DE69433787T2

DE69433787T2 - HTLV-I UND HTLV-II gp21 abgeleitete Peptide zur diagnostischen Verwendung

Info

Publication number: DE69433787T2
Application number: DE69433787T
Authority: DE
Inventors: Kenneth G. Hadlock; Chin-Joo Goh; Steven K.H. Fong
Original assignee: Genelabs Technologies Inc; Leland Stanford Junior University
Current assignee: Genelabs Technologies Inc; Leland Stanford Junior University
Priority date: 1993-02-05
Filing date: 1994-02-02
Publication date: 2005-05-25
Anticipated expiration: 2014-02-03
Also published as: CA2155001C; EP0682703A1; ES2221664T3; EP0682703B1; US5643714A; ATE267253T1; SG49829A1; CA2155001A1; JPH08509597A; WO1994018322A1; JP3470899B2; AU690540B2; AU6132094A; DE69433787D1

Description

Diese Anmeldung ist eine Teilfortführung der ebenfalls anhängigen U.S.-Patent-Anmeldungen für "HTLV-I and HTLV-II Peptide Antigens and Methods", Serien-Nr. 07/653,091, die am 8. Februar 1991 eingereicht wurde, die wiederum eine Teilfortführung der U.S.-Patent-Anmeldung "HTLV-I Peptide Antigen and Methods", Serien-Nr. 336,313 darstellt, die am 13. Juni 1989 eingereicht wurde und die jetzt die U.S.-Patent-Nr. 5,066,579 trägt und am 19. November 1991 erteilt wurde, welche wiederum eine Fortsetzung der U.S.-Patent-Anmeldungen für "HTLV-I Peptide Antigen and Methods", Serien-Nr. 948,270 darstellt, die am 31. Dezember 1986 eingereicht und jetzt fallen gelassen wurde.
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein HTLV-spezifisches Peptid und Verfahren zur Herstellung und zur Verwendung des Antigens.
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3. Hintergrund der Erfindung
Die menschlichen T-Zellen-Leukämie-Viren (HTLV) stellen eine Familie von T-Zellen-Retroviren mit drei bekannten Mitgliedern dar. HTLV-Typ-I (HTLV-I) besitzt eine transformierende Aktivität in vitro und ist ätiologisch mit der adulten T-Zellen-Leukämie verbunden, von der bekannt ist, dass sie in verschiedenen Teilen der Welt endemisch ist. HTLV-II ist ein anderes Retrovirus, das die Fähigkeit zur Transformation in vitro besitzt und das aus einem Patienten mit einer T-Zellen-Variante der Haarzellen-Leukämie isoliert wurde (für einen Übersichtsartikel über HTLV-I und -II vergleiche mit Cann und Chen). HTLV-III, das auch als Lymphadenopathie-assoziiertes Virus bezeichnet wurde und das nun als das menschliche Immunschwächevirus (HIV) bekannt ist, ist für bestimmte Arten von T-Zellen lytisch und wurde mit der Ätiologie des erworbenen Immunschwäche-Syndroms (AIDS) in Verbindung gebracht. Anders als die HTLV-I- und -II-Viren ist von HTLV-III nicht bekannt, dass es eine transformierende Aktivität in vitro besitzt.
Die Diagnose einer HTLV-I-Infektion basiert gewöhnlich auf der Antikörper-Antwort des Serums auf HTLV-I-Peptid-Antigene. Dies umfaßt in der Regel einen anfänglichen Durchmusterungs-Testansatz zur Identifizierung von HTLV-I-Antikörpern, der auf einem Enzym-Immun-Testansatz (EIA) mit HTLV-I-Virion-Peptiden basiert. Die Testansätze, die gegenwärtig zur Durchmusterung von Blut verwendet werden, weisen etwa 0,5 bis 0,05 % HTLV-I- und HTLV-II-Positive bei Blutspendern in den Vereinigten Staaten nach; von diesen sind etwa 4 von 5 Falsch-Positive. Daher müssen die positiven Seren mit einem bestätigenden Testansatz unter Verwendung von HTLV-I-Virus-Lysaten, bei denen das Western-Blot-Verfahren angewendet wurde, weiter untersucht werden. Die derzeitigen Verfahren zum Austesten von Blut erfordern, dass die Individuen sowohl Antikörper gegen das HTLV-I-p24-gag-Protein als auch gegen mindestens eines der Hüll-Proteine gp46 und gp68 besitzen (public health service working group [Arbeitsgruppe des öffentlichen Gesundheitsdienstes]). Es hat sich jedoch als technisch schwierig herausgestellt, die Proteine gp46 oder gp68 unter Verwendung eines Western-Blot-Testansatzes nachzuweisen. Daher muß oft eine zweite Runde eines Radioimmun-Präzipitations-Testansatzes zur Bestätigung durchgeführt werden, um eine Antikörperreaktion auf die HTLV-I-Hüllproteine nachzuweisen.
Eine Teillösung dieses Problems wurde durch die molekulare Clonierung eines Teils von 134 Aminosäuren des transmembranen Glycoproteins gp21 bereitgestellt (Samuel et al.). Das rekombinante Protein, das als p21E-Protein bezeichnet wird, reagiert sowohl mit den Seren aus HTLV-I als auch mit denen aus HTLV-II infizierten Individuen und wurde erfolgreich zur Bestätigung einer Infektion mit HTLV in Western-Blot-Testansätze eingebaut (Lillehoj et al., Lipka et al., 1991). Es wurde jedoch herausgefunden, dass das p21E-Protein ebenfalls mit 0,6 % der HTLV-negativen Blutspender reagierte (Lal et al.), Darüber hinaus werden viel höhere Raten an Reaktivität gegen p21E (etwa 5 % bei den U.S.-Blutspendern) bei Individuen beobachtet, die bei den HTLV-EIA-Durchmusterungs-Tests reagieren, die aber weder Antikörper gegen HTLV-I-gag- noch gegen -env-Genprodukte aufweisen, wenn sie mit einem HTLV-Bestätigungs-Testansatz untersucht werden, und die daher die etablierten Kriterien für eine Infektion mit HTLV nicht erfüllen (Lal et al.; Lipka et al., 1991). Darüber hinaus waren bei der Studie von Lipka et al. (Lipka et al., 1991) alle der mit p21E reagierenden und HTLV-indeterminierte Individuen negativ für die Anwesenheit von HTLV-I- und HTLV-II-Nucleinsäuren, wenn sie über eine PCR unter Verwendung von HTLV-I- und HTLV-II-spezifischen Primern und Sonden untersucht wurden. Daher besitzen einige Individuen, die nicht mit HTLV-I oder mit HTLV-II infiziert sind, Antikörper, die mit dem p21E-Antigen reagieren. Diese Tatsache schränkte die Verwendung des rekombinanten p21E-Proteins ein, insbesondere bei HTLV-Durchmusterungs-Testansätzen, bei denen eine hohe Rate an Falsch-Positiven bei HTLV-negativen Seren zum unnötigen Verwerfen des gespendeten Blutes führen würde.
Deshalb wäre es wünschenswert, ein verbessertes Verfahren zum Nachweis von HTLV-I- und HTLV-II-positiven Seren bereitzustellen. Das verbesserte Testverfahren sollte insbesondere in der Lage sein, alle HTLV-I- und HTLV-II-positiven Seren bei einer minimalen Zahl an Fasch-Positiven nachzuweisen, und es sollte auch in der Lage sein, HTLV-I infizierte Seren von HTLV-II infizierten Seren zu unterscheiden.
4. Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung umfaßt in einem Aspekt ein Peptid, das einen HTLV-spezifischen antigenen Bereich besitzt, der im Wesentlichen aus der Aminosäuresequenz besteht, die durch die SEQ ID NO: 1 identifiziert wird. Das Peptid ist gekennzeichnet durch (i) Immunreaktivität mit Seren aus menschlichen Individuen, die mit HTLV-I oder mit HTLV-II infiziert sind, und (ii) keine Immunreaktivität mit Seren, die (1) von Menschen erhalten wurden, die nicht mit HTLV-I oder mit HTLV-II infiziert sind, aber (2) mit dem HTLV-I-p21E-Antigen immunreaktiv sind.
Es wird ebenfalls ein Kit zum Nachweis des Vorhandenseins einer Infektion mit HTLV-I oder HTV-II in einem menschlichen Serum offenbart. Der Kit umfaßt (a) einen festen Träger, (b) das vorstehend erwähnte HTLV-spezifische Peptid, das mit dem Träger verknüpft ist, und (c) ein Reportermittel zum Nachweis der Anwesenheit menschlicher Antikörper, die an den Träger gebunden sind.
In einer Ausführungsform zur Verwendung beim Nachweis einer HTLV-I- oder einer HTLV-II-Infektion umfaßt der feste Träger zwei Reaktionszonen, von denen eine mit dem vorstehend erwähnten HTLV-spezifischen Peptid beschichtet ist und eine zweite Reaktionszone mit einem HTLV-spezifischen antigenen Bereich beschichtet ist, der im Wesentlichen aus der Aminosäuresequenz besteht, die durch die SEQ ID NO: 2 identifiziert wird. Dieses Peptid ist durch seine Immunreaktivität mit Seren gekennzeichnet, die (1) aus Menschen erhalten wurden, die nicht mit HTLV-I oder mit HTLV-II infiziert sind, aber (2) mit dem HTLV-1-p21E-Antigen immunreaktiv sind.
Der Kit kann auch eine oder mehrere Reaktionszonen enthalten, die dazu entworfen wurden, eine Unterscheidung zwischen einer Infektion mit HTLV-I und HTLV-II zu ermöglichen. Ein bevorzugtes Peptid zur Verwendung in diesem Kit ist ein Peptid, das einen HTLV-I-spezifischen antigenen Bereich besitzt, der im Wesentlichen aus der Sequenz besteht, die durch die SEQ ID NO: 3 identifiziert wird. Alternativ oder zusätzlich kann der Kit ein Peptid umfassen, das einen HTLV-II-spezifischen antigenen Bereich enthält, der im Wesentlichen aus der Sequenz besteht, die durch die SEQ ID NO: 4 identifiziert wird.
In einem anderen Aspekt umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur positiven Identifizierung einer HTLV-I- oder einer HTLV-II-Infektion in einem menschlichen Individuum. Der Test umfaßt die Reaktion des Serums aus dem Individuum mit einem Peptid, das einen HTLV-spezifischen antigenen Bereich enthält, der im Wesentlichen aus der Aminosäuresequenz besteht, die durch die SEQ ID NO: 1 identifiziert wird, um einen Immunkomplex zwischen dem Peptid und den Antikörpern im Serum aus einem Individuum zu bilden, das eine HTLV-I- oder eine HTLV-II-Infektion aufweist. Das Peptid wird dann auf die Anwesenheit des Immunkomplexes hin untersucht.
Ebenfalls offenbart wird eine Impfstoff-Zusammensetzung zur Immunisierung eines Individuums gegen eine HTLV-I- und eine HTLV-II-Infektion. Die Zusammensetzung umfaßt ein Peptid, das einen HTLV-spezifischen antigenen Bereich besitzt, der im Wesentlichen aus der Aminosäuresequenz besteht, die durch die SEQ ID NO: 1 identifiziert wird. Das Peptid ist an ein Trägerprotein gekoppelt.
In einem noch weiteren Aspekt umfaßt die Erfindung einen Passiv-Impfstoff zur Vorbeugung vor und zur Behandlung von HTLV, sowie ein Verfahren zur passiven Impfung, das einen menschlichen monoclonalen Antikörper oder einen menschlichen rekombinanten Antikörper verwendet, der spezifisch gegen das 2B3A-Peptid gerichtet ist.
Diese und andere Aufgaben und Eigenschaften der vorliegenden Erfindung werden noch deutlicher, wenn die folgende detaillierte Beschreibung der Erfindung in Verbindung mit den sie begleitenden Zeichnungen gelesen wird.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt im oberen Teil das Genom von HTLV-I, in der Mitte einen vergrößerten Teil des Genoms, der die codierenden Bereiche des gp46- und des gp21-Hüllproteins enthält, und der untere Teil der Figur enthält die codierenden Bereiche, die den rekombinanten HTLV-I-Peptiden p21E, 2A2B, 2B3A und 3A3B innerhalb des codierenden Bereiches von gp21 entsprechen, sowie die HTLV-I-Peptide MTA-1, MTA-4 und MTA-5 innerhalb des codierenden Bereiches von gp46.
Die 2A und 2B zeigen die codierende Sequenz des Polynucleotids (SEQ ID NO: 5) und die entsprechende Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 6) des p21E-env-Proteins von HTLV-I (2A) sowie die codierende Sequenz des Polynucleotids (SEQ ID NO: 7) und die entsprechende Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 8) der p21E-Region des gp21-env-Proteins von HTLV-II (2B). Die 5'-Enden der HTLV-I-spezifischen Sequenzen der Oligonucleotidprimer, die zur Konstruktion der rekombinanten HTLV-I-Peptide verwendet wurden, sind angegeben.
