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Diese Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Purin-
2',3'-didesoxynukleosiden oder deren pharmazeutisch annehmbaren
Derivaten als antivirale Therapie bei der Behandlung von akuter
oder chronischer Infektion mit Hepatitis B-Virus in Lebewesen.
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Hepatitis B ist eine alltägliche Krankheit mit einer
weltweiten Verbreitung. Der Virus wird durch Blut und
Blutprodukte, Kontamination von Nadeln bei IV-Drogenabhangigen,
sexuell und vertikal von infizierten Müttern und
Überträgermüttern auf Kinder übertragen. Auf einer globalen
Basis ist die Krankheit in Südostasien, Afrika und Teilen von
Südamerika am stärksten verbreitet. In diesen Gebieten führt die
vertikale Übertragung auf Kinder im frühen Alter dazu, daß ein
hoher Anteil der infizierten Individuen zu chronischen Trägern
von Hepatitis B wird. Männer, die als Kinder mit Hepatitis B
infiziert worden sind, haben eine etwa 40%ige
Wahrscheinlichkeit, an Zirrhose oder primarem hepatozellulärem
Karzinom als Folge einer chronischen Hepatitis B-Infektion zu
sterben. Frauen, die bei der Geburt infiziert worden sind, haben
15% Wahrscheinlichkeit, an einer ähnlichen Todesursache in Folge
einer chronischen Hepatitis B-Infektion zu sterben. Es wird
geschätzt, daß es weltweit 280.000.000 Träger von Hepatitis B
gibt.
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Das Gebiet der antiviralen Chemotherapie ist relativ neu.
Da die Replikation der Viren so unmittelbar die Wirtszelle
einbezieht, ist es sehr schwierig gewesen, virusspezifische
Angriffspunkte für spezifische antivirale Chemotherapie zu
identifizieren. Versuche, chronische Träger von Hepatitis B-
Viren zu behandeln, sind wenig erfolgreich verlaufen.
Adeninarabinosid und Interferon wurden zur Behandlung von
chronischen Trägern verwendet. Es gab bisher drei kontrollierte
Studien, die Adeninarabinosid mit einem Plazebo bei der
Behandlung von chronischen Hepatitis B-Infektionen verglichen.
In zwei dieser Studien war die Ansprechwahrscheinlichkeit auf
Adeninarabinosid in behandelten Patienten signifikant höher als
in Vergleichsgruppen (Bassendine et al., Gastroenterology 80,
1016-1021, 1981; Yokosuta et al. Gastroenterology 89, 246-251,
1985).
In der dritten Studie wurde kein vorteilhafter Effekt bei
den Adeninarabinosid-behandelten Patienten festgestellt
(Hoofnagle et al, Gastroenterology, 86, 150-157, 1984).
Vorbehandlung der Patienten mit einer abnehmenden Menge von
Prednison vor der Therapie mit Adeninarabinosid wurde als
vorteilhaft berichtet (Perrillo, R.P. et al, Gastroenterology,
88, 780-786, 1985). Allerdings haben in den meisten offenen und
kontrollierten Untersuchungen nur etwa 30% der behandelten
Patienten einigen Nutzen aus der Therapie, und sogar diese
Ergebnisse sind nicht sehr überzeugend. Zusätzlich wurde
Adeninarabinosid mit Knochenmarksuppression, neuromuskulären
Schmerzen und Neurotoxizität in Verbindung gebracht. Die meisten
Versuche, chronische Hepatitis B-Infektionen mit
Adeninarabinosid zu behandeln, wurden abgesetzt, weil der Erfolg
nur begrenzt war und auf Grund der mäßigen Toxizität dieses
antiviralen Wirkstoffes. Versuche, manifeste chronische
Hepatitis, die durch Hepatitis B-Virus verursacht ist, mit
Interferon alleine oder in Kombination mit Adeninarabinosid zu
behandeln, hatten ebenfalls nur begrenzten Erfolg und
beträchtliche Toxizität. Es mangelt daher an einer effektiven
antiviralen Behandlungsform für Hepatitis B.
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Die 2',3'-Didesoxynukleoside wurden als antivirale
wirkstoffe vorgeschlagen, und tatsächlich wird 2',3'-
Didesoxycytidin aktiv als antiviralen Wirkstoff gegen
Retroviren, einschließlich dem menschlichen Immundefizienzvirus
(HIV), untersucht. Es wurde gezeigt, daß andere 2',3'-
Didesoxynukleoside, aber nicht 2',3-Didesoxythymidin, wirksame
Inhibitoren von HIV sind (Mitsuya et al PNAS 82, 7096-7100,
1985; Mitsuya und Broder PNAS 83, 1911-1915, 1986).
