels wie Dicyclohexylcarbodiimid oder dergleichen. Die Synthesebeispiele 1–5 geben Beispiele solcher Synthesen. Geeignete Alkohole umfassen einwertige Alkohole mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie Ethylalkohol, n-Propylalkohol, n-Butanol, n-Hexanol.
Geeignete primäre Amine oder Peptide umfassen 6-Amino-2-methyl-2-heptanol (Heptaminol), Arginin, Asparaginsäure, Asparagin, Glutaminsäure, Glutamin, Glycin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Phenylalanin, Serin, Threonin, Valin und ARG-PRO, ARG-PRO-LYS und ARG-PRO-LYS-THR und deren Analoga. Geeignete Verfahren zur Herstellung der Polyamid-Oligonucleotid-Konjugate sind in Haralambidis et al. (1990) ausgeführt.
Die vorliegende Erfindung gibt auch ein Verfahren zur Potenzierung der Immunantwort eines Säugetiers, das eine Behandlung der immunogenen Stimuli benötigt. Das Verfahren umfasst die Verabreichung einer immunpotenzierend wirkenden Menge einer 5'-nucleotidaseresistenten Inosin-5'-monophosphatverbindung, wie in Anspruch 2 definiert, an das Säugetier. In einer bevorzugten Ausführungsform wird bevorzugt die T-Zellsubpopulation Th1 stimuliert.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung von Tumorpatienten. Das Verfahren umfasst die Schritte Verabreichen einer wirksamen Menge eines 5'-nucleotidaseresistenten Inosin-5'-monophosphats als Immunstimulator wie hierin beschrieben und Verabreichung einer wirksamen Menge eines Endotoxins wie Lipopolysaccharid (LPS) oder in einer bevorzugten Ausführungsform Salmonellavakzine, verabreicht nach FDA-Richtlinien. Es sei bemerkt, dass es bei Leukämie möglich ist, eine wirksame Menge eines 5'-nucleotidaseresistenten Inosin-5'-monophosphats als Immunstimulator therapeutisch zu verabreichen, wie hier mit der FLV-Leukämie beschrieben.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Ermittlung von Patienten, die von einer Behandlung mit 5'-nucleotidaseresistentem Inosin-5'-monophosphat profitieren würden. Das Verfahren umfasst das Isolieren von Lymphozyten aus dem peripheren Blut auf bekannte Weise und Durchführung eines Lymphozyten-Stimulations-Assay in vitro in Gegenwart eines Mitogens und geschütztem IMP. Patienten mit einer verminderten in vitro-Antwort auf das geschützte IMP sind keine Kandidaten für die Behandlung mit dem geschützten IMP.
Die Begriffe "Immunstimulator" und/oder "Immunpotenzierer", wie sie hier verwendet werden, beziehen sich auf Verbindungen, welche, wenn sie einer Person verabreicht oder in vitro geprüft werden, die Immunantwort auf ein Antigen und/oder eine Verbindung in der Person oder im Testsystem steigern, denen sie verabreicht werden. Solche Antigene sind schwach immunogen, wenn sie allein verabreicht werden, oder für die Person toxisch bei Konzentrationen, die in der Person Immunreaktionen hervorrufen. Der Immunstimulator oder Immunpotenzierer kann die Immunantwort der Person auf das Antigen oder die Verbindung steigern, indem er das Antigen stärker immunogen oder das Immunsystem ansprechender macht. Der Immunstimulator/Immunpotenzierer kann auch die Immunreaktion beeinflussen, so dass eine geringere Dosis des Antigens/der Verbindung erforderlich ist, um eine Immunantwort in der Person zu erzielen.
Intrazelluläre bakterielle Pathogene umfassen Salmonella, Legionella, Listeria, Mycobacteria und Brucella. Salmonella-Arten gehören zu den Enterobakterien. Die von der vorliegenden Erfindung in Erwägung gezogene Behandlung viraler Pathogene umfasst ohne Beschränkung darauf Influenza, Friend Leukämievirus, Hepatitis, Herpes und HIV.
Zur Behandlung der oben besprochenen Erkrankungen wird ein Immunstimulator gegeben, ausgewählt aus 5'-nucleotidaseresistenten Inosin-5'-monophosphatderivaten, nach der Diagnose einer sekundären Immunschwäche in Verbindung mit Krebstumoren, Virusinfektionen oder intrazellulärer bakterieller Infektion. Der Immunstimulator wird in einer wirksamen Menge angewendet, allgemein 1 bis 50 mg/kg Körpergewicht pro Tag mit einer bevorzugten Ausführungsform von 1 bis 10 mg/kg Körpergewicht pro Tag. Der Immunstimulator wird zum Zeitpunkt der ersten Diagnose gegeben, entweder täglich oder zu Zeitpunkten, die nach guter medizinischer Praxis bestimmt werden, wobei der klinische Zustand des einzelnen Patienten, Verabreichungsstelle und -verfahren, Verabreichungsplan und andere dem medizinischen Praktiker bekannte Faktoren berücksichtigt werden.
Die "wirksame Menge" für den hiesigen Zweck ist daher durch solche Überlegungen bestimmt, wie sie Kunst der Behandlung sekundärer Immunschwächen bekannt sind, wobei sie wirksam sein muss, um eine messbare Erleichterung bei der behandelten Person zu ergeben, so dass sich Verbesserungen zeigen, welche ohne Beschränkung darauf umfassen: Verbesserte Überlebensrate, schnellere Erholung, Besserung oder Verschwinden von Symptomen oder Verminderung von Komplikationen nach Infektion und, wo angebracht, Antikörpertiter oder erhöhter Titer gegen das infektiöse Agens, Verminderung der Tumormasse oder andere Messungen soweit angemessen und dem medizinischen Fachmann bekannt.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann der erfindungsgemäße Immunstimulator, d. h. Derivate des Inosin-5'-monophosphats (geschütztes IMP), auf verschiedene Weise verabreicht werden. Man beachte, dass der Immunstimulator als Verbindung oder als pharmazeutisch zulässiges Salz, und zwar allein oder in Kombination mit pharmazeutisch zulässigen Trägern, verabreicht werden kann. Die Verbindungen können oral, subkutan oder parenteral verabreicht werden, einschließlich intravenöser, intraarterieller, intramuskulärer, intraperitonealer und intranasaler Verabreichung. Implantate der Verbindungen sind ebenfalls brauchbar. Der behandelte Patient ist ein warmblütiges Tier und insbesondere ein Säugetier einschließlich des Menschen.
Es ist zu beachten, dass Menschen im Allgemeinen länger als die hier als Beispiel dienenden Mäuse behandelt werden, wobei die Behandlung eine Dauer proportional zur Dauer der Erkrankung und zur Wirksamkeit des Arzneistoffs hat. Im Allgemeinen sind die Dosen proportional zum Körpergewicht und Metabolismus und Dosierungen werden von hier beispielhaft genannten Tiermodellen auf Menschen übertragen, wobei diese Faktoren in bekannter Weise berücksichtigt werden.
Die Dosen können Einzeldosen oder, in der bevorzugten Ausführungsform, Mehrfachdosen über einen Zeitraum von mehreren Tagen sein.
Bei parenteraler Verabreichung der geschützten IMP-Derivate im Allgemeinen als injizierbare Einheitsdosis formuliert (Lösung, Suspension, Emulsion). Die zur Injektion geeigneten pharmazeutischen Formulierungen umfassen sterile wässrige Lösungen oder Dispersionen, und sterile Pulver zur Wiederherstellung steriler injizierbarer Lösungen oder Dispersionen. Der Träger kann ein Lösungsmittel oder ein Dispersionsmittel, das beispielsweise Wasser, Ethanol, Polyol (z.B. Glyzerin, Propylenglykol, flüssiges Polyethylenglykol und dergleichen), geeignete Mischungen davon und Pflanzenöle enthalten kann.
Die richtige Fließfähigkeit kann beispielsweise eingehalten werden durch Verwendung einer Beschichtung wie Lecithin, Einhalten der nötigen Partikelgröße im Fall von Dispersionen und durch Verwendung von Netzmitteln. Nichtwässrige Träger wie Squalan, Baumwollöl, Sesamöl, Sojaöl, Maisöl, Sonnenblumenöl oder Erdnußöl und Ester, wie Isopropylmyristat, können ebenfalls als Lösemittelsysteme für Zusammensetzungen der Verbindungen verwendet werden. Zusätzlich können verschiedene Additive, welche die Stabilität, Sterilität und Isotonizität der Zusammensetzungen verbessern, einschließlich antimikrobieller Konservierungsmittel, Antioxidantien, Komplexbildner und Puffer zugesetzt werden. Die Einwirkung von Mikroorganismen kann verhindert werden durch verschiedene antibakterielle und fungizide Agenzien, z.B. Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure und dergleichen. In vielen Fällen ist es erwünscht, isotonische Mittel, z.B. Zucker, Natriumchlorid und dergleichen einzuschließen. Ausgedehnte Absorption des injizierbaren pharmazeutischen Materials kann durch die Verwendung von Agenzien, welche die Absorption verzögern, bewirkt werden, z.B. Aluminiummonostearat und Gelatine. Erfindungsgemäß muss jedoch jeder verwendete Träger, Verdünner oder Zusatz mit den Verbindungen kompatibel sein.
Sterile injizierbare Lösungen können durch Inkorporieren der bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendeten Verbindungen in der erforderlichen Menge des geeigneten Lösungsmittels, nach Wunsch mit verschiedenen der anderen Zutaten, hergestellt werden.
Eine pharmakologische Formulierung der geschützten IMP-Derivate kann dem Patienten als injizierbare Formulierung verabreicht werden, die einen kompatiblen Träger enthält, wie verschiedene Träger, Adjuvantien, Additive und Verdünnungsmittel; oder die in der vorliegenden Erfindung benutzten Verbindungen können dem Patienten parenteral in Form von subkutanen Depotimplantaten oder zielgerichteten Abgabesystemen wie Polymermatrizes, Lipo somen und Mikrokugeln, verabreicht werden. Ein zur erfindungsgemäßen Verwendung geeignetes Implantat kann die Form eines Pellets haben, das sich nach der Implantation langsam auflöst, oder ein in der Technik bekanntes biokompatibles Abgabemodul sein. Solche wohlbekannten Darreichungsformen und Module sind so ausgelegt, dass die aktiven Bestandteile langsam über einen Zeitraum von mehreren Tagen bis mehreren Wochen freigesetzt werden.
