DE3853779T2

DE3853779T2 - Hiv-1 neutralisierende monoklonale antikörper.

Info

Publication number: DE3853779T2
Application number: DE3853779T
Authority: DE
Inventors: Nancy Chang; Tse Chang; Sek Fung; Ruey Liou; Edward Rosen; Bill Sun; Cecily Sun
Original assignee: Baylor College of Medicine; Tanox Inc
Current assignee: Baylor College of Medicine; Tanox Inc
Priority date: 1987-05-29
Filing date: 1988-05-27
Publication date: 1995-09-07
Anticipated expiration: 2008-05-28
Also published as: WO1988009181A3; JP2520464B2; DE3853779D1; EP0366718A1; CA1339857C; ATE122237T1; WO1988009181A2; EP0366718B1; JPH03504556A

Description

Hintergrund der Erfindung

Erworbene Immuninsuffizienz ("acquired immune deficiency syndrome"), allgemein durch ihr Acronym AIDS bekannt, ist wahrscheinlich die ernsthafteste Gesundheitsbedrohung, mit der die Gesellschaft konfrontiert wird. Die Krankheit nimmt einen schmerzhaften und schwächenden Verlauf und führt gewöhnlich zum Tod ihres Opfers. In der Tat umfaßt die durchschnittliche Lebensspanne eines AIDS-Opfers von der Diagnose an weniger als zwei Jahre.
Bis heute ist in den Vereinigten Staaten von etwa 40 000 AIDS-Fällen berichtet worden. Ungefähr zwei Drittel der Personen sind an der Krankheit gestorben.
AIDS wird von einem Virus ausgelöst, das zu unterschiedlichen Zeiten humanes T-Zell-Leukämie-Virus Typ III (HTLV III) oder Lymphadenopathie-assoziiertes Virus (LAV) genannt wurde. Das Virus ist gegenwärtig als humanes Immuninsuffizienzvirus I (HIV-1) bekannt. Das Center for Disease Control, U.S. Public Health Services, und die National Academy of Sciences nehmen an, daß in den Vereinigten Staaten allein etwa 1,5 Millionen Menschen bis 1991 infiziert worden sind. Die Ergebnisse aus vielen epidemiologischen Langzeitstudien weisen darauf hin, daß zwanzig bis sechzig Prozent der infizierten Gruppe innerhalb der nächsten fünf bis sieben Jahre AIDS entwickeln werden. Zum Beispiel nimmt das Center for Disease Control an, daß es bis 1991 etwa 300 000 AIDS-Fälle geben wird.
HIV-1 löst auch ein etwas leichteres Immuninsuffizienzsyndrom aus, das klinisch als ARC (AIDS-related complex) definiert wird. ARC geht oft dem Ausbruch von AIDS voran. Es gibt gegenwärtig viel mehr ARC-Fälle als AIDS-Fälle. Wenn die Zahl der Fälle weiterhin steigt, wird ARC in und durch sich selbst, ein extrem kostspieliges und ernstes Gesundheitsproblem werden.
AIDS ist die Folge, weil die Infektion mit HIV-1 das Immunsystem des Opfers schädigt und schließlich zerstört. Das Immunsystem wird bis zu dem Punkt reduziert, wo das Opfer nicht länger sekundäre opportunistische Infektionen abwehren kann. Es sind oft die sekundären Infektionen, die das Opfer schwächen und die Ursache für den Tod sind.
Zusätzlich zur Empfänglichkeit fuhr sekundäre Infektionen entwickeln AIDS-Opfer häufig sonst seltene Krankheiten. Eine große Zahl entwickelt eine seltene Form von Hautkrebs, die als Kaposi-Sarkom bekannt ist. Man nimmt an, daß dieser Zustand auch von der Immuninsuffizienz herrührt, die von dem Virus ausgelöst wird. HIV-1 schädigt das Immunsystem durch Infektion und Erschöpfung der T- Helfer/"inducer"-Lymphocyten (nachstehend als "T-Zellen" bezeichnet). T-Zellen sind wichtig, weil sie die Antikörperproduktion durch B- Zellen, die Reifung cytotoxischer T-Lymphocyten (Killer-T-Zellen), die Reifung und Aktivität von Makrophagen und natürlichen Killerzellen und, direkt und indirekt, zahlreiche andere Regulator- und Effektorfunktionen des Immunsystems kontrollieren.
Die Infektion einer T-Zelle findet durch Interaktion zwischen einem Epitop von HIV-1 und einer auf der T-Zelloberfläche liegenden Rezeptorstelle statt. Diese Rezeptorstelle auf der T-Zelle ist ein Proteinmolekül, das als CD4-Antigen bekannt ist. Das Epitop auf HIV-1 wird von dem Hüllglykoprotein gp 120 (Molekulargewicht 120.000 Daltons) gebildet. Das Glykoprotein gp 120 wird hergestellt, wenn ein in der T-Zelle hergestelltes Vorläufer-Glykoprotein gp 160, in gp 41 (Molekulargwicht 41.000 Dalton) und gp 120 gespalten wird. Gp 41 trägt das Epitop, das die vorherrschende Antikörperantwort in den meisten infizierten Individuen auslöst, wogegen das von gp 120 stammende Epitop an das CD4-Ahtigen bindet und dabei dem Virus ermöglicht, in die Zelle einzudringen.
HIV-1 ist ein Retrovirus. Nachem das Virus in die Zelle eingedrungen ist, transkribiert ein virales Enzym, das reverse Transkriptase genannt wird, die virale Genom-RNA im Kern der Wirtszelle in DNA. Die frisch synthetisierte DNA dient als Matrize und bewirkt, daß die infizierte T-Zelle die neue DNA zu transkribieren beginnt, wobei Kopien der Messenger-RNA und der genomischen RNA hergestellt werden. Die viralen Genom-RNAs werden mit Core-Proteinen, reverser Transkriptase und bestimmten anderen Proteinen gepackt. Sie werden dann von Teilen der zellulären Membran umhüllt und aus der Zelle als frisch synthetisierte Virionen in den Blutstrom freigesetzt (Knospung, Budding) Diese neuen Virionen können in andere T-Zellen eindringen und diese infizieren.
Es gibt zwei bekannte Mechanismen, durch die HIV-1 in T-Zellen im Körper der infizierten Individuen übertragen wird. Der erste kommt vor, wenn das freie Virus an das CD4-Antigen auf den T-Zellen bindet. Der zweite Mechanismus besteht in direkter Zell-zu-Zell-Übertragung des Virus.
Eine direkte Zell-zu-Zell-Übertragung findet statt, wenn eine infizierte Zelle, die das virale gp 120 auf ihrer Oberfläche exprimiert, an das CD4-Antigen einer nicht-infizierten Zelle bindet. Als Ergebnis fusionieren die zwei Zellen und die Virionen können zur nicht-infizierten Zelle gelangen.
Direkter Zell-zu-Zell-Kontakt und die so erhaltene Fusion sind eine bedeutende Quelle zellulärer Infektion und können eine Hauptquelle der T-Zell-Zerstörung in HIV-1-infizierten Personen sein. Infizierte und nicht-infizierte Zellen fusionieren oft in großen Gruppen, wobei Aggregate mit vielen Kernen, die als Syncytien bekannt sind, gebildet werden. Die Zellfusion löst den Tod der Zellen in den Syncytien aus. Siehe Lifson et al. "Induction of CD4-Dependent Cell Fusion by the HTL-III/LAV Envelope Clycoprotein", Nature 323 (1986): 725-27.
Man nimmt an, daß der Zelltod hauptsächlich in Syncytien stattfindet. Diese Theorie entsteht, weil es unwahrscheinlich erscheint, daß eine bedeutende Infektion aus anderen Quellen, wie freiem Virus im Blutstrom, stattfinden kann. Die Konzentrationen an freiem Virus im Blutstrom von infizierten Individuen sind typischerweise sehr gering. Es scheint auch unwahrscheinlich, daß eine deutliche Zellinfektion aus einer einzelnen Fusion von einzelnen infizierten und nicht-infizierten Zellen stattfinden kann. In einer Studie wurde herausgefunden, daß das Verhältnis von infizierten T-Zellen in infizierten Individuen gewöhnlich nur eines zu je 10 000 bis 100 000 weißen Blutkörperchen ist.
Nichtsdestoweniger wurde berichtet, daß die Zahl der CD4-positiven Zellen (d.h. T-Zellen) allmählich abnahm.
Patienten, die von HIV-1 infiziert sind, bilden nicht genügende Mengen neutralisierender Antikörper. Sie haben typischerweise sehr geringe Titer neutralisierender Antikörper in ihrem Serum. So wären monoclonale Antikörper, die HIV-1 neutralisieren, besonders nützlich für die Behandlung.
Monoclonale Antikörper werden von Hybridzellen gebildet. Hybridome sind Zellen, die alle aus einer einzelnen fusionierten Zelle cloniert worden sind. Alle Clone sind mit dem Elternclon identisch. Entsprechend stellen alle Hybridome desselben Clons identische Antikörper her, die an das gleiche Epitop binden.
Ein Verfahren, monoclonale Antikörper herzustellen, wurde zuerst von Köhler und Milstein beschrieben. Siehe Milstein et al., Nature 256 (1975) :495-97; Köhler et al., Eur. J. Immunol. 6 (1976):511-19. Ein Wirtstier, gewöhnlich eine Maus, wird mit einem Antigen immunisiert und dann getötet. B-Zellen enthaltende Lymphocyten werden dann entfernt, gewöhnlich aus der Milz oder anderen Lymphgeweben. Die entfernten Lymphocyten werden mit Myelomzellen zur Bildung von Hybridomen fusioniert. Die Hybridome, die einen Antikörper gegen bestimmte Epitope des immunisierenden Antigens bilden, werden cloniert und ausgewählt. Diese Hybridome werden dann zur Herstellung der gewünschten monoclonalen Antikörper verwendet.
Ein monoclonaler Antikörper, der die Infektiosität und Syncytienbildung hemmt, hätte gegenüber anderen neutralisierenden Mitteln viele Vorteile. Große Mengen des monoclonalen Antikörpers könnten hergestellt werden.
Die Hybridome sind durch die Fusion mit Myelomzellen unsterblich und können fast endlos wiederhergestellt werden.
Ein weiterer Vorteil des monoclonalen Verfahrens ist, daß monoclonale Antikörper hoher Spezifität und hoher Affinität aus einer großen Zahl Antikörper verschiedener Reaktivitäten und Affinitäten ausgewählt werden können. Wenn man Antikörper hoher Spezifität und hoher Affinität gewinnen kann, kann dies die therapeutische Verwendung des Antikörpers in minimalen Mengen ermöglichen, die gerade hinreichend genug sind, um die geeigneten Epitope zur Neutralisierung des Virus zu binden und die Syncytienbildung zu verhindern.
EP-A2 214 709 betrifft ein synthetisches Peptid mit einer Aminosäuresequenz entsprechend einem Segment des Hüllproteins p41 von HTLV-III und seine Verwendung zum Nachweis von Antikörpern gegen HTLV- III. W086/02383 betrifft Hüllantigene des LAV-Virus und seine Verwendung zum Nachweis von Antikörpern gegenüber LAV. W087/02778 betrifft ein Festphasen-Liposomen-Immuntestsystem. J. Biol. Chem. 262 (1987) 5769 offenbart einen monoclonalen Antikörper, der mit gp120 HIV-I reagiert und die Infektiosität des Virus hemmt oder neutralisiert.
Die hohe Spezifität monoclonaler Antikörper muß dem anderer neutralisierender Mittel gegenübergestellt werden. In einer Studie wurden Antiseren aus Ziegen gesammelt, die mit verschiedenen Proteinen aus der Hülle von HIV-1, einschließlich gp 120, immunisiert worden waren. Die Antiseren blockierten die Infektion von HIV-1 nur in geringen Verdünnungen wirksam. Siehe S.D. Putney et al., "HTLV- III/LAV-Neutralizing antibodies to an E. coli-Produced Fragment of the Virus Envelope", Science 234 (1986): 1392-95. Ännlich waren Antiseren aus Kaninchen und Meerschweinchen, die mit rekombinanten gp 120 immunisiert worden waren, nur in geringen Verdünnungen für die HIV-1- Neutralisierung wirksam. Siehe L.A. Lasky et al., "Neutralization of the AIDS Retrovirus by Antibodies to a Recombinant Envelope Glycoprotein", Science 233 (1986):209-212. Die in diesen Studien verwendeten polyclonalen Antikörper sind unspezifisch und mußten deshalb in relativ großen Mengen verwendet werden.
Die vorstehend erwähnten Ergebnisse legen nahe, daß das ganze gp120 und lange rekombinante Peptide keine Neutralisierungs-Antikörper mit hohem Titer induzieren können, wahrscheinlich weil die Neutralisierungs-Epitope nicht immunogen sind. Darüber hinaus werden die Antikörper als typspezifisch und nicht gruppenspezifisch befunden, d.h. sie reagieren nur mit dem immunisierenden HIV-1-Stamm und nicht mit anderen Stämmen, die genetisch deutlich unterschiedlich sind.
Zur Verwendung eines monoclonalen Antikörpers für therapeutische und prophylaktische Zwecke bei AIDS, muß er eine Schutzwirkung gegen verschiedene HIV-1-Stämme und eine große Zahl oder einen deutlichen Teil an HIV-1-Feldisolaten entfalten.
Zusammenfassend verhindert ein monoclonaler Antikörper von möglichem therapeutischen Wert zur Behandlung von Patienten mit AIDS oder ARC und mit einer Schutzwirkung bei der Hemmung von AIDS bei asymptomatischen gesunden, mit HIV-1 infizierten Individuen oder bei der Vermeidung einer HIV-1-Infektion bei Individuen von Hochrisikogruppen die Infektion von empfänglichen Zellen durch breite HIV-1-Stämme, die entweder durch Angriff durch freie Virionen oder durch direkte Zell-zu-Zell-Übertragung (Syncytienbildung) abläuft.

Zusammenfassung der Erfindung

Monoclonale Antikörper, die an das virale Hüllglykoprotein gp 120 von HIV-1 binden, sind isoliert worden. Die monoclonalen Antikörper hemmen die HIV-1-Infektion von T-Zellen durch freie Virionen und sie hemmen auch die Syncytienbildung. Es ist wichtig, daß die monoclonalen Antikörper gruppenspezifisch sind und neutralisieren und in einer Kreuzreaktion vor verschiedenen Stämmen und verschiedenen HIV-1- Isolaten schützen können.
Die HIV-1 neutralisierenden Antikörper können zur Behandlung von AIDS und ARC verwendet werden und zur passiven Immunisierung gegenüber einer HIV-1-Infektion. Bei diesen Verfahren können die Antikörper als ganze Antikörper oder als Antikörper-Fragmente verwendet werden oder sie können an cytotoxische oder antivirale Mittel konjugiert werden, oder an solche Mittel enthaltende Mikroträger zur Ausrichtung dieser Mittel auf infizierte Zellen.
Die zielgerichtete Ausrichtung der therapeutischen Mittel kann auch durch bispezifische, von den erfindungsgemäßen anti-HIV-1-Antikörpern stammende Antikörper, die mit einer zweiten Spezifität für auf das Ziel ausgerichtete Mittel ausgestattet worden sind, erreicht werden. Polyclonale oder monoclonale Antikörper gegen das Paratop der neutralisierenden Antikörper können zur Stimulierung einer neutralisierenden Immunantwort gegen HIV-1 verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper können in vivo als Antikörper, die ganz aus Mäusen oder anderen Tieren stammen, verwendet werden. In einer anderen Ausführungsform können, insbesondere zur therapeutischen Anwendung, virale neutralisierende Antikörper in Form von chimären Tier/Mensch-Antikörpern hergestellt werden. Vorzugsweise stammt die konstante Region des chimären Antikörpers vom Menschen und die variable Region vom Tier.
Die erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper werden durch kontinuierliche, stabile Antikörper-produzierende Zelllinien hergestellt. Diese Zelllinien können durch Hybridomtechniken und durch Techniken der Gentechnologie hergestellt werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1 ist eine graphische Darstellung, die die relative Wirksamkeit von vier der erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper bei der Neutralisierung der HIV-1-Infektion von H9-Zellen zeigt. Der Prozentsatz der infizierten Zellen wurde neun Tage nach der Infektion bestimmt.
Figur 2 ist eine graphische Darstellung, die die relative Wirksamkeit von vier der erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper bei der Neutralisierung der HIV-1-Infektion von H9-Zellen zeigt. Der Prozentsatz der infizierten Zellen wurde dreizehn Tage nach der Infektion bestimmt.
Figur 3 ist eine schematische Darstellung der Struktur der chimären Gene, die eine leichte und eine schwere Kette für einen HIV- neutralisierenden chimären Antikörper codieren. (A) Das Plasmid pSV184ΔHneo.BAT123Vκ hCκ enthält ein chimäres Gen der leichten Kette, das aus einem 4,4 Kbp großen Hind III-Fragment des Maus Vκ -Gens, das an das humane Cκ-Gen fusioniert ist, besteht. Dieses Plasmid enthält einen neo-Selektionsmarker. (B) Das Plasmid pSV2ΔHgpt.BAT123VHhCγ&sub1; enthält ein Genkonstrukt der schweren Chimär-Kette, das aus einem 4,5 Kbp großen Eco RI-Fragment des Maus VH-Gens, das an das humane Cγ&sub1;-Gen fusioniert ist, besteht. Das Plasmid trägt einen Eco gpt- Selektionsmarker. B: Bam HI, E: Eco RI, H: Hind III, S: Sal I, V: Gen der variablen Region, C: konstante Region.
Figur 4 zeigt die Muster der isoelektrischen Fokussierung des HIV- neutralisierenden chimären Antikörpers (Bahn 2) und des monoclonalen Antikörpers BAT123 der Maus (Bahn 1). S stellt die Standardproteine der pH-Kalibrierung mit pI-Werten von (von der Kathode (oben) bis zur Anode (unten)): 8,65, 8,45, 8,15, 7,35, 6,85, 6,55, 5,85, 5,20, 4,55 und 3,50 dar.
Figur 5 zeigt die elektrophoretische Analyse des chimären Immunglobulins. (A) Durch r-Protein-A-Affinitätschromatographie gereinigte Immunglobuline wurden mittels Elektrophorese auf einem 10%igem SDS-Polyacrylamidgel mit oder ohne Reduktion der Disulfidbrücken analysiert. Bahn 1, BAT123, reduziert; Bahn 2, chimärer Antikörper, reduziert; Bahn 3, BAT123, nicht-reduziert; Bahn 4, chimärer Antikörper, nicht-reduziert. (B) Westernblotanalyse der Immunreaktivität des Immunglobulins gegenüber den anti-Maus- Antikörper. Gereinigtes Immunglobubulin (2 ug) wurde in 10% SDS-PAGE unter Reduktionsbedingungen aufgetrennt, nach der Elektrotransfer- Methode (Elektro-Blot) auf einen Nitrocellulose-Membranfilter übertragen und mit anti-Maus-Antikörper zur Reaktion gebracht. Bahn 1, BAT123, Bahn 2, chimärer Antikörper. (C) ein Doppel der "transgeblotteten" Membran aus (B) wurde mit anti-menschlichem Antikörper zur Reaktion gebracht. Bahn 1, BAT123; Bahn 2, chimärer Antikörper.
Figur 6 zeigt die IgG-Subklasse des chimären Antikörpers, wie durch seine Reaktivität gegenüber den Antiseren im ELISA gezeigt. Die getesteten Antiseren waren ( ) anti-menschliches IgG1, (o) antimenschliches IgG3.
Figur 7 zeigt die Westernblotanalyse der Antigenspezifität des chimären Antikörpers. (A) Immunreaktivität der Immunglobuline gegen die HIV-1-Antigene, die in SDS-PAGE aufgetrennt und auf Nitrocellulose-Membranfilter elektrotransferiert wurden. Streifen 1, ein AIDS-Patientenserum (Verdünnung 1:200), Streifen 2, BAT123 (1 ug/ml); Streifen 3, chimärer Antikörper (1 ug/ml). (B) Reaktivität des Antikörpers gegenüber synthetischen Oligopeptiden, die mögliche antigene Determinanten (Epitope) von HIV-gp120, die auf einen Nitrocellulose-Membranfilter geblottet wurden, darstellen. Streifen 1, BAT123; Streifen 2, chimärer Antikörper.
Figur 8 zeigt die neutralisierenden Aktivitäten des chimären Antikörpers auf die Infektion von H9-Zellen durch HIV-1. Zellfreie Kulturüberstände wurden am Tag 14, nachdem die H9-Zellen HIV-1 in Abwesenheit und in Anwesenheit des getesteten Antikörpers exponiert worden waren, fuhr spezifische HIV-1-Antigen-Aufnahmetests gewonnen. Jede Antikörperkonzentration wurde dreifach getestet. Die Hemmung der HIV-1-Infektion wurde durch Vergleich der bei den Antigeneinfangtests der mit dem Virus in Gegenwart des Antikörpers infizierten Kulturen gewonnen optischen Dichten mit der Negativkontrolle ohne zugesetzten Antikörper bewertet. Die getesteten Antikörper waren BAT123 (o), der chimäre Antikörper cAG1-51-4 ( ) und ein nicht-reaktiver Mäuse-anti-hcG-Antikörper (Δ).