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Burroughs Wellcome beschreibt in EP-A-0206497, daß die
Didesoxynukleoside bei der Behandlung von Infektionen mit
Hepadnaviren, wie Hepatitis B, nützlich sein können. Allerdings
liefern sie keinen experimentellen Beweis, der diese Hypothese
unterstützen würde, und sie erwähnen unsere unerwartete
Entdeckung nicht, daß Purin-2',3'-didesoxynukleoside wesentlich
wirksamer sind als Pyrimidin-2',3'-didesoxynukleoside. Obwohl es
bekannt ist, daß 2',3'-Didesoxynukleoside antivirale Aktivität
haben, hat sich die offenbarte Arbeit auf diese Art von
Verbindung als wirksames Mittel gegen Retroviren, insbesondere
HIV konzentriert. Die am meisten wirksamen 2',3'-
Didesoxynukleoside gegen HIV waren 2',3'-Didesoxycytidin (ddC)
und 2',3'-Didesoxyadenosin (ddA), ein Pyrimidin-2',3'-
didesoxynukleosid beziehungsweise ein Purin-2',3'-
didesoxynukleosid. Offensichtlich ist es unmöglich, die
qualitative Empfindlichkeit von Hepadnaviren gegen 2',3'-
Didesoxynukleoside auf Grund der bekannten Empfindlichkeit von
Retroviren gegen diese Verbindungen vorherzusagen. Dies ist
nicht überraschend, da Retroviren RNA-Viren sind, während
Hepadnaviren DNA-Viren aus einer klar unterschiedlichen Familie
sind und sich durch einen anderen Mechanismus replizieren.
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In EP-A-0286425 werden verschiedene 6-substituierte 2',3'-
Didesoxypurinnukleoside und pharmazeutisch annehmbare Derivate
sowie deren Verwendung bei der Behandlung und Vorbeugung von
HIV-Infektionen offenbart.
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Biochem.Biophys.Res.Comm., 145(1), 227-285 (1987)
beschreibt, daß die 2',3'-Didesoxyriboside von 2,6-Diaminopurin
und ihre 2',3'-Didehydroderivate die Desaminierung von 2',3'-
Didesoxyadenosin, welches ein Inhibitor der Replikation des HIV-
Virus ist, inhibieren.
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Entsprechend einem Gesichtspunkt der Erfindung wird eine
Verwendung eines biologisch aktiven 2',3'-Didesoxynukleosids bei
der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines
Hepadna-infizierten Lebewesen bereitgestellt, wobei das genannte
2',3'-Didesoxynukleosid durch die Formel (I) dargestellt wird:
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wobei X und Y wie folgt sind:
Halogen
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R&sub2; ist H oder ein biologisch kompatibler Ester oder Salz des
genannten Esters, um ein biologisch verträgliches Salz zu
liefern.
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Spezifische Ausführungsformen dieser Erfindung werden in
den Zeichnungen gezeigt, wobei:
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Figur 1 die Dosis-Ansprechkurve für ausgewählte Purin und
Pyrimidin-2',3'-didesoxynukleoside zeigt;
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Figur 2 eine "Dot blot"-Hybridisierung der DNA von nicht
behandelten (VC) und von arzneimittelbehandelten, mit DHBV
infizierten Hepatozyten ist;
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Figur 3 eine "Southern blot"-Analyse von intrazellulärer
Virus-DNA, die in einem 1,5% Agarosegel getrennt wurde, ist;
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Figur 4 eine "Southern blot"-Analyse von extrazellulärer
Virion-DNA, die in einem 1,5% Agarosegel getrennt wurde, ist;
und
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Figur 5 eine "Dot blot"-Analyse von Seren, die von Tieren,
die mit DHBV infiziert waren, extrahiert wurden.
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Die Entdeckung, daß die Verbindungen der Formel I einen
unerwartet signifikanten Nutzen als antiviralen Wirkstoff bei
der Behandlung von Hepadnavirus-Infektionen hat, wird in dieser
detaillierten Diskussion der bevorzugten Ausführungsform dieser
Erfindung gezeigt. Es ist angenehm, daß die Wirksamkeit solcher
Verbindungen sehr einfach an Lebewesen gezeigt werden kann, und
insbesondere ist bekannt, daß sich der Enten-Hepatitis B-Virus
in Enten sehr ähnlich verhält wie der analoge Hepatitis B-Virus
in Menschen. Testen dieser Verbindung, um ihren unerwarteten
Nutzen zu prüfen, wurde daher mit Enten, die mit dem
Enten-Hepatitis B-Virus (DHBV) infiziert waren, durchgeführt. Es wird
angenommen, daß sind die Verbindungen in Lebewesen, die mit
Hepadnaviren infiziert sind, wirksam sind; zum Beispiel in
menschlichen und nicht-menschlichen Lebewesen. Nicht-menschliche
Lebewesen umfassen Enten, Waldmurmeltiere, kleine Beechey-
Erdhörnchen und Känguruhs.