Die 3A–3C zeigen die Polynucleotidsequenzen der Vorwärts-Primer (3A), die hierin als 1A (SEQ ID NO: 9), 2A (SEQ ID NO: 10), MF1 (SEQ ID NO: 11), MF2 (SEQ ID NO: 12) und 3A (SEQ ID NO: 13) identifiziert werden, und der Rückwärts-Primer (3B), die hierin als 1B (SEQ ID NO: 14), 2B (SEQ ID NO: 15), MR1 (SEQ ID NO: 16), MR2 (SEQ ID NO: 17) und 3B (SEQ ID NO: 18) identifiziert werden, wobei die Restriktionsenzym-Erkennungssequenzen, die sich in den Primern befinden, unterstrichen sind. Die Restriktionsenzym-Schnittstellen des modifizierten pGEX-Plasmids, pGEX-GLI, werden ebenfalls gezeigt (SEQ ID NO: 44) (3C).
4 zeigt die Aminosäuresequenzen der rekombinanten HTLV-I-Peptide, die als p21E (SEQ ID NO: 6), 1A1B (SEQ ID NO: 19), 2A2B (SEQ ID NO: 20), 2A3B (SEQ ID NO: 21), 2B3A (SEQ ID NO: 22), 3A3B (SEQ ID NO: 30), MF1R2 (SEQ ID NO: 24) und MF2R1 (SEQ ID NO: 25) identifiziert werden.
5 zeigt die Aminosäuresequenz des Peptids 2B3A, das in der vorliegenden Erfindung konstruiert wurde (SEQ ID NO: 22), sowie die entsprechenden Sequenzen aus drei unterschiedlichen HTLV-I-Stämmen (SEQ ID NOS: 26, 27 und 28), ein entsprechendes HTLV-II-2B3A-Peptid (SEQ ID NO: 29) und die Konsensus-Sequenz des 2B3A-Peptids (SEQ ID NO: 1).
6 zeigt die Aminosäuresequenz des Peptids 3B3A, das in der vorliegenden Erfindung konstruiert wurde (SEQ ID NO: 23), sowie die entsprechenden Sequenzen aus drei unterschiedlichen HTLV-I-Stämmen (SEQ ID NOS: 31, 32 und 2), ein entsprechendes HTLV-II-3B3A-Peptid (SEQ ID NO: 34) und die Konsensus-Sequenz des 3A3B-Peptids (SEQ ID NO: 2).
7 zeigt einen Vergleich der codierenden Sequenzen der Polynucleotide des HTLV-I-Peptids 2B3A (SEQ ID NO: 35) und des homologen HTLV-II-Peptids 2B3A(II) (SEQ ID NO: 36).
8 zeigt einen Vergleich der codierenden Sequenzen der Polynucleotide des HTLV-I-Peptids 3A3BA (SEQ ID NO: 37) und des homologen HTLV-II-Peptids 3A3B(II) (SEQ ID NO: 38).
9 zeigt die Aminosäuresequenzen der homologen Bereiche der gp46-Proteine von HTLV-I und HTLV-II in den Bereichen der gp46-Peptide, die in der 1 als MTA-1 (SEQ ID NO: 3), MTA-4 (SEQ ID NO: 39) und als MTA-5 (SEQ ID NO: 40) identifiziert werden, das zusätzliche HTLV-I-Peptid K163 (SEQ ID NO: 41) sowie analoge HTLV-II-Peptide, die hierin als K15 (SEQ ID NO: 42) und als 4 (SEQ ID NO: 4) identifiziert werden.
Die 10A–10D illustrieren eine Festphasen-Testansatzplatte mit 4 Zonen zur Verwendung bei einem Testverfahren zum Nachweis einer HTLV-I- oder einer HTLV-II-Infektion in menschlichen Seren (10A) und zeigen ein typisches Testergebnis für ein HTLV-I-positives Individuum (10B), ein HTLV-II-positives Individuum (10C) und ein falsch-positives Testergebnis (10D).
Genaue Beschreibung der Erfindung
I. Definitionen
Sofern nicht anders angegeben, haben die nachstehenden Begriffe die folgenden Bedeutungen:
Die "zusammengesetzte HTLV-env-Sequenz" wird durch Ausrichtung homologer Aminosäuresequenzen aus Bereichen des transmembranen env-Proteins unterschiedlicher HTLV-I- und HTLV-II-Stämme gebildet, sowie an jeder einzelnen Position aus der Auswahl (i) der Konsensus-Aminosäure an dieser Position, oder (ii), wenn die Aminosäuren sich an dieser Position zwischen den HTLV-I- und den HTLV-II-Sequenzen unterscheiden, aller Aminosäure-Variationen an dieser Position. Zum Beispiel enthält die zusammengesetzte Sequenz von 2B3A-HTLV, die in 5 gezeigt wird, Aminosäure-Variationen innerhalb der Aminosäuresequenzen des 2B3A-Peptids bei drei unterschiedlichen HTLV-I-Stämmen (SEQ ID NOS: 26, 27 und 28), einem entsprechenden 2B3A-Peptid aus HTLV-II (SEQ ID NO: 29) und der Konsensus-Sequenz des 2B3A-Peptids (SEQ ID NO: 1).
"HTLV-spezifisches" Peptid bedeutet ein Peptid, das eine zusammengesetzte HTLV-Sequenz besitzt, d. h. entweder eine HTLV-I-Aminosäuresequenz, eine HTLV-II-Aminosäuresequenz oder eine der zusammengesetzten HTLV-Sequenzen.
"Nicht-infizierte Individuen" bezieht sich auf Menschen, deren Serum Antikörper enthalten kann, die mit einigen HTLV-I- oder HTLV-II-Proteinen wie z. B. dem p21E-Protein kreuzreagieren, deren Serum aber keinen Hinweis auf eine HTLV-I- oder HTLV-II-Infektion zeigt, wie dies beurteilt werden kann durch: 1.> Fehlschlag beim Nachweis von Antikörpern sowohl gegen HTLV-gag- als auch gegen HTLV-env-Proteine bei einem bestätigenden Testansatz und/oder 2.> Fehlschlag beim Nachweis HTLV-spezifischer Sequenzen bei der Sequenz-Amplifikation mit HTLV-spezifischen Primern unter Verwendung des Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Verfahrens (Kwok et al., Lipka et al., 1991).
II. HTLV-I und HTLV-II-Env-Peptide
Die 1, oberer Teil, stellt einen Teil des HTLV-I-Genoms dar, der in den transmembranen env-Glycoproteinen gp46 und gp21 exprimiert wird. Die codierenden Bereiche reichen bei gp46 von den Basenpaaren 5180 bis 6116 und für das gp21-Protein von 6117 bis 6644 (vergrößerter Teil des Genoms in 1).
Der codierende Bereich zwischen den Basen 6096 und 6497 codiert ein rekombinantes Protein, das als p21E bezeichnet wird und von dem bekannt ist, dass es mit Seren aus HTLV-I oder HTLV-II infizierten Individuen reagiert, das aber auch mit einem geringen Prozentsatz an Individuen reagiert, die nicht mit einem der beiden HTLV-Viren infiziert sind (Lal et al., Lipka et al., 1991). In dem codierenden Bereich von p21E enthalten und in der unteren rechten Hälfte der Figur gezeigt, befinden sich die codierenden Bereiche der drei HTLV-I-Peptide, die hierin als 2A2B, 2B3A und 3A3B identifiziert sind. Die vorliegende Erfindung umfaßt das 2B3A-Peptid und einen diagnostischen Test-Kit sowie ein Verfahren, das das 2B3A-Peptid umfaßt. Der Kit und das Verfahren können auch das 3A3B-Peptid umfassen. Die Eigenschaften des 2B3A- und des 3A3B-Peptids, die für den Test-Kit und das Verfahren zum Nachweis der mit HTLV-I oder mit HTLV-II infizierten menschlichen Seren relevant sind, werden nachstehend diskutiert.
Der codierende Bereich von 5565 bis 5895, der im unteren linken Teil der Figur gezeigt wird, enthält die codierenden Bereiche der drei MTA-Peptide, die in der ebenfalls anhängigen U.S.-Patentanmeldung für "HTLV-I and HTLV-II Peptide Antigens and Methods", Serien-Nr. 07/653,091, die am 8. Februar 1991 eingereicht wurde, beschrieben werden und die hierin als MTA-1, MTA-4 und MTA-5 identifiziert sind. Diese Peptide können in Kombination mit dem 2B3A-Peptid oder dem 2B3A-Peptid plus dem 3A3B-Peptid in einem Test-Kit und einem Verfahren zum Austesten von HTLV-I oder HTLV-II infizierten menschlichen Seren ebenfalls verwendet werden. Die Eigenschaften der MTA-Peptide, die für die Verwendung in einem solchen Kit und Verfahren sachdienlich sind, werden nachstehend angegeben.
A. Das 2B3A-Peptid
Die 4 zeigt die Aminosäuresequenz des 2B3A-Peptids aus HTLV-I (SEQ ID NO: 22). Wie nachstehend gezeigt wird, wurde das Peptid durch PCR-Amplifikation des HTLV-I-Stammes MT2-Virus unter Verwendung von Primern (die 7 Codons an jedem Ende des amplifizierten codierenden Bereiches beisteuern) exprimiert, die aus der codierenden Nucleotidsequenz der HTLV-I-Variante ATK entworfen wurden, die durch Seiki et al. isoliert wurde. Daher entsprechen die sieben Aminosäuren an jedem Ende des Peptids in ihrer Sequenz dem 2B3A-Peptid des HTLV-I-Stammes ATK, und die verbleibenden internen Aminosäuren entsprechen der Sequenz des 2B3A-Peptids des HTLV-I-Stammes MT2. Die Ein- und die Drei-Buchstaben-Aminosäurecodierungen in der Figur entsprechen dem allgemeinen Gebrauch (z. B. Maniatis).
Gemäß eines wichtigen Aspekts der Erfindung und wie nachstehend in Einzelheiten beschrieben, ist das Peptid (i) mit Seren aus Menschen immunreaktiv, die mit HTLV-I oder mit HTLV-II infiziert sind, aber (ii) mit einem Serum nicht immunreaktiv, welches mit dem HTLV-I-p21E-Antigen immunreaktiv ist, das aber keinen Hinweis auf eine HTLV-I- oder eine HTLV-II-Infektion zeigt, zum Beispiel bei der PCR-Analyse viraler Sequenzen in der Serumprobe, wie nachstehend diskutiert wird.
5 zeigt die Aminosäuresequenzen von Peptiden, die das 2B3A-Peptid aus drei verschiedenen HTLV-I-Stämmen enthalten, die hierin als ATK, MT2 und B41281 identifiziert werden, sowie ein HTLV-II-Peptid, das hierin als Stamm MO bezeichnet wird. Die Nucleotid- und die Aminosäuresequenzen dieser HTLV-Varianten wurden aus der Genbank-Sequenz-Datenbank erhalten. Die Locus-Namen der Stämme, die dazu verwendet werden können, die Sequenzen aus der Genbank-Sequenz-Datenbank zu erhalten, sind wie folgt: HTLV1A = env-Region der HTLV-I-Variante ATK, HTVENVAA = env-Region der HTLV-I-Variante MT2, B41281 = ein weiteres, noch unterschiedlicheres HTLV-I-Isolat und HL3V2CG = MoT-Stamm von HTLV-II. Die Figur zeigt auch die Aminosäuresequenz-Übereinstimmungen zwischen der oberen 2B3A-Sequenz und den entsprechenden Bereichen der drei HTLV-I-Stämme und des einen HTLV-II-Stammes. Die Sequenzhomologie zwischen dem obersten 2B3A-Peptid und dem entsprechenden Teil des gp21-Proteins eines individuellen Stammes ist direkt über der Aminosäuresequenz jedes Stammes angegeben. Der Grad an Homologie wird durch ein ":" für eine identische Sequenz und durch eine Leerstelle für nicht übereinstimmende Aminosäurereste angezeigt.
Die 2B3A-Sequenzen (d. h. die Teile der gp21-Aminosäuresequenzen, die dem HTLV-I-Peptid-Antigen 2B3A entsprechen) werden in der Figur wie folgt identifiziert: SEQ ID NO: 26 = ATK-Variante von HTLV-I; SEQ ID NO: 28 = MT2-Variante von HTLV-I und SEQ ID NO: 28 = die HTLV-Variante, die durch den Locus-Namen B41281 identifiziert ist. Das entsprechende HTLV-II-2B3A-Peptid des Stammes Mo ist hierin durch SEQ ID NO: 29 identifiziert. Die Stämme, die in der 5 und der 6 nachstehend gezeigt werden, stehen stellvertretend für die unterschiedlichen Aminosäuresequenzen, die aus etwa 30 einzelnen Varianten von HTLV-I, STLV und HTLV-II erhalten wurden (die Aminosäure- und die Nucleotidsequenzen aller dieser Varianten können aus der Genbank-Datenbank erhalten werden).