Beispiele wohlbekannter, in der vorliegenden Erfindung brauchbaren Implantate und Module umfassen: US 4,487,603 , das eine implantierbare Mikroinfusionspumpe zur Abgabe von Medikation mit konstanter Geschwindigkeit offenbart; US 4,486,194 , das eine therapeutische Vorrichtung zur Verabreichung von Arzneimitteln durch die Haut offenbart; US 4,447,233 , das eine Medikationsinfusionspumpe zur Abgabe von Medikation mit genauer Infusionsgeschwindigkeit offenbart; US 4,447,224 , das eine implantierbare Infusionsvorrichtung zur kontinuierlichen Abgabe von Arzneistoffen mit variablem Fluss offenbart; US 4,439,196 , das ein osmotisches Arzneistoffabgabesystem mit Mehrkammerabteilungen offenbart und US 4,475,196 , das ein osmotisches Arzneistoffabgabesystem offenbart. Viele andere solche Implantate, Abgabesysteme und Module sind dem Fachmann wohlbekannt.
Eine pharmakologische Rezeptur der erfindungsgemäß verwendeten geschützten IMP-Derivate kann dem Patienten oral verabreicht werden. Herkömmliche Verfahren sind anwendbar, wie die Verabreichung als Tabletten, Suspensionen, Lösungen, Emulsionen, Kapseln, Pulver, Sirups und dergleichen.
Bekannte Techniken, welche die geschützten IMP und ihre Derivate oral, intravenös oder nasal abgeben und die biologische Aktivität aufrechterhalten, sind bevorzugt.
In einer Ausführungsform kann das geschützte IMP zunächst durch intravenöse Injektion verabreicht werden, um den Blutspiegel des geschützten IMP auf eine geeignete Höhe zu bringen. Der Spiegel des Patienten wird dann durch eine orale Darreichungsform aufrechterhalten, obwohl auch andere Verabreichungsformen, darunter nasal, je nach dem Zustand des Patienten und wie oben angezeigt, verwendet werden können. Die zu verabreichende Menge des geschützten IMP und seiner Derivate ist je nach dem Patienten verschieden und variiert von etwa 10 μg/kg Körpergewicht pro Tag bis 100 mg/kg Körpergewicht pro Tag und ist bevorzugt von 1 bis 10 mg/kg Körpergewicht pro Tag.
Zur Herstellung der Impfstoff-Adjuvans-Kombination kann ein im Handel erhältlicher FDA-zugelassener Impfstoff verwendet werden. Alternativ kann ein Impfstoff hergestellt werden, wie in der Technik der Impfstoffherstellung bekannt. Als Beispiel wird ein Hepatitis-Impfstoff verwendet. Beispielsweise kann ein im Handel erhältlicher Hepatitis-Impfstoff verwendet werden, oder man kann einen durch Dosierung von Hepatitis-Oberflächenantigen nach FDA-Richtlinien herstellen. Das Adjuvans wird in einer Konzentration angewendet, welche eine wirksame Menge ergibt, und ist im Allgemeinen von 0,01 bis 100 mg/kg Körpergewicht. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Adjuvans in einer Konzentration angewendet, die 0,01 bis 10 mg/kg Körpergewicht ergibt. (Sosa et al., 1992).
Alternativ wird eine Impfstoffzubereitung verabreicht und eine Dosis von 5'-nucleotidaseresistenten Inosin-5'-monophosphatderivaten, wie Mp-IMP wird gleichzeitig mit verabreicht.
In einer weiteren Alternative kann nach anfänglicher Verabreichung des reinen Impfstoffs, der gemeinsamen Verabreichung von Impfstoff und Adjuvans oder der Kombination Adjuvans-Impfstoff noch eine spätere Verabreichung des Adjuvans gegeben werden. Das Adjuvans wird in wirksamer Menge verwendet und ist allgemein in einer Konzentration, die von 0,01 bis 100 mg/kg Körpergewicht ergibt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Adjuvans in einer Konzentration verwendet, die von 0,01 bis 10 mg/kg Körpergewicht ergibt (Sosa et al., 1992). Das Adjuvans wird über sieben Tage der ursprünglichen Verabreichung gegeben, entweder täglich oder zu Zeiten, die nach guter medizinischer Praxis bestimmt werden, wobei der klinische Zustand des einzelnen Patienten, Verabreichungsstelle und -verfahren, Verabreichungsplan und andere dem medizinischen Praktiker bekannte Faktoren berücksichtigt werden.
Die "wirksame Menge" für hiesige Zwecke ist daher durch solche Betrachtungen bestimmt, wie sie in der Kunst der Impfung bekannt sind, wobei sie wirksam sein muss, um messbare Antivirustiter in Personen, die Adjuvans und Impfstoff erhielten, zu ergeben, in bevorzugter Ausführungsform in Personen, die auf einen Standardimpfstoff nicht ansprechen.
Adjuvans und Impfstoff können zusammen in einer injizierbaren vordosierten Darreichungsform formuliert werden, oder einzeln, wobei man in der Impfkunst bekannte Träger zur subkutanen oder parenteralen, einschließlich intramuskulärer und intraperitonealer Injektion wie auch oral oder nasal verwendet. Die zur Injektion geeigneten pharmazeutischen Rezepturen umfassen sterile wässrige Lösungen oder Dispersionen und sterile Pulver zur Wiederherstellung steriler injizierbarer Lösungen oder Dispersionen. Herkömmliche Verfahren, wie Verabreichung der Kombination Adjuvans-Impfstoff in Tabletten, Suspensionen, Lösungen, Emulsionen, Kapseln, Pulvern, Sirupen oder dergleichen, sind anwendbar. Bekannte Techniken, welche die vorliegende Erfindung oral, nasal oder durch Injektion abgeben, wobei die biologische Aktivität erhalten bleibt, sind bevorzugt.
Um zu bestimmen, ob eine Person, die auf Impfstoffe des Standes der Technik nicht ansprach, und die erfindungsgemäß geimpft wurde, nun erfolgreich immunisiert ist, können Titer bestimmt werden, wie auch Proliferationsassays als Antwort auf das virale Antigen durchgeführt werden, wie im Stand der Technik bekannt.
Von Isoprinosin wurde gezeigt, dass es eine gewisse Wirksamkeit bei der Behandlung letaler Influenza-Belastungen bei Mäusen hat, und, wenn es mit einer subinfektiösen Virusdosis verabreicht wurde, verhinderte es bei nachfolgender Belastung mit Virus die Mortalität (Glasky, 1985). Diese Schutzwirkung wird möglicherweise durch die Adjuvanswirkung von Isoprinosin erklärt.
Die Aktivität von 5'-nucleotidaseresistenten Inosin-5'-monophosphatderivaten, Zunahme des Überlebens und der mittleren Überlebenszeit bei der Influenzabelastung, wie in den Beispielen gezeigt, stellt eine dem Isoprinosin überlegene Wirkung dar. Die Verwendung eines 5'-nucleotidaseresistenten Inosin-5'-monophosphatderivats mit Squalan zur Erzeugung eines 100%-Schutzes vor der letalen Influenzabelastung wurde bisher für keinen Immunstimulator/Immunpotenzierer berichtet. Die Wirkung eines geschützten IMP-Derivats zur Steigerung des Überlebens und der mittleren Überlebenszeit nach Salmonella- und Influenzabelastung (d. h. therapeutische Wirksamkeit) ist einzigartig für jedes vor 5'-Nucleotidase geschützten IMP. Bei diesen infektiösen Belastungen tritt der Tod rasch ein und die Mechanismen, nach denen die geschützten IMP-Derivate wirken, sind nicht aus ihrem immunpharmakologischen Gesamtprofil vorausgesagt. Die Wirkung der 5'-nucleotidaseresistenten Inosin-5'-monophosphatderivaten zur Lebensverlängerung und Steigerung des Überlebens bei Listeria ist für keinen anderen Purin-Immunmodulator berichtet worden.
Eine Hypothese für den Mechanismus des immunstimulatorischen Effekts von 5'-nucleotidaseresistenten Inosin-5'-monophosphatderivaten kann aufgestellt werden, ist aber nicht als Beschränkung der vorliegenden Erfindung auf diese Wirkungsart auszulegen. Neuere Einsichten in die beim Überleben von Infektionsbelastungen beteiligten Schlüsselmechanismen wurden bei Untersuchungen mit fakultativen intrazellulären Pathogenen, wie Toxoplasma, Leishmania und Listeria aufgedeckt (Mossman und Coffman, 1989; Scott, 1991; Haak-Frendocho et al., 1992, Trinchieri, 1993, Tripp et al., 1994, Scott, 1994, Bogdan et al., 1991, Fiorentino et al., 1989). Bei diesem Modell schützen Th1-Zellreaktionen, gefördert durch IL-12 und vermittelt durch IL-2 und γ-IFN und bekämpft (opposed) durch IL-4 und IL-10 Tiere mit Infektionen wie Listeria. Durch IL-4 bis IL-10 vermittelte Th2-Antworten sind mit Letalität bei Infektionen wie Listeria verbunden. Dieses Modell zeigte sich als anwendbar für humane Infektionen mit Mycobacterium leprae (Seiling et al., 1994). Es wird daher vorausgesagt, dass die 5'-nucleotidaseresistenten Inosin-5'-monophosphatderivate durch die Förderung der Th1- vor den Th2-Antworten wirken. Diese Voraussage ist weiter durch die bevorzugte Wirkung der 5'-nucleotidaseresistenten Inosin-5'-monophosphatderivate auf Hypersensitivitätsreaktionen vom verzögerten Typ gegenüber den antikörpervermittelten Reaktionen gestützt (Sosa et al., 1992).
Die Anmelder zeigen in den Vergleichsbeispielen unten, dass MIMP über einen weiten Konzentrationsbereich aktiv bei der Stimulation der Reaktionen von Maus- und Menschlymphozyten auf ein T-Zellmitogen wie PHA, und in stärker veränderlichem Ausmaß, auf B-Zellmitogene wie LPS und Kermesbeere (pokeweed) ist. Die Wirkung von MIMP wird ferner für Reaktionen von angereicherten menschlichen CD4+- und CD8+-Lymphozyten bestätigt. Außerdem zeigen die Ergebnisse, dass die Suppressorwirkung eines HIV-Peptids, IFNα, und PGE2 auf die PHA-Reaktion normaler Lymphozyten umgekehrt werden kann, wenn die Suppression schwach bis mäßig und nicht extrem oder möglicherweise toxisch ist. Die Ergebnisse zeigen auch, dass die Lymphozyten von älteren und HIV-infizierten Personen auf Stimulation durch geschützte IMP in Gegenwart von PHA reagieren können, wenn die Reaktionen nicht extrem supprimiert sind. Die Wirkung des beispielhaften Me-IMP in diesen Untersuchungen scheint die des IMP zu sein, weil die Wirkungen von Me-IMP und IMP in vitro parallel sind.