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In vergangenen Studien von antiviralen Wirkstoffen wurde
keine Unterscheidung zwischen der Wirksamkeit von Purin-2',3'-
didesoxynukleosiden und Pyrimidin-2',3'-didesoxynukleosiden
gemacht. Solche Unterschiede in der Wirksamkeit wurden im
vorliegenden System für den Enten-Hepatitis B-Virus klar
gezeigt. Die Ursache für die selektive antivirale Aktivität von
Purin-2',3'-didesoxynukleosiden wird nicht vollständig
verstanden. Es wird gegenwärtig postuliert, daß die Verbindungen
der Formel I die Fähigkeit haben, an das an das Genom gebundene
Protein, das für die Synthese des negativen DNA-Strangs als
Starter (primer) fungiert, zu binden. Da der vollständige
negative Strang als Matrize (template) für die Synthese des
positiven Strangs dient (Will et al, J.of Virology, 61, 904-911,
1987), würde ein Blockieren in einem so frühen Stadium der DNA-
Synthese die Synthese des negativen und des positiven Strangs
blockieren.
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Die Replikation von Hepadnaviren unterscheidet sich
deutlich von der anderer DNA-Viren. Ein größerer Unterschied ist
ein reverser Transkriptionsschritt analog zu dem bei Retroviren
gesehenen. Der Replikationsmechanismus von Hepadnaviren wurde
ursprünglich im DHBV-Modell von Summers und Mason (Cell 29, 403-
415, 1982; Mason et al, PNAS, USA, 3997-4001, 1982) entdeckt,
und später wurde gezeigt, daß er bei Hepatitis B ähnlich ist
(Blum et al, Virology 139, 87-96, 1984; Miller et al, Virology
139, 53-63, 1984; Miller et al, Virolgy 139, 64-72, 1984).
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Nachdem der Hepadnavirus in die Zielzelle (Hepatozyten)
eingedrungen ist, werden die Hüllproteine entfernt und die DNA
gelangt in den Kern. Im Kern wird die partiell doppelsträngige
DNA des Virus in eine doppelsträngige, kovalent geschlossene,
zirkuläre Form konvertiert. Der negative Strang fungiert als
Matrize für die Synthese der prägenomischen RNA, die größer (3,4
kb) als der negative Strang (3,2 kb) ist. Die prägenomische RNA
wird von der zellulären RNA-Polymerase synthetisiert. Die
prägenomische RNA dient als Matrize für die Synthese des
negativen DNA-Strangs; dies wird durch die virale DNA-Polymerase
(reverse Transkriptase-Aktivität) gemacht. Die Synthese des
negativen Strangs wird durch ein kovalent gebundenes Protein
gestartet (Gerlich und Robinson, Cell 21, 801-809, 1980; Molnar-
Kimber et al, J.of Virology 45, 165-172, 1984). Während der
Synthese wird die prägenomische RNA durch eine Ribonuklease H-
ähnliche Aktivität der viralen DNA-Polymerase abgebaut. Gegen
Ende der Synthese des negativen Strangs wird ein kleines Stück
der prägenomischen RNA von der DR1- zu der DR2-Region des
Minusstrangs transponiert und dient als Starter für die Synthese
des positiven Strangs (Will et al, J.of Virology 61, 904-911,
1987). Die Synthese des positiven Strangs kann bis zu der
Umhüllung durch Nukleokapside und Export der viralen Partikel
dauern.
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Daher ist eine mögliche Erklärung für die unerwartete
Sensitivität von Hepadnaviren gegen Purin-2',3'-
didesoxynukleoside im Vergleich zu Pyrimidin-2',3'-
didesoxynukleosiden, daß purin-2',3'-didesoxynukleoside an das
an das Genom gebundene Protein, das die Synthese des negativen
Strangs startet, bindet. Im Hepatitis B-Virus ist die Sequenz
des 5'-Endes des negativen Strangs 5'-d(GAAAAAGT...) (Will et
al, J.of Virology 61, 904-911, 1987) und 5'-d(GTAATTCTT...) bei
DHBV (Lien, J.M. et al, J.of Virology 61, 3832-3840, 1987). In
beiden Fällen ist das Nukleotid am 5'-Ende, an das das Protein
gebunden ist, ein Purinnukleotid. Die gegenwärtigen Ergebnisse
mit Hepatozytenkulturen zeigen, daß DHBV, und in einem
Analogieschluß die anderen Hepadnaviren, mindestens 100 bis 1000
mal sensitiver gegen Purin-2',3'-didesoxynukleoside als gegen
Pyrimidin-2',3'-didesoxynukleoside sind. Dieser einzigartige
Schritt des Startens der DNA-Synthese des negativen Strangs
durch ein Protein ist ein möglicher Mechanismus, durch den die
unerwartete Entdeckung erklärt werden könnte. Allerdings können
auch andere Mechanismen dafür verantwortlich sein. Auf jeden
Fall zeigen die Testergebnisse klar die Wirksamkeit der
Verbindungen mit der Formel I.