Die Konsensus-Sequenz der fünf 2B3A-Sequenzen, d.h. die zusammengesetzte HTLV-Sequenz dieses Bereichs, wird im unteren Teil der Figur gezeigt und wird hierin durch die SEQ ID NO: 1 identifiziert. Diese Sequenz wurde aus den Konsensus-Aminosäuren konstruiert, wobei eine vollständige Übereinstimmung zwischen den fünf Peptiden vorhanden ist, und durch die bekannten Variationen in den Aminosäuren an den sechs Positionen (X₁-X₆), an denen Aminosäure-Variationen auftreten. Für diese Sequenz gilt: Xi ist K oder Q, X₂ ist L oder I, X₃ ist K oder R, X₄ ist I oder V, X₅ ist R oder C und X₆ ist P oder L. Die SEQ ID NO: 1 umfaßt daher die fünf Aminosäuresequenzen, die vorstehend als SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 28 und SEQ ID NO: 29 identifiziert werden. Es wird erwartet, dass andere Aminosäure-Austausche als diejenigen, die spezifisch in SEQ ID NO: 1 enthalten sind, ebenfalls erlaubt sind, sofern sie die Immunreaktivität des 2B3A-Peptids nicht wesentlich beeinflussen, wie nachstehend beschrieben wird. Noch allgemeiner umfaßt das 2B3A-Peptid der Erfindung ein HTLV-spezifisches Peptid, das im Wesentlichen aus der Aminosäuresequenz besteht, die durch SEQ ID NO: 1 identifiziert wird, wobei das Peptid charakterisiert ist durch:

(i) Immunreaktivität mit Seren aus menschlichen Individuen, die mit HTLV-I oder mit HTLV-II infiziert sind, und
(ii) keine Immunreaktivität mit einem Serum, das (1) mit dem HTLV-I-p21E-Antigen immunreaktiv ist, aber (2) von Menschen erhalten wurde, die nicht mit HTLV-I oder mit HTLV-II infiziert sind.

B. Das 3A3B-Peptid
Das 3A3B-Peptid von HTLV-I besitzt die obere Aminosäuresequenz, die in 4 gezeigt wird, und wird durch SEQ ID NO: 30 identifiziert. Von dem Peptid wird beabsichtigt, es in Kombination mit dem 2B3A-Peptid in einem Test-Kit und für ein Verfahren zur Durchmusterung menschlicher Seren auf Infektion mit HTLV-I oder mit HTLV-II zu verwenden.
Wie vorstehend bemerkt, enthalten die Seren, die aus Patienten erhalten wurden, die mit HTLV-I oder mit HTLV-II infiziert sind, Antikörper, welche mit dem HTLV-I-gp21-Protein und dem aus gp21 abgeleiteten rekombinanten p21E-Protein immunreaktiv sind. Daher wurden diese Peptide routinemäßig bei Immun-Testverfahren und in Kits zum Nachweis einer Infektion mit HTLV (I oder II) bei Menschen eingesetzt. Diese Peptide kreuzreagieren jedoch ebenfalls mit Antikörpern, die in den Seren eines bestimmten Prozentsatzes nicht infizierter Individuen enthalten sind, und ergeben bei dem Test falschpositive Ergebnisse. Die Häufigkeit der Kreuzreaktivität scheint bei etwa 1 % bei den HTLV-negativen Blutspendern zu liegen, zumindest in den bestimmten Bezirken in den U.S., von denen Statistiken verfügbar sind.
Das vorstehend beschriebene 2B3A-Peptid ist mit Seren aus HTLV infizierten Individuen immunreaktiv, aber es ist nicht mit nicht infizierten Individuen immunreaktiv, wie vorstehend diskutiert wurde. Dieses Peptid stellt daher ein nützliches Antigen zum Nachweis einer HTLV-Infektion dar, und dies ohne die Falsch-Positven, die durch das p21E-Protein erzeugt werden. Es wäre weiterhin bei einem HTLV-Testansatz nützlich, ein Protein bereitzustellen, das nicht infizierte p21E-positive Individuen nachweist, aber nicht mit HTLV infizierte Individuen, und zwar zur Bestätigung, dass das untersuchte Serum nicht infiziert ist, obwohl es mit dem p21E-Protein kreuzreagiert.
Das hierin beschriebene 3A3B-Peptid besitzt die gewünschten Eigenschaften insofern, als dass das Peptid durch Immunreaktivität mit Seren gekennzeichnet ist, die (1) aus Menschen erhalten wurden, die nicht mit HTLV-I oder mit HTLV-II infiziert sind, die aber (2) mit dem HTLV-I-p21E-Antigen immunreaktiv sind.
Das Peptid wurde durch PCR-Amplifikation der codierenden Sequenz des HTLV-I-Virus, Stamm MT2, unter Verwendung von Primern (die 7 Codons an jedem Ende des amplifizierten codierenden Bereiches beisteuern) aus der HTLV-I-Variante ATK exprimiert. Daher entsprechen die sieben Aminosäuren an jedem Ende des Peptids in ihrer Sequenz dem 3A3B-Peptid der HTLV-I-Variante ATK, und die verbleibenden internen Aminosäuren entsprechen der Sequenz des 3A3B-Peptids des HTLV-I-Stammes MT2. Das entsprechende Peptid aus HTLV-II, das hierin als SEQ ID NO: 34 bezeichnet wird, besitzt die Aminosäuresequenz, die in 6 oben gezeigt wird, und wird hierin als SEQ ID NO: 34 identifiziert.
6 zeigt die Aminosäuresequenzen von Peptiden, die das 3A3B-Peptid aus drei unterschiedlichen HTLV-1-Stämmen enthalten. Die 3A3B-Sequenzen sind in der Figur wie folgt identifiziert: SEQ ID NOS: 31 = ATK-Variante von HTLV-I; SEQ ID NO: 32 = MT2-Variante von HTLV-I und SEQ ID NO: 33 = die HTLV-Variante, die durch den Locus-Namen HTVENVCH identifiziert wird. Das entsprechende HTLV-II-3A3B-Peptid des Stammes Mo ist hierin durch SEQ ID NO: 34 identifiziert. Die Nucleotid- und die Aminosäuresequenzen der Stämme wurden, wie vorstehend beschrieben, aus der Genbank-Datenbank erhalten.
Die Figur zeigt auch die Aminosäuresequenz-Übereinstimmung zwischen der oberen 3A3B-Sequenz und den entsprechenden Bereichen der drei HTLV-I-Stämme und des einen HTLV-II-Stammes. Die Sequenzhomologie zwischen dem obersten 3A3B-Peptid und dem entsprechenden Teil des gp21-Proteins eines individuellen Stammes wird direkt über der Aminosäuresequenz jedes Stammes gezeigt. Der Grad an Homologie ist durch ein ":" für eine identische Sequenz und durch eine Leerstelle für nicht übereinstimmende Aminosäurereste angezeigt.
Die Konsensus-Sequenz der fünf 3A3B-Sequenzen, d.h. die zusammengesetzte HTLV-Sequenz dieses Bereichs, wird im unteren Teil der Figur gezeigt und wird hierin durch die SEQ ID NO: 2 identifiziert. Wie vorstehend, wurde diese Sequenz aus den Konsensus-Aminosäuren an den Positionen konstruiert, an denen eine vollständige Übereinstimmung zwischen den fünf Peptiden vorhanden ist, sowie mit den bekannten Variationen in den Aminosäuren an den acht Positionen (X₁-X₈), an denen Aminosäure-Variationen auftreten. Für diese Sequenz gilt: X₁ ist R oder C, X₂ ist P oder L, X₃ ist T oder S, X₄ ist S oder T, X₅ ist S oder P, X₆ ist I, M oder V, X₇ ist N oder K und X₈ ist L oder I. Die SEQ ID NO: 2 umfaßt daher die fünf Sequenzen, die vorstehend als SEQ ID NO: 30, SEQ ID NOS: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 und SEQ ID NO: 34 identifiziert wurden. Es wird erwartet, dass andere Aminosäure-Austausche als diejenigen, die in SEQ ID NO: 2 enthalten sind, ebenfalls erlaubt sind, sofern sie die Immunreaktivität des 3A3B-Peptids nicht wesentlich beeinflussen, wie nachstehend beschrieben wird.
Noch allgemeiner umfaßt das 3A3B-Peptid ein HTLV-spezifisches Peptid, das im Wesentlichen aus der Aminosäuresequenz besteht, die durch SEQ ID NO: 2 identifiziert wird, wobei das Peptid charakterisiert ist durch Immunreaktivität mit einem Serum, das (1) mit dem HTLV-I-p21E-Antigen immunreaktiv ist, aber (2) von Menschen erhalten wurde, die nicht mit HTLV-I oder mit HTLV-II infiziert sind.
C. HTLV-I- und HTLV-II-spezifische Peptide
Das 2B3A-Peptid und die Kombination des 2B3A- und des 3A3B-Peptids, die vorstehend beschrieben wurden, wurden zur Verwendung in einem Immun-Testansatz-Verfahren und einem Kit zum Nachweis von HTLV-I oder HTLV-II infizierten menschlichen Seren entworfen. Die HTLV-I-MTA-Peptide und die entsprechenden gp46-Peptide von HTLV-II, die in diesem Abschnitt beschrieben werden, sind bei einem solchen Testansatz und Kit nützlich, um zwischen einer Infektion mit HTLV-I und einer Infektion mit HTLV-II zu unterscheiden.
Die Herstellung und die Eigenschaften der MTA-Peptide und der entsprechenden HTLV-II-Peptide wurden in der ebenfalls anhängigen U.S.-Patentanmeldung für "HTLV-I and HTLV-II Peptide Antigens and Methods", Serien-Nr. 07/653,091, die am 8. Februar 1991 eingereicht wurde, und der entsprechenden PCT-Patentanmeldung PCT/US92/00823, die am 20. August 1992 veröffentlicht wurde und die beide hierin durch Bezugnahme eingeschlossen sind, beschrieben. Die codierenden Bereiche der MTA-Peptide, die als MTA-1, MTA-4 und MTA-5 identifiziert sind, werden in 1 dargestellt und umfassen den Bereich zwischen den Basen 5565 und 5895.
9 zeigt die Aminosäuresequenzen von MTA-1 (SEQ ID NO: 3), MTA-4 (SEQ ID NO: 39) und MTA-5 (SEQ ID NO: 40). Alle drei Peptide sind mit den HTLV-I infizierten Seren spezifisch immunreaktiv, d. h. sie sind mit den HTLV-II infizierten Seren nicht immunreaktiv. Ein kleineres HTLV-I-Peptid, das in 10 als K163 (SEQ ID NO: 41) identifiziert wird, ist ebenfalls mit den HTLV-I infizierten Seren spezifisch immunreaktiv.
Der untere Teil der 9 zeigt die entsprechenden HTLV-II-Sequenzen, die mit HTLV-II-Seren spezifisch immunreaktiv sind, d. h. keine Immunreaktivität mit Seren aus Patienten zeigen, die nur mit HTLV-I infiziert sind. Diese umfassen K15 (SEQ ID NO: 42), K34 (SEQ ID NO: 43) und 4 (SEQ ID NO: 4). Von dem kleineren Peptid-Antigen K34 wurde gezeigt, dass es im Wesentlichen die gleiche Immunreaktivität gegen HTLV-II infizierte Seren besitzt, wie die größeren Peptid-Antigene K15 und K55.
Die vorstehend beschriebenen HTLV-I- und HTLV-II-spezifischen Peptide können durch die rekombinanten Verfahren hergestellt werden, die in der vorstehend zitierten PCT-Anmeldung PCT/US92/00823 beschrieben werden.
II. Identifizierung der 2B3A- und 3A3B-Peptide
Die codierende p21E-Polynucleotidsequenz, die hierin als SEQ ID NO: S identifziert wird und die sich von den Basen 6096 bis 6497 erstreckt, wird in 2 gezeigt und wurde aus einem p21E-Clonierungsvektor (Samuel et al.) abgeleitet. Eine Reihe von Peptiden innerhalb dieses Bereiches wurden auf ihre Immunreaktivität mit HTLV-I und HTLV-IIinfizierten Seren hin untersucht, sowie mit einem nicht infizierten Serum, das mit dem p21E-Peptid immunreaktiv ist.
A. Die Herstellung von Bakterienlysaten
Die Peptide, die konstruiert wurden, werden in 4 gezeigt. Diese umfassen die rekombinanten Peptide, die als p21E (SEQ ID NO: 6), 1A1B (SEQ ID NO: 19), 2A2B (SEQ ID NO: 20), 2A3B (SEQ ID NO: 21), 2B3A (SEQ ID NO: 22), 3A3B (SEQ ID NO: 30), MF1R2 (SEQ ID NO: 24) und als MF2R1 (SEQ ID NO: 25) identifiziert sind.
Diese Peptide wurden hergestellt durch (i) PCR-Amplifikation des ausgewählten codierenden Bereichs aus dem HTLV-I-Stamm MT2, (ii) dem Einbau der amplifizierten codierenden Sequenz in den pGEX-GLI-Expressionsvektor und (iii) der Transformation kompetenter E. coli-Wirtszellen mit dem Expressionsvektor, wie in Einzelheiten in Beispiel 1A beschrieben wird.
