DE69132925T2

DE69132925T2 - An stabile proteinkernstruktur gebundene proteinpolyliganden

Info

Publication number: DE69132925T2
Application number: DE69132925T
Authority: DE
Inventors: Jean-Paul Soulillou
Original assignee: CT HOSPITALIER REGIONAL DE NAN
Current assignee: CT HOSPITALIER REGIONAL DE NAN
Priority date: 1990-08-29
Filing date: 1991-08-22
Publication date: 2002-10-10
Anticipated expiration: 2011-08-23
Also published as: CA2090105A1; EP0547163A1; EP0547163B1; DE69132925D1; US5672486A; EP0547163A4; ES2171392T3; WO1992003569A1; JPH06502301A

Description

Viele der Aktivitäten von Säugetierzellen werden durch die Bindung von Liganden an Oberflächenmembran-Proteinrezeptoren reguliert. Somit können die DNA-Replikation und Zellproliferation, Differenzierung, Reifung, das Homing, der Metabolismus, neuronale Signale und viele funktionale Fähigkeiten das Ergebnis der Bindung eines oder mehrerer Liganden an den Oberflächenmembran-Rezptoren, die auf einer Zelle vorhanden sind, und der Transduktion eines Signals infolge dieser Bindung sein. In einigen Situationen, wie z. B. Krebs, wo die Krebszellen aufgrund autokriner Reaktionen proliferieren können, besteht ein Interesse an der Hemmung der Signaltransduktion. In anderen Situationen, wie z. B. Allotransplantat-Abstoßung ist es die anfängliche Erkennung durch CD4- und CD8-T-Zellen des Transplantats als Fremdmaterial, das hauptsächlich die Abstoßung des Transplantats hervorruft. Ebenso kann allogenes Knochenmark Graft-versus- Host-Krankheit hervorrufen, bei der allogene T-Zellen in Knochenmarkimplantat enthalten sind, oder es können Autoimmunerkrankungen T-Zellen involvieren, wobei die Hemmung der T-Zellen-Proliferation wünschenswert ist.
Es gibt viele Beispiele dafür, dass man die Zellreaktion auf einen verfügbaren Liganden modulieren möchte. Häufig möchte man die Ligand-induzierte Signaltransduktion hemmen oder ihre Wirkung auf null absenken. Bemühungen in dieser Hinsicht verwendeten monoklonale Antikörper, wobei in der Literatur zahlreiche Bereiche über die Modulation des Immunsystems in Tiermodellen zu finden sind. Beispielsweise wurde über Verwendungen von Antikörpern gegen den Interleukin-2-Rezeptor (IL-2R) berichtet. Monoklonale Antikörper, die auf Peptidrezeptoren abziehen, wurden auch in Menschen verwendet, wobei aufgezeigt wurde, dass ein blockierender, gegen das IL-2R gerichteter Antikörper den Allotrarisplantat-Abstoßungsprozess hemmt. Soulillou et al., Lancet 1, 1339-1342 (1987); Soulillou et al., N.E.J.M. 322, 1175-1181 (1990). Der Vorteil dieser Vorgangsweise besteht darin, dass IL-2R nur auf Lymphozyten des Transplantatrezipienten exprimiert wird, die durch Donorantigene aktiviert sind, und nicht auf den ruhenden Lymphozyten, die genetisch nicht gegen Donorantigene gerichtet sind.
Zumeist waren die bei der Behandlung von Menschen verwendeten Reagenzien chimäre oder humanisierte monoklonale Antikörper oder bindende Fragmente (Fab oder (Fab')&sub2;) monoklonaler Antikörper gegen Membranrezeptoren. Diese Reagenzien sind in vivo mit zahlreichen Nachteilen verbunden, d. h. mit relativ niedriger Affinität im Vergleich zum Liganden selbst sowie üblicherweise keinen oder mangelhaften Effektorfunktionen (Komplement- und Antikörper-abhängige Zytotoxizität); außerdem rufen diese Proteine - sofern sie fremd sind - die Synthese von Wirtsantikörpern gegen Isotyp- oder Idiotyp-Determinanten hervor. "Humanisierte" Antikörper vermeiden wahrscheinlich die Inzidenz von Antiisotyp-, aber nicht von Antiidiotyp-Antikörpern, die sich später als blockierende Antikörper verhalten. Außerdem sind mehrere unabhängige monoklonale Antikörper erforderlich, damit die Chance der Reproduktion experimenteller, in einem Tiermodell erzielter Resultate beim Menschen deutlich erhöht wird (aufgrund des möglichen Fehlens von Kreuzreaktivität).
Es besteht daher hohes Interesse, alternative Bioreagenzien bereitzustellen, die dazu dienen können, physiologische Funktionen zu hemmen oder als Zytotoxizitätsmediatoren aufzutreten.
Bacha et al., J. Exp. Med. 167, 612-621 (1988), berichten über ein Reagens, das durch Fusion von IL-2 und Diphtherietoxin entsteht, während Lorberboum-Galski H. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 1922-1926 (1988), über die Fusion von IL-2 mit Pseudomonastoxin berichten. Es wurde aufgezeigt, dass sich diese Reagenzien mit hoher Affinität an die IL-2R-Bindungsstelle binden und zytotoxische Wirkung entfalten. Traunecker et al., Nature 339, 68-70 (1989); Capon et al., Nature 337, 535-531 (1989); und Gregerson et al., Archives of Virology 111, 29-43 (1990); beschreiben CD4-IgH- oder IgL-Konstantregionen-Fusionsproteine.
Die EP-A-0.314.317 und EP-A-0.325.262 offenbaren beide Fusionen von Abschnitten von Ig-Molekülen mit Abschnitten von CD4 (einem Rezeptor auf der Oberfläche verschiedener Zellen). Die Fusionen können mit Komplement in Wechselwirkung treten, was möglicherweise zu Komplement-mediierter Immunität führt (EP-A-0.325.262).
Gemäß der Erfindung ist eine Zusammensetzung bereitgestellt, die als Zytotoxizitätsvermittler bzw. -mediator wirkt, umfassend zumindest vier kovalent verbundene Untereinheiten, worin die Untereinheiten zumindest einen Abschnitt eines natürlich vorkommenden Poly(untereinheits)proteins umfassen, wobei der Abschnitt des natürlich vorkommenden Untereinheitsproteins zur Assemblierung nach der Expression in einem Zellwirt fähig ist und worin jede der Untereinheiten an zumindest einen Abschnitt einer natürlich vorkommenden Peptidsequenz fusioniert ist, die fähig ist, sich an einen natürlich vorkommenden Rezeptor auf einer Zelloberflächenmembran zu binden.