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

A. Zusammenfassung der verwendeten Verfahren

Die erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper binden an Peptide der Sequenz RPNNNTRKSIRIQRG, VQKEYAFFYKLDIIP oder RIQRGPGRAPVTIGK, wobei jede Sequenz eine Sequenz eines Teils des viralen Hüll-Glykoproteins gp 120 von HIV-1 ist. Bei der Prozessierung (Reifung) des spezifischen HIV-1-Hüllproteins in infizierten T-Zellen ist gp 41 eine Transmembrandomäne und sie wird nicht exponiert. Im Gegensatz dazu ist gp 120 ein externes Hüllprotein, das extrazellulär ist. Auf diese Weise bietet das gp 120-Protein in infizierten T-Zellen Bindungsepitope für die erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper.
Es wurde herausgefunden, daß die monoclonalen Antikörper wirksam die Infektiosität und Syncytienbildung hemmen. Dies deutet darauf hin, daß sie wahrscheinlich wirksam bei der in vivo-Neutralisierung sind, da man annimmt, daß der größte Teil des Zelltods im Syncytium abläuft. Es ist wichtig, daß die Antikörper verschiedene Stämme und verschiedene Isolate von HIV-1 neutralisieren können (d.h. die Antikörper sind gruppenspezifisch). Die Antikörper neutralisieren die Zellinfektion durch verschiedene Stämme und verschiedene Isolate von HIV-1. Die neutralisierenden Antikörper hemmen auch die Syncytienbildung durch verschiedene HIV-1-Stämme, die einen starken Grad an Heterogenität in der Aminosäuresequenz von gp 120 aufweisen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß die Antikörper durch Kreuzreaktivität schützen können und vor verschiedenen Virusstämmen in der Population schützen.
Die erfindungsgemäßen neutralisierenden Antikörper können ein großes Potential haben, die Infektiosität zu neutralisieren. Zum Beispiel können die monoclonalen Antikörper mit einer IC&sub5;&sub0; von unter 10 ng/ml die Infektion der empfänglichen menschlichen T-Zelllinien durch HIV-1B bei 20facher TCID&sub5;&sub0; in einem neuntägigen Test hemmen.
Das allgemeine Verfahren zur Herstellung der Antikörper wird nachstehend diskutiert.
Die erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper wurden mittels konventioneller Techniken hergestellt, die allgemein bei der Hybridomproduktion verwendet werden. In Kürze, Mäuse wurden mit inaktiviertem HIV-1 immunisiert. Aus den Milzen von immunisierten Mäusen entnommene B-Zellen wurden mit NS-1-Myelomzellen fusioniert. Polyethylenglycol, das mit Dimethylsulfoxid (DMSO) in Calcium/Magnesium-freier phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gemischt war, wurde als Fusionsreagenz verwendet. Die aus der Fusion gebildeten Hybridome wurden dann in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen gebracht und gezüchtet.
Die Hybridome, die die monoclonalen Antikörper produzierten, die HIV-1 neutralisieren, wurden durch eine Serie von Screeningverfahren isoliert. Zunächst wurde ein Enzym-Immuntest ("enzyme-linked immunoassay"-ELISA) mit den Clonen in allen Vertiefungen durchgeführt. Bei diesem Test wurde bestimmt, ob von diesen Clonen produzierte monoclonale Antikörper an gereinigtes gp 120 binden wurden. Clone aus den Vertiefungen, die höchste Reaktivität mit gp 120 zeigten, wurden für weiteres Screening durch einen Immunfluoreszenztest ausgewählt.
Der Immunfluoreszenztest diente zur Bestimmung, welche der ELISA- positiven monoclonalen Antikörper speziell an intakte,lebende,infizierte T-Zellen, aber nicht an nicht-infizierte T- Zellen binden würden. Die Clone, die bei der Immunfluoreszenz positiv waren, d.h. solche, die für die infizierten Zellen spezifische Antikörper produzierten, wurden zum Einzelzell-Clonieren verwendet.
Beim Einzellclonieren werden die Clone verdünnt, so daß nur einige Zellen pro Volumen vorhanden sind. Dieses Volumen wird dann einer Vertiefung zugesetzt und die Zellen werden gezüchtet. Das Ziel ist, durch Binomialverteilung zufällig in einigen Vertiefungen nur eine Einzelzellkolonie pro Vertiefung zu erhalten. Diese Zellkolonie wird unter einem Mikroskop zur Bestimmung, ob sie monoclonal ist, beobachtet.
Die ELISA-positiven Clone wurden auch in einer Westernblot-Analyse getestet. Bei diesem Verfahren wurden Lysate von HIV-1-Proteinen durch Gelelektrophorese getrennt und auf Nitrocellulosestreifen aufgebracht. Die Überstände aus den ELISA-positiven Vertiefungen werden dann auf die Reaktivität mit der Bande des gp 120-Proteins auf den Streifen getestet.
Als Ergebnis dieser Absuchverfahren wurden monoclonale Antikörper isoliert, die spezifisch für die Peptidsequenzen von gp 120, worauf vorstehend Bezug genommen wird, und für infizierte Zellen sind.
Die in der Immunfluoreszenz positiven Hybridome wurden dann in das Peritoneum von Mäusen zur Produktion einer größeren Menge monoclonaler Antikörper aus der Ascitesflüssigkeit injiziert. Die Antikörper wurden dann für Neutralisierungstests gereinigt.
Eine Anzahl von Veränderungen der vorstehend erwähnten Immunisierung, Fusion, Absuchen und Verfahren zur Antikörperproduktion sind möglich. Zum Beispiel können andere Tiere als Mäuse für die Immunisierung verwendet werden. B-Zellen werden dann aus dem immunisierten Tier zur Verwendung bei der Fusion gewonnen.
Darüber hinaus können andere als die diskutierten Reagenzien für die chemische Fusion verwendet werden. Eine andere Alternative besteht darin, zur Bildung von Hybridomen eher die elektrische Fusion als die chemische Fusion zu verwenden. Diese Technik ist gut bekannt. Statt einer Fusion kann man auch eine B-Zelle transformieren, um sie unsterblich zu machen, zum Beispiel unter Verwendung eines Epstein- Barr-Virus oder eines transformierendes Gens. (Zum Beispiel ein Verfahren zur Transformation einer B-Zelle, siehe "Continuously Proliferating Human Cell Lines Synthesizing Antibody of Predetermined Specifity," Zurawaki,V.R. et al, in Monoclonal Antibodies, Hrsg. Kennett R.H. et al., Plenum Press, N.Y. 1980, S. 19-33.)
Im Hinblick auf ELISA, den Immunfluoreszenztest und die Western-Blot- Analyse sollte angemerkt werden, daß mehrere Ausführungsformen all dieser Schritte möglich sind. Man könnte eine größere oder kleinere Zahl an Absuchschritten durchführen. Oder man könnte andere Absuchverfahren als jene, die beschrieben sind, zum Beispiel einen Radioimmuntest oder immunohistochemische Färbeverfahren, anwenden. Die wichtige Überlegung ist, daß das Verfahren Hybridome auswählt,die für gp 120 spezifische monoclonale Antikörper sezernieren, die an die Zelloberfläche von HIV-1-infizierten T-Zellen spezifisch binden.
Das Einzelzellclonierungsverfahren kann so variiert werden, daß verschiedene Zellzahlen anfangs in jede Vertiefung gebracht werden. Der Test,ob es in der Tat nur einen Clon gibt, der in jeder Vertiefung vorhanden ist, kann durch eine Anzahl von Verfahren durchgeführt werden.
Das Verfahren zur Produktion von monoclonalen Antikörpern, d.h. das Injizieren von Hybridomen in Mäuse, kann auch variiert werden. Es ist möglich, große Mengen an monoclonalen Antikörpern in Kultur unter Verwendung von Perfusions- oder Hohlfasertechniken zu züchten.
Nach der Isolierung von monoclonalen Antikörpern nach den vorstehend beschriebenen Verfahren, die spezifisch für gp 120 und intakte, lebend infizierte Zellen sind, wurde die Wirksamkeit der Antikörper bei der Neutralisierung von HIV-1 getestet. Monoclonale Antikörper aus jedem Clon, der in der Immunfluoreszenz positiv war, wurden isoliert. Ein Vergleich wurde gemacht von der Zahl der von HIV-1 infizierten Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit der monoclonalen Antikörper. Verschiedene Titer jedes Antikörpers wurden zum Vergleich ihres Potentials verwendet. Der Neutralisationstest wurde mit einer Immunfluoreszenztechnik aufgezeichnet.
Der zweite Neutralisationstest besteht in der Syncytienhemmung. Beim Syncytienhemmungstest wurden infizierte T-Zellen einer Vertiefung zugesetzt, in der sich transfizierte HeLa-Zellen befanden, die künstlich mit CD4-Genen transfiziert worden sind, und dem CD4-Antigen auf der Oberfläche. Das CD4-Antigen auf der Zelloberfläche fusioniert unter Bildung von vielkernigen Riesenzellen mit infizierten T-Zellen. Es wurde bestimmt, ob verschiedene Titer der in der Immunfluoreszenz positiven Antikörper die Riesenzellbildung hemmen wurden.
Die Neutralisationstests und ihre Aufzeichnungsverfahren können im großen Rahmen geändert werden. Es kann wünschenswert sein, nur einen und nicht den anderen zu testen, wenn zum Beispiel nur die Syncytienbildung und nicht die Infektion durch freie Virionpartikel eine Rolle spielt.
Die Antikörper werden in diesen Tests zur Neutralisierung verschiedener Virusstämme und -isolate getestet.
Zusammenfassend sind eine Vielzahl von Wegen zur Herstellung und zum Testen der erfindungsgemäßen Produkte möglich und im erfindungsgemäßen Rahmen. Die Vorteile und Anwendungen für die erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper werden jetzt diskutiert.

B.Vorteile und Anwendungen

Wie vorstehend erwähnt, ist ein Vorteil der monoclonalen Antikörper ihre Spezifität. Diese Spezifität macht die erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper in hohem Maße geeignet zur Verwendung in der Therapie, weil es bedeutet, daß geringere Dosen verwendet werden können.
Die therapeutischen Anwendungen für die erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper umfassen sowohl eine in vivo-Immuntherapie als auch eine extrakorporale Immuntherapie. Eine direkte in vivo-Behandlung mit den erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörpern umfaßt eine innere Anwendung, vorzugsweise durch intravenöse Injektion. Wenn die Behandlung von infizierten Zellen im Gehirn nötig ist, kann es möglich sein, den monoclonalen Antikörper an ein Mittel zu koppeln, wie bestimmte lipophile Substanzen, das es ihm ermöglicht,durch die Blut- Hirn-Schranke zu passieren. Die erfindungsgemäßen Antikörper können verschiedene Stämme und Isolate von HIV-1 neutralisieren und so wirksam vor verschiedenen Virusarten schützen, denen man in einer Patientenpopulation begegnet.
In der extrakorporalen Therapie werden Blutleucocyten vom Patienten entfernt und mit dem neutralisierenden Antikörper behandelt. Der monoclonale Antikörper wird dann den Leucocyten zugesetzt. Die Leucocyten können auch mit immunsteigernden Mitteln stimuliert werden, zum Beispiel Interleukin-2. Die Leucocyten werden dann dem Patienten zurückgegeben.
Die erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper aus der Maus können sowohl direkt für eine in vivo als auch für eine extrakorporale Immuntherapie verwendet werden. Jedoch ist beobachtet worden, daß, wenn monoclonale Antikörper aus der Maus bei Menschen als therapeutische Mittel verwendet werden, der Patient menschliche anti- Maus-Antikörper erzeugt. So ist gesagt worden, daß monoclonale Antikörper aus der Maus, zumindest in einigen Fällen, nur einen begrenzten therapeutischen Wert haben. Siehe V.T. Oi et al., "Chimeric Antibodies," Bio Techniaues 4 (3) (1986):214-221. Mit etablierten Techniken der Gentechnologie ist es jedoch möglich, Antikörper herzustellen, die Teile vom Tier und Teile vom Menschen haben. Chimäre Antikörper umfassen eine Antigen-Bindungs- (variable) Region, die aus einem Tierantikörper stammt und eine konstante Region, die aus einem menschlichen Antikörper stammt. Die Herstellung von viralen neutralisierenden Antikörpern wird nachstehend beschrieben.
Eine weitere alternative Form eines monoclonalen Antikörpers ist ein bispezifischer Antikörper. Bispezifische Antikörper tragen zwei verschiedene Antigenbindungsteile, die beide von verschiedener Spezifität sind. Ein bispezifischer monoclonaler Antikörper kann ein Antigenbindungsteil aufweisen, das von den monoclonalen erfindungsgemäßen Antikörpern stammt, und einen zweiten Antigenbindungsteil mit einer Spezifität für ein Mittel, das zu einer speziellen Stelle geleitet werden soll. Zum Beispiel kann die zweite Spezifität für ein Oberflächenepitop einer menschlichen T-Zelle oder eines Makrophagen, wie das CD4-Molekül, sein. Diese bispezifischen Antikörper können verwendet werden, um eine T-Zelle oder einen Makrophagen zu einer HIV-1-infizierten Zelle zu leiten.
Die bispezifischen Antikörper können einzelne Hybridantikörper oder Antikörperfragmente mit einer Bispezifität sein (Siehe M.Brennan, " A Chemical Technique for the Preparation of Bispecific Antibodies from Fab'Fragments of Mouse Monoclonal IgGI", Biotechniques 4 (1986):424-27 oder sie können Heteroaggregate zweier Antikörper mit unterschiedlicher Spezifität sein.
Die möglichen Patientenpopulationen zum Empfang der Immuntherapie- Antikörper-Behandlungen umfassen Patienten mit AIDS oder ARC. Eine Variante der Immuntherapie ist der Schutz durch passive Immunisierung. Die erfindungsgemäßen Antikörper sind besonders für die passive Immunisierung geeignet, weil sie wegen ihrer Kreuzreaktivität gegen verschiedene HIV-1-Stämme in der Population schützen können. Bei diesem Verfahren werden Patienten, die asymptomatisch (noch nicht die Symptome von AIDS oder ARC zeigen) sind oder die seronegativ, aber in einer Hochrisikogruppe sind, zur Verhinderung der Infektion behandelt. Die Zielgruppe umfaßt Feten in HIV-1-Müttern oder Babies von HIV-1- Müttern und Angehörige des Gesundheitswesens, die mit AIDS-Patienten oder Blutprodukten arbeiten, wie Zahnärzte und Schwestern. Wieder kann das Mittel zur Behandlung aus erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörpern, monoclonalen chimären Maus/Mensch-Antikörpern oder bispezifischen monoclonalen Antikörpern bestehen.
Der größte Teil der Forschungsarbeit im Bestreben, AIDS zu stoppen, hat sich auf die Suche nach einem Impfstoff konzentriert. Bei einer Art des vorgeschlagenen Impfstoffs ist das immunisierende Mittel ein Teil von HIV-1, das selbst nicht-infektiös ist, aber nichtsdestoweniger die Antikörperproduktion anregt. Monoclonale Antikörper, die HIV-1 neutralisieren, können bei der Suche nach solch einem Impfstoff helfen. Sie können zur Lokalisierung, Identifizierung und zum Studium der "neutralisierenden" Epitope auf HIV-1, die an die monoclonalen Antikörper binden, verwendet werden. Diese Epitope sind wahrscheinlich der nicht-infektiöse, aber nichtsdestoweniger immunogene Teil des Moleküls. Das Studium dieser Epitope erlaubt die Synthese eines nicht-pathogenen Immunogens mit einer Struktur, die dem Epitop gleich oder äquivalent ist. Zum Beispiel kann das Immunogen ein Peptid sein, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die die gleiche ist wie, oder dem Epitop ähnlich ist, das an einen HIV-1 neutralisierenden HIV-1-Antikörper gebunden ist.
Zwei der erfindungsgemäßen neutralisierenden Antikörper erkennen in einem Bereich von gp 120 gelegene Epitope mit der folgenden Aminosäuresequenz:

RPNNNTRKSIRIQRGPGRAFVTIGK

Dieses Segment stellt ein 25 Aminosäurereste langes Segment von gp 120 dar. Ein Antikörper (BAT267) reagiert mit einem Peptid der Sequenz RPNNNTRKSIRIQRG (Peptid a) und der andere Antikörper (BAT123) reagiert mit einem Peptid der Sequenz RIQRGPGRAFVTIGK (Peptid b).
Diese zwei 15 Aminosäurereste langen Peptide stellen zwei benachbarte, überlappende Segmente von gp120 von HIV-1B dar. BAT267 reagiert mit Peptid "a" und nicht mit Peptid "b", das sich in die fünf Aminosäuren RIQRG teilt, oder mit einem weiteren 15 Aminosäuren langen Peptid, das ein zu Peptid "a" benachbartes Segment von gp120 darstellt und fünf Aminosäuren RPNNN gemeinsam hat. Diese Ergebnisse legen nahe, daß BAT267 ein Epitop erkennt, das entweder ganz aus allen oder einem Teil der mittleren fünf Aminosäurereste TRKSI oder aus allen oder einem Teil dieser fünf Aminosäurereste mit einigen der flankierenden Aminosäurereste besteht. Auf der Grundlage ähnlicher Ergebnisse scheint BAT123 mit einem Epitop zu reagieren, das entweder ganz aus allen oder einem Teil von PGRAF oder aus einer Kombination aller oder eines Teils von PGRAF mit einigen der flankierenden Aminosäureresten gebildet wird.
Der Antikörper BAT085 reagiert mit einem Peptid der Aminosäuresequenz VQKEYAFFYKLDIIP.
Die erfindungsgemäßen peptidischen Immunogene können die vorstehend identifizierten Aminosäuresequenzen oder deren immunochemische und immunogene Äquivalente umfassen. Diese Äquivalente umfassen zum Beispiel irgendeinen der tatsächlichen Epitopteile irgendeiner dieser Sequenzen, entsprechend den peptidischen Bereichen aus verschiedenen HIV-1-Stämmen und den durch verschiedene Änderungen, wie Insertionen, Deletionen und Substitutionen von Aminosäuren, erzeugten Peptiden.
Die erfindungsgemäßen Peptide können zur Bildung größerer, multivalenter Oligopeptide gekoppelt werden Die Peptide können durch chemische Synthese hergestellt werden. In einer anderen Ausführungsform können sie durch rekombinante DNA- Technologie hergestellt werden, wobei die Peptide codierende DNA- Sequenzen synthetisiert oder aus HIV-1-DNA isoliert und in einem geeigneten Expressionssystem exprimiert werden.
Die Peptide können auch einzeln oder in Kombination zur Auslösung einer Immunantwort gegen HIV-1 verwendet werden. Zu diesem Zweck können die Peptide in Impfstoffzusammensetzungen zubereitet werden, im allgemeinen zur Anwendung in Konzentrationen im Bereich von 1 ug bis 20 mg/kg des Wirts. Physiologisch verträgliche Träger, wie Wasser, Kochsalzlösung oder phosphatgepufferte Kochsalzlösung, können bei den Zubereitungsformen verwendet werden. Adjuvantien wie Aluminiumhydroxidgel können auch verwendet werden. Der Applikationsweg kann intramuskulär, intraperitoneal, subkutan oder intravenös sein. Die Zusammensetzungen können ein- oder mehrmals, gewöhnlich in Intervallen von einer bis vier Wochen verabreicht werden.
In bevorzugten Ausführungsformen der Impfstoffzusammensetzung werden die Peptide an ein Trägerprotein wie ein fremdes Keyhole-limpet- Hämocyanin gekoppelt.
Dies kann die Immunogenität der Haptenpeptide verstärken.
Die Peptide können in Immuntests zur Identifizierung des neutralisierenden Antikörpers oder zum Absuchen auf das Vorliegen des neutralisierenden Antikörpers im Serum verwendet werden.
Eine andere Art von Impfstoff, den HIV-1-neutralisierende monoclonale Antikörper möglich machen, beruht auf einem anti-Idiotyp-Antikörper. Antikörper tragen "Idiotypen", Bereiche in der Nähe ihrer Antigen- Erkennungsstellen, die selbst antigen und in der Lage sind, die Antikörperproduktion zu stimulieren. Antikörper, die spezifisch für die Antigen-Bindungsstellen sind, werden Paratop-spezifische anti- Idiotyp-Antikörper genannt. Diese Antikörper tragen die gleiche Erkennungsstelle wie das Antigen, das anfangs die Antikörperproduktion stimulierte. Siehe J.L. Marx, "Making Antibodies without Antigens", Science 288:162-65 (1986).
Auf diese Weise kann ein Paratop-spezifischer anti-idiotypischer Antikörper mit teilweise der gleichen Struktur wie HIV-1 durch Immunisierung eines Tieres mit dem monoclonalen HIV-1-Antikörper zu HIV-1 hergestellt werden. Diese Paratop-spezifischen anti- idiotypischen Antikörper, die eine bestimmte gleiche Struktur wie die immunogenen Teile des Virus tragen, wären wahrscheinlich zur Verwendung als Impfstoff geeignet, weil sie eine Immunantwort auslösen würden. Vorteilhafterweise würden diese anti-idiotypischen Antikörper, weil sie aus Protein bestehen und keine virale Nucleinsäure enthalten, zu weniger Bedenken hinsichtlich ihrer Pathogenität führen. Ein anti- idiotypischer chimärer Maus/Mensch-Antikörper, in dem die variable Region ein monoclonaler anti-idiotypischer Maus-Antikörper und die konstante Region humanes Immunglobulin ist, ist am stärksten vorzuziehen.
Die erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper könnten auch zur Bereitstellung von cytotoxischen oder antiviralen Mitteln, durch Einbau in zum Beispiel Mikroträger oder Liposomen verwendet werden. Zu den beispielhaften cytotoxischen Mitteln zählen cytotoxische Steroide, Galanin, Abrin, Ricin und Phospholipasen. Beispiele für antivirale Mittel sind Interferon, Azidothymidin und Ribovirin. Wiederum sollte bemerkt werden, daß chimäre monoclonale Maus/Mensch-Antikörper oder bispezifische monoclonale Antikörper auch zur Bereitstellung von Pharmaka geeignet sind.
Im üblichen Sinn gelten Antikörper, einschließlich monoclonaler Antikörper, als Mediator humoraler Immunität. Jedoch können die so erhaltenen Immuntoxine in der Tat die zelluläre Immunität vermitteln, weil Antikörper, die spezifisch für einzelne Zelloberflächantigene auf Zielzellen sind, mit cytolytischen oder cytotoxischen Mitteln konjugiert werden können. Cytotoxische T-Lymphocyten, die der Schlüsselmediator der antigenspezifischen zellulären Immunität sind, erkennen und lysieren die mit Virus infizierten Zellen. Auf diese Weise können die Antikörper, die spezifisch für virale, auf der Oberfläche der infizierten Zelle liegende Antigenepitope sind, durch spezielle Technologie die Hauptfunktion der cytotoxischen T- Lymphocyten erreichen.

C. Produktion von Virus-produzierenden neutralisierenden Antikörpern (Immunglobulinen)

Erfindungsgemäße Virus-neutralisierende chimäre Antikörper werden aus schweren und leichten chimären Immunglobulinketten hergestellt. Jede chimäre Kette ist ein Polypeptid, in dem eine nicht-humane variable Region und eine humane konstante Region aneinandergrenzen. Die schweren und leichten chimären Ketten sind unter Bildung eines Moleküls mit einer funktionellen Antigen-Bindungsregion assoziiert.
Die chimären Immunglobuline können monovalent, divalent oder polyvalent sein. Monovalente Immunglobuline sind Dimere (HL), die aus einer schweren chimären Kette (H) bestehen, die mit einer leichten chimären Kette (L) verbunden ist (durch Disulfidbrücken). Divalente Immunglobuline sind Tetramere (H&sub2;L&sub2;), die aus zwei assoziierten Dimeren gebildet werden. Polyvalente Antikörper können zum Beispiel durch Verwendung von konstanten Regionen schwerer Ketten, die aggregieren (z.B. die konstanten Regionen des mu-Typs) hergestellt werden.
Die chimären Immunglobuline können als Antigen-Bindungsfragmente hergestellt werden. Fragmente wie Fv, Fab, Fab' oder F(ab')&sub2; können durch Verwendung der konstanten Regionen der in geeigneter Weise verkürzten schweren Kette hergestellt werden.
Die variablen Regionen der chimären Immunglobuline stammen aus nichthumanen Immunglobulinen mit der gewünschten Virusspezifität und den Virus-neutralisierenden Eigenschaften. In bevorzugten Ausführungsformen neutralisiert das antivirale Stamm-Immunglobulin verschiedene Arten, Stämme und Isolate eines Virus. Dies bietet durch Kreuzreaktivität Schutz gegenüber Viren verschiedener Arten, Stämme und Isolate, die in viralen Populationen vorkommen.
Wichtige pathogene Viren, für die Virus-neutralisierende chimäre Antikörper hergestellt werden, sind HIV, humanes T-Zell lymphotropes Virus I (ein ursächlicher Erreger der T-Zell-Leukämie bei Erwachsenen) und das Hepatitis B-Virus.
Die HIV-neutralisierenden Immunglobuline sind nachstehend beschrieben. Diese HIV-neutralisierenden Antikörper reagieren speziell mit dem Glykoprotein gp 120 von HIV-1; sie hemmen die Infektion von T-Zellen durch freie Virionen und die Infektion von T-Zellen durch Fusion mit HIV-infizierten Zellen. Die Antikörper sind vorzuziehen, weil sie wegen ihrer Kreuzreaktivität verschiedene Stämme und Isolate von HIV-1 neutralisieren. Zum Beispiel wird der Antikörper BAT123 wegen seiner neutralisierenden Aktivität und seiner Kreuzreaktivität mit den Stämmen speziell bevorzugt. Der BAT123-Antikörper hemmt in einem neuntägigen Test mit einer IC&sub5;&sub0; von unter 10 ng/ml die Infektion einer empfänglichen humanen T-Zelllinie, H9, durch HTLV-III-B-Stämme in 20facher TCID&sub5;&sub0;. Der Antikörper hemmt auch einige andere clonierte HIV-1-Stämme und die in vitro-Replikation breiter, frisch isolierter Feld-HIV-1-Proben aus Patienten.
Die konstante Region der schweren Kette für die chimären Immunglobuline kann aus jedem der fünf Isotypen alpha, delta, epsilon, gamma oder mu ausgewählt werden. Schwere Ketten verschiedener Subklassen (wie die IgG-Subklassen 1-4) können verwendet werden. Die verschiedenen Klassen und Subklassen schwerer Ketten sind an verschiedenen Effektorfunktionen beteiligt und so, durch Auswahl der Art der konstanten Region der schweren Kette, können chimäre Antikörper mit erwünschter Effektorfunktion hergestellt werden. Die leichten Ketten können entweder eine konstante Kappa- oder Lambda- Kette aufweisen.
Die erfindungsgemäßen chimären Immunglobuline werden durch Techniken der Gentechnologie hergestellt. Geeignete Empfängerzellen werden mit Nucleinsäurekonstrukten, vorzugsweise DNA, die die gewünschte leichte oder schwere Chimärkette codiert, transfiziert. Im allgemeinen umfassen DNA-Konstrukte jeder der Bestandteile der leichten und schweren Kette des chimären Immunglobulins ein fusioniertes Gen, das ein erstes DNA-Segment umfaßt, das mindestens den funktionellen Teil der variablen Region codiert, die an ein zweites DNA-Segment gebunden ist, das mindestens einen Teil der konstanten Region codiert. Das fusionierte Gen wird zur Transfektion der geeigneten Empfängerzellen in einem Expressionsvektor zusammengebaut oder in einen solchen inseriert.
In bevorzugten Ausführungsformen umfaßt das fusionierte Genkonstrukt ein funktionell rearrangiertes Gen, das eine variable Region einer Kette eines Virus-neutralisierenden Immunglobulins codiert, das an ein eine konstante Region einer Immunglobulinkette codierendes Gen gebunden ist. Das Konstrukt schließt auch den endogenen Promotor und den Verstärker ("Enhancer") für das codierende Gen der variablen Region ein. Zum Beispiel können die codierenden Gene für die variable Region als DNA-Fragmente, umfassend das Leaderpeptid, das VJ-Gen (funktionell rearrangierte variable (V)-Regionen mit dem verbindenden (J)-Segment) für die leichte Kette oder das VDJ-Gen für die schwere Kette und den endogenen Promotor und Verstärker für diese Gene, erhalten werden. Diese Gene für die variable Region können aus den Antikörper-produzierenden Zellen erhalten werden, die den gewünschten Virus-neutralisierenden Antikörper durch standardisierte DNA- Clonierungsverfahren produzieren. Siehe Molecular Cloning: A Laboratory Manual. T. Maniatis et al. Cold Spring Harbor Laboratory (1982). Das Absuchen der Genombank auf die funktionell wiederhergestellte Region kann unter Verwendung geeigneter DNA-Sonden erzielt werden, wie DNA-Segmente, enthaltend die DNA-Sequenzen der J- Region der Mäuse-Keimlinie und die Sequenzen stromabwärts. Die Identifizierung und Bestätigung der richtigen Clone werden dann durch DNA-Sequenzieren der clonierten Gene und Vergleich der Sequenz mit der entsprechenden Sequenz der mRNA voller Länge, die korrekt gespleißt ist, erzielt. Das DNA-Fragment, enthaltend das Gen der funktionell wiederhergestellten variablen Region, ist an ein DNA-Fragment gebunden, enthaltend das Gen, das die gewünschte konstante Region (oder einen Teil davon) codiert.
Gene, die die leichten und schweren Ketten des Antikörpers codieren, können im allgemeinen aus Immunglobulin-produzierenden lymphatischen Zellen gewonnen werden. Hybridzelllinien, die einen Antikörper gegen ein gewünschtes Virus produzieren, können durch Standardverfahren hergestellt werden. Siehe Koprowski et al., U.S.-Patent Nr. 4 196 265. Im allgemeinen umfassen diese die Exposition eines Tieres gegenüber einem Virus oder einem gereinigten oder teilweise gereinigten viralen Antigen, die Fusion der aus dem immunisierten Tier stammenden Antikörper-produzierenden Zellen mit kompatiblen Myelomzellen zur Bildung von Hybridzellen, die Clonierung der so erhaltenen Hybridzellen und das Auswählen der Clone, die Antikörper gegen das Virus produzieren. Die Hybridomclone können auf die Produktion von Virus-neutralisierenden Antikörpern durch Tests auf die neutralisierende Aktivität für das spezielle Virus abgesucht werden. Zum Beispiel werden hier mehrere in vitro-Tests auf die HIV- neutralisierende Aktivität beschrieben.
Konstante menschliche Regionen können aus den Antikörperproduzierenden Zellen mittels standardisierter Gen- Clonierungstechniken gewonnen werden. Gene für die zwei Klassen menschlicher leichter Ketten und die fünf Klassen menschlicher schwerer Ketten sind cloniert worden und auf diese Weise sind konstante Regionen menschlichen Ursprungs aus diesen Clonen leicht verfügbar. Chimäre Immunglobulinfragmente, wie die monovalenten Fv, Fab oder Fab'-Fragmente oder das divalente F(ab')&sub2;-Fragment, können durch Konstruktion eines Gens der chimären schweren Kette in verkürzter Form hergestellt werden. Zum Beispiel wurde ein chimäres Gen, das eine F(ab')&sub2;-schwere Kette codiert, DNA-Sequenzen, die die CH&sub1;-Domäne und mindestens den Sulfhydryl-enthaltenden Teil der Gelenk- ("Hinge"-)Region der schweren Kette codiert, enthalten.
Die fusionierten Gene, die entweder die leichten oder schweren Ketten codieren, werden zusammengebaut oder in Expressionsvektoren zum Einbau in eine Empfängerzelle inseriert. Geeignete Vektoren für die chimären Genkonstrukte umfassen Plasmide der Typen pBR322, pEMBL und pUC. Die Einführung der Genkonstrukte in Plasmidvektoren kann durch standardisierte Verfahren erzielt werden.
In bevorzugten Ausführungsformen ist der Expressionsvektor so gebaut, daß er zwei selektierbare genetische Marker enthält, einen zur Selektion in einem prokaryotischen (bakteriellen) System und der andere zur Selektion in einem eukaryotischen System. Die Fusionsgene können hergestellt und in einem bakteriellen System amplifiziert werden und in der Folge in eukaryotische Zellen eingebaut und selektiert werden. Beispiele für selektierbare Gene für ein prokaryotisches System sind das Gen, das die Ampicillinresistenz verleiht, und das Gen, das die Chloramphenicolresistenz verleiht. Zwei Gene für die Selektion eukaryotischer Transfektanten sind bevorzugt, (i) das Xanthinguaninphosphoribosyl-Transferasegen (mit gpt bezeichnet) und (ii) das Phosphotransferasegen aus Tn5 (mit neo bezeichnet). Eine Selektion mit gpt beruht auf der Fähigkeit des von diesem Gen codierten Enzyms, Xanthin als Substrat für die Purinnucleotidsynthese zu verwenden; das analoge endogene Enzym kann es nicht. In einem Medium, das Xanthin und Mycophenolsäure enthält, das die Umwandlung von Inosinmonophosphat in Xanthinmonophosphat blockiert, können nur Zellen, die das gpt-Gen exprimieren, überleben. Das Produkt von neo blockiert die Hemmung der Proteinsynthese in eukaryontischen Zellen, die durch das Antibiotikum G418 und andere Antibiotika ihrer Klasse ausgelöst werden.
Die chimären Gene der leichten und schweren Kette können in zwei verschiedene Expressionsvektoren eingebracht werden, die zur Cotransfektion einer Empfängerzelle verwendet werden können. In diesem Fall ist jeder Vektor so konstruiert, daß er ein unterschiedliches selektierbares Gen für die eukaryotischen Transfektanten hat. Dies erlaubt die Cotransfektion der Empfängerzelle und die Selektion der cotransfizierten Zellen (d.h. Zellen, die beide Vektoren erhalten haben). Die Selektion der cotransfizierten Zellen wird durch Selektion auf beide selektierbaren Marker durchgeführt, was gleichzeitig oder nacheinander geschehen kann.
Empfängerzelllinien sind im allgemeinen lymphatische Zellen. Die bevorzugte Empfängerzelle ist ein Myelom. Myelome können Immunglobuline, die von transfizierten Genen codiert werden, synthetisieren, zusammenbauen und sezernieren und sie können ein Protein glykosylieren. Eine speziell bevorzugte Empfängerzelle ist das Myelom Sp2/0, das normalerweise kein endogenes Immunglobulin produziert. Wenn sie einmal transfiziert ist, wird die Zelle nur Immunglobulin produzieren, das von den transfizierten Genkonstrukten codiert wird. Transfizierte Myelome können in Kultur oder im Peritoneum von Mäusen gezüchtet werden, wo sezerniertes Immunglobulin aus der Ascitesflüssigkeit gewonnen wird. Andere lymphatische Zellen wie B-Lymphocyten oder Hybridome können als Empfängerzellen verwendet werden.
Es gibt mehrere Verfahren zur Transfektion von lymphatischen Zellen mit Vektoren, die Chimärgene der L- und H-Ketten enthalten. Ein bevorzugter Weg, einen Vektor in lymphatische Zellen einzuführen, ist das Calciumphosphat-Präzipitationsverfahren, das von Graham und van der Eb, Virology 52 (1973):456, beschrieben ist. Ein anderer Weg ist durch Elektroporation. Bei diesem Verfahren werden Empfängerzellen in Gegenwart der in die Zelle einzubauenden DNA einem elektrischen Puls unterworfen. Siehe z.B., Potter, et al. PNAS 81 (1984):7161. Ein weiterer Weg, DNA einzuführen, ist durch Protoplastenfusion. Ein Lysozym wird zur Verdauung der Zellwände von Bakterien, die den rekombinanten Vektor mit dem Gen der Chimärkette enthalten, zur Herstellung von Sphäroplasten verwendet. Die Sphäroplasten werden mit den lymphatischen Zellen in Gegenwart von Polyethylenglycol fusioniert. Nach der Protoplastenfusion werden die Transfektanten selektiert und isoliert. (Oi, et al.PNAS 80 (1983):825). Schließlich kann auch das von Cullen, et al. Nature 307 (1984):241 beschriebene DEAE-Dextranverfahren angewendet werden.
Die erfindungsgemäßen Virus-neutralisierenden chimären Immunoglobuline können für die antivirale Therapie und Prophylaxe verwendet werden. Eine direkte in vivo-Behandlung mit den erfindungsgemäßen chimären Immunglobulinen erfordert ihre interne Verabreichung, vorzugsweise als intravenöse Injektion in einem pharmazeutisch verträglichen Träger, wie einer sterilen Salzlösung. Die Antikörper können in Verbindung mit anderen anti-viralen Mitteln verabreicht werden.
Eine Variante der Immuntherapie ist der Schutz durch passive Immunisierung. Dabei wird der Antikörper Personen, die in Gefahr sind, sich durch eine Virusinfektion anzustecken, zum Schutz gegen die Infektion verabreicht.
HIV-neutralisierende chimäre Immunglobuline können zur Behandlung von AIDS-Patienten oder Personen, die HIV-Träger sind, verwendet werden. Wie vorstehend erwähnt, sind chimäre Immunglobuline (der Erfindung, zum Beispiel aus HIV-neutralisierenden Immunglobulinen wie BAT123 gebildet) in der Lage, verschiedene Stämme und Isolate von HIV-1 zu neutralisieren. Darüber hinaus können diese Immunglobuline die Übertragung des Virus durch Syncytienbildung hemmen. Die chimären Immunglobuline können zur Senkung der viralen Belastung in einem AIDS- Patienten und zur Verzögerung des weiteren Fortschreitens der Krankheit verabreicht werden. Die Immunglobuline können in Verbindung mit anderen anti-AIDS-Mitteln wie AZT verabreicht werden. Zusätzlich können mehrere verschiedene HIV-neutralisierende chimäre Immunglobuline zusammen verabreicht werden.
In bestimmten Patientenpopulationen kann die passive Immunisierung mit den HIV-neutralisierenden chimären Immunglobulinen geeignet sein. Bei diesem Verfahren werden Patienten, die asymptomatisch (noch keine Symptome von AIDS und ARC zeigen) oder seronegativ, aber in einer Hochrisikogruppe sind, zur Hemmung der Infektion behandelt. Die Zielgruppen umfassen Feten von HIV-1-tragenden Müttern oder Babies, die von diesen geboren werden, und medizinisches Personal, die mit AIDS-Patienten oder Blutprodukten arbeiten, wie Zahnärzte und Schwestern.
Die Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele erläutert.