Die Vorzugswirkung von 5'-nucleotidaseresistentem Inosin-5'-monophosphat auf T-Lymphozyten bezieht eine rezeptorbasierte Wechselwirkung ein. Für Me-IMP wurde gezeigt, dass es Differen zierungsmarker von Prothymozyten (Touraine et al., 1991) induziert, zusätzlich zu den hier für reife T-Lymphozyten beschriebenen Wirkungen.
Die Purinwiederverwendung (salvage pathway) hat wichtige Folgen für Entwicklung und Funktion von T-Lymphozyten. Mängel an sowohl Adenosindeaminase als auch Nucleosidphosphorylase führen zu Immunschwächesyndromen, bei denen funktionierende T-Lymphozyten fehlen. Es kann vorgeschlagen werden, dass ein inosinhaltiges Molekül für Entwicklung und Funktion der T-Lymphozyten essentiell ist. Die Basis für diese Voraussage liegt beim Transferfaktor (Wilson und Fudenberg, 1983). Wenn IMP Teil des Transferfaktorphänomens ist, dann kann geschütztes IMP unspezifische Aspekte der Transferfaktorfunktion nachahmen, vielleicht über einen Rezeptor auf den T-Lymphozyten. Die Anmelder haben bestätigt, dass eine Transferfaktorherstellung in Prothymozyten einen Differenzierungsmarker induziert, d. h. Me-IMP nachahmt (Hadden et al., 1986).
Die Folge, dass geschütztes IMP für die IL-2-Wirkung regulatorisch ist, ist wichtig für die zentrale Rolle, die IL-2 bei der Organisation der durch T-Helferzellen vom Typ Th1 vermittelten zellulären Immunreaktion spielt. In dieser Hinsicht ist zu bemerken, dass PHA, das in den Untersuchungen der Anmelder mit geschützten IMP hauptsächlich verwendete Mitogen, bevorzugt ein Th1-Zytokinmuster auslöst: IL-1, IL-2, γ-IFN und IL-12. Die Anmelder haben gefunden, dass PHA IL-10 induziert, aber nicht IL-3 oder IL-4. Vorläufige Daten zeigen, dass Me-IMP nur eine geringe steigernde Wirkung auf PHA-induziertes IL-2 oder γ-IFN hat, jedoch die IL-10-Produktion mächtig inhibiert. Diese Beobachtungen legen nahe, dass geschütztes IMP auf die Th1-Reaktionen wirkt. Th1-Reaktionen wurden als kritisch für die Resistenz gegen HIV, Krebs und Pathogeninfektion, d. h. Toxoplasma, Listeria und Leishmania einbezogen (Clerici und Shearer, 1995; Teppler, 1993; Scott und Trinchieri, 1989). Daher schließt die begünstigende Wirkung von geschützten IMP für diese Reaktionen die klinische Brauchbarkeit unter solchen Bedingungen ein.
Diese Analyse wird gestützt von in vivo-Untersuchungen mit geschützten IMP, wobei DTH vorzugsweise über PFC-Reaktionen stimuliert wird und in denen das Überleben bei Belastung mit AIDS, Tumoren und Infektionen (Listeria und Salmonella) gesteigert wurde. In diesen Untersuchungen erwies sich Me-IMP als oral aktiv bei Dosen von oder unter 1 mg/kg und war nicht toxisch (orale LD₅₀ > 5000 mg/kg).
Daher sind klinische Anwendungen von geschützten IMP-Verbindungen wie Me-IMP relevant für die Wiederherstellung der Immunität bei sekundärer Immunschwäche, bei denen die Funktion der T-Lymphozyten beeinträchtigt ist, obwohl die Zahl der T-Lymphozyten einigermaßen erhalten ist. Solche Schwächen wurden in den relativ frühen Phasen sowohl von HIV-Infektion (ARC) als auch Krebs beschrieben.
In der frühen HIV-Infektion sind T-Lymphozytenreaktionen als essentiell zur Verhinderung der Progression zu AIDS angesehen worden. Durch Produkte des HIV, darunter gp160, gp41 und TAT (siehe Good et al., 1991 zur Nachprüfung). Neuere Arbeiten legen nahe, dass ein retrovirales Peptid, CKS12, assoziiert mit P-15E, den Übergang Th1 – Th2 durch Hemmen der IL-2- und γ-IFN-Herstellung und Fördern der IL-10-Produktion auslöst (Haraguchi et al., 1995). Die Anmelder haben die Wirkung von Me-IMP zur Umkehrung des immunsuppressiven Effekts eines 17-Aminosäuren-Peptids von gp41, das homolog für CKS-17 ist und fanden Umkehrung wenn die Suppression mild bis mäßig war. Me-IMP verbesserte auch die PHA-Reaktionen von HIV-infizierten Personen. Diese Ergebnisse zeigen, dass geschütztes IMP eingesetzt werden kann, um das Fortschreiten von HIV-infizierten Patienten zu AIDS zu hemmen.
Die vorliegende Erfindung offenbart auch die Verwendung von geschützten IMP bei anderen viralen Infektionen, weil die Im munsuppression alle untersuchten Typen viraler Infektionen behandelt (Rouse und Horohov, 1986). Die Immunsuppression ist wegen der sekundären bakteriellen Infektionen für die hohe Mortalität der Influenza bei älteren und hoch morbiden Personen verantwortlich. Die Produktion von Interferon stellt einen Mechanismus dar, nach dem Virus die Immunität supprimieren können. Die Wirkung geschützter IMP zur Umkehrung der Suppression von IFNα in der PHA-Reaktion empfiehlt diesbezüglich ihre Anwendung.
Bekanntlich supprimieren Entzündung und physikalisches Trauma die zellulären Immunantworten, teilweise durch Prostaglandin vermittelt (Davis und Shires 1986). Die Fähigkeit von MIMP, die suppressive Wirkung von PGE₂ in der PHA-Reaktion umzukehren, stützt seine Brauchbarkeit bei diesen Formen sekundärer Immunschwächen.
Die obige Diskussion liefert eine faktische und theoretische Basis für die Anwendung der 5'-nucleotidaseresistenten Inosin-5'-monophosphatderivate. Die dabei angewendeten Verfahren und die Nützlichkeit der vorliegenden Erfindung kann durch die folgenden Beispiele gezeigt werden.
BEISPIELE
Allgemeine Verfahren
Wenn nicht anders angegeben, wurden die folgenden Materialien und Arbeitsweisen angewendet.
Materialien
Methyl-5'-inosinmonophosphat (Methyl-IMP oder Me-IMP), Methyl-5'-inosinmonophosphonat (Mp-IMP), Ethyl-5'-inosinmonophosphat (Ethyl-IMP oder E-IMP), Arginin-5'-inosinmonophosphat (Arginin-IMP oder Arg-IMP) und Heptamin-1-ol-5'-inosinmonophosphat (Ha-IMP) wurden nach den Synthesebeispielen 1, 2, 3, 4 bzw. 5 hergestellt. Die MIMP-Zubereitungen für die Anwendung in Zellkul turen wurden durch Limuluslysatassay (Whittaker Bioproducts, Walkersville, MD) als endotoxinfrei bestätigt.
Inosin-5'-monophosphat (IMP) und Adenosin-5'-monophosphat wurden von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) bezogen.
Die Lymphozytenmitogene Phytohämagglutinin (PHA), Concanavalin A (Con A) und Pokeweedmitogen (PWM) wurden von Burroughs Wellcome (Research Triangle Park, NC), Sigma Chemical (St. Louis, MO), Gibco (Grand Island, NY) und Murex Diagnostics (Atlanta, GA) wie bezeichnet bezogen.
Schaferythrozyten (SRBC) wurden von Diamedix Corp. (Miami, FL) bezogen. Hank's gepufferte Salzlösung und Meerschweinchenkomplement (guinea pig complement) wurden von Gibco bezogen. Agarose wurde von Bacto (Detroit, MI) und DEAE-Dextran von Sigma (St. Louis, MO) bezogen. Gewebekulturplatten (96 und 6 Näpfchen) wurden von Falcon bezogen. FICOLL-HYPAQUE wurde von Pharmacia Inc. (Piscataway, NY) und E. coli-Lipopolysaccharid (LPS) von Sigma bezogen.
Rekombinantes IL-2 (rIL-2) war ein Geschenk von G. Caspritz von Hoechst Pharmaceuticals (Frankfurt, BRD).
Eine Sequenz mit 17 Aminosäuren aus dem gp41-Abschnitt des gp160-Peptids des humanen Immunschwächevirus (HIV) wurde von M. Strand (Johns Hopkins University, Baltimore, MD) synthetisiert und freundlicherweise zur Verfügung gestellt (Reugg und Strand, 1990).
Prostaglandin E2 wurde von Sigma Chemicals (St. Louis, MO) und rekombinantes Interferon α (IFNα, Intron A) von Schering Corp. (Kenilworth, NJ) bezogen.
Die menschlichen Spender umfassten 22 gesunde Vergleichspersonen (Alter von 20–50), 24 ältere Personen (mittleres Alter 84±1 Jahre), 8 HIV-infizierte Patienten vor AIDS (CDC-Klasse II, mittlere CD4-Zahl 544) und 8 AIDS-Patienten (mittlere CD4- Zahl 40).
Subpopulationen CD4+ und CD8+ menschlicher Lymphozyten wurden von normalen Vergleichspersonen unter Anwendung kommerzieller Panning-Technik (Applied Immune Sciences, Santa Clara, CA) erhalten.
Zellkultur
Alle sich auf die Zellkultur beziehenden Schritte wurden unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Es wurden allgemeine, hier nicht beschriebene Verfahren der Zellimmunologie ausgeführt, wie sie in Monographien der zellimmunologischen Verfahren beschrieben sind, wie Mishell und Shiigi, Selected Methods in Cellular Immunology, W.H. Freeman & Co. (New York 1981) und in Stites und Terr, Basic Clinical Immunology, 7. Auflage, Appleton und Lange (Norwalk, CT, 1991).
