DE68924155T2

DE68924155T2 - Verfahren zur herstellung von natürlichem hiv-glykoprotein 160.

Info

Publication number: DE68924155T2
Application number: DE68924155T
Authority: DE
Inventors: Vaniambadi Kalyanaraman; Mangalasseril Sarngadharan
Original assignee: Akzo NV
Current assignee: Akzo NV
Priority date: 1988-08-16
Filing date: 1989-08-10
Publication date: 1996-04-18
Anticipated expiration: 2009-08-11
Also published as: KR900702045A; AU638214B2; FI102684B; FI901879A0; HK1000969A1; EP0394386A1; AU4068789A; ATE127526T1; EP0394386B1; DE68924155D1; US5116740A; DK90090A; WO1990002196A1; FI102684B1; DK90090D0; DK175733B1; EP0394386A4

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von nativem gp169 des menschlichen Immundefizienzvirus (HIV), dem ätiologischen Agens des erworbenen Immundefizienzsyndroms (AIDS).
Menschliches Immundefizienzvirus (HIV) ist heute als ätiologisches Agens des erworbenen Immundefizienzsyndroms (AIDS) gut gesichert. Das Virus ist in Zellen, die das CD4- Antigen tragen, tropisch und ist hoch cytopathogen für T4- Helfer-Inducer-Zellen. Das Hüllgenprodukt von HIV wird als ein gp160-Vorläufermolekül synthetisiert, das anschliessend in das externe Hüllprotein gp120 und das Transmembranprotein gp41 verarbeitet wird. Die Vorläufer/Produkt-Beziehung zwischen gp160 und den kleineren Proteinen gp 120 und gp 41 wurde nun, ebenso wie die Aminosäuresequenzen von allen drei Proteinen, gut dokumentiert [Allan et al., Science, 228:1091-1094 (1985) und Veronese et al., Science, 229:1402-1405 (1985)]. Das externe Glykoprotein gp120 bindet in der Initialphase der von dem Virus induzierten viralen Zellfusion und Riesenzellbildung an das CD4-Molekül suszeptibler Zellen [Dalgeish et al., Nature, 312:763-766].
Ausser ihrer Rolle bei der Erkennung der Zelloberflächenrezeptoren und der Zellfusion sind das HIV gp120 und gp41 die primären Ziele der Immunerkennung bei Individuen, die mit HIV infiziert sind. Daher gemessen diese Proteine besondere Aufmerksamkeit bei Untersuchungen zur Virusneutralisation und der Impfstoffentwicklung. Es wurde beobachtet, dass lange Segmente des gp120, die durch rekombinante DNA- Techniken exprimiert wurden oder natives gp120, das aus HIV-infizierten Zellen gereinigt wurde, vorwiegend typspezifische neutralisierende Antikörper in Tieren hervorrufen. Ausserdem bildete das HIV-Vorläuferhüllprotein gp160, das in Insektenzellen mit Baculovirusvektoren exprimiert wurde, eine starke typspezifische Immunantwort in Ziegen [Rusche et al., PNAS USA, 84:6924:6928 (1987)].
Die Fähigkeit bestimmte lebende Zelllinien mit HIV zu infizieren und die infizierten Zellen in einen kontinuierlichen Hersteller intakter Viren zu verwandeln, wurde in dem US- Patent 4.652.599 beschrieben. Selbst die Fähigkeit die Zelllinie zu infizieren und die HIV-Variante der vorliegenden Erfindung wurden bereits beschrieben [Getchell et al., J. Clin. Microbiol. 23:737-742 (1986)].
Keines dieser Ereignisse allein erlaubt die Schaffung eines Verfahrens, das in der Lage ist, das HIV-Glykoprotein gp160 in seiner nativen Form herzustellen. Normalerweise zerfällt das native gp160 in gp120 und gp41. Folglich ist das Hüllprotein, das aus Zellkulturmedien oder aus lysiertem Virus erhalten wird, gp 120 und gp41. Es ist daher überraschend, dass gp160 in seiner nativen Form erhalten werden kann.
Das Glykoprotein gp160 wurde nun durch rekombinante Mittel hergestellt. Rekombinantes gp160 unterscheidet sich jedoch von nativem gp160, inbesondere hinsichtlich der Glykosylierung. Diese Unterschiede werden bei der Suche nach einem HIV-Impfstoff kritisch, inbesondere da die Hüllproteine den viralen Tropismus bestimmen und Epitope beherbergen, die für die Entwicklung von neutralisierenden Antikörpern gegen das Virus wesentlich sind.