Die 3A und 3B zeigen die Sequenzen der vier Vorwärts- beziehungsweise der vier Rückwärts-Primer, die zur Konstruktion der codierenden Bereiche der Peptide verwendet wurden. Diese umfassen die Vorwärts-Primer, die als FP-1A (SEQ ID NO: 9), FP-2A (SEQ ID NO: 10), FP-MF1 (SEQ ID NO: 11) und FP-3A (SEQ ID NO: 13) identifiziert sind, und die Rückwärts-Primer, die hierin als RP-1B (SEQ ID NO: 14), RP-2B (SEQ ID NO: 15), RP-MR1 (SEQ ID NO: 16) und RP-3B (SEQ ID NO: 18) identifiziert sind. Die 5'-Enden der Primer sind mit Erkennungssequenzen für eines oder mehrere der folgenden Restriktionsenzyme ausgestattet: NcoI, BamHI und EcoRI. Die amplifizierten DNAs können dann mit den geeigneten Restriktionsenzymen zur Ligierung mit dem auf die gleiche Weise verdauten pGEX-GLI-Expressionsvektor geschnitten werden. Die Clonierungsstelle von pGEX-GLI wird in 3C ebenfalls gezeigt.
Jeder ausgewählte codierende Bereich eines Peptids wird durch die PCR-Amplifikation mit einen ausgewählten Vorwärts- und Rückwärts-Primer konstruiert. Um zum Beispiel den codierenden Bereich des 1A1B-Peptids zu konstruieren, werden der Vorwärts-Primer FP-1A und der Rückwärts-Primer RP-1B verwendet, um die codierende Sequenz von p21 zu amplifizieren. Um den codierenden Bereich des 2B3A-Peptids zu konstruieren, werden der Vorwärts-Primer MF1 und der Rückwärts-Primer MR1 bei der PCR-Amplifikation der Sequenz verwendet.
B. Die Durchmusterung der Bakterienlysate
Die vorstehenden rekombinanten Peptide wurden mit einem Western-Blot-Testansatzformat durchmustert, das in Beispiel 1C beschrieben wird. Kurzgefaßt wurde das Gesamtzell-Bakterienlysat, das mit einem ausgewählten Expressionsvektor transformiert worden war, über SDS/PAGE (Laemmli) aufgetrennt, durch Elektrotransfer auf Nitrocellulose übertragen und auf die Immunreaktivität mit (i) anti-HTLV-I-Antikörpern, die aus EBV aktivierten Lymphocyten von HTLV-I infizierten Individuen erhalten wurden (Beispiel 1B), und (ii) mit HTLV-II infizierten Seren sowie mit Kontrollseren untersucht. Die Einzelheiten werden nachstehend in Beispiel 1C angegeben.
Die Ergebnisse werden nachstehend in der Tabelle 1 gezeigt. In der Tabelle bedeutet "ND": "Nicht durchgeführt"; "I" bezeichnet ein Serum aus einem HTLV-I infizierten Individuum; "II" bezeichnet ein Serum aus einem HTLV-II infizierten Individuum, wobei die Diagnose von HTLV-I und HTLV-II über PCR bestätigt wurde; "Uninf" bezeichnet ein Serum aus einem nicht infizierten Individuum. "ÜS" bezeichnet den Gewebekultur-Überstand (1 : 2 verdünnt) aus einer Anzucht von EBV aktivierten peripheren B-Zellen aus einem HTLV-I-positiven Spender, und "Ind" bezeichnet Seren, die mit dem rekombinanten p21E-Protein reagieren, die aber im Hinblick auf das Vorhandensein einer HTLV-I- oder einer HTLV-II-Infektion durch PCR unter Verwendung von HTLV-I- und HTLV-II-spezifischen Primern und Sonden als negativ bewertet wurden.
Tabelle 1
Insgesamt reagierten die Seren von 10 der 10 mit HTLV-I/II infizierten untersuchten Individuen stark mit dem relativ großen rekombinanten p21E-Protein 2A3B. Jedoch nur 2 der 10 mit HTLV-I/II untersuchten Antiseren reagierten entweder mit dem rekombinanten Protein 2A2B oder mit 3A3B. Wenn die anti-p21E-Antikörper der mit EBV aktivierten B-Zelllinien-Gewebekultur-Überstände untersucht wurden, reagierten die beiden Überstände in ähnlicher Weise mit dem rekombinanten Protein 2A3B, jedoch nicht mit 2A2B oder mit 3A3B. Dies legt nahe, dass der zentrale Teil von 2A3B das immundominante Epitop von HTLV-I-gp21 enthält.
Dies wurde bestätigt, als das rekombinante Protein 2B3A untersucht wurde, das 44 Aminosäuren aus dem zentralen Teil des 2A3B-Proteins enthält. Zehn der 10 untersuchten HTLV-I/II-Seren reagierten mit dem rekombinanten 2B3A-Protein. Darüber hinaus reagierten die beiden untersuchten anti-p21E-EBV-I/II-Seren mit dem rekombinanten 2B3A-Protein. Zusätzlich produzierten die beiden untersuchten anti-p21E-EBV aktivierten B-Zellen Antikörper, die 2B3A erkannten.
Die Lage des Epitops, das durch die Seren erkannt wurde, die mit dem rekombinanten p21E-Protein reagieren, die aber füx die HTLV-I- oder die HTLV-II-Nucleinsäuren durch PCR als negativ bewertet wurden, wurde ebenfalls bestimmt. Sieben von 7 p21E-indeterminierten Seren reagierten mit den rekombinanten Proteinen 2A3B und 3A3B. Keines der 7 p21E-indeterminierten Seren reagierte mit dem rekombinanten 2B3A-Protein. Somit sind Epitope unterscheidbar, die durch Seren aus HTLV-I infizierten Individuen und aus Individuen erkannt werden, die nicht infiziert sind, die aber einen Antikörper aufweisen, der p21E erkennt.
Unter erneuter Bezugnahme auf 4 erkennt man, dass das 2B3A-Peptid durch die Peptide MF1R1 und MF2R2 in Etwa in zwei Hälften unterteilt wird. Vorläufige Untersuchungen, die zur Unterstützung der Erfindung durchgeführt wurden, zeigen, dass keines der Peptide mit den 2 HTLV-I- und den 2 HTLV-II-Seren immunreaktiv ist, die stark mit dem 2B3A-Peptid reagierten. Dies zeigt, dass der größte Teil der Sequenz des 2B3A-Peptids für die Immunreaktivität mit HTLV-positiven Seren erforderlich ist.
C. Die Herstellung gereinigter Proteine
Die rekombinanten Peptide 2A2B, 2B3A und 3A3B wurden aus Bakterienlysaten transformierter Bakterien hergestellt, wie in Einzelheiten in Beispiel 1D beschrieben wird. Kurzgefaßt wurden die Zellen unter Bedingungen angezogen, die die Expression des rekombinanten Proteins induzierten, durch Zentrifugation sedimentiert und durch mehrere Einfrier-Auftau-Zyklen lysiert. Nach der Lyse wurden die Proteine durch Zugabe von Triton-X100^TM solubilisiert, und die unlöslichen Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation sedimentiert.
Die Überstandsfraktion wurde über eine Glutathion-Agarose-Säule geleitet, und die gebundenen Proteine wurden mit 5 mM Glutathion eluiert. Die Protein enthaltenden Fraktionen wurden auf ihren Gehalt an Protein hin untersucht.
Es wird anerkannt, dass die Peptide 2B3A und 3A3B direkt durch Festphasen-Peptid-Syntheseverfahren, wie z. B. durch Mitchell et al., beschrieben wurde, oder durch alternative rekombinante Systeme hergestellt werden können.
D. Die Immunreaktivität der gereinigten Proteine
Die vorstehenden gereinigten Peptide 2A2B, 2B3A und 3A3B wurden in einem Western-Blot-Testansatzformat auf ihre Immunreaktivität mit 56 Seren aus HTLV-positiven Individuen, 7 Seren aus HTLV-negativen Individuen und 18 Seren aus mit p21E reagierenden, HTLV-indeterminierten Individuen untersucht, wie nachstehend in Tabelle 2 gezeigt wird. Wie man sieht, war das 2B3A-Peptid mit allen der HTLV-I- und HTLV-II-positiven Seren immunreaktiv, zeigte jedoch keine Kreuzreaktivität mit nicht infizierten Seren. Im Gegensatz dazu, reagierte das 3A3B-Peptid mit einigen der HTLV-positiven Seren, reagierte jedoch mit allen 18 der nicht infizierten Seren (die ebenfalls mit dem p21E-Peptid immunreaktiv waren).
Tabelle 2
IV. Verfahren und Kit zur Diagnose von HTLV-I und HTLV-II
Es werden vier grundlegende Arten einer diagnostischen Anwendung des 2B3A-Peptids (welches so definiert ist, dass es das zusammengesetzte 2B3A-Peptid enthält) der Erfindung beschrieben.
Die Erste allgemeine An eines Testansatzes ist ein Enzym-Immun-Testansatz zur Durchmusterung menschlicher Seren auf eine Infektion mit HTLV-I oder HTLV-II. Bei diesem Testansatzformat wird ein Festphasen-Reagenz, das ein an eine Oberfläche gebundenes 2B3A-Peptid besitzt, mit dem zu untersuchenden Serum unter Bedingungen zur Reaktion gebracht, die eine Bindung des Antikörpers an das Peptid auf dem Reagenz erlauben. Der Testansatz kann auch weitere HTLV-Peptide verwenden, wobei es sich entweder um rekombinante oder aus HTLV-Virus-Lysaten stammende handeln kann, die an die Festphase gebunden sind. Nach dem Waschen des Reagenzes, um ungebundene Serumbestandteile zu entfernen, wird das Reagenz mit einem Reporter markierten anti-Mensch-Antikörper reagieren gelassen, um den Reporter an das Reagenz zu binden, entsprechend der Menge des anti-HTLV-I- oder des -HTLV-II-spezifischen Antikörpers, die an das 2B3A-Peptid und irgendein (irgendwelche) anderes (anderen) HTLV-Peptid (Peptide) gebunden sind, das (die) ebenfalls an den festen Träger gebunden ist (sind). Das Reagenz wird erneut gewaschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen, und die Menge des Reporters, der mit dem Reagenz assoziiert ist, wird bestimmt. Auf den mit dem Reporter markierten Antikörper sowie auf zusätzliche Reagenzien, die zum Nachweis des Reporters erforderlich sein können, wird hierin ebenfalls als Reportermittel zum Nachweis der Anwesenheit eines menschlichen Antikörpers, der an das Peptid-Antigen auf dem festen Träger gebunden ist, Bezug genommen.
Die zweite Art eines Testansatzes ist ein Enzym-Immun-Testansatz sowohl zum Nachweis von Antikörpern gegen HTLV-I und HTLV-II als auch zur Unterscheidung von mit HTLV-I und HTLV-II infizierten Individuen. Bei diesem Testansatzformat werden rekombinante Peptidantigene, die in der Lage sind, Antikörper gegen HTLV-I oder HTLV-II oder sowohl gegen HTLV-I als auch gegen HTLV-II, spezifisch nachzuweisen, an ein Festphasen-Reagenz an unterschiedlichen Stellen angeheftet. Doppelproben des zu untersuchenden Serums werden den geeigneten Bereichen des Festphasen-Reagenzes zugegeben, und anschließend wird der Testansatz, im Wesentlichen wie vorstehend beschrieben, durchgeführt.
10A zeigt eine spezifische Ausführungsform eines Festphasen-Reagenzes dieser Art. Das Reagenz umfaßt einen festen Träger 10, der Teil eines Kits zur Verwendung beim Nachweis von HTLV-I- oder HTLV-II-Infektionen in menschlichen Serumproben bildet. Der Träger besitzt eine erste, zweite, dritte und vierte Reaktionszone, die als 12 beziehungsweise 14, 16 und 18 bezeichnet werden. Die Reaktionszone 12 besitzt an die Oberfläche angeheftete 2B3A-Peptidmoleküle. Diese Zone ist mit Antikörpern aus HTLV-positiven Serumproben (HTLV-I- oder HTLV-II-Infektion) immunreaktiv, aber nicht mit "Falsch-Positiven", die mit dem p21E-Peptid immunreaktiv sind, aber kein Anzeichen für eine Infektion mit HTLV-I oder HTLV-II zeigen.
Die Reaktionszone 14 besitzt an die Oberfläche angeheftete 3A3B-Peptidmoleküle. Diese Zone ist mit Antikörpern immunreaktiv, die mit dem HTLV-I-p21E-Peptid kreuzreagieren, bei denen aber das Serum selbst kein Anzeichen für eine Infektion mit HTLV-I oder HTLV-II zeigt, z. B. beim Nachweis HTLV-spezifischer Sequenzen über eine PCR.