Beispiel I: Herstellung der Hybridome und monoclonalen Antikörper

a) Herstellung des Virus

Zur Aufrechterhaltung eines Vorrats an inaktiviertem HIV-1 wurde ein Virusstammpräparat wie folgt hergestellt. Die H9-Clone der HT- Zelllinie (die durch M. Robert-Guroff et al. in Nature 316: 72-74, a.a.O. beschrieben sind) wurden in Kultur gehalten. Diese H9-Zellen wurden mit HIV-1 (HTLV IIIB) infiziert, was ein Geschenk von Dr. R. Ting, Biotech Research Laboratory, Rockville, Maryland, war. Das Halten der infizierten H9-Zellen in Kultur erlaubt den Zellen, sich zu reproduzieren und fortwährend einen Vorrat an HIV-1 zu synthetisieren. Die H9-Zellen wurden in einem Wachstumsmedium von 20% FBS (hitzeinaktiviert)-RPMI 1640, ergänzt durch 5mM L-Glutamin, 5 mM HEPES, 50 Einheiten/ml Penicillin und 50 mg/ml Streptomycin, gezüchtet.
Gereinigtes HIV-1 wurde zuerst durch 10minütige Zentrifugation der Zellkultur bei 1000 g zur Entfernung der Zellen und der Zelltrümmer gewonnen. Der Überstand wurde dann eine Stunde bei 90 000 g zentrifugiert. Das Viruspellet wurde in einem Minimalvolumen phosphatgepufferter Kochsalzlösung, pH 7,4, resuspendiert und auf ein Zentrifugenröhrchen mit einem vorgeformten Saccharosegradienten (20% - 60%) geladen. Die Probe wurde dann sechzehn Stunden bei 100 000 g zentrifugiert. Das Virus wurde bei einem Gradienten von 38% gesammelt. Das Virus wurde dann aliquotiert und, nach Messen des Proteingehalts bei -80ºC eingefroren.

b) Immunisierungsverfahren

Männliche Balb/c-Mäuse wurden für die Immunisierung verwendet. Jede Maus erhielt 100 ug des inaktivierten HIV-1. Die Inaktivierung des Virus wurde gemäß dem vom FDA genehmigten Protokoll durch UV- Bestrahlung und Zusetzen eines Detergens, Nonidet P-40 (0,1%), durchgeführt. Ein Suspensionsvolumen mit 100 ug Virus pro Maus wurde in 200 ul phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) suspendiert und mit gleichem Volumen kompletten Freundschem Adjuvans emulgiert.
Jede Maus wurde subkutan mit 100 ug des emulgierten Virus immunisiert. Die Mäuse erhielten Injektionen an Stellen mit hohen Konzentrationen an Lymphknoten, zum Beispiel an der Beuge zwischen Rumpf und Gliedmaßen. Ein Monat später erhielten die Mäuse an den gleichen Stellen mit der gleichen Menge an Virus subkutane Boosterinjektionen. Die Boosterpräparate wurden im wesentlichen auf die gleiche Weise wie die erste Injektion hergestellt, außer daß die Emulgierung für die Boosterpräparate in komplettem Freundschem Adjuvans durchgeführt wurde.
Ein Monat später wurde jede Maus subkutan mit 100 ug von in PBS suspendiertem Virus reimmunisiert. Jede Maus wurde subkutan an der Beuge zwischen Rumpf und Gliedmaßen und intraperitoneal injiziert. Drei Tage nach der letzten Injektion wurden die Mäuse getötet und ihre Milzen entfernt. Die Milzzellen wurden dann mit Myelomzellen durch das folgende Verfahren fusioniert.

c) Fusion

Suspensionen, die Milzzellen zu Myelomzellen im Verhältnis funf zu eins enthielten, wurden hergestellt. Die ausgewählten Myelomzellen waren NS-1. Die NS-1-Zellen wurden so konditioniert, daß sie sich etwa alle siebzehn Stunden verdoppelten. Sie wurden in der log-Phase zur Fusion verwendet. Die NS-1-Zellen wurden auf bakteriologischen Platten (100 mm) in einer Konzentration von 6 x 10&sup4; Zellen/ml in 10 ml Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), enthaltend 5% fetales Rinderserum (FBS), 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 Mikrogramm/ml Streptomycin, subkultiviert. Das Medium wurde alle drei Tage gewechselt. In einer anderen Ausführungsform wurden die Zellen in einer Konzentration von 1,54 x 10&sup5; Zellen/ml in 10 ml des gleichen Mediums subkultiviert und das Medium alle zwei Tage gewechselt.
Die Milzzellen wurden durch Aufbringen der Milz auf eine bakteriologische Platte (100 mm) und Injektion von 20 ml Calcium- Magnesium-freiem PBS (CMF-PBS) in beide Enden der Milz zum Ausspülen der Milzzellen gewonnen. Die ausgespülten Milzzellen wurden dann in ein 50 ml-Zentrifugenröhrchen verbracht.
Die Milzzellen wurden fünf Minuten bei 400 g zentrifugiert und dann 10 Minuten in 5 ml 0,83% NH&sub4;Cl (0,155 M) bei Raumtemperatur zur Lyse der Erythrocyten suspendiert. 5 ml CMF-PBS wurden dem Röhrchen zur Beendigung der Lyse zugesetzt. Die Zellen wurden dann pelletiert und in 10 ml CMF-PBS resuspendiert.
Die Konzentration an Lymphocyten wurde durch Zusetzen von 40 Mikroliter Zellsuspension zu 10 ml Salzlösung zusammen mit 3 Tropfen Zap-oglobin bestimmt. Die Zahl der Lymphocyten wurde mit einem Hämocytometer gezählt und aus diesem Wert wurde die Konzentration der Zellen bestimmt. Die Konzentration wurde dann mit dem Verdünnungsfaktor 250 multipliziert, wobei die aktuelle Konzentration an Zellen in der Suspension erhalten wurde.
Die NS-1-Zellen wurden von fünf der bakteriologischen Platten (100 mm) in ein 50 ml-Zentrifugenröhrchen verbracht. Die Zellkonzentration wurde mittels der vorstehend beschriebenen Zähltechnik bestimmt. 5 x 10&sup7; der NS-1-Zellen wurden dann in 10 ml CMF-PBS suspendiert und mit 2,5 x 10&sup8; Milzzellen in einem 50 ml-Zentrifugenröhrchen gemischt.
Die Zellen wurden zentrifugiert und einmal mit 10 ml CMF-PBS gewaschen. Der Überstand wurde so weit wie möglich mit einer Glas- Pasteur-Pipette abgesaugt. Das Röhrchen wurde vorsichtig geschüttelt, um das Zellpellet freizusetzen.
Vor dem Gewinnen der Zellen war ein Fusionsgemisch, wie folgt, hergestellt worden. 5 g Polyethylenglycol 1450 (von Kodak) waren mit 5 ml CMF-PBS und 0,5 ml DMSO gemischt worden. Dieses Gemisch wurde dann zum Schmelzen auf 56ºC erwärmt, bis zu einem End-pH von 7,0 titriert und durch ein 0,22 Mikron-Milliporefilter zur Sterilisation filtriert. Aliquots von 1,0 ml waren den Gefrierröhrchen zugesetzt worden, und diese waren bei -70ºC aufbewahrt worden.
Zur Herstellung des gebrauchsfertigen Fusionsgemischs wurde eines der Aliquots in den Gefrierröhrchen durch Erhitzen auf 37ºC geschmolzen. Unabhängig davon wurde ein Röhrchen mit 1 ml DMEM (ohne Serum) auf 37ºC erhitzt.
Das 1,0 ml-Aliquot des Polyethylenglycolfusionsgemisches wurde der Zellsuspension zugesetzt und die Suspension wurde gut gemischt. Fünfundvierzig Sekunden nach der Zugabe des Polyethylenglycolfusionsgemisches wurden 2,0 ml des vorher erhitzten DMEM (ohne Serum) tropfenweise unter Mischen zugesetzt. Die übrigbleibenden 8 ml des vorher erhitzten DMEM (ohne Serum) wurden dann zugesetzt. Die Zellen wurden 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen.
2,0 ml FBS wurden der Suspension zugesetzt und die Suspensionen wurden gut gemischt. Die Kombination aus FBS und DMB-PBS kann das Anheften von Zellen an die Wände des Teströhrchens vermeiden helfen. Die Suspensionen wurden dann vier Minuten bei 400 g zentrifugiert. Nachdem sie zentrifugiert worden waren, wurden die Zellen in 116 ml modifiziertem Medium, ergänzt mit 5% FBS, 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 Mikrogramm/ml Streptomycin und Littlefield's Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT), suspendiert.
Die Konzentration der Zellsuspension wurde auf 3,3 x 10&sup5; Milzzellen pro 200 Mikroliter Suspension eingestellt. 200 Mikroliter Aliquots der Suspension wurden dann auf jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen verteilt. Nachem siebzehn solcher Platten hergestellt worden waren, wurden die Platten in einen Inkubator verbracht und bei 37ºC in 5% CO&sub2; aufbewahrt.
Die Zellen wurden sieben Tage auf den Platten gezüchtet, dann wurde das Wachstumsmedium entfernt und neues Medium zugesetzt. Vier Tage danach wurde das Medium erneut gewechselt. Vier Tage später wurden die Antikörper einem "Enzyme linked immunosorbent assay" (ELISA) in den Vertiefungen unterworfen, zur Bestimmung, welcher an das gp 120- Protein von HIV-1 binden wurde. Der ELISA wurde wie folgt durchgeführt.

d) ELISA-Verfahren

Gereinigtes gp 120-Protein wurde wie in W.G. Robey, "Prospect for Prevention of Human Immunodeficiency Virus Infection: Purified 120-kD Envelope Glycoprotein Induces Neutralizing Antibody", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: (1986): 7023-27 beschrieben, hergestellt. 50 ul einer gp 120-Suspension (in einer Konzentration von 0,1 bis 1,0 ug/ml) wurden den Vertiefungen von Immulon I-Platten mit 96 Vertiefungen mit einer Zwölf-Kanal-Pipette zugesetzt. Die Platten wurden abgedeckt und achtzehn Stunden bei 4ºC inkubiert, um dem Protein zu ermöglichen, an die Platte zu binden.
Der flüssige Inhalt der Platten wurde dann entfernt und 200 ul 0,1 M NH&sub4;Cl wurden jeder Vertiefung zur Absättigung aller restlichen Bindungsstellen auf den Platten zugesetzt. Die NH&sub4;Cl-Lösung wurde dreißig Minuten bei Raumtemperatur in den Vertiefungen stehengelassen. Die NH&sub4;Cl-Lösung wurde dann entfernt und die Vertiefungen dreimal mit PBS und 0,05% Tween 20 gewaschen. Ein Rest der PBS/0,05% Tween 20- Lösung wurde in den Vertiefungen gelassen, bis die nachstehend beschriebene Antikörpersuspension zugesetzt wurde.
50 ul des Überstands der Zellfusion aus jeder Vertiefung der siebzehn Platten mit 96 Vertiefungen wurden jeder der Vertiefungen auf den Immulon I-Platten zugesetzt und eine Stunde inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Platten dreimal mit PBS/0,05% Tween 20 zur Entfernung jedes ungebundenen Antikörpers gespült.
Der Überstand der Zellfusion enthält den Antikörper, der von verschiedenen Hybridomen in den Platten mit den 96 Vertiefungen produziert wird. Der Antikörper, der spezifisch für gp 120 ist, bindet daran. Insofern das gp 120 an die Immunlon I-Platte gebunden ist, wird der für gp 120 spezifische Antikörper auch an die Platte gebunden werden.
Die nächste Stufe besteht darin, den Marker, der die Menge an gebundenem Antikörper in jeder Vertiefung anzeigt, zuzusetzen. Der ausgewählte Marker war Meerrettich-Peroxidase. Dieser Marker wurde mit Ziegen-anti-Maus-IgG konjugiert, so daß Peroxidase-konjugiertes Ziegen-anti-Maus-IgG erhalten wurde. Das Ziegen-anti-Maus-IgG bindet an jeden monoclonalen Antikörper der Maus, der an die Platte gebunden ist.
Der Peroxidase-Marker kann dann zur Bestimmung der Menge des gebundenen Antikörpers durch eine Enzymreaktion aktiviert werden.
Der Marker wurde durch Zusetzen von 100 Mikroliter Peroxidase- konjugiertem Ziegen-anti-Maus-IgG, das in einer Konzentration von 1:1000 in PBS/0,05% Tween 20 und 1% BSA verdünnt war, zugesetzt. Die Platten wurden eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden die Platten dreimal mit PBS/0,05% Tween 20 zur Entfernung jedes ungebundenen Ziegen-anti-Maus-IgG-Konjugats gewaschen.
Der nächste Schritt besteht darin, den Peroxidase-Marker, der an das Ziegen-anti-Maus-IgG konjugiert ist, zu aktivieren. Dies geschieht durch Zusetzen von 200 Mikroliter 3', 3', 5', 5'-Tetramethylbenzidin- Substratlösung zu jeder Vertiefung und 30minütige Inkubation bei Raumtemperatur. Die Farbreaktion wird durch Zusetzen von 50 Mikroliter 2,0 M H&sub2;SO&sub4; gestoppt. Die Farbintensität wurde mit einem ELISA- Ablesegerät bei 450 nm bestimmt. Die Menge an gp 120-spezifischem Antikörper ist proportional zur Intensität der Farbe.
Es wurde herausgefunden, daß ungefähr 200 Vertiefungen in den Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen zumindest bis zu einem gewissen Grad an gp 120 gebundene Antikörper produzierten. Von diesen 200 Vertiefungen wurden die 39, die Antikörper produzierten, die höchste Farbintensität ergaben, für einen weiteren Absuchschritt ausgewählt.

e) Immunfluoreszenztest mittels lebender T-Zellen

Ein Immunfluoreszenztest wurde zur Bestimmung, ob irgendeiner der Antikörper, die mit gp 120 im ELISA reagierten, spezifisch an lebende HIV-1-infizierte H9-Zellen binden wurde, durchgeführt. Die H9- Zelllinie ist permissiv für eine persistente Infektion durch HIV-1. Diese Zelllinie wurde von der American Type Culture Collection in Rockville, Maryland, erhalten. Der Antikörper, der an infizierte Zellen bindet, aber nicht an nicht-infizierte Zellen, ist wahrscheinlich für eine Domäne des HIV-1-Hüllproteins auf der extrazellulären Seite der Zellmembran selektiv. Der Immunfluoreszenztest hilft, solche mit gp 120 reaktiven Antikörper zu selektieren, die ein hohes Potential für die Erkennung der Neutralisierungsepitope auf dem HIV-1-Virion und die Hemmung der Syncytienbildung durch infizierte T-Zellen aufweisen.
Kulturen von infizierten H9-Zellen wurden, wie vorstehend unter der Überschrift "Herstellung des Virus" beschrieben, erhalten. Das Verfahren, mittels dessen der Test durchgeführt wurde, ist nachstehend beschrieben.

(i) Testverfahren

50 ul Aliquots der infizierten H9-Zellsuspension in einer Konzentration von 5 x 10&sup6; Zellen/ml wurden jedem der neunundreißig 1,5 ml-Mikrofugeröhrchen zugesetzt. 50 ul-Aliquots des Überstands aus den 39 Vertiefungen, enthaltend die im ELISA positiven Clone, wurden dann jedem Röhrchen zugesetzt. Die Antikörper in dem Überstand, die mit H9- Zellen reagieren, binden an alle H9-Zellen im Röhrchen.
Die Röhrchen wurden dann dreißig Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Röhrchen zentrifugiert, der Überstand entfernt und die Zellen dreimal mit einem Gemisch aus RPMI 1640, enthaltend 2% fetales Kälberserum und 0,1% Natriumazid, gewaschen.
Die Röhrchen wurden dann geschüttelt, wobei das Zellpellet freigesetzt wurde.
10 ul markierter Antikörper, nämlich Ziegen-anti-Maus-IgG, konjugiert an Fluorescein-Isothiocyanat (FITC), wurde jedem Teströhrchen in einer Verdünnung von 1 zu 200 zugesetzt. Dieser markierter Antikörper bindet an alle monoclonalen Antikörper, die an HIV-1-infizierte H9-Zellen gebunden haben und stellt ein Mittel zur Identifizierung dieser monoclonalen Antikörper bereit.
Die Röhrchen wurden wieder dreißig Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Röhrchen wurden zentrifugiert und die Zellen mit dem gleichen Medium wie zuvor gewaschen. Die Zellen wurden dann in PBS resuspendiert, auf einzelne Objektträger aufgebracht und mit einem Deckglas versehen. Die Zellen wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet.
Zur Bestimmung, welche der neununddreißig ausgewählten Vertiefungen Antikörper enthielten, die an nicht-infizierte H9-Zellen banden, wurde ein im wesentlichen identisches Verfahren wie vorstehend beschrieben durchgeführt, wobei man stattdessen infizierte H9-Zellen verwendete.