Ausführungsformen der Erfindung können als "Zytomuline" bezeichnet werden. Sie besitzen mehrere Ketten, die natürlich miteinander verknüpft sind und individuelle N- und/oder C-Termini aufweisen, wobei jede der Ketten durch Fusion an zumindest einen Abschnitt eines natürlich vorkommenden Liganden verlängert ist. Insbesondere ist eine trunkierte u-Kette oder ein IgM-Molekül an zumindest einen Bindungsabschnitt eines Liganden fusioniert, wobei der Ligand die N- oder C-terminale Region bereitstellt. Die resultierende oligomere Verbindung mediiert physiologische Wirkungen, z. B.:
(1) die Hemmung der Signaltransduktion in Zellen, die den Oberflächenmembran-Rezeptor des betreffenden Liganden tragen; und
(2) Mediation von Komplement-abhängiger Zytotoxizität auf in (1) beschriebenen Zellen; in diesem Fall verhält sich die Komplementbindungs-H-Kette wie ein "humanisiertes" Toxin.
Es folgt eine ausführliche Beschreibung von Ausführungsformen der Erfindung unter Bezugnahme auf die beiliegenden Abbildungen, worin:
Fig. 1 die DNA-Sequenz (SEQ.-ID Nr. 1) und die kodierte Aminosäuresequenz (SEQ.-ID Nr. 2) der Hybrid-IL2Mu-cDNA ist. Die im Versuchsteil besprochenen SalI-, BamHI- und Xbal-Stellen sind angezeigt;
Fig. 2 ein Graph der CTLL2-Proliferation ist (angezeigt durch die Anzahl unterschiedlicher Fusionsproteine); und
Fig. 3 ein Graph der C'-abhängigen Zytotoxizität für eine Anzahl unterschiedlicher Fusionsproteine ist.
Es werden neuartige Zusammensetzungen bereitgestellt, umfassend Fusionen von Ketten natürlich vorkommender Polyuntereinheitsproteine an ihren N- oder C-Termini an den komplementären Terminus von zumindest einem Abschnitt eines Liganden, der sich an einen natürlich vorkommenden Oberflächenmembran-Proteinrezeptor bindet. Diese Fusionsproteine werden als "Zytomuline" bezeichnet. Das resultierende Produkt besitzt eine Vielzahl von Bindungsstellen zur Bindung an den natürlich vorkommenden Rezeptor. Durch Verwendung natürlich vorkommender Polyuntereinheitsproteine kann die modifizierte Untereinheit als Ergebnis der Fusion noch immer richtig in einem geeigneten Wirtsorganismus verarbeitet werden, um die Einheiten zu assemblieren und für die gewünschte Polyuntereinheits-Assemblierung zu sorgen. Von besonderem Interesse und ein Beispiel für die Polyuntereinheitsproteine ist die u-Kette von IgM.
Die vorliegenden Zusammensetzungen können durch die folgende Formel charakterisiert werden:
(L-SU)n
worin:
L der Ligand oder ein Fragment davon ist, der/das zur spezifischen Bindung an den natürlich vorkommenden Liganden fähig ist;
SU für die Untereinheit eines Polyuntereinheitsproteins steht, wobei die Untereinheiten direkt oder durch einen zentralen Kern miteinander verbunden sein können; und
n zumindest 4, noch bevorzugter zumindest 6 und möglicherweise 10 oder mehr, üblicherweise höchstens 16, noch häufiger höchstens 10, ist.
Das Polyuntereinheitsprotein besitzt die folgenden Eigenschaften: (1) es besitzt zumindest 4 Ketten, noch bevorzugter zumindest 6, Ketten; (2) es kann an eine Sequenz am N- oder C-Terminus gebunden sein, ohne das Assemblieren des Polyuntereinheitsproteins in einem Wirtsorganismus zu verhindern; Gegebenenfalls kann auch nur ein Teil des Polyuntereinheitsproteins verwendet werden. Somit kann betreffend die IgM-u- Ketten beispielsweise die für die Wechselwirkung mit der Leichtkette verantwortliche Schwerkettendomäne entfernt werden; und (3) es besitzt gegebenenfalls Effektorfunktionen.
Diese Eigenschaften werden durch die u-Kette von IgM oder andere natürlich vorkommende Polyuntereinheitsproteine oder modifizierte Proteine aufgezeigt, wobei ein Cystein in die Kette eines dimeren Moleküls oder eines Moleküls höherer Ordnung eingesetzt wird, welche Cysteine dann in vitro aneinander gekoppelt werden können, um ein Oligomer höherer Ordnung zu bilden. Beispiele für solche Proteine sind MHC-Antigene, verschiedene Mitglieder der Immunglobulin-Überfamilie, β-Galactosidase usw. Die u-Kette kann ein Oligomer, üblicherweise ein Decamer, mit 10 Schwerketten bilden. Durch zweckgemäße Verwendung der Schwer- und Leichtketten mit oder ohne den J- Kern können jedoch Leicht-, Schwer- oder beide Ketten für die Fusion an die Liganden- Bindungsstruktur verwendet werden. Die Verarbeitung muss nicht einheitlich sein, sodass Gemische von Oligomeren entstehen können.
Es werden jene Teile von u-Schwerketten bewahrt, die Funktionen bereitstellen, die für das neuartige fusionierte Produkt wünschenswert sind. Wenn somit die Domänen CH&sub2; bis einschließlich CH&sub4; im Fusionsprodukt bewahrt werden (wobei ein Teil oder die Gesamtheit der Domäne CH&sub1; fehlt), enthält dieses adäquate Information für das Assemblieren des neuartigen fusionierten Produkts, das zur Bindung von Komplement fähig ist.
Es eignen sich hierin viele unterschiedliche Liganden von Interesse. Es existiert eine umfangreiche Literatur über Gene, die für Liganden kodieren, die sich an Rezeptoren binden und aufgrund ihrer physiologischen Aktivität von Interesse sind. Zu diesen Liganden zählen Proteine wie etwa die Interleukine 1-7, insbesondere 1, 2, 3 und 4; Cytokine wie etwa die transformierenden Wachstumsfaktoren α und β; Tumor-Nekrosefaktor, Epidermis-Wachstumsfaktor, Blutplättchen-abgeleiteter Wachstumsfaktor, Monozytenkolonie- Stimulationsfaktor, Granulozytenkolonie-Stimulationsfaktor, Granulozyten-Monozytenkolonie-Stimulationsfaktor, Erythropoietin, Fibroblasten-Wachstumsfaktor, Stel- oder Stammzellen-Wachstumsfaktor, Melanozyten-Stimulationshormon (MSH) usw.; die Interferone α, β un d γ; Insulin, Somatomedin, Somatotropin, Chorion-Gonadotropin und dergleichen. Außerdem können Haupthistokompatibilitäts-Komplex-Antigen-Bindungssequenzen als Liganden dienen.