Die Reaktionszone 16 besitzt an die Oberfläche angeheftete Peptidmoleküle, die mit Serum-Antikörpern aus HTLV-I infizierten Individuen spezifisch immunreaktiv sind. Ein bevorzugtes HTLV-I-Peptid ist das MTA-1-Peptid, das vorstehend identifiziert wurde (SEQ ID NO: 3). Eine Vielzahl verwandter gp46-Peptide kann ebenfalls verwendet werden, einschließlich MTA-4, MTA-5 und K163 (alle werden in 11 gezeigt).
Die Reaktionszone 18 besitzt an die Oberfläche angeheftete Peptidmoleküle, die mit Serum-Antikörpern aus HTLV-II infizierten Individuen spezifisch immunreaktiv sind. Ein bevorzugtes HTLV-I-Peptid ist das K55-Peptid, das vorstehend identifiziert wurde (SEQ ID NO: 4). Weitere bevorzugte HTLV-II-Peptide sind das K15- und das K34-Peptid, die vorstehend identifiziert wurden (SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 43).
Das Reagenz mit fester Oberfläche bei dem vorstehenden Testansatz wird durch bekannte Verfahren zum Anheften von Proteinmaterial an festes Trägermaterial hergestellt, wie z. B. ein Polymer-Träger oder ähnliches. Der Träger kann mit reaktionsfähigen Oberflächenresten bereitgestellt werden, wie z. B. Aminaldehyd-, Carboxyl-, Alkohol- oder Sulfhydryl-Resten. Die Verfahren zur Anheftung des Peptids umfassen im Allgemeinen die unspezifische Adsorption des Proteins an den Träger oder die kovalente Anheftung des Proteins, typischerweise durch eine freie Amingruppe, an einen chemisch reaktionsfähigen Rest auf dem festen Träger, wie z. B. eine aktivierte Carboxyl-, Hydroxyl- oder Aldehyd-Gruppe. Die Verfahren zur Anheftung von Peptiden an feste Trägeroberflächen, entweder durch unspezifische Adsorption oder durch Bildung chemischer Derivate, sind wohlbekannt.
Bei einem typischen Testansatzverfahren wird eine geeignete Verdünnung einer Serumprobe mit jeder der vier Reaktionszonen auf dem Festphasen-Reagenz in Kontakt gebracht. Im Allgemeinen wird die Serumprobe auf jede Zone in einer Menge aufgetragen, die ausreicht, um die Zone zu bedecken, z. B. 50–200 μl Serumprobe. Das Serum wird mit dem Reagenz unter Bedingungen inkubiert, die ausreichen, um die Immunreaktion der Serum-Antikörper mit dem an den Träger gebundenen Peptiden zu erlauben. Die typischen Reaktionsbedingungen sind 37°C für 30–60 Minuten.
Nach der Inkubation wird das Reagenz mit einem physiologischen Puffer gewaschen, der ähnlich demjenigen ist, der dazu verwendet wurde, das ungebundene und das unspezifisch gebundene Serummaterial zu entfernen. Zu jeder der gewaschenen Zonen wird dann ein Tropfen des/der Nachweis-Reagenzes(ien) zugegeben, wie z. B. der Enzym markierte anti-Mensch-Antikörper, um das Enzym an das Reagenz entsprechend der Menge des gebundenen anti-HTLV-I-Antikörpers auf dem festen Träger zu binden. Das Reagenz wird erneut gewaschen, um den ungebundenen Antikörper zu entfernen, und die Menge an Enzym, die mit dem Reagenz assoziiert ist, wird bestimmt.
10B zeigt das Reaktionszonen-Muster, das mit einer Serumprobe aus einem HTLV-I infizierten Individuum beobachtet werden kann, wobei die Schraffierung eine nachweisbare Immunreaktion anzeigt. Im vorliegenden Fall trat keine Reaktion mit der zweiten Zone auf, obwohl einige HTLV-I-Proben mit dem 3A3B-Peptid in der zweiten Zone immunreaktiv sein können (Tabelle 2, vorstehend). Die Reaktion mit der dritten, aber nicht mit der vierten Zone, zeigt eine Infektion nur mit HTLV-I an.
10C zeigt das Reaktionszonen-Muster, das mit einer Serumprobe aus einem HTLV-II-infizierten Individuum beobachtet werden kann. In diesem Fall sind die Serum-Antikörper mit dem 3A3B-Peptid sowie mit dem 2B3A-Peptid immunreaktiv (Tabelle 2, vorstehend). Die Reaktion mit der vierten, aber nicht mit der dritten Zone, zeigt eine Infektion nur mit HTLV-II an.
Schließlich stellt 10D das Reaktionszonen-Muster dar, das mit einer Serumprobe eines nicht infizierten, aber kreuzreagierenden Serums beobachtet werden kann. Die Abwesenheit einer Reaktion mit der ersten Zone zeigt an, dass keine Infektion mit HTLV-I oder mit HTLV-II vorliegt, obwohl das Serum einen kreuzreagierenden Antikörper enthält, der das 3A3B-Peptid erkennt. Das Fehlen einer Reaktion sowohl mit der dritten als auch mit der vierten Zone bestätigt weiterhin die Abwesenheit einer HTLV-I- oder HTLV-II-Infektion im Testserum.
Ein drittes allgemeines Testansatzformat ist ein Western-Blot-Testansatz zur Verwendung bei der Bestätigung von HTLV-I- oder HTLV-II-Antiseren. Dieses Testansatzformat umfaßt zusätzlich zu einem der in dieser Erfindung beschriebenen gp21-Peptidantigene eines oder mehrere rekombinante gp46-Peptide, die in dem U.S.-Patent-Nr. 5,614,366 und der PCT-Patent-Anmeldung PCT/US92/00823 beschrieben werden und die wirksam sind zum Nachweis und zur Unterscheidung von Serum-Antikörpern gegen HTLV-I und HTLV-II. In einem bevorzugten Format umfassen die zur Bestätigung verwendeten Peptide das p24-gag-Protein aus dem HTLV-I-Virus-Lysat und das rekombinante p21E-Hüllprotein, das einen großen Teil des HTLV-I-gp21-Hüllproteins enthält. Das HTLV-I-Virus-Lysat weist fast alle Seren nach, die Antikörper gegen HTLV-I und/oder gegen HTLVgag-Proteine enthalten. Antikörper gegen die HTLV-I- und die HTLV-II-env-Region werden durch das rekombinante p21E-Protein nachgewiesen; einige Seren aus nicht infizierten Individuen werden jedoch auch mit dem p21E-Protein reagieren (Lal et al.; Lipka et al., 1991). Das Serum wird als mit HTLV-I oder mit HTLV-II infiziert diagnostiziert, durch seine Reaktivität, die es gegenüber dem HTLV-I-gp46-Peptidantigen MTA1 und dem HTLV-II-gp46-Peptidantigen K55 aufweist. Wenn daher ein bestimmtes infiziertes Serum mit MTA1 und nicht mit K55 reagiert, ist das Individuum mit HTLV-I infiziert. Wenn das Gegenteil gilt, kann das Individuum als mit HTLV-II infiziert diagnostiziert werden. Bewertungen dieses zur Bestätigung dienenden Western-Blot-Testansatzes wurden durch die Anmelder und ihre Mitarbeiter berichtet (Roberts et al.; Lipka et al., 1992b). Bei diesen Studien besaß der beschriebene Testansatz eine Spezifität von 99 % und eine Empfindlichkeit von 99 % für den Nachweis von HTLV-I und HTLV-II infizierten Individuen. Die Einzelheiten des Blot-Verfahrens sind in Beispiel 2B und in den zitierten Veröffentlichungen angegeben.
Bei einer anderen Ausführugsform des Western-Blot-Testansatzes wird das rekombinante p21E-Protein durch das gp21-Peptid 2B3A ersetzt, das in dieser Erfindung beschrieben wird. Bei diesem Format weist entweder die HTLV-I- oder die HTLV-II-Version des 2B3A-Peptids Antikörper gegen entweder das HTLV-I- oder das HTLV-II-gp2l-Protein nach. Aufgrund des Fehlens einer Reaktionsfähigkeit des 2B3A-Peptids mit Seren aus nicht infizierten Individuen, die mit dem rekombinanten p21 E-Protein kreuzreagieren, würde man von diesem Testansatz erwarten, dass er eine deutlich größere Spezifität für HTLV infizierte Individuen mit im Wesentlichen der gleichen Empfindlichkeit besitzt, die gegenwärtig die Untersuchungsverfahren aufweisen, die das rekombinante p21E-Protein verwenden.
Eine letzte Ausführungsform könnte sowohl das 2B3A- als auch das 3A3B-Peptid umfassen. Tatsächlich würden mit HTLV infizierte Individuen mit dem 2B3A- und möglicherweise mit dem 3A3B-Peptid reagieren. Individuen, die nicht mit HTLV-I oder mit HTLV-II infiziert sind, die aber Antikörper besitzen, die mit dem rekombinanten p21E-Protein kreuzreagieren und die daher bei HTLV-Durchmusterungs-Testansätzen positiv sind, werden nur mit dem 3A3B-Protein reagieren. Diese Ausführungsform würde den Vorteil besitzen, ein Antigen bereitzustellen, das ein positives Signal sowohl bei den tatsächlich mit HTLV infizierten Individuen als auch bei den nicht infizierten, HTLV-indeterminierten Individuen anzeigt. Dies würde eine genauere Bestimmung der Reaktionsfähigkeit des Serums eines bestimmten Individuums erlauben.
V. HTLV-Peptid-Impfstoff-Zusammensetzungen
Die Erfindung umfaßt auch eine Impfstoff-Zusammensetzung, die einen 2B3A-Peptid immunogenen Peptidträger umfaßt, an den das Peptid gebunden ist. Genauer gesagt enthält der Impfstoff ein Peptid, das einen HTLV-spezifischen antigenen Bereich besitzt, der im Wesentlichen aus der Aminosäuresequenz besteht, die durch die SEQ ID NO: 22 identifiziert ist, in Kombination mit einem immunogenen Peptid-Träger.
Besonders nützliche immunogene Träger für das/die Peptid(e) umfassen KLH ("keyhole limpet hemocyanin"), Tetanus-Toxoid, Poly-1-(Lys:Glu), Erdnuß-Agglutinin, Poly-D-Lysin, Diphtherie-Toxoid, Ovalbumin, Sojabohnen-Agglutinin, Rinderserumalbumin (BSA), menschliches Serumalbumin und ähnliche.
Das 2B3A-Peptid kann mit dem Träger über eine Vielzahl an bekannten Verfahren konjugiert werden, einschließlich der Bildung chemischer Derivate und durch gentechnische Verfahren. Ein solches letzteres Verfahren wird in Einzelheiten durch Gerald Quinnan, "Proceedings of a Workshop", 13.–14. November 1984 offenbart. Die Impfstoffe und die Impfmaterialien der vorliegenden Erfindung können durch Injektion, die gewöhnlich intramuskulär oder subcutan erfolgt, oral, mittels einer magensaftresistenten Kapsel oder Tablette, als Zäpfchen, als Nasenspray und über andere geeignete Wege der Verabreichung verabreicht werden. Bei einem menschlichen Patienten hängt die geeignete Dosis des Polypeptids zum Teil von dem gewählten Weg der Verabreichung und einer Reihe anderer Faktoren ab. Zu diesen Faktoren gehören das Körpergewicht des Säugers, der immunisiert werden soll, der Träger, wenn er verwendet wird, das Adjuvanz, wenn es verwendet wird, und die Zahl an Impfungen, die man vorzunehmen wünscht.
Individuelle Inokulationen bei einem menschlichen Patienten enthalten typischerweise Einheitsdosen von etwa 10 Mikrogramm bis etwa 100 Milligramm des Polypeptids, der Träger nicht eingeschlossen, an den das Polypeptid gebunden sein kann. Wenn gewünscht, kann für eine optimale Immunität eine Reihe von Dosen über einen bestimmten Zeitraum verabreicht werden. Der Impfstoff kann, wenn gewünscht, auch in Form von Einheitsdosierungen bereitgestellt werden, die die vorstehend erwähnten Mengen des Polypeptids enthalten.
In jedem Fall liegt das Immunogen, das in einem Impfstoff oder in dem Impfmaterial enthalten ist, in einer "wirksamen Menge" vor, wobei die Menge von einer Vielzahl an Faktoren abhängt, wie im immunologischen Fachgebiet wohlbekannt ist, wie z. B. dem Körpergewicht des Säugers, der immunisiert werden soll, der verwendeten Trägereinheit, dem verwendeten Adjuvans, der Dauer, für die ein Schutz vorhanden sein soll, und dem gewünschten Immunisierungsprotokoll.
VI. Anti-2B3A-Peptid-Antikörper
Dieser Abschnitt beschreibt die Herstellung menschlicher monoclonaler Antikörper (Mabs), die spezifisch gegen das 2B3A-Peptid gerichtet sind; die Herstellung menschlicher rekombinanter Antikörper (Rabs), die spezifisch gegen das 2B3A-Peptid gerichtet sind, und die Verwendungen der Antikörper als Passivimpfstoff gegen eine virale HTLV-I-Infektion.