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Die unerwartete Empfindlichkeit von Hepadnaviren gegen
Purin-2',3'-didesoxynukleoside ohne jeden offensichtlichen
nachteiligen Effekt auf die Wirtszellen bei viel höheren
Konzentrationen (100 bis 1000fach) läßt die Vermutung zu, daß
diese antiviralen Wirkstoffe bei einem einzigarigen Schritt der
viralen Replikation wirken. Die Hypothese, daß das durch ein
Protein bewirkte Starten der viralen Nukleinsäuresynthese
mittels Purin-2',3'-didesoxynukleoside blockiert wird, hat
weitreichende Anwendungen auf andere Viren, wie zum Beispiel
Polio und Adenoviren, von denen ebenfalls bekannt ist, daß der
Start ihrer Nukleinsäuresynthese durch ein Protein erfolgt.
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Die bevorzugten Verbindungen, die für diese Erfindung
nützlich sind, sind in der obigen Formel I dargestellt, wobei X
und Y sind:
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Die bevorzugten Verbindungen der Formel I sind Adenin-,
Guanin-, Hypoxanthin- oder 2,6-Diaminopurinderivate der obigen
Formel; d.h. wobei X H und Y NH&sub2; ist, X NH&sub2; und Y OH ist, X H
und Y OH ist beziehungsweise X NH&sub2; und Y NH&sub2; ist. Viele der
obigen Verbindungen agieren als Vorstufen zu Arzneimitteln, die
in vivo zu den aktiveren 2',3'-Didesoxynukleosiden, wie zum
Beispiel 2',3'-Didesoxyguanosin metabolisiert werden.
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R&sub2; kann Hydroxyl oder ein Ester davon, Salze des Esters
oder Salze per se sein, wobei alle biologisch verträglich sind.
Solche Ester können geradkettig oder verzweigt sein.
Vorzugsweise ist der Ester von kürzerer Kettenlänge mit 1 bis 4
Kohlenstoffatomen. Eine oder mehrere dieser Verbindungen können
verabreicht werden, um eine wirksame Konzentration im Blutstrom
von weniger als 50 ug/ml zu erzielen. Der bevorzugte
Konzentrationsbereich zur Dosierung liegt im Bereich von 0,1 bis
10,0 ug/ml. Solche Zusammensetzungen können durch normale
Verfahren, wie orale Tabletten, Flüssigkeit, Suppositorium,
injizierbare Flüssigkeit, Aerosol etc., verabreicht werden.
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Das Fehlen eines wirksamen antiviralen Wirkstoffes zur
Behandlung von Hepatitis B veranlaßte die Verwendung von Enten-
Hepatozytenkulturen, um DHBV wachsen zu lassen und um
chemotherapeutische Wirkstoffe auf antivirale Wirksamkeit zu
testen. Enten-Hepatozytenkulturen werden verwendet, um DHBV zu
wachsen zu lassen und um chemotherapeutische Wirkstoffe auf
antivirale Wirksamkeit zu testen. Obwohl die beschriebenen
Verfahren die Behandlung von DHBV besprechen, kann angenommen
werden, daß diese Behandlungsweise gegen Viren mit einem
ähnlichen Replikationsmechanismus wirksam ist.
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Dosis-Ansprechkurven wurden für Purin-2',3'-
didesoxynukleoside und Pyrimidin-2',3'-didesoxynukleoside unter
Verwendung des mit Enten-Hepatitis B-Virus infizierten
Hepatozytensystems erstellt. Die DHBV-infizierten
Hepatozytenkulturen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben
etabliert. Didesoxynukleosidanaloge wurden zum Medium der
Hepatozytenkulturen am Tag 2 zugefügt und in der Kultur
belassen, wobei Medien alle 2 Tage gewechselt wurden. Am Tag 16
wurde die DNA aus den Zellen extrahiert und die "Dot blots"
wurden unter Verwendung der ³²P-markierten DHBV-Sonde
durchgeführt. Die Radioaktivität jedes "Dots" wurde durch
Ausschneiden desselben und Auszählen seiner Radioaktivität
quantifiziert. Die folgenden Abkürzungen wurden in Figur 1, die
die Dosis-Antwortkurven zeigt, verwendet:
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ddA = 2',3'-Didesoxyadenosin;
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ddG = 2',3'-Didesoxyguanosin;
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ddDAPR = 2,6-Diaminopurin-2',3'-didesoxyribosid;
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ddI = 2',3'-Didesoxyinosin;
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ddT = 2',3'-Didesoxythymidin;
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ddC = 2',3'-Didesoxycytidin.
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Aus den in Figur 1 gezeigten Ergebnissen ergeben sich die
folgenden Konzentrationen der Nukleosidanalogen, die zur
Inhibition der Virusreplikation um 50% (ID&sub5;&sub0;) nötig sind: 0,07
ug/ml für 2,6 Diaminopurin-2',3'-didesoxyribosid, 0,07 ug/ml für
2',3'-Didesoxyguanosin, 0,12 ug/ml für 2',3'-Didesoxyadenosin,
1,5 ug/l für 2',3'-Didesoxyinosin und 40 ug/ml für 2',3'-
Didesoxycytidin. Keine Inhibierung der DHBV-Replikation wurde
mit 2',3'-Didesoxythymidin beobachtet.