Zusammenfassung der Erfindung

Es ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung einen einzigartigen Klon von HUT78-Zellen zur Verfügung zu stellen, die, wenn sie chronisch mit HTLV-III&sub4;&sub5;&sub1; infiziert sind, funktionell intaktes virales Glykoprotein gp160 in das extrazelluläre Medium entlassen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer immortalisierten Zelllinie, die in einem serumfreien Medium unter solchen Bedingungen gezüchtet wird, dass die Zelllinie gp160 in seiner nativen Form in das Medium entlässt.
Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein intaktes gp160 in seiner nativen Form zur Verfügung zu stellen.
Diese und andere Gegenstände und Vorteile der Erfindung werden durch Züchten der infizierten Zelllinie 6D5&sub4;&sub5;&sub1; in einem serumfreien Medium und Isolieren des von den Zellen in das Medium entlassene gp160 erzielt.

Beschreibung der Figuren

Figur 1 (Bande 1) zeigt das SDS-PAGE-Profil des aus der Linsen-Lectin-Sepharose eluierten Glykoproteins. Bande 2 zeigt das gereinigte, mit Coomassie-Blau gefärbte gp160.
Figur 2 zeigt das Ausscheiden HIV-spezifischer Proteine durch 6D5&sub4;&sub5;&sub1;-Zellen. Tafel A: Medium von Zellen, die FCS gezüchtet wurden; Tafel B: Medium von Zellen, die in HB101 gezüchtet wurden. Bande 1: HIV-positives, humanes Serum; Bande 2: Hasen-anti-HTLV-IIIB gp41; Bande 3: Hasen-anti 121-Peptid (Centocore); Bande 4: Ziegen-anti-HTLV-IIIB gp120; Bande 5: normales menschliches Serum; Bande 6: normales Hasenserum; Bande 7: normales Ziegenserum.
Figur 3 zeigt die Inhibition MIV-induzierter Syncytienbildung durch HTLV-III&sub4;&sub5;&sub1;-Glykoproteine. CEM-Zellen wurden gemeinsam mit Molt-3/HTLV-IIIB-Zellen wie unten beschrieben kultiviert. Die Zellen wurden nach 48 Stunden fotografiert.
Um die Wirkung der viralen Glykoproteine zu untersuchen, wurden CEM-Zellen mit dem Glykoprotein 1 Stunde vor der Cokultivierung vorinkubiert. Tafel A: unbehandelte CEM- Zellen; Tafel B: CEM-Zellen plus Molt-3/HTLV-IIIB-Zellen; Tafel C: CEM-Zellen, vorbehandelt mit Glykoproteinen von nichtinfizierten 6D5-Zellkulturen; Tafel D: CEM-Zellen, die mit 6D5&sub4;&sub5;&sub1;-Glykoproteinen vorbehandelt wurden.
Figur 4 zeigt die Bindung von gp120 und gp160 durch CD4.
Konditioniertes Medium von einer ³&sup5;S-Methionin-markierten 6D5&sub4;&sub5;&sub1;-Kultur wurde durch Zentrifugation bei 2000 x g , gefolgt von einer Filtrierung durch einen 0,45 u-Filter geklärt. Ein halber Milliliter des Mediums wurde mit CEM&sub5;&sub0;- Zellen in einem Gesamtvolumen von 2 ml wie unten beschrieben inkubiert. Die gebundenen Proteine wurden mit dem OKT4- Antikörper immungefällt. Bande 1: 0,5 x 10&sup6; Zellen; Bande 2: 1 x 10&sup6; Zellen; Bande 3: 2 x 10&sup6; Zellen; Bande 4: 5 x 10&sup6; Zellen; Bande 6: 20 x 10&sup6; Zellen.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform

Ein einzelner Zellklon von HUT78-Zellen wurde mit dem menschlichen Immundefizienzvirus Typ1 1 (HIV-1) infiziert, wobei die infizierte Zelllinie ein kontinuierlicher Virushersteller wurde. Klon 6D5 ist für eine chronische Infektion mit HIV-1 suszeptibel, wie von Getchell et al., J. Clinic. Microbiol., 23:737-742, beschrieben wurde. Klon 6D5 ist mit einem spezifischen HIV-1-Stamm, HTLV-III&sub4;&sub5;&sub1; infiziert, um die infizierte Zelllinie 6D5&sub4;&sub5;&sub1; herzustellen. Die infizierte Zelllinie wird dann in serumfreien Medium gezüchtet, durch Pelletieren der 6D5&sub4;&sub5;&sub1;-Zellen und Resuspendieren in serumfreien Medium (wie HB101-Medium, käuflich erhältlich von Du Pont). Serumfreies Medium HB104, das ebenfalls von Du Pont erhältlich ist, kann auch bei der Anwendung dieser Erfindung verwendet werden.
Nur wenn serumfreies Medium verwendet wird, kann gp160 von anderen Proteinen in dem Medium getrennt werden. gp160 kann von anderen Mediumkomponenten nicht unterschieden werden, wenn serumenthaltendes Medium verwendet wird.
In der bevorzugten Ausführungsform enthält das HB101-Medium auch Wachstumszusätze wie Transferrin, Insulin und Rinderserumalbumin. Um das Wachstum der Zellen zu unterstützen, wurden die Zellen alle vier Tage subkultiviert. Die 6D5&sub4;&sub5;&sub1;- Zellen wurden 2 bis 3 Generationen gezüchtet. Die Menge an HIV-Protein, das in das Medium abgegeben wurde, die durch Reverse Transktiptase-Aktivität gemessen wurde, war annähernd fünfmal grösser in serumfreiem Medium als in serumenthaltendem Medium. Reverse Transkriptase (RT) im Kulturmedium der infizierten Zellen wurde mit (dT) 15.(A)n als Primermatrize analysiert, wie von Poiesz et al., PNAS USA, 77:7415-7419 (1980) beschrieben wurde.
Das zellfreie Medium wurde als Quelle für das Glykoprotein verwendet. Das Medium wurde mit Natriumphosphat, pH 7,5, 0,5% Triton X-100, 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid und 400 mm Natriumchlorid auf 20 mM gebracht. Nach der Inkubation bei Raumtemperatur während einer Stunde, wurde das Medium mit einem Pellicon-Kassettensystem, das von Millipore erhältlich ist, 30-fach konzentriert. Überschüssiges Protein, das von den Mediumzusätzen stammte, wurde durch Immunaffinitätsabsorption (über Nacht) mit einem Sepharosegebundenen Ziegenantikörper, der gegen die Proteine in dem Wachstumszusatz in dem serumfreien Medium gezüchtet wurde, aus dem Konzentrat entfernt. Proteine, die an den Ziegenantikörper gebunden waren, wurden entfernt und das ungebundene Material wurde dann durch eine Lectin-Affintätssäule, vorzugsweise eine Lectin-Sepharosesäule (Pharmacia) gegeben.
Obwohl die Verwendung von einer Linsen-Lectin-Säule bevorzugt wird, können auch andere Lectine, die Mannose erkennen, wie Concanavalin A, angewendet werden. Nach dem Waschen mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) wurde die Säule mit 400 mm Alphamethylmannosid eluiert, um das virale Glykoprotein zu gewinnen. Obwohl die Verwendung von Methylmannosid zum Eluieren der Säule bevorzugt wird, kann jede Mannose, Pyranosid oder Saccharid, das mit dem Lectin der Affinitätssäule kompetitiert, verwendet werden. Figur 1 (Bande 1) zeigt das SDS-PAGE-Profil des von Linsen-Lectin- Sepharose eluierten Glykoproteins. Die vorherrschenden Glykoproteine in der Probe waren die 120 KD und die 160 KD grossen Proteine. Diese Proteine reagierten auch stark in Immunoblots mit für HIV-1-Antikörper positivem menschlichen Serum. Die Immunoblot-Analyse des HTLV-III&sub4;&sub5;&sub1;-Glykoproteins wurde durch ein bekanntes Verfahren durchgeführt, wie von Sarngadharan et al., Science 224:506-508 (1984) beschrieben wurde. Im wesentlichen werden die Proteine auf einem 7%- igen SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt und auf Nitrocellulosestreifen (im Handel erhältlich) überführt. Die Nitrocellulosestreifen wurden dann mit den geeigneten Antikörpern behandelt und die Blots wurden mit peroxydasekonjugierten sekundären Antikörpern entwickelt; die Banden wurden sichtbar gemacht durch Reagieren der Streifen mit Diaminbenzidin.
gp160 wurde aus der Mischung von Glykoproteinen gereinigt, die von der Linsen-Lectin-Sepharosesäule eluiert wurden durch Immunaffinitätschromatographie unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gegen das gp41-Protein von HIV-1. Der monoklonale Antikörper wurde unter Verwendung von teilweise gereinigtem HTLV-III&sub4;&sub5;&sub1;-Glykoprotein durch Standardverfahren entwickelt. Die Immunglobulinfraktion des Antikörpers wurde gemäss dem vom Hersteller (Pharmacia) beschriebenen Verfahren an die Sepharose gekuppelt. Das Eluat der Linsen-Lectin-Sepharosesäule wurde bei 4ºC mit der anti-HIV-1-gp41-Sepharose in 20 mM Tris-HCl, pH 8,5, das 0,5% Triton X-100, 1 M Kaliumchlorid und 0,1 mM PMSF enthielt, äquilibriert. Die Sepharose wurde dann in eine Säule gepackt, mit PBS gewaschen und das gebundenen Protein wurde mit 100 mm Natriumhydrogencarbonat eluiert. Das HTLV- III&sub4;&sub5;&sub1;-gp160 wurde von der Säule in einem nahezu homogenen Zustand eluiert. Figur 1 (Bande 2) zeigt das gereinigte gp160, durch SDS-PAGE getrennt und mit Coomassie-Blau gefärbt.
Glykoprotein gp160 und seine Derivate, die gemäss der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, können auf herkömmliche Weise in immuntherapeutischen und/oder immundiagnostischen Verfahren und Zusammensetzungen verwendet werden. Solche Verfahren der Behandlung und angewendete Mengen sind im Stand der Technik bekannt und können von dem Fachmann aus den zur Verfügung stehenden Verfahren und Techniken gewählt werden. Zum Beispiel kann gp160, das gemäss der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger in einer wirksamen Menge vereint werden, um ein diagnostisches Mittel für einen ELISA-Assay zu liefern.
Damit die hier beschriebene Erfindung verständlicher wird, werden die folgenden Beispiele angegeben.