Lymphozytentransformation
In vitro: Es wurden sowohl Lymphozyten aus dem humanen peripheren Blut (HPBL) als auch aus der Mäusemilz (MSL) eingesetzt. Die Proliferation wurde durch inkorporiertes tritiiertes Thymidin gemessen, wie von Hadden et al. (1975) und Hadden et al. (1986) beschrieben. Für die HPBL-Transformation wurden PHA und PWM mit 0,5 μg/ml angewendet. Zur MSL-Transformation wurde Con A mit 0,5 μg/ml, Phytohämagglutinin (PHA, Murex Diagnostics, Atlanta, GA) mit 0,5 μg/ml und Lipopolysaccharidendotoxin (LPS, Sigma, St. Louis, MO) mit 10 μg/ml verwendet. Wenn geschützte IMP-Derivate zugesetzt wurden, wurden sie am Start der Kultur mit unterschiedlichen Konzentrationen von 0,1 μg/ml bis 100 μg/ml zugesetzt.
Mausmilzzellen wurden aus 4–12 Monate alten BALB/c-Mäusen nach Standardverfahren (Hadden et al., 1975) erhalten. Sie wurden in Mikrotüpfelplatten mit 1,5·10⁶ Zellen/ml in Minimal Essential Medium (MEM, Gibco Labs, Grand Island, NY) mit 5 fötalem Kalbsserum (FCS, Hyclone Labs, Logan, UT) kultiviert und auf ihre proliferative Reaktion gegenüber Mitogenen geprüft, die durch Inkorporieren von (³H)tritiiertem Thymidin (New England Nuclear, Wilmington, DE, 6,7 μCi/mmol; 2,5 μCi/ml) während eines Abschlußpulses mit nachfolgender Flüssigszintillationsspektrometrie gemessen wurde. Humane Zellen wurden mit 10⁹/ml ausgesät und 48 h mit einem 18 h-Puls ³H-Thymidin kultiviert.
In vivo: Die Verbindungen wurden oral, durch Sonde oder intraperitoneal verabreicht. Am Schluß wurde die Milz entnommen wie in Florentin et al. (1982) beschrieben und Zellen für die Proliferationsreaktion mit Con A = 0,5 μg/ml, PHA = 0,5 μg/ml oder LPS = 0,5 μg/ml präpariert.
Antikörperbildende Zellen
Direkte antikörperbildende Zellen der Mäusemilz (PFC) wurden nach dem etwas abgewandelten Verfahren von Jerne et al. (1963) bestimmt. Kurz: Eine Gruppe von Mäusen wurde intraperitoneal mit SRBC geimpft, und die interessierenden Verbindungen wurden oral oder intraperitoneal, wie in den Ergebnissen angegeben, verabreicht. Fünf Tage später wurden Suspensionen der Milzzellen hergestellt und ihre Lebensfähigkeit mit dem Trypanblau-Ausschlusstest geprüft. Die Zellen wurden bei 3·10⁶ suspendiert. 0,2 ml der Milzzellsuspension wurde mit 0,8 ml 0,7proz. Agarose und 0,2 ml frisch gewaschenen SRBC (bei 6·10⁵/ml) gemischt. Das Gemisch wurde sofort auf die Platte gegossen und erstarren lassen. Nach 60 min Inkubation bei 37°C in einer feuchten Atmosphäre mit 5% CO₂ in Luft wurde die Platte mit 1 ml Meerschweinchenkomplement, verdünnt 1:5 mit Hank's gepufferter Salzlösung übergossen. Die hämolytischen Plaques wurden mit einem Umkehrmikroskop (inverted scope) mit vierfacher Vergrößerung ausgezählt.
Statistische Analyse
Jeder Versuch wurde 2–10 Mal ausgeführt, wie angegeben. Man verwendete Vierfachproben von jedem Spender bei jeder Konzentration. Die Daten werden als Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) für einzelne repräsentative Versuche oder als Verhältnis zum Vergleich ± SEM für zusammengefasste Daten ausgedrückt. Die Daten wurden mittels Student's t-Test auf statistische Signifikanz geprüft, wenn nicht anders angegeben.
Immunoassay-Arbeitsverfahren
Im Sllgemeinen wurden Immunassays, entweder EIAs oder RIAs, mit handelsüblichen Sätzen wie angegeben durchgeführt. Alternativ kann ein EIA entwickelt werden, wie es dem Fachmann bekannt ist. Es können polyklonale und monoklonale Antikörper hergestellt und in den Assays verwendet werden. Die Standardtechnologie zur Antikörperherstellung ist dem Fachmann wohlbekannt und ist wie allgemein beschrieben in Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1988. Wenn angebracht, können andere Immunassays, wie Radioimmunassay (RIA), verwendet werden, wie sie dem Fachmann bekannt sind. Verfügbare Immunassays sind in der wissenschaftlichen und Patentliteratur ausführlich beschrieben. Siehe z. B. die US-Patente 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3, 850, 578; 3, 853, 987; 3, 867, 517; 3, 879, 262; 3, 901, 654; 3, 935, 074; 3, 984, 533; 3, 966, 345; 4, 034, 074; 4, 098, 876; 4,879,219 und 5,011,771; wie auch Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989.
Allgemeine Verfahren für Untersuchungen mit intrazellulären Pathogenen
Je nach dem zu untersuchenden Pathogen wurden verschiedene Mäusestämme verwendet. Zur Prüfung von Salmonella und Listeria wurden männliche BALB/c-Mäuse mit 14–16 g verwendet. Für die Reaktionen auf das Influenzavirus wurde der NMRI-Stamm der Maus verwendet. Die Mäuse wurde von Animal Laboratory, Academy of Medical Science, Russland, bezogen und wurden in den hier be schriebenen Beispielen 11–13 verwendet.
Allgemeine Verfahren für Untersuchungen mit Hepatitis-Impfstoffen: Tiere
Verschiedene Mäusestämme, durch das Pre-S2-Zone-S-Gen HBV für ihre Immunreaktion auf Protein kodiert und in der folgenden Haplotyp-Reihenfolge angeordnet: (Benaceraf und McDevitt, 1972): H – 2^b > H – 2^d > H – 2^s > H – 2^k > H – 2^f. DBA/2-Mäuse erzeugen keine Antikörper gegen hohe Spiegel von HBsAg, wenn sie mit dem Antigen allein behandelt werden (Walker et al., 1981). Daher wurden männliche DBA/2-Mäuse von 16–18 g von Animal Laboratory, Academy of Medical Science, Russland, bezogen und in den hier ausgeführten Beispielen verwendet. Diese Mäuselinie wurde gewählt, da sie auf Hepatitis B-Impfstoff schlecht ansprechen.
Bestrahlungsprotokoll
Versuchsmäuse wurden mit einer Dosisleistung von 25 rad/min (1 rad = 0,01 Gy) mittels einer 60Co-γ-Strahlenquelle 4 min lang bestrahlt. Die Daten stellen den Mittelwert für 10 Tiere in jeder Gruppe dar.
Immunassayverfahren
Serumproben von geimpften Mäusen wurden auf Gegenwart von Anti-HBs in einem Enzymimmunassay (EIA) unter Verwendung der Diagnosekits von Roche Diagnostica nach den Anweisungen des Herstellers geprüft. Der Anti-HBs-EIA-Kit (Roche) hat eine Empfindlichkeit von < 10 IU/l.
Die Antikörperkonzentration wurde mittels Eichkurven bestimmt, die auf der Basis von Ergebnissen der Anti-HBs-Bestimmung in einer Reihe Standardsera (Roche Diagnostica) mit folgenden Konzentrationen aufgestellt worden war: 10 IU/l, 50 IU/l, 100 IU/l und 150 IU/l. Die Ergebnisse der zwei Versuche wurden zur Be rechnung von Mittelwerten verwendet.
Protokoll für die Verabreichung von geschützten IMP und HBsAg
HBsAg wurde mit einer Dosis von 16 mg/Maus in 0,2 ml PBS (pH 7,4) zweimal im Abstand von zwei Wochen zwischen den Injektionen verabreicht.
Ein geschütztes IMP, MIMP, wurde sowohl oral als auch intraperitoneal mit einer Dosis von 50 mg/kg verabreicht.
Es wurden drei Schemata der Verabreichung von MIMP angewendet:
Schema #1: MIMP wurde oral durch Sonde 30 min vor Einführung des HBsAg gegeben.
Schema #2: HBsAg und MIMP wurden intraperitoneal gegeben.
Schema #3: HBsAg und MIMP wurden einmal intraperitoneal gegeben und danach wurde MIMP vier Tage lang oral verabreicht.
SYNTHESEBEISPIEL 1 (VERGLEICH)
Methyl-5'-inosinmonophosphat
Methyl-5'-inosinmonophosphat wurde durch Reaktion von Inosin-5'-monophosphat mit Methanol unter Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid als Kondensierungsmittel hergestellt.
Zu einer Lösung von Inosin-5'-monophosphat (2,2 g, 6 mmol) in Methanol (300 ml) wurden Tributylamin (1,4 ml, 12 mmol) und Dicyclohexylcarbodiimid zugesetzt. Die Lösung wurde 4 Tage bei 25°C gehalten und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Eine Lösung von 2,3% NaOH (20 ml, 11,4 mmol) wurde zum Rückstand gegeben und die resultierende Suspension wurde filtriert. Der Niederschlag wurde mit Wasser (20 ml) gewaschen und verworfen. Das Filtrat wurde dreimal mit Ether extrahiert, auf eine Säule mit 50 g Amberlite IR/20 PLUS (NH₄ ⁺-Form) gegeben und mit Wasser eluiert. Die UV absorbierenden Fraktionen wurden unter vermindertem Druck eingedampft und der resultierende Sirup in Methanol (20 ml) gelöst. Die Lösung wurde auf Azeton (300 ml) gegossen, die resultierende Suspension mit Azeton und Ether gewaschen, im Vakuum über P₂O₅ getrocknet und ergab 1,4 g (68%) eines pulvrigen Produkts, Smp. 145°C, UV λmax 249 nm (pH 5, 5, H₂O) und 253 nm (pH 10).
Analyse: Berechnet für C₁₁H₂₀N₅O₉P (MG 397,24):
C, 33, 25, H 5, 07, N 17, 63;
gefunden C 33,31, H 5,13, N 17,34; C, 33,36, H 5,13, N 17, 34.
NMR-Daten DMSO-d₆: 3,50 (s, 3H, CH₃OP), 3,20-4,70 (m, 7H, Ribose), 5, 94 (d, 1H, Anomer J-6Hz), 8, 12 (s, 1H, C-2), 8, 40 (s, 1H, C-8), 8, 20 (br s 5H, NH (CO) und NH₄).
