DE68928917T2

DE68928917T2 - Lys(B28) Insuline. Analogen des menschlichen Insulins

Info

Publication number: DE68928917T2
Application number: DE68928917T
Authority: DE
Inventors: Per 3060 Espergaerde Balschmidt; Jens Vejlgaard 2930 Klampenborg Brange
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1988-12-23
Filing date: 1989-12-21
Publication date: 1999-08-05
Anticipated expiration: 2009-12-22
Also published as: EP0861851A1; ATE170875T1; DE68928971T2; EP0837072A2; JPH04502465A; DE861851T1; ATE178908T1; DE68928971D1; DE68928917D1; CN1043719A; FI913037A0; EP0837072B1; AU641631B2; NO912438L; ATE175974T1; EP0861851B1; US5164366A; NZ231936A; CA2006578A1; HUT56857A

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Analoge von menschlichem Insulin, die ein geringes Assoziierungsvermögen in Lösung aufweisen, ein Verfahren zur Herstellung derartiger Insulin-Analoge, Insulin-Präparate, die die erfindungsgemäßen menschlichen Insulin-Analoge enthalten, und ein Verfahren zur Behandlung von Diabetes Mellitus unter Verwendung dieser Analoge von menschlichem Insulin.

Allgemeiner Stand der Technik

Seit der Entdeckung von Insulin im Jahr 1922 sind viele verschiedene Arten von Insulin-Präparaten zur Behandlung von Diabetes Mellitus verwendet worden. Zu Beginn wurden ausschließlich Insulinlösungen, die eine schnell beginnende und relativ schnell endende Insulin-Aktivität aufwiesen, verwendet. Später jedoch sind Insulin-Präparate, die ein breiteres Aktivitätsprofil aufwiesen, bewirkt durch Herabsetzen der Löslichkeit von Insulin mit Hilfe von Zusätzen von Zinksalz und/oder Protaminen, hergestellt worden. Aus Gründen der Verfügbarkeit ist das hierzu verwendete Insulin üblicherweise aus dem Pankreas von Haustieren, am häufigsten Ochsen, Schweinen und Schafen, gewonnen worden. Jedoch sind in der letzten Zeit auch Präparate auf dem Markt erhältlich, die menschliches Insulin mit biotechnologischer Herkunft enthalten.
Die Struktur von menschlichem Insulin wird mit der folgenden Formel wiedergegeben:
Die Insuline von bestimmten Haustieren sind in ihrer Struktur menschlichem Insulin sehr ähnlich. So unterscheidet sich Insulin vom Hund und Schwein nur dadurch von menschlichem Insulin, daß es Ala in Position 30 der B- Kette enthält und Kaninchen-Insulin nur dadurch, daß es Ser in der gleichen Position enthält. Diese Insuline können zu menschlichem Insulin umgewandelt werden, indem die B30-Aminosäure mit Thr durch semisynthetische Verfahren wie durch Morihara et al., Nature 280 (1979), 412-413 und Marcussen (US-Patent Nr. 4,343,898) beschrieben, ersetzt wird.
Wenn ein derartiges Insulin bei einem physiologischen pH-Wert gelöst wird, stellt sich ein konzentrationsabhängiges Assoziationsgleichgewicht zwischen monomerem, dimerem, tetramerem, hexamerem und sogar polymerem Insulin ein. Das Gleichgewicht kann z. B. durch Ultrazentrifugation, Osmometrie oder durch Gelfiltrationsverfahren bestimmt werden, siehe z. B. R. Valdes Jr. und G. A. Ackers, "Methods in Enzymology", Bd. 61 (Enzyme Structure, Teil H., Herausgeber: Hirs & Timasheff), Academic Press 1979, Seiten 125-142. In normalen Formulierungen von Insulin-Präparaten ist dieses Gleichgewicht auf eine Weise verschoben, daß das Insulin sich in einem hohen Grade in einer hexameren Form befindet.
Substitutionen in dem Insulinmolekül können zum Zwecke der Verbesserung des Aktivitätsprofils des Insulins bei der Behandlung von Diabetes eingeführt werden. So offenbart die veröffentlichte internationale Anmeldung Nr. WO 86/05497, daß eine oder mehrere Substitutionen von Glu in dem Insulinmolekül durch eine neutrale Aminosäure ein Verschieben der Präzipitationszone von Insulin auf eine solche Weise verursacht, daß eine langsamere Freisetzung nach Injektion erhalten wird.
Darüber hinaus offenbart die veröffentlichte europäische Anmeldung Nr. EP 214 826 Insulin-Analoge, die besonders schnell nach Injektion absorbiert werden. Diese Wirkung resultiert aus der Tatsache, daß mittels bestimmter Substitutionen, insbesondere in der B9-B12-Region und in den B26-B28- Positionen in dem Insulinmolekül, eine Unterdrückung der Assoziationstendenz von Insulin erhalten wird, so daß es im wesentlichen als Monomer oder Dimer vorliegt. Jedoch weist eine Anzahl dieser Insulin-Analoge eine herabgesetzte biologische Aktivität auf.
Im Laufe der Jahre ist eine große Anzahl von künstlich erzeugten Analogen von menschlichem Insulin beschrieben worden, üblicherweise mit der Absicht, den Einfluß der Struktur auf die Aktivität zu erhellen, siehe z. B. Märke et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 360 (1979), 1619-1632. Untersuchungen des Einflusses von Substitutionen in der (B22-B26)-Sequenz von Insulin auf die Rezeptorbindung sind von besonderem Interesse gewesen, da diese Sequenz als eine wesentliche Bindungsstelle für den Insulinrezeptor betrachtet worden ist und da natürlich auftretende Mutationen gefunden worden sind, die Substitutionen an dieser Stelle aufwiesen. Siehe z. B. S. Shoelson et al., PNAS 80 (1983), 7390-7394 und M. Kobayashi et al., Biomed. Res. 5 (3) (1984), 267-272. Bei Analogen, bei denen Phe (B24) oder Phe (B25) substituiert ist, sind sehr geringe biologische Aktivitäten festgestellt worden und deshalb hat man die Schlußfolgerung gezogen, daß die Gegenwart dieser beiden Aminosäuren von entscheidender Bedeutung für die Rezeptorbindung ist.
Die vorliegende Erfindung basiert darauf, daß man überraschenderweise erkannt hat, daß bestimmte Analoge von menschlichem Insulin, in denen eine der Aminosäuren [PheB24] oder [PheB25] nicht vorkommt, eine niedrige Assoziationstendenz in Lösung aufweisen und gleichzeitig eine unveränderte oder sogar höhere biologische Aktivität in vitro als menschliches Insulin. Die Deletion von [PheB24] oder [PheB25] wird die Wirkung besitzen, daß [LysB29] in [LysB28] überführt wird. Die Position einer positiven Ladung in dieser Position in dem menschlichen Insulinmolekül wird als ein wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung betrachtet.

