DE69532436T2

DE69532436T2 - Einzelkettenformen des clycoprotein-hormon-quartetts

Info

Publication number: DE69532436T2
Application number: DE69532436T
Authority: DE
Inventors: Irving Boime
Original assignee: St Louis University; Washington University in St Louis WUSTL
Current assignee: St Louis University; Washington University in St Louis WUSTL
Priority date: 1994-08-12
Filing date: 1995-08-01
Publication date: 2004-11-25
Anticipated expiration: 2015-08-02
Also published as: EP0725795A1; HU227311B1; KR960704932A; NO961433D0; CA2173750C; CN1131952A; ES2210307T3; HUT75900A; FI120150B; FI961600A0; NO961433L; CN1157408C; NO317394B1; WO1996005224A1; ATE257843T1; DE69532436D1; AU3206695A; DK0725795T3; EP0725795A4; CA2173750A1

Description

Förderung durch die Regierung
Diese Erfindung wurde von der Regierung mit Mitteln des NIH (National Institutes of Health) gemäß NIH-Vertrag Nr. N01-HD-9-2922 gefördert. Die Regierung hält bestimmte Rechte an der Erfindung.
Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft das Gebiet der Bearbeitung von Proteinen und der Glycoprotein-Hormone, die normalerweise als Heterodimere auftreten. Insbesondere betrifft die Erfindung einzelkettige Formen von Chorion-Gonadotropin (CG), thyroidstimulierendem Hormon (TSH), luteinisierendem Hormon (LH) und Follikel-stimulierendem Hormon (FSH).
Hintergrund der Erfindung
Beim Menschen weisen vier wichtige Glycoprotein-Hormon-Heterodimere (LH, FSH, TSH und CG) identische α-Untereinheiten und unterschiedliche β-Untereinheiten auf. Drei dieser Hormone kommen auch in praktisch sämtlichen übrigen Wirbeltier-Spezies vor. CG wurde bisher nur in Primaten und in der Plazenta und im Urin vom Pferd festgestellt.
Die PCT-Anmeldung WO-90/09800, Veröffentlichungstag 7. September 1990, beschreibt eine Anzahl von modifizierten Formen dieser Hormone. Eine wichtige Modifikation ist eine C-terminale Erweiterung der β-Untereinheit durch das carboxyterminale Peptid von humanem Chorion-Gonadotropin oder einer Variante davon. Weitere Muteine dieser Hormone werden ebenfalls beschrieben. Die einschlägigen Positionen für das CTP liegen im Bereich von einer beliebigen Position 112-118 bis zur Position 145 der β-Untereinheit von humanem Chorion-Gonadotropin. Die PCT-Anmeldung beschreibt Varianten der CTP-Erweiterung, die durch konservative Aminosäuresubstitutionen in der Weise erhalten worden sind, dass die Fähigkeit des CTP zur Veränderung der Clearance-Eigenschaften nicht beseitigt werden. Ferner beschreibt die US-Anmeldung SN-08/049,869, Anmeldetag 20. April 1993, die Modifikation dieser Hormone durch Erweiterung mit oder Insertion von CTP an Stellen, die vom C-Terminus abweichen und unter Verwendung von CTP-Fragmenten, die kürzer sind als die Sequenz, die sich von den Positionen 112-118 bis 145 erstreckt.
Die CTP-erweiterte β-Untereinheit von FSH wird auch in zwei Artikeln der vorliegenden Anmelder beschrieben: P.S. LaPolt et al., Endocrinology, Bd. 131 (1992), S. 2514-2520; und F. A. Fares et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 89 (1992), 5. 4304-4308.
Die Kristallstruktur der heterodimeren Form von humanem Chorion-Gonadotropin wurde nunmehr in mehr oder weniger gleichzeitigen Artikeln veröffentlicht: einer von A. J. Lapthorn et al., Nature, Bd. 369 (1994), S. 455-461, und der andere von H. Wu et al., Structure, Bd. 2 (1994), S. 545-558. Die Ergebnisse dieser Artikel werden von D. J. Patel, Nature, Bd. 369 (1994), S. 438-439, zusammengefasst.
In mindestens einem Fall ist nunmehr die erfolgreiche Herstellung einer einzelkettigen Form eines Heterodimeren bekannt. Das natürlich vorkommende Süßungsmittel-Protein Monellin wird in einer heterodimeren Form aus Serendipity-Beeren isoliert. Untersuchungen über die Kristallstruktur des Heterodimeren stimmten mit dem Vorschlag überein, dass der C-Terminus der B-Kette mit dem N-Terminus der A-Kette über einen Linker, der die räumlichen Eigenschaften der heterodimeren Form bewahrt, verbunden ist. Eine derartige Verknüpfung ist vorteilhaft, da es zur Verwendung als Süßungsmittel-Protein von Vorteil sein sollte, dieses Molekül in einer bei hohen Temperaturen stabilen Form bereitzustellen. Dies wurde in erfolgreicher Weise durch Herstellung der einzelkettigen Form erreicht, wodurch die Wärmedenaturierung vermieden wird; vergl. US-Patent 5,264,558.
Die PCT-Anmeldung WO-91/16922, Veröffentlichungstag 14. November 1991, beschreibt eine Vielzahl von Chimären und anderweitig modifizierten Formen der heterodimeren Glycoprotein-Hormone. Im allgemeinen konzentriert sich die Offenbarung auf Chimäre von α-Untereinheiten oder β-Untereinheiten unter Beteiligung von Bereichen verschiedener α- bzw. β-Ketten. Ein Konstrukt, das in dieser Anmeldung lediglich aufgelistet und nicht anderweitig beschrieben wird, fusioniert im wesentlichen die Gesamtheit der β-Kette von humanem Chorion-Gonadotropin mit dem α-Untereinheit-Präprotein, d. h. unter Einschluß der sekretorischen Signalsequenz für diese Untereinheit. Dieses Konstrukt fällt nicht unter den Umfang der vorliegenden Erfindung, da die Anwesenheit der Signalsequenz zwischen der β- und α-Kette nicht als Linkerrest gemäß der hier gegebenen Definition und Beschreibung dienen kann.
Es wurde nunmehr festgestellt, dass die normalerweise heterodimeren Glycoprotein-Hormone ihre Eigenschaften in der einzelkettigen Form behalten, einschließlich einzelkettige Formen, die die verschiedenen hier beschriebenen CTP-Erweiterungen und Insertionen enthalten.
Offenbarung der Erfindung
Die Erfindung stellt einzelkettige Formen der Glycoprotein-Hormone bereit, wobei mindestens einige dieser Hormone in den meisten Wirbeltier-Spezies auftreten. Die erfindungsgemäßen einzelkettigen Formen können glycosyliert, partiell glycosyliert oder nicht-glycosyliert sein und die α- und β-Ketten (oder β und β), die in den nativen Glycoprotein-Hormonen oder Varianten davon vorkommen, können gegebenenfalls über einen Linkerrest verknüpft sein. Besonders bevorzugte Linkerreste umfassen die carboxyterminale Peptid (CTP)-Einheit entweder als vollständige Einheit oder nur als ein Teil davon. Die resultierenden einzelkettigen Hormone behalten entweder die Aktivität der unmodifizierten heterodimeren Form oder sind Antagonisten dieser Aktivität.
Somit ist gemäß einem Aspekt die Erfindung auf einen Agonisten oder Antagonisten von Glycoprotein-Hormonaktivität abgestellt, wobei es sich beim Agonisten oder Antagonisten um ein glycosyliertes oder nichtglycosyliertes Protein handelt, das folgendes umfasst:
α-β, β-α oder β-β,
wobei das Glycoprotein-Hormon aus der Gruppe Follikel-stimulierendes Hormon (FSH), luteinisierendes Hormon (LH), Chorion-Gonadotropin (CG) und thyroidstimulierendes Hormon (TSH) ausgewählt ist;
wobei die α- und β- oder β und β-Untereinheiten kovalent gebunden sind, und zwar gegebenenfalls über einen Linkerrest;
wobei α die native Aminosäuresequenz der α-Untereinheit, die bei Glycoprotein-Hormonen üblich ist, oder eine Variante davon darstellt und β oder die einzelnen Reste β unabhängig voneinander die β-Untereinheit eines Glycoprotein-Hormons oder einer Variante davon darstellt, wobei es sich bei einer Variante der genannten α- oder β-Untereinheit um eine modifizierte Form dieser Untereinheit handelt, die 1 bis 10 Deletionen oder Substitutionen enthält, wobei es sich bei den Substitutionen um konservative Substitutionen handelt,
wobei es sich beim Linker um einen hydrophilen Rest handelt, der die α- und β- oder β- und β-Untereinheiten ohne Beeinträchtigung von deren Aktivität verbindet, mit der Maßgabe, dass der Linker nicht ein. Signalpeptid unmittelbar stromaufwärts von der stromabwärtigen Untereinheit einschließt; und
wobei dann, wenn es sich bei der β-Untereinheit um eine Chorion-Gonadotropin-β-Untereinheit in Verknüpfung mit einer α-Untereinheit handelt, der Linker abwesend ist oder nicht aus einem Linker mit 1 bis 16 Aminosäurerresten besteht.
Ferner beschreiben wir glycosylierte oder nicht-glycosylierte einzelkettige Formen der biologisch wichtigen Dimeren, deren Wirksamkeit aufgrund der einzelkettigen Formen des Hormon-Quartetts angenommen wird. Darunter fallen die einzelkettigen Formen der Interleukine3 und 12 (IL-3 und IL-12), des Tumor-Nekrosefaktors (TNF), des transformierenden Wachstumsfaktors (TGF) sowie von Inhibin. Ferner fallen darunter hybride Interleukine, z. B. einzelkettige Formen von einer Untereinheit aus IL-3 und der anderen Untereinheit aus IL-12.
Gemäß weiteren Aspekten ist die Erfindung auf rekombinante Materialien und Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen einzelkettigen Proteine, auf pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese Bestandteile enthalten, auf dafür spezifische Antikörper und auf Verfahren zu deren Herstellung abgestellt.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Konstruktion eines SalI-gebundenen DNA-Fragements durch Fusion des dritten Exons von CGβ mit dem zweiten Exon, das für die α-Untereinheit kodiert.
2 zeigt die Aminosäuresequenz und die Numerierung der Positionen 112-145 von humanem CGβ.
3 zeigt die Ergebnisse eines kompetitiven Bindungstests für den FSH-Rezeptor für verschiedene FSH-Rnaloge.
4 zeigt die Ergebnisse eines Signal-Transduktionstests bezüglich des FSH-Rezeptors für verschieden FSH-Analoge. Ausführungsformen zur Durchführung der Erfindung Vier "Glycoprotein"-Hormone bilden beim Menschen eine Familie, zu denen humanes Chorion-Gonadotropin (hCG), follikel-stimulierendes Hormon (FSH), luteinisierendes Hormon .(LH) und thyroidstimulierendes Hormon (TSH) gehören. Der hier verwendete Ausdruck "Glycoprotein-Hormone" bezieht sich auf die Mitglieder dieser Familie, unabhängig davon, ob sie beim Menschen oder in anderen Wirbeltieren auftreten. Alle diese Hormone sind Heterodimere, die aus α-Untereinheiten, die für eine gegebene Spezies eine identische Aminosäuresequenz innerhalb der Gruppe aufweisen, und β-Untereinheiten, die sich entsprechend dem Mitglied der Familie unterscheiden, bestehen. Somit treten normalerweise diese Glycoprotein-Hormone als Heterodimere auf, die aus α- und β-Untereinheiten bestehen, die miteinander assoziiert sind, jedoch nicht notwendigerweise kovalent verknüpft sind. Die meisten Wirbeltiere erzeugen FSH, TSH und LH, während Chorion-Gonadotropin nur in Primaten, einschließlich Menschen und Pferden gefunden wird. Eine spezifische Form von CG von Pferden wurde als Glycoprotein aus dem Serum trächtiger Stuten (PMSG), "pregnant mare Serum glycoprotein") bezeichnet.
Somit besteht dieses Hormon-"Quartett" aus Heterodimeren, bei denen die α- und β-Untereinheiten jeweils in unterschiedlichen Genen kodiert und vom Wirt getrennt synthetisiert werden. Der Wirt setzt die getrennt synthetisierten Untereinheiten zu einem nicht-kovalent verknüpften heterodimeren Komplex zusammen. Auf diese Weise unterscheiden sich die Heterodimeren dieses Hormon-Quartetts von Heterodimeren, wie Insulin, die aus einem einzigen Gen synthetisiert werden (in diesem Fall mit einer intervenierenden "Pro"-Sequenz) und die Untereinheiten sind unter Verwendung von Disulfid-Bindungen kovalent aneinander gekuppelt. Dieses Hormon-Quartett unterscheidet sich auch von den Immunoglobulinen, die aus unterschiedlichen Loci zusammengesetzt werden, die aber kovalent über Disulfidverknüpfungen gebunden sind. Andererseits wird Monellin, bei dem es sich jedoch um ein Pflanzenprotein handelt, durch eine nicht-kovalente Wechselwirkung zwischen seinen A- und B-Ketten zusammengehalten. Bisher ist nicht bekannt, ob die beiden Ketten an getrennten Genen kodiert werden.
Somit gibt es eine Vielzahl von Faktoren, die einen Einfluß bei der Festlegung des Verhaltens von biologisch aktiven Verbindungen ausüben, bei denen es sich um Dimere handelt, die aus identischen oder unterschiedlichen Untereinheiten gebildet werden. Die Untereinheiten können kovalent oder nicht-kovalent gebunden sein. Sie können durch gleiche oder verschiedene Gene synthetisiert werden und sie können in ihren Vorläuferformen eine "Pro"-Sequenz, die die beiden Bestandteile des Dimeren verknüpft, enthalten oder nicht. Auf der Grundlage der Ergebnisse, die mit den einzelkettigen Formen des Glycoprotein-Hormon-Quartetts hier erhalten worden sind, ist es offensichtlich, dass einzelkettige Formen der biologisch aktiven Dimeren Interleukin-12, Interleukin-3 (IL-12 und IL-3), Inhibin, Tumor-Nekrosefaktor (TNF) und transformierender Wachstumsfaktor (TGF) ebenfalls biologisch aktiv sind.
Die einzelkettigen Formen der Heterodimeren oder Homodimeren weisen gegenüber ihren dimeren Formen eine Anzahl von Vorteilen auf. Erstens sind sie im allgemeinen stabiler. Insbesondere LH ist für seine Instabilität und seine kurze Halbwertszeit bekannt. Zweitens werden die Schwierigkeiten bei der rekombinanten Herstellung verringert, da nur ein einziges Gen transkribiert, translatiert und prozessiert werden muß. Dies ist von besonderer Bedeutung für die Expression in Bakterien. Drittens stellen sie selbstverständlich eine alternative Form dar, die eine Feinabstimmung von Aktivitätsgraden und in vivo-Halbwertszeiten ermöglicht. Schließlich stellen einzelkettige Formen besondere Ausgangsmaterialien zum Identifizieren von geschnittenen Formen mit der Aktivität des Dimeren dar. Die Verknüpfung zwischen den Untereinheiten ermöglicht es, das Protein ohne Störung der Gesamtfaltung des Proteins zu manipulieren.
Merkmale der Mitglieder des Quartett
Die β-Untereinheit von hCG ist erheblich größer als die übrigen β-Untereinheiten, da sie etwa 34 zusätzliche Aminosäuren am C-Terminus enthält, der hier als carboxyterminaler Bereich (CTP) bezeichnet wird, der bei Glycosylierung an den O-verknüpften Stellen als verantwortlich für die vergleichsweise längere Serumhalbwertszeit von hCG im Vergleich zu anderen Gonadotropinen angesehen wird (M. Matzuk et al., Endocrinol, Bd. 126 (1989), S. 376). Im nativen Hormon enthält diese CTP-Erweiterung vier mucinartige, O-verknüpfte Oligosaccharide.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform sind die α- und β-Ketten der Glycoprotein-Hormone zu einem einzelkettigen proteinartigen Material gekuppelt, bei dem die α- und β-Kette kovalent gegebenenfalls über einen Linkerrest verknüpft sind. Der Linkerrest kann eine weitere Aminosäuresequenz umfassen und insbesondere können die hier beschriebenen CTP-Einheiten vorteilhafterweise im Linker enthalten sein. Ferner kann der Linker Peptid- oder Nichtpeptid-Arzneistoffe enthalten, die auf die Rezeptoren für die Hormone abgestellt sind.
Zusätzlich zur Kopf-Schwanz-Konfiguration, die durch einfaches Kuppeln der beiden Peptidketten über eine Peptidbindung erhältlich ist, können die α- und β-Ketten Kopf-an-Kopf oder Schwanz-an-Schwanz verknüpft sein. Kopf-an-Kopf- und Schwanz-an-Schwanz-Kupplungen beinhalten Vorgänge der synthetischen Chemie unter Anwendung von üblichen Techniken zur Verknüpfung von zwei Carboxyl- oder zwei Aminogruppen über einen Linkerrest. Beispielsweise können zwei Aminogruppen über ein Anhydrid oder über ein Dicarbonsäurederivat verknüpft werden. Zwei Carboxylgruppen können über Diamine oder Diole unter Anwendung üblicher Aktivierungstechniken verknüpft werden. Bei einer besonders bevorzugten Form handelt es sich jedoch um eine Kopf-Schwanz-Konfiguration, bei der übliche Peptidverknüpfungen ausreichen und wobei die einzelkettige Verbindung in rekombinanter Weise als ein Fusionsprotein oder unter Anwendung von Peptid-Synthesetechniken entweder in einer einzigen Kette oder vorzugsweise unter Verknüpfung von einzelnen Bereichen der gesamten Sequenz hergestellt werden kann. Selbstverständlich können gegebenenfalls die Peptid- oder Nichtpeptid-Linkerreste auch in diesem Fall verwendet werden, wobei dies aber nicht notwendig ist und es die bequeme rekombinante Herstellung des einzelkettigen Proteins als empfehlenswert erscheinen lässt, dass Ausführungsformen, die dieses Herstellungsverfahren ermöglichen, die mit Abstand bevorzugteste Vorgehensweise darstellen.
Bei Anwendung einer Kopf-an-Schwanz-Konfiguration können Linker im wesentlichen aus einer zusätzlichen Peptidsequenz bestehen. Wie es bei den Heterodimeren der Fall ist, können die beiden β-Ketten über eine CTP-Einheit verknüpft werden, wie nachstehend näher ausgeführt wird. Somit umfassen mögliche Ausführungsformen der Erfindung (mit dem N-Terminus auf der linken Seite) α-FSHβ, β-FSH α, α-βLH, α-CTP-βLH, βLH-CTP-α, CTP-βLH-CTP-α und dergleichen.
Die einzelkettigen Formen der heterodimeren Gonadotropine oder des Glycoprotein-Quartetts beziehen sich auch auf zusätzliche wichtige Sätze von Ausführungsformen, bei denen anstelle einer Kupplung der α- und β-Untereinheiten zwei β-Untereinheiten miteinander unter Bildung einer einzelkettigen Verbindung gekuppelt sein können. Wie beim Heterodimeren kann die Kupplung Kopf-an-Kopf, Kopf-an-Schwanz oder Schwanz-an-Schwanz erfolgen.
Die einzelkettigen "2β"-Tandempeptide eignen sich insbesondere als Antagonisten für die Rezeptoren, die normalerweise durch die heterodimeren Glycoprotein-Hormone aktiviert werden. Da angenommen wird, dass die α-Untereinheit weitgehend für die Signaltransduktion verantwortlich ist, während die β-Untereinheit Rezeptorspezifität verleiht, und da die α- und β-Untereinheiten ähnliche Konformationen aufweisen, sollten die einzelkettigen Verbindungen zur spezifischen Bindung an einen Rezeptor, für den mindestens eine β-Kette vorhanden ist, ohne Aktivierung des Rezeptors befähigt sein.
Die antagonistische Aktivität der einzelkettigen "2-β"-Tandempeptide beruht zum Teil auf der Kristallstruktur der Heterodimeren. Es ist darauf hinzuweisen, dass die α- und β-Ketten ähnliche Cystin- Knotenkonfigurationen aufweisen und dass einige der Faltmuster der beiden Ketten analog sind.
Die erfindungsgemäßen einzelkettigen "2-β"-Verbindungen können so konstruiert sein, dass sie Tandemkopien der gleichen β-Untereinheit enthalten, d. h. FSHβ-FSHβ; HCGβ-HCGβ; TSHβ-TSHβ; oder LHβ-LHβ; oder es können _Chimäre, einzelkettige Verbindungen verwendet werden, wie HCGβ-FSHβ; FSHβ-LHβ; LHβ-TSHβ und dergleichen. Es gibt insgesamt 12 mögliche Kombinationen. Zusätzlich verbessert das carboxylterminale Peptid (CTP) der HCGβ-Untereinheit die Konformation der einzelkettigen Verbindung, wenn es zwischen den beiden β-Ketten vorhanden ist. Dies ist automatisch der Fall, wenn HCGβ den stromaufwärtigen Bereich darstellt. In anderen Fällen ist es jedoch zweckmäßig, eine CTP-Untereinheit gemäß den hier gemachten Ausführungen am Carboxylterminus des stromaufwärtigen Teilnehmers zu verwenden. Zwei derartige CTP-Einheiten fallen ebenfalls unter den Umfang der Erfindung. Somit umfassen bevorzugte Ausführungsformen FSHβ-CTP-FSHβ; FSHβ-CTP-CTP-FSHβ; LHβ-CTP-FSHβ; LHβ-CTP-CTP-FSHβ und dergleichen.
Die folgenden Definitionen sind bei der Beschreibung der einzelkettigen Formen der Moleküle möglicherweise hilfreich.
Die hier verwendeten Ausdrücke α-Untereinheit sowie FSH-, LH-, TSHund CGβ-Untereinheiten entsprechen ebenso wie die heterodimeren Formen im allgemeinen ihren herkömmlichen Definitionen und beziehen sich auf die Proteine mit den aus dem Stand der Technik an sich bekannten Aminosäuresequenzen oder auf allele Varianten davon, unabhängig vom Glycosylierungsmuster, das sie zeigen.
"Native" Formen dieser Peptide sind solche Formen, die die Aminosäuresequenzen aufweisen, die sich bei Isolierung aus dem entsprechenden Wirbeltiergewebe ergeben und die diese an sich bekannten Sequenzen aufweisen, oder es handelt sich um deren allele Varianten.
"Variante" Formen dieser Proteine sind Formen, die gezielte Veränderungen der Aminosäuresequenz des nativen Proteins aufweisen, wie sie beispielsweise durch positionsspezifische Mutagenese oder durch andere rekombinante Manipulationen entstehen, oder es handelt sich um synthetisch hergestellte Produkte.
Diese Abänderungen bestehen aus 1-10, vorzugsweise 1-8 und insbesondere 1-5 Aminosäureänderungen, einschließlich Deletionen, Insertionen und Substitutionen, wobei insbesondere konservative Aminosäuresubstitutionen gemäß der nachstehenden Definition vorliegen.
Die sich ergebenden Varianten müssen eine Aktivität behalten, die die entsprechende Aktivität des nativen Hormons beeinflusst, d. h. sie müssen entweder die biologische Aktivität des nativen Hormons direkt beibehalten oder sie müssen sich als Antagonisten verhalten, im allgemeinen aufgrund ihrer Fähigkeit zur Bindung der Rezeptoren für die nativen Hormone, wobei ihnen aber die Fähigkeit zur Ausübung einer Signaltransduktion fehlt. Es ist beispielsweise bekannt, dass dann, wenn die Glycosylierungsstelle an der Position 52 der α-Untereinheit durch eine Aminosäuresubstitution beseitigt wird (wodurch jegliche Glycosylierung an dieser Stelle verhindert wird), die Hormone, bei denen es sich um Heterodimere mit dieser veränderten α-Untereinheit handelt, im allgemeinen Agonisten darstellen und zur Bindung von Rezeptoren befähigt sind, wobei sie in kompetitiver Weise das native Hormon an einer derartigen Bindung hindern. (Auf der anderen Seite scheint die Glycosylierungsstelle der α-Untereinheit in Position 78 die Aktivität der Hormone nicht stark zu beeinflussen.) Weitere Veränderungen der Aminosäuresequenz können ebenfalls zu einer antagonistischen anstelle einer agonistischen Aktivität für die Variante führen.
Bei einem Satz von bevorzugten Varianten handelt es sich um Produkte, bei denen die Gycosylierungsstellen der α- und/oder β-Untereinheiten abgeändert sind. Die α-Untereinheit enthält 2 Glycosylierungsstellen, eine in Position 52 und die andere in Position 78. Der Einfluß von Veränderungen dieser Stellen auf die Aktivität wurde unmittelbar vorher beschrieben. Gleichermaßen enthalten die β-Untereinheiten im allgemeinen 2N-verknüpfte Glycosylierungsstellen (an Positionen, die je nach der Natur der β-Kette etwas variieren), wobei sich ähnliche Abänderungen an diesen Stellen vornehmen lassen. Die CTP-Erweiterung von hCG enthält 4 O-verknüpfte Glycosylierungsstellen. Konservative Mutationen an den Serinresten (z. B. eine Umwandlung des Serins zu Alanin) zerstören diese Stellen. Eine Zerstörung der Overknüpften Glycosylierungsstellen kann eine Umwandlung von einer agonistischen Aktivität zu einer antagonistischen Aktivität bewirken.
Schließlich beeinflussen Veränderungen der Aminosäuresequenz, die proximal zu den N-verknüpften oder O-verknüpften Glycosylierungsstellen vorliegen, die Natur der Glycosylierung, die am resultierenden Molekül vorliegt, und verändern ferner die Aktivität.
Veränderungen der Aminosäuresequenz umfassen ferner sowohl Insertionen als auch Deletionen. Somit fallen geschnittene Formen der Hormone unter die Varianten, z. B. Mutanten der α-Untereinheit, denen einige oder sämtliche Aminosäuren an den Positionen 85-92 am C-Terminus fehlen. Ferner fallen darunter α-Untereinheiten, bei denen vom N-Terminus 1 bis 10 Aminosäuren deletiert worden sind. Einige geeignete Varianten des hier beschriebene Hormon-Quartetts sind im US-Patent 5 177 193 (Ausgabetag 5. Januar 1993), auf das durch Verweis Bezug genommen wird, beschrieben. Wie dort dargelegt, können die Glycosylierungsmuster verändert werden, indem man die entsprechenden Stellen zerstört oder indem man alternativ eine Wirtszelle wählt, in der das Protein erzeugt wird.
Wie vorstehend erläutert, handelt es sich bei den einzelkettigen Formen um zweckmäßige Ausgangsmaterialien für verschieden manipulierte Muteine. Derartige Muteine umfassen Produkte, bei denen nicht-kritische Regionen verändert oder beseitigt worden sind. Derartige Deletionen und Veränderungen können gesamte Schleifen umfassen, so dass Sequenzen von erheblich mehr als 10 Aminosäuren deletiert oder abgeändert worden sind. Die einzelkettigen Moleküle müssen jedoch mindestens die Rezeptor-Bindungsdomänen und/oder die an der Signaltransduktion beteiligten Regionen beibehalten.
Es gibt umfangreiche Literatur über Varianten des hier beschriebenen Hormon-Quartetts. Aus dieser Literatur geht klar hervor, dass eine große Anzahl von möglichen Varianten, die sowohl zu agonistischer als auch zu antagonistischer Aktivität führen, hergestellt werden können. Derartige Varianten werden beispielsweise in folgenden Literaturstellen beschrieben: F. Chen et al., Molec. Endocrinol., Bd. 6 (1992), S. 914-919; J. Yoo et al., J. Biol. Chem., Bd. 268 (1993), S. 13034-13042; J. Yoo et al., J. Biol. Chem., 8d. 266 (1991), 5. 17741-17743; D. Puett et al., Glycoprotein Hormones, Herausgeber J. W. Lusbader et al., Springer Verlag New York, (1994), S. 122-134; H. T. Kuetmann et al. (a.a.O.), 5. 103-117; L. D. Erickson et al., Endocrinology, Bd. 126 (1990), 5. 2555-2560; und M. Bielinska et al., J. Cell. Biol., Bd. 111 (1990), S. 330a (Abstract 1844).
Wie vorstehend ausgeführt, besteht ein Verfahren zur Konstruktion von wirksamen Antagonisten in der Herstellung eines einzelkettigen Moleküls, das zwei β-Untereinheiten des gleichen oder eines unterschiedlichen Mitglieds des Glycoprotein-Quartetts enthält. Zu besonders bevorzugten Varianten dieser einzelkettigen Formen gehören Produkte, bei denen eine oder mehrere Cystin-Bindungen deletiert worden sind, typischerweise durch Ersetzen von einem oder beiden Cysteinen, die an der Verknüpfung teilnehmen, durch eine neutrale Aminosäure. Besonders bevorzugte Cystin-Verknüpfungen, die deletiert werden können, befinden sich zwischen den Positionen 26 und 110 und zwischen den Positionen 23 und 72.
Ferner wurde nachgewiesen, dass die β-Untereinheiten des Hormon-Quartetts in Chimären Formen konstruiert werden können, so dass biologische Funktionen beider Komponenten der Chimäre bereitgestellt werden können, oder im allgemeinen Hormone mit einer veränderten biologischen Funktion. Somit lassen sich Chimäre Moleküle, die sowohl FSH- als auch LH/CG-Aktivitäten aufweisen, gemäß den Angaben von Moyle, Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 88 (1991), S. 760-764; Moyle, Nature, Bd. 368 (1994), S. 251-255, konstruieren. Wie in diesen Literaturstellen ausgeführt, erhält man durch Einsetzen der Aminosäuren 101-109 von FSH-β anstelle der entsprechenden Reste in der CG-β-Untereinheit ein Analoges, das sowohl hCG- als auch FSH-Aktivität aufweist.
Diese Chimären Formen von β-Untereinheiten können auch in den einzelkettigen Verbindungen verwendet werden, die zwei β-Untereinheiten zu einem einzigen Molekül kuppeln.
Obgleich es bekannt ist, dass das Glycosylierungsmuster einen großen Einfluß auf die Aktivität sowohl in qualitativer als auch in quantitativer Hinsicht ausübt, beziehen sich aus Zweckmäßigkeitsgründen die Ausdrücke FSH-, LH-, TSH- und CG-β-Untereinheiten auf die Aminosäuresequenz-Charakteristiken der Peptide, wie es für die "α-Untereinheit" der Fall ist. Wenn nur auf die β-Kette Bezug genommen wird, lautet der Ausdruck beispielsweise FSHβ. Bei Bezugnahme auf das Heterodimere wird der einfache Ausdruck "FSH" verwendet. Aus dem Zusammenhang geht klar hervor, in welcher Weise das Glycosylierungsmuster beispielsweise durch einen rekombinanten Expressionswirt oder Veränderung der Glycosylierungsstellen beeinflusst wird. Formen des Glycoproteins mit bestimmten Glycosylierungsmustern werden als solche bezeichnet.
Die Ausdrücke "Peptid" und "Protein" werden in austauschbarer Weise verwendet, da die Längenunterscheidung zwischen diesen Ausdrücken willkürlich ist.
In den erfindungsgemäßen einzelkettigen Formen kann die α- und/oder β-Kette eine CTP-Erweiterung enthalten, die in eine nicht-kritische Region inseriert ist.
Bei den "nicht-kritischen" Regionen der α- und β-Untereinheiten handelt es sich um die Regionen der Moleküle, die für die biologische Aktivität (einschließlich der agonistischen und antagonistischen Aktivität) nicht erforderlich sind. Im allgemeinen werden diese Regionen von Bindungsstellen, Vorläufer-Spaltungsstellen und katalytischen Regionen entfernt. Regionen, die zur Induktion einer einwandfreien Faltung, Bindung an Rezeptoren, katalytische Aktivität und dergleichen erforderlich sind, sind zu vermeiden. Gleichermaßen sind Regionen, die zur Gewährleistung der dreidimensionalen Konformation des Proteins kritisch sind, zu vermeiden. Es ist darauf hinzuweisen, dass einige der Regionen, die im Fall von Dimeren kritisch sind, in einzelkettigen Formen nicht-kritisch werden, da die durch die Einzelkette auferlegte Konformationsrestriktion die Notwendigkeit für diese Regionen überflüssig machen kann. Die Ermittlung der nicht-kritischen Regionen läßt sich leicht vornehmen, indem man die in Frage kommenden Regionen deletiert oder modifiziert und den entsprechenden Test auf die gewünschte Aktivität durchführt. Regionen, in denen Modifikationen zu einem Aktivitätsverlust führen, sind kritisch. Regionen, bei denen eine Veränderung zu einer gleichen oder ähnlichen Aktivität führt (einschließlich einer antagonistischen Aktivität) werden als nicht-kritisch angesehen.
Es ist zu betonen, dass unter "biologischer Aktivität" eine Aktivität zu verstehen ist, die zur Aktivität der nativen Hormone agonistisch oder antagonistisch ist. Somit sind bestimmte Regionen für das Verhalten einer Variante als Antagonist kritisch, selbst wenn der Antagonist nicht dazu befähigt ist, direkt für die physiologische Wirkung des Hormons zu sorgen.
Beispielsweise werden für die α-Untereinheit die Positionen 33-59 für die Signaltransduktion als erforderlich angesehen, und die Länge von 20 Aminosäuren am Carboxy-Terminus wird für die Signaltransduktion/Rezeptorbindung benötigt. Reste, die für das Zusammenfügen der β-Untereinheit kritisch sind, umfassen mindestens die Reste 33-58 und insbesondere 37-40.
Sofern sich die nicht-kritische Region "proximal" zum N- oder C-Terminus befindet, erfolgt die Insertion an einer beliebigen Position innerhalb von 10 Aminosäuren zum Terminus, vorzugsweise innerhalb von 5 Aminosäuren und ganz besonders am Terminus an sich.
Im allgemeinen wird der Ausdruck "proximal" dazu verwendet, eine Position anzugeben, die sich innerhalb von 10 Aminosäuren und vorzugsweise innerhalb von 5 Aminosäuren einer Referenzposition und insbesondere an der Referenzposition an sich befindet. Somit können bestimmte Varianten Substitutionen von Aminosäuren "proximal" zu einer Glycosylierungsstelle enthalten. Hierbei gilt diese Definition.
Ferner können die α- und β-Untereinheiten miteinander an Positionen verknüpft sein, die "proximal" zu ihren N- oder C-Termini sind.
Der hier verwendete Ausdruck "CTP-Einheit" bezieht sich auf eine Aminosäuresequenz, die am Carboxyterminus der humanen Chorion-Gonadotropin-β-Untereinheit, die sich von den Aminosäuren 112-118 bis zum Rest 145 am C-Terminus erstreckt oder einen Teil davon ausmacht, auftritt. Somit enthält jede "vollständige" CTP-Einheit 28-34 Aminosäuren, je nach dem N-Terminus des CTP. Die native Sequenz der Positionen 112-145 ist in 2 gezeigt.
Unter einer "partiellen" CTP-Einheit ist eine Aminosäuresequenz zu verstehen, die zwischen den Positionen 112-118 bis einschließlich 145 auftritt, bei der aber mindestens eine Aminosäure von der kürzesten möglichen "vollständigen" CTP-Einheit (d. h. von den Positionen 118-145) deletiert ist. Die "partiellen" CTP-Einheiten, die unter die Erfindung fallen, enthalten vorzugsweise mindestens eine O-Glycosylierungsstelle, wenn eine agonistische Aktivität angestrebt wird. Einige nichtglycosylierte Formen der Hormone stellen Antagonisten dar und sind als solche wertvoll. Die CTP-Einheit enthält vier derartige Stellen an den Serinresten in den Positionen 121 (Stelle 1); 127 (Stelle 2); 132 (Stelle 3); und 138 (Stelle 4). Die partiellen Formen von CTP, die sich in erfindungsgemäßen Agonisten eignen, enthalten eine oder mehrere dieser Stellen, die in der Reihenfolge angeordnet sind, in der sie in der nativen CTP-Sequenz auftreten. Somit kann die in den erfindungsgemäßen Agonisten verwendete "partielle" CTP-Einheit sämtliche vier Glycosylierungsstellen; die Stellen 1, 2 und 3; die Stellen 1, 2 und 4; die Stellen 1, 3 und 4; die Stellen 2, 3 und 4; oder nur die Stellen 1 und 2; 1 und 3; 1 und 4; 2 und 3; 2 und 4; oder 3 und 4; oder lediglich eine der Stellen 1, 2, 3 oder 4 aufweisen.
Unter dem Ausdruck "Tandem"-Inserts oder -Erweiterungen ist zu verstehen, dass das Insert oder die Erweiterung mindestens zwei "CTP-Einheiten" enthält. Jede CTP-Einheit kann vollständig oder fragmentär sein. Dabei kann es sich um ein natives Produkt oder um eine Variante handeln. Sämtliche CTP-Einheiten in der Tandem-Erweiterung oder -Insert können identisch sein oder sie können sich voneinander unterscheiden.
Somit kann die Tandem-Erweiterung oder das Tandem-Insert beispielsweise allgemein partiell-vollständig; partiell-partiell; partiell-vollständigpartiell; vollständig-vollständig-partiell; und dergl. sein, wobei es sich bei jeder der angegebenen partiellen oder vollständigen CTP-Einheiten unabhängig um eine Variante oder um die native Sequenz handeln kann.
Beim "Linkerrest" handelt es sich um einen Rest, der die α- und β-Sequenzen verbindet, ohne die Aktivität zu beeinträchtigen, die sich ansonsten durch die gleichen α- und β-Ketten als Mitglieder eines Heterodimeren ergeben würden, oder der die Aktivität von einer agonistischen in eine antagonistische Aktivität umwandelt. Der Aktivitätsgrad kann sich innerhalb eines vernünftigen Bereiches ändern, wobei aber die Anwesenheit des Linkers sich nicht so auswirken kann, dass die einzelkettige Form frei sowohl von einer wesentlichen agonistischen Aktivität als auch von einer wesentlichen antagonistischen Aktivität ist. Die einzelkettige Form muß als einzelkettige Form erhalten bleiben, wenn sie aus dem Produktionsmedium gewonnen wird, und sie muß eine Aktivität aufweisen, die sich auf die hormonelle Aktivität des Heterodimeren, dessen Elemente die Bestandteile der einzelkettigen Form darstellen, bezieht.
Varianten
Die Hormon-Untereinheiten und die CTP-Einheiten können genau dem nativen Hormon oder der CTP-Sequenz entsprechen oder es kann sich um Varianten handeln. Die Natur der Varianten wurde vorstehend definiert. In den Varianten sind 1-10, vorzugsweise 1-8 und insbesondere 1-5 der Aminosäuren, die in der nativen Sequenz enthalten sind, durch im Vergleich zur nativen Aminosäure an dieser Position unterschiedliche Aminosäuren substituiert, oder es sind lediglich 1-10, vorzugsweise 1-8 und insbesondere 1-5 Aminosäuren deletiert, oder es liegt eine Kombination davon vor. Wie vorstehend betont, kann dann, wenn nichtkritische Regionen der einzelkettigen Formen identifiziert werden, insbesondere durch Nachweis des Vorliegens von nicht-kritischen "Schleifen", die Anzahl der durch Deletion oder Substitution veränderten Aminosäuren auf 20 oder 30 oder auf eine beliebige willkürliche Zahl erhöht werden, und zwar in Abhängigkeit von der Länge der Aminosäuresequenz in der einschlägigen, nicht-kritischen Region. Selbstverständlich führen Deletionen oder Substitutionen in mehr als einer nicht-kritischen Region dazu, dass in den einzelkettigen Formen eine noch größere Anzahl an Aminosäuren betroffen ist, wobei Substitionsund Deletionsstrategien in Kombination miteinander verwendet werden können. Die Substitutionen oder Deletionen führen zusammen genommen nicht zu einer erheblichen Beseitigung von agonistischer oder antagonistischer Aktivität, die mit dem Hormon verbunden ist. Substitutionen durch konservative "Analoge" der nativen Aminosäure werden bevorzugt.
Unter einem "konservativen Analogen" ist im herkömmlichen Sinn ein Analoges zu verstehen, bei dem der eingeführte Rest der gleichen allgemeinen Aminosäurekategorie wie der Rest, der substituiert worden ist, angehört. Aminosäuren lassen sich in derartige Gruppen einteilen, wie aus dem Stand der Technik bekannt ist, z. B. aus M. Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequences and Structure, Bd. 5 (1972), S. 89-99. Im allgemeinen fallen saure Aminosäuren in eine Gruppe; basische Aminosäuren in eine weitere Gruppe; neutrale, hydrophile Aminosäuren in eine noch andere Gruppe; und dergl.
Insbesondere lassen sich Aminosäurereste im allgemeinen in die vier folgenden Hauptklassen einteilen:
Saure Reste: Der Rest weist aufgrund eines Verlustes an H-Ionen bei einem physiologischen pH-Wert eine negative Ladung auf und der Rest wird von einer wässrigen Lösung angezogen, so dass er in der Konformation eines Peptids, in dem er enthalten ist, eine Oberflächenposition anstrebt, wenn sich das Peptid in einem wässrigen Medium mit einem physiologischen pH-Wert befindet.
Basische Aminosäuren: Der Rest weist aufgrund einer Assoziation mit H-Ionen bei einem physiologischen pH-Wert eine positive Ladung auf und der Rest wird durch eine wässrige Lösung angezogen, so dass er in der Konformation eines Peptids, in dem er enthalten ist, die Oberflächenpositionen anstrebt, wenn sich das Peptid in einem wässrigen Medium bei einem physiologischen pH-Wert befindet.
Neutrale/unpolare Aminosäuren: Die Reste sind bei einem physiologischen pH-Wert ungeladen und werden durch eine wässrige Lösung abgestoßen, so dass sie in der Konformation eines Peptids, in dem sie enthalten sind, innere Positionen anstreben, wenn sich das Peptid in einem wässrigen Medium befindet. Diese Reste werden hier auch als "hydrophob" bezeichnet.
Neutrale/polare Reste: Die Reste sind bei einem physiologischen pH-Wert ungeladen, werden aber durch eine wässrige Lösung angezogen, so dass sie in der Konformation eines Peptids, in dem sie enthalten sind, die äußeren Positionen anstreben, wenn sich das Peptid in einem wässrigen Medium befindet.
Es ist selbstverständlich, dass in einer statistischen Ansammlung von Molekülen einzelner Reste einige Moleküle geladen sind und einige nicht und somit in einem mehr oder minder großen Umfang eine Anziehung oder Abstoßung durch ein wässriges Medium gegeben ist. Damit die Definition "geladen" erfüllt wird, ist ein signifikanter prozentualer Anteil (mindestens etwa 25 %) der einzelnen Moleküle bei physiologischem pH-Wert geladen. Der Grad der Anziehung oder Abstoßung, der für die Einteilung als polar oder unpolar erforderlich ist, ist willkürlich und daher werden Aminosäuren, die erfindungsgemäß spezifisch in Betracht kommen, der einen oder anderen Klasse zugeordnet. Die meisten Aminosäuren, die nicht speziell aufgeführt sind, lassen sich auf der Grundlage ihres bekannten Verhaltens einteilen.
Aminosäurereste lassen sich ferner einer Unterklassifikation als cyclisch oder nicht-cyclisch und aromatisch oder nicht-aromatisch zuordnen – Klassifizierungen, die bezüglich der Seitenketten-Substituentengruppe der Reste selbsterklärend sind – sowie als klein oder groß. Ein Rest der als klein angesehen wird, enthält insgesamt 4 Kohlenstoffatome oder weniger, einschließlich des Carboxyl-Kohlenstoffatoms. Kleine Reste sind selbstverständlich immer nichtaromatisch.
Für die natürlich auftretenden Protein-Aminosäuren ergibt sich gemäß dem vorstehenden Schema folgende Unterklassifikation:

Sauer: Asparaginsäure und Glutaminsäure;
Basisch/nicht-cyclisch: Arginin, Lysin;
Basisch/cyclisch: Histidin;
Neutral/polar/klein: Glycin, Serin, Cystein;
Neutral/unpolar/klein: Alanin;
Neutral/polar/groß/nicht-aromatisch: Threonin, Asparagin, Glutamin;
Neutral/polar/groß/aromatisch: Tyrosin;
Neutral/unpolar/groß/nicht-aromatisch: Valin, Isoleucin, Leucin, Methionin;
Neutral/unpolar/groß/aromatisch: Phenylalanin und Tryptophan.

Die genetisch kodierte sekundäre Aminosäure Prolin fällt zwar technisch unter die Gruppe neutral/unpolar/groß/cyclisch/nicht aromatisch, stellt aber aufgrund ihrer bekannten Einflüsse auf die sekundäre Konformation von Peptidketten einen Sonderfall dar und wird daher nicht in diese definierte Gruppe aufgenommen.
Wenn die erfindungsgemäßen einzelkettigen Proteine durch rekombinante Verfahren konstruiert werden, enthalten sie nur genetisch kodierte Aminosäuresubstitutionen. Wenn jedoch irgendwelche Teile durch übliche Verfahren, z. B. durch Festphasen-Peptidsyntheseverfahren, synthetisiert und beispielsweise auf enzymatischem Wege mit dem restlichen Protein verknüpft werden, so können auch nicht-genetisch kodierte Aminosäuren, wie Aminoisobuttersäure (Aib), Phenylglycin (Phg), und dergl., als Ersatz für ihre analogen Gegenstücke verwendet werden.
Diese nicht-kodierten Aminosäuren umfassen ferner beispielsweise R-Alanin (β-Ala) oder andere Omega-Aminosäuren, wie 3-Aminopropionsäure, 4-Aminobuttersäure und dergl., Sarcosin (Sar), Ornithin (Orn), Citrullin (Cit), tert.-Butylalanin (t-BuA), tert.-Butylglycin (t-BuG), N-Methylisoleucin (N-MeIle) und Cyclohexylalanin (Cha), Norleucin (Nle), Cysteinsäure (Cya), 2-Naphthylalanin (2-Nal); 1,2,3,4-Tetrahydroisochinolin-3-carbonsäure (Tic); Mercaptovaleriansäure (Mvl); β-2-Thienylalanin (Thi); und Methioninsulfoxid (MSO). Diese Produkte fallen zweckmäßigerweise in spezielle Kategorien.
Auf der Grundlage der vorstehenden Definitionen gilt folgendes:

Sar, β-Ala und Aib sind neutral/unpolar/klein;
t-BuA, t-BuG, N-MeIle, Nle, Mvl und Cha sind neutral/unpolar/groß/nicht-aromatisch;
Orn ist basisch/nicht-cyclisch;
Cya ist sauer;
Cit, Acetyl-Lys und MSO sind neutral/polar/groß/nicht-aromatisch; und
Phg, Nal, Thi und Tic sind neutral/unpolar/groß/aromatisch.

Die verschiedenen Omega-Aminosäuren werden entsprechend ihrer Größe als neutral/unpolar/klein (β-Ala, d. h. 3-Aminopropionsäure, 4-Aminobuttersäure) oder groß (alle übrigen) klassifiziert.
Somit können auch Aminosäuresubstitutionen, die von genetisch kodierten Aminosäuren abweichen, in den erfindungsgemäßen Peptidverbindungen enthalten sein und gemäß ihrer Struktur in dieses allgemeine Schema eingeteilt werden.
Bevorzugte Ausführungsformen der einzelkettigen Hormone Die erfindungsgemäßen einzelkettigen Hormone lassen sich in besonders wirkungsvoller und wirtschaftlicher Weise durch rekombinante Techniken herstellen. Daher werden die Formen von α- und β-Ketten, CTP-Einheiten und anderen Linkerresten, die nur genetisch kodierte Aminosäuren enthalten, bevorzugt. Es ist jedoch möglich, wie vorstehend ausgeführt, zumindest Teile der einzelkettigen Hormone unter Anwendung synthetischer Peptidtechniken oder anderer organischer Synthesetechniken zu konstruieren. Somit fallen Varianten, die genetisch nicht kodierte Aminosäuren enthalten, unter den Umfang der Erfindung.
In den besonders bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen einzelkettigen Hormone ist der C-Terminus der β-Untereinheit kovalent gegebenenfalls über einen Linker mit dem N-Terminus der reifen a-Untereinheit verknüpft. Formen, bei denen der C-Terminus der a-Untereinheit mit dem N-Terminus der β-Untereinheit verknüpft ist, sind ebenfalls geeignet, können aber eine geringere Aktivität als Antagonisten oder Agonisten des entsprechenden Rezeptors aufweisen. Bei der Verknüpfung kann es sich um eine direkte Peptidverknüpfung handeln, bei der die C-terminale Aminosäure einer Untereinheit direkt über die Peptidbindung an den N-Terminus der anderen Untereinheit gebunden ist. Jedoch ist es in vielen Fällen bevorzugt, einen Linkerrest zwischen den beiden Termini aufzunehmen. In zahlreichen Fällen ergibt der Linkerrest mindestens eine β-Windung zwischen den beiden Ketten. Das Vorliegen von Prolinresten im Linker kann somit vorteilhaft sein.
Wie vorstehend ausgeführt, kann der N-Terminus der α-Kette auch an den N-Terminus der β-Kette gekuppelt sein oder der C-Terminus der α-Kette kann an den C-Terminus der β-Kette gekuppelt sein, und zwar in jedem Fall über eine Linkereinheit. Ähnliche Kombinationen fallen unter die einzelkettigen Formen mit zwei α- oder zwei β-Untereinheiten.
Es ist darauf hinzuweisen, dass bei der Erörterung von Verknüpfungen zwischen den Termini der Untereinheiten, die die einzelkettigen Formen umfassen, einer oder mehrere Termini durch Substitution und/oder Deletion gemäß den vorstehenden Ausführungen verändert werden können.
Bevorzugte Ausführungsformen der einzelkettigen Verbindungen mit einem Gehalt an zwei β-Untereinheiten sind solche, bei denen der C-Terminus von einer Einheit mit dem N-Terminus der anderen Einheit, gegebenenfalls über einen Linker und vorzugsweise über einen Peptidlinker, verknüpft sind. Ferner sind, wie vorstehend ausgeführt, Verknüpfungen zwischen den N-Termini der beiden β-Ketten oder Verknüpfungen zwischen den C-Termini der beiden β-Ketten möglich. In diesen Fällen ist selbstverständlich ein Linker erforderlich.
Während vorstehend die Kopf-an-Kopf-, Schwanz-an-Schwanz- und Kopfan-Schwanz-Konfigurationen sowohl des einzelkettigen Heterodimeren als auch der einzelkettigen Form mit zwei β-Untereinheiten beschrieben wurde, kann die Verknüpfung auch zwischen den beiden Untereinheiten an Positionen erfolgen, die nicht genau am N- oder C-Terminus der einzelnen Elemente liegen, sich jedoch in Positionen in der Nähe davon befinden.
In einem besonders bevorzugten Satz von Ausführungsformen erfolgt die Verknüpfung Kopf-an-Kopf und der Linkerrest enthält eine oder mehrere CTP-Einheiten und/oder Varianten oder geschnittene Formen davon. Nachstehend werden bevorzugte Formen von CTP-Einheiten, die in derartigen Linkerresten verwendet werden, beschrieben.
Ferner kann der Linkerrest einen kovalent und vorzugsweise lösbar an den Linkerrest gebundenen Arzneistoff enthalten. Mittel zur Kupplung des Arzneistoffes an den Linkerrest und zur Gewährleistung ihrer Freisetzung entsprechend den herkömmlichen Mitteln.
Zusätzlich zu ihrem Auftreten im Linkerrest können CTP und Varianten und geschnittene Produkte davon auch in beliebigen nicht-kritischen Regionen der Untereinheiten, die das einzelkettige Hormon bilden, enthalten sein. Die Natur dieser Einschlüsse und ihre Positionen wird ausführlich in der Stammanmeldung beschrieben.
Während CTP-Einheiten bevorzugte Einschlüsse im Linkerrest darstellen, ist darauf hinzuweisen, dass es sich beim Linker um ein beliebiges geeignetes, kovalent gebundenes Material handeln kann, das die entsprechende räumliche Beziehung zwischen den α- und β-Untereinheiten herstellt. Somit kann es sich für Kopf-an-Schwanz-Konfigurationen beim Linker im allgemeinen um ein Peptid mit einer willkürlichen Anzahl an Aminosäuren (typischerweise weniger als 100 und vorzugsweise weniger als 50) handeln, bei dem ein geeignetes Verhältnis von Hydrophilizität zu Hydrophobizität vorliegt, um für den entsprechenden Abstand und Konformation in Lösung zu sorgen. Im allgemeinen sollte der Linker ausgewogen hydrophil sein, so dass er in der umgebenden Lösung verbleibt und der Wechselwirkung zwischen den α- und β-Untereinheiten oder den beiden β-Untereinheiten nicht im Weg steht. Es ist bevorzugt, dass der Linker β-Windungen, die typischerweise durch Prolinreste bereitgestellt werden, umfasst. Beliebige geeignete Polymere, einschließlich Peptidlinker, mit den vorstehend beschriebenen korrekten Eigenschaften können verwendet werden.
Ein spezieller Linkerrest, der nicht unter den Umfang der Erfindung fällt, ist der Rest, der ein Signalpeptid unmittelbar oberhalb von der stromabwärtigen Untereinheit enthält.
Zu besonders bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen einzelkettigen Hormone gehören folgende Produkte:

βFSH-α; βFSH-βFSH; ßFSH-βLH;
βLH-α; βLH-βLH; βLH-ßFSH;
βTSH-α; βTSH-βTSH; βTSH-ßFSH;
βCG-α; β-CG-β-CG; βCG-βFSH; βCG-βTSH;
βFSH-CTP-α; βFSH-CTP-βFSH; βFSH-CTP-βLH;
sβLH-CTP-α; βLH-CTP-βLH; βLH-CTP-βFSH;
sβCG-CTP-α; βFSH-CTP-CTP-βLH;
sβFSH-CTP-CTP-α; βFSH-CTP-CTP-βTSH;
sβLH-CTP-CTP-α; βLH-CTP-CTP-βLH;
βCG-CTP-CTP-α; und βCG-CTP-CTP-βLH.

Ferner sind die humanen Formen der Untereinheiten besonders bevorzugt. In den vorstehenden Konstruktionen bezieht sich "CTP" auf CTP oder dessen Varianten oder geschnittene Produkte, wie im nachstehenden Abschnitt ausführlich erläutert wird.
Besonders bevorzugte Ausführungsformen von CTP-Einheiten Für die erfindungsgemäßen CTP-Einheiten wird folgende Notation verwendet: für Bereiche der vollständigen CTP-Einheit werden die Positionen in dem Bereich durch ihre Nummern, wie sie in 2 angegeben sind, bezeichnet. Sofern Substitutionen auftreten, wird die substituierte Aminosäure zusammen mit einem hochgestellten Index zur Bezeichnung von deren Position angegeben. Somit stellt beispielsweise CTP (120-143) den Teil von CTP dar, der sich von den Positionen 120 bis 143 erstreckt. CTP (120-130; 136-143) stellt eine fusionierte Aminosäuresequenz dar, der die Positionen 118-119, 131-135 und 144-145 der nativen Sequenz fehlen. CTP (Arg¹²²) bezieht sich auf eine Variante, bei der Lysin an Position 122 durch Arginin ersetzt ist. CTP (Ile¹³⁴) bezieht sich auf eine Variante, bei der das Leucin in Position 134 durch Isoleucin ersetzt ist. CTP (Va1¹²⁸Va1¹⁴³) bezieht sich auf eine Variante, bei der zwei Substitutionen vorgenommen sind, eine für Leucin an Position 128 und die andere für Isoleucin an Position 142. CTP (120-143; Ile¹²⁸Ala¹³⁰)"bezieht sich auf den einschlägigen Teil der CTP-Einheit, an dem die beiden angegebenen Substitutionen vorgenommen worden sind.
Ferner sind unter den CTP-Varianten solche bevorzugt, bei denen eine oder mehrere der O-verknüpften Glycosylierungsstellen abgeändert oder deletiert worden sind. Eine besonders bevorzugte Maßnahme zur Veränderung der Stelle, um eine Glycosylierung zu verhindern, besteht in der Substitution des Serinrestes an diesen Stellen durch einen Alaninrest.
Besonders bevorzugt sind CTP-Einheiten der folgenden Formeln:

#1 CTP (116-132)
#2 CTP (118-128; 130-135)
#3 CTP (117-142)
#4 CTP (116-130}
#5 CTP (116-123; 137-145)
#6 CTP (115-133; 141-145)
#7 CTP (1I7-140, Ser¹²³ Gln¹⁴⁰)
#8 CTP (125-143, Ala¹³⁰)
#9 CTP (135-145, G1u¹³⁹)
#10 CTP (131-143, Val¹⁴² Val¹⁴³)
#11 CTP (118-132)
#12 CTP (118-127}
#13 CTP (118-145)
#14 CTP (115-132)
#15 CTP (115-127}
#16 CTP (115-145)
#17 CTP (112-145)
#18 CTP (112-132)
#19 CTP (112-127=

Bevorzugte Ausführungsformen der α- und α-Untereinheiten
Selbstverständlich gehören die nativen Formen der α- und β-Untereinheiten in der einzelkettigen Form zu den bevorzugten Ausführungsformen. Jedoch werden auch bestimmte Varianten bevorzugt. Insbesondere werden Varianten der α-Untereinheit, bei der die Nverknüpfte Glycosylierungsstelle an Position 52 beseitigt oder durch Aminosäuresubstitutionen an dieser Stelle oder in der Nähe davon verändert ist, wegen ihrer antagonistischen Aktivität bevorzugt. Ähnliche Modifikationen an der Glycosylierungsstelle an Position 78 werden ebenfalls bevorzugt. Eine Deletion von einer oder mehreren Aminosäuren an den Positionen 85-92 beeinflusst ebenfalls die Natur der Aktivität von Hormonen mit einem Gehalt an der α-Untereinheit. Eine Substitution oder Deletion von Aminosäuren an diesen Positionen fällt ebenfalls unter die bevorzugten Ausführungsformen.
Gleichermaßen können die N-verknüpften Glycosylierungsstellen in der β-Kette zweckmäßigerweise modifiziert werden, um die Glycosylierung zu beseitigen und somit die agonistische oder antagonistische Aktivität der β-Ketten zu beeinflussen. Wenn CTP entweder nativ oder in CG oder aufgrund des Vorhandenseins als Linker vorliegt, können die O-verknüpften Glycosylierungsstellen in diesem Rest ebenfalls verändert sein.
Spezielle Varianten, die modifizierte oder deletierte Glycosylierungsstellen enthalten, werden in folgenden Literaturstellen beschrieben: J. Yoo et al., J. Biol. Chem., Bd. 268 (1993), S. 13034-13042; J. Yoo et al., J. Biol. Chem., Bd. 266 (1991), S. 17741-17743; und M. Bielinska et al., J. Cell. Biol., Bd. 111 (1990), S. 330a (alle Literaturstellen vorstehend zitiert) sowie M. M. Matzuk et al., J. Biol. Chem., Bd. 264 (1989), S. 2409-2414; J. L. Keene et al., J. Biol. Chem., Bd. 264 (1989), S. 4769-4775; und J. L. Keene et al., Mol. Endocrinol., Bd. 3 (1989), S. 2011-2017.
Es können nicht nur die Glycosylierungsstellen an sich direkt modifiziert sein, sondern es können auch Positionen in der Nähe zu diesen Stellen bevorzugt so modifiziert sein, dass der Glycosylierungsstatus der Mutante beeinflusst wird. Für die α-Untereinheit werden beispielsweise Varianten, bei denen Aminosäuren zwischen den Positionen 50 bis 60 substituiert sind, einschließlich konservative und nicht-konservative Substitutionen, begünstigt, insbesondere Substitutionen an den Positionen 51, 53 und 55, aufgrund ihrer Nähe zur Glycosylierungsstelle an Asn₅₂.
Ferner werden Mutanten der α-Untereinheit bevorzugt, bei denen Lysin in Position 91 in Methionin oder Glutaminsäure abgeändert ist.
Obgleich die Varianten vorstehend unter Bezugnahme auf Variationen in den einzelnen Untereinheiten erörtert worden sind, ist darauf hinzuweisen, dass die einzelkettigen Formen des Dimeren zusätzliche Gelegenheiten zur Modifikation bieten. Speziell sind möglicherweise Regionen, die für die Faltung des Dimeren kritisch sind, für die korrekte Konformation des einzelkettigen Moleküls nicht kritisch, so dass diese Regionen für die Variation der einzelkettigen Form zur Verfügung stehen, obgleich sie vorstehend nicht in Bezug auf die einzelnen Elemente der dimeren Formen beschrieben wurden. Ferner können die einzelkettigen Formen erheblich im Zusammenhang mit nicht-kritischen Regionen modifiziert werden, deren Veränderung und/oder Deletion die biologische Aktivität gemäß den vorstehenden Ausführungen nicht beeinträchtigt.
Geeignete Arzneistoffe
Zu geeigneten Arzneistoffen, die im Linkerrest enthalten sein können, gehören Peptide oder Proteine, wie insulinartige Wachstumsfaktoren; epidermale Wachstumsfaktoren; saure und basische Fibroblasten-Wachstumsfaktoren; von Blutplättchen abgeleitete Wachstumsfaktoren; verschiedene kolonienstimulierende Faktoren, wie Granulozyten-CSF, Makrophagen-CSF und dergl.; sowie die verschiedenen Cytokine, wie IL-2, IL-3 und die Vielfalt weiterer Interleukin-Proteine; die verschiedenen Interferone; Tumor-Nekrosefaktor; und dergl. Arzneistoffe auf Peptid- oder Proteinbasis haben den Vorteil, dass sie in der Einzelkette enthalten sein können und das gesamte Konstrukt leicht durch rekombinante Expression eines einzigen Gens erzeugt werden kann. Ferner können Arzneistoffe in Form von kleinen Molekülen, wie Antibiotika, entzündungshemmende Arzneistoffe, Toxine und dergl., verwendet werden.
Im allgemeinen handelt es sich bei den Arzneistoffen innerhalb des Linkerrestes um solche, von denen erwünscht ist, dass sie in der Nähe der Rezeptoren, an die die Hormone üblicherweise binden, wirken. Es werden geeignete Maßnahmen getroffen, um den Arzneistoff aus seinem Einschluss innerhalb des Linkers freizusetzen, indem man beispielsweise Stellen für eine enzymkatalysierte Lysis aufnimmt, wie sie im nachstehenden Abschnitt mit der Bezeichnung "Herstellungsverfahren" beschrieben ist.
Weitere Modifikationen
Die erfindungsgemäßen einzelkettigen Proteine können ferner gemäß allgemeinen Möglichkeiten zur Derivatisierung von Aminosäuresequenzen konjugiert oder derivatisiert sein, z. B. durch Phosphorylierung, Glycosylierung, Deglycosylierung von üblicherweise glycosylierten Formen, Modifikation der Aminosäure-Seitenketten (z. B. Umwandlung von Prolin in Hydroxyprolin) oder ähnliche Modifikationen in Analogie zu den posttranslationalen Ereignissen, von denen festgestellt wurde, dass sie im allgemeinen auftreten.
Der Glycosylierungsstatus der erfindungsgemäßen Hormone ist von besonderer Bedeutung. Die Hormone können in nicht-glycosylierter Form entweder durch Erzeugung in prokaryontischen Wirten oder durch Mutation der Glycosylierungsstellen, die normalerweise in den Untereinheiten und/oder etwaigen CTP-Einheiten, die vorhanden sein können, vorliegen. Sowohl nicht-glycosylierte Versionen als auch partiell glycosylierte Versionen der Hormone können durch Manipulation der Glycosylierungsstellen hergestellt werden. Normalerweise fallen selbstverständlich auch glycosylierte Versionen unter den Umfang der Erfindung.
Wie es allgemein aus dem Stand der Technik bekannt ist, können die erfindungsgemäßen einzelkettigen Proteine auch an Markierungen, Trägerstoffe, feste Träger und dergl. gekuppelt werden, und zwar je nach dem gewünschten Verwendungszweck. Die markierten Formen können zum Nachvollziehen ihres Stoffwechselschicksals verwendet werden. Zu geeigneten Markierungen für diesen Zweck gehören insbesondere Radioisotop-Markierungen, wie Iod 131, Technetium 99, Indium 111 und dergl. Die Markierungen können auch zur Vermittlung des Nachweises der einzelkettigen Proteine in Testsystemen herangezogen werden. In diesem Fall können Radioisotope ebenso wie Enzymmarkierungen, fluoreszierende Markierungen, chromogene Markierungen und dergl. verwendet werden. Die Verwendung derartiger Markierungen erweist sich insbesondere für diese Proteine als hilfreich, da sie Mittel darstellen, die auf den Rezeptorliganden abzielen.
Die erfindungsgemäßen Proteine können auch an Trägerstoffe gekuppelt sein, um ihre Immunogenizität bei der Herstellung von Antikörpern, die speziell mit diesen neuen modifizierten Formen immunoreaktiv sind, zu verstärken. Zu geeigneten Trägerstoffen für diesen Zweck gehören Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin (KLH), Rinderserumalbumin (BSA), Diphtherie-Toxoid und dergl. Übliche Kupplungstechniken zur Verknüpfung der erfindungsgemäßen modifizierten Peptide mit Trägerstoffen, einschließlich die Verwendung von bifunktionellen Linkern, können herangezogen werden.
Ähnliche Verknüpfungstechniken können zusammen mit anderen Techniken. zur Kupplung der erfindungsgemäßen Proteine an feste Träger herangezogen werden. In gekuppelter Form können diese Proteine sodann als Affinitätsreagenzien zur Trennung der angestrebten Komponenten mit denen sie eine spezifische Reaktion zeigen, verwendet werden.
Herstellungsverfahren
Verfahren zur Konstruktion der erfindungsgemäßen Proteine sind aus dem Stand der Technik bekannt. Wenn, wie vorstehend ausgeführt, nur genetisch kodierte Aminosäuren enthalten sind und die Einzelkette sich in einer Kopf-an-Schwanz-Konfiguration befindet, so besteht derzeit der zweckmäßigste Weg in einer rekombinanten Synthese dieser Materialien durch Expression der für das angestrebte Protein kodierenden DNA. DNA, die die für die einzelkettigen Formen, einschließlich Varianten, kodierende Nucleotidsequenz enthält, lässt sich aus nativen Sequenzen herstellen. Techniken für die positionsgerichtete Mutagenese, Ligation von zusätzlichen Sequenzen, PCR und Konstruktion von geeigneten Expressionssystemen sind alle aus dem Stand der Technik bekannt. Teile oder die Gesamtheit der DNA, die für das angestrebte Protein kodiert, lassen sich synthetisch unter Anwendung üblicher Festphasentechniken konstruieren, vorzugsweise unter Einbau von Restriktionsstellen, um die Ligation zu erleichtern. Geeignete Steuerelemente für die Transkription und Translation der enthaltenen Kodierungssequenz können an den DNA-Kodierungssequenzen vorgesehen sein. Bekanntlich stehen derzeit Expressionssysteme zur Verfügung, die mit einer Vielzahl von Wirten, einschließlich prokaryontischen Wirten, wie Bakterien, und eukaryontischen Wirten, wie Hefe, Pflanzenzellen, Insektenzellen, Säugetierzellen, Vogelzellen und dergl., verträglich sind.
Die Wahl des Wirts ist insbesondere auf posttranslationale Ereignisse, insbesondere unter Einschluss von Glycosylierung, abgestellt. Die Position der Glycosylierung wird meist durch die Natur der Glycosylierungsstellen innerhalb des Moleküls gesteuert. Jedoch wird die Art der Zucker, die diese Stelle besetzen, weitgehend von der Natur des Wirts gesteuert. Demzufolge lässt sich durch die geeignete Wahl des Wirts eine Feinabstimmung der Eigenschaften der erfindungsgemäßen Hormone erreichen.
Eine besonders bevorzugte Form eines Gens für den a-Untereinheitsbereich (unabhängig davon, ob die α-Untereinheit modifiziert ist oder nicht) ist die "Minigen"-Konstruktion.
Der hier verwendete Ausdruck α-Untereinheit-"Minigen" bezieht sich auf die Genkonstruktion, die von M. M. Matzuk et al., Mol. Endocrinol., Bd. 2 (1988), S. 95-100, bei der Beschreibung der Konstruktion von pM²/cG α oder pM²/α angegeben wird. Dieses "Minigen" ist durch die Beibehaltung nur der Intron-Sequenz zwischen dem Exon 3 und dem Exon 4 gekennzeichnet, wobei sämtliche stromaufwärtigen Introns deletiert worden sind. Bei der beschriebenen speziellen Konstruktion werden die Nterminalen Kodierungssequenzen, die vom Exon 2 abgeleitet sind, und ein Teil des Exons 3 von cDNA bereitgestellt und direkt über eine XbaI-Restriktionsstelle in die Kodierungssequenz des Exons 3 ligiert, so dass die Introns zwischen den Exons I und II und zwischen den Exons II und III abwesend sind. Jedoch bleiben das Intron zwischen den Exons III und IV sowie die Signale in 3'-Stellung von der Kodierungssequenz erhalten. Das resultierende Minigen kann zweckmäßigerweise als ein BamHI/BglII-Segment inseriert werden. Weitere Maßnahmen zur Konstruktion eines vergleichbaren Minigens sind selbstverständlich möglich. Die Definition ist nicht auf die spezielle Konstruktion beschränkt, bei der die Kodierungssequenzen über eine XbaI-Stelle ligiert werden. Jedoch stellt dies eine zweckmäßige Maßnahme zur Konstruktion des Gens dar. Es bestehen keine speziellen Vorteile gegenüber anderen Wegen, z. B. eine synthetische oder teilsynthetische Herstellung des Gens. Die Definition umfasst die Kodierungssequenzen für die α-Untereinheit, bei denen das Intron zwischen den Exons III und IV oder beliebige andere Introns und vorzugsweise keine anderen Introns erhalten bleiben.
Für die rekombinante Herstellung werden modifizierte Wirtszellen unter Verwendung von Expressionssystemen verwendet und gezüchtet, um das angestrebte Protein zu erzeugen. Diese Ausdrücke werden hier in folgender Weise verwendet:
Eine "modifizierte" rekombinante Wirtszelle, d. h. eine Zelle, die so modifiziert ist, dass sie die erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionssysteme enthält, bezieht sich auf eine Wirtszelle, die so modifiziert worden ist, dass sie dieses Expressionssystem enthält, und zwar auf eine beliebige zweckmäßige Art und Weise zu dessen Einführung, einschließlich Transfektion, virale Infektion und dergl. "Modifiziert" bezieht sich auf Zellen, die dieses Expressionssystem enthalten, unabhängig davon, ob das System in das Chromosom integriert ist oder extrachromosomal vorliegt. Die "modifizierten" Zellen, können bezüglich des Einbaus des Expressionssystems stabil sein oder nicht. Kurz zusammengefasst, beziehen sich mit dem erfindungsgemäßen Expressionssystem "modifizierte" rekombinante Wirtszellen auf Zellen, die dieses Expressionssystem als Ergebnis einer entsprechenden Manipulation enthalten, wenn dies im nativen Zustand nicht der Fall ist, und zwar unabhängig von der Art und Weise, in der dieser Einbau vollzogen wird.
Der Ausdruck "Expressionssystem" bezieht sich auf ein DNA-Molekül, das eine kodierende, zu exprimierende Nucleotidsequenz und die begleitenden Kontrollsequenzen, die zur Durchführung der Expression der Kodierungssequenz erforderlich sind, enthält. Typischerweise enthalten diese Kontrollsequenzen einen Promotor, Terminationsregulationssequenzen und in einigen Fällen einen Operator oder einen anderen Mechanismus zur Regulierung der Expression. Bei den Kontrollsequenzen handelt es sich um Sequenzen, die so konstruiert sind, dass sie in einer speziellen rekombinanten Zielwirtszelle funktionell sind. Daher muss die Wirtszelle so gewählt werden, dass sie mit den Kontrollsequenzen im konstruierten Expressionssystem verträglich ist.
Wenn eine Sekretion des erzeugten Proteins erwünscht ist, werden weitere Nucleotidsequenzen, die für ein Signalpeptid kodieren, aufgenommen, um das Signalpeptid in funktioneller Verknüpfung mit dem einzelkettigen Hormon zu erzeugen, so dass das Präprotein entsteht. Bei der Sekretion wird das Signalpeptid unter Freisetzung des reifen einzelkettigen Hormons abgespalten.
Die hier verwendeten Ausdrücke "Zellen", "Zellkulturen" und "Zelllinien" werden in austauschbarer Weise ohne spezielle Betonung der Nuancen ihrer Bedeutungen verwendet. Wenn ein Unterschied zwischen diesen Ausdrücken von Bedeutung ist, so geht dies aus dem Zusammenhang klar hervor. Wenn alle Bedeutungen in Frage kommen, so fallen sie alle unter diese Ausdrücke.
Das erzeugte Protein kann bei intrazellulärer Bildung aus dem Lysat von Zellen oder bei Sekretion aus dem Medium gewonnen werden. Techniken zur Gewinnung von rekombinanten Proteinen aus Zellkulturen sind aus dem Stand der Technik bekannt. Diese Proteine lassen sich unter Anwendung bekannter Techniken, wie Chromatographie, Gelelektrophorese, selektive Fällung und dergl., reinigen.
Die Gesamtheit oder ein Teil der erfindungsgemäßen Hormone können direkt unter Anwendung von aus dem Stand der Technik bekannten Peptid-Synthesetechniken hergestellt werden. Synthetisierte Teile können verknüpft werden und Freisetzungsstellen für beliebige, im Linkerrest enthaltene Arzneistoffe können durch übliche chemische Maßnahmen eingeführt werden. Für die Ausführungsformen, die Aminosäuren enthalten, die nicht durch das Gen kodiert werden, und für Ausführungsformen, bei denen eine Kopf-an-Kopf- oder Schwanz-an-Schwanz-Konfiguration verwendet wird, muss die Synthese selbstverständlich zumindest teilweise auf dem Proteinniveau erfolgen. Kopf-an-Kopf-Verbindungen an den natürlichen N-Termini oder an Positionen in der Nähe der natürlichen N-Termini können über Linker herbeigeführt werden, die funktionelle Gruppen enthalten, die mit Aminogruppen reaktiv sind, z. B. Dicarbonsäurederivate. Schwanz-an-Schwanz-Konfigurationen an den C-Termini oder an Positionen in der Nähe der C-Termini können über Linker beeinflusst werden, bei denen es sich um Diamine, Diole oder Kombinationen davon handelt.
Antikörper
Die erfindungsgemäßen Proteine können zur Erzeugung von Antikörpern verwendet werden, die speziell mit diesen neuartigen Verbindungen immunoreaktiv sind. Diese Antikörper eignen sich für eine Vielzahl von diagnostischen und therapeutischen Anwendungen. Wenn beispielsweise einzelkettige Formen der Erfindung therapeutisch entweder im humanmedizinischen oder tiermedizinischen Zusammenhang verwendet werden, können die Arzneistoffkonzentrationen unter Verwendung dieser Antikörper mit herkömmlichen Immunoassay-Techniken überwacht werden. Da ferner einige der Antikörper, die durch diese einzelkettigen Formen entstehen, mit dem Heterodimeren kreuzreaktiv sind, können diese zur Diagnose von natürlich auftretenden Konzentrationen des Heterodimeren herangezogen werden.
Die Antikörper werden im allgemeinen durch übliche Immunisierungsverfahren in Säugetieren, wie Kaninchen, Mäusen, Schafen oder Ratten, erzeugt. Die Antikörper werden wie polyklonale Antiseren titriert, um eine angemessene Immunisierung zu gewährleisten. Die polyklonalen Antiseren können sodann als solche geerntet werden, und zwar beispielsweise zur Verwendung in Immunoassays. Antikörper sezernierende Zellen des Wirts, z. B. Milzzellen, oder periphere Blutleukozyten, können unter Anwendung bekannter Techniken immortalisiert und einem Screening zur Erzeugung von monoklonalen Antikörpern, die mit den erfindungsgemäßen Proteinen immunospezifisch sind, unterzogen werden.
Unter dem Ausdruck "immunospezifisch für die Proteine" sind Antikörper zu verstehen, die mit den einzelkettigen Proteinen immunoreaktiv sind, jedoch nicht mit den Heterodimeren an sich, und zwar innerhalb der allgemeinen Parameter, die zur Bestimmung der Affinität oder Nichtaffinität in Betracht kommen. Es ist darauf hinzuweisen, dass Spezifität ein relativer Ausdruck ist und eine willkürliche Grenze gewählt werden kann, z. B. ein 100-facher oder größerer Unterschied in der Immunoreaktivität. Demnach ist ein erfindungsgemäßer immunospezifischer Antikörper mit dem einzelkettigen Protein mindestens 100-fach reaktiver als mit den entsprechenden Heterodimeren.
Zubereitung
Die erfindungsgemäßen Proteine werden in vergleichbarer Weise wie bekannte Heterodimere, die der einzelkettigen Form entsprechen, zubereitet und verabreicht. Dabei können die Zubereitungs- und Verabreichungsverfahren je nach dem speziellen verwendeten Hormon variieren. Jedoch können die Dosierungshöhe und die Häufigkeit der Verabreichung im Vergleich zum Heterodimeren abgeändert werden, insbesondere wenn CTP-Einheiten vorhanden sind, und zwar im Hinblick auf die verlängerte biologische Halbwertszeit aufgrund von deren Anwesenheit.
Zubereitungen für erfindungsgemäße Proteine sind Zubereitungen, die für Protein- oder Peptid-Arzneistoffe typisch sind, z. B. gemäß Remingtons's Pharmaceutical Sciences, neueste Auflage, Mack Publishing Company, Easton, PA. Im allgemeinen werden Proteine durch Injektion, typischerweise durch eine intravenöse, intramuskuläre, subkutane oder intraperitoneale Injektion, oder unter Verwendung von Zubereitungen für eine transmukosale oder transdermale Abgabe verabreicht. Diese Zubereitungen enthalten im allgemeinen ein Detergens oder Penetrationshilfsmittel, wie Gallensalze, Fusidinsäuren und dergl. Diese Zubereitungen können in Form von Aerosolen oder Suppositorien oder im Fall einer transdermalen Verabreichung in Form von Hautpflastern verabreicht werden.
Auch eine orale Verabreichung ist möglich, vorausgesetzt, dass die Zubereitung die erfindungsgemäßen Peptide vor einem Abbau im Verdauungssystem schützt.
Eine Optimierung des Dosierungsschemas und der Zubereitung wird routinemäßig und entsprechend der allgemeinen Vorgehensweise auf dem einschlägigen Gebiet durchgeführt.
Anwendungsverfahren
Die erfindungsgemäßen einzelkettigen Peptide können auf zahlreichen Wegen verwendet werden, insbesondere als Ersatzprodukte für die heterodimeren Formen der Hormone. Somit können die agonistischen Formen der erfindungsgemäßen einzelkettigen Hormone wie die Heterodimeren bei der Behandlung von Unfruchtbarkeit, als Hilfsmittel bei in vitro-Fertilisationstechniken und anderen therapeutischen Verfahren, die im Zusammenhang mit den nativen Hormonen stehen, eingesetzt werden, und zwar sowohl bei Menschen als auch bei Tieren.
Die einzelkettigen Hormone eignen sich als Reagenzien in ähnlicher Weise wie die Heterodimeren.
Zusätzlich können die erfindungsgemäßen einzelkettigen Hormone als diagnostische Werkzeuge zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit von Antikörpern in Bezug auf die nativen Proteine in biologischen Proben verwendet werden. Sie eignen sich auch als Kontrollreagenzien in Testpackungen zur Bestimmung der Konzentrationen dieser Hormone in verschiedenen Proben. Bei Verfahren zur Bestimmung der Konzentrationen der Hormone selbst oder von gegen sie erzeugten Antikörpern handelt es sich um übliche Immunoassays, die gemäß dem Stand der Technik gebräuchlich sind. Verschiedene kompetitive und direkte Testverfahren können herangezogen werden, wobei eine Vielzahl von Markierungstechniken verwendet werden, einschließlich Radioisotopenmarkierung, Fluoreszenzmarkierung, Enzymmarkierung und dergl.
Die erfindungsgemäßen einzelkettigen Hormone eignen sich auch zum Nachweis und zur Reinigung von Rezeptoren, an die die nativen Hormone binden. Somit können die erfindungsgemäßen einzelkettigen Hormone an feste Träger gekuppelt und bei der affinitätschromatographischen Herstellung von Rezeptoren oder Antihormon-Antikörpern verwendet werden. Die erhaltenen Rezeptoren eignen sich selbst zur Bestimmung der Hormonaktivität für in Frage stehende Arzneistoffe bei Screening-Tests für Kandidaten für Therapeutika und Reagenzien.
Schließlich können die Antikörper, die in spezieller Weise mit den erfindungsgemäßen einzelkettigen Hormonen reagieren, als Reinigungswerkzeuge zur Isolierung von im Anschluss daran hergestellten Präparaten dieser Materialien verwendet werden. Sie können auch zur Überwachung der Konzentrationen von einzelkettigen Hormonen, die als Arzneistoffe verabreicht werden, verwendet werden.
Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung, ohne diese zu beschränken.
Beispiel 1
Herstellung von für CGβ-α kodierender DNA
1 zeigt die Konstruktion eines Inserts für einen Expressionsvektor, wobei der C-Terminus der β-Kette von humanem CG mit dem N-Terminus der reifen humanen α-Untereinheit verknüpft ist.
Wie in 1 dargestellt, wird die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zur Fusionierung der beiden Untereinheiten zwischen dem Exon 3 von CGß und dem Exon 2 der α/Untereinheit so verwendet, dass das Codon für die carboxyterminale Aminosäure von CGβ direkt im Leseraster mit dem der Nterminalen Aminosäure der α-Untereinheit fusioniert ist. Dies wird durch Verwendung eines hybriden Primers erreicht, um ein Fragment zu amplifizieren, das das Exon 3 von CGß enthält, wobei der hybride Primer einen "Schwanz" enthält, der für die N-terminale Sequenz der α-Untereinheit kodiert. Das erhaltene amplifizierte Fragment enthält somit einen Teil des Exons 2, das für humanes CGα kodiert.
Unabhängig davon wird ein hybrider Primer, der für die N-terminale Sequenz der α-Untereinheit kodiert, die mit den dem C-Terminus von CGβ entsprechenden Codons fusioniert sind, als einer der Primer verwendet, um das α-Minigen zu amplifizieren. Die beiden amplifizierten Fragmente, die nunmehr jeweils überlappende Portionen, die für die andere Untereinheit kodieren, enthalten, werden zusammen mit zwei zusätzlichen Primern, die die gesamte Spanne überdecken, amplifiziert, wodurch man das SalI-Insert erhält.
Im Detail zeigt die Reaktion I die Bildung eines Fragments mit einem Gehalt an dem Exon 3 von CGβ und den ersten vier Aminosäuren der reifen α-Untereinheit sowie einer SalI-Stelle in 5'-Richtung der kodierenden Sequenzen. Das Produkt wird durch Amplifikation eines Teils der genomischen CGβ-Sequenz erhalten, die von M. M. Matzuk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 84 (1987), S. 6354-6358; P. Policastro et al., J. Biol. Chem., Bd. 258 (1983), 5. 11492-11499, beschrieben worden ist.
Der Primer 1 stellt die SalI-Stelle bereit und weist die folgende Sequenz auf:
Der andere Primer, nämlich der Primer 2, ist komplementär mit vier Codons der a N-terminalen Sequenz und 5 Codons der C-terminalen CGβ-Sequenz und weist folgende Sequenz auf:
Das erhaltene amplifizierte Segment, das das Reaktionsprodukt von I darstellt, weist somit eine SalI-Stelle in 5'-Richtung von der fusionierten Kodierungsregion auf.
Bei der Reaktion II wird eine analoge fusionierte Kodierungsregion aus dem vorstehend beschriebenen α-Minigen erhalten. Beim Primer 3 handelt es sich um einen hybriden Primer, der vier Codons der β-Untereinheit und fünf Codons von a enthält und folgende Sequenz aufweist:
Der Primer 4 enthält eine SalI-Stelle und ist komplementär zur Erweiterung eines α-Exons 4. Der Primer 4 weist die folgende Sequenz auf:
Somit überlappen sich die Produkte der Reaktionen I und II und ergeben bei PCR in Gegenwart der Primer 1 und 4 das angestrebte SalI-Produkt, wie in der Reaktion III dargestellt ist.
Das amplifizierte Fragment, das das CGβ-Exon 3 und das α-Minigen enthält, wird in die SalI-Stelle von pM2HA-CGβ-Exon 1, 2 inseriert, einem Expressionsvektor, der sich von pM² mit einem Gehalt an CGβ-Exons 1 und 2 gemäß B. Sachcis, R. M. Snider, J. Lowe, J. Krause, J. Biol. Chem., Bd. 268 (1993), 5. 2319, ableitet. pM2 mit einem Gehalt an CGβ-Exons 1 und 2 wird von M. M. Matzuk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 84 (1987), S. 6354-6358 und M. M. Matzuk et al., J. Cell. Biol., Bd. 106 (1988), S. 1049-1059, beschrieben.
Dieser Expressionsvektor bildet sodann die einzelkettige Form von humanem CG, wobei der C-Terminus der β-Untereinheit direkt mit dem N-Terminus der α-Untereinheit verknüpft ist.
Beispiel 2
Herstellung und Aktivität des einzelkettigen humanen CG
Der in Beispiel 1 konstruierte Expressionsvektor wurde in Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO-Zellen) transfiziert und die Herstellung des Proteins wurde durch Immunopräzipitation von radioaktiv markiertem Protein an SDS-Gelen bestimmt. Das Kulturmedium wurde gewonnen und die Bioaktivität des einzelkettigen Proteins wurde in einem kompetitiven Bindungstest in Bezug auf den humanen LH-Rezeptor mit dem Heterodimeren verglichen. Bei diesem Test wurde die cDNA, die für den vollständigen humanen LH-Rezeptor kodiert, in den Expressionsvektor pCMX inseriert (J. X-C. Oikawa et al., Mol. Endocrinol., Bd. 5 (1991), S. 759-768). Exponentiell wachsende 293-Zellen wurden mit diesem Vektor gemäß dem Verfahren von C. Chen et al., Mol. Cell. Biol., Bd. 7 (1987), S. 2745-2752, transfiziert.
Bei diesem Test wurden die Zellen, die den humanen LH-Rezeptor exprimierten (2 × 105/Röhrchen), mit 1 ng markiertem hCG in Konkurrenz mit der zu testenden Probe 18 Stunden bei 22 °C inkubiert. Sodann wurden die Proben 5-fach mit kaltem Dulbecco-PBS (2 ml), das mit 0,1 % BSA ergänzt war, verdünnt und 15 Minuten bei 800 × g zentrifugiert. Die Pellets wurden 2-mal mit D-PBS gewaschen. Die Radioaktivität wurde mit einem gamma-Zähler bestimmt. Die spezifische Bindung betrug 10-12 % des gesamten markierten (iodierten) hCG, das in Abwesenheit der Probe zugesetzt worden war. Die Abnahme der Markierung in Gegenwart der Probe stellt ein Maß für die Bindungsfähigkeit in der Probe dar. Bei diesem Test in Bezug auf den humanen LH-Rezeptor in 293-Zellen wies Wildtyp-hCG einen ED50-Wert von 0,47 ng auf und das einzelkettige Protein wies einen ED50-Wert von 1,1 ng auf.
In einem zusätzlichen Test auf die agonistische Aktivität wurde die Stimulation der cAMP-Bildung bestimmt. In diesem Fall wurden 293-Zellen, die humane LH-Rezeptoren exprimierten (2 × 10⁵/Röhrchen) mit variierenden Konzentrationen des heterodimeren hCG oder einzelkettigem hCG inkubiert und 18 Stunden gezüchtet. Die Konzentrationen an extrazellulärem cAMP wurden durch einen spezifischen Radioimmunoassay gemäß J. B. Davoren et al., Biol. Reprod., Bd. 33 (1985), S. 37-52, bestimmt. Bei diesem Test wies der Wildtyp einen ED50-Wert von 0,6 ng/ml auf und die einzelkettige Form wies einen ED50-Wert von 1,7 ng/ml auf (ED50 bedeutet 50 % der wirksamen Dosis).
Somit ist in sämtlichen Fällen das Verhalten der Wildtypform und der einzelkettigen Form ähnlich.
Beispiel 3
Weitere Aktivitätstests
Das Medium aus CHO-Zellen, die mit einem Expressionsvektor für das einzelkettige βFSH-CTP-α-Konstrukt transfiziert waren, wurde gewonnen und gemäß Beispiel 2 getestet. Die Ergebnisse des kompetitiven Tests auf Bindung an den FSH-Rezeptor sind in 3 dargestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass die einzelkettige Form wirksamer ist als Wildtyp-FSH oder FSH mit einem Gehalt an einer CTP-Erweiterung an der β-Kette, und zwar bezüglich der Hemmung der Bindung von FSH selbst an den Rezeptor. Der ED50-Wert für die einzelkettige Form beträgt etwa 50 mIU/ml, während der ED50-Wert für das erweiterte Heterodimere etwas über 100 mIU/ml liegt. Der Wert für Wildtyp-FSH beträgt etwa 120 mIU/ml.
Die Ergebnisse des Signaltransduktionstests sind in 4 dargestellt. Die Wirksamkeit sämtlicher drei Typen von FSH ist vergleichbar.
Beispiel 4
Konstruktion von zusätzlichen Expressionsvektoren
Auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1 werden Expressionsvektoren für die Herstellung von einzelsträngigem FSH, TSH und LH (βFSH-α, β-FSH-CTPa, βTSH-α, βTSH-CTP-α, βLH-α und βLH-CTP-α) hergestellt und in CHO-Zellen transfiziert. Die erhaltenen Hormone zeigen beim Test gemäß Beispiel 2 ähnliche Aktivitäten wie die Wildtypformen.
Gleichermaßen werden Expressionsvektoren für die einzelkettigen Doppel-β"-Formen in analoger Weise wie in Beispiel 1 konstruiert und gemäß Beispiel 2 exprimiert und getestet.

Claims

Agonist oder Antagonist von Glycoprotein-Hormonaktivität, wobei es sich beim Agonisten oder Antagonisten um ein glycosyliertes oder nicht-glycosyliertes Protein handelt, das folgendes umfasst: α-β, β-α oder β-β, wobei das Glycoprotein-Hormon aus der Gruppe Follikel-stimulierendes Hormon (FSH), luteinisierendes Hormon (LH), Chorion-Gonadotropin (CG) und thyroidstimulierendes Hormon (TSH) ausgewählt ist; wobei die α- und β- oder β und β-Untereinheiten kovalent gebunden sind, und zwar gegebenenfalls über einen Linkerrest; wobei a die native Aminosäuresequenz der α-Untereinheit, die bei Glycoprotein-Hormonen üblich ist, oder eine Variante davon darstellt und β oder die einzelnen Reste β unabhängig voneinander die β-Untereinheit eines Glycoprotein-Hormons oder einer Variante davon darstellt, wobei es sich bei einer Variante der genannten α- oder β-Untereinheit um eine modifizierte Form dieser Untereinheit handelt, die 1 bis 10 Deletionen oder Substitutionen enthält, wobei es sich bei den Substitutionen um konservative Substitutionen handelt, wobei es sich beim Linker um einen hydrophilen Rest handelt, der die α- und β- oder β- und β-Untereinheiten ohne Beeinträchtigung von deren Aktivität verbindet, mit der Maßgabe, dass der Linker nicht ein Signalpeptid unmittelbar stromaufwärts von der stromabwärtigen Untereinheit einschließt; und wobei dann, wenn es sich bei der β-Untereinheit um eine Chorion-Gonadotropin-β-Untereinheit in Verknüpfung mit einer α-Untereinheit handelt, der Linker abwesend ist oder nicht aus einem Linker mit 1 bis 16 Aminosäurerresten besteht.
Agonist oder Antagonist nach Anspruch 1, wobei das Protein α-β umfasst.
Agonist oder Antagonist nach Anspruch 1, wobei das Protein β-α umfasst.
Agonist oder Antagonist nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, wobei es sich bei den α- und β-Untereinheiten um humane α- und β-Untereinheiten oder um Varianten davon handelt.
Agonist oder Antagonist nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei es sich beim Linker um ein vollständiges carboxyterminales Peptid (CTP) oder eine Variante davon handelt, wobei das vollständige CTP die Positionen 112-118 bis einschließlich 145 von humanem Chorion-Gonadotropin (hCG) darstellt; und wobei es sich bei der Variante von CTP um eine modifizierte Form von CTP mit einem Gehalt an 1-5 Deletionen und/oder Substitutionen handelt, wobei es sich bei etwaigen Substitutionen um eine konservative Aminosäure handelt; oder wobei es sich beim Linker um ein partielles CTP handelt, das zumindest die Positionen 112-132; 115-132; 116-132; oder 118-132; oder 112-127; 115-127; 116-127; oder 118-127 von hCG umfasst.
Agonist oder Antagonist nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei eine oder beide der α- und β- oder β- und β-Untereinheiten ferner eine Insertion einer vollständigen CTP-Einheit oder einer Variante davon umfassen; wobei es sich bei der Variante von CTP um eine modifizierte Form von CTP mit einem Gehalt an 1-5 Deletionen und/oder Substitutionen handelt, wobei es sich bei etwaigen Substitutionen um eine konservative Aminosäure handelt; oder wobei es sich bei der Insertion um ein partielles CTP handelt, das zumindest die Positionen 112-132; 115-132; 116-132; oder 118-132; oder 112-127; 115-127; 116-127; oder 118-127 von hCG umfasst; wobei diese Insertion in einer nicht-kritischen Region der α- oder β-Untereinheit vorliegt und wobei die Insertion innerhalb von 5 Aminosäuren des N- oder C-Terminus vorliegt.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die den Agonisten oder Antagonisten nach einem der Ansprüche 1 bis 6 im Gemisch mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger umfasst.
Antikörper, die immunospezifisch für den Agonisten oder Antagonisten nach einem der Ansprüche 1 bis 6 sind.
Isoliertes DNA- oder RNA-Molekül, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die für das Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 6 kodiert.
Expressionssystem zur Herstellung eines Agonisten oder Antagonisten eines Glycoprotein-Hormons, wobei das Expressionssystem eine erste Nucleotidsequenz, die für das Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 6 kodiert, in funktioneller Verknüpfung mit Kontrollsequenzen, die die Expression der Nucleotidsequenz bewirken, umfasst.
Expressionssystem nach Anspruch 10, ferner enthaltend eine zweite Nucleotidsequenz, die für ein Signalpeptid in funktioneller Verknüpfung mit dem Protein, das durch die erste Nucleotidsequenz kodiert wird, kodiert.
Wirtszelle, die so modifiziert ist, dass sie das Expressionssystem von Anspruch 10 oder 11 enthält.
Verfahren zur Herstellung eines Agonisten oder Antagonisten von Glycoprotein-Hormonaktivität, wobei das Verfahren die Züchtung der Zellen von Anspruch 12 unter Bildung des Agonisten oder Antagonisten und das Gewinnen des Agonisten oder Antagonisten aus der Kultur umfasst.