SYNTHESEBEISPIEL 2
Methyl-5'-inosinmonophosphonat
Methyl-5'-inosinmonophosphonat wurde durch Reaktion von 2',3'-Isopropylideninosin mit Methylphosphonsäuredichlorid und nachfolgender Deblockierung des Nukleotids hergestellt.
Zu einer kalten Mischung von 2',3'-Isopropylideninosin (2 g, 6,49 mmol) in 50 ml trockenem Pyridin wurde bei 10°C Methylphosphonsäuredichlorid (0,86 g, 6,49 mmol) tropfenweise zugesetzt. Nach 18 h Rühren der Mischung wurden Eis und Wasser zugegeben und man erhielt das geschützte Nukleotid. Die Hydrolyse des blockierten Nukleotids erfolgte mit Ameisensäure. HPLC wurde mit H₂O/Methanol durchgeführt. Die geeigneten Fraktionen wurden unter vermindertem Druck eingedampft und man erhielt Methy-5'-inosinmonophosphonat.
SYNTHESEBEISPIEL 3
Ethyl-5'-Inosinmonophosphat
Ethyl-5'-Inosinmonophosphat wurde in ähnlicher Weise zu Synthesebeispiel 1 hergestellt, jedoch wurde Inosin-5'-monophosphat mit Ethanol unter Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid als Kondensierungsmittel zur Reaktion gebracht.
SYNTHESEBEISPIEL 4
Arginin-5'-inosinmonophosphat
Arginin-5'-inosinmonophosphat wurde durch Reaktion von Inosin-5'-monophosphat mit Arginin und Dicyclohexylcarbodiimid als Kondensierungsmittel hergestellt.
Zu einer Lösung von Inosin-5'-monophosphat (0,55 g, 0,15 mmol) in Formamid (3 ml) wurde L-Argininbase (1,04 g, 6 mmol) zugesetzt. Zu der Mischung wurde Dicyclohexylcarbodiimid (1,6 g, 7,5 mmol) in t-Butanol (10 ml) zugesetzt und die resultierende Suspension wurde 8 h auf 80°C erhitzt.
Der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert, dreimal mit Wasser gewaschen und die vereinigten Filtrate zur Entfernung des t-Butanols eingedampft. Die Lösung wurde dreimal mit gleichen Volumina Ether extrahiert und im Vakuum zu einem Sirup eingedampft. Nach Zusatz von Ethanol (30 ml) wurde der resultierende Niederschlag abfiltriert und ergab ein sehr hygroskopisches gummiartiges Material. Nach 10 d Stehen wurde das gummiartige Material fest, Smp. 130°C. UV λmax 249 nm (H₂O).
SYNTHESEBEISPIEL 5
Heptamin-1-ol-5'-inosinmonophosphat
Heptamin-1-ol-5'-inosinmonophosphat wurde durch Reaktion von Inosin-5'-monophosphat mit 6-Amino-2-methyl-2-heptanol und Dicyclohexylcarbodiimid als Kondensierungsmittel hergestellt.
Zu einer Lösung von Inosin-5'-monophosphat-monohydrat (1,045 g, 3 mmol) in Formamid (5 ml) wurde 6-Amino-2-methyl-2-heptanolhydrochlorid zugesetzt. Eine Lösung von Dicyclohexylcarbodiimid (6,22 g, 30 mmol) in Butanol (25 ml) wurde dem Gemisch zugesetzt. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde unter Rühren 8 h auf 80–90°C erhitzt. Der entstandene Niederschlag wurde filtriert und dreimal mit 5 ml Wasser gewaschen. Der Niederschlag von Dicyclohexylharnstoff wurde verworfen und das vereinigte Filtrat wurde eingedampft, um Butanol zu entfernen. Die Lösung wurde dreimal mit Ether extrahiert und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der ölige Rückstand wurde in Azeton suspendiert und ergab en weißes hygroskopisches Material. Es wurde durch Lösen in Wasser und Behandlung mit Aktivkohle gereinigt, dann in Azeton gefällt und ergab ein weißes hygroskopisches Material. UV λmax 249 nm (H₂O).
Ausbeute des gereinigten Materials 0,7 g (53,4%), Smp. 95°C, mit der Summenformel C₁₈H₂₈N₅O₈P: P berechnet 7,03, gefunden 5,81.
SYNTHESEBEISPIEL 6
Hepatitis B-Virusoberflächenantigen (HBsAg)
Hepatitis B-Oberflächenantigene (HBsAG; Subtyp ad und ay) wurden aus Blutplasma von Antigenträgern nach folgendem Schema gereinigt:

(1) HBsAg enthaltendes Blutplasma wurde anfänglich mit zwei Volumenteilen physiologischer Kochsalzlösung verdünnt und im Wasserbad 60 min auf 80°C erhitzt. Das gebildete Gerinnsel wurde entfernt und mechanisch zerrissen und die denaturierten Proteine durch Zentrifugieren entfernt.
(2) Das HBsAg wurde dann mit Polyethylenglykol M 6000 mit einer Endkonzentration von 15% (Gewicht/Volumen) wieder gefällt. Der HBsAg enthaltende Niederschlag wurde gegen 0,9 mol/l NaCl dialysiert und mit Pepsin (100 mg/ml) und Tween 80 (Endkonzentration 2%) behandelt.
(3) Die erhaltene HBsAg-Lösung wurde zweimal mit linearem Sucrosegradienten ultrazentrifugiert. Die gereinigte HBsAg-Zubereitung wurde gegen 0,9 mol/l NaCl dialysiert, in 1 ml-Volumina aliquotiert und bei –60°C eingefroren.
(4) Nach 50 bis 100fachem Auf konzentrieren hatte die resultierende Zubereitung folgende Eigenschaften: Sie bestand nur aus sphärischen Teilchen mit 18–25 nm Durchmesser und war frei von DAME-Teilchen oder fädigen Teilchen von HBsAg. In Tests auf HBeAg (EIA-Kit von Abbott Laboratories), DNA-Polymerase, HBV-DNA nach dem Verfahren der gerichteten Verstärkung und auf die Gegenwart von charakteristischen Proteinen des normalen humanen Blutserums erhielt man negative Ergebnisse.

Die erhaltene Zubereitung diente als Grundlage für die Ausarbeitung von Versuchsansätzen von Hepatitis B-Impfstoff.
Alternativ ist Hepatitis B-Impfstoff von SmithKline Beecham Biologicals erhältlich und HBsAG kann von Sigma gekauft werden.
BEISPIEL 1
Prüfung auf Schutz vor 5'-Nucleotidaseaktivität
Die Fähigkeit von 5'-Nucleotidase (aus Crotalus atrox-Gift, Sigma Chemical Co., St.Louis, MO), IMP und andere Verbindungen zu hydrolysieren wurde durch Messung der Freisetzung von anorganischem Phosphat nach dem Verfahren von Ames et al. (1960) geprüft. Nukleotidproben (40–60 nmol) wurden bei 37°C 10 min mit 0,02 Einheiten 5'-Nucleotidase in einem Gesamtvolumen von 100 μl, enthaltend 50 mmol HEPES, pH 7, 3, und 5 mmol MgCl₂, inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Zusatz von 800 μl 0,42 Natriummolybdat in 1 n H₂SO₄:10% Ascorbinsäure (6:1, v/v) und dann 0,3 ml H₂O·KH₂PO₄ abgebrochen; Standards (2–80 nmol) wurden gleich behandelt. Proben und Standards wurden bei 45°C 20 min inkubiert. Phosphat wurde durch Extinktion bei 820 nm bestimmt. Zur Korrektur für nichtenzymatische Hydrolyse wurden Leerproben, bestehend aus Nukleotid ohne Enzym, parallel geprüft. Der hydrolysierte Anteil in % wurde aus der genauen Menge Nukleotidsubstrat berechnet, die durch UV-Extinktion unter Anwendung des Extinktionskoeffizienten e = 12,2 bei 249 nm bestimmt wurde. Die Ergebnisse von vier Versuchen sind in Tabelle 1A zusammengestellt.
Tabelle 1A
Empfindlichkeit von Verbindungen gegen 5'- Nucleotidaseangriff
Die getesteten Materialien wurden als unterschiedlich resistent gegenüber Abbau durch 5'-Nucleotidase befunden. Ha-IMP und Arg-IMP zeigten geringe bzw. mäßige Widerstandsfähigkeit gegen Hydrolyse, während sowohl Me-IMP als auch Mp-IMP außerordentlich resistent gegen Hydrolyse waren, wie auch E-IMP. Keines der 5'-IMP-Derivate inhibierte die Hydrolyse von IMP, was zeigt, dass die Verbindungen nicht per se 5'-Nucleotidaseinhibitoren sind.
Es wurde eine weitere Versuchsreihe durchgeführt, in der IMP, MIMP und Adenosin-5'-monophosphat (AMP) auf Empfindlichkeit gegen Abbau durch 5'-Nucleotidase geprüft wurden. Das Protokoll war wie oben, außer dass die ersten Inkubation 20 min in einem Gesamtvolumen von 200 μl, 0,1 mmol/l HEPES und 10 mmol/l MgCl₂, war. Jede Bestimmung der % Hydrolyse der Nukleotide wurde doppelt ausgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1B angegeben.
Tabelle 1B
Prozent Hydrolyse durch 5'-Nucleotidase
Diese Daten zeigen, dass der immunstimulierende Effekt von 5'-IMP-Derivaten eine Funktion der Resistenz des substituierten 5'-IMP gegen Hydrolyse und nicht die Art der speziellen Substitution ist.
BEISPIEL 2
UNTERSUCHUNGEN MIT LYMPHOZYTEN DES HUMANEN PERIPHEREN BLUTS
Reaktion normaler HPBL auf Mitogenstimulation
Normale Lymphozyten des humanen peripheren Bluts (HPBL) wurden mit den Mitogenen PHA oder PWM stimuliert. In einer Versuchsreihe wurden Ha-IMP, Arg-IMP, E-IMP, Me-IMP, Mp-IMP und Inosin-5'-monophosphat über einen Konzentrationsbereich von 0,1, 1, 10 und 100 μg/ml auf ihre stimulierende Wirkung für diese Reaktion untersucht. Während die einzelnen Blutspender in ihren Reaktionen auf diese Mitogene und die interessierenden Verbindungen variierten, stimulierten alle fünf IMP-Derivate übereinstimmend die Reaktion der HPBL auf PHA, wie in 1 gezeigt. IMP per se zeigte Aktivität vergleichbar zu Me-IMP. Ha-IMP war niedrig, während Arg-IMP, Me-IMP und E-IMP aktiver waren, und Mp-IMP war die aktivste Verbindung. Die geprüften Verbindungen zeigten geringe oder keine Wirkung auf die PWM-Reaktion. Keine der Verbindungen stimulierte HPBL in Abwesenheit von Mitogen. Das die PHA-Reaktion die Proliferation von T-Lymphozyten und die PWM-Reaktion die von B-Lymphozyten widerspiegelt, zeigen die Ergebnisse, dass die 5'-substituierten IMP-Derivate bevorzugt die Reaktion der T-Lymphozyten potenzieren. Als Beispiel wird in den folgenden Versuchen Me-IMP (MIMP) verwendet.