(ii) Ergebnisse

Sieben der neununddreißig getesteten Vertiefungen enthielten Clone, die monoclonale Antikörper produzierten, die an lebende infizierte H9- Zellen, aber nicht an nicht-infizierte H9-Zellen binden. Das heißt, wenn man Antikörper aus diesen sieben Vertiefungen verwendet, fluoreszierten die infizierten Zellen, aber nicht die nichtinfizierten Zellen.
Zellen und Antikörper aus den sieben Vertiefungen, die Clone enthielten, die in der Immunfluoreszenz positiv waren, wurden gesammelt. Diese Hybridome und Antikörper sind bei der American Type Culture Collection in Rockville, Maryland hinterlegt worden und sind für die Inspektion durch das Patent- und Warenzeichenamt während der Anhängigkeit dieser Anmeldung verfügbar.

f) Clonieren einzelner Zellen

Zellsuspensionen aus jedem der neununddreißig ELISA-positiven Vertiefungen wurden in den Vertiefungen einer Platte mit vierundzwanzig Vertiefungen vermehrt. Nach fünftägigem Wachstum in der Platte mit vierundzwanzig Vertiefungen erwies sich die Zellsuspension aus den sieben gepesteten Vertiefungen als immunreaktiv gegenüber infizierten H9-Zellen, die auf dreißig, fünfzig und einhundert Zellen pro Milliliter verdünnt worden waren. 0,1 ml der verdünnten Zellsuspensionen (die im Durchschnitt drei, fünf bzw. zehn Clone enthielten) wurden in die Vertiefungen einer Platte mit sechsundneunzig Vertiefungen gebracht. Die Vertiefungen waren zuvor mit Histon beschichtet worden.
Nachdem jede Zelle bis zu einer Kolonie heranwuchs, wurden die Zellen unter dem Mikroskop untersucht. Die Zellen keiner Kolonie bewegten sich und bildeten Satellitenkolonien. Der Clon aus einer einzelnen Zelle aus jedem der sieben Clone, der die stärkste Reaktivität im ELISA und der Immunfluoreszenz zeigte, wurde ausgewählt und in Kultur vermehrt.

g) Natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) und Westernblotverfahren

Bei der Western-Blot-Analyse wird das Virus in seine Proteinbestandteile solubilisiert. Die Clone, die monoclonale Antikörper produzieren, die an das äußere Hüllprotein von HIV-1 (gp 120) binden, sind die erwünschten. Das Verfahren ist nachstehend beschrieben.
30 Mikrogramm HIV-1 wurden durch fünfminütiges Erhitzen in einem Probenpuffer (der 2% SDS und 5% Beta-Mercaptoethanol enthielt) bei 100ºC solubilisiert. Er wurde dann auf ein 12%iges, 1,5 mm dickes Plattengel aufgetragen. Das Gel wurde dann 8 Stunden bei Raumtemperatur einer konstanten Spannung von 35 mV ausgesetzt. Das Verfahren ist in "Procedure for Preparation of Gels for Western Blot Detection of HTLV-III Antibodies" beschrieben, das von Biotech Research Laboratories, Inc., Rockville, Maryland veröffentlicht wurde. Die Proteinbanden wurden auf ein Nitrocellulosepapier transferiert, indem ein Strom von 30 Volt (etwa 0,1 A) eingestellt und 16 Stunden bei Raumtemperatur belassen wurde. Am nächsten Morgen wurde die Spannung auf 60 Volt (etwa 0,2 A) erhöht und der Transfer 1-2 Stunden fortgesetzt, um den Transfer von gp 120 und gp 160 zu maximieren. Der Transferpuffer enthielt 24 g Tris-Base, 57,6 g Glycin und 800 ml Methanol. Wasser wurde zugesetzt, um die Lösung auf 4 Liter aufzufüllen.
Die Nitrocelluloseblätter wurden dann mit PBS/0,05% Tween 20 gespült und in eine Schale mit Blotto-Puffer gelegt. Die Schale wurde vorsichtig zwei Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Der Blotto- Puffer besteht aus 50 g fettfreier Trockenmilch, 1,0 g Entschäumer A (wahlweise), 0,1 g Merthiolat und genügend PBS zur Herstellung eines Endvolumens von 1,0 Liter. Der pH-Wert des Puffers wurde auf 7,0 eingestellt.
Die Nitrocelluloseblätter wurden dann in PBS/0,05% Tween 20 gespült und auf einem Papiertuch zwischen beschwerten Plexiglasplatten getrocknet. Die Nitrocelluloseblätter wurden dann in Streifen von 0,5 cm Breite geschnitten, die jeweils in der Reihenfolge numeriert wurden. Die Streifen können entweder sofort verwendet werden oder trocken und in der Dunkelheit bis zu einem Monat aufbewahrt werden. Die Streifen, die die gp 120-Bande tragen, werden beim nächsten Schritt verwendet.
Die Nitrocellulosestreifen mit gp 120 wurden dann behandelt, um die Bindung des monoclonalen Antikörpers an die Proteinbanden zu ermöglichen. Vierzig dieser Streifen wurden einzeln in einen bezeichneten Schlitz eines Schlitztabletts gebracht und 20 Minuten in PBS/0,35 Tween 20 voreingeweicht. Die Einweichlösung wurde in eine Clorox enthaltende Falle abgesaugt. Die Vertiefungen mit den Streifen wurden dann einmal mit PBS/0,05% Tween 20 gespült, die Schale mehrere Male geschüttelt und die Lösung abgesaugt.
Die Positivkontrolle bestand aus 2,0 ml Blotto-Puffer/4% Ziegenserum (das durch Mischen von 100 ml Blotto-Puffer und 4 ml hitzeinaktiviertem normalem Ziegenserum hergestellt wird), der einem Streifen zugesetzt wurde, danach wurden 10 Mikroliter hitzeinaktiviertes AIDS-Patientenserum der Vertiefung zugesetzt. 2,0 ml Überstand wurden aus jedem der neununddreißig Vertiefungen in den Mikrotiterplatten entfernt, die ELISA-positive Clone enthielten. Gemische wurden hergestellt, die aus 2,0 ml Überstand, 5% fettfreier Trockenmilch, 50 Mikroliter 1 M HEPES (pH 8,0) und Merthiolat bestanden.
Ein Aliquot der Suspension wurde jeder Vertiefung, die einen Streifen enthielt, zugesetzt. Das Gemisch wurde dann in eine Clorox enthaltende Falle abgesaugt. Die Vertiefungen mit den Streifen wurden dann einmal mit PBS/0,05% Tween 20 gewaschen, mehrere Male mit der Hand geschüttelt und mit Waschpuffer abgesaugt. Die Streifen wurden dann dreimal mit PBS/0,05% Tween 20 gewaschen, wobei man für jede Spülung fünf Minuten ansetzte.
Die Streifen reagierten dann mit den Färbereagenzien, die die Sichtbarmachung einer spezifischen Antikörperbindung an gp 120 erlauben. Das ausgewählte Reagenz war Meerrettich-Peroxidase. Dieses Reagenz zeigt Farbe, wenn es mit einem Substrat in Kontakt gebracht wird, das aus 10 ml PBS, pH 7,4, 2,0 ml Substratlösung und 4,0 Mikroliter 30% H&sub2;O&sub2; besteht. Die Substratlösung wird durch Lösen von 0,3 g 4-Chlor-1-napthol in 100 ml wasserfreiem Methanol hergestellt.
2,0 ml Blotto/4% Ziegenserum, enthaltend 1:100 verdünntes biotinyliertes Ziegen-anti-Maus-IgG, wurden dann jeder Vertiefung mit Streifen zugesetzt. Die Schalen wurden dreißig Minuten auf einem Schüttler inkubiert. Das Ziegen-anti-Maus-IgG-Konjugat bindet natürlich an jeden monoclonalen Antikörper, der an gp 120 auf einem Streifen gebunden hat.
Die Vertiefungen mit Streifen wurden dann einmal mit PBS/0,05% Tween 20 gespült und mehrere Male zur Entfernung überschüssigen Ziegen-anti- Maus-IgG-Konjugats mit der Hand geschüttelt. Der Waschpuffer wurde verworfen. Die Vertiefungen mit den Streifen wurden dann dreimal mit PBS/0,05% Tween 20 gewaschen. Jeder Waschschritt dauerte fünf Minuten.
2,0 ml Blotto/4% Ziegenserum, enthaltend 1:1000 verdünntes Meerrettich-Peroxidase-Avidin D-Konjugat, wurden jeder Vertiefung mit Streifen zugesetzt. Das Avidin in diesem Konjugat bindet an das Biotin im Ziegen-anti-Maus-IgG-Konjugat. Deshalb wird der Meerrettich- Peroxidase-Marker an das Ziegen-anti-Maus-IgG gebunden und markiert dadurch jeden gebundenen Antikörper. Nach Zusetzen des Konjugats wurden die Schalen dreißig Minuten bei Raumtemperatur auf einem Schüttler inkubiert.
Jede Vertiefung mit Streifen wurde dreimal mit PBS/0,05% Tween 20, fünf Minuten pro Waschung, dann einmal mit PBS gewaschen. 2,0 ml des verwendeten Enzymsubstrates wurden jeder Vertiefung zugesetzt und die Schalen wurden bei Raumtemperatur inkubiert, bis sich die Farbe entwickelte. Die verwendete Substratlösung enthielt 0,05% 4-Chlor-1- naphthol und 0,01% H&sub2;O&sub2; in Phosphatpuffer-Kochsalzlösung bei pH 7,4.

(iii) Ergebnisse

Wie vorstehend diskutiert, wurde die Western-Blot-Analyse unter Verwendung der Antikörper aus den neununddreißig im ELISA positiven Vertiefungen durchgeführt. Mit der Western-Blot-Analyse wurde herausgefunden, daß nur Antikörper aus sechs dieser neununddreißig Vertiefungen mit gp 120 reagierten. Alle sechs dieser Vertiefungen waren unter den sieben Vertiefungen, die im Immunfluoreszenztest als positiv befunden worden waren. So war nur einer dieser sieben Clone, die positiv in der Immunfluoreszenz waren, nicht auch in der Western- Blot-Analyse positiv.

h) Produktion und Reinigung der monoclonalen Antikörper

Zur Produktion großer Mengen erwünschter monoclonaler Antikörper wurde das folgende Verfahren durchgeführt.
Die sieben in der Immunfluoreszenz positiven Clone, die sich in den Vertiefungen in der zweiten Platte mit vierundzwanzig Vertiefungen befunden haben, wurden in einer 100 mm-Gewebekultur-Platte gezüchtet. Die vermehrte Kultur der selektierten sieben Einzelzellclone wurde dann getrennt in den Bauchraum der mit Pristan behandelten Mäuse unter Verwendung von fünf Millionen Zellen pro Maus injiziert. Nach sieben Tagen wurde die Ascitesflüssigkeit jeder Maus gewonnen und eingefroren.
Die monoclonalen Antikörper in der Ascitesflüssigkeit wurden wie folgt gereinigt. Die gefrorene Ascitesflüssigkeit wurde aufgetaut und durch ein Nylontuch zur Entfernung des viskösen Materials gefiltert. Genügend Phenylmethylsulfonylfluorid wurde der Ascitesflüssigkeit zugesetzt, so daß die Endkonzentration 0,1 mM war. 0,05 ml 1,2 M Acetatpuffer (pH 4,0) wurden pro Milliliter der Ascitesflüssigkeit zugesetzt. Die Endkonzentration des Acetatpuffers war 60 mM. Der pH- Wert wurde auf 4,5 eingestellt.
Für jeden Milliliter der behandelten Ascitesflüssigkeit wurden 25 ul Caprylsäure (M.G. 144,21, Dichte 0,91) tropfenweise unter starkem Rühren zugesetzt. Die Suspension wurde bei Raumtemperatur gehalten und kontinuierlich 30 Minuten weitergerührt.
Die Suspension wurde dann 10 Minuten bei 15 000 g zur Entfernung des Präzipitats zentrifugiert. Der Überstand, der IgG enthielt, wurde durch Zusetzen eines Volumens 1 M HEPES-Puffer (pH 8,0), das einem Zehntel des Volumens des Überstands entspricht, neutralisiert. Das IgG wurde dann mit 50% (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; präzipitiert. Das Präzipitat wurde dann in HEPES-Kochsalzlösungpuffer gelöst. Diese Lösung wurde über Nacht gegen HEPES-Kochsalzlösungpuffer zur Entfernung von ((NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; aus dem IgG dialysiert. Der HEPES-Kochsalzlösungpuffer wurde zweimal während der Dialyse gewechselt. Nach der Dialyse enthält der HEPES- Kochsalzlösungpuffer gereinigtes, gelöstes IgG. Das gereinigte IgG wurde in Infektiositätstests verwendet und in Syncytienbildungstests, die folgen.

Beispiel II: Bestätigung der erfindungsgemäßen Wirksamkeit

a) Neutralisationstest

Ein Test wurde zur Bestimmung der Wirksamkeit der erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper bei der Hemmung der Infektion von T-Zellen durch das HIV-1-Virion durchgeführt. Ein Vergleich wurde durchgeführt zwischen der Zahl der infizierten Zellen, wenn HIV-1 allein einer Zellkultur zugesetzt wurde, und der Zahl der infizierten, wenn HIV-1 und die erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper zugesetzt wurden. Die für den Neutralisationstest ausgewählten Zellen waren die H9-Clone der HT-Zelllinie.

i) Herstellung des Virus, Antikörpers und der Zellen

Die H9-Zellen wurden durch Waschen einer Zellkultur mit H9- Wachstumsmedium hergestellt. Das H9-Wachstumsmedium enthielt 20% FBS (hitze-inakiviert) in RPMI 1640, 5 mM L-Glutamin, 50 Einheiten/ml Penicillin, 50 mg/ml Streptomycin, und 5 mM HEPES. Die Zellen wurden dann bis zu einer Endkonzentration von 2 x 10&sup6; Zellen/ml resuspendiert. Die Suspension wurde dann mit 2 Mikrogramm/ml Polybren zwanzig Minuten in einem Wasserbad bei 37ºC inkubiert.
Nach der Inkubation wurden die Zellen sieben Minuten bei 700 g zentrifugiert. Der überstand wurde dann entfernt und die Zellen wurden in H9-Wachstumsmedium resuspendiert und zur Entfernung des Polybren wieder gewaschen. Die Zellen wurden dann bis zu einer Konzentration von 2 x 10&sup6; Zellen/ml im Wachstumsmedium resuspendiert.
Sechs der sieben Clone, die positiv in der Immunfluoreszenz waren, wurden zur Verwendung im Neutralisationstest ausgewählt. Die Antikörper aus dem gereinigten Ascites (wie vorstehend beschrieben) wurden durch Passage durch einen 0,22 Mikron-Millipore-Filter filtriert. Die Lösung wurde dann in H9-Wachstumsmedium verdünnt, wobei sich unterschiedliche Endkonzentrationen von 100, 10, 1, 0,1 und 0,01 Mikrogramm/ml ergaben.
Virus in einer Konzentration von 20 TCID&sub5;&sub0; oder des zwanzigfachen TCID&sub5;&sub0;-Wertes wurde bei der Infektion von H9-Zellen verwendet. Der TCID&sub5;&sub0;-Wert der Viruspräparation wurde in vorangegangenen Infektiositätstests unter den gleichen experimentellen Bedingungen bestimmt. Als Virustiter ist der Titer definiert, bei dem 50% der experimentellen Vertiefungen infiziert sind. 20 TCID&sub5;&sub0; waren ungefähr einer 4,72 x 10&supmin;&sup5;-Verdünnung des Virusstammpräparats äquivalent.
Bei den Infektiositätstests wurden 30 ul Virusssuspension und 30 ul jeder der Antikörperlösungen in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte bei 4ºC eine Stunde gemischt. Für jede Vertiefung wurde eine Doppelbestimmung durchgeführt. Die Platte wurde dann in einem Inkubator bei 37ºC und 5% CO&sub2; dreißig Minuten erwärmt. 30 ul der mit Polybren behandelten H9-Zellsuspensionen wurden dann jeder Vertiefung zugesetzt.
Die Mikrotiterplatten wurden dann eine Stunde bei 37ºC in einem Inkubator inkubiert. 110 ul des Wachstumsmediums wurden jeder Vertiefung zugesetzt, was ein Gesamtvolumen von 200 ul erbrachte. Die Platten wurden drei Tage inkubiert und das neue Wachstumsmedium wurde alle drei Tage ersetzt. Die Zellen wurden am dritten, sechsten, neunten und dreizehnten Tag gewonnen.
Das vorstehend beschriebene, identische Verfahren wurde auch unter Verwendung von monoclonalem Maus-Antikörper gegenüber menschlichem Gonadotropin (anti-HcG) anstatt einem der erfindungsgemäßen anti-HIV- 1-Antikörper durchgeführt. Die mit anti-HCG-Antikörper behandelten Zellen dienten als Negativkontrolle.

ii) Immunfluoreszenztest infizierter Zellen

100 ul Aliquots der am Tag 9 und 13 gewonnenen Zellsuspensionen wurden mit 3 ml PBS gewaschen. Die Zellsuspensionen wurden sieben Minuten bei 700 g zentrifugiert und wieder in PBS gewaschen. Die Zellen wurden schließlich in 50 ul PBS resuspendiert und 10 ul Suspension wurden auf einen Glasobjektträger punktförmig aufgetragen. Diese Suspensionen wurden luftgetrocknet und dann mit 1:1 Aceton/Methanol zehn Minuten fixiert, luftgetrocknet und vor dem Test bei - 20ºC aufbewahrt.
Bei dem Test wurden die fixierten Zellen in PBS zwanzig Minuten rehydratisiert und dann mit 5% normalen Ziegenserum in PBS weitere dreißig Minuten inkubiert. Nach dem Abtropfen des überschüssigen normalen Ziegenserums wurden die Zellen eine Stunde bei Raumtemperatur mit einem monoclonalen anti-p24-Antikörper (in einer Verdünnung von 1:100), enthaltend 2% normales Ziegenserum, inkubiert. Dieser Antikörper bindet spezifisch an das p24-Core-Protein von HIV-1. Die Objektträger wurden in einem Raumluftbefeuchter zur Vermeidung des Austrocknens gehalten. Nach der Inkubation wurden die Objektträger dreimal in PBS für eine Gesamtzeit von 30 Minuten gespült. Dann wurde das Fluorescein-konjugierte Ziegen-anti-Maus IgG (F(ab')&sub2;)-Fragment in einer Verdünnung von 1:20 zugesetzt. Die Objektträger wurden eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Objektträger wurden dann dreimal mit PBS dreißig Minuten gespült und fünf Minuten mit 0,5% Evansblue gegengefärbt, gewaschen und in Fluoromount G gebracht. Die Zellen wurden dann unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet.
Die Zahl der infizierten Zellen wurde bei einer Vergrößerung von 400x gezählt. Vier Punktwerte wurden von jedem Objektträger durch zufällige Stichproben über das Feld gewonnen.