Zusammenfassung der Erfindung

In ihrem breitesten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung daher Analoge von menschlichem Insulin, in denen sich eine positiv geladene Aminosäure, d. h. Lys oder Arg in Position B28 befindet, d. h. in Position 8 der B-Kette, gerechnet von [GlyB20].
Die vorliegenden Insulin-Analoge besitzen eine überraschend geringe Assoziationstendenz und gleichzeitig eine erhöhte physikalische Stabilität im Vergleich zu anderen Insulin-Analogen mit geringer Assoziationstendenz. Die Einführung einer positiven Ladung in die Position B28 kann auf zwei Wegen erreicht werden. Entweder durch Entfernen einer der Aminosäuren in Position B24, B25, B26, B27 oder B28 in dem menschlichen Insulinmolekül, was zu einem menschlichen Insulin-Analogen mit Lys in Position B28 führt, oder indem [Pro²&sup8;] in dem menschlichen Insulinmolekül mit Lys oder Arg ersetzt wird. Wenn Arg in Position B28 bevorzugt ist, kann die Deletion einer der Aminosäuren in Position B24, B25, B26, B27 oder B28 Weiterhin mit einer Substitution des ursprünglichen [LysB29] durch Arg kombiniert werden.
Die vorliegenden Analoge von menschlichem Insulin können weiterhin eine oder mehrere Modifikationen in dem C-terminalen Ende der B-Kette, verglichen mit menschlichem Insulin, enthalten. So können die Aminosäurereste in Position B25 bis B27 und der/die [LysB28] oder [ArgB28] folgende(n) Aminosäurerest(e) willkürlich unter den natürlich vorkommenden Aminosäureresten ausgewählt werden mit der Maßgabe, daß sich kein Pro in Position B29 befindet oder B29 oder B30 oder beide können fehlen.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung kann [TyrB26] durch eine andere ungeladene Aminosäure ersetzt werden, wobei das zweite Kohlenstoffatom in der Seitenkette (Cγ) sp²-hybridisiert ist (die Bindungen besitzen eine planare Struktur).
Wenn bezweckt wird, das Molekül gegen chemischen Abbau zu stabilisieren, kann auch Asn in Position A21 und/oder B3 weiterhin durch eine andere Aminosäure ersetzt werden:
Die vorliegenden Analoge von menschlichem Insulin können durch die folgende Formel I gekennzeichnet werden:
wobei X&sub1;, X&sub2;, X&sub3;, Y&sub1; und Y&sub2; eine beliebige, natürlich vorkommende Aminosäure sein können, X&sub4; Lys oder Arg ist; X&sub5; ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus jeder beliebigen, natürlich vorkommenden Aminosäure mit Ausnahme von Pro, X&sub6; jede beliebige, natürlich vorkommende Aminosäure sein kann, die die C-terminale Hydroxygruppe trägt, oder -OH oder X&sub5; und X&sub6; zusammen die C-terminale Hydroxygruppe bilden.
In der vorstehenden Formel können Y&sub1; und/oder Y&sub2; in einer Ausführungsform aus der Gruppe, bestehend aus jeder beliebigen, natürlich vorkommenden Aminosäure mit Ausnahme von Asn ausgewählt sein.
In der vorstehenden Formel I kann X&sub1; insbesondere Phe, Ala, His, Thr, Ser, Asn oder Tyr sein.
X&sub2; kann insbesondere Tyr, Thr, Glu, Asp, Ala, His, Ser oder Phe sein,
X&sub3; kann insbesondere Pro, Glu, Asp, Ser, Thr oder His sein,
X&sub5; kann insbesondere Lys, Thr, Ser, Ala, Asp oder Glu sein,
X&sub6; kann insbesondere Thr-OH, Ser-OH, Ala-OH, Asp-OH, Glu-OH oder -OH sein,
Y&sub1; kann Asn, Glu, Asp, His, Ser, Ihr, Val, Leu, Ile, Ala, Met, Trp, Tyr, Gln oder Gly, stärker bevorzugt Gly, Asp, Glu oder Ala sein,
Y&sub2; kann Asn, Glu, Asp, His, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Ala, Met, Trp, Tyr, Gln oder Gly, stärker bevorzugt Glu oder Asp sein.
Eine Gruppe der vorliegenden Analoge von menschlichem Insulin kann gekennzeichnet werden als eine solche, in der eine der Aminosäurereste in Position B24 oder B25 entfernt worden ist, daß der Aminosäurerest in Position B26 wahlweise durch einen anderen, ungeladenen Aminosäurerest, in dem das Kohlenstoffatom in der γ-Position sp²-hybridisiert ist, ersetzt ist, daß wahlweise einer oder mehrere der Aminosäurereste in Position A21, B3 und B30 sich von dem Aminosäurerest in der entsprechenden Position in menschlichem Insulin unterscheiden, und daß wahlweise kein Aminosäurerest in Position B30 vorkommt.
Gemäß einer einfacheren Definition sind derartige Analoge Analoge von menschlichem Insulin, in denen [TyrB26] nicht vorkommt, in denen [PheB25] wahlweise durch einen anderen, ungeladenen Aminosäurerest ersetzt worden ist, in dem das Kohlenstoffatom in der γ-Position sp²-hybridisiert ist, in der einer oder mehrere der Aminosäurereste in Positionen A21, B3 und B30 sich wahlweise von den Aminosäureresten in menschlichem Insulin unterscheiden und in denen wahlweise kein Aminosäurerest in Position B30 vorkommt.