In 2 sind die Ergebnisse der Reaktion von HPBL zweier Spender auf PHA in vitro in Gegenwart von IMP und MIMP dargestellt. Wieder wurden die Reaktionen von Vergleichslymphozyten dreier normaler Spender auf Stimulation mit PWM über einen Konzentrationsbereich durch MIMP nicht beeinflusst.
Lymphozyten des humanen peripheren Bluts sind im Mittel 80% T-Lymphozyten und 20% B-Lymphozyten, und von den T-Lymphozyten sind 2/3 vom CD4+-Helfer/Induktor-Phänotyp und 1/3 sind von CD8+-Suppressor/zytotoxischen Phänotyp. Anreicherung der CD4+- oder CD8+-T-Zellen kann durch Verminderung des anderen Phänotyps (> 98%), Entfernung unter Anwendung der Adhäsion an mit monoklonalen Antikörpern beschichteten Kolben (panning) erzielt werden. Eine solche Anreicherung wurde mit drei normalen Vergleichen (zusammengefasste Daten) eingesetzt und 3 zeigt die Wirkung von MIMP auf diese zwei Zellpopulationen. Die PHA-Reaktionen von CD4+- und CD8+-Lymphozyten werden durch MIMP wesentlich gesteigert (p < 0,01 für die Reaktion jeder der drei Personen).
Reaktionen von HPBL auf Suppression durch ein von HIV abgeleitetes Peptid, Interferon α und PGE₂
Ein synthetisches Peptid mit 17 Aminosäuren, welches die immunsuppressive Stelle des Intermembranabschnitts gp91 des humanen Immunschwächevirus (HIV) darstellt, wurde an Lymphozyten aus Vergleichen geprüft. Einer von fünf repräsentativen Versuchen ist in 4 gezeigt, wobei dieses Peptid eine progressive Hemmung der PHA-induzierten Lymphozytenproliferation mit einer maximalen suppressiven Dosis von 100 mmol/l induzierte. Die Wirkung von MIMP von 0,1–100 μg/ml wurde in Kombination mit unterschiedlichen Hemmungsgraden durch das Peptid untersucht. Wenn die peptidinduzierte Suppression kleiner als 50% war, brachte MIMP die Proliferationsreaktion in nahezu den normalen Bereich zurück, war die Hemmung jedoch stärker (> 50%), war die Wirkung von MIMP nicht signifikant. Diese Daten zeigen, dass MIMP die immunsuppressive Wirkung von HIV-verbundenem Peptid zurückführen kann, wenn die Wirkung schwach bis mäßig, aber nicht, wenn sie schwerwiegend ist.
Virusinfektionen sind mit verminderten lymphoproliferativen Reaktionen verbunden. 5 zeigt die Wirkung eines virusinduzierten Mediators, rIFN-α, zur Hemmung der in vitro PHA-Reaktion der Lymphozyten aus Vergleichen und die Wirkung von MIMP bei 1, 10 und 100 μg/ml zur Aufhebung der Hemmung, wenn sie mäßig ist, d. h. bei der Konzentration von 10 und 100 Einheiten/ml IFN-α.
Entzündung wie bei rheumatoider Arthritis ist mit verminderter lymphoproliferativer Reaktion verbunden. 6 zeigt die Wirkung eines Entzündungsmediators, PGE₂ (bei 10^–5 mol/l) zur Hemmung der PHA-Reaktion normaler Lymphozyten und die Wirkung von MIMP zur Aufhebung der Hemmung.
Reaktionen der HPBL von älteren und HIV-infizierten Personen
7 stellt die PHA-Reaktionen von drei älteren und HIVinfizierten Personen und die Wirkung der Stimulation mit 100 μg/ml MIMP gegenüber normalen Vergleichen (C) dar. Die Vergleichspatienten (22) hatten normale PHA- und MIMP-Reaktionen. Fünfzehn ältere Patienten (Ag+) hatten normale PHA- und MIMP-Reaktionen. Neun ältere Patienten (Ag–) hatten deutlich verminderte Reaktionen auf PHA und auch auf MIMP. Von den neun scheinbar gesunden älteren Patienten, die auf PHA schlecht reagierten, wurden fünf auf Lymphozytenzahl untersucht und waren im Mittel normal.
Acht HIV-infizierte Personen (ARC) hatten im Mittel 50% der mittleren normalen PHA-Reaktion und zeigten beträchtliche Reak tion auf MIMP. Acht AIDS-Patienten zeigten keine Reaktion. Diese Daten deuten an, dass klinische Patienten zur MIMP-Behandlung vor der Behandlung auf Empfindlichkeit für den Arzneistoff in vitro vorgetestet werden sollten.
Das obige Versuchsprotokoll wurde mit Mp-IMP bei 10 und 100 μg/ml wiederholt und ergab die gleichen Ergebnisse wie MIMP bei 100 μg/ml.
BEISPIEL 3
UNTERSUCHUNGEN MIT MILZLYMPHOZYTEN DER MAUS
MSL wurden mit den Mitogenen Con A und LPS stimuliert. In einer Versuchsreihe über einen Konzentrationsbereich von 0,1, 1, 10 und 100 μg/ml wurden Ha-IMP, Arg-IMP, E-IMP, Me-IMP, Mp-IMP und IMP auf ihre Wirkung zur Stimulation dieser Reaktionen untersucht. Wie in 8 gezeigt, stimulierten Ha-IMP, Arg-IMP, E-IMP, Me-IMP, Mp-IMP und IMP die Proliferationsreaktion von MSL auf Con A.
Vergleicht man Daten der Lymphozyten für Maus (8) und Mensch (1), dann sind humane Lymphozyten empfindlicher für diese Verbindungen als Mauslymphozyten.
In einem weiteren Versuch wurden Maussplenozyten mit PHA oder LPS und MIMP (1–100 μg/ml) inkubiert. MIMP beeinflußte die Splenozytenreaktion in Abwesenheit von Mitogen nicht. In Gegenwart von Mitogen steigerte MIMP progressiv und signifikant die Proliferationsreaktion der Lymphozyten, wie durch Inkorporierung von tritiiertem Thymidin gemessen (siehe unten). Die Reaktion der Splenozyten auf PHA spiegelt bevorzugt die Reaktion der T-Lymphozyten wider und bestätigen die mit Con A beobachteten Reaktionen. Auch die LPS-Reaktionen laufen mit dem vorangehenden Versuch parallel.
Die Daten wurden von vier verschiedenen Tieren erhalten und Stellen Vierfachproben für jede Konzentration dar. Sie sind als CPM ± SEM ausgedrückt, wobei * eine Signifikanz von p < 0,05 und ** von p < 0,01 anzeigt.
BEISPIEL 4
In vivo Stimulation der PFC-Reaktion
Intraperitoneal (ip) verabreicht
Um festzustellen, ob die Verbindungen in vivo Lymphozyten stimulieren, wurden Mäuse mit Schaferythrozyten (SRBC), 1·10⁸ Zellen, und 50 mg/kg Körpergewicht von Ha-IMP, Arg-IMP, Me-IMP oder IMP ip-geimpft, und die Plaqueantikörper bildenden Zellen der Milz (PFC) wurden fünf Tage später gemessen. Ha-IMP, Arg-IMP und Me-IMP stimulierten die PFC-Reaktion signifikant (wie in 9 Gezeigt). IMP wurde in drei Versuchen bei 50 mg/kg Körpergewicht den Vergleichen gegenübergestellt und hatte keine signifikante Wirkung (IMP: 12 Proben mit mittlerer PFC-Zahl 197 ± 21, Vergleich: 15 Proben mit mittlerer PFC-Zahl 210 ± 17). Dies zeigt, dass IMP in vivo nur aktiv ist, wenn es vor der Aktivität der 5'-Nucleotidase geschützt ist.
Dosis-Wirkung-Daten für Ha-IMP, Arg-IMP und Me-IMP auf die PFC-Reaktion wurden entwickelt wie in 10A, 10B bzw. 10C gezeigt. Alle drei Verbindungen stimulierten optimal bei 50 mg/kg Körpergewicht, jedoch war Me-IMP bei geringeren Dosen aktiv.
Im Gegensatz schien bei den in vitro-Daten zur Proliferation von Mauslymphozyten Me-IMP die wirksamste der geprüften Verbindungen zu sein.
Orale Verabreichung
Um festzustellen, ob es bei oraler Verabreichung Aktivität gibt, wurden Mäuse intraperitoneal mit 1·10⁸ Schaferythrozyten (SRBC) und oral mit Me-IMP geimpft. Das Me-IMP wurde zum Zeitpunkt der Impfung mit dem SRBC-Antigen verabreicht und danach täglich über fünf Tage. Plaqueantikörper bildenden Zellen der Milz (PFC) wurden am Ende der fünf Tage gemessen. 11 zeigt die Ergebnisse für verschiedene Dosismengen des Me-IMP.
Oral mit dem SRBC-Antigen und über fünf Tage täglich gegebene Mehrfachdosen Me-IMP stimulieren die PFC-Reaktion mit einer Spitze bei 50 mg/kg Körpergewicht.
BEISPIEL 5 (Vergleich)
In vitro-Reaktion auf Mitogene nach in vivo-Verabreichung des Me-IMP
Ein Parallelversuch zu Beispiel 4 bestätigt, dass sowohl die PHA- als auch die Con A-Reaktion von Milzlymphozyten durch orale Verabreichung von Me-IMP stimuliert werden.
Von Mäusen, die fünf Tage lang Me-IMP, Bereich von 0–100 mg/kg Körpergewicht, oral verabreicht bekommen hatten und dann getötet worden waren, wurden Milzlymphozyten gewonnen. Die Milzlymphozyten wurden mit PHA (0,5 μg/ml) oder Con A (0,5 μg/ml) 48 h inkubiert. Die Kulturen wurden mit tritiiertem Thymidin über die letzten 18 h gepulst. 12 zeigt die Ergebnisse für verschiedene orale Dosismengen des Me-IMP.