Es ist in den meisten Fällen praktikabel, den gesamten Liganden zu verwenden. In vielen Fällen ist es aber möglicherweise wünschenswert, nur jenen Abschnitt des Liganden oder eine Verlängerung davon zu verwenden, der/die für die angestrebte physiologische Wirkung sorgt. Dies variiert von Fall zu Fall und hängt davon ab, wie groß der Ligand ist, ob der bindende Abschnitt des Liganden bekannt ist, welche Wirkung die Fusion der Sequenz an die Untereinheit auf die Aktivität entfaltet und dergleichen. In einigen Fällen kann man die zwei aktiven Abschnitte des Moleküls durch eine Verbindungseinheit fusionieren, die üblicherweise weniger als etwa 25 Aminosäuren umfasst. Diese Aminosäuren können eine Vielzahl von Funktionen bereitstellen, z. B. die Erreichung höherer Hydrophilie oder Hydrophobie an der Fusionsstelle, die Erleichterung des Zugangs zur Bindungsstruktur und dergleichen. Alternativ dazu können eine oder mehrere Mutationen, z. B. Substitutionen, Deletionen oder Insertionen, eingeführt werden (üblicherweise nicht mehr als drei Mutationen). Beispielsweise können einige Modifikationen in der Sequenz der u-Kette die Komplement-Bindungskapazität modifizieren. Möglicherweise besitzt ein Ligand größere Affinität, wenn er am C- oder N-Terminus der trunkierten Kette gebunden ist. In dieser Situation wird der korrespondierende Ligand an den geeigneten Terminus gebunden.
Die vorliegenden Zusammensetzungen können folgendermaßen hergestellt werden: (1) Konstruktion eines für die vorliegende Zusammensetzung kodierenden Fusionsgens; dabei werden bekannte Gene für die zwei Abschnitte des vorliegenden Moleküls verwendet. (2) Expression des Fusionsgens in Zellen. Im Fall von Immunglobulin-Fusionen können für die Immunglobulin-Ketten (Schwer- oder Leichtketten) kodierende Gene von jenen Sequenzen befreit werden, die für die variable Region und günstigerweise die erste Konstantregion kodieren. Üblicherweise enthalten im Fusionsgen vorhandene Gensequenzen jene, die für den zweiten Abschnitt der Konstantregion kodieren. Durch Einbringen geeigneter Restriktionsenzymstellen um die Sequenzen herum, die für die Bindungsstruktur und das Polyuntereinheitsprotein kodieren (oder für jene Teile dieser Proteine, die im fusionierten Produkt zu bewahren sind), können Strategien entwickelt werden, um die Sequenzen im korrekten Leserahmen aneinander zu fügen. Die resultierende fusionierte Sequenz trägt ein Initiationscodon, sodass das fusionierte Gen exprimiert werden kann. Die zwei Sequenzen können durch Ligation unter Einsatz von PCR, Rekombination oder dergleichen kombiniert werden. Berichte über die Anwendung solcher Techniken finden sich in der Literatur zuhauf. Die konkrete Art des Aneinanderfügens der zwei Abschnitte des fusionierten Moleküls ist für die Erfindung nicht entscheidend und hängt von den jeweils verwendeten Bausteinen ab.
Die verschiedenen Manipulationen der Gene können in einem zweckmäßigen Klonierungsvektor erfolgen, wobei zahlreiche derartige Vektoren zur Verfügung stehen, die für hochwirksame Klonierung, Isolation und Replikation sorgen. Beispiele für diese Vektoren sind pBR322 die pUC-Reihe und ihre Derivate. Die Klonierungsvektoren sind dadurch charakterisiert, dass sie ein geeignetes Replikationssystem, einen Selektionsmarker, üblicherweise ein oder mehrere antibiotische Resistenzgene, und einen oder mehrere Polylinker aufweisen, die für vereinfachtes Einsetzen und Ausschneiden der klonierten Sequenzen sorgen. Nach jedem Schritt kann die Integrität der Sequenz durch Restriktionsenzym-Kartierung, Sequenzieren oder dergleichen überprüft werden.
Für dimere Proteine kodierende DNA-Sequenzen können durch in vitro-Mutagenese in der für die C-proximalen Aminosäuren kodierenden Region modifiziert werden, um für ein einzelnes Cystein zu kodieren, das im ursprünglich kodierten Protein nicht vorhanden ist. Ein derartiges Cystein sollte nicht in der Lage zu sein, eine innere Disulfidbrücke zu bilden. Beispielsweise können durch Auswahl eines MHC-Moleküls, insbesondere eines Klasse II-Moleküls, die für α- und β-Ketten kodierenden Gene mutiert werden, um Cysteincodons einzusetzen. In den aus diesen mutierten Genen exprimierten Proteinen bilden die eingeführten Cysteine keine intramolekulare Disulfidbrücke innerhalb einer einzelnen Kette oder zwischen den α- und β-Ketten eines einzelnen MHC-Moleküls. Das Assemblieren kann in vitro durch Aktivieren der Thiolgruppen mittels geeigneter chemischer Modifikation erfolgen.
Die aktivierten Thiolgruppen reagieren dann zu intermolekularen Disulfidbrücken, um Oligomere zu bilden. Andere Techniken zur Regulierung der Verbindung und Bildung von Oligomeren kommen ebenfalls in Frage.
In einigen Fällen kann es günstig sein, unterschiedliche Liganden im gleichen Oligomer vorzusehen. Wenn Zielzellen Kombinationen von Rezeptoren aufweisen, welche Kombinationen sich von anderen Zellen unterscheiden, sorgt die höhere Avidität des gemischten Ligandoligomers für höhere Selektivität. Beispiele für solche Situationen sind ruhende Zellen (im Gegensatz zu stimulierten Zellen), z. B. Lymphozyten, Endothelzellen usw., Vorläuferzellen und reife oder differenziertere Zellen, normale Zellen und neoplastische Zellen und dergleichen.
Sobald das fusionierte Gen hergestellt ist, kann es in einen geeigneten Expressionsvektor insertiert werden, um eine Expressionskassette zu erzeugen. In vielen Fällen trägt das fusionierte Gen selbst die Signale, die für die Translationsinitiation und -termination notwendig sind (wenn dies nicht der Fall ist, werden diese Signale dem Fusionsgen hinzugefügt).
Signale für die Initiation der Transkription und RNA-Verarbeitung (Kappen, Spleißen, Polyadenylation usw.) können durch den Expressionsvektor bereitgestellt werden.
Die Expressionskassette enthält eine Transkriptions- und Translations-Initiationsregion sowie eine Transkriptions- und Translations-Terminationsregion. Die Transkriptions-Initiationsregion umfasst einen RNA Polymerase II-Promotor, eine Transkriptions-Startstelle, gegebenenfalls einen Enhancer, in einigen Fällen eine Sequenz, die induzierbare Transkription ermöglicht, und andere geeignete funktionale Sequenzen. Für die Translation werden die Initiations- und Terminationssignale üblicherweise auf dem fusionierten Gen getragen und stellen jene dar, die auf den natürlich vorkommenden Genen getragen werden, die zur Herstellung des fusionierten Gens dienen. In einigen Fällen können Mutationen dieser Sequenzen zur Steigerung der Wirksamkeit der Translation durchgeführt werden. Die Transkriptions-Terminationsregion stellt eine Polyadenylationsstelle und Terminationssequenz bereit.