Beispiele von ungeladenen Aminosäureresten, bei denen Cγ sp²-hybridisiert ist, sind Tyr, Phe, His, Trp und Asn.
Es ist möglich, weitere Substitutionen oder Derivatisierungen in die vorstehend erwähnten Analoge von menschlichem Insulin einzuführen, wenn die Eigenschaften sich nicht wesentlich ändern. Derartige weitere Derivatisierungen können Veresterungen oder Amidierungen von Carboxylgruppen, eine Acylierung oder Alkylierung von Amino- oder Hydroxylgruppen oder eine Deamidierung von Carboxamidgruppen sein. Weitere Substitutionen können ein Austausch von [ThrA8] durch His oder von [HisB10] durch Asp sein. Darüber hinaus ist es möglich, einen einzelnen oder einige wenige Amino säurereste am C- und/oder N-terminalen Ende, vorzugsweise der B-Kette, hinzuzufügen oder zu entfernen.
Eine Gruppe der erfindungsgemäßen Analoge von menschlichem Insulin wird die in der nachstehenden Formel II gezeigte Struktur besitzen, worin X Tyr, His, Phe oder Asn bedeutet, Y Thr, Ser, Ala, Asp oder Glu oder eine Deletion bedeutet, und worin wahlweise eine oder beide der unterstrichenen Asn-Reste durch Substitution oder Deamidierung zu Asp geändert wurde, oder das unterstrichene Asn in der A-Kette kann Gly sein.
Bevorzugte erfindungsgemäße Analoge von menschlichem Insulin sind die folgenden:
menschliches Des[PheB25]-Insulin
menschliches Des[TyrB26]-Insulin
menschliches Des[ThrB27]-Insulin
menschliches Des[ProB28]-Insulin
Des[PheB25]-Insulin vom Schwein
Des[ProB28]-Insulin vom Schwein
Des[ProB28]-Insulin vom Kaninchen
menschliches Des[PheB25],des[ThrB30]-Insulin
menschliches Des[TyrB26],des[ThrB30]-Insulin
menschliches [SerA21]-des[ProB28]-Insulin
menschliches [GlyA21]-des[ProB28]-Insulin
menschliches [GlyA21]-des[PheB25]-Insulin
menschliches [AspA21]-des[PheB25]-Insulin
menschliches [HisB25]-des[TyrB26],des[ThrB30]-Insulin
menschliches [AsnB25]-des[TyrB26],des[ThrB30]-Insulin
menschliches [AspA21]-des[PheB25],des[ThrB30]-Insulin
menschliches [AspB28]-des[PheB25]-Insulin
menschliches [AspB3]-des[PheB25]-Insulin
menschliches [LysB28]-Insulin
menschliches [LysB28,ThrB29]-Insulin
menschliches [ArgB28]-des[LysB29]-Insulin
Die Analoge von menschlichem Insulin gemäß der vorliegenden Erfindung können vorteilhafterweise bei der Behandlung von Diabetes eingesetzt werden, da das herabgesetzte Assoziationsvermögen zu einer schnelleren Aufnahme in den Blutstrom führt als bei normalem Insulin, nicht nur nach der normalerweise angewendeten subkutanen Injektion, sondern auch bei nicht parenteraler Verwendung, siehe z. B. die veröffentlichte internationale Anmeldung Nr. WO 87/06137. Ihre erhöhte physikalische Stabilität wird die erfindungsgemäßen Analoge ebenfalls bei der Diabetesbehandlung vorteilhafter werden lassen.
Die Insulin-Analoge gemäß der vorliegenden Erfindung können hergestellt werden, indem das Proinsulin-Gen durch Ersetzen des/der Kodons an der geeigneten Stelle in dem nativen menschlichen Proinsulin-Gen durch ein Kodon/Kodons verändert wird, die das gewünschte Aminosäure-Substitut bzw. die gewünschten Aminosäure-Substitute kodieren und/ oder durch Entfernen des/der Kodon(s), das/die der gewünschten Deletion bzw. den gewünschten Deletionen entsprechen. Alternativ dazu kann die gesamte DNA-Sequenz, die das gewünschte Insulin-Analoge kodiert, synthetisiert werden. Das Gen, das das gewünschte Insulin-Analoge kodiert, wird dann in einen geeigneten Expressionsvektor insertiert, der das gewünschte Produkt erzeugt, wenn er in einen geeigneten Wirtsorganismus überführt wird, z. B. E. coli, Bacillus oder Hefe. Das exprimierte Produkt wird dann aus den Zellen oder dem Nährmedium isoliert, je nach dem, ob das exprimierte Produkt von den Zellen sekretiert wird oder nicht.
Die neuen Insulin-Analoge können ebenfalls durch chemische Synthese mittels Verfahren erzeugt werden, die dem von Märki et al. (Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 360 (1979), 1619-1632) beschriebenen Verfahren analog sind. Sie können ebenfalls aus getrennt in vitro-hergestellten A- und B- Ketten hergestellt werden, die die geeigneten Aminosäure-Substitutionen und -Deletionen enthalten, woraufhin die modifizierten A- und B-Ketten durch Erzeugen von Disulfid-Brücken gemäß bekannter Verfahren miteinander verbunden werden (z. B. Chance et al., in: Rick DH, Gross E (Hrsg.) Peptides: Synthesis - Structure - Function. Proceedings of the seventh American peptide symposium, Illinois, S. 721-728).