Diese Daten zeigen, dass die 5'-IMP-Derivate im Gegensatz zu IMP wirksame Adjuvantien für eine T-zellabhängige Antikörperreaktion sind und, im Fall des Me-IMP, ein wirksames Stimulans der Proliferationsreaktionen der T-Lymphozyten.
Bei den verwendeten Dosen war Me-IMP sowohl parenteral als auch oral aktiv und anscheinend nicht toxisch. Die akute Toxizität (LD50) des Me-IMP war intraperitoneal größer als 500 mg/kg Körpergewicht und oral größer als 5000 mg/kg Körpergewicht.
BEISPIEL 6 (Vergleich)
Stimulation der Delayed-Type Hypersensitivity in vivo
Durch intraperitoneale Verabreichung von SRBC in abgestuften Dosen von 10⁶ bis 10⁹ Zellen wurden Mäuse geimpft. Vorversuche zeigten, dass eine optimal immunisierende Dosis von SRBC für Delayed-type Hypersensitivity zwischen 10⁷ und 10⁸ Zellen lag. Bei diesem Versuch wurde eine Dosis von 10⁷ zur Impfung der Tiere gewählt.
Vier Tage nach der Impfung wurde jede Maus durch subkutane Injektion von 108 SRBC in 50 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in die linke hintere Fußsohle belastet. Die Trägerlösung (50 μl PBS) wurde zum Vergleich in die rechte hintere Fußsohle subkutan injiziert. Die zu prüfenden Verbindungen wurden intraperitoneal entweder zum Zeitpunkt der Impfung oder der Belastung injiziert. Nach 24 h Belastung wurde die Schwellung der Fußsohle als Dickenzunahme (links minus rechts) unter Verwendung einer Schieblehre (Engineer's calipers) gemessen. Die Ergebnisse sind als Zuwachs der Fußsohlendicke in 0,1 mm-Einheiten ausgedrückt. Die Eigenschaften der so gemessenen Delayed-type Hypersensitivity wurden bereits in MacDonald et al. (1979) beschrieben. 13 und 14 zeigen die Ergebnisse dieser Prüfung. Insbesondere zeigt 13 ein Dosis-Wirkung-Diagramm für Me-IMP bei Verabreichung zur Zeit der Impfung. 14 zeigt die Reaktion für Me-IMP bei Verabreichung zur Zeit der Impfung (immunization) und zur Zeit der Belastung (challenge).
Wenn das Me-IMP als Einzeldosis zur Zeit der Impfung verabreicht wurde, stimulierte es signifikant die Delayed-type Hypersensitivity-Reaktion. Wurde es als Einzeldosis zur Zeit der Belastung verabreicht, war seine Wirkung nicht signifikant. Diese Daten zeigen, dass Me-IMP die zelluläre Immunität fördert, vermutlich durch eine Wirkung auf das hinführende Glied der Immunreaktion, die T-Helferzellen. Dies tut es bei niedrigeren Dosen als jene, die die Antikörperproduktion steigern, was auf einen bevorzugten Effekt auf DTH und daher auf Th1-Zellen hinweist, die die Reaktion vermitteln.
BEISPIEL 7 (Vergleich)
In vivo-Behandlung mit geschützten IMP-Derivaten
Friend's Leukämievirus (FLV)
Um die klinische Nützlichkeit der immunmodulierenden geschützten IMP-Derivate zu demonstrieren, wurden BALB/c-Mäuse mit Friend's Leukämievirus (FLV) infiziert. Vergleichsmäuse wurden vom Tag 3 bis zum Tag 13 nach der Infektion intraperitoneal mit Salzlösung behandelt, und die mit Me-IMP behandelten Mäuse wurden vom Tag 3 bis zum Tag 13 mit 1 mg/kg/Tag behandelt, und der Todestag wurde notiert. 15 zeigt, dass die mit Me-IMP behandelten Mäuse eine längere mittlere Überlebenszeit (MST) hatten, die im Wilcoxon-Test statistisch signifikant (P < 0,004) war.
Tumorträger
Um die Wirkung von Me-IMP auf tumortragende Tiere zu prüfen, wurden Gruppen (6) von "swiss mice" subkutan nach dem Verfahren von Carswell et al. (1975) mit Meth A-Tumor geimpft. Nach 8 Tagen, wenn die Tumore etwa 8 mm groß waren, wurden die Tiere intravenös mit einer Grunddosis von verschiedenen Mengen Me-IMP oder gleichen Volumina Salzlösung behandelt. Fünf Stunden später wurden die Tiere intravenös mit 10 μg Lipopolysaccharidendotoxin (LPS) behandelt. Die Spiegel des Tumornekrosefaktors (TNF) wurden im Serum nach 24 h analysiert und die Tumornekrose (- bis +++) wurde 48 h nach der Behandlung bewertet. Am Tag 20 wurde die komplette Tumorregression bewertet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2
Tabelle 2 zeigt, dass Me-IMP (100) allein oder LPS (10) allein keine signifikante Wirkung auf Tumornekrose (alle + oder –), Tumorregression (0/12) oder Überlebenszeit nach Tag 20 (0/6) hatten, während Me-IMP (100) plus LPS (10) signifikante Tumornekrose (2 von 3 waren ++ oder +++), vollständige Tumorregression (2/12) und erhöhte Überlebenszeit nach 20 Tagen (6/6) induzierten. Unter dieser Bedingung waren die TNF-Spiegel nach 24 h bei den mit Me-IMP und LPS behandelten 4 Mäusen als bei den Vergleichen mit Salzlösung plus LPS (4 Mäuse) (4240 gegenüber < 200). Diese Daten zeigen, dass Me-IMP, wenn es mit LPS und nicht allein verwendet wird, eine signifikante Antikrebsaktivität hat, vermutlich vermittelt durch die Induktion von TNF und verwandten Lymphokinen.
BEISPIEL 8 (Vergleich)
Wirkung eines geschützten IMP auf Listeria-Infektion
Protokoll:
Infektion. Ein mausadaptierter Bakterienstamm L. monocytogenes BGD (Gamaleya Research Institute Academy Medical Science, Rußland) wurde männlichen BALB/c-Mäusen (14–16 g) in einer Dosis von 1,7·10⁴ Zellen/Maus i.p. in 0,5 ml PBS (pH 7,4) am Tag 0 verabreicht.
Behandlung. Lösungen mit verschiedenen Konzentrationen an MIMP (AGS-36-217) wurden entweder oral oder parenteral wie in Tabelle 3 gezeigt verabreicht, beginnend 5 Tage vor der Infektion (Tag -5).
Tabelle 3 Verschiedene Behandlung zum Antünfektionsschutz (L. monocytogenes)
Ergebnisse
Tabelle 4
Wie in Tabelle 4 gezeigt, steigerte MIMP bei 10 mg/kg Körpergewicht per os und bei 1 und 10 mg/kg Körpergewicht durch i.p.-Injektion die mittlere Überlebenszeit (MST) und die absolute Anzahl der Überlebenden, wenn es fünf Tage vor Belastung gegeben wurde. MIMP bei 0,1 bis 10 mg/kg steigerte die MST und die Überlebenden, wenn eine Kombinationsbehandlung sowohl i.p. als auch p.o. ab fünf Tage vor Belastung gegeben wurde.
BEISPIEL 9 (Vergleich)
Wirkung eines geschützten IMP auf Salmonella-Infektion
Protokoll:
Infektion. Ein mausadaptierter Salm. typhimurium-Stamm 415 (Gamaleya Research Institute Academy Medical Science, Rußland) wurde in einer Dosis von 5·10⁴ Zellen in 0,5 ml PBS (pH 7,4) je Maus i.p. injiziert. Die Dosen waren so festgelegt, dass sie eine 100proz. Mortalität nach 6 Tagen mit einer mittleren Überlebenszeit von 2,5 Tagen ergaben.
Behandlung. Lösungen mit verschiedenen Konzentrationen von MIMP (AG-36-217) wurden parenteral verabreicht wie in Tabelle 5 angegeben und die Ergebnisse sind in Tabelle 6 aufgeführt.
Tabelle 5 Verschiedene Behandlung zum Antünfektionsschutz
Tabelle 6 Schutzwirkung von MIMP bei Versuchsinfektion (S. typhimurium)
Wie in Tabelle 6 gezeigt, starben alle Vergleichstiere innerhalb fünf Tagen mit einer mittleren Überlebenszeit von etwa 2,5 Tagen. Die verschiedenen MIMP-Behandlungen verlängerten die MST auf etwa 4 Tage (p < 0,01) mit einigen Langzeitüberlebenden, am offensichtlichsten bei der Behandlung N3.
BEISPIEL 10 (Vergleich)
Einfluß von MIMP auf die vom Influenzavirus induzierte Mortalität
Bei diesem Modell wurden NMRI-Mäuse mit dem Aerosolverfahren mit Influenzavirus belastet. Die Dosis des Influenzavirus wurde bei Vergleichstieren bestimmt, so dass die Mortalität 80 – 100 mit einer mittleren Überlebenszeit (MST) von 8 bis 11 Tagen war. Behandlungen mit Vergleichssubstanz (PBS), MIMP (100 oder 200 μg/Maus) und Squalan (1%) plus MIMP (200 μg/Maus) wurden einen Tag vor, eine Stunde vor und eine Stunde nach der Infektion eingeleitet.
Die Ergebnisse sind unten in Tabellen 7 und 8 angegeben. MIMP steigerte die Zahl der Überlebenden und die mittlere Überlebenszeit (MST) bei intranasaler Gabe von 200 μg/Maus (5 mg/kg) 24 h (Tag 1) vor oder eine Stunde vor oder nach der Belastung (Tabelle 7). MIMP steigerte das Überleben und MST bei einer Gabe von 100 μg/Maus nur, wenn dies eine Stunde vor Infektion erfolgte.
In einem zweiten Versuch steigerte MIMP die Zahl der Überlebenden und MST bei intranasaler Gabe mit Squalan (1%) bei einer Dosis von 200 μg/Maus einen Tag vor Infektion oder eine Stunde nach Infektion. Wie in 17 gezeigt, überlebten 100% der Mäuse dieser Behandlungsgruppe. Squalan allein hatte keine Wirkung.