A. Die Herstellung menschlicher anti-2B3A-Mabs
Hybridome, die anti-2B3A-Antikörper produzieren, können durch die Fusion eines anti-2B3A-Antikörper produzierenden Lymphocyten, der aus den B-Lymphocyten eines mit HTLV-I oder mit HTLV-II infizierten Menschen isoliert wurde, mit einer Myelomzelle als Fusionspartner unter Verwendung von Hybridom-Herstellungstechniken erzeugt werden, die im Fachgebiet bekannt sind (Harlow).
In einem beispielhaft dargestellten Verfahren zur Hybridom-Herstellung werden die B-Lymphocyten, die aus dem peripheren Blut eines asymptomatischen HTLV-I infizierten Individuums isoliert wurden, mit dem Epstein-Barr-Virus (EBV) aktiviert und anschließend auf Antikörper hin ausgewählt, die mit den 2B3A-Peptiden immunreaktiv sind, wie in Beispiel 1B beschrieben.
Eine Kultur von Zellen, die eine positive anti-2B3A-Aktivität aufweist, wird vermehrt und mit einem geeigneten menschlichen oder Maus-Mensch-Myelom-Fusionspartner wie z. B. mit den GLI-H7-Myelom-Partnerzellen, die im nachstehenden Materialteil beschrieben werden, unter Verwendung von Polyethylenglycol (PEG) als Fusogen fusioniert. Die Hybridome werden dann gemäß gut etablierten Kriterien (Mitchell) durch Anzucht in einem Medium selektiert, das Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin und Ouabain enthält.
Die Überstände der Hybridom-Kulturen werden auf die Anwesenheit von Immunglobulinen hin untersucht, die mit dem 2B3A-Peptid immunreaktiv sind, zum Beispiel unter Verwendung der Verfahren, die in Beispiel 2 beschrieben werden.
Die durch die vorstehenden Schritte identifizierten positiven Hybridom-Kulturen werden durch eine begrenzte Verdünnung subcloniert und erneut auf Immunreaktivität mit dem 2B3A-Peptid hin untersucht. Positive Subclone werden vermehrt und weiterhin auf den Immunglobulin-Isotyp und auf Immunreaktivität gegen das 2B3A-Peptid getestet.
B. Die Herstellung menschlicher rekombinanter anti-2B3A-Antikörper
Kulturen von Hybridomen, die anti-2B3A-Mabs produzieren, werden, wie vorstehend beschrieben, hergestellt. Aus den Zellen wird die Messenger-RNA (mRNA) isoliert, und die mRNA wird dazu verwendet, die entsprechenden cDNAs gemäß wohlbekannten Verfahren (Maniatis) herzustellen.
Die codierenden Sequenzen für die variablen Regionen der leichten Kette und der schweren Kette der Immunglobulin-Gene werden über PCR-Verfahren amplifiziert, die bekannte PCR-Primer für die variablen Regionen der schweren und der leichten IgG-Kette verwenden (Larrick et al., 1989, 1991, 1992). Das amplifizierte codierende Sequenzfragment der variablen Region der leichten Kette wird gereinigt, an den geeigneten Restriktionsenzym-Schnittstellen geschnitten und in einen geeigneten Expressionsvektor zur Expression der leichten IgG-Kette unter Befolgung veröffentlichter Verfahren (Larrick et al., 1989, 1991, 1992) eingebaut. Die Konstruktion eines geeigneten Expressionsvektors, der hierin als pSXRD.kappa-IgG identifiziert wird, ist in Beispiel 3 angegeben.
Das amplifizierte codierende Sequenzfragment der variablen Region der schweren Kette wird auf ähnliche Weise gereinigt, mit geeigneten Restriktionsenzymen geschnitten und in einen geeigneten Expressionsvektor zur Expression der schweren IgG-Kette unter Befolgung veröffentlichter Verfahren (Larrick et al., 1989, 1991) eingebaut. Ein geeigneter Expressionsvektor zur Expression der variablen Region der schweren Kette ist der pcDNA1/neo.IgG1-Vektor. Der Vektor kann durch Modifizierung des pcDNA1-Vektors (Invitrogen, San Diego, CA) über den Einbau einer codierenden Region einer konstanten schweren IgG-Kette (Larrick et al., 1992) konstruiert werden. Die beiden Plasmide werden dann zusammen entweder in CHO- oder in GLI-H7-Zellen unter Verwendung der Lipofektion oder der Elektroporation transfiziert. Die Selektion auf das Plasmid mit der schweren Kette wurde unter Verwendung des Antibiotikum GENETICIN^TM (G418, BRL # 860-1811I) durchgeführt. Die Zellen werden auf die Herstellung von IgG untersucht und subcloniert. Die Subclone werden auf die Bindung des 2B3A-Peptids untersucht. Die positiven Clone wurden mehrere Male subcloniert, um ihre Reinheit sicherzustellen.
Alternativ kann ein Clon-Selektionsverfahren wie z. B. ein solches, das beschrieben wurde (Huse, McCafferty), dazu verwendet werden, rekombinante anti-2B3A-Antikörper zu erzeugen, das als Quelle der codierenden Regionen der variablen Region der B-Lymphocyten, cDNAs verwendet, die aus B-Lymphocyten hergestellt wurden, welche aus einem Menschen isoliert wurden, der mit HTLV-I oder mit HTLV-II infiziert ist.
Die cDNAs werden in Phagenvektoren eingebaut, die Vektoren werden in einer geeigneten E. coli-Bakterien-Wirtszelle exprimiert, und die freigesetzten Phagen werden über Affinitätsbindung an einem festen Träger selektiert, der das Antigen enthält. Die eingefangenen Phagen werden dann dazu verwendet, um eine Bakterien-Wirtszelle erneut zu infizieren.
C. Passivimpfstoff-Zusammensetzungen
Die menschlichen anti-2B3A-Mabs oder -Rabs, die, wie vorstehend beschrieben, hergestellt, wurden, werden in einer Impfstoff-Zusammensetzung zur Verwendung bei der Behandlung und/oder zur Vorbeugung einer Infektion mit HTLV-I und/oder HTLV-II angewendet. Bei diesem Ansatz werden Mabs oder Rabs, die das 2B3A-Peptid erkennen, Individuen verabreicht, die HTLV-I oder HTLV-II möglicherweise ausgesetzt waren und/oder damit infiziert sind. Die Bindung dieser Antikörper an HTLV-I infizierte Zellen liefert dann eine humorale Immunantwort, bei der die Makrophagen diejenigen B-Lymphocyten zerstören, die anti-HTLV-I-Antikörper gebunden haben.
Die anti-HTLV-Antikörper werden in einer geeigneten Lösung zur Injektion formuliert, die typischerweise über den parenteralen Weg erfolgt, um die Impfstoff-Zusammensetzung zu bilden. Die Zusammensetzung wird in einer wirksamen Menge verabreicht, um die HTLV-Infektion in einem nicht infizierten Individuum zu blockieren, oder um die Replikation des Virus in einem infizierten Patienten zu hemmen. Die bevorzugte Dosierung des Antikörpers liegt in einem Bereich zwischen etwa 0,5 bis 5 mg Antikörper/kg Körpergewicht. Die Zusammensetzung kann zur Behandlung eines infizierten Individuums in zeitlich getrennten Intervallen verabreicht werden, bevorzugt etwa in 1- bis 4-wöchigen Intervallen. Die Impfung kann vor einer erwarteten Infektion erfolgen, oder zur Behandlung einer bestehenden Infektion mit HTLV-I.
In einer allgemeinen Anwendung wird den Säuglingen, deren Mütter als mit HTLV-I infiziert diagnostiziert wurden, die Antikörper-Zusammensetzung injiziert, um die Entwicklung der Virus-Infektion zu verhindern, insbesondere wenn der Säugling über einen längeren Zeitraum über die Brust ernährt wird. Die Antikörper können in einem Verfahren zur Behandlung oder zur Vorbeugung von HTLV-I durch Immun-Prophylaxe parenteral wie z. B. intramuskulär, subcutan oder intravenös verabreicht werden, oder im Falle von Säuglingen auch durch orale Verabreichung.
VII. Die Identifizierung von mit 3A3B kreuzreagierenden Proteinen
Die Identifizierung des HTLV-Epitops 3A3B, das spezifisch mit nicht HTLV infizierten Menschen kreuzreagiert, kann gemäß den Verfahren, die in diesem Abschnitt beschrieben werden, zur Identifizierung des Proteins oder der Proteine verwendet werden, die für die Induktion des kreuzreagierenden Antikörpers verantwortlich sind.
A. Antikörper-Identifizierung des Proteins
Polyclonale oder monoclonale Antikörper, die gegen das 3A3B-Peptid spezifisch sind, können dazu verwendet werden, kreuzreagierende Peptide zu isolieren und zu identifizieren, die in Seren von kreuzreagierenden Individuen vorliegen, wie z. B. in Individuen, die in Bezug auf das HTLV-Virus negativ sind, deren Serum aber mit dem HTLV-p21E-Antigen kreuzreagiert.
Bei dem anti-3A3B-Antikörper kann es sich um einen polyclonalen oder um einen monoclonalen Antikörper handeln, der unter Verwendung des 3A3B-Peptids als Antigen gemäß herkömmlichen Verfahren hergestellt wurde (Harlow). Das Peptid-Antigen wird bevorzugt mit einem geeigneten Trägerprotein konjugiert, wie z. B. KLH, und einem geeigneten Tier injiziert, wie z. B. einem Kaninchen zur Herstellung polyclonaler Antikörper oder einer Maus zur Herstellung von Mabs.
Alternativ kann der Antikörper über Affinitätsreinigung gereinigt werden, und zwar durch Anheftung des 3A3B-Peptids an einen festen Träger und dem Einfangen der Antikörper aus kreuzreagierenden Individuen, wobei die bekannten Verfahren zur Affinitätsreinigung verwendet werden (Harlow).
Um das kreuzreagierende Protein aus einem kreuzreagierenden Individuum zu isolieren, wird der anti-3A3B-Antikörper durch Standardverfahren zur Derivatbildung an einen festen Träger angeheftet, und eine Plasmaprobe oder das Gesamt-Zelllysat, das aus dem mit 3A3B kreuzreagierenden Individuum isoliert wurde, wird über das Trägerbett gegeben, um die kreuzreagierenden Proteine auf dem Träger einzufangen. Die eingefangenen Proteine können von der Säule freigesetzt werden, Proteine, die als Kandidaten in Frage kommen, können durch präparative SDS-PAGE oder durch Chromatographie gereinigt werden, und die gereinigten Proteine können unter Verwendung von Standardverfahren sequenziert werden.
Nachdem eine Teilsequenz des Proteins erhalten wurde, ist es möglich unter Verwendung von Verfahren, die im Fachgebiet wohlbekannt sind (Maniatis et al., SISPA-Patent), die codierende Sequenz zu identifizieren, die für das Peptid verantwortlich ist. Ein solches Verfahren beinhaltet die Isolierung von Nucleinsäuren aus einem Serum und/oder einer PBMC-Probe aus einem mit 3A3B kreuzreagierenden Individuum, gefolgt von der Konstruktion einer λgt10-Genbank. Die erhaltene Genbank wird mit markierten degenerierten Primern durchmustert, um Clone zu identifizieren, die hybridisierende Sequenzen im Serum enthalten, die das isolierte und mit 3A3B kreuzreagierende Protein codieren. Es können auch andere Verfahren verwendet werden, die nicht in den Rahmen dieser Erfindung fallen.
Die folgenden Beispiele erläutern verschiedene Aspekte der Erfindung, sind aber keineswegs dazu beabsichtigt, den Rahmen der Erfindung zu begrenzen.
Materialien
Die Materialien, die in den folgenden Beispielen verwendet wurden, waren wie folgt: Enzyme: DNAase I und alkalische Phosphatase wurden von Boehringer Mannheim Biochemicals (BMB, Indianapolis, IN) bezogen; EcoRI, EcoRI-Methylase, DNA-Ligase und Polymerase I von New England Biolabs (NEB, Beverly, MA); und RNase wurde von Sigma (St. Louis, MO) erhalten.
Weitere Reagenzien: EcoRI-Linker wurden von NEB bezogen, und Nitroblau-Tetrazolium (NBT), 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat (BCIP), 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-ß-D-galactopyranosid (X-Gal) sowie Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid (IPTG) wurden von Sigma erhalten.
Die GLI-H7-Zelllinie ist eine Mensch-Maus-Heteromyelom-Fusionspartner-Zelllinie, die durch die Fusion eines NS-1-Maus-Myeloms mit einem menschlichen aktivierten B-Lymphocyten konstruiert wurde, wie durch Carroll beschrieben wurde. Die HEp-2-Zelllinie ist eine epidermale Karzinom-Zelllinie (aus menschlichen Kehlkopf), die von der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD (ATCC-CCL-23) erhalten wurde.
Ovarienzellen des chinesischen Hamsters (DUX-B11) wurden von L.A. Chasin (Urlaub) bezogen.