iii) Ergebnisse

Die Ergebnisse sind graphisch in den Figuren 1 und 2 dargestellt, wobei der Prozentsatz der Zellen in der Immunfluoreszenz gegen die Antikörper-Konzentration in der Suspension aufgetragen ist. Die Ergebnisse in Figur 1 sind aus den am Tag 9 gewonnenen Zellen. In Figur 2 wurden die Zellen am Tag 13 gewonnen.
Wenn man die Figuren 1 und 2 betrachtet, kann man sehen, daß vier der sechs getesteten Antikörper (als BAT 123, 267, 509 und 085 bezeichnet) bei der Hemmung der Infektion wirksam waren. Insbesondere zeigte BAT123 fast vollständige Hemmung der Infektion am Tag 9. Dieses Ergebnis muß im Gegensatz zu dem anti-HcG-Antikörper der Negativkontrolle gesehen werden, der praktisch keine Hemmung zeigte. Fast 100% der mit anti-HcG behandelten Zellen waren in der Immunfluoreszenz positiv, unabhängig von der Konzentration des Antikörpers. Ein ähnliches Ergebnis wurde mit dem monoclonalen Antikörper BAT 496 erhalten, der mit gp 120 reagiert, aber keine Neutralisierungsaktivität zeigt. Aus diesem Grund wurde BAT 496 nicht am Tag 13 getestet und erscheint nicht in Figur 2.
Es sollte angemerkt werden, daß ein weiterer Antikörper, BAT401, auf Neutralisierung getestet wurde. Jedoch erscheinen die Ergebnisse nicht in den Figuren 1 und 2, weil er sich als weniger wirksam bei der Hemmung der Syncytienbildung erwies.
Ein Vergleich der Figuren 1 und 2 zeigt, daß mit der Zeit immer mehr Zellen in der Suspension infiziert werden. Dieses Ergebnis wird erwartet. Die in der Suspension verfügbare Menge an Antikörper zur Neutralisierung des Virus nimmt entsprechend der Veränderung im Medium und wahrscheinlich aufgrund von Abbau oder der Internalisierung ab. Jedoch produzieren die infizierten H9-Zellen fortlaufend mehr Virus und dieses Virus infiziert schließlich alle Zellen.
Die graphischen Darstellungen in den Figuren 1 und 2 zeigen, daß mit abnehmender Konzentration an Antikörper eine größere Anzahl an Zellen infiziert wird. Dies weist darauf hin, daß die neutralisierende Wirkung der Antikörper dosisabhängig ist. Der IC&sub5;&sub0;-Wert jedes monoclonalen Antikörpers, d.h. die Dosis, bei der 50% der Zellen infiziert sind, wurde bestimmt. Die Ergebnisse, wie sie am Tag 9 gewonnen wurden, erscheinen nachstehend in Tabelle I. Tabelle I Monoclonale Antikörper Anti-HcG (Negativkontrolle)
Man kann sehen, daß die monoclonalen Antikörper, die am wirksamsten hemmen (BAT 123, 267 und 509), es in Nanogrammmengen tun. Dies weist darauf hin, daß diese monoclonalen Antikörper auch in winzigen Mengen noch sehr wirksam bei der in vivo-AIDS-Therapie sein können. Die Verwendung solcher winzigen Dosen wäre ein deutlicher Vorteil gegenüber bekannten therapeutischen Mitteln.

b) Hemmung der Syncytienbildung

Ein weiterer Test auf die erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper war die Bestimmung, ob sie die Syncytienbildung hemmten. Die Hemmung der Syncytienbildung würde den therapeutischen Wert der Antikörper verstärken, da man annimmt, daß der größte Teil der Zellinfektion und des Zelltods in vivo über Syncytien geht.
Der Syncytientest basierte auf der Annahme, daß das äußere Hüllprotein des Virus in infizierten H9-Zellen an das CD4-Antigen bindet, das auf T-Zellen liegt. Bei dem Test werden T-Zellen einer Vertiefung zugesetzt, die die mit CD4-DNA transfizierten HeLa-Zellen enthält. HeLa-Zellen werden verwendet, weil sie in einer einzelligen Schicht am Grund der Vertiefung anhaften. Diese transfizierten HeLa-Zellen exprimieren im Übermaß das CD4-Antigen auf ihrer Zelloberfläche. Auf diese Weise haben sie die Fähigkeit, mit infizierten H9-Zellen zu fusionieren. Deshalb binden, wenn eine Syncytiumbildung auftritt, Aggregate von HeLa- und H9-Zellen an die Vertiefung. Diese vielkernigen Riesenzellen können leicht beobachtet und gezählt werden.
Das Protokoll für den Test auf Syncytienbildung ist nachstehend dargestellt.

(i) Verfahren für einen Test zur Syncytienbildung

HeLa-T4-Zellen (die das CD4-Antigen auf der Oberfläche exprimieren) wurden in einem HeLa-T4-Wachstumsmedium, das 5% FBS (hitzeinaktiviert) in DMEM, 5 mM L-Glutamin, 50 Einheiten/ml Penicillin, 50 mg/ml Streptomycin und 5 mM HEPES enthielt, gezüchtet. Die Zellen wurden nach Trypsinierung zur Entfernung der Zellen aus dem Glaskolben geerntet und gewaschen. Die Zellen wurden dann auf eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen in einer Dichte von 10 000 Zellen pro Vertiefung gesät. Die Platten wurden sechsunddreißig Stunden bei 37ºC inkubiert, bis 90% Konfluenz erreicht war.
Sowohl die infizierten als auch die nicht-infizierten H9-Zellen wurden dann hergestellt. Zur Herstellung dieser Zellen wurde die Zellsuspension zuerst zweimal mit H9-Wachstumsmedium (20% FBS in RPMI 1640, 5 mM L-Glutamin, 50 Einheiten/ml Penicillin, 50 mg/ml Streptomycin und 5 mM HEPES) gewaschen. Die Zellen wurden dann in HeLa-T&sub4; in einer Konzentration von 0,4 Millionen/ml resuspendiert.
Die Antikörper wurden zuerst durch Durchführen einer Sterilfiltration mit den sieben Antikörperlösungen, die in dem Neutralisationsstest verwendet worden waren, hergestellt. Sechs dieser Lösungen enthielten erfindungsgemäße Antikörper und die siebte enthielt anti-HcG. Jede Lösung wurde dann zur Herstellung zweier Endkonzentrationen von 1,0 und 10 ug/ml verdünnt.
50 Mikroliter jeder Antikörperlösung und 50 Mikroliter der infizierten H9-Zellsuspension wurden den verschiedenen Vertiefungen der Mikrotiterplatte zugesetzt. Die Vertiefungen der Mikrotiterplatte waren zuvor mit den Hela T4-Zellen beschichtet worden. In einer weiteren, mit HeLa T4-beschichteten Vertiefung wurde eine mit H9 infizierte Zellsuspension ohne Zugabe des Antikörpers zugesetzt. Diese Vertiefung sollte als Positivkontrolle dienen. In einer weiteren beschichteten Vertiefung wurde eine nicht-infizierte H9-Zellsuspension zugesetzt. Diese Vertiefung sollte als Negativkontrolle dienen. Die Experimente wurden dreifach durchgeführt.
Die Platten wurden dann achtzehn Stunden bei 37ºC und 5% CO&sub2; inkubiert. Die Platten wurden vorsichtig zweimal mit DMEM zur Entfernung der nicht-haftenden H9-Zellen gewaschen. Das DMEM wurde entfernt und die Zellen wurden durch siebenminütiges Zusetzen von 200 ul Methanol pro Vertiefung fixiert. Nach Entfernen des Methanol wurden die Zellen luftgetrocknet und dann 10 Minuten mit 100 ul 1,4% Methylenblau gefärbt. Die Zellen wurden dreimal mit destilliertem Wasser gespült.
Nach dem Anfärben wurden die Zellen dann unter einem Umkehr-Mikroskop (bei einer 100fachen Vergrößerung) beobachtet und die Zahl der Syncytien pro Fläche wurde bestimmt. Zellaggregate wurden als Syncytium angesehen, wenn mehr als fünf Kerne vorhanden waren. Jede Vertiefung wurde einer statistischen Dreifachzählung unterworfen.

(ii) Ergebnisse

Die Vertiefung der Negativkontrolle zeigte keine Syncytiumbildung. Die Ergebnisse für den Rest der Vertiefungen erscheinen nachstehend in Tabelle II, ausgedrückt durch den Mittelwert ± Standardabweichung. TABELLE II Hemmung der Syncytienbildung zwischen HIV-infizierten H9-Zellen und HeLa-T&sub4;-Zellen Antikörper* & Konzentration Zahl der Syncytien pro Fläche %Hemmung Keine * Die 1,0-Mikrogramm/ml- und die 10 Mikrogramm/ml-Lösungen des Antikörpers werden als "1" bzw. "10" bezeichnet. ** Nicht signifikant unterschiedlich zur Negativkontrolle
Es ist aus Tabelle II zu ersehen, daß diese Ergebnisse nahelegen, daß das Absuchen durch die vorstehend beschriebenen Verfahren wesentlich zur Identifizierung der besten Antikörper zum therapeutischen Gebrauch ist. Die gleichen Antikörper, die die Infektiosität von freien HIV-1- Virionen (wie in den Figuren 1 und 2 gezeigt) gesenkt haben, erwiesen sich auch als wirksam bei der Hemmung der Syncytienbildung. BAT 123, 267 und 509 waren in beiden Anwendungen besonders wirksam. BAT 496 war in beiden Anwendungen fast unwirksam, ebenso natürlich die Negativkontrolle anti-HcG. Obwohl BAT 085 bei der Neutralisierung wirksam war, war er nicht unter den wirksamsten bei der Syncytienhemmung.
BAT 401 war bei der Syncytienhemmung nicht sehr wirksam, obwohl er im Neutralisationstest wirksam war. Dieses Ergebnis zeigt, daß Antikörper, die bei der Hemmung der HIV-1-Infektion wirksam sind, nicht notwendigerweise bei der Hemmung der Syncytienbildung wirksam sind. Entsprechend wurden die drei erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper, die bei der Hemmung sowohl der Infektiosität durch die HIV-Virionen als auch der Syncytienbildung am wirksamsten waren, bei der American Type Culture Collection in Rockville, Maryland, hinterlegt. Sie sind für die Begutachtung durch das Patent- und Warenzeichenamt während der Dauer dieser Anmeldung verfügbar.
Die Ergebnisse der Tabelle II zeigen, daß, ähnlich der in Tabelle I gezeigten Neutralisierung, die Syncytienhemmung auch dosisabhängig ist. Die Lösungen mit 10 Mikrogramm/ml Antikörper waren im allgemeinen bei der Hemmung wirksamer als die 1 Mikrogramm/ml-Lösungen.

Beispiel III: Neutralisierung verschiedener HIV-1-Stämme und -isolate

Man fand, daß mehrere Antikörper die Infektiosität von freien HIV-1- Virionen und die Syncytienbildung zwischen HeLa-CD4+-Zellen und von mit HIV-1B infizierten H9-Zellen hemmten. Da die Genomanalysen zeigen, daß das Virus sowohl in vivo als auch in vitro deutlich mutiert (Alizon, M., Wain-Hobson, S., Montagnier, L. und Sonigo, P. Cell 46: (1986):63-74; Starcich, B. R., Hahn, B.H., Shaw, G.M., McNeely, P.D., Modrow, S., Wolf, H., Parks, E.S., Parks, W.P., Josephs, S.F., Gallo, R.C. und Wong-Staal, F. Cell 45: (1986):637-648) ist, beruht die Anwendung dieser neutralisierenden monoclonalen Antikörper als Mittel der Therapie und des Schutzes vor allem darauf, ob sie gruppenspezifisch sind und vor einer HIV-1-Infektion schützen, die von einem Großteil der Virusstämme in der Population ausgelöst werden. Es ist wichtig zu wissen, ob BAT123 und die anderen neutralisierenden monoclonalen Antikörper, die wir erzeugten, ein oder mehr unterschiedliche Neutralisierungsepitope in dem viralen Hüllprotein gp 120 mit konservierten Aminosäuresequenzen unter den verschiedenen Stämmen von HIV-1 erkennen. Zum Verständnis dieser Kennzeichen der Antikörper untersuchten wir, ob diese Antikörper die Syncytiumbildung durch andere Stämme von HIV-1 mit einem wesentlichen Grad an Heterogenität in der Aminosäuresequenz von gp120 (RF, AL, MN, Z84 und Z34) (Starcich et al a.a.O., hemmen können. Der Neutralisierungsantikörper BAT123 wurde in der Studie ausgewählt, weil gezeigt wurde, daß er höchste Potenz bei der Neutralisierung des Virus entfaltet. Zur Bestimmung der Wirksamkeit der neutralisierenden Antikörper auf verschiedene HIV-1-Varianten, die in der infizierten Population existieren, sammelten wir Blutproben, die nach dem Zufallsprinzip von infizierten Individuen (in Houston, Texa; in Los Angeles, California, und in Boston, Massachusetts) mit verschiedenen Krankheitsstadien gewonnen wurden, und untersuchten die Wirkung von BAT 123 auf die virale Infektion in den Lymphocytenpräparationen durch Co-Kultivierungsexperimente.

a) Syncytienbildungstest

Der Syncytienbildungstest wurde wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt.

b) Co-Kultivierungstest

Das verwendete Verfahren ist ähnlich dem früher beschriebenen, 30 ml heparinisiertes Blut aus jedem Patienten wurden frisch gewonnen und durch Dichte-Gradientenzentrifugation für mononucleäre Leucocyten verarbeitet. Kurz gesagt, das gesamte Blut wurde mit einem gleichen Volumen an Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünnt. 25 ml verdünntes Blut wurden über 10 ml Ficoll-Paque (Pharmacia) geschichtet und 30 Minuten bei 1 500 x g zentrifugiert; am Ende der Zentrifugation wurde die Zwischenphase, enthaltend mononucleäre Leucocyten, entfernt und zweimal in PBS gewaschen. Die mononucleären Leucocyten wurden dann in einer Konzentration von 0,5 - 1 x 106/ml in RPMI 1640-Medium gezüchtet, das mit 15% hitze-aktiviertem fetalen Rinderserum, 2 mM L- Glutamin, 10% Interleukin-2 (Cellular Products), 25 neutralisierenden Einheiten/ml Schaf-anti-menschliches-alpha-Interferon (Interferon Science), 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 ug/ml Streptomycin und 2 ug/ml Polybren ergänzt war. Ein gleiches Volumen an mit Phytohämagglutinin (PHA) stimulierten mononucleären Leucocyten aus normalem Spenderblut wurde mit der Patientenkultur gemischt. Die mononucleären Leucocyten aus normalem Spenderblut wurden einen Tag früher mit 2 ug/ml PHA-P (Sigma) stimuliert. Sie wurden zweimal in PBS zur Entfernung des Lectins gewaschen. BAT 123 wurde der Testkultur in der Endkonzentration von 10 ug/ml zugesetzt. Das Gesamtvolumen der Kultur betrug 10 ml. Fünf ml der Zellkultur wurde in 3-4-Tage- Intervallen entfernt, 15 Minuten bei 1 500 x g zur Entfernung der Zellen und der Zelltrümmer zentrifugiert. Die Überstände wurden gewonnen und auf Aktivitäten der reversen Transkriptase nach Präzipitation des Virus unter Verwendung von 10% Polyethylenglycol (PEG) (Gupta, P., Galachandran, R., Grovit,K., Webster, D. und Rinaldi, C. Jr. J. Clin Microbiology 25 (1987):1122-1125), getestet.

c) Reverse Transkriptase-Test

Das Verfahren zur Messung der Aktivität der reversen Transkriptase wurde früher beschrieben (Barre-Sinoussi, F., Chermann, J.C., Rey, F. Nugeyre, M.T., Charmaret, S., Gruest, J., Daugnet, C., Axler-Blin, C., Vezinet-Brun, F., Ronziou, C., Science 220: (1984) 86-87). In Kürze, das PEG-präzipitierte Virus wurde 20 Minuten in 100 ul Trisgepufferter Kochsalzlösung (pH 8,2), enthaltend 0,1% Triton X-100, 2 mM Dithiotreit, 0,2 mM Leupeptin und 50 mM Amino-n-capronsäure, solubilisiert. Bei dem Test wurden 100 ul der Substratlösung in 50 mM Tris-HCl pH 8,2, enthaltend 8 mM MgCl&sub2;, 20 uCi ³H-Thymidintriphosphat (2m Ci/ml), 0,05 Einheiten Template-Primer-Poly (rA)x-p(dT)&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8; zu 25 ul des solubilisierten Virus zugesetzt. Kein Template-Primer wurde der entsprechenden Kontrolle zugesezt, aber stattdessen mit destilliertem Wasser ersetzt. Die Reaktionsgemische wurden eine Stunde bei 37ºC inkubiert und die Reaktion wurde durch Zusetzen von 5% kalter Trichloressigsäure beendet und anschließend wurde über Whatman GF/C- Filter filtriert, die vollständig gewaschen wurden, und unter Verwendung eines Szintillationszählers auf Radioaktivität gezählt. Die spezifischen Aktivitäten der reversen Transkriptase wurden als Unterschied in der Radioaktivität nach Zusetzen des Template-Primers berechnet.

Ergebnisse & Diskussion

Wir untersuchten die beanspruchten neutralisierenden monoclonalen Antikörper im Hinblick auf ihre Virus-spezifische Gruppenspezifität gegenüber sechs unterschiedlichen HIV-1-Stämmen (HIV-1B, HIV-1RF, HIV- 1AL, HIV-1MN, HIV-1Z84 und HIV-1Z34. Bei dem Test auf Syncytiumbildung zwischen HeLa-CD4+-Zellen und chronisch mit diesen HIV-1-Stämmen infizierten H9-Zellen hemmte BAT 123 in einer Konzentration von 25 ug/ml die Syncytiumbildung um fast 80%. Es reduzierte auch die Syncytiumbildung von infizierten H9-Zellen, die mit HIV-1MN, HIV-1AL, HIV-1RF und HIV-1&sub3;&sub4; infiziert waren, um etwa 50% und HIV-1Z84 um 23% (siehe Tabelle III). Tabelle III Schutz durch Kreuzreaktivität vor Syncytiumbildung durch mit unterschiedlichen HIV-1-Stämmen infizierte H9-Zellen Infizierte H9-Zellen Hemmung Mit Antikörper Ohne Antikörper H9 nicht-infiziert (Kontrolle) * Ausgedrückt als Zahl der Syncytien pro mikroskopischer Fläche (x ± S.E. , n= 11 oder 12). p = 0,05, gepaarter Student's Test
Bei den Co-Kultivierungsexperimenten unter Verwendung von aus dem peripheren Blut von Patienten isolierten Lymphocyten mit klinisch diagnostizierten asymptomatischen Zustand, AIDS oder ARC, war von 32 getesteten Patientenblutseren das Virus, gemessen anhand der Aktivitäten der reversen Transkriptase, aus 18 Proben isoliert worden. Wenn 10 ug/ml BAT 123 dem Kulturmedium während der Experimente zugesetzt wurden, wurde die virale Replikation in allen der 18 Viruspositiven Kulturen gehemmt. Das Ausmaß der Hemmung reichte von 43,7 bis 100%. Unter den 18 Proben wurden 8 Proben mehr als 90% wirksam gehemmt. (Siehe Tabelle IV).
Die Ergebnisse aus unseren in vitro-Experimenten legen nahe, daß der neutralisierende monoclonale Antikörper BAT 123 gruppenspezifisch ist und verschiedene unterschiedliche Stämme von HIV-1 in Syncytienbildungsstests durch Kreuzreaktivität schützen und die virale Infektion in Patientenblutproben hemmen kann. co-Kultivierungsexperimente Aktivität der reversen Transkriptase (cpm) Patienten-Nr Kontrolle Mit BAT 123 Prozent Hemmung T4-Zellen Count/ul Gesamtlymphocyten/ul Klinischer Status Blut nicht verarbeitet** * N.D.&submin;= Nicht nachgewiesen ** Probe aus VA-34 wurde nicht verarbeitet, da nicht genug Blut vorhanden war asym= asymptomatisch AIDS = Erworbene Immuninsuffizienz ARC = AIDS related complex PCP = Pneumocystis-carinii-Pneumonie KS = Kaposi-Sarkom

Beispiel IV: Bestimmung der Peptidsegemente von go 120, die mit monoclonalen Antikörpern reagieren

Verfahren

Zur Kartierung der gp 120-Epitope von HIV-1, die durch die monoclonalen Antikörper erkannt werden, haben wir unter Verwendung der Western-Blot-Tests die Reaktivitäten einiger der monoclonalen Streifen bestimmt. Die Streifen wurden von Dr. Steve Petteway, Medical Products Department, DuPont de Nemours and Company, Wilmington, Delaware, erhalten. Die synthetischen Peptide auf den Streifen sind 8-20 Aminosäurereste lang. Diese Peptide stellen überlappende Peptidsegmente über die gesamte Länge von gp 120 des HIV-1B-Stamms dar. Eine größere Anzahl ("several tens") Peptidlösungen waren auf den einzelnen Streifen in Bereichen, die gleichen Abstand voneinander haben, adsorbiert worden und die Streifen wurden uns in einer trockenen Form geliefert.
Das Immun-Blot-Verfahren unter Verwendung der Nitrocellulosestreifen ist das gleiche wie das Western-Blot-Verfahren, das zur Bestimmung verwendet wurde, ob die monoclonalen Antikörper mit dem im vorstehenden Abschnitt beschriebenen gp 120 reagieren.