BEISPIEL 1
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Neugeborene Entenküken wurden mit DHBV infiziert. 5 bis 7
Tage nach der Infektion wurden von den Entenküken Blutproben
genommen und auf Anwesenheit von DHBV-DNA mittels "Dot"-
Hybridisierung unter Verwendung einer spezifischen DNA-Sonde
untersucht [Mason et al, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79, 3997-4001
(1982)]. Die Lebern der "Dot blot"-positiven Entenküken wurden
entfernt und verwendet, um primäre, mit DHBV infizierte
Hepatozytenkulturen, wie bereits früher beschrieben,
herzustellen. (Tuttleman et al, J.of Virology, 58, 17-25). Nach
zwei Tagen in Kultur werden die antiviralen Wirkstoffe zu den
Kulturmedien zugegeben. Die Medien werden alle 2 Tage
gewechselt, und zu bestimmten Zeiten werden die Zellen entfernt
und die gesamte DNA extrahiert.
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Die DNA wird als Fleck auf Nitrozellulosepapier aufgebracht
und nach dem folgenden Verfahren mit der ³²P-markierten DHBV-
DNA-Sonde hybridisiert. Die DNA von DHBV-infizierten Hepatozyten
wurde extrahiert und als Fleck auf ein Nitrozellulosepapier
aufgebracht. Die oben erwähnte ³²P-"Nick"-translatierte DHBV-
DNA-Sonde (pDH-010=DHBV) wurde verwendet. Die DNA wurde von 6
cm-Zellkulturschalen zu verschiedenen Zeiten nach dem Plattieren
extrahiert. In der VC-Gruppe wurden Zellen nach 2, 6, 8, 10, 14,
18 und 20 Tagen geerntet. Doppelproben wurden für die Tage 14,
18 und 20 aufgebracht. In arzneimittelbehandelten Gruppen wurden
Zellen nach 8, 14 und 20 Tagen geerntet. In Figur 1 (richtig
vermutlich: Fig.2, Anm.d.Übers.) ist dies von links nach rechts
dargestellt. Arzneimittel wurden 2 Tage nach Plattieren zu den
Kulturen zugefügt und während der Medienwechsel, die alle 2 Tage
erfolgten, beibehalten. Die verwendeten Konzentrationen (ug/ml)
sind in Figur 1 (richtig vermutlich: Fig.2, Anm.d.Übers.) für
2',3'-Didesoxythymidin (ddT), 2',3'-Didesoxycytidin (ddC),
Adeninarabinosid (ara A), 2',3'-Didesoxyadenosin (ddA) und
2',3'-Didesoxyguanosin (ddG) angegeben. Die gesamte
intrazelluläre DNA wurde aus den Zellen mit dem
Standardphenolextraktionsverfahren extrahiert. Die Zellen aus
einer Petrischale mit 6 cm Durchmesser (ca 5 x 10&sup6; Zellen)
wurden in einem Lysispuffer, der 0,2% SDS, 150 mM Tris HCl pH
8, 0,
10 mM EDTA, 5 mM EGTA und 150 mM NaCl enthält, lysiert. Das
Zellysat wurde mit 0,5 mg/ml Pronase E (erhältlich von Sigma)
bei 37ºC 2 Stunden verdaut und durch Extraktion mit dem gleichen
Volumen Phenol, das mit 20 mM Tris HCl pH 7,5, 0,5 mM EDTA und
0,1% 8-Hydroxychinolin gesättigt ist, deproteinisiert. Zu der
wässrigen Phase wurde konzentriertes Ammonacetat [pH 7,0 (2,5
M)] zugefügt, um eine 0,25 M Ammonacetatlösung zu erhalten, und
die Nukleinsäuren wurden mit 2 Volumen 100% Ethanol gefällt. Die
gefällten Nukleinsäuren wurden mit Ethanol gewaschen und
getrocknet. Die DNA wurde in einer Lösung, die 12,5 mM Tris HCl
pH 7,5, 10 mM EDTA, 30% Glycerin und 0,01% Bromphenolblau
enthält, gelöst. Ein Zwölftel der DNA-Probe wurde für die "Dot
blot"-Analyse auf Nitrozellulose aufgebracht. ddA, ddG, ddC und
ddT wurden von Pharmacia bezogen. 2,6-Diaminopurin-2',3'-
didesoxyribosid [oder 2,
6-Diamino-9-(2,3-didesoxy-β-D-glyceropentofuranosyl)purin] (ddDAPR) kann nach einem Verfahren
hergestellt werden, das kürzlich für eine effiziente Umwandlung
von Adenosin in seine ddAdo-Derivate verwendet wurde (Robins et
al, Tetrahedron Lett., 25, 367-360, 1984; Hansske und Robins,
Tetrahedron Lett., 26, 4295-4298, 1985). Kristallines ddDAPR hat
einen Schmelzpunkt von 194 bis 195ºC; MS m/z 250,1180 [M+
(C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub4;N&sub6;O&sub7;)=250, 1178].