Die Expressionskassette kann in unterschiedlicher Weise in eine geeignete Stammzelle transformiert werden, so dass sie im Wirt beibehalten wird. Alternativ dazu kann die Expressionskassette unter Bedingungen in den Wirt transformiert werden, unter denen sie stabil in das Wirtsgenom integrierbar ist. In jedem Fall besitzt sie normalerweise einen Marker für die Selektion des sie enthaltenden Wirts. Somit ist Antibiotika-Resistenz eine Option, z. B. das Neomycin-Resistenzgen, das Resistenz gegenüber G418 bietet.
Die Expressionskassette und der Marker können gemeinsam mit einem Replikationssystem für die extrachromosomale Bewahrung im Wirt verbunden werden. In den meisten Fällen werden Säugetier-Replikationssysteme aus Viren gewonnen, die Säugetierzellen infizieren, z. B. Papillomvirus, Adenovirus, Affenvirus 40, Vacciniavirus oder dergleichen. Viele Vektoren stehen zur Verfügung, die diese Replikationssysteme, einen oder mehrere Marker und einen Polylinker umfassen, um die Insertion der Expressionskassette durchzuführen.
Die Transformation der Wirtszelle kann unter Anwendung jeder beliebigen Technik wie z. B. Elektroporation, Calciumphosphat-gefällte DNA, Transfektion, Verwendung von Protoplasten oder dergleichen durchgeführt werden. Verfahren zum Transformieren von Wirtszellen sind in der Literatur bekannt und müssen hier nicht veranschaulicht werden.
Es eignen sich verschiedene Säugetier-Wirtszellen, die entweder normal oder neoplastisch sind. Die Zellen können lymphozytisch, insbesondere B-lymphozytisch, oder nicht-lymphozytisch sein - dies hängt davon ab, ob die Verarbeitung der u- oder einer anderen Kette mit Glykosylierung von Interesse ist. Nicht-sekretierende Myelom-Zelllinien, die das für J-Kette kodierende Gen exprimieren, kommen ebenfalls in Frage, wenn die u-Kette der Polyeinheits-Proteinkern ist. Die Co-Expression der J-Kette ist für die Komplementbindung durch eine u-Ketten-Polyeinheit nicht erforderlich, kann sie aber verstärken und die Bildung großer multimerer Spezies erleichtern. Nach der Transformation zum geeigneten Wirt werden die Zellen in herkömmlichem Medium gezüchtet, wo das die u-Kette und den Liganden umfassende fusioneirte Protein exprimiert und assembliert wird, um ein Decamer von u-Ketten zu bilden und insgesamt zehn Liganden bereitzustellen. Auf diese Weise braucht man keine Leichtkette. Keine verwendete Wirtszelle sollte Schwer- oder Leichtketten produzieren.
In einigen Fällen kann eine Signalsequenz bereitgestellt sein, die die Verarbeitung des assemblierten Moleküls mit Sekretion erlaubt. Die Signalsequenz kann für den Liganden natürlich, für das Polyuntereinheitsprotein natürlich oder beiden fremd sein. Bei Verwendung einer Signalsequenz sollte man darauf achten, dass diese entfernt ist oder nicht die Ligandenbindung beeinträchtigt. Die Entfernung der Signalsequenz kann intra- oder extrazellulär erfolgen. Wenn die Sekretion erreicht ist, kann das Assemblieren für verschiedene Reihenfolgen von Oligomer sorgen. Das Oligomer kann in vitro modifiziert werden, um die Anzahl an Untereinheiten des Oligomers zu erhöhen, z. B. durch Oxidation oder Thiolaktivierung, wenn Disulfidbrückenbildung beteiligt ist.
Die vorliegende Methodologie eignet sich für jeden Säugetierwirt, insbesondere Primaten, vor allem Menschen, und Nutz- bzw. Haustiere, z. B. Mäuse, Rinder, Ziegen, Schafe, Hunde, Katzen, Pferde, Hasen usw.
Das exprimierte Produkt kann durch Lyse von Wirtszellen, Isolierung aus dem Überstand, Extraktion von Protein, Reinigung mittels Elektrophorese, Affinitätschromatographie, HPLC oder dergleichen isoliert werden. Das gereinigte Produkt kann dann in unterschiedlicher Weise zur Verwendung als Therapeutikum formuliert werden. Das Produkt kann in einer Vielzahl an physiologisch annehmbaren Medien wie z. B. in entionisiertem Wasser, Kochsalzlösung, Phosphat-gepufferter Salzlösung, wässrigem Ethanol oder dergleichen formuliert werden. Die Konzentration der vorliegenden Verbindungen reicht im Allgemeinen von etwa 0,01 bis 100 mM - dies hängt von der Dosierungsmenge, der Wirksamkeit des Produkts, der Art der Verabreichung, dem Verabreichungszweck und dergleichen ab. Im Allgemeinen variieren aus ähnlichen Gründen auch die Dosierungen - sie reichen von etwa 1 pg/kg des Wirts bis etwa 1 mg/kg des Wirts.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können bei der Untersuchung von Zellen in vitro, bei der Phorese zur Entfernung bestimmter Zellen aus einem Zellengemisch, beim Stimulieren von Zellen zur Proliferation oder Hemmung der Stimulation sowie zur Analyse des an der Stimulation beteiligten Prozesses und dergleichen eingesetzt werden. Wenn gemischte Liganden verwendet werden, ist die Wahrscheinlichkeit hoch, dass beide Rezeptoren gleichzeitig gebunden werden, sodass die Wirkung verlängerter gleichzeitiger Bindung untersucht werden kann.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können die durch eine Ligandenbindung an den Rezeptor erzeugten Signale blockieren, indem die Internalisierung des Rezeptor-Ligand- Komplexes gehemmt und/oder die Zielzelle durch Komplement-mediierte Zytotoxizität oder eine andere Effektorfunktion abgetötet wird, z. B. Antikörper-abhängige Zytotoxizität (ADCC) oder dergleichen. Auf diese Weise können viele unterschiedliche Ereignisse moduliert werden, z. B. Mitose, Differenzierung, Homing, Stimulation und dergleichen.
Somit kann man eine Immunreaktion durch Verhindern der Proliferation von T- und/ oder B-Zellen hemmen, die Stimulation von T-Zellen durch Bindung an MHC-Antigene verhindern usw.
Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung und sind nicht einschränkend.