(Tabelle 7) Einfluss von MIMP auf die vom Influenzavirus induzierte Mortalität
Tabelle 8 Einfluss von MIMP auf die vom Influenzavirus induzierte Mortalität
BEISPIEL 11 (Vergleich)
Stimulation der Antikörperreaktion auf HBsAg
Aufgrund früherer Untersuchungen wurde der Mausstamm DBA/2 als "poor responder" bei der Antikörperproduktion gegen HBsAg ausgewählt (Walker et al., 1981).
Normale (Vergleichs-) DBA/2-Mäuse

Die Ergebnisse des Anti-HBs-Nachweises in der mit HBsAg allein behandelten Vergleichsgruppe der Mäuse und in den mit der Kombination von MIMP und HBsAg behandelten Gruppen, wie in den Beispielen hergestellt, sind in Tabelle 9 aufgeführt. Die verschiedenen Impfpläne sind in der folgenden Liste angegeben.

Schema	Behandlung
1	HBsAg allein
2	HBsAg+MIMP per os (30 min vor Impfung)
3	HBsAg+MIMP i.p. gleichzeitig, dann alle 4 Tage
	MIMP per os
4	HBsAg+MIMP gleichzeitig
5	Bestrahlung + HBsAg
6	Bestrahlung + Schema N2
7	Bestrahlung + Schema N3
8	Vergleich

Tabelle 9
Einfluß von MIMP auf Anti-HBs-Produktion in DBA/2-Mäusen

*0,01 < p < 0,05; **p < 0,01

Die mit der kombinierten Verabreichung von HBsAg und MIMP nach den verschiedenen Schemata erhaltene Antikörperreaktion übertraf den Antikörperspiegel in der Vergleichstiergruppe.
Immungeschwächte DBA/2-Mäuse
In einer zweiten Versuchsreihe wurde die Wirkung von MIMP auf die Induktion einer spezifischen Immunreaktion auf HBsAg in immungeschwächten DBA/2-Mäusen, die ionisierender Strahlung unterworfen worden waren, unter Anwendung derselben Impfpläne wie für die Vergleichs-DBA/2 dargelegt untersucht.
Die Ergebnisse des Nachweises von Anti-HBs in den bestrahlten Mäusen der Vergleichsgruppe (nur HBsAg injiziert) und der mit der Kombination (HBsAg und MIMP unter Anwendung von Schemata 1 und 3) behandelten Gruppe sind in Tabelle 10 dargestellt.
Tabelle 10. Einfluss von MIMP auf die Anti-HBs-Reaktion in immungeschwächten bestrahlten DBA/2-Mäusen

**p < 0,01

Die Daten besagen, dass in den Fällen der Schemata 2 und 3 am Tag 21 Anti-HBs signifikant erhöht war, was eine wiederherstellende Wirkung des MIMP auf das Immunsystem der bestrahlten Tiere anzeigt.
Die im Beispiel 11 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass ein geschütztes IMP-Derivat die Entwicklung der humoralen Immunreaktion auf HBsAg beeinflussen kann. Es wurde gezeigt, dass MIMP sowohl als intraperitoneale als auch orale Einzeldosis von 50 mg/kg eine signifikante Zunahme des Antikörperspiegels gegen HBsAg induzieren kann. Nach intraperitonealer Verabreichung mit dem Antigen steigerte zusätzliche orale Verabreichung von MIMP seine Aktivität nicht.
Es kann eine Hypothese für den Mechanismus der Adjuvanswirkung von 5'-nucleotidaseresistenten Inosin-5'-monophosphatderivaten aufgestellt werden, die jedoch nicht als die vorliegende Erfindung auf diese eine Wirkungsweise beschränkend ausgelegt werden soll. Nichtansprechen auf Hepatitis B-Impfstoff wurde bei Hämodialysepatienten (Walz et al., 1989) und immungeschwächten Personen (Ness et al., 1989) beobachtet. In einigen Fällen führten höhere Impfstoffdosen oder eine erhöhte Anzahl von Dosen zu Serokonversion (Walker et al., 1981). Bei diesen Patienten wurden Spiegel des löslichen Interleukin-2-Rezeptors beobachtet und die resultierende Minderung der Interleukin-2-Wirkung durch Bindung von verfügbarem IL-2 kann die Reaktion auf Hepatitis B-Impfstoff beeinflussen (Walz et al., 1989; Meuer et al., 1989). Meuer et al. (1989) injizierten 10 Hämodialysepatienten, die "nonresponder" waren, 40 mg-Dosen des Impfstoffs und dann 1,2·10⁵ Einheiten natürlichen Interleukins-2. Vier Wochen später zeigten sechs der zehn Patienten Serokonversion, obwohl die Antikörperspiegel immer noch unter der Norm lagen. Das mit dem MHC verbundene Nichtansprechen auf Protein- oder Peptidantigene kann ebenfalls durch Verabreichung von IL-2 überwunden werden. Die Ergebnisse dieser Beispiele legen nahe, dass geschützte IMP-Derivate als Adjuvantien über T-Zellen erkannt werden können und Interleukin-2 einbeziehen können.
Verschiedene Veröffentlichungen in dieser Anmeldung sind durch Fundstelle oder Nummer zitiert. Die oben nicht gegebenen vollständigen Fundstellen für die zitierten Veröffentlichungen sind unten gelistet.
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Claims

Immunopotenzierendes Inosin 5'-monophosphat-Derivat der Formel (I)
wobei R C_1-6 Alkyl, C₂_₆ Alkoxy oder eine sekundäre Aminogruppe ist, wobei die sekundäre Aminogruppe ist: -NHR², wobei R² C_1-6-Alkyl ist; oder
wobei R³ ist Wasserstoff, C_1-9 ist Alkyl oder Carboxyl, und R⁴ ist Hydroxyl, Amino, Carboxyl, sekundär-Alkyl, Alkylsubsituiertes Hydroxymethyl, -NCH(NH)NH₂, -CONH₂,
und n ist 0 bis 4; oder ein durch sein N-terminales Ende mit dem Phosphoratom verbundenes Peptid, wobei das Peptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus arg-pro, arg-pro-lys und argpro-lys-thr, zur Verwendung in einer Therapie.
Verwendung eines immunopotentierenden Inosin 5'-Monophosphat-Derivats der Formel (I) oder
wobei R C_1-6 Alkyl, C_2-6 Alkoxy oder eine sekundäre Aminogruppe ist, wobei die sekundäre Aminogruppe ist: -NHR², wobei R² C_1-16-Alkyl ist_; oder
wobei R³ ist Wasserstoff, C_1-9 Alkyl oder Carboxyl, und R⁴ ist Hydroxyl, Amino, Carboxyl, sekundär-Alkyl, Alkylsubsituiertes Hydroxymethyl, -NCH(NH)NH₂, -CONH₂,
oder und n ist 0 bis 4, oder ein Peptid, welches mit seinem N-terminalen Ende mit dem Phosphoratom verbunden ist, wobei das Peptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus arg-pro, argpro-lys und arg-pro-lys-thr, bei der Herstellung eines Medikaments zur Potenzierung einer Immunantwort eines Säugetieres.
Inosin 5'-monophoppat-Derivat nach Anspruch 1 oder Verwendung nach Anspruch 2, wobei das sekundäre Alkyl ein solches der Formel -CH(R⁵)R⁶ ist, wobei R⁵ und R⁶, welche gleich oder verschieden sein können, unabhängig voneinander C_1-3 Alkyl sind.
Inosin 5'-monophophat-Derivat oder Verwendung nach Anspruch 3, wobei die sekundäre Alkylgruppe eine Gesamtzahl von vier Kohlenstoffatomen hat.
Inosin 5'-monophophat-Derivat nach Anspruch 1 oder Verwendung nach Anspruch 2, wobei die Alkyl-substituierte Hydroxymethyl-Gruppe eine solche der Formel C(R⁷)(R⁸)OH ist, wobei R⁷ Wasserstoff oder C_1-3 Alkyl ist und R⁸ ist C_1-3 Alkyl.
Inosin 5'-monophosphat-Derivat oder Verwendung nach oa Anspruch 5, wobei R⁷ und R⁸ beide Methyl sind.
Inosin 5'-monophophat-Derivat nach Anspruch 1 oder dessen Verwendung nach Anspruch 2, wobei die sekundäre Aminogruppe Arginin ist.
Inosin 5'-monophospat-Derivat nach Anspruch 1 oder Verwendung nach Anspruch 2, wobei das Derivat der Formel (I) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Methyl-5'-inosinmonophosphonat; Ethyl-5'-inosinmonophosphat; Arginin-5'-inosinmonophosphat; und (Heptamin-1-ol)-5'-inosinmonophosphat.
Inosin 5'-monophosphat-Derivat nach Formel (IB)
wobei R ist C_2-6 Alkoxy oder eine sekundäre Aminogruppe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: -NHR², wobei R² ist C_1-16 Alkyl
wobei R³ ist Wasserstoff, C_1-9 Alykl oder Carboxyl, und R⁴ ist eine sekundäre Alkylgruppe der Formel -CH(R⁵)R⁶, wobei R⁵ und R⁶, welche gleich oder verschieden sein können, unabhängig voneinander sind C_1-3 Alkyl oder eine Alkyl-subsituierte Hydroxymethylgruppe der Formel -C(R⁷)(R⁸)OH, wobei R⁷ ist Wasserstoff oder C_1-3 Alkyl und R⁸ ist C_1-3 Alkyl; -Arginin; oder ein durch dessen N-terminales Ende mit dem Phosphoratom verbundenes Peptid, wobei das Peptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus arg-pro, arg-pro-lys und argpro-lys-thr; und n ist 0 bis 4.
Derivat nach Anspruch 9, wobei die sekundäre Alkylgruppe eine Gesamtzahl von vier Kohlenstoffatomen hat.
Derivat nach Anspruch 9, wobei R⁷ und R⁸ beide Methyl sind.
Derivat nach Anspruch 9, wobei die sekundäre Aminogrup pe Arginin ist.
Derivat nach Anspruch 9, welches ist Ethyl-5'-inosinmonophophat; Arginin-5'-inosinmonophosphat; oder (Heptamin-1-ol)-5'-inosinmonophosphat.
Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend ein Derivat nach einem der Ansprüche 9 bis 13 zusammen mit einem pharmazeutischen akzeptablen Träger, Verdünnungsmittel oder Excipienten für dieses.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 9 bis 13, wobei das Verfahren umfasst: Kondensierung von Inosin 5'-monophosphat mit einer Verbindung R-H, wobei R wie in einem der Ansprüche 9 bis 13 definiert ist.