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Dieses System zeigt die unerwartet hohe Empfindlichkeit von
DHBV gegen 2',3'-Didesoxyadenosin (ddA) und 2',3'-
Didesoxyguanosin (ddG). Wie in Figur 1 (richtig vermutlich:
Fig.2, Anm.d.Übers.) gezeigt, inhibiert 2',3'-Didesoxythymidin
(ddT) die DHBV-DNA-Synthese selbst bei einer Konzentration von
10 ug/ml nicht. 2',3'-Didesoxycytidin inhibiert bei 10 ug/ml die
virale DNA-Produktion um etwa 57%, hat bei 1 ug/ml aber nur
wenig inhibitorische Wirksamkeit. Adeninarabinosid inhibiert bei
10 ug/ml die DHBV-DNA-Synthese um etwa 63%. Allerdings
inhibieren sowohl ddA als auch ddG die DHBV-DNA-Synthese bei
einer Konzentration von 1 ug/ml um mehr als 99%. Diese
Ergebnisse waren in dreifach ausgeführten Experimenten
konsistent. Siehe Tabelle 2.
TABELLE 2
Vergleich der Wirksamkeit der Inhibition der
Hepadnavirusreplikation durch 2',3'-Didesoxynukleoside und
Pyrimidin-didesoxynukleoside
Die Daten basieren auf densitometrischer Auswertung der "Dot"-
Hybridisierung nach 20 Tagen
VERGLICHEN
PROZENT INHIBITION
Medienkontrolle
2,6-diaminopurine 2',3'-dideoxyriboside
*"Dot"-Hybridisierung für diese beiden Verbindungen ist in Figur
1 (richtig vermutlich: Fig.2, Anm.d.Übers.) nicht gezeigt.
BEISPIEL 2
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"Southern blot"-Analyse bestätigt, daß die antivirale
Wirksamkeit von Purin 2',3'-Didesoxynukleosidanalogen spezifisch
für DHBV DNA ist, wie in Figur 2 (richtig vermutlich: Fig.3,
Anm.d.Übers.) gezeigt. Diese Information wurde folgendermaßen
gewonnen.
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Intrazelluläre virale DNA wurde für die "Southern blot"-
Analyse in einem 1,5%igen Agarosegel getrennt. Die DNA wurde von
DHBV-infizierten Hepatozyten aus einer 6 cm-Schale extrahiert
und ein Fünftel der gesamten DNA wurde in jeweils eine Spur
geladen. Wie in Figur 2 (richtig vermutlich: Fig.3,
Anm.d.Übers.) gezeigt, wurde die Virus-DNA für den
Vergleichsversuch am Tag 2 (Spur 1), 8 (Spur 2), 14 (Spur 3) und
20 (Spur 4) extrahiert. Arzneimittelbehandelte Gruppen wurden 14
und 20 Tage nach dem Plattieren geerntet. Die DNA-Proben von
arzneimittelbehandelten Hepatozyten waren ddA (10 ug/ml), Tag 14
(Spur 5) und Tag 20 (Spur 6), ddA (1 ug/ml), Tag 14 (Spur 7) und
Tag 20 (Spur 8), ddG (10 ug/ml), Tag 14 (Spur 9) und Tag 20
(Spur 10), ddG (1 ug/ml), Tag 14 (Spur 11) und Tag 20 (Spur 12).
Relaxiert zirkuläre (RC), kovalent geschlossene zirkuläre (CCC)
und einzelsträngige (SS) DNA-Spezies sind in Figur 2 (richtig
vermutlich: Fig.3, Anm.d.Übers.) gekennzeichnet. Die
Größenmarker (Kilobasen) wurden aus mit HindIII verdauter
Bakteriophage λ-DNA erhalten.
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Die relaxiert zirkulären (RC), kovalent geschlossenen
zirkulären (CCC) und einzelsträngigen (SS) Formen von DHBV-DNA
nehmen in den DHBV-infizierten Hepatozyten mit der Länge der
Inkubation zu. Die Synthese von DHBV-DNA wird durch ddA oder ddG
inhibiert. Allerdings war in Dreifachexperimenten ddG wirksamer
als ddA. Bei einer Konzentration von 1 ug/ml findet man sehr
starke Inhibierung der Synthese von allen DHBV-DNA-Formen durch
ddA. Man findet eine geringfügige Zunahme der RC-DNA in ddA-
behandelten Hepatozyten zwischen Tag 14 und Tag 20. Andererseits
führt ddG-Behandlung am Tag 20 zu einer Abnahme aller Formen von
DHBV DNA. Auf Grund dieser Studien ist ddG ein wirksamerer
antiviraler Wirkstoff gegen DHBV als ddA. Andererseits sind
sowohl ddA als auch ddG wesentlich wirksamere antivirale
Wirkstoffe als ddC oder ddT oder andere Nukleosidanalogen wie
Adeninarabinosid. Unter Verwendung von 2',3'-Didesoxyinosin
(ddI) und 2,6-Diaminopurin-2',3'-didesoxyribosid (ddDAPR) haben
ähnliche Experimente gezeigt, daß diese Purin-2',3'-
didesoxynukleoside ebenfalls sehr wirksame antivirale Wirkstoffe
gegen DHBV sind (> 95% Inhibition bei 1 ug/ml). Siehe Tabelle I
(richtig vermutlich: Tabelle II, Anm.d.Übers.). Es ist bekannt,
daß ddDAPR durch Adenosindesaminase deaminiert wird (Balzarini
et al, Biochem.Biophys.Res.Commun. 145, 269-276, 1987; Balzarini
et al, Biochem.Biophys.Res.Commun. 145, 277-283, 1987). Es ist
daher wahrscheinlich, daß ddDAPR als eine wirksame
Arzneimittelvorstufe von ddG wirkt.