EXPERIMENTELLER TEIL

Beispiel 1

Ein kloniertes cDNA-Fragment mit Sequenzen, die für die gesamte Konstantregion der Human-Immunglobulin-u-Schwerkette kodieren, wird als Templat für Polymerase-Kettenreaktions- (PCR-) Amplifikation unter Einsatz der folgenden Primer verwendet:

SEQ.-ID Nr. 3:

1) 5' - CGGATCCGTGATTGCTGAGCTGCCTCCC -3'

SEQ.-ID Nr. 4:

2) 5' - CTCTAGAGGGTCAGTAGCAGGTGCCAG - 3'
Dies führt zur Produktion eines DNA-Fragments, das Sequenzen enthält, die für die Cu2 bis einschließlich Cu4-Regionen kodieren (angeordnet zwischen einer BamHI-Spaltstelle und einer Xbal-Spaltstelle). Relevante Sequenzen (nur ein DNA-Strang ist dargestellt) sind: SEQ.-ID Nr. 5:
Dieses Fragment wird mit BamHI und Xbal gespalten und zwischen die BamHI- und die Xbal-Stelle des Plasmids PKCRα insertiert. Das resultierende rekombinante Plasmid (pMu) wird in E. coli-Stamm XL·1 transformiert und in selektivem Medium zur Selektion transformierter Wirte gezüchtet, die bis zum stationären Zustand in 2XTY-Medium expandiert und gezüchtet werden. Die Zellen werden dann geerntet und das Produkt durch herkömmliche Cesiumchlorid-Dichtegradient-Techniken isoliert und gereinigt. Voll-RNA aus Jurkat-Zellen werden als Templat für reverse Transkription unter Verwendung von Oligo dT als Primer verwendet. Das resultierende Gemisch von cDNAs dient als Templat für die PCR-Amplifikation unter Einsatz der folgenden Primer:

SEQ.-ID Nr. 6:

1) 5' -, CGTCGACTCCTGCCACAATGTACAGG - 3'

SEQ.-ID Nr. 7:

2) 5' - CGGATCCAGTCAGTGTTGAGATGATGC - 3'
Dies führt zur Produktion eines DNA-Fragments, das Sequenzen enthält, die für Human- IL-2 kodieren (einschließlich der Peptidsequenz) und zwischen Spaltstellen für SalI (N- Terminus) und BamHI (C-Terminus) liegen. Es ist zu beachten, dass das IL2-Stoppcodon durch eine BamHI-Spaltungssequenz ersetzt wurde. Die relevanten Sequenzen sind (nur ein Strang ist dargestellt): SEQ.-ID Nr. 8
Dieses Fragment wird durch SalI und BamHI geschnitten und zwischen die SalI- und die BamHI-Stelle von pMu eingesetzt. Das rekombinante Plasmid wird wie oben für pMu hergestellt und als plL2 Mu bezeichnet. Dieses Plasmid enthält ein SalI-Xbal-Fragment, das für ein IL-2- (Cg2 → Cu4) Fusionsprotein kodiert; die "Linker"-Region zwischen IL2 und u ist die Sequenz Gly-ser, für die die BamHI-Spaltstellensequenz kodiert (GGATCC).
pIL2-Mu enthält das Fusionsgen im Expressionsvektor pKCRα. Das Fusionsgen steht unter der Transkriptionssteuerung der frühen SV40-Gen-Promotor- und -Enhancerelemente, wobei die Spleiß- und Polyadenylierungssignale aus einem Kaninchen-β-Globin-Gen verwendet werden.
Das vorliegende Plasmid wird γemäß herkömmlicher Techniken in Sp2/0-Zellen transformiert. Siehe Junghans et al., Cancer Research 50, 1495-1502. Da das IL2-Gen die Signalsequenz trägt, wird das Produkt selbstassembliert in den Überstand sekretiert. Außerdem wird das assemblierte Produkt in den SP2/0-Zellen beibehalten. Die Zellen werden geerntet, unter Verwendung von schwacher Base lysiert und das Proteinprodukt frei von Zellbruchstücken isoliert und gereinigt.
Die Wirkung des IL2-abhängigen Wachstums alloreaktiver T-Zell-Klone wird durch das von Lemauff et al., Human Immunol. 19, 53-58 (1987), beschriebene Verfahren untersucht. Die Wirkung leukämischer Zeltlinien und des Leukozytenwachstums wird unter Anwendung der gleichen Vorgangsweise aufgezeigt. Das Potenzial der vorliegenden Zusammensetzung, in die Immunreaktion von Rezipienten von Allotransplantaten einzugreifen, wird gemäß dem Verfahren von Peyronney et al., Transplant. Proc. 20, 300-302 (1988), und Soulillou et al., N.E.J.M. 322, 1175-82 (1990), untersucht. Da Human-IL2 mit Ratten-IL2 kreuzreaktiv ist, zeigt sich die Aktivität der erfindungsgemäßen Zusammensetzung in Ratten. Zielzellen werden durch Mediation von Komplement abgetötet.