Die Insulin-Analoge können weiterhin durch ein Verfahren hergestellt werden, das dem in der EP-Patentanmeldung Nr. 0163529A beschriebenen Verfahren analog ist, dessen Offenbarung hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird. Durch ein derartiges Verfahren wird ein Insulinvorläufer eines Analogen von menschlichem Insulin, bei dem die basische Aminosäure in Position B28 oder B29 (wenn das Endprodukt eine basische Aminosäure in dieser Position besitzen soll) mit GlyA1 mittels entweder einer Peptidbindung oder einer Peptidkette variierender Länge verbunden ist, durch die Hefe exprimiert und sekretiert mit richtig positionierten Disulfidbrücken und wird dann in das gewünschte Analoge von menschlichem Insulin durch das Morihara-Verfahren (Morihara supra) oder die sog. Transpeptidierungs-Reaktion (siehe US-Patent Nr. 4,343,898) umgewandelt.
Demgemäß können die vorliegenden Insulin-Analoge hergestellt werden durch Insertieren einer DNA-Sequenz, die einen Vorläufer des Insulin-Analogen kodiert, in ein geeignetes Hefe-Expressions-Vehikel, das, wenn es in Hefe überführt wird, den Vorläufer des Insulin-Analogen exprimieren und sekretieren kann, indem [LysB28], [ArgB28], [LysB29] oder [ArgB29] mit GlyA1 verbunden ist durch eine Peptidbindung oder eine Peptidkette mit der Formel III
-Rn-R¹- (III)
worin R eine Peptidkette mit n Aminosäureresten ist, n eine ganze Zahl von 0 bis 33 ist und R¹ Lys oder Arg ist, wenn die transformierte Hefe in einem geeigneten Nährmedium gezüchtet wird. Der Vorläufer wird dann aus dem Kulturmedium gewonnen und mit einer Aminoverbindung der Formel IV
Q-QR" (IV)
umgesetzt, worin Q ein einzelner Aminosäurerest, vorzugsweise Thr, oder ein Dipeptid ist und R" eine Carboxy-Schutzgruppe ist (z. B. Methyl oder tert-Butyl), unter Verwendung von Trypsin oder einem Trypsin-artigen Enzym als Katalysator in einem Gemisch von Wasser und organischen Lösungsmitteln auf analoge Weise, wie in der US-Patentschrift Nr. 4,343,898 beschrieben ist (deren Offenbarung durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird), woraufhin die Carboxy-Schutzgruppe entfernt wird und das Insulin-Analoge aus dem Reaktionsgemisch isoliert wird.
Wenn die Insulin-Analogen einen Aminosäurerest enthalten, der von Lys oder Arg als dem C-terminalen Rest in der B-Kette verschieden ist, können sie auch durch ein Verfahren hergestellt werden, daß dem in der veröffentlichten europäischen Anmeldung Nr. EP 195 691 beschriebenen Verfahren analog ist, deren Offenbarung durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird. Durch dieses Verfahren werden Insulinanalog-Vorläufer des Typs mit einer Brücke zwischen der A-Kette und der B-Kette, die aus einem einzelnen Paar von basischen Aminosäuren (Lys, Arg) bestehen, in Hefe hergestellt und dann durch eine enzymatische Umsetzung in das Insulin-Analoge umgewandelt.
Wenn der C-terminale Aminosäurerest in der B-Kette Lys oder Arg ist, dann können die Insulin-Analoge aus den vorstehenden biosynthetischen Vorläufern durch enzymatische Spaltung mit Trypsin hergestellt werden.
Erfindungsgemäße Analoge von menschlichem Insulin, in denen Substitutionen nur innerhalb der letzten Aminosäurereste, nahe dem C-terminalen Ende der B-Kette vorkommen, können darüber hinaus auf eine Weise, die per se bekannt ist, aus z. B. Schweine-Insulin hergestellt werden, wie in K. Inoye et al.; JACS 101 (3), (1979), 751-752 beschrieben wird, wodurch Schweine- Insulin zuerst mit Trypsin zu menschlichem Des(B23-30)-Insulin gespalten wird, woraufhin letzteres, ebenfalls enzymatisch, mit einem synthetischen Peptid mit der gewünschten Aminosäuresequenz gekoppelt wird.
Die vorliegenden Insulin-Analoge können zur Herstellung von neuen Insulin- Präparaten mit Insulin-Aktivität verwendet werden, um menschliches oder Schweine-Insulin in den bisher bekannten Insulin-Präparaten zu ersetzen. Derartige neue Insulin-Präparate enthalten die erfindungsgemäßen Insulin- Analoge oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon in wäßriger Lösung oder Suspension, vorzugsweise bei neutralem pH. Das wäßrige Medium wird isotonisch gemacht, z. B. mit Natriumchlorid, Natriumacetat oder Gycerol. Weiterhin kann das wäßrige Medium Zinkionen, Puffer wie Acetat und Citrat und Konservierungsstoffe wie m-Kresol, Methylparaben oder Phenol enthalten. Der pH-Wert des Präparats wird auf den geeigneten Wert eingestellt und das Insulin-Präparat wird durch Sterilfiltration sterilisiert.
Die vorliegenden Insulin-Analoge können auch mit anderen Insulin-Analogen mit einer verlängerten Insulin-Aktivität gemischt werden, um Insulin-Präparate herzustellen, die aus einem Gemisch von schnell wirkendem und protrahierendem Insulin bestehen.
Die erfindungsgemäßen Insulin-Präparate können auf ähnliche Weise wie die bekannten Insulin-Präparate verwendet werden.