BEISPIEL 3
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Die Fähigkeit der 2',3'-Didesoxynukleosidanalogen, die
Produktion von extrazellulärem DHBV zu inhibieren, ist in Figur
3 (richtig vermutlich: Fig.4, Anm.d.Übers.) gezeigt.
Extrazelluläre Virion-DNA wurde für die "Southern blot"-Analyse
in einem 1,5%igen Agarosegel getrennt. Kulturmedien wurden vom
Tag 16 bis Tag 20 nach Plattieren vereinigt. Die
abzentrifugierten Virionen wurden mit Pronase verdaut und die
DNA der gesamten Probe wurde auf jeweils eine Spur geladen. In
Figur 3 (richtig vermutlich: Fig.4, Anm.d.Übers.) werden gezeigt:
Virusvergleichsversuch (Spur 1); mit 1 ug/ml ddA behandelte
Hepatozyten (Spur 2); mit 1 ug/ml ddG behandelte Hepatozyten
(Spur 3); mit 1 ug/ml ddT behandelte Hepatozyten (Spur 4); und
mit 1 ug/ml ddC behandelte Hepatozyten (Spur 5). RC in Figur 3
(richtig vermutlich: Fig.4, Anm.d.Übers.) zeigt relaxiert
zirkuläre DNA an.
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Die Produktion von extrazellulärem Virus nimmt bei einer
Konzentration von 1 ug/ml ddA oder ddG merkbar ab. ddT und ddC
können allerdings bei einer Konzentration von 1 ug/ml die
Produktion von extrazellulären Viren nicht inhibieren.
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Purin-2',3'-didesoxynukleoside inhibieren die DHBV-
Replikation bei niederen Konzentrationen. Der Mechanismus der
selektiven Inhibition von DHBV-Replikation durch Purin-2',3'-
didesoxynukleoside im Vergleich mit Pyrimidin-2',3'-
didesoxynukleosiden ist nicht bekannt. Wie bereits erwähnt, gibt
es allerdings zumindest eine mögliche Erklärung des Mechanismus,
der hinter dieser Entdeckung stehen könnte. Ein anderer
möglicher Mechanismus ist, daß Pyrimidin-2',3'-
didesoxynukleoside nicht so effektiv wie Purin-2',3mu
didesoxynukleoside in den Enten-Hepatozyten phosphoryliert
werden. Auch wenn wir sehr gute Phosphorylierung der Purin-
2',3'-didesoxynukleoside annehmen, m~ßten allerdings die Purin-
2',3'-didesoxynukleosidtriphosphate mit dGTP und dATP
konkurrieren, um die virale DNA-Polymerase zu inhibieren. Die in
diesen Experimenten beobachtete hohe Wirksamkeit der Inhibition
läßt einen speziellen Wirkungsmechanismus für Purin-2',3'-
didesoxynukleoside vermuten. HBV sollte ebenfalls durch Purin-
2',3'-didesoxynukleosidanaloge selektiv inhibiert werden. Da HBV
einen sehr ähnlichen Replikationsmechanismus hat, sollte er
ähnliche Empfindlichkeit gegen diese antiviralen Wirkstoffe
zeigen. Diese Behandlungsweise sollte sich als wirksam gegen
Viren, die in ähnlicher Weise wie DHBV replizieren, wie z.B. HBV
in Menschen, erweisen.
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Die 2',3'-didesoxynukleosidanalogen Verbindungen der Formel
I können als biologisch verträgliche Ester, Salze solcher Ester
oder als ein biologisch verträgliches Salz verabreicht werden.
Diese Verbindungen der Erfindung können zur Therapie über einen
von mehreren Wegen, z.B. oral, rektal, parenteral (intravenös,
intramuskulär oder subkutan) oder durch Aerosolinhalation
verabreicht werden.
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Es ist bekannt, daß Purin-2',3'-didesoxynukleoside bei
sauren pH-Werten, wie sie üblicherweise im Magen gefunden
werden, spaltbar sind. Es ist deshalb für die orale Gabe eine
Formulierung nötig, die die 2',3'-Didesoxynukleoside durch den
sauren pH-Breich des Magens passieren läßt. Dies kann durch eine
Kapsel mit verzögerter Freisetzung oder durch Neutralisieren des
pH-Werts des Magens vor der oralen Gabe der Purin-2',3'-
didesoxynukleoside erfolgen.