Die Zellkulturmedien (PFHM, RPMI, IMDM) wurden von Gibco Laboratories bezogen.
Beispiel 1
Die Herstellung der rekombinanten 2B3A- und 3A3B-Peptide
A. Die Konstruktion der Expressionsvektoren
Ein Plasmid, das eine vollständige Kopie einer DNA-Insertion enthielt, welche von dem HTLV-I-Genom stammte, wurde von den Drs. R.C. Gallo und F. Wong-Staal aus dem Laboratory of Tumor Cell Biology, National Institutes of Health (Bethesda, MD) erhalten.
Der codierende Bereich von gp21 (2) stammte aus dem gp21 codierenden Bereich, der in dem HTLV-I-Clon sp6S-MT-2 vorlag, der von Dr. Wong-Staal erhalten wurde. Die Oligonucleotid-Primer, die dazu entworfen wurden, ausgewählte Teile von HTLV-I-gp21 zu amplifizieren (3), wurden mit einem automatischen Synthesegerät (Applied Biosystems, Foster City, CA) nach den Vorschriften des Herstellers synthetisiert. Alle Primer enthielten entweder eine BamHI, eine NcoI und/oder eine EcoRI-Schnittstelle, die sich an ihren 5'-Enden befand, um die Clonierung der amplifizierten DNAs als Insertionen im Leseraster in das pGEX-GLI-Expressionsssytem zu ermöglichen.
Die PCR wurde gemäß den Vorschriften des Herstellers durchgeführt (Perkin-Elmer/Cetus, Norwalk, CT), und alle PCR-Reaktionen enthielten 2 ng des HTLV-I-Clons sp65-MT-2 als Matrize (in großzügiger Weise von Dr. F. Wong-Staal zur Verfügung gestellt) sowie 1,0 μM der geeigneten Oligonucleotidprimer. Die PCR-Amplifikation wurde über 25 Zyklen der Matrizen-Denaturierung (1 Minute bei 94 °C), der Primer-Anlagerung (2 Minuten bei 50 °C) und der Primer-Verlängerung (2 Minuten bei 72 °C) durchgeführt. Die amplifizierten DNAs wurden gereinigt, 2 Stunden mit den geeigneten Restriktionsenzymen verdaut und in den Expressionsvektor pGEX-GLI ligiert, der eine modifizierte Version des kommerziell erhältlichen Vektors pGEX-2 (Pharmacia, Piscataway, NJ) darstellt und der zuvor mit den gleichen Restriktionsenzymen verdaut worden war.
B. Die Herstellung von Antikörpern für die Durchmusterung
Periphere B-Zellen wurden aus einem asymtomatischen HTLV-I infizierten Individuum isoliert und mit dem Epstein-Barr-Virus (EBV) bei 10⁴ Zellen pro Vertiefung in einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen, wie vorher beschrieben (Perkins et al., 1989; Foung et al., 1990), aktiviert. Nach 2 Tagen Kultur wurde die spezifische anti-HTLV-I-IgG-Aktivität unter Verwendung eines auf dem viralen Lysat von HTLV-I basierenden Enzym-Immuntestansatzes (Diagnostic Biotechnology, Singapur) untersucht. Es wurde anti-HTLV-I-Aktivität nachgewiesen, und die mit EMB unsterblich gemachten B-Zellen wurden dann in Kultur für etwa 1 Monat angezogen, wobei über diesen Zeitraum die verbrauchten Überstände der Kulturen gesammelt wurden. Durch eine anschließende Western-Blot-Analyse unter Verwendung eines Bestätigungs-Testansatzes für HTLV-I (Diagnostic Biotechnology) wurde bestimmt, dass 3 der mit EBV aktivierten B-Zelllinien, die als 3E9, 5G4 und 6E9 bezeichnet wurden, stark mit dem rekombinanten env-Protein p21E reagierten. Dann wurden die Überstände 1/2 in BLOTTO verdünnt und dazu verwendet, die isolierten rekombinanten gp21-Proteine zu durchmustern. Bei der anschließenden Fusion mit Maus-Mensch-Heteromyelomzellen konnte keine dieser 3 mit EBV aktivierten B-Zelllinien erfolgreich fusioniert werden, und die Antikörperproduktion der mit EBV aktivierten B-Zellen hörte schließlich auf. Die Überstände der aktivierten B-Zellen lieferten jedoch ein hochspezifisches Antikörperpräparat, das für das nachstehend beschriebene Durchmusterungsverfahren nützlich war. Darüber hinaus bestätigt die Isolierung von Antikörpern gegen das 2B3A-Peptid aus 3 getrennten EBV aktivierten B-Zellen, dass Antikörper gegen das 2B3A-Peptidantigen einen Hauptbestandteil der Immunantwort infizierter Individuen gegen HTLV-I oder HTLV-II darstellen.
C. Die Durchmusterung immunogeng er Peptide
Plasmid enthaltende Bakterien wurden auf die Proteinproduktion durch Western-Blot-Analyse von Rohlysaten durchmustert, die aus 2 ml-Kulturen der transformierten E. coli-Zellen hergestellt worden waren. Ein Zehntel Volumen des Gesamt-Zelllysats wurde pro Bahn aufgetragen und auf einem 12,0%-igen Polyacrylamid-SDS-Gel (Laemmli) elektrophoretisch aufgetrennt. Das so erhaltene Gel wurde durch Elektrotransfer auf Nitrocellulose-Filterpapier (Schleicher und Schuell, Keene, NH) übertragen, und die HTLV-I-Western-Blots wurden über Nacht bei Zimmertemperatur mit den mit EBV aktivierten B- Zellen-Gewebekultur-Überständen, die 1/2 verdünnt worden waren (Beispiel 1B), oder mit den HTLV infizierten oder Kontroll-Antiseren, die 1/100 verdünnt worden waren, inkubiert. Alle Seren und Überstände wurden mit BLOTTO verdünnt (10 mM TRIS-HCl, pH 7,4; 5 % entfettete Trockenmilch; 2,5 % normales Ziegenserum und 0,5 % Tween-20). Die Western-Blots wurden 3-mal für jeweils 5 Minuten mit TTBS-Waschpuffer (10 mM TRIS-HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl; 0,05 % Tween-20) gewaschen.
Das gebundene Mensch-IgG wurde durch eine 1-stündige Inkubation mit anti-Mensch-IgG aus Ziege nachgewiesen, das mit alkalischer Phosphatase (Promega, Madison, WI) konjugiert war. Darauf erfolgten 4 5-minütige Spülungen mit TTBS. Der gebundene Zweitantikörper wurde durch Inkubation der Streifen in einer Substratlösung nachgewiesen, die 5-Brom-4-Chlor-3-indolylphosphat (BCIP) und Nitroblau-Tetrazolium (NBT) in 100 mM TRIS-HCl, pH 9,5 und 50 mM MgCl₂ enthielt. Die so erhaltenen Western-Blots wurden mit Seren aus HTLV-I infizierten oder nicht infizierten Individuen durchmustert. Die Ergebnisse dieser Analysen sind in Tabelle 1 dargestellt.
Die DNAs der rekombinanten Clone 2A3B, 2A2B, 2B3A und 3A3B wurden alle durch das Didesoxy-Terminations-Verfahren sequenziert (Maniatis et al.). Die erhaltene Sequenz der DNA-Insertionen stimmte mit den DNA-Sequenzen der Primer und der Matrizen überein, die zur ihrer Konstruktion verwendet worden waren, und erlaubten die Herstellung der gewünschten rekombinanten Proteine.
D. Die Reinigung rekombinanter Antigene
Die Reinigung des rekombinanten Fusionsproteins wurde, im Wesentlichen wie beschrieben (20), durchgeführt. Kurzgefaßt wurde eine über Nacht angezogene 10 ml-Kultur von Bakterien, die das rekombinante Plasmid von Interesse enthielten, 1/100 in Flaschen verdünnt, die 500 ml NZYDT-Medium (Maiantis et al.) mit 100 μg/ml Ampicillin enthielten. Die Expression des Fusionsproteins wurde durch die Zugabe von IPTG (Endkonzentration 0,2 mM) zu Kulturen in der log-Phase induziert. Die Kulturen wurden weitere 3 bis 4 Stunden bei 37 °C angezogen, und zu diesem Zeitpunkt wurden die Bakterien durch 10 Minuten Zentrifugation bei 5.000 × g sedimentiert. Die Zellen wurden in 20 ml kaltem MTBS resuspendiert und durch mehrere Einfrier-Auftau-Zyklen lysiert. Nach der Lyse wurden die Proteine durch die Zugabe von Triton-X100 (Sigma, St. Louis, MO) zu 1,0 %, DNAse I zu 1 μg/ml und Aprotinin zu 1,0 % solubilisiert. Nach 5 Minuten Inkubation bei 25 °C wurden die unlöslichen Zelltrümmer durch 2-malige Zentrifugation bei 10.000 × g über 10 Minuten sedimentiert, und die Überstände wurden aufbewahrt. Aliquote sowohl der Sediment- als auch der Überstand-Fraktion wurden durch SDS-PAGE (Laemmli) analysiert, um zu bestimmen, ob die rekombinanten Proteine durch das vorstehende Verfahren solubilisiert worden waren.
Die rekombinanten Proteine 2A3B, 2A2B und 3A3B lagen alle in der löslichen Fraktion vor. Bei allen drei der rekombinanten Proteine führte eine 1 Liter-Kultur zur Reinigung von 1–2 mg an Fusionsprotein mit einer Reinheit von annähernd 50 %. Dann wurden die Überstände durch eine Säule hindurch geleitet, die 0,8 ml Glutathion-Agarose (Pharmacia, Piscataway, NJ) enthielt und die nach den Empfehlungen des Herstellers vorbehandelt worden war. Die Säule wurde mit 10 ml MTBS plus 1% Triton und 1% Aprotinin gewaschen, darauf erfolgte eine Waschung mit 5 ml MTBS alleine. Die gebundenen Proteine wurden mit einem Puffer eluiert, der 5 mM Glutathion in 50 mM Tris, pH 8,0 enthielt, und es wurden 10 1 ml-Fraktionen gesammelt. Die Peaklage des eluierten Proteins wurde durch die Messung der Extinktion bei 280 nm der Fraktionen bestimmt, sowie durch SDS-PAGE-Analyse von Aliquoten der Fraktionen. Fraktionen, die signifikante Mengen an Protein enthielten, wurden vereinigt, und Aliquote dieser Sammlung wurden bei – 70 °C für die weitere Analyse eingefroren.
Beispiel 2
Die serologische Auflistung der gereinigten p21E-Rekombinanten gegen HTLV-I-, HTLV-II- und p21E-indeterminierte Seren
A. Antiseren
Die Antiseren, die bei diesen Analysen verwendet wurden, umfaßten ein gut charakterisiertes Panel an Seren aus 26 mit HTLV-I und 28 mit HTLV-II infizierten Individuen (Lipka et al. 1991; Hadlock et al. 1992). Alle der HTLV-I- und der HTLV-II-Seren besaßen Antikörper-Profile, die die Standardkriterien für eine HTLV-Infektion erfüllten (Antikörper gegen p24-gag- und gegen gp46- und/oder gp68-env-Proteine). Darüber hinaus waren die Seren als mit HTLV-I infiziert klassifiziert, sowohl aufgrund ihrer positiven Reaktivität gegenüber dem rekombinanten HTLV-I-Antigen MTA1 als auch/oder durch PCR unter Verwendung von HTLV-I-spezifischen Oligonucleotid-Primern und Sonden (Lipka et al. 1992b). In ähnlicher Weise waren die 32 mit HTLV-II infizierten Individuen durch ihre Reaktivität gegenüber dem rekombinanten HTLV-II-Antigen K55 und/oder durch PCR unter Verwendung von HTLV-II-spezifischen Primern und Sonden identifiziert (Lipka et al. 1992b).
Die gp21-Peptidantigene wurden ebenfalls auf ihre Immunreaktivität mit Seren aus 7 HTLV-I-negativen Individuen und mit Seren aus 18 Individuen untersucht, deren Seren mit dem rekombinanten p21E-Protein reagierten, die aber in Bezug auf HTLV-Nucleinsäuren negativ waren, wenn sie durch PCR unter Verwendung von HTLV-I- und HTLV-II-spezifischen Primern und Sonden getestet worden waren. Darüber hinaus erfüllten diese 18 mit p21E reagierenden Seren die serologischen Kriterien für eine HTLV-Infektion nicht. Die mit HTLV-I und HTLV-II infizierten Individuen stammten alle aus der Gegend von Nord-Kalifornien, mit Ausnahme des Antiserums J103, das von einem HTLV-I infizierten japanischen Blutspender stammte. Die nicht infizierten Seren stammten alle von Blutspendern der Blutbank der Stanford University. Die 18 mit p21E reagierenden HTLV-negativen Seren stammten entweder von Blutspendern aus Nord-Kalifornien oder wurden von dem Center for Disease Control, Atlanta, Georgia bereitgestellt.