Beispiel 2

Materialien und Verfahren

Standardtechniken der Molekularbiologie, z. B. PCR, Manipulation von DNA-Fragmenten, Transfektion von COS-1-Zellen mittels DEAE-Dextran-Arbeitsvorschrift und Laufen- Lassen von SDS-Polyacrylamidgelen, entsprechen im Wesentlichen den Ausführungen in "Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausgabe", herausgegeben von Sambrook, Fritsch und Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA.
Um IL2Mu oder IL2Um enthaltende Überstände auf Proliferations-induzierende Aktivität zu testen, wurden 3000 Zellen aus der IL2-abhängigen CTL-L2-Zelllinie 18 h lang in Gegenwart entweder des geeigneten Überstands (es wurden verschiedene Verdünnungen untersucht), von Medium alleine oder von bekannten Mengen an IL2 kultiviert. Die Kulturen wurden mit 0,5 uCi titriertem Thymidin während der letzten 6 Stunden der Inkubation gepulst und inkorporiertes Thymidin auf Filtern unter Verwendung eines Zellernters. isoliert. Die Filter wurden gemeinsam mit 0,5 ml Szintillationsflüssigkeit in Fläschchen eingebracht und die Radioaktivität mittels eines β-Zählers gemessen.

Komplement-abhängige Zytotoxizität

CTL-IL2-Zellen wurden mit eiskaltem COS-1-Zellüberstand 30 min lang inkubiert und dann zweimal vor der Zugabe von Kaninchen-Komplement (50% in RPMI) gewaschen. Nach 45-minütiger Inkubation bei 37ºC wurde die Lebensfähigkeit der Zellen untersucht - entweder durch Zählen der Zellen unter dem Mikroskop in Gegenwart von Eosin oder durch Messen der von den Zellen freigesetzten Radioaktivität, welche Zellen mit Na&sub2;&sup5;¹CrO&sub4; vor ihrem Kontakt mit Überständen markiert worden waren. 3 · 10&sup6; Zellen wurden mit 100 uCi Na&sub2;&sup5;¹CrO&sub4; 2 h lang bei 37ºC inkubiert und dann dreimal gewaschen. Die spontane Freisetzung von Radioakvitität (SR) war jene, die freigesetzt wurde, als die Zellen (3000/Napf) mit Medium alleine, Komplement alleine oder COS-1-Zellen- Überstand alleine inkubiert wurden. Die maximale Freisetzung (MR) wurde in Gegenwart von 1% Triton X100 erzielt. Die bei Verwendung eines bestimmten Überstands freigesetzte Radioaktivität wurde gemeinsam mit Komplement = ER verwendet. Die spezifische zytotoxische Aktivität = 100 · (ER-SR) dividiert durch (MR-SR).

Fusionsprotein-Analyse

Mit geeigneten DNAs transfizierte COS-1-Zellen wurden 30 h lang in RPMI 1640 Medium ohne Methionin und Cystein (Selectamin, Gibco), jedoch mit 5% dialysiertem Kalbsfötenserum und 100 uCi/ml ³&sup5;S-markiertem Methionin und Cystein (Amersham) kultiviert. Überstände wurden auf eine Säule von Affi-Gel 10 (Bio-Rad), gekoppelt mit 3 mg eines polyklonalen Ziegen-Anti-Human-IgM-Antikörpers (u-Ketten-spezifisch) (Biosys), aufgebracht. Die Immunaffinitätsmatrix wurde dann ausgiebig mit PBS, die 1 M NaCl und 0,05% Tween 20 enthielt, und dann mit zehnfach in destilliertem Wasser verdünnter PBS gewaschen. Die Elution von gebundenem Material erfolgte unter Verwendung eines Glycin-HCl-Puffers (0,2 M, pH 2,5); die Eluate wurden durch Messungen der Radioaktivität und optischen Dichte (280 nm) überwacht. Fraktionen mit eluiertem Material wurden sofort mit Na&sub2;HPO&sub4; (0,5 M), neutralisiert, gepoolt und gegen Phosphatpuffer (20 mM, pH 7,0) dialysiert, bevor die Konzentration mittels Speed Vac erfolgte. SDS-PAGE fand gemäß dem Verfahren von Laemmli auf 4,5-16% Polyacrylamid- Gradienten-Scheibengelen statt. Vor dem Laden wurden lyophilisierte Proben 3 min lang in Probenpuffer auf 95ºC erhitzt, der 5% 2-Mercaptoethanol enthielt. Nach der Elektrophorese wurden die Gele mit Amplify (Amersham) äquilibriert, getrocknet und für die Autoradiographie bei -70ºC getrocknet. Die radiomarkierten Molekulargewichtsstandards stammten von Pharmacia.

Ergebnisse und Diskussion

Hybrid-cDNA-Konstruktion

Die allgemeine Strategie zur Produktion von Immunglobulin-Fusionsproteinen umfasst die Ersetzung der variablen Immunglobulin-Region durch das Protein von Interesse. Es wurde die Immunglobulin-u-Schwerketten-Konstantregion verwendet. Die CH2-CH4- Domänen enthalten die zur Bindung von Komplement und Mediation von ADCC notwendigen Sequenzen sowie auch die Cysteinreste, die an der Multimerisation des Immunglobulins beteiligt sind (normalerweise als Pentamere oder Hexamere vorgefunden). Das IL-2-(CH2-CH4-Domänen-) Fusionsprotein würde Multimere bilden, die ihre Fähigkeit beibehielten, den IL2-Rezeptor mit hoher Affinität zu binden, Komplement zu fixieren und ADCC zu mediieren.
Als erster Schritt für die Produktion des Fusionsproteins wurde eine Hybrid-IL2-Immunglobulin-u-cDNA hergestellt. Die cDNA-Population, erhalten aus reverser Transkription von aus transient stimulierten Jurkat-Zellen isolierter Voll-RNA, diente als Templat für die PCR-Amplifikation. Ein verwendeter Primer korrespondierte mit einer Region der untranslatierten 5'-Region der IL2-mRNA und wurde mit einer SalI-Spaltungssequenz verknüpft. Der zweite Primer war komplementär zu den Sequenzen, die für die Carboxyterminalen Aminosäuren von IL2 kodieren, und würde mit einer Spaltungssequenz für BamHI verbunden. Auf diese Weise wurde ein für IL2 kodierendes SalI-BamHI-Fragment erhalten, wobei das Stoppcodon durch die BamHI-Stelle ersetzt war. In einer anderen Versuchsreihe wurde eine für eine Human-Immunglobulin-u-Schwerkette kodierende Teil-cDNA als Templat für die PCR-Amplifikation verwendet. Ein verwendeter Primer korrespondiertes mit Sequenzen, die für die ersten Aminosäuren der CH2-Domäne kodieren, und wurde mit einer BamHI-Spaltungssequenz verbunden. Der andere Primer war komplementär zu Sequenzen, die für den Carboxy-terminalen Schwanz des Immunglobulins kodieren, und wurde mit einer Xbal-Spaltungssequenz verbunden. Auf diese Weise entstand ein BamHI-Xbal-Fragment, das für die CH2-CH4-Domänen kodiert. Die zwei PCR-Produkte wurden über ihre BamHI-Sequenzen kombiniert, um die gewünschte Hybrid-cDNA zu produzieren. Die Sequenz ist in Fig. 1 zu sehen. Diese cDNA sollte alle Information tragen, die notwendig ist, um die Produktion eines sekretierten 483- Aminosäuren-Fusionsproteins (IL2-Mu) zu spezifizieren, das Multimere bilden, sich an den IL2-Rezeptor binden und Komplement aktivieren kann. Eine Variante der cDNA wurde durch Umkehren der Orientierung eines BstEI-Fragments produziert (siehe Fig. 1), das innerhalb der Immunglobulin-Kodiersequenzen enthalten ist. Diese cDNA kodiert für ein trunkiertes 221-Aminosäuren-Fusionsprotein (IL2Um), dem ein Teil der CH2-Domäne und die Gesamtheit der CH3- und CH4-Domänen fehlt und das somit nicht in der Lage sein sollte, Multimere zu bilden oder Komplement zu binden, während es weiterhin die Fähigkeit besitzt, sich an den IL2-Rezeptor zu binden.