Ergebnisse

Die drei monoclonalen Antikörper BAT123, BAT267 und BAT085 zeigten sehr klare und spezifische Reaktivitäten mit speziellen Peptiden im Western-Blot-Test.
BAT267 RPNNNTRKSIRIQRG
BAT123 RIQRGPGRAFVTIGK
BAT085 VQKEYAFFYKLDIIP
Die 15 Aminosäuren langen Peptide, die mit BAT267 und BAT123 reagieren, überlappen mit 5 Aminosäuren. Jedoch reagieren die Antikörper nur mit einem dieser und nicht mit den anderen in einem meßbaren Grad. Die Antikörper reagieren auch nicht mit Peptiden, die an den anderen Enden überlappen, d.h. BAT267 reagiert nicht mit LNQSVRINCTRPNNN und BAT123 reagiert nicht mit VTIGKIGNMRQAHCN. Diese Ergebnisse legen nahe, daß die Antikörper mit einem Epitop des gesamten oder eines Teils der mittleren fünf Aminosäuren oder einer Kombination dieser Aminosäuren mit einigen der flankierenden Aminosäuren reagieren. Ähnliche Befunde sind für BAT085 gemacht worden und ähnliche Schlußfolgerungen können dafür gezogen werden.

Beispiel V: Clonierung und Identifikation der funktionell rearrangierten VL- und VH-Gene von BAT123

Das Clonieren der funktionell rearrangierten VL- und VH-Gene von BAT123 wurde durch das Absuchen der Genbanken von BAT123 unter Verwendung geeigneter Molekülsonden nach einer ähnlich der von Oi und Morrison (Biotechniques 4:214-221) beschriebenen Strategie duchgeführt. Die Identifizierung und endgültige Bestimmung der clonierten Gensegmente wurde mit Hilfe der Nucleotidsequenzen der mRNAs für die BAT123-Immunglobulinmoleküle erzielt. Die Überlegung beruht auf der Tatsache, daß nur, wenn ein Gensegment der variablen Region in geeigneter Weise an das Gen der J-Region im Falle des κ- Ketten-Rearrangements gebunden ist oder geeignetes VDJ-Joining im Falle des Rearrangements der schweren Kette vorkommt, die Immunglobulin-mRNA in voller Länge und korrekt gespleißt in den Antikörper-produzierenden Zellen synthetisiert wird.
Die Sequenzen dieser mRNAs, die entweder durch direktes Sequenzieren des mRNA-Moleküls oder aus den cDNA-Clonen bestimmt werden, sind deshalb am geeignetesten, als Hilfsmittel für die Selektion und Bestimmung der funktionell rearrangierten Gene der variablen Region zu dienen. Jedes Gensegment, das zu der RNA-Sequenz identische Sequenzen enthält, kann als funktionell rearrangiert betrachtet werden.
Die den variablen Regionen entsprechenden Sequenzen der mRNA-Moleküle wurden durch ein "Primerextension/Didesoxynucleotidterminations- Verfahren" unter Verwendung der aus den Polysomen der BAT123- Hybridomzellen hergestellten mRNA bestimmt. Diese Annäherung über direktes RNA-Sequenzieren vermeidet die Zwischenstufe der Clonierung der cDNA in der üblichen Annäherung, zur Ableitung der mRNA-Sequenz; auf diese Weise stellt es einen relativ schnellen Weg zur Bestimmung der RNA-Sequenz bereit.
Die für das Sequenzieren dieser RNA verwendeten Primer waren 5'dTGGATGGTGGGAAGATG3' für die mRNA der leichten Kette und 5'dGGCCAGTGGATAGAC3' für die mRNA der schweren Kette (beide Primer wurden von Pharmacia, Nutley, NJ erhalten) . Diese Oligonucleotide waren komplementär zu den mRNA-Sequenzen in den konstanten Regionen an Stellen, die proximal zu den Verbindungsstellen der J- und C-Regionen der Moleküle sind. Die Primerextension wurde unter Verwendung der AMV- reversen Transkriptase durchgeführt und mit Didesoxynucleotiden beendet. Die Nucleotidsequenz der mRNAs wurde durch Gelelektrophorese und anschließende Autoradiographie bestimmt.
Eine Genbank der Genom-DNA für BAT123-Zellen wurde im Lambdaphagenvektor λ2001 (Karin, J., Natthes, W.D.H., Gait, M.J., Brenner, S. Gene 32 (1984): 217-274) konstruiert. Hochmolekulare Genom-DNA aus BAT123-Hybridomzellen wurde teilweise mit der Restriktionsendonuclease Sau 3AI gespalten und auf einem 10-40%igen Saccharose-Dichtegradienten nach der Größe fraktioniert. DNA-Fragmente von 18-23 Kilobasenpaaren (Kbp) wurden mit λ2001/BamH1-Armen (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) ligiert und unter Verwendung von Gigapack Gold packaging extracts (Stratagene) gepackt. Diese Genombank wurde zuerst auf das funktionell rearrangierte Gen der variablen Region der leichten Kette von BAT123 (VL) abgesucht. Die für dieses Absuchen verwendeten Sonden umfaßten ein 2,7 Kbp großes Hind III-DNA-Fragment enthaltend die gesamten Joining-Regionen JI-J5 der Kappa (κ)-Kette der Mäuse-Keimlinie (Jκ-Sonde; Max, E.E., Maizel, J.V., und Leder,P. J. Biol.Chem. 256 (1981):5116-5120) und zwei Oligonucleotidsonden, Vκ-1 und Vκ-2, die von der Nucleotidsequenz der mRNA der leichten Kette von BAT123 stammen. Die Sequenzen dieser Oligonucleotidsonden sind Vκ-1: 5'dTTTGCTGACAGTAATAGG3' und Vκ-2: 5' dATATAACTATCACCATCA3'. Die Sonden wurden unter Verwendung des Phosphoramidit-Verfahrens auf einem Applied Biosystems-DNA Synthesizer-Modell 381 synthetisiert.
Ungefähr 5 x 10&sup5; rekombinante Phagen wurden anfangs mit einer ³²P- markierten Maus-Jκ-DNA-Sonde abgesucht. Plaquehybridisierungen wurden in 5 x SSC mit 50% (v/v) Formamid 16 Stunden bei 42ºC (1 x SSC- 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat) durchgeführt. Schließlich wurde in 0,2 x SSC/0,1% SDS bei 65ºC gewaschen. Zwei positive Clone wurden erhalten. Sie wurden unter Verwendung von ³²P-markierten Oligonucleotidsonden Vκ-1 und Vκ-2 nacheinander abgesucht. Die Hybridisierung mit den Oligosonden wurde in 5 x SSC bei 37ºC 18 Stunden durchgeführt und Waschschritte wurden in 2 x SSC/0,1% SDS bei Raumtemperatur durchgeführt. Es wurde gezeigt, daß einer dieser Clone, Vκ123-23, mit der Jκ-DNA-Sonde und beiden Oligonucleotidsonden hybridisiert. Die Bestimmung der DNA-Sequenz dieses Clons durch das Didesoxynucleotidterminationsverfahren zeigte, daß es ein VL-Gen- Segment mit einer Sequenz trug, die identisch mit der war, die von der mRNA der leichten Kette von BAT123 bestimmt worden war. Dieser Clon wurde bei der folgenden Konstruktion des Gens der Maus/Mensch-Chimär- L-Kette verwendet.
Für das Clonieren der funktionell rearrangierten Gene der variablen Region für BAT123 wurden teilweise Genombanken der schweren Kette (VH) hergestellt. Genomische Southern-Blots des EcoRI-Spaltprodukts mit der IH-Sonde (siehe nachstehend) hatten vorher 2 möglicherweise funktionell rearrangierte VH-Gene in BAT123 ergeben, eines 7,5 Kbp lang und das andere 4,5 Kbp lang, zusätzlich zu dem 6,6 Kbp großen Fragment, das vermutlich von den "Fusionseltern" von BAT123, d.h. NS- 1-Zellen, stammt. Zwei Teilbanken, enthaltend diese DNA-Banden, wurden hergestellt. Hochmolekulare DNA wurde mit EcoRI vollständig gespalten und auf einem 0,7% Agarosegel fraktioniert. DNA-Fragmente von der Größe von 4-6 Kbp und 6-9 Kbp wurden isoliert und mit dem Lambda- Vektor λgtWESλB ligiert (Leder,P., Timeier, D., und Enquiest, L. Science 196: (1977):175-177). Die ligierten DNAs wurden gepackt und rekombinante Plaques wurden abgesucht. Die verwendeten Sonden umfaßten ein 2 Kbp BamHI-EcoRI-DNA-Fragment, enthaltend die Joining-Regionen J3 und J4 der Maus-H-Kette (JH-Sonde; Gough, N.M. und Bernard, O., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981): 509-513) und eine von der mRNA- Sequenz von BAT123 stammende Oligonucleotidsonde VH-1, 5' dAGTGTGGCTGTGTCCTC3'. Die Hybridisierungsbedingungen für diese Sonden waren wie für die κ-Kette vorstehend beschrieben. Das Absuchen dieser zwei mit EcoRI erhaltenen Teil-Banken mit der JH-Sonde führte zu der Isolierung von 3 unabhängigen Phagenclonen, enthaltend ein 4,5 Kbp, 7,5 Kbp oder 6,6 Kbp großes DNA-Fragment. Die nachfolgende Hybridisierung unter Verwendung der Oligonucleotidsonde VH-1 ergab, daß nur der Phagenclon, der die 4,5 Kbp-Insertion enthält, Clon VH123- E3, mit der Sonde hybridisierte. Das DNA-Sequenzieren dieses Clons zeigte, daß er eine mit der VH-mRNA von BAT123 identische Vκ-Sequenz enthielt. Dieser Clon wurde bei der Konstruktion des chimären Gens der Maus/Mensch-H-Kette verwendet.
Fusion von Mäuse-V- mit menschlichen C-Exons und Einführung in Mäuse- Myelomzellen
Die funktionell rearrangierten V-Gene der L- und H-Kette, die aus BAT123-Zellen isoliert worden waren, wurden mit den Genen der menschlichen κ- und γ1-C-Region in Expressionsvektoren verbunden, die dominante, selektierbare Marker, neo, enthielten (Southern, P.J. & Berg, P. J. Mol. ADDl. Genet. 1 (1981):327-341) bzw. gpt (Mulligan, R.C. und Berg, P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981):2072-2076). Zur Konstruktion des erwünschten chimären Gens wurde das Hind-III-Fragment von pV184ΔHneo.DNSVL-hCκ (Oi, V.T. und Morrison, S.L., Biotechniques 4 (1986):214-221), enthaltend das Dansylspezifische VL-Gen, durch das 4,4 Kbp Hind-III-Fragment, enthaltend das Gen der L-Kette von BAT123, das aus dem Clon Vk123-23 stammt, ersetzt. Die Struktur des so erhaltenen Plasmids pSV184ΔHneo.BAT123-VκhCκ wird in Figur 3A gezeigt. Das chimäre Gen der schweren Kette wurde durch Ersatz des EcoRI- Fragments im pSV2ΔHgpt.DNSVH.hCγ1-Plasmid, enthaltend das Dansylspezifische VH-Gen mit dem 4,5 Kbp-EcoRI-Fragment, enthaltend das funktionell rearrangierte Gen der H-Kette von BAT123, das aus dem Phagenclon VH123-E2 stammt, konstruiert. Die Struktur des so erhaltenen Plasmids pSV2ΔHgpt.BAT123.VH-hCγ1 ist in Figur 3B gezeigt. Die chimären Gene der L- und H-Kette, die in Figur 3 gezeigt sind, werden zur Transfektion der Mäuse-Myelomzellen verwendet. Die ausgewählten Myelomzellen, Sp2/0, sind eine nicht-sezernierende Zelllinie (Shulman, M., Wilde, C., und Kohler, G. (1978) Nature 276:269-270), die keine eigenen Immunglobulinmoleküle produziert. Das Calciumphosphat-Präzipitationsverfahren (Graham und van der Eb (1973) Virologvy 52:456) wurde zur Transformation der chimären Gene in Sp2/0- Zellen verwendet.
Zur Erleichterung der DNA-Transfektion wurden Sp2/0-Zellen mit einer Konzentration von 5 x 10&sup6; Zellen pro 100 mm-Petrischale, die zuvor mit Histon (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo) behandelt worden war, beschickt und 16 Stunden bei 37ºC inkubiert. Ungefähr 7,5 x 10&sup7; Sp2/0- Zellen wurden mit auf CsC1-Ethidiumbromid-Gradienten gereinigtem pSV184ΔHneo.BAT123-VκhCκ (150 ug) und pSV2ΔHgpt.BAT123.VH.hCγ1 (150 ug) unter Verwendung des Calciumphosphatpräzipitationsverfahrens cotransfiziert. Zwei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen in Mikrotiterplatten in einer Dichte von 1 x 10&sup5; Zellen pro Vertiefung in Kulturmedium, enthaltend 400 ug/ml G418 und 0,2 ug/ml Mycophenolsäure, subkultiviert. Die Häufigkeit der Transfektanten, die resistent gegenüber beiden Selektionspharmaka waren, betrug ungefähr 2 x 10&supmin;&sup5;. Die stabilen Transfektanten (Transfektome) wurden auf die Produktion von sezernierten, funktionellen chimären Antikörpern mittels ihrer Affinität zu gereinigtem HIV-gp 120, einem bestimmten Merkmal von BAT123, abgesucht. Gereinigtes gp 120 wurde auf Mikrotiterplatten immobilisiert und man ließ es mit Kulturüberständen aus den Transfektanten reagieren. Die Antigen-Antikörper-Komplexe wurden mit alkalischer Phosphatase konjugierten Antiseren, die spezifisch für menschliches IgG sind, nachgewiesen. Wie in Tabelle V gezeigt, ergaben 707 der getesteten 1200 Transfektanten ein positives Signal im ELISA, was darauf hinwies, daß der intakte chimäre Antikörper sezerniert wurde und dieses Protein die Fähigkeit zum Binden von HIV-gp 120 behielt. Die nicht-transfizierte Stammzelllinie ergab ein negatives Ergebnis.
Tabelle V Ausmaß der Sezernierung des chimären Antikörpers durch Transfektome Empfängerzelle Anzahl der getesteten Transfektome Anzahl negativ Anzahl schwach Anzahl positiv Prozent positiv
Die Transfektome wurden auf Grund ihrer OD im ELISA beurteilt. "Negativ" wird als OD von 0,0 bis 0,1 definiert, "schwach positiv" bedeutet 0,1 bis 0,2 und "positiv" bedeutet 0,2 -3,0.
Produktion des chimären Antikörpers aus den Transfektomzelllinien
Siebzehn Tranfektomzelllinien, die eine OD von mehr als 1,0 im ELISA zeigten, wurden ausgewählt und die den chimären Antikörper produzierenden Zellen wurden mittels der Einzellclonierungstechnik gereinigt. Es wurden zwölf stabile Zelllinien erhalten. Diese Transfektomzelllinien wurden dann auf Stabilität der Produktion des chimären Antikörpers in Abwesenheit der Selektionspharmaka G418 und Mycophenolsäure getestet. Die Zellen wurden in dem Medium mit schrittweiser Reduktion der Selektionspharmaka in 2-Wochen-Intervallen kultiviert, wobei schließlich die Pharmaka vollständig eliminiert waren. Während jeder Senkung der Pharmaka wurde die Produktion des chimären Antikörpers in diesen Zellen mittels ELISA aufgezeichnet. Drei dieser Zelllinien verloren ihre Fähigkeit zur Sekretion des chimären Antikörpers bei der Entfernung des Selektionsdrucks.
Die restlichen 9 Zelllinien blieben bei der Produktion des chimären Antikörpers 5 Wochen nach der vollständigen Elimination der Selektionspharmaka im Kulturmedium stabil.
Zur Bestimmung der Höhe der Produktion des chimären Antikörpers und zur Herstellung des Antikörpers zur weiteren Charakterisierung wurde die Transfektomzelllinie GAG1-51-4 vermehrt und im Gewebekulturmedium gezüchtet. Ungefähr 600 ml Kulturmedium wurden gewonnen und daraus wurden 14,4 mg (bestimmt durch den BGA-Proteintest, Pierce, Rockford,IL) des chimären Antikörpers unter Verwendung der r-Protein- A-Sepharose-Affinitätssäule (Repligen Corporation, Cambridge, MA) gewonnen. Somit betrug die IgG-Konzentration im Kulturüberstand dieser Transfektomzelllinie 24 ug/ml, ein etwas höherer Spiegel als der von den BAT123-Hybridzellen (20 ug/ml) produzierte.
Biochemische Analyse des chimären Antikörpers
Gereinigtes chimäres Immunglobulin wurde zur Charakterisierung der biochemischen/immunologischen Eigenschaften des chimären Antikörpers verwendet.