Terminologie

Die für die Aminosäuren verwendeten Abkürzungen sind jene, die in J. Biol. Chem. 243 (1968), 3558 erwähnt werden. Die Aminosäuren sind in der L-Konfiguration. Sofern dies nicht anders angegeben wird, sind die hierin genannten Insulin-Spezies menschlich.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen wie folgt veranschaulicht:
Fig. 1 zeigt das Expressionsplasmid pYGABA 14276,
Fig. 2 zeigt den Hefevektor pAB24,
Fig. 3 zeigt die DNA-Sequenz des 0,4 kb EcoRI-XbaI-Fragments aus dem Plasmid pKFN-864, und
Fig. 4 zeigt die Herstellung des Expressionsplasmids pKFN-866.

Ausführliche Beschreibung

DNA-Sequenzen, die modifizierte Insulin-Vorläufer kodieren, wurden mit Basis in der Expressionskassette konstruiert, die in dem BamHI-Restriktionsfragment aus dem Expressionsplasmid pYGABA, wie in Fig. 1 gezeigt, enthalten ist, eine Länge von 1103 Basenpaaren besitzt und im wesentlichen das folgende enthält (aufgeführt in Abfolge, ausgehend von dem 5'-Ende): Den GAPDH-Promoter (Travis et al., J. Biol. Chem., 260 (1985), 4384- 4389), gefolgt von der kodierenden Region, bestehend aus: Die 83 N-terminalen Aminosäuren der MFα1-Leitsequenz, kodiert durch die Wildtyp-Hefe- DNA-Sequenz, wie von Kurjan & Herskowitz beschrieben, gefolgt von den beiden Kodons AAA und AGA, die Lys und Arg kodieren und wiederum gefolgt von der kodierenden Region für die menschliche Insulinvorläufer- Einzelkette Des[ThrB30]-Insulin (SCI), die ein synthetisch konstruiertes Gen unter Verwendung bevorzugter Hefe-Kodons ist. Nach zwei Stopp-Kodons ist eine SalI-Restriktionsschnittstelle angeordnet und der Rest der Sequenz bildet die MFα1-Sequenz, die die Terminatorregion enthält. Die Sequenz ist unter gänzlicher Anwendung von Standardverfahren konstruiert.
Das eingesetzte Verfahren war die "ortsspezifische gerichtete Mutagenese mittels Oligonukleotiden", die durch Zoller & Smith, DNA, Bd. 3, Nr. 6 (1984), 479-488 beschrieben wurde. Das Verfahren wird nachfolgend kurz beschrieben und wird in Beispiel 1 gründlich beschrieben. Die Insulin- Vorläufer-Sequenz wird aus dem Expressionsplasmid isoliert und in einen einzelsträngigen, ringförmigen M13-Bakteriophagen-Vektor insertiert. Ein auf chemische Weise synthetisierter komplementärer DNA-Strang wird dann an das einzelsträngige Genom reassoziiert. Der DNA-Strang enthält die gewünschte Sequenz, umgeben von Sequenzen, die zu den Insulin-Sequenzen auf der ringförmigen DNA vollständig homolog sind. Der Primer wird dann auf biochemische Weise in vitro unter Verwendung der Klenow-Polymerase auf die gesamte Länge des ringförmigen Genoms ausgedehnt. Dieser Strang wird dann einzelsträngige Phagen erzeugen, die es bei Wachstum in E. coli möglich machen, doppelsträngige DNA mit der gewünschten Sequenz zu isolieren. Von dieser doppelsträngigen DNA kann ein Restriktionsfragment isoliert und in den Expressionsvektor reinsertiert werden.

Wege zur Durchführung der Erfindung

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht.

BEISPIEL I

Konstruktion eines Expressionsplasmids, das zur Expression von Des[PheB25] SCI verwendet werden kann.
Die Expressionskassette, die in dem Expressionsplasmid pYGABA (in Fig. 1 gezeigt) auf einem BamHI-Restriktionsfragment enthalten ist, wurde isoliert: Das Expressionsplasmid wurde mit der Restriktionsendonuklease BamHI inkubiert. Die Bedingungen waren: 20 ug Plasmid, 50 Einheiten BamHI, 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2; und 1 mM DTT in einem Volumen von 100 ul. Die Temperatur betrug 37ºC und die Reaktionszeit 2 Stunden. Die beiden DNA-Fragmente wurden auf einem 1%- igen Agarosegel getrennt und das gewünschte Fragment wurde isoliert.

Ligation mit dem M13-Vektor M13mp18:

Das isolierte Restriktionsfragment wurde mit dem Bakteriophagenvektor M13mp18 ligiert, der ebenfalls mit der Restriktionsendonuklease BamHI in dem folgenden Reaktionsgemisch geschnitten worden war: Fragment 0,2 ug, Vektor 0,02 ug, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT und 1 mM ATP in einem Volumen von 20 ul. 5 ul dieses Gemischs wurden in den E. coli-Stamm JM101 transformiert. Die Anwesenheit des Fragments in dem Vektor und die Orientierung des Fragments wurden durch Restriktionsenzym-Kartierung von doppelsträngiger M13-DNA bestimmt, die von den Transformanten isoliert worden war.

Isolierung von Einzelstrang (ss) DNA (Matrize):

Von den vorstehend beschriebenen Transformanten wurde ss-DNA gemäß einem Verfahren, das von Messing in Gene, 19 (1982), 269-276 beschrieben wurde, isoliert.

5'-Phosphorylierung der Mutagenese-Primer:

Der Mutagenese-Primer mit der Sequenz 5'-TTGGAGTGTAGAAACCTCTT- 3' wurde am 5'-Ende in einem Reaktionsgemisch von 30 ul phosphoryliert, das 70 mM Tris-HCl, pH 7,0, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT, 1 mM ATP, 100 pmol Oligonukleotid und 3,6 Einheiten T4-Polynukleotid-Kinase enthielt. Die Reaktion wurde für 30 Min. bei 37ºC durchgeführt. Dann wurde das Enzym durch Inkubieren des Gemischs für 10 Min. bei 65ºC inaktiviert.

Reassoziierung von Matrize und phosphoryliertem Mutagenese-Primer:

Das Reassoziieren von Matrize und Primer wurde in einem Volumen von 10 ul, das 0,5 pmol Matrize, 5 pmol Primer, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl und 1 mM DTT enthielt, durch Erhitzen für 10 Min. bei 65ºC und anschließendes Abkühlen auf 0ºC durchgeführt.

Ausdehnungs-/Ligations-Reaktion:

Dem vorstehend genannten Reaktionsgemisch wurden 10 ul des folgenden Gemischs zugesetzt: 0,3 mM dATP, 0,3 mM dCTP, 0,3 mM dGTP, 0,3 mM dTTP, 1 mM ATP, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 3 Einheiten T4-DNA-Ligase und 2,5 Einheiten Klenow-Polymerase. Dann wurde die Reaktion 16 Stunden bei 16ºC durchgeführt.

Transformation von JM101:

Das vorstehend genannte Reaktionsgemisch wurde in verschiedenen Verdünnungen in CaCl&sub2;-behandelte E. coli-JM101-Zellen unter Anwendung von Standardverfahren transformiert und in 2 · YT-Top-Agar auf 2 · YT-Agar- Platten plattiert. (2 · YT = Trypton 16 g/l, Hefeextrakt 10 g/l, NaCl 5 g/l. 2 · YT-Top-Agar = 2 · YT mit 0,4% zugegebener Agarose, autoklaviert. 2 · YT Agar-Platten = 2 · YT mit 2% zugegebenem Agar, autoklaviert). Die Platten wurden über Nacht bei 37ºC inkubiert.

Identifizierung von positiven Klonen:

Das angewendete Verfahren war die Kolonie-Hybridisierung ("plaque-lift hybridisation"), die wie folgt beschrieben wird: Ein Nitrozellulose-Filter wurde auf eine Platte mit einer geeigneten Plaque-Dichte so gelegt, daß der Filter benetzt wurde. Der Filter wurde dann in den folgenden Lösungen gewaschen: 1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH für 30 Sek., 1,5 M NaCl, 0,5 M Tris-HCl, pH 8,0 für 1 Min., 2 · SSC (0,3 M NaCl, 0,03 M Natriumcitrat) bis zur späteren Verwendung. Die Filter wurden auf 3MM-Filterpapier getrocknet und für 2 Stunden bei 80ºC in einem Vakuumofen gebacken.
Der Mutagenese-Primer mit der Sequenz 5'-TTGGAGTGTAGAAACCTCTT- 3' wurde am 5'-Ende radioaktiv markiert in einem Volumen von 30 ul, das 70 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT, 10 pmol Oligonukleotid, 20 pmol γ-³²P-ATP und 3,5 Einheiten T4-Polynukleotid-Kinase enthielt. Das Gemisch wurde bei 37ºC für 30 Min. inkubiert und dann für 5 Min. bei 100ºC.
Die getrockneten Filter wurden für 2 Stunden bei 65ºC in 6 · SSC, 0,2 Rinderserumalbumin, 0,2% Ficoll, 0,2% Polyvinylpyrrolidon, 0,2% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 50 ug/ml Lachssperma-DNA prähybridisiert. Dann wurde das die markierte Sonde enthaltende Reaktionsgemisch zu 15 ml frischem Prähybridisierungs-Mix gegeben und der Filter wurde darin über Nacht bei 28ºC unter leichtem Schütteln gebadet. Nach der Hybridisierung wurde der Filter dreimal für je 15 Min. in 2 · SSC + 0,1% SDS gewaschen und autoradiographiert. Nach dem Waschen in der gleichen Lösung, aber nun bei 52ºC, und einer weiteren Autoradiographie, wurden Plaques, die DNA-Sequenzen, die zu den Mutagenese-Primern komplementär sind, identifiziert.

Erneutes Durchmustern ("re-screening") nach positiven Klonen:

Weil der identifizierte Klon ein Ergebnis einer Heteroduplex ist, wurde der Plaque nochmals plattiert. Die Hybridisierung und Identifizierung wurde wiederholt.

Reinigung von doppelsträngiger M13-Phagen-DNA:

Ein Klon, der durch das erneute Durchmustern erhalten worden war, wurde zur Infektion des E. coli-Stamms JM101 verwendet. Eine Kultur, die etwa 10&sup8; Phagen und 5 Kolonien von JM 101 enthielt, wurde für 5 Stunden in 5 ml 2 · YT-Medium bei 37ºC wachsen gelassen. Dann wurde doppelsträngige, ringförmige DNA gemäß dem Verfahren, das durch Birnboim & Doly, Nucleic Acids Res., 2 (1979), 1513 beschrieben wurde, aus dem Pellet gereinigt.

Isolierung eines Restriktionsfragments, das modifizierten Insulin-Vorläufer enthält:

Die wie vorstehend beschrieben isolierte DNA-Präparation (etwa 5 ug) wurde mit 10 Einheiten der Restriktionsendonuklease BamHI in 60 ul 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2; und 1 mM DTT für 2 Stunden bei 37ºC verdaut. Die DNA-Produkte wurden auf einem Agarosegel getrennt und die Fragmente wurden aus dem Gel gereinigt.

Ligation mit dem Hefevektor pAB24 (Fig. 2):

Das isolierte Restriktionsfragment wurde mit dem Hefevektor pAB24 ligiert, der mit der Restriktionsendonuklease BamHI in dem folgenden Reaktionsgemisch verdaut worden war: Fragment 0,2 ug, Vektor 0,02 ug, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 1 mM ATP in einem Gesamtvolumen von 20 ul. 5 ul dieses Reaktionsgemischs wurden dann zur Transformation des E. coli-Stamms MC1061 eingesetzt, in dem das modifizierte Expressionsplasmid identifiziert und vermehrt wurde. Das Plasmid war identisch zu pYGABA mit Ausnahme des entfernten Kodons.

Hefetransformation:

Die Tranformation des Expressionsplasmids in den Hefestamm Saccharomyces cerevisiae JC482ΔpepΔLeu2cirº (α, his4, pep4, ura3, leu2, cirº) wurde, wie durch Ito et al., J. Bact., Bd. 153, Nr. 1, (1983), 163-168 beschrieben, durchgeführt. Die transformierten Zellen wurden auf SC-ura-Medium (0,7 Yeast-Nitrogen-Base, 2,0% Glucose, 0,5% Casamino Acids, 2,0% Agar) zur Selektion auf Plasmid enthaltende Zellen plattiert.

BEISPIEL II

Konstruktion eines Expressionsplasmids, das zur Erzeugung von Des[TyrB26]- SCI verwendet werden kann.

Das angewendete Verfahren war im wesentlichen das gleiche wie das in Beispiel I beschriebene, mit der Ausnahme, daß der Mutagenese-Primer die Sequenz 5'-ACCCTTTGGAGTGAAGAAACCTCT-3' besaß, daß die Hybridisierungstemperatur 36ºC betrug, und daß die Waschtemperatur nach der Hybridisierung 60ºC betrug. Das modifizierte Plasmid besaß eine Sequenz, die bis auf das entfernte Kodon identisch mit der von pYGABA war.

BEISPIEL III

Konstruktion eines Expressionsplasmids, das für die Erzeugung von [HisB25],des[TyrB26]-SCI verwendet werden kann.

Das angewendete Verfahren war im wesentlichen das gleiche wie das in Beispiel I beschriebene, mit der Ausnahme, daß der Mutagenese-Primer die Sequenz 5'-AATACCCTTTGGAGTGTGGAAACCTCTTTCACC-3' besaß, daß die Hybridisierungstemperatur 43ºC betrug, und daß die Waschtemperatur nach der Hybridisierung 66ºC betrug. Das modifizierte Plasmid besaß eine Sequenz, die bis auf die modifizierten und entfernten Kodons identisch mit der von pYGABA war.

BEISPIEL IV

Konstruktion eines Expressionsplasmids, das für die Erzeugung von [AsnB25],des[TyrB26]-SCI verwendet werden kann.

Das angewendete Verfahren war im wesentlichen das gleiche wie das in Beispiel I beschriebene, mit der Ausnahme, daß der Mutagenese-Primer die Sequenz 5'-AATACCCTTTGGAGTGTGGAAACCTCTTTCACC-3' besaß, daß die Hybridisierungstemperatur 42ºC betrug, und daß die Waschtemperatur nach der Hybridisierung 65ºC betrug. Das modifizierte Plasmid besaß eine Sequenz, die bis auf die modifizierten und entfernten Kodons identisch mit der von pYGABA war.

BEISPIEL V

Expression von Vorläufer und Isolierung aus dem Kulturmedium.

Hefezellen, transformiert wie in Beispielen I bis IV beschrieben, wurden in Petri-Schalen, die Minimalmedium ohne Uracil enthielten, 48 Stunden bei 30ºC vermehrt. 100 ml fassende Schüttelkolben, die Minimalmedium ohne Uracil + 5 g/l Casamino Acids + 10 g/l Bernsteinsäure + 30 g/l Glucose bei pH 5,0 enthielten, wurden mit einer einzelnen Kolonie von der Petrischale angeimpft. Die Flaschen wurden dann 72 Stunden bei 30ºC in einem Inkubator geschüttelt.
Nach einer Zentrifugation wurde 1 Liter des vereinigten Überstands mittels Filtration sterilisiert und auf einen pH-Wert von 4-4,5 und eine Leitfähigkeit von < 10 mS durch Zugabe von 5 M HCl und Wasser eingestellt. Der Überstand wurde dann mit einer Fließgeschwindigkeit von 120 ml/h auf eine 1,6 · 6 cm-Säule von S/Sepharose®FF aufgetragen, die zuvor mit 50 mM Essigsäure, 50% (auf das Volumen bezogen) Ethanol, eingestellt auf pH 4,0 mit NaOH, äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit 60 ml Puffer gewaschen und der Vorläufer wurde dann durch einen linearen Gradienten von NaCl von 0 bis 0,35 M in 360 ml Puffer mit einer Fließgeschwindigkeit von 10 ml/h eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von 4 ml geteilt und die UV-Absorption ermittelt. Fraktionen, die Vorläufer enthielten, wurden durch RP-HPLC-Analyse identifiziert und vereinigt. Nach einem Entsalzen über eine Sephadex®G25-Säule in 1 M Essigsäure wurde der Vorläufer durch Lyophilisierung isoliert.

BEISPIEL VI

Herstellung von menschlichem Des[PheB25],des[ThrB30]-Insulin.

400 mg Des[PheB25]-SCI, hergestellt durch die in Beispielen I und V beschriebenen Verfahren, wurden in 40 ml 50 mM Tris(hydroxymethyl)- aminomethan, 20% (bezogen auf das Volumen) Ethanol, der mit HCl auf pH 9 eingestellt worden war, gelöst, und 40 ml (Volumen nach Absetzen) Sepharose®, die 32 mg immobilisiertes Trypsin in dem gleichen Puffer enthielt, wurden zugegeben. Die Suspension wurde für 24 Stunden bei 8- 10ºC unter leichtem Rühren stehengelassen und dann filtriert. Das Gel wurde mit 40 ml Puffer gewaschen, und die vereinigten Filtrate wurden auf eine 2,6 · 7,5 cm-Säule aus Q-Sepharose®FF aufgebracht, die zuvor mit 50 mM Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, 50% (auf das Volumen bezogen) Ethanol, mit HCl auf pH 8,0 eingestellt, äquilibriert worden war. Die Säule wurde dann mit einem linearen NaCl-Gradienten von 0 bis 0,15 M in dem gleichen Puffer über 6 Stunden mit einer Fließgeschwindigkeit von 225 ml/h eluiert. Die UV-Absorption des Eluats wurde bestimmt und Fraktionen, die den Hauptprotein-Peak enthielten, vereinigt. Das Protein wurde nach Entfernung des Ethanols in vacuo bei pH 5,4 ausgefällt.
250 mg menschliches Des[PheB25],des[ThrB30]-Insulin wurden durch Lyophilisation isoliert.
Die Identität des Produktes wurde durch Aminosäureanalyse, durch Plasmadesorption-Massenspektrometrie und durch sequentiellen Edman-Abbau der abgetrennten vinylpyridylierten A- und B-Ketten bestätigt.

BEISPIEL VII

Herstellung von menschlichem Des[PheB25]-Insulin.

200 mg menschliches Des[PheB25],des[ThrB30]-Insulin, hergestellt durch die in Beispiel VI beschriebenen Verfahren, wurden in einem Gemisch gelöst, das 400 mg Threoninmethylester, 2,0 ml Ethanol und 0,8 ml Wasser enthielt. Der pH-Wert wurde mit Essigsäure auf 6,3 eingestellt, und 4 ml (Volumen nach Absetzen) Sepharose®, die 3,2 mg immobilisiertes Trypsin enthielt, wurden zugegeben. Nach einem Stehenlassen für 2 h bei 20ºC unter leichtem Rühren wurde das Gel durch Filtration entfernt, und das Protein wurde durch Zugabe von 10 Volumen 2-Propanol ausgefällt. Der luftgetrocknete Niederschlag wurde in 20 mM Tris(hydroxymethyl)-aminomethan/HCl, 60% (auf das Volumen bezogen) Ethanol, pH 8,25, erneut gelöst und auf eine 2,6 · 20 cm Q-Sepharose® FF-Säule aufgebracht, die zuvor mit dem Puffer äquilibriert worden war, und mit einem linearen NaCl-Gradienten in dem gleichen Puffer, von 0 bis 0,1 M über 15 Stunden ansteigend, mit einer Fließgeschwindigkeit von 125 ml/h eluiert. Der Ethanol wurde in vacuo aus den vereinigten Fraktionen, die menschlichen Des[PheB25]-Insulin- (B30-methylester) enthielten, entfernt und das Protein wurde bei pH 6,1 ausgefällt. Die Suspension wurde zentrifugiert und der Niederschlag wurde lyophilisiert. Der Methylester wurde dann 10 Min. in kaltem 0,1 M NaOH bei einer Proteinkonzentration von 10 mg/ml hydrolysiert. Die Reaktion wurde durch Einstellen des pH-Wertes auf 8,5 beendet, und zwei Volumen 20 mM Tris(hydroxymethyl)-aminomethan/HCl, pH 8,5 wurden zugesetzt. Die Lösung wurde dann auf eine 2,6 · 20 cm Q-Sepharose®FF-Säule aufge bracht und wie vorstehend beschrieben eluiert. Das Protein wurde nach Entfernung des Ethanols in vacuo bei pH 5,5 ausgefällt.
80 mg menschliches Des[PheB25]-Insulin wurden nach Lyophilisation erhalten.
Die Identität des Produktes wurde durch Aminosäureanalyse, durch Plasmadesorption-Massenspektrometrie und durch sequentiellen Edman-Abbau der abgetrennten vinylpyridylierten A- und B-Ketten bestätigt.

BEISPIEL VIII

Herstellung von menschlichem Des[TyrB26],des[ThrB30]-Insulin.

200 mg Des[TyrB26]-SCI, hergestellt durch die in Beispielen II und V beschriebenen Verfahren, wurden in 25 ml 50 mM Tris(hydroxymethyl)- aminomethan, 20% (bezogen auf das Volumen) Ethanol, mit HCl auf pH 9 eingestellt, gelöst, und 25 ml (Volumen nach Absetzen) Sepharose®, die 20 mg immobilisiertes Trypsin in dem gleichen Puffer enthielt, wurden zugesetzt. Die Suspension wurde 24 Stunden bei 8-10ºC unter leichtem Rühren stehengelassen und dann filtriert. Das Gel wurde mit 25 ml Puffer gewaschen, und die vereinigten Filtrate wurden auf eine 2,6 · 7,5 cm-Säule aus Q-Sepharose®FF aufgebracht, die zuvor mit 50 mM Tris(hydroxymethyl)- aminomethan, 50% (auf das Volumen bezogen) Ethanol, mit HCl auf pH 8,0 eingestellt, äquilibriert worden war. Die Säule wurde dann mit einem linearen NaCl-Gradienten von 0 bis 0,15 M in dem gleichen Puffer über 6 Stunden mit einer Fließgeschwindigkeit von 225 ml/h eluiert. Die UV- Absorption des Eluats wurde bestimmt und Fraktionen, die den Hauptprotein- Peak enthielten, wurden vereinigt. Das Protein wurde nach Entfernen des Ethanols in vacuo bei pH 5,4 ausgefällt.
130 mg menschliches Des[TyrB26],des[ThrB30]-Insulin wurden durch Lyophilisation isoliert.
Die Identität des Produktes wurde durch Aminosäureanalyse und sequentiellen Edman-Abbau der abgetrennten vinylpyridylierten A- und B-Ketten bestätigt.

BEISPIEL IX

Herstellung von menschlichem [HisB25],des[TyrB26],des[ThrB30]-Insulin.

450 mg [HisB25],des[TyrB26]-SCI, hergestellt durch die in Beispielen III und V beschriebenen Verfahren, wurden gelöst in 45 ml 50 mM Tris(hydroxymethyl)-aminomethan, 20% (bezogen auf das Volumen) Ethanol, mit HCl auf pH 9 eingestellt, und 25 ml (Volumen nach Absetzen) Sepharose®, die 36 mg immobilisiertes Trypsin in dem gleichen Puffer enthielt, wurden zugegeben. Die Suspension wurde 24 Stunden bei 8-10ºC unter leichtem Rühren stehengelassen und dann filtriert. Das Gel wurde mit 40 ml Puffer gewaschen, und die vereinigten Filtrate wurden auf eine 2,6 · 7,5 cm-Säule aus Q-Sepharose®FF aufgebracht, die zuvor mit 50 mM Tris(hydroxymethyl)- aminomethan, 50% (bezogen auf das Volumen) Ethanol, eingestellt mit HCl auf pH 8,0, äquilibriert worden war. Die Säule wurde dann mit einem linearen NaCl-Gradienten von 0 bis 0,15 M in dem gleichen Puffer über 6 Stunden mit einer Fließgeschwindigkeit von 225 ml/h eluiert. Die UV- Absorption des Eluats wurde bestimmt und Fraktionen, die den Hauptprotein- Peak enthielten, wurden vereinigt. Das Protein wurde nach Entfernen des Ethanols in vacuo bei pH 5,4 ausgefällt.
200 mg menschliches [HisB25],des[TyrB26],des[ThrB30]-Insulin wurden durch Lyophilisation isoliert.
Die Identität des Produktes wurde durch Aminosäureanalyse und sequentiellen Edman-Abbau der abgetrennten vinylpyridylierten A- und B-Ketten bestätigt.

BEISPIEL X

Herstellung von menschlichem [AsnB25],des[TyrB25],des[ThrB30]-Insulin.

150 mg [AsnB25],des[TyrB26]-SCI, hergestellt durch die in Beispielen IV und V beschriebenen Verfahren, wurden in 15 ml 50 mM Tris(hydroxymethyl)- aminomethan, 20% (bezogen auf das Volumen) Ethanol, mit HCl eingestellt auf pH 9, gelöst, und 15 ml (Volumen nach Absetzen) Sepharose®, die 12 mg immobilisiertes Trypsin in dem gleichen Puffer enthielt, wurden zugegeben. Die Suspension wurde 24 Stunden bei 8-10ºC unter leichtem Rühren stehengelassen und dann filtriert. Das Gel wurde mit 40 ml Puffer gewaschen, und die vereinigten Filtrate wurden auf eine 2,6 · 7,5 cm-Säule aus Q-Sepharose®FF aufgebracht, die zuvor mit 50 mM Tris(hydroxymethyl)- aminomethan, 50% (auf das Volumen bezogen) Ethanol, mit HCl auf pH 8,0 eingestellt, äquilibriert worden war. Die Säule wurde dann mit einem linearen NaCl-Gradienten von 0 bis 0,15 in dem gleichen Puffer über 6 Stunden mit einer Fließgeschwindigkeit von 90 ml/h eluiert. Die UV-Absorption des Eluats wurde bestