DE3689620T2

DE3689620T2 - Durch cys-kodon modifizierte dns.

Info

Publication number: DE3689620T2
Application number: DE3689620T
Authority: DE
Original assignee: HOSPITAL BOSTON, University of
Current assignee: HOSPITAL BOSTON, University of
Priority date: 1985-11-13
Filing date: 1986-11-13
Publication date: 1994-06-16
Anticipated expiration: 2006-11-14
Also published as: JPS63501799A; EP0246307B1; JP2635035B2; ATE101162T1; DE3689620D1; AU6733287A; EP0246307A4; WO1987002987A1; EP0246307A1

Description

Hintergrund der Erfindung

Diese Erfindung wurde teilweise mit Finanzmitteln der Regierung erarbeitet und die Regierung hat gewisse Rechte an der Erfindung.
Diese Erfindung betrifft die Verwendung rekombinanter DNA-Techniken zur Herstellung von Analogen von Toxinmolekülen und die Verwendung solcher Moleküle in der Behandlung medizinischer Erkrankungen.
Die Literatur enthält eine Reihe von Beispielen hybrider Moleküle, die einen Ligandenteil mit spezifischer Bindung und einen Toxinteil (z. B. Ricin oder Diphtherietoxin) enthalten; der Ligand richtet das Toxin gegen eine unerwünschte Zellklasse, wobei gesunde Zellen verschont bleiben, an die der Ligand nicht bindet.
Zum Beispiel beschreibt Bacha et al. im U.S. Patent Nr. 4.468.382 (das hiemit durch Bezugnahme eingebracht wird) hybride Moleküle, die durch Derivatisierung eines Neuropeptidhormons (z. B. thyreotropes Hormon) und eines enzymatisch aktiven Fragments von Diphtherietoxin unter Verwendung von schwefelhältigen Gruppen und anschließende Reaktion der derivatisierten Moleküle zu deren Verbindung über eine Disulfidbindung hergestellt werden. Ein Nachteil dieser Methode besteht darin, daß die Stelle der Derivatisierung an beiden Molekülen nicht exakt kontrolliert werden kann, so daß das Endprodukt heterogen ist und einige Moleküle enthält, bei welchen die Derivatisierung und Kopplung die Toxizität oder Bindungskapazität des hybriden Moleküls beeinträchtigt hat.
Ein Versuch, der sich mit diesem Problem der Heterogenität beschäftigt, wird in Murphy PCT Internationale Veröffentlichungsnr. WO/83/03971 beschrieben (welche hiemit durch Bezugnahme eingebracht wird). Die Murphy-Anmeldung beschreibt hybride Proteine, die von Genen kodiert werden, die sowohl für das Toxin als auch für den spezifischen Bindungsteil des hybriden Protein kodieren. Diese Methode kann natürlich nur für DNA-kodierte Peptidliganden verwendet werden.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung schafft Toxinmoleküle, die an jeden spezifisch bindenden Liganden, ob dieser nun ein Peptid ist oder nicht, an einer Position, die für jedes Toxinmolekül vorbestimmbar dieselbe ist, gebunden werden können.
Die Erfindung beschreibt in einem Merkmal allgemein eine DNA-Sequenz, die für ein Fragment eines Toxinmoleküls kodiert, das groß genug ist, um eine cytotoxische Aktivität zu zeigen, und klein genug, um keine generalisierte eukaryotische Bindung zu zeigen; die DNA-Sequenz enthält ein nicht natürlich vorkommendes Cysteinkodon, vorzugsweise derart angeordnet, daß das Fragment, das durch die DNA-Sequenz kodiert wird, eine cytotoxische enzymatische Aktivität zeigt, wenn es an einen zellspezifischen Liganden über den Cysteinrest, der durch das Cysteinkodon kodiert wird, gebunden wird.
In bevorzugten Ausführungsbeispielen ist das Toxin Diphtherietoxin, Ricin oder Abrin; das Cysteinkodon wird bei dem C-Terminus-kodierenden Ende der toxinkodierenden DNA-Sequenz oder innerhalb von 100 Basenpaaren davon eingefügt; der Ligand ist ein Peptidhormon, ein proteinischer Wachstumsfaktor (vorzugsweise Interleukin I, Interleukin II, Interleukin III oder B-Zellen-Wachstumsfaktor), ein Antikörper oder ein Steroidhormon (z. B. Östradiol).
In einem anderen Merkmal beschreibt die Erfindung einen spezifisch bindenden Peptidliganden und dafür kodierende DNA-Sequenzen, der an jedes reaktive schwefelgruppenhältige Toxinmolekül auf eine vorbestimmte und beständige Weise binden kann. Die DNA-Sequenz dieses Merkmals der Erfindung kodiert für ein Fragment eines Liganden (vorzugsweise eines der oben angeführten), das groß genug ist, um eine spezifische Zellbindung aufzuweisen; das Gen enthält ein nicht natürlich vorkommendes Cysteinkodon, das vorzugsweise so angeordnet ist, daß das Fragment, das durch die DNA-Sequenz kodiert wird, eine spezifische Zellbindung zeigt, wenn es über den Cysteinrest, der von dem Cysteinkodon kodiert wird, an ein Toxin gebunden ist.
Die Erfindung beschreibt auch die hybriden Moleküle, die unter Verwendung der Cys-modifizierten Toxine und Liganden der Erfindung hergestellt werden, wie auch die Verfahren zur Herstellung solcher hybrider Moleküle.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung gehen aus der folgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsbeispiele und den Ansprüchen hervor.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsbeispiele

Zunächst werden kurz die Zeichnungen beschrieben.

Zeichnungen

Fig. 1 ist Teil einer Restriktionskarte eines DNA-Fragments der Erfindung in Plasmid pABC1508.
Fig. 2 ist eine diagrammartige Darstellung des Diphtherietoxinmoleküls.
Fig. 3 ist eine Restriktionskarte, die die Position und Ausrichtung des Diphtherie-tox-Gens auf dem 3,9 BamHI-I Restriktionsfragment von Corynephage Betatox zeigt.
Die Fig. 4-5 sind diagrammartige Darstellungen der Schritte, die in der Konstruktion von pABC1508 beteiligt sind.
Fig. 6 ist eine diagrammartige Darstellung eines Plasmids, pMSH53, das eine α-MSH-kodierende DNA enthält.
Fig. 7 ist die Nucleotidsequenz des tox²²&sup8; Allels und der flankierenden Regionen, wobei Aminosäurereste über den Nucleotiden dargestellt sind; das tox²²&sup8; Allel ist dasselbe wie das Wildtyp-tox-Allel, mit Ausnahme einiger Mutationen, vor allem der Gegenwart einer NruI-Stelle auf dem tox²²&sup8; Allel (Fig. 7 wurde nach Fig. 1 von Kaczorek et al. (1983) Science 221, 855, bearbeitet).

Tox-Gen

Es werden nun kurz das tox-Gen und das Diphtherietoxinmolekül, für welches es kodiert, beschrieben.
Die Fig. 2 und 3 zeigen das Diphtherietoxinmolekül, beziehungsweise das Diphtherie-tox-Gen, das auf dem 3,9 kb BamHI-Restriktionsfragment von Corynephage Betatox angeordnet ist. Fig. 7 zeigt die Sequenz des tox²²&sup8; Allels.
Mit Bezugnahme auf Fig. 2 besteht das Diphtherietoxin aus mehreren funktionellen "Domänen", die, beginnend bei dem terminalen Aminoende des Moleküls, charakterisiert werden können als: eine hydrophobe Signalsequenz; enzymatisch aktives Fragment A, die exponierte proteasesensitive Disulfidschleife (DSL)1&sub1; aus vierzehn Aminosäuren, die eine Spaltungsdomäne enthält; Fragment B, das die lipidassozierenden Regionen enthält, z. B. eine hydrophile amphipathische Domäne und eine hydrophobe Domäne; DSL 1&sub2;; und ein carboxyterminales Ende. a. DSL 1&sub1; enthält drei Argininreste; die Sau3AI Stelle zwischen Fragment A und Fragment B (siehe Fig. 3) befindet sich an einer Position auf dem Diphtherietoxingen, die dem Argininrest entspricht, der am weitesten stromabwärts der drei liegt.
Der Vorgang, durch welchen das Diphtherietoxin empfindliche eukaryotische Zellen vergiftet, enthält zumindest die folgenden Schritte: (i) das Diphtherietoxin bindet an spezifische Rezeptoren an der Oberfläche einer empfindlichen Zelle; (ii) während es an seinen Rezeptor gebunden ist, wird das Toxinmolekül in ein endocytisches Vesikel aufgenommen; (iii) entweder vor der Aufnahme oder in dem endocytischen Vesikel kann das Toxinmolekül an einer Stelle in der 47.000 Dalton Region von dem N-terminalen Ende gespalten (oder verarbeitet) werden; (iv) mit Abnahme des pH-Wertes des endocytischen Vesikels auf weniger als 5,5, fügt sich die verarbeitete Form des Toxins, während dieses noch an seinen Rezeptor gebunden ist, spontan in die endosomale Membran ein; (v) sobald es in der Membran eingebettet ist, bilden die lipidassoziierenden Regionen eine Pore; (vi) es kommt zu einer proteolytischen Spaltung in 1&sub1;, zwischen Fragment A und B; (vii) anschließend wird Fragment A oder ein Polypeptid, das Fragment A enthält, in die Zellflüssigkeit freigesetzt; (viii) die katalytische Aktivität von Fragment A, d. h., die Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-abhängige Adenosindiphosphat-Ribosylierung des Elongationsfaktors 2, bewirkt den Tod der vergifteten Zelle. Es ist offensichtlich, daß ein einziges Molekül von Fragment A, das in die Zellflüssigkeit eingeführt wird, ausreicht, um eine Zelle zu töten.

Modifiziertes Tox-Gen

Mit Bezugnahme auf Fig. 1 wird die Region von Plasmid pABC1508 gezeigt, die für ein Peptid der Erfindung kodiert.
Die DNA-Region, die in Fig. 1 dargestellt ist, enthält den Lambda-PR-Promotor (der den Promotor ersetzt, der von Natur aus mit dem tox Gen verbunden ist); eine ATG-Startstelle; eine DNA-Sequenz, die für das enzymatisch aktive Fragment A des Diphtherietoxins kodiert; einen Teil der DNA-Region, die für das Fragment B des Diphtherietoxins kodiert; und einen Linker, der ein Cys-Kodon enthält.
Mit Bezugnahme auf die Fig. 1-3 enthält der Teil des Diphtherie-tox-Gens, der zur Herstellung einer DNA-Sequenz der Erfindung verwendet wird, die Region, die für das enzymatisch aktive Fragment A (und vorzugsweise die dem Fragment A vorangehende hydrophobe Leadersequenz) kodiert, und einen Teil der Fragment B-kodierenden Region, der zumindest so lange wie jenes Ende an der MspI Stelle ist. Wie in Fig. 3 dargestellt, beginnt die Fragment A-kodierende Region (einschließlich der Leadersequenz) unmittelbar stromabwärts von einer passenden Sau3AI Stelle. Die MspI Stelle ist die ungefähre Stelle des Endes der Region des tox Gens, das für kreuzreagierendes Material 45 (CRM 45) kodiert, wie in Bacha et al., id beschrieben. Dieser Teil des Diphtherietoxinmoleküls enthält die lipidassoziierenden Regionen von Fragment B, enthält aber nicht 12 und ist in Fig. 2 als der Teil des Fragments B zwischen y und z dargestellt. Die verwendete Fragment B-kodierende Region kann irgendwo nach der MspI Stelle bis zu der SphI Stelle enden. Wenn die SphI Stelle verwendet wird, ist 12 enthalten und der Teil von Fragment B ist jener zwischen y und x in Fig. 2. Wie zuvor erwähnt, kann jede Region, die zwischen MspI und SphI endet, verwendet werden; ein Beispiel ist die Region, die an der Position von NruI endet, die wie die Region, die bei MspI endet, für ein Fragment kodiert, das 12 nicht enthält. Jede Region, die kürzer ist als jene, die bei MspI endet, sollte nicht verwendet werden, da ein solches Fragment nicht genügend der quergerichteten lipidassoziierenden Region enthält und somit zu keiner Porenbildung führt, die für die Toxizität notwendig ist. Es sollten keine Teile von Fragment B verwendet werden, die von Regionen kodiert werden, welche stromabwärts von SphI enden, um einen Einschluß der Diphtherietoxin-Rezeptorbindungsdomäne zu vermeiden. (NruI wird auf dem Wildtyp tox Allel nicht gefunden, sondern nur auf dem mutanten tox²²&sup8; Allel, wie in Kaczorek et al. (1983) Science 221 855 beschrieben).
In dem dargestellten DNA-Konstrukt (Fig. 1) ist das Cys-Kodon am C-terminalen Ende der tox-kodierenden DNA-Sequenz angeordnet. Diese Stelle garantiert, daß der Linker, der das Cys-Kodon enthält, die enzymatische Aktivität von Fragment A nicht beeinträchtigt. Andere Stellen in dem Molekül, die stromabwärts von der Fragment A-kodierenden Region liegen, können auch verwendet werden, d. h., der Cys-Kodon-hältige Linker kann irgendwo in der Fragment B-kodierenden Region eingefügt werden.
Andere Toxine, die DNA-kodierte Aminosäureketten sind, können zusätzlich zu dem Diphtherietoxin verwendet werden; Beispiele sind Ricin und das pflanzliche Toxin Abrin.

Liganden

Die spezifisch bindenden Liganden, die in der Erfindung verwendet werden, können aus einem vollständigen Liganden oder einem Teil eines Liganden, der die gesamte Bindungsdomäne des Liganden enthält, oder einem wirksamen Teil der Bindungsdomäne bestehen. Es soll am besten die gesamte oder der Großteil der Bindungsdomäne des Ligandenmoleküls enthalten sein. Im Falle von Alpha-MSH, einem kleinen Peptid aus dreizehn Aminosäuren, oder Beta-MSH, das siebzehn Aminosäuren enthält, kann der Teil des Moleküls verwendet werden, der aus neun Aminosäuren des carboxyterminalen Endes des Moleküls besteht und die rezeptorspezifische Bindungsdomäne enthält, oder es kann insbesondere das gesamte Molekül verwendet werden. Es wird besonders bevorzugt, daß zumindest ein Teil des Liganden, der nicht an der Zellbindung beteiligt ist, enthalten ist, so daß die Derivatisierung in diesem nichtbindenden Teil durchgeführt werden kann, wodurch die Wahrscheinlichkeit, daß die Derivatisierung die Bindung beeinträchtigt, verringert wird. Zum Beispiel wird die Derivatisierung von Alpha-MSH vorzugsweise bei oder nahe dem N-terminalen Ende des Moleküls durchgeführt, da das C-terminale Ende die spezifische Bindungsdomäne enthält.
Die Regionen innerhalb zellspezifischer Liganden, in welchen die Bindungsdomäne angeordnet ist, sind für eine Reihe solcher Liganden bekannt. Ferner befähigen jüngste Fortschritte in der Festphasen-Polypeptidsynthese die Fachmänner in dieser Technologie, die Bindungsdomäne von praktisch jedem Peptidliganden zu bestimmen, indem verschiedene Fragmente des Liganden synthetisiert und auf ihre Fähigkeit, an die zu tötende Zellklasse zu binden, getestet werden.
Die spezifische Zellklasse, die von den Hybriden der Erfindung gebunden und getötet wird, wird durch den spezifischen Liganden bestimmt, der die Bindungsdomäne des hybriden Moleküls liefert. Es kann jeder zellspezifische Ligand verwendet werden, der eine Bindungsdomäne besitzt, die für eine bestimmte Zellenklasse, die getötet werden soll, spezifisch ist. Polypeptidhormone sind als solche Liganden zweckdienlich. Hybride Proteine, die unter Verwendung von zum Beispiel Alpha oder Beta-MSH hergestellt werden, können selektiv an Melanocyten binden, wodurch die Hybride in der Behandlung von primärem Melanom und metastatischen Melanomstellen zweckmäßig sind. Andere spezifisch bindende Liganden, die verwendet werden können, umfassen die proteinischen Wachstumsfaktoren Interleukin I, Interleukin II, Interleukin III und den B-Zellen-Wachstumsfaktor. Interleukin II ist wegen seiner Rolle bei allergischen Reaktionen und Autoimmunerkrankungen wie dem systemischen Lupus erythematodes (SLE), bei welchen aktivierte T-Zellen beteiligt sind, von besonderer Bedeutung. Hybride, die unter Verwendung des B-Zellen-Wachstumsfaktors hergestellt werden, können als immunsuppresive Reagenzien verwendet werden, die proliferierende B-Zellen töten, die B-Zellen-Wachstumsfaktor-Rezeptoren tragen und an Überempfindlichkeitsreaktionen und Organabstoßungen beteiligt sind.
Die andere Hauptklasse von spezifischen Bindungsproteinen sind Antikörper. Die zweckdienlichsten Antikörper sind jene gegen Tumore; solche (im allgemeinen monoklonale) Antikörper sind bereits als zielgerichtete Mittel gut bekannt, die in Verbindung mit kovalent gebundenen Cytotoxinen verwendet werden. In der vorliegenden Erfindung sind die Anti-Tumor-Antikörper (vorzugsweise nicht der ganze Antikörper, sondern nur der Fab Teil) jene, die eine Oberflächendeterminante auf den Tumorzellen erkennen und in diese Zellen über die rezeptorvermittelte Endocytose eingeschlossen werden; Antikörper, die überdeckt und abgestreift werden, sind nicht so wirksam.
Andere zweckmäßige Polypeptidliganden mit zellspezifischen Bindungsdomänen sind Somatostatin, follikelstimulierendes Hormon (spezifisch für Ovarzellen); luteinisierendes Hormon (spezifisch für Ovarzellen); thyreotropes Hormon (spezifisch für Schilddrüsenzellen); Vasopressin (spezifisch für Uteruszellen wie auch Blasen und Darmzellen); Prolactin (spezifisch für Brustzellen); und Wachstumshormon (spezifisch für gewisse Knochenzellen).
Peptidhormone müssen mit einer Sulfhydrylgruppe derivatisiert werden, die mit dem Cys des Toxinmoleküls reaktiv ist. Dies kann durch Einfügen eines Cys-Kodon-hältigen Linkers in eine geeignete Stelle in einer DNA-Sequenz, die für das Hormon kodiert, auf eine analoge Weise zu jener, die unten für das tox Gen beschrieben wird, erfolgen. Oder es kann eine Sulfhydrylgruppe entweder selbst oder als Teil eines Cys-Rests unter Verwendung von Festphasen-Peptidsynthesetechniken eingefügt werden. Zum Beispiel wird die Einfügung von Sulfhydrylgruppen in Peptide in Hiskey (1981) Peptides 3, 137, beschrieben. Die Derivatisierung kann auch nach dem Verfahren durchgeführt werden, das für die Derivatisierung des Peptidhormons Thyreotropin freisetzendes Hormon in Bacha et al., U.S. Patent Nr. 4.468.382 id., beschrieben ist. Ebenso können Proteine auf der Ebene der DNA oder Proteinchemie derivatisiert werden. Das Einfügen von Sulfhydrylgruppen in Proteine wird in Maasen et al., (1983), Eur. J. Biochem. 134, 2, 32, beschrieben.
Die Hauptklasse von in der Erfindung zweckmäßigen, nicht-Peptid spezifisch bindenden Liganden sind die Steroidhormone. Ein Beispiel ist Östrogen und Östrogenderivate wie Östradiol; diese werden gegenwärtig in der Behandlung des Prostatakarzinoms und postmenopausalen Mammakarzinoms verwendet. Hybride, die diese Hormone oder Analoge davon enthalten, können in denselben oder geringeren Dosierungen zur Behandlung derselben Erkrankungen verwendet werden.
Die Derivatisierung von Steroidhormonen kann unter Verwendung von Standardtechniken durchgeführt werden, wie jenen, die in Ikagawa et al., (1981), J. Org. Chem., 46, 18, 3747, beschrieben sind. Zum Beispiel kann das Steroidhormon 17-Beta-Östradiol derivatisiert werden, indem eine Hydroxylgruppe durch eine SH-Gruppe ersetzt wird, um folgendes zu erhalten:

Genkonstruktion

Im allgemeinen werden Plasmide nach Standardtechniken manipuliert. Plasmid DNA wird mit Restriktionsendonucleasen, wie vom Hersteller (z. B. New England Biolabs, Beverly, Mass.) empfohlen, gespalten. Restriktionsfragmente werden in 1% waagrechten Agarosegelen 30-60 Minuten bei 80-100 V in TBE (89 mM Borsäure, 89 mM Trizmabase [Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.], 2,5 mM EDTA, pH 7,0) in Gegenwart von 200 ng/ml Ethidiumbromid einer Elektrophorese unterzogen. Kleine DNA-Fragmente werden in 8% senkrechten Polyacrylamidgelen bei 100 V 2-5 Stunden einer Elektrophorese unterzogen und mit Ethidiumbromid gefärbt. Die Gele werden auf einem Ultraviolett-Transilluminator auf Polaroidfilm Typ 667 unter Verwendung eines Rotfilters photographiert.
Die Konstruktion von Plasmid pABC508 erfolgte durch Fusion zweier DNA-Stücke, von welchen eines für Fragment A kodierte und das andere für einen Teil von Fragment B kodierte, an die ein Cys-Kodon-hältiger Linker befestigt wurde.
Mit Bezugnahme auf Fig. 4 wurde diese Fusion aus zwei Plasmiden, pDT201, das die Fragment A-kodierende Region enthält, und pDT301, das den Großteil der Fragment B-kodierenden Region des Diphtherietoxingens enthält, konstruiert. Die Konstruktion jedes dieser DNA-Stücke wird in der Folge beschrieben.
Plasmid pDT301 wurde konstruiert, indem eine Sau3AI-1-Sequenz, die für alles außer den C-terminalen 17 Aminosäuren von Fragment B kodiert, aus dem tox Allel geschnitten wurde. Diese Sequenz, die die Restriktionsendonucleasestellen ClaI, MspI und SphI trägt, wurde in die BamHI Stelle von Plasmid pUC8 (beschrieben in Viera et al. (1982) Gene 19, 259) eingesetzt, um pDT301 zu erhalten. Plasmid pDT201 enthält die Fragment A-kodierende Sau3AI-2 Sequenz (Fig. 3) (siehe Leong et al. (1983) Science 220, 515). (pDT301 und pDT201 in E. coli wurden in der American Type Culture Collection, Rockville, MD hinterlegt und erhielten die ATCC Zugriffsnummer 39360 bzw. 39359. Der Lizenznehmer des Anmelders, Seragen, Inc., anerkennt seine Verantwortlichkeit, diese Kulturen auszutauschen, sollten sie vor dem Ende der Frist eines hiefür erteilten Patents absterben, und seine Verantwortlichkeit, die ATCC von der Erteilung eines solchen Patents in Kenntnis zu setzen, wobei zu diesem Zeitpunkt die Hinterlegungen der Öffentlichkeit für eine Dauer von zumindest 30 Jahren nach dem Hinterlegungsdatum zugänglich gemacht werden. Bis zu diesem Zeitpunkt sind die Hinterlegungen dem Leiter des Patentamts unter den Bestimmungen von 37 CFR 14 und 35 USC 2 zugänglich).
Mit weiterer Bezugnahme auf Fig. 4 wurde Plasmid pDT301 durch die Zugabe eines Cys-Kodon-hältigen Linkers wie folgt modifiziert. Ein synthetischer Linker wurde auf einem Festphasenträgerglas mit spezieller Porengröße in einem 380A DNA-Synthetisierer (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) durch Hybridisierung von 21-mer und 29-mer Oligonucleotiden durch einen 21 bp homologen Kern konstruiert, wobei eine 4bp 1/2 SphI und 1/2 HindIII einzelsträngige Sequenz an jedem Ende verblieb. Der Linker besitzt die Sequenz
Der Linker kodiert für drei Alaninreste und enthält ein Cys-Kodon (TGT) und ein Stoppkodon (TAG). (Diese Konstruktion ermöglicht nicht nur die Expression eines Cys-hältigen Peptids gemäß der vorliegenden Erfindung, sondern könnte auch das Einfügen eines Gens, das für einen spezifisch bindenden Liganden kodiert, an der PstI Stelle ermöglichen).
Wie in Fig. 4 dargestellt, wurde pDT301 mit SphI und HindIII gespalten, um die in Fig. 4 als "E" bezeichnete DNA-Region zu entfernen, und der Cys-Kodon-hältige Linker wurde dann in das Plasmid an den SphI, HindIII Stellen ligiert, um Plasmid pBC508 zu erhalten. pBC508 wurde dann mit HindIII und Sau3AI geschnitten, um Fragment 1 zu erhalten.
Mit weiterer Bezugnahme auf Fig. 4 wurde Plasmid pDT201 mit HindIII gespalten und die einzelsträngigen Enden mit DNA Polymerase I (Klenow Fragment) aufgefüllt. Die erhaltenen stumpfen Enden wurden an die doppelsträngigen EcoRI Linker CCTTAAGG
GGAATTCC
(New England Biolabs, Beverly, MA) ligiert, um pDT201' zu erhalten, das dann mit EcoRI und Sau3AI geschnitten wurde, um Fragment 2 zu erhalten.
Die Fragmente 1 und 2 wurden in äquimolaren Konzentrationen miteinander ligiert nach Standardverfahren vermischt, und die Mischung wurde dann mit EcoRI und HindIII gespalten. Die aufgespaltene Mischung wurde dann in das EcoRI und HindIII gespaltene pEMBL8 (Dente et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11, 1645) ligiert, das einmalige EcoRI und HindIII Stellen enthält, uni pABC508 zu erhalten. Plasmid pACB508 kann in einen geeigneten Wirt, z. B. E. coli, wie in der Folge beschrieben transformiert werden, um Cys-modifizierte Toxinmoleküle zu erhalten.
Der natürlich vorkommende tox Promotor kann aber auch wie folgt durch einen anderen Promotor ersetzt werden.
Der Lambda PR Promotor ist in dem Expressionsvektor pEMBL8ex3 (Dente et al., id.) enthalten. Mit Bezugnahme auf Fig. 5 ist die DNA-Sequenz um die Startstelle des tox Gens dargestellt, wie auch die entsprechenden Aminosäuren. pABC508 wurde mit EcoRI geschnitten und dann mit Bal31 über eine Dauer von 10-15 Minuten bei 37ºC mit einer Einheit Enzym pro Mikrogramm DNA behandelt. Die erhaltene Mischung von DNA-Fragmenten wurde an die BamHI Linker CCTAGGCC, transformiert in E.coli HB101
GGATCCGG
(Bethesda Laboratories, Gaithersburg, MD), und die DNA-Sequenz der Region, die für das 5' Ende von tox kodiert, ligiert, und die Sequenz von 30 erhaltenen Klonen wurden bestimmt. Ein Klon, der die in Fig. 5 dargestellte DNA-Sequenz enthielt, wurde gereinigt und das BamHI-HindIII-Fragment isoliert und in pEMBL8ex3 eingesetzt, das mit BamHI und HindIII geschnitten worden war. Das erhaltene Plasmid, pABC1508 enthält den Lambda PR Promotor und ein ATG translationales Startkodon. Während dieses Verfahrens wird ein zusätzlicher Asparagin und Prolinrest eingesetzt. In Fig. 5 stellt Cro das Cro Gen von Lambda dar und SD stellt die Shine-Dalgarno-Sequenz dar. Der Lambda PR Promotor kann durch das Lambda cI Gen reguliert werden. In diesem Beispiel wird das mutante cI&sub8;&sub5;&sub7; temperaturempfindliche Repressorgen verwendet, so daß der PR Promotor bei 30ºC inaktiv und bei 37ºC aktiv ist.
pABC1508 wurde unter Anwendung herkömmlicher Techniken (z. B. wie in Maniatis et al. (1984) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., beschrieben) in E. coli HB101 transformiert (es können auch andere, z. B. E. coli JM 101 oder 5Y327 verwendet werden) und die Expression der Diphtherie-tox-Genprodukte analysiert. Die Einführung des positiv geladenen Asparaginrests in die tox Signalsequenz beeinflußt das Ausschleusen der tox Polypeptide in das periplasmatische Kompartiment des rekombinanten Wirts nicht.
E.coli Zellen, die mit Vektoren transformiert sind, die Cys-modifiziertes Toxin-kodierende DNA enthalten, werden unter Standard-Kulturbedingungen vermehrt, z. B. in Luria Nährlösung, die pro Liter 10 g Trypton, 10 g NaCl und 5 g Hefeextrakt enthält und mit 100 g/ml Ampicillin ergänzt ist. Die Diphtherietoxin-verwandten Moleküle, die in den periplasmatischen Raum ausgeschleust werden, werden aus periplasmatischen Extrakten gereinigt. Periplasmatische Extrakte werden aus Zellen bereitet, die in 9,5 Liter Volumina bei 37ºC bis zu A&sub5;&sub9;&sub0; von etwa 1,0 vermehrt wurden. Wenn der natürliche tox Promotor durch temperaturempfindliche cI857 Regulatorsequenzen unter der Kontrolle des temperaturempfindlichen cI&sub8;&sub5;&sub7; Gens ersetzt wurde, wie hierin beschrieben, werden Zellen bei 30ºC vermehrt und die Expression wird durch Erhöhung der Inkubationstemperatur auf 42ºC für 15 Minuten ausgelöst. Die Kultur wird dann für eine weitere Stunde bei 40ºC vermehrt. In jedem Fall wird die Kultur auf ungefähr 1 Liter durch Filtration durch 0,45 u Membrane (Pellicon System, Millipore Corp., Bedford, Mass.) konzentriert und auf 4ºC abgekühlt. Bakterien werden durch Zentrifugation geerntet, in eiskalter 20% Sucrose, 30 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5, resuspendiert und dann mit Lysozym (750 g/ml Endkonzentration) 30 Minuten aufgeschlossen. Sphäroblasten werden durch Zentrifugation entfernt, 2 mg p-Amidinophenylmethylsulfonylfluorid (p-APMSF, Calbiochem, San Diego, Kalif.) wird hinzugefügt, und der periplasmatische Extrakt wird durch Filtration durch 0,2 u Membrane sterilisiert.
Die Cys-modifiziertes Toxin-verwandten Moleküle werden dann durch Chromatographie auf Phenyl-Sepliarose (Pharmacio Fine Chemicals, Piscataway, N.J.) und DEAE-Zellulose, im wesentlichen wie von Rappuoli et al. (1985) Biotechnology, S. 165, beschrieben, gereinigt. Periplasmatische Extrakte werden gegen 10 mM Natriumphosphat- (pH 7,2) Puffer und Ammoniumsulfat, das auf 13% (Gew.-/Vol.-) zugegeben wird, dialysiert. Die Rohextrakte werden dann auf eine Phenyl-Sepharose-Säule aufgebracht, die mit 10 mM Phosphatpuffer, der 13% Ammoniumsulfat enthält, äquilibriert ist. Das modifizierte Toxin wird eluiert und gegen 10 mM Phosphatpuffer dialysiert und dann auf eine DEAE-Zellulose-Säule aufgebracht. Nach dem Waschen mit dem Phosphatpuffer wird die DEAE-Zellulose-Säule mit einem linearen NaCl Gradienten in Phosphatpuffer entwickelt.
Das modifizierte Toxin wird dann auf eine Anti-Diphtherietoxin-Immunoaffinitätssäule aufgebracht, die Antikörper enthält, der wie in Zucker et al. (1984) Molecular Immunol 21, 785, beschrieben hergestellt wurde. Nach dem gründlichen Waschen wird das modifizierte Toxin mit 4 M Guanidin-Hydrochlorid eluiert und sofort gegen Phosphatpuffer dialysiert. Das gereinigte modifizierte Toxin wird dann auf ungefähr 100 g/ml konzentriert, indem der Dialysebeutel in trockenes Sephadex G-200 gelegt wird. Alle Reinigungsschritte werden bei 4ºC ausgeführt, und das modifizierte Toxin wird in kleinen Teilmengen bis zur Verwendung bei -76ºC gelagert.

Spezifisch bindender Ligand: Alpha-MSH

Mit Bezugnahme auf Fig. 6 ist Plasinid pMSH53 dargestellt, der eine DNA-Insert-kodierende Alpha-MSH enthält. pMSH53 wurde hergestellt, indem in pUC8 eine Alpha-MSH-kodierende Sequenz mit einer 1/2 PstI-Stelle an jedem Ende eingefügt wurde:
Plasmid pMSH53 kann unter Verwendung herkömmlichen Methoden zur Schaffung eines Expressionsvektors für die Herstellung von Alpha-MSH in gezüchteten Bakterienzellen, z. B. E.coli, verwendet werden. Ferner kann vor einer solchen Expression ein Cys-hältiger Linker an das oder in der Nähe des N-terminalen Endes der Alpha-MSH-kodierenden Sequenz in einer Weise analog zu der oben für das tox Gen beschriebenen Methode aufgeschmolzen werden, um ein modifiziertes Alpha-MSH herzustellen, das ein N-terminales Cys enthält, das imstande ist, mit dem zugefügten Cys des Diphtherietoxinfragments zu reagieren. Das Cys-hältige MSH-Molekül kann aber auch chemisch an jedes Toxinmolekül gebunden werden, auf dem eine reaktive Sulfhydrylgruppe vorhanden ist oder posttranslational, d. h., auf der Proteinchemie und nicht DNA-Ebene, hinzugefügt wurde.
Anstelle der Herstellung von Alpha-MSH unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken wie oben beschrieben, kann Alpha-MSH von biologischen Quellen gereinigt oder im Handel erhalten werden (z. B. von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO).

Chemische Verbindung

Nachdem ein verfügbares Cys durch Gentechniken an den Liganden angefügt worden ist, oder wenn der Ligand ein verfügbares reaktives Cys oder eine andere schwefelhältige Gruppe enthält, werden das Toxin und der Ligand durch Reduzierung beider Verbindungen und Vermischen des Toxins und des Liganden in einem Verhältnis von ungefähr 1 : 5 bis 1 : 20 gekoppelt und die Disulfidreaktion wird bis zur Vollendung bei Raumtemperatur (im allgemeinen 20 bis 30 Minuten) ablaufen gelassen. Die Mischung wird dann gründlich gegen phosphatgepufferte Kochsalzlösung zur Entfernung nicht reagierter Ligandenmoleküle dialysiert. Der abschließende Reinigungsschritt umfaßt die Trennung, basierend auf der Größe, der gewünschten Toxin-Hormonkonjugate von Toxin-Toxin und Hormon-Hormon-Dimeren; dies erfolgt durch Sephadex G100 Chromatographie in phosphatgepufferter Kochsalzlösung.

Anwendung

Die hybriden Toxin-Ligandenmoleküle werden an ein Säugetier wie z. B. einen Menschen verabreicht, das an einer medizinischen Erkrankung wie z. B. Krebs leidet, die durch die Gegenwart einer Klasse unerwünschter Zellen gekennzeichnet ist, an welche der Ligand selektiv binden kann. Die Menge des verabreichten hybriden Moleküls schwankt mit der Art der Erkrankung, dem Ausmaß der Erkrankung und der Größe und Gattung des Säugetiers, das an dieser Erkrankung leidet. Im allgemeinen liegen die Mengen im Bereich jener, die für andere cytotoxische Mittel verwendet werden, die in der Behandlung von Krebs eingesetzt werden, obwohl in einigen Fällen wegen der Spezifität der Moleküle geringere Mengen erforderlich sind.
Die hybriden Moleküle können unter Anwendung jeder herkömmlichen Methode verabreicht werden; z. B. durch Injektion oder über ein Implantat mit verzögerter Wirkstoffabgabe. Die hybriden Proteine können mit jeder nichttoxischen pharmazeutisch verträglichen Trägersubstanz kombiniert werden.
Im Falle der MSH Hybride können topische Cremen zur Abtötung primärer Melanomzellen verwendet werden, und Injektionen oder Implantate können zur Abtötung metastatischer Zellen verwendet werden.
Östradiolhybride, die eine Bindungspezifität für gewisse Brustkrebsarten aufweisen, die durch Zellen charakterisiert sind, welche Östradiolrezeptoren tragen, können zur Behandlung primärer und metastatischer Zellen verwendet werden.
Andere Ausführungsformen sind im Umfang der folgenden Ansprüche.

Claims

1. Zielgerichtetes Toxinmolekül mit einem enzymatisch aktiven Toxinanteil, der an einen zellspezifischen Liganden gekoppelt ist, welcher ein Peptid, einen proteinischen Wachstumsfaktor oder ein modifiziertes Steroidhormon aufweist, wobei der Toxinanteil cytotoxische Aktivität besitzt, aber keine generalisierte eukaryotische Zellbindung aufweist und durch eine DNA-Sequenz kodiert wird, die ein nicht natürlich vorkommendes Cysteinkodon enthält; und wobei der Toxinanteil an den zellspezifischen Liganden über eine Disulfidbindung zwischen dem nicht natürlich vorkommenden Cysteinrest und einer Stelle auf dem Liganden gekoppelt ist.

2. Zielgerichtetes Toxinmolekül nach Anspruch 1, wobei das Toxin Diphtherietoxin, Ricin oder Abrin ist.

3. Zielgerichtetes Toxinmolekül nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei der Ligand eine Sulfhydrylgruppe enthält und die Disulfidbindung zwischen der Sulfhydrylgruppe und dem nicht natürlich vorkommenden Cysteinrest des Toxinmoleküls besteht.

4. Zielgerichtetes Toxinmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Peptid ein Hormon ist.

5. Zielgerichtetes Toxinmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der proteinische Wachstumsfaktor Interleukin I, Interleukin II, Interleukin III oder B-Zellen-Wachstumsfaktor ist.

6. Zielgerichtetes Toxinmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Steroidhormon Östradiol ist.

7. Zielgerichtetes Toxinmolekül mit einem enzymatisch aktiven Toxinanteil, der an einen zellspezifischen Liganden gekoppelt ist, welcher ein Peptid, einen proteinischen Wachstumsfaktor oder einen Antikörper aufweist, der durch eine DNA-Sequenz kodiert wird, die ein nicht natürlich vorkommendes Cysteinkodon enthält, wobei der Toxinanteil an den zellspezifischen Liganden über eine Disulfidbindung zwischen dem nicht natürlich vorkommenden Cysteinrest und einer Stelle auf dem Toxinmolekül gekoppelt ist.

8. Zielgerichtetes Toxinmolekül nach Anspruch 7, wobei das Peptid ein Hormon ist.

9. Zielgerichtetes Toxinmolekül nach Anspruch 7, wobei der proteinische Wachstumsfaktor Interleukin I, Interleukin II, Interleukin III oder B-Zellen-Wachstumsfaktor ist.