A) Isoelektrische Punkte

Das Muster des isoelektrischen Fokussierungs (IEF)-Gels des gereinigten chimären Antikörpers zusammen mit dem von BAT123 ist in Figur 4 gezeigt.
Das IEF-Muster wurde durch Aufbringen der gereinigten Antikörper- Proben auf das Pharmacia's Phast System erhalten und die IEF wurde gemäß dem von dem Hersteller empfohlenen Verfahren durchgeführt. Das IEF-Muster zeigte, daß der chimäre Antikörper zwei Hauptarten von Molekülen mit pI-Werten im Bereich von pH 6,8 -7,2 enthielt, wobei die entsprechenden Moleküle von BAT123 einen pI-Wert im Bereich von pH 5,6 bis 5,8 zeigten. Das Ersetzen der konstanten Regionen des Immunglobulinmoleküls der Maus durch menschliche änderte deshalb stark die Zusammensetzung des Antikörpers, was sich in dem IEF-Muster widerspiegelt.

B) Reaktivität des chimären Antikörpers gegenüber anti-Maus- sowie anti-menschlichen Antiseren

Wenn der chimäre Antikörper unter reduzierenden Bedingungen (Laemmli, U.K. Nature 227 (1970):680-685) einer 10% SDS- Polyacrylamidgelektrophorese unterworfen wurde, wurden zwei Banden beobachtet (Figur 5A, Bahn 2). Die Proteinbande mit Molekulargewicht 53 000 Dalton entspricht den chimären schweren Ketten und zeigt eine große Ähnlichkeit in der Größe mit den schweren Ketten des BAT123- Immunglobulins (Figur 5A, Bahn 1). Die Proteinbande mit der Größe von ungefähr 23 000 Dalton bezeichnet die leichten Ketten der Antikörper. Die für die chimären leichten Ketten beobachtete leicht geringere Mobilität zeigt sich auch in einem anderen chimären Antikörper und muß nicht notwendigerweise der größeren Größe der konstanten Region der menschlichen leichten κ-Kette (hCκ) verglichen mit dem Gegenstück bei der Maus zugeschrieben werden. Das vollständig zusammengesetzte H&sub2;L&sub2;- Molekül des chimären Antikörpers zeigt identische Mobilität mit dem vom BAT123 (M.G. 146 000 Dalton), wenn die Immunglobuline im 10%igem SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden Bedingungen aufgetrennt wurden (Figur 5A, Bahnen 3 & 4).
Als Test, ob der chimäre Antikörper in der Tat die konstanten Regionen des menschlichen Immunglobulins einbaute, wurden 2 ug des chimären Antikörpers und BAT123 auf einer Nitrocellulosemembran elektrogeblottet (100 Volt, 1 Stunde in einem Transblotpuffer bestehend aus 25 mM Tris-HCl, 192 mM Glycin, 20% (v/v) Methanol, pH 8,3) , nachdem die Proteine unter Reduktionsbedingungen in 10% SDS- PAGE in einem BioRad Mini-Protein II Dual Slab Cell-Apparat aufgetrennt worden waren. Einer der Replica-Membranfilter reagierte mit biotinyliertem anti-Maus-Antikörper (Vector Laboratory, Burlingame, CA), wogegen der andere Filter mit biotinyliertem antimenschlichem Antikörper in Blotto-Puffer, bestehend aus 5% fettfreier Trockenmilch in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), reagierte. Nach 1stündiger Inkubation bei 37ºC wurden die Membranfilter zweimal mit PBS + 0,1% Tween 20 (PBST) gewaschen und beide Membranen wurden bei Raumtemperatur 30 Minuten mit Meerrettich-Peroxidase-Avidin- Konjugat in Blotto umgesetzt. Nach dem Waschen am Ende mit PBST wurden die reaktiven Proteinbanden durch Farbentwicklung unter Verwendung von 4-Chlor-1-napthol (4-CN) und Wasserstoffperoxid sichtbar gemacht.
Wie in Figur 5B gezeigt, reagierte das BAT123-Immunglobulin extensiv mit dem anti-Maus-Antiserum, wogegen der chimäre Antikörper nur schwach mit dem gleichen Serum reagierte. Andererseits reagierte der chimäre Antikörper stark mit anti-menschlichem Antiserum, wogegen BAT123 keine merkliche Reaktivität gegenüber dem Antiserum zeigte (Figur 5C). Dieses Ergebnis zeigte, daß Teile des chimären Antikörpermoleküls in der Tat von menschlichem Immunglobulin stammten.

C) Die IgG-Subklasse des chimären Antikörpers

Das chimäre Gen der schweren Kette wurde durch Spleißen des VH-Gens von BAT123 in die codierende Sequenz der menschlichen Cγ1-Region konstruiert. Man erwartet deshalb, daß der so erhaltene chimäre Antikörper zur IgG1-Subklasse gehört. Zur Bestätigung des Isotyps des exprimierten konstruierten chimären Antikörpers wurde das folgende Experiment durchgeführt. Mikrotiterplattenvertiefungen wurden getrennt mit anti-menschlichem IgG1- und IgG3-Antiseren der Maus (Fisher Biotech) in zweifacher Serien-Verdünnung beschichtet: Ein chimärer Antikörper in einer Konzentration von 20 ug/ml wurde diesen Vertiefungen zugesetzt und bei 37ºC 1 Stunde inkubiert. Nach dem Waschen mit PBST wurden die Komplexe durch Inkubation mit Ziegen-antimenschliches Immunglobulin-Antikörper-Meerrettich-Peroxidase-Konjugat (Vector) mit nachfolgender Farbentwicklung nachgewiesen. Das Ergebnis (in Figur 6 gezeigt) zeigte deutlich, daß der chimäre Antikörper zur IgG1-Subklasse gehört.

D) Antigenspezifität des chimären Antikörpers

Man nimmt allgemein an, daß die Aminosäurereste innerhalb eines Immunglobulinmoleküls, die direkt an der Bildung der Antigenbindungsstelle beteiligt sind, sich in der "complementary determining"-Region (CDR) befinden, die in der variablen Domäne (V) des Immunglobulins liegt. Zur Bestimmung, ob der chimäre Antikörper die Antigenspezifität des Stamm-Antikörpers behält, wurden folgende Experimente durchgeführt. Im ersten Experiment ließ man den chimären Antikörper mit einem kommerziell erhältlichen Immunblot-Streifen (Geschenk von Dr. Robert Ting, Biotech Research Labs) reagieren, der alle Antigene des gereinigten HIV enthielt, die in SDS-PAGE aufgetrennt und nachfolgend auf Nitrocellulosemembranfilter elektrotransferiert worden waren. Die Reaktion wurde 16 Stunden bei Raumtemperatur in Blotto-Puffer durchgeführt. Die reaktiven Komplexe wurden dann durch Inkubation zuerst mit biotinylierten antimenschliche Antiseren (Vector) und anschließend mit Avidin- Meerrettich-Peroxidase nachgewiesen, wobei zwischen jedem Inkubationsschritt gewaschen wurde, und schließlich durch Farbentwicklung mit den Enzymsubstraten 4-CN und Wasserstoffperoxid sichtbar gemacht. Das Ergebnis wurde in Figur 7A gezeigt. Die Antigenbande, die mit dem chimären Antikörper (Bahn 3) reagierte, war mit dem vom BAT123-Antikörper in einer parallelen Reaktion nachgewiesenen (Bahn 2) identisch und entsprach dem viralen Hüllglykoprotein gp120 in einem viralen Antigenprofil, das durch die Reaktion mit einem Referenzserum von einem AIDS-Patienten erhalten wurde.
Dieses Ergebnis zeigte, daß der chimäre Antikörper die Antigenspezifität von BAT1123 zur Bindung von HIV-gp 120 behielt.
Um weiter zu testen, ob der chimäre Antikörper die gleiche antigene Determinante (Epitop) innerhalb gp120 erkennt wie BAT123, ließ man den Antikörper mit einem Membranstreifen, enthaltend eine Serie von 32 überlappenden Oligopeptiden, die die potentiellen antigenen Determinanten in gp120 darstellen (Geschenk von S. Petteway, Du Pont), reagieren. Das Inkubationsverfahren war im wesentlichen das gleiche wie das für den Immunblot-Streifen viraler Antigene. Das Ergebnis (in Figur 7B gezeigt) weist darauf hin, daß der chimäre Antikörper an das gleiche Oligopeptid bindet wie BAT123, das die Aminosäuresequenz Arg- Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr-Ile-Gly-Lys aufweist. Die Antigenspezifität des Mäuse-Antikörpers BAT123 wurde deshalb bei der Umwandlung in einen chimären Mäuse/Mensch-Antikörper gut erhalten.
Biologische Aktivität des chimären Antikörpers

A) Neutralisierung der HIV-1-Infektion von H9-Zellen durch chimäre Antikörper

Die Fähigkeit der chimären Antikörper, die HIV-1-Infektion von H9- Zellen zu neutralisieren, wurde unter Verwendung des früher beschriebenen ähnlichen Verfahrens (U.S. Patent-Anmeldung Nr. 137,861, eingereicht am 24. Dezember 1987, die eine continuation-in-part der U.S.-Anmeldung Nr. 057,445, eingereicht am 29. Mai 1987, ist) gemessen. Das verwendete Virus wurde aus Kulturüberständen von HTLV- IIIB-infizierten H9-Zellen hergestellt. 40 ml zellfreier Überstand wurde 3 Stunden bei 35 000 g zentrifugiert. Das Pellet wurde in 3 ml Wachstumsmedium resuspendiert. Der Virustiter wurde durch Infektion von H9-Zellen mit dem Stammvirus in zehnfachen Reihenverdünnungen gemessen. Die TCID&sub5;&sub0; des Stammvirus wurde als infektiöse Dosis, bei der die Hälfte der Zahl der Minikulturen infiziert war, bestimmt.
Bei dem Neutralisationstest wurde eine Infektiositätsdosis, die äquivalent der 20fachen TCID&sub5;&sub0; war, verwendet. 50 ul des 60fachen TCID&sub5;&sub0; des Stammvirus wurde mit 50 ul der getesteten Antikörper in einer Mikrokultur-Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen vorinkubiert. Die getesteten Antikörper waren der chimäre Antikörper CAG1-51-4, der monoclonale Mäuse-Antikörper BAT123 und ein monoclonaler Mäuse-Antikörper gegen menschliches Choriongonadotropin (anti-hCG). Als Kontrolle wurden 50 ul Wachstumsmedium ohne irgendwelche Antikörper verwendet. Die Gemische wurden 1 Stunde bei 37ºC in einem CO&sub2; (5%)-Inkubator mit 5% CO&sub2; gehalten. Die Endkonzentration des Antikörpers betrug 100, 50, 25, 12,5 und 6,25 ug/ml. Jede Konzentration der getesteten Antikörper wurde dreifach durchgeführt. Am Ende der Inkubation wurden 50 ul 4 x 10&sup6;/ml H9-Zellen zugesetzt. Die H9-Zellen wurden in der log-Phase geerntet und 1 Stunde bei 37ºC mit 2 ug/ml Polybren im RPMI-1640-Wachstumsmedium, enthaltend 15% hitze-inaktiviertes fetales Rinderserum, vor Zugabe zum Gemisch vorinkubiert. Am Ende der Inkubation wurden die Zellen in allen Mikrokultur-Vertiefungen resuspendiert, 40 ul der Zellsuspension wurden 200 ul frischem Wachstumsmedium in den entsprechenden Vertiefungen anderer Mikrokulturplatten zugesetzt.
Die Mikrokulturplatten wurden bei 37ºC in einem CO&sub2; (5%)-Inkubator gehalten. Am Tag 3, Tag 5, Tag 7, Tag 9, Tag 11 und Tag 14 wurden 150 ul Zellsuspension aus jeder Mikrokultur entfernt und in eine andere Platte mit 96 Vertiefungen mit U-förmigen Böden eingebracht. Die Platte wurde 5 Minuten bei 200 x g zentrifugiert. Die Überstände wurden für HIV-1-Virus-Antigen-Einfangtests gesammelt. Die Vertiefungen wurden mit 150 ul frischen Wachstummedium gefüttert.
Bei dem Antigen-Einfangtest wurden die HIV-1 spezifischen Antigene in den zellfreien Überständen mittels ihrer Affinität zu den Immunglobulinen von AIDS-Patienten gemessen. 100 ul verdünntes gereinigtes AIDS-Patienten-Immunglobulin (1:2000, ungefähr 5 ug/ml) wurden jeder Vertiefung einer Cobind-Platte zugesetzt und 2 Stunden bei 37ºC inkubiert. Dann wurden die Vertiefungen zweimal mit 200 ul phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gespült. Die Vertiefungen wurden mit 220 ul 1%igem Rinderserumalbumin (BSA) in PBS 1 Stunde bei 37ºC blockiert. Dann wurde es dreimal mit PBST (PBS, enthaltend 0,1% Tween 20) gespült. Die Vertiefungen wurden dann geleert. 50 ul der Testproben (unverdünnt oder in geeigneter Verdünnung) wurden zusammen mit 50 ul PBSTB (PBS, enthaltend 1% BSA und 0,1% Tween 20) der Vertiefung zugesetzt. Die Negativkontrolle enthielt 50 ul Wachstumsmedium. Die Platte wurde 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Dann wurde sie dreimal mit PBST gespült. 100 ul verdünnte, Peroxidase- konjugierte Immunglobuline von AIDS-Patienten wurden jeder Vertiefung 1 Stunde bei Raumtemperatur zugesetzt. Die Platte wurde dann dreimal mit PBST gespült. 100 ul einer Substratlösung (enthaltend 20 mM Natriumacetatpuffer pH 6,0, 0,001% 3,3', 5,5'-Tetramethylbenzidin und 0,001% Wasserstoffperoxid) wurden jeder Vertiefung zugesetzt und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden 50 ul 2M H&sub2;SO&sub4; jeder Vertiefung zum Stoppen der Reaktion zugesezt. Die Absorption wurde bei 490 nm abgelesen. Die Ergebnisse des dreifachen Ablesens wurden gemittelt und ein Vergleich gemacht zwischen der Kontrolle und dem Testantikörper auf den Prozentsatz der Hemmung, wenn neutralisierende Antikörper zugesetzt wurden. Die Ergebnisse (Figur 8) zeigten, daß der chimäre Antikörper in allen Verdünnungen vollständig die HIV-1- Infektion von H9-Zellen in einem 14-Tage-Test neutralisierte. Diese neutralisierende Aktivität war identisch mit der des Stamm-Mäuse- Antikörpers BAT123. Ein Kontroll-Mäuse-Antikörper (anti-hCG) und das Wachstumsmedium zeigten keine hemmende Aktivität.

B) Hemmung der Syncytienbildung durch den chimären Antikörper

Die HIV-neutralisierende Aktivität des chimären Antikörpers wurde auch durch seine Fähigkeit zur Hemmung der Syncytienbildung bewertet. Die Wirkungen des chimären Antikörpers auf die HIV-1-Übertragung durch Zellfusion wurden unter Verwendung von HIV-1-infizierten H9-Zellen und CD4-exprimierenden HeLa-Zellen (HeLa-CD4+) studiert, die bei Kontakt fusionieren und Syncytien in Kultur bilden. HeLa ist eine menschliche Krebszelllinie. HeLa-CD4+ enthält in ihrem Genom CD4-codierende DNA, die durch Transfektion eingeführt wurde und so das CD4-Antigen auf seiner Zelloberfläche exprimiert. Die HeLa-CD&sub4;+-Zelllinie war ein Geschenk von David. D. Ho (University of California, Los Angeles). Eine HeLa-CD4+-Zellkultur wurde auf Vertiefungen von Mikrokulturplatten mit 96 Vertiefungen in 20 000 Zellen pro Vertiefung plattiert. Die Platten wurden 36 Stunden inkubiert und zu diesem Zeitpunkt waren die Epithelialzellen der einzelligen Schicht fast konfluent. Wenn 1 x 10&sup4; infizierte H9-Zellen den konfluenten HeLa- CD4+-Zellen zugesetzt wurden, bildeten die Zellen Kontakt und fusionierten und innerhalb von 18 Stunden wurden vielkernige Riesenzellen (Syncytien) gebildet. Diese Syncytien mit mehr als fünf Kernen konnten leicht identifiziert und ausgezählt werden und auf diese Weise quantitative Messungen der Syncytienbildung bereitstellen. Wenn die Wirkungen der chimären Antikörper auf die Syncytienbildung studiert wurden, wurden Antikörper in verschiedenen Konzentrationen mit infizierten H9-Zellen gemischt und den HeLa-CD4+-Zellen zugesetzt. Das End-Gesamtvolumen des Kulturmediums pro Vertiefung war 200 ul. Am Ende der 18stündigen Inkubation wurden die Vertiefungen mit PBS gewaschen, mit Methanol fixiert, luftgetrocknet und mit Methylenblau angefärbt. Die Zellen wurden in 100facher Vergrößerung untersucht und die Zahl der Syncytien (mit mehr als 5 Kernen) wurde in vier zufällig ausgewählten Gebieten bestimmt und gemittelt. Wie in Tabelle VI gezeigt, ergab der chimäre Antikörper CAG1-51-4 eine Reduzierung der gebildeten Syncytien, die zwischen H9-Zellen und HeLa-CD4+-Zellen gebildet wurden, um 89,1%, 65,7% und 58,6% bei Mengen von 20 ug/ml, 10 ug/ml bzw. 5 ug/ml. Diese Wirkung ist im wesentlichen dem von BAT123 verursachten identisch und zeigt, daß die chimären Antikörper die Aktivität behielten, die Fusion zwischen den HIV-infizierten Zellen und nicht-infizierten Zellen zu hemmen, eine der Hauptwege für die HIV-Übertragung.
Der Mäuse-Kontroll-Antikörper anti-hCG ergab keinen Effekt auf die Syncytienbildung. Tabelle VI Hemmung der Syncytienbildung zwischen HIV-1-infizierten H9- Zellen und HeLa-CD4+-Zellen durch einen chimären Antikörper Getesteter Antikörper Zahl der Syncytien pro Fläche Prozent Hemmung Kontrolle (kein Antikörper) * Zahl der Syncytien aus 5 zufällig ausgewählten Mikroskopfeldern in einer Vergrößerung von 100x. **Ergebnisse ausgedrückt in x ± s, n= 3

Claims

1. Monoclonaler Antikörper, der an ein Peptid mit der Sequenz

RPNNNTRKSIRIQRG, oder VQKEYAFFYKLDIIP

bindet, wobei jede Sequenz eine Sequenz eines Bereichs von gp120 von HIV-1 ist.

2. Monoclonaler Antikörper, der an ein Peptid mit der Sequenz

RIQRGPGRAFVTIGK

bindet, wobei die Sequenz eine Sequenz eines Bereichs von gpl20 von HIV-1 ist;

oder ein monoclonaler Antikörper, der an eine entsprechende Sequenz aus anderen HIV-1-Stämmen bindet.

3. Zellinie, die die monoclonalen Antikörper nach Anspruch 1 oder 2 produziert.

4. Maus/Mensch-Chimäre der Antikörper nach Anspruch 1 oder 2 mit variablen Bereichen, die aus der Maus stammen und konstanten Bereichen, die aus dem Menschen stammen.

5. Antikörperkonjugat, umfassend den Antikörper nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 4, konjugiert mit einem cytotoxischen Wirkstoff, einem antiviralen Mittel oder einem Wirkstoff, der den Durchgang durch die Blut-Hirnschranke erleichtert.

6. Arzneimittel, enthaltend den Antikörper nach einem der Ansprüche 1, 2, 4 oder 5, gegebenenfalls in Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.

7. Verwendung eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 1, 2, 4 oder 5 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Prophylaxe oder Behandlung von HIV-1-Infektionen.