Expression von Fusionsprotein

Die Hybrid-cDNAs wurden in den eukaryotischen Expressionsvektor pKCRα unter der Steuerung des frühen SV40-Gen-Promotors eingesetzt. COS-1-Zellen wurden mit den resultierenden Plasmiden oder pKCRα transfiziert und sekretierte Proteine zwecks Analyse geerntet. Diese Proteine wurden Affinitätschromatographie unter Verwendung eines Anti-IgM-Harzes unterzogen. Gebundene Proteine wurden durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen eluiert und analysiert. Diese Analyse affinitätsgereinigter Proteine aus Versuchen mit den IL2Mu- und IL2Um-cDNAs ermöglichte die Detektion von 64 kDa- bzw. 39 kDa-Proteinen. Keines dieser Proteine wurde detektiert, als der pKCRα- Vektor für die Transfektion verwendet wurde.

Sowohl IL2Mu als auch IL2Um stimulieren Zellwachstum

Nachdem aufgezeigt wurde, dass die Hybrid-eDNAs dazu dienen können, entweder IL2Mu oder IL2Um zu produzieren, wurde bestimmt, ob sich diese Proteine an den IL2- Rezeptor binden können. Zu diesem Zweck wurden Fusionsproteine auf ihre Fähigkeit untersucht, das Wachstum der IL2-abhängigen Mäuse-T-Zelllinie CTL-L2 und Lectin-aktivierter Human-T-Lymphozyten zu fördern. Überstände aus COS-1-Zellen (transfiziert mit IL2Mu- oder IL2Um-Expressionsvektoren) konnten im Gegensatz zu jenen aus mit dem "leeren" Expressionsvektor pKCRα transfizierten Zellen die Proliferation von Mäuse- und Human-aktivierten T-Zellen spezifisch hervorrufen.

ILMu-, aber nicht IL2Um-Bindung führt zu Komplement-induzierter Zytotoxizität (Fig. 2 und 3; zwei unterschiedliche Präparate jedes Fusionsproteins werden untersucht)

In der nächsten Studie wurde ermittelt, ob die gebundenen Fusionsproteine dazu dienen konnten, Komplement-induzierte Abtötung zu bewirken, die für jene Lymphozyten spezifisch ist, die einen IL2-Rezeptor hoher Affinität exprimieren. Zu diesem Zweck wurden &sup5;¹Cr-markierte CTL-L2-Lymphozyten mit den zu testenden Reagenzien inkubiert (Überstände aus COS-1-Zellen, transfiziert mit den IL2Mu- und IL2Um-Expressionsvektoren oder dem pCKRα-Vektor). Kaninchen-Komplement wurde 45 später zugegeben, und die Zellen wurden 1 h lang bei 37ºC inkubiert. Die Menge des freigesetzten &sup5;¹Cr wurde dann geschätzt und der Prozentsatz spezifischer Zelllyse berechnet. Signifikante Lyse von CTL-L2-Zellen wurde nach der Inkubation mit IL2Mu (umfassend Überstände und Kaninchen-Komplement) beobachtet, während man keine Abtötung zusätzlich zu jener, die durch Komplement alleine induziert wurde, feststellte, als IL2Um mit Überständen und Kaninchen-Komplement verwendet wurde. Dieses Phänomen war dosisabhängig und spezifisch, da IL2-Rezeptor-negative Zeillinien (z. B. DA-1a-Mäusezellen) unter den gleichen Assaybedingungen nicht abgetötet wurden.
Gemäß den obigen Verfahren kann die für den IL2-Liganden kodierende Sequenz durch eine für jeden anderen Liganden kodierende Sequenz ersetzt werden. In einigen Situationen kann es wünschenswert sein, eine gemischte Zusammensetzung vorzusehen, wobei einige der Ketten einen Liganden für einen Rezeptor umfassen, während andere Ketten einen Liganden für einen anderen Rezeptor umfassen. Solche gemischten Zusammensetzungen können Anwendung finden, wenn ausgewählte Rezeptoren für eine bestimmte Zellklasse spezifisch sind, sodass die abgezielte Population auf Zellen einer bestimmten Klasse beschränkt werden kann.
Außerdem sollten die Fusionsproteine den speziellen Vorteil aufweisen, keinerlei Immunreaktion aus dem Humanrezipienten auszulösen - beide ihrer Komponenten sind natürlichen menschlichen Ursprungs. Somit können die vorliegenden Zusammensetzungen wiederholt verabreicht werden, ohne durch das Immunsystem inaktiviert zu werden oder eine Immunreaktion zu induzieren.
Es ergibt sich aus der obigen Beschreibung, dass die Verbindungen der Erfindung eine neuartige Methodologie zum Hemmen einer Vielzahl physiologischer Prozesse darstellen. Die Multiligand-Verbindung kann sich an eine Vielzahl an Oberflächenmembran- Proteinrezeptoren binden und auf diese Weise die Liganden-Internalisierung verhindern, die Signalinduktion vermeiden oder die Zielzelle durch Komplementmediation abtöten. Auf diese Weise können viele Prozesse für die prophylaktische oder therapeutische Behandlung von Säugetierwirte moduliert werden.
Durch Verwendung der vorliegenden Zusammensetzungen alleine oder in Verbindung mit anderen Medikamenten können verschiedene Zustände, wie z. B. Transplantatabstoßung, Autoimmunerkrankungen, Graft-versus-Host-Erkrankung und Tumore behandelt werden.
Alle hierin angeführten Publikationen und Patentanmeldungen legen Zeugnis ab über die Kompetenz der Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung.
Nach dieser ausführlichen Beschreibung der Erfindung ist zu beachten, dass es für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist, dass zahlreiche Veränderungen und Modifikationen erfolgen können, ohne vom Schutzumfang der beigefügten Patentansprüche abzuweichen.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE INFORMATIONEN:
(i) ANMELDER: Soulillou, Jean-Paul
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: Mit einem stabilen Proteinkern verbundene Proteinpolyliganden
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 11
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADDRESSAT: Cooley Godward Castro Huddleson & Tatum
(B) STRASSE: 5 Palo Alto Square, Suite 400
(C) STADT: Palo Alto
(D) BUNDESSTAAT: Kalifornien
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 94306
(v) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) ART DES MEDIUMS: 5,25 Zoll, 360 Kb Diskette
(B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release # 1.0, Version #1.25
(vi) AKTUELLE ANMELDEDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER: US 07/646.875
(B) EINREICH DATUM: 28. Januar 1991
(C) KLASSIFIZIERUNG:
(vii) PRORITÄTSANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDENUMMER: US 07/575.394
(B) ANMELDUNGSDATUM: 23. August 1990
(viii) INFORMATIONEN ÜBER ANWALT/VERTRETER:
(A) NAME: Rowland Phd.D., Bertram I.
(B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 20.015
(C) KENNZAHL/ZEICHEN: ATLA-001/01 US
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSANGABEN:
(A) TELEFON: 415/494-7622
(B) TELEFAX: 415/857-0663
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID NR. 1:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 1540 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGBESCHAFFENHEIT: doppelt
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CD5
(B) POSITION: 17...1528 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID NR. 1:
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID NR. 2:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 504 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTY: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID NR. 2:
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID NR. 3:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 28 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGBESCHAFFENHEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: synthetische DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID NR. 3:
CGGATCCGTG ATTGCTGAGC TGCCTCCC 28
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID NR. 4:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 27 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGBESCHAFFENHEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(iii) MOLEKÜLTYP: synthetische DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID NR. 4:
CTCTAGAGGG TCAGTAGCAG GTGCCAG 27
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID NR. 5:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID NR. 5:
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID NR. 6:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 28 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGBESCHAFFENHEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: synthetische DNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CD5
(B) POSITION 1...15 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID NR. 6:
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID NR. 7:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID NR. 7:
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID NR. 8:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 26 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGBESCHAFFENHEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: synthetische DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID NR. 8:
CGTCGACTCC TGCCACAATG TACAGG 26
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID NR. 9:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 27 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGE BESCHAFFENHEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: synthetische DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID NR. 9:
CGGATCCAGT CAGTGTTGAG ATGATGC 27
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID NR. 10:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 28 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGBESCHAFFENHEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: synthetische DNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CD5
(B) POSITION: 1...21 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID NR. 10:
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID NR. 11:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
(B) TYP: Amlinosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID NR. 11:

Claims

1. Zusammensetzung, die als Zytotoxizitätsvermittler wirkt, umfassend zumindest vier kovalent verbundene Untereinheiten, worin die Untereinheiten zumindest einen Abschnitt eines natürlich vorkommenden Poly(untereinheits)proteins umfassen, wobei der Abschnitt des natürlich vorkommenden Untereinheitsproteins zur Assemblierung nach der Expression in einem Zellwirt fähig ist und worin jede der Untereinheiten an zumindest einen Abschnitt einer natürlich vorkommenden Peptidsequenz fusioniert ist, die fähig ist, sich an einen natürlich vorkommenden Rezeptor auf einer Zelloberflächenmembran zu binden.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin die an die Peptidsequenzen oder Abschnitte davon fusionierten Untereinheiten zur Assemblierung nach der Expression in einem Zellwirt fähig sind.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, worin die Untereinheiten Immunglobulin-Untereinheiten sind.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 3, worin die Immunglobulin-Untereinheiten IgM-u-Ketten sind.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, worin die Untereinheiten über Disulfidbrücken verbunden sind.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, worin die Untereinheiten IgM-u-Ketten sind und die Hemmung der Signalübertragung nach der Bindung an den entsprechenden Rezeptor durch eine Blockade der Rezeptor-Internalisierung vermitteln.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, worin die Untereinheiten IgM-u-Ketten sind und komplementabhängige Abtötung oder eine Effektorfunktion des konstanten Abschnitts eines Ig vermitteln und für eine Zelle, die den spezifischen Rezeptor trägt, zytotoxisch sind.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, worin mehr als eine natürlich vorkommende Peptidsequenz vorhanden ist, die zur Bindung an den natürlich vorkommenden Oberflächenmembranrezeptor fähig ist.

9. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, worin sich der Rezeptor an ein Hormon oder Zytokin bindet.

10. DNA-Sequenz, die für eine Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche kodiert.

11. DNA-Sequenz nach Anspruch 10, die an ein stabiles Replikationssystem und/ oder an einen Marker für die Selektion eines Zellwirts gebunden ist.

12. DNA-Sequenz nach Anspruch 11, worin die natürlich vorkommende Untereinheit, für die kodiert wird, eine Immunglobulin-Untereinheit ist.

13. Expressionskassette, die eine DNA-Sequenz nach Anspruch 11 umfasst, die an eine Transkriptionsinitiationsregion und eine Transkriptionsterminationsregion gebunden ist und unter deren Transkriptions- und Translationsregulierung steht.

14. Zellwirt, der eine Expressionskassette nach Anspruch 13 umfasst.

15. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: das Züchten eines Zellwirts nach Anspruch 14 in einem geeigneten Nährstoffmedium, wodurch die Zusammensetzung exprimiert wird; und das Isolieren der Zusammensetzung.

16. Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Herstellung einer Zytotoxizität vermittelnden Zusammensetzung zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung von Säugetieren.