Beispiel 1

Zwanzig Millionen 6D5&sub4;&sub5;&sub1;-Zellen wurden 15 Stunden in 10 ml des serumfreien HB101-Medium markiert, das 5% der normalen Methionin-Menge, 1 mCi ³&sup5;S-Methionin und 5% dialaysierten HB101-Zusatz enthielt. Der zellfreie Überstand wurde durch einen 0,45 Micron-Filter filtriert, konzentriert und mit 0,5% Triton X-100, 500 mM Natriumchlorid und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid behandelt. Nach einer Stunde bei Raumtemperatur wurde das gelöste Medium mit einem gleichen Volumen PBS, das 0,5% Triton X-100, 1% Desoxycholat und 0,1% Natriumdodecylsulfat (PBS-TFS) enthielt, gemischt. Ein Milliliter der Mischung wurde über Nacht mit 10 ul eines anti- HIV-Serums und 150 ul einer 10%-igen Protein-A-Sepharose inkubiert. Die Sepharose wurde pelletiert, viermal mit PBS- TDS gewaschen und 2 Minuten mit 1% SDS, 1% Beta- Mercaptoethanol und 125 mm Tris-HCl (pH 6,8) gekocht. Die gelösten, markierten Proteine wurden auf einem 7,5%-igen SDS-Polyacrylamidgel getrennt und autoradiographiert wie von Veronese et al., Science 229:1402-1405 (1980) beschrieben wurde. Figur 2 zeigt gp160 als ein deutlich immunreaktionsfähiges Proteinprodukt in dem Kulturmedium.