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Für parenterale Gabe würden sich die 2',3'-
Didesoxynukleoside in wässrigen oder nicht-wässrigen, sterilen
und injizierbaren Lösungen befinden. Da diese Verbindungen
wasserlöslich sind, wäre eine isotonische, wässrige Lösung mit
neutralem pH, die einen geeigneten Puffer und einen
tolerierbaren bakteriostatischen Wirkstoff enthält, die
wahrscheinlichste Formulierung für eine der intravenösen Gabe.
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Es ist wünschenswert, Plasmakonzentrationen von 1 bis 10
ug/ml zu erzielen. Es wird angemerkt, daß in einigen Fällen
höhere Konzentrationen nötig sein können, obwohl nicht erwartet
wird, daß die Konzentrationen 50 ug/ml im Blutstrom
überschreiten werden.
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Basierend auf veröffentlichten Studien über andere 2',3'-
Didesoxynukleoside, können die niedrigeren Werte von 1 bis 10
ug/ml einfach durch die Gabe von 1-5 mg/kg über den oralen Weg
erzielt werden, unter Berücksichtigung der oben erwähnten
Einschränkungen durch die Säurelabilität. Dies basiert auf der
bekannten Erfahrung mit anderen Nukleosidanalogen, wie 3'-Azido-
3'-desoxythymidin (AZT), das Spitzenplasmakonzentrationen von 1
ug/ml nach Infusion von 1 mg/kg oder der oralen Gabe von 2 mg/kg
liefert. Wirksame Plasmakonzentrationen zur Inhibierung von HIV
durch ddC werden auf ähnliche Weise nach oraler Gabe erreicht.
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Die Toxizität der Purin-2',3'-didesoxynukleoside wurde mit
Enten-Hepatozyten und Affennieren-Zellen (Vero) getestet und
dies zeigte, daß eine Verringerung der Lebensfähigkeit der
Zellen bei 100 ug/ml ddA oder ddG über einen Zeitraum von 10
Tagen nicht beobachtet wurde. Wie bekannt, wurden bereits früher
mehrere Lymphozyt-Zellinien auf Lebensfähigkeit und Funktion in
der Gegenwart von 2',3'-Didesoxynukleosiden untersucht. Diese
Zellinien zeigten keine verringerte Lebensfähigkeit und Funktion
in der Gegenwart von 2',3'-Didesoxynukleosiden. Diese Zellinien
zeigten sogar dann keine verringerte Lebensfähigkeit und nur
geringfügig unterdrückte Immunfunktion, wenn sie einer
Konzentration von 100 ug/ml 2',3'-Didesoxynukleosiden ausgesetzt
waren (Mitsuya et al PNAS, 82, 7096-7100, 1985).
BEISPIEL 4
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Zusätzlich wurden Tests durchgeführt, um die Wirkung in
vivo zu belegen. Vier Pekin-Enten mit bewiesener hartnäckiger
Infektion mit DHBV wurden mit 2,6-Diaminopurin-2',3'-
didesoxyribosid (ddDAPR) behandelt. Die Tiere erhielten durch
intramuskuläre Injektion zweimal täglich 10 mg/kg über einen
Zeitraum von zwei Wochen. Wie in Figur 5 gezeigt, führte die
Behandlung zu sehr raschem Verschwinden von Virus aus den Seren.
Reihe "a" zeigt die Ergebnisse der "Dot blot"-Analyse von 5
Tieren vor der Behandlung. Alle fünf Tiere zeigten Zeichen einer
hartnäckigen DHBV-Infektion. Tiere 1 bis 4 wurden behandelt, und
Reihe "b" zeigt die Ergebnisse der Behandlung nach einer Woche.
Wie gesehen werden kann, werden durch die Behandlung Viren nach
einer Woche vollständig aus den Seren entfernt. Die unbehandelte
Ente (Nummer 5) wurde zu diesem Zeitpunkt nicht geblutet. Reihe
"c" zeigt die Ergebnisse des "Dot blot" nach zweiwöchiger
Behandlung. Der Virus war vollständig aus den Seren der
behandelten Tiere entfernt. Das Vergleichstier (Nummer 5) blieb
nach 2 Wochen stark positiv (Reihe c, Spalte 5).
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Wir haben auch bestätigt, daß ddDAPR rasch zu ddG
metabolisiert wird. Dies gelang unter Verwendung von Vollblut
einer Ente durchgeführt, indem die Umwandlungsrate von ddDAPR in
ddG gemessen wurde. Unsere Ergebnisse zeigten, daß mehr als 95%
des ddDAPR in 5 Minuten zu ddG metabolisiert werden.
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Diese Tests liefern eine überzeugende Bestätigung, daß
ddDAPR sowohl in vivo als auch in vitro sehr aktiv ist und daß
es höchstwahrscheinlich eine Arzneimittelvorstufe von ddG ist.