B. Die Seroreaktivität gereinigter rekombinanter Peptide
Die rekombinanten Proteine 2A2B, 2B3A und 2A3B wurden wie in Beispiel 1 hergestellt. Aliquote der gereinigten Proteine wurden unter reduzierenden Bedingungen auf einem 11,5%-igen Polyacryamidgel (Laemmli) aufgetrennt. Die aufgetrennten Proteine wurden durch Elektrotransfer auf eine Nitrocellulose-Membran übertragen, die mit BLOTTO blockiert, an der Luft getrocknet und in 3 mm breite Steifen zerschnitten wurde.
Bei dem Testansatz wurden die vorstehenden Teststreifen zuerst in TTBS-Puffer rehydratisiert, und dann wurden die Streifen über Nacht mit menschlichen Test-Seren inkubiert, die 1:50 mit BLOTTO verdünnt worden waren. Die Streifen wurden mehrere Male mit Waschpuffer gewaschen und dann über eine Stunde mit anti-Mensch-IgG aus Ziege inkubiert, das mit alkalischer Phosphatase (Bio-Rad, Hercules, CA) konjugiert war. Nach dem Waschen wurde die Farbentwicklung durch die Inkubation der Streifen in einer Substratlösung erreicht, die NBT und BCIP in 100 mM Tris-HCl-Puffer, pH 9,5 und 50 mM MgCl₂ enthielt. Die Farbentwicklung wurde so lange durchgeführt, bis sich ein gleichmäßiger Hintergrund auf dem Streifen entwickelte, und wurde dann durch zweimaliges Abspülen der Streifen mit deionisiertem Wasser gestoppt. Die rekombinanten Proteine 2A2B, 2B3A und 2A3B wurden gegen Panelen von HTLV infizierten und negativen Seren getestet, die in Beispiel 2A beschrieben wurden. Die Ergebnisse der Immuntests sind in der vorstehenden Tabelle 2 angegeben.
Beispiel 3
Die Konstruktion von pSXRD.kappa-Ig
Die Konstruktion des Säuger-Expressionsvektors pSXRD.kappa-Ig wurde über mehrere Schritte durchgeführt. Der Basis-Vektor ist pUC18. In die BamHI-Schnittstelle von pUC18 wurde das 585 bp große BamHI-Bg1II-Fragment aus dem HBV-Oberflächenantigen-Gen eingebaut, welches auch das Polyadenylierungs-Signal umfaßt (Larrick et al. 1992). Die Orientierung war derart, dass sich die BamHI-Schnittstelle der HBV-Insertion am nächsten zur EcoRI-Schnittstelle des Vektors befand. Der Bereich zwischen der HindIII- und der HincII-Schnittstelle des Polylinkers wurde durch Verdau des Plasmids mit diesen beiden Enzymen und der anschließenden Umwandlung der HindIII-Schnittstelle in ein glattes Ende unter Verwendung des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase entfernt. Nach der Ligierung wurde das so erhaltene Plasmid als pUCHBV3' bezeichnet. Unter Verwendung eines synthetischen Oligonucleotid-Primers wurde eine nur einmal vorkommende Sa1I-Schnittstelle in die BamHI-Schnittstelle eingebaut.
Zwischen die nur einmal vorhandene EcoRI-Schnittstelle und die Sa1I-Schnittstelle wurden die folgenden Fragmente über einer Reihe von Ligierungen eingefügt: (a) ein früher SV40-Promotor, der von einer EcoRI-Schnittstelle begrenzt war (die durch Anhängen eines synthetischen Oligonucleotids an die PvuII-Schnitstelle direkt vor dem SV40-Promotor und die HindIII-Schnittstelle direkt vor dem Start-Codon des T-Antigens erzeugt worden war), (b) ein Stuffer-Fragment, das aus einer irrelevanten cDNA stammte und das durch eine HindIII-Schnittstelle begrenzt war und mit einer XbaI-Schnittstelle endete, (c) ein XbaI-Bg1II-Fragment aus pcDNA1/neo, das das SV40-Polyadenylierugssignal und den RSV-Promotor enthielt. Die XbaI-Schnittstelle wird durch den Vektor bereitgestellt, und die Bg1II-Schnittstelle wurde unter Verwendung der PCR-Clonierung eingebaut, um sie an die Verbindungsstelle zwischen dem RSV-Promotor und dem Neo-Selektionsmarker zu positionieren, und (d) die murine DHFR-cDNA, die von einer Bg1II-Schnittstelle am 3'-Ende begrenzt ist. Die Restriktionsschnittstellen wurden unter Verwendung der PCR eingebaut.
Obwohl die Erfindung unter Bezugnahme auf bestimmte Ausführungsformen, Verfahren zur Konstruktion und Anwendungszwecken beschrieben wurde, ist es für Fachleute verständlich, dass zahlreiche andere Anwendungen, Formulierungen und Verfahren zur praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen werden können.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Peptid, das einen HTLV-spezifischen antigenen Bereich hat, der im Wesentlichen aus der Aminosäuresequenz besteht, die durch SEQ ID NO: 1 identifiziert wird, wobei das Peptid gekennzeichnet ist durch: (i) Immunreaktivität mit Seren aus menschlichen Individuen, die mit HTLV-I oder HTLV-II infiziert sind, und (ii) keine Immunreaktivität mit Seren, die (1) immunreaktiv mit HTLV-I-p21E-Antigen sind, aber (2) von Menschen erhalten wurden, die nicht mit HTLV-I oder HTLV-II infiziert sind.
Peptid nach Anspruch 1, wobei die Peptidsequenz durch SEQ ID NO: 22 identifiziert wird, die in SEQ ID NO: 1 enthalten ist.
Peptid nach Anspruch 1, wobei die Peptidsequenz durch SEQ ID NO: 29 identifiziert wird, die in SEQ ID NO: 1 enthalten ist.
Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Verwendung in einem Festphasen-Test zum Nachweis einer HTLV-I- oder HTLV-II-Infektion in einer menschlichen Serumprobe, der auf einem festen Träger ausgeführt wird.
Kit zum Nachweis der Anwesenheit einer HTLV-I- oder HTLV-II-Infektion in einem menschlichen Serum, umfassend (a) einen festen Träger; (b) verknüpft mit dem Träger, in einer ersten Reaktionszone, ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3; und (c) Reportermittel zum Nachweis der Anwesenheit menschlicher Antikörper, die an den Träger gebunden sind.
Kit nach Anspruch 5, der des Weiteren eine zweite Reaktionszone in dem festen Träger einschließt, und, verknüpft mit dieser zweiten Zone, einen zweiten HTLV-spezifischen antigenen Bereich, der im Wesentlichen aus der Aminosäuresequenz besteht, die durch SEQ ID NO: 2 identifiziert wird und gekennzeichnet ist durch Immunreaktivität mit Seren, die (1) von Menschen erhalten wurden, die nicht mit HTLV-I oder HTLV-II infiziert sind, aber (2) immunreaktiv mit HTLV-I-p21E-Antigen sind.
Kit nach Anspruch 6, wobei der zweite antigene Bereich durch SEQ ID NO: 30 identifiziert wird, die in SEQ ID NO: 2 enthalten ist.
Kit nach Anspruch 5, der des weiteren eine dritte Reaktionszone in dem festen Träger einschließt, und, verknüpft mit dieser dritten Zone, ein drittes HTLV-spezifisches Antigen, das in der Lage ist, zwischen Serumantikörpern, die spezifisch gegen HTLV-I und HTLV-II sind, zu unterscheiden.
Kit nach Anspruch 8, wobei das dritte Antigen einen HTLV-I-spezifischen antigenen Bereich, im Wesentlichen bestehend aus der Sequenz identifiziert durch SEQ ID NO: 3, oder einen HTLV-II-spezifischen antigenen Bereich, im Wesentlichen bestehend aus der Sequenz identifiziert durch SEQ ID NO: 4, enthält.
Kit für den Nachweis der Anwesenheit von HTLV-I- oder HTLV-II-Infektion in einem menschlichen Serum, umfassend (a) einen festen Träger, der erste, zweite und dritte Reaktionszonen hat, (b) immobilisiert an der ersten Reaktionszone ein erstes Peptid, das einen HTLV-spezifischen antigenen Bereich hat, der im Wesentlichen aus der Aminosäuresequenz identifiziert durch SEQ ID NO: 1 besteht, wobei das Peptid gekennzeichnet ist durch: (i) Immunreaktivität mit Seren aus menschlichen Individuen, die mit HTLV-I oder HTLV-II infiziert sind, und (ii) keine Immunreaktivität mit Seren, die (1) immunreaktiv mit HTLV-I-p21E-Antigen sind, aber (2) von Menschen erhalten wurden, die nicht mit HTLV-I oder HTLV-II infiziert sind; (c) immobilisiert an der zweiten Zone ein zweites Peptid, das einen HTLV-spezifischen antigenen Bereich hat, der im Wesentlichen aus der Aminosäuresequenz identifiziert durch SEQ ID NO: 2 besteht, und gekennzeichnet ist durch Immunreaktivität mit Seren, die (1) immunreaktiv mit HTLV-I-p21E-Antigen sind, aber (2) von Menschen erhalten wurden, die nicht mit HTLV-I oder HTLV-II infiziert sind; (d) immobilisiert an der dritten Zone ein drittes HTLV-spezifisches Antigen, das in der Lage ist, zwischen Serumantikörpern zu unterscheiden, die spezifisch gegen HTLV-I und HTLV-II sind; und (e) Reportermittel für den Nachweis der Anwesenheit menschlicher Antikörper, die an den Träger gebunden sind.
Kit nach Anspruch 10, wobei die erste Peptidsequenz durch SEQ ID NO: 22 identifiziert wird, die in SEQ ID NO: 1 enthalten ist, und die zweite Peptidsequenz identifiziert wird durch SEQ ID NO: 30, die in SEQ ID NO: 2 enthalten ist.
Kit nach Anspruch 10, wobei das dritte Peptid einen HTLV-I-spezifischen antigenen Bereich hat, der im Wesentlichen aus der Aminosäuresequenz identifiziert durch SEQ ID NO: 3 besteht, wobei das Peptid gekennzeichnet ist durch: (i) Immunreaktivität mit Seren aus menschlichen Individuen, die mit HTLV-I infiziert sind, und (ii) keine Immunreaktivität mit Seren aus menschlichen Individuen, die nur mit HTLV-II infiziert sind.
Kit nach Anspruch 10, wobei das dritte Peptid einen HTLV-II-spezifischen antigenen Bereich hat, der im Wesentlichen aus der Aminosäuresequenz identifiziert durch SEQ ID NO: 4 besteht, wobei das Peptid gekennzeichnet ist durch: (i) Immunreaktivität mit Seren aus menschlichen Individuen, die mit HTLV-II infiziert sind, und (ii) keine Immunreaktivität mit Seren aus menschlichen Individuen, die nur mit HTLV-I infiziert sind.
Verfahren zum positiven Nachweis einer HTLV-I- oder HTLV-II-Infektion in einem menschlichen Individuum, umfassend Reagieren des Serums aus dem Individuum mit einem Peptid, das einen HTLV-spezifischen antigenen Bereich enthält, der im Wesentlichen aus der Aminosäuresequenz identifiziert durch SEQ ID NO: 1 besteht; Bildung eines Immunkomplexes zwischen dem Peptid und Antikörpern im Serum eines Individuums, das eine HTLV-I- oder HTLV-II-Infektion hat, durch das Reagieren; und Untersuchen des Peptids nach dem Vorliegen eines Immunkomplexes, der das Vorhandensein von HTLV-I- oder HTLV-II-Antikörpern im Serum belegt.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Sequenz des antigenen Bereichs durch SEQ ID NO: 22 oder SEQ ID NO: 29 identifiziert ist, die in SEQ ID NO: 1 enthalten sind.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Reagieren des Weiteren das Reagieren des Serums mit einem Peptid einschließt, das einen zweiten HTLV-spezifischen antigenen Bereich enthält, wobei die Sequenz des zweiten Bereichs durch SEQ ID NO: 2 identifiziert ist und gekennzeichnet ist durch Immunreaktivität mit Seren, die (1) von Menschen erhalten wurden, die nicht mit HTLV-I oder HTLV-II infiziert sind, aber (2) immunreaktiv mit HTLV-I-p21E-Antigen sind.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei der zweite antigene Bereich durch SEQ ID NO: 30 identifiziert ist, die in SEQ ID NO: 2 enthalten ist.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Reagieren des Weiteren das Reagieren des Serums mit einem Peptid einschließt, das ein drittes HTLV-spezifisches Antigen enthält, das in der Lage ist, zwischen Serumantikörpern, die spezifisch für HTLV-I und HTLV-II sind, zu unterscheiden.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei das dritte Antigen einen HTLV-I-spezifischen antigenen Bereich enthält, der im Wesentlichen aus der Sequenz identifiziert durch SEQ ID NO: 3 besteht.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei das dritte Antigen einen HTLV-II-spezifischen antigenen Bereich enthält, der im Wesentlichen aus der Sequenz identifiziert durch SEQ ID NO: 4 besteht.