Beispiel 2

Die viralen Proteine in dem extrazellulären Medium der in serumfreiem Medium gezüchteten 6D5&sub4;&sub5;&sub1;-Zellen wurden durch metabolisches Markieren mit ³&sup5;S-Methionin, wie oben beschrieben, analysiert. Die freigewordenen radioaktivmarkierten Proteine wurden entweder mit HIV-1 seropositivem Serum oder Antikörpern, die für das gp120 oder gp41 von HTLV-IIIB spezifisch waren, immungefällt. HIV-1-positives menschliches Serum fällte, zusätzlich zu dem bedeutenstem Kernprotein (p24), zwei Proteine von annähernd 120 KD und 160 KD. Ein Ziegenantikörper gegen das gp120 von HTLV-IIIB fällte sowohl die 120 KD- als auch die 160 KD-Proteine, was darauf hinweist, dass sie immunreaktionsfähige Domänen des gp120 enthalten. Auf der anderern Seite fällte Hasen-anti- gp41 nur das 160 KD-Protein. Diese Ergebnisse zeigen, dass das 160 KD grosse Protein sowohl die gp120 als auch die gp41-Domänen von HIV trägt, während das 120 KD gosse Protein nur die gp120-Epitope von HIV hat.

Beispiel 3

Die nativen 120 und 160 KD grossen Glykoproteine, die gemäss der Erfindung hergestellt werden, wurden weiter durch ihre Reaktionsfähigkeit mit Antikörpern, die spezifisch für das gp120 und gp41 von HTLV-IIIB sind, charakterisiert. Zu diesem Zweck wurden die Proteine durch SDS-PAGE getrennt, auf Nitrocellulosestreifen übertragen und mit Antikörpern behandelt, die für das gp120 und gp41 von HTLV-IIIB spezifisch sind. Sowohl die 120 KD und 160 KD grossen Proteine reagierten mit dem HIV-I-positiven Serum und mit dem Ziegen-anti-gp120. Nur das gp160 KD-Protein reagierte mit den Antikörpern gegen das gp41 von HTLV-IIIB. Von den beiden verwendeten monoklonalen Antikörper gegen gp120 reagierte nur einer mit beiden, was typenspezifische Reaktionsfähigkeit der monoklonalen Antikörper mit verschiedenen HIV- Isolaten zeigt.

Beispiel 4

Obwohl das primäre Ziel der HIV-Infektion die Helfer/Inducer-Teilmenge der T-Lymphocyten ist, die die CD4- Zelloberflächenmarker tragen, wird gerade erst begonnen den eigentlichen Mechanismus, mit dem das Virus suszeptible Zielzellen infiziert, zu verstehen. Von monoklonalen Antikörpern gegen bestimmte Epitope der CD4-Antigene wurde festgestellt, dass sie die virale Infektion blockieren und Komplexe aus CD4 und gp120 immunfällen können. Dies scheint darauf hinzuweisen, dass die Schlüsselinteraktion zwischen gp120 und CD4 den Infektionsvorgang von HIV-1 initiiert. Eine Konsequenz der Virusinfektion ist die Bildung von multinukleären Riesenzellen, die aus Zellfusionsereignissen resultieren. Von einem Klon von CEM-Zellen konnte gezeigt werden, dass er eine schnelle und quantitative Syncytienbildung zeigt, wenn er mit HIV-1-infizierten Zelllinien gemischt wird [Mathews et al., PNAS USA 84:5424-5428 (1987)] (Figur 3B). Diese Art von Syncytienbildung dient oft als ein Mass einer gp120-CD4-Interaktion während der Virusinfektion. Die Fähigkeit des HTLV-IIIB-Glykoproteins mit HTLV-IIIB-induzierter Fusion von CEM-Zellen zu interferieren, wurde durch 36-stündige Inkubation der Ziel-CEM-Zellen mit einer teilweise gereinigten Glykoprotein-Präparation vor dem Mischen mit Molt-3/HTLV-IIIB-Zellen getestet. Vorinkubation der CEM-Zellen mit Glykoproteinpräparationen von nichtinfizierten 6D5-Zellen hatte keine Wirkung auf die Syncytienbildung (Figur 3C). Im Gegensatz dazu blockierte die Vorbehandlung der CEM-Zellen mit den HTLV-IIIB- Glykoproteinpräparationen die Syncytienbildung vollständig, die durch HTLV-IIIB/Molt-3-Zellen induziert wurde (Figur 3D). Dies deutet daraufhin, dass das virale Glykoprotein selektiv an CD4-Antigene auf den Zielzellen bindet und dabei die Infektion durch die HIV-1-infizierten Zellen blokkiert.
Durch Immunfällung mit einem menschlichen Serum wurde festgestellt, dass mehr als 90% der viralen Glykoproteine in der löslichen Form nach einer Hochgeschwindigkeitszentrifugation des konditionierten Mediums vorlagen. Die Interaktion des HTLV-III&sub4;&sub5;&sub1;-Glykoproteins wurde weiter durch die spezifische Bindung von markiertem gp120 und gp160 an CEM- Zellen untersucht. Zu diesem Zweck wurde zellfreier Überstand von mit ³&sup5;S-Methionin markierten 6D5&sub4;&sub5;&sub1; mit ansteigenden Zahlen an CEM-Zellen inkubiert. Nach dem Waschen der Zellen mit PBS wurde der gebundenen HIV-Glykoprotein/CD4- Komplex auf den Zellen mit Detergentien gelöst, wie anderswo beschrieben. Der gelöste Extrakt wurde mit zwei monoklonalen Antikörpern gegen das CD4-Molekül immungefällt. Beide HIV-Glykoproteine wurden durch OKT4 gefällt. Es ist jedoch interessant, dass, wenn die Rezeptordichte limitierend war, gp120 die vorherrschende Spezies war, die an die Zellen gebunden vorlag. Bei höherer Zelldichte, wenn die Bindungsstellen häufiger waren, waren sowohl gp120 als auch gp160 in dem CD4-Komplex deutlich vorhanden. Der CD4- Glykoprotein-Komplex konnte nicht mit dem monoklonalen OKT4A gefällt werden. Dies ist in Übereinstimmung mit früheren Beobachtungen, dass die Bindungsstelle des HIV-gp120 auf dem CD4-Molekül das OKT4-Epitop ist. Die relative Affinität der Rezeptorstelle scheint gp120 dem gp160 vorzuziehen, basierend auf der Beobachtung, dass praktisch kein gp160 aus einer Mischung aus gp120 und gp160 bei limitierenden CD4-Konzentrationen gebunden wurde. Wieviel von dieser Schwierigkeit der Bindung durch topologische Beschränkungen des grösseren gp160 beim Annähern an die Cd4- Zelloberfläche diktiert wird, muss noch bestimmt werden.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von nativem gp160 des menschlichen Immundefizienzvirus, welches umfasst:

Infizieren von Zelllinien einer HUT78-T-Zelllinie mit HTLV- III&sub4;&sub5;&sub1;;

Auswählen von infizierten HUT78-Zellen, die natives gp160 produzieren;

Inkubieren der genannten gp160-produzierenden Zelllinie in serumfreien Medium unter Bedingungen, die Zellwachstum fördern; und

Isolieren des nativen gp160 aus genanntem Medium.

2. Verfahren zur Herstellung von nativem gp160 des menschlichen Immundefizienzvirus gemäss Anspruch 1, welches umfasst:

Inkubieren von Zeilen einer natives gp160 produzierenden infizierten 6D5&sub4;&sub5;&sub1;-T-Zelllinie in serumfreien Medium; und

Isolieren eines 160 KD grossen Proteins, das dem nativen HIV- Hüllglykoprotein gp160 entspricht.

3. Verwendung einer mit HTLV-III&sub4;&sub5;&sub1; infizierten HUT78-Zelllinie, die fähig ist, natives gp160 zu produzieren, wenn sie in freien Medium gezüchtet wird.

4. Verwendung gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelllinie die Zelllinie 6D5&sub4;&sub5;&sub1; ist.

5. Natives Glykoprotein gp160 des menschlichen immundefizienzvirus, das von der Zelllinie 6D5&sub4;&sub5;&sub1; gemäss Anspruch 4 produziert wird.

6. Natives gp160, dass gemäss dem Verfahren von Anspruch 1 hergestellt wird.

7. Natives gp160, dass gemäss dem Verfahren von Anspruch 2 her- gestellt wird.

8. Natives Glykoprotein gp160 des menschlichen Immundefizienzvirus gemäss Anspruch 5 in einem serumfreien Medium.

9. Eine Agenszusammensetzung, die gp160 umfasst, das durch das Verfahren von Anspruch 1 oder Anspruch 2 hergestellt wurde, und als ein diagnostisches Agens durch Reagieren mit den Antikörpern gegen gp160, gp120 oder gp41 in einem Immunassay wirksam ist.

10. Eine Impfstoffzusammensetzung, die eine wirksame Menge an nativem Glykoprotein gp160 des menschlichen Immundefizienzvirus ge- mäss Ansprüchen 5-8 umfasst, um eine Immunantwort zu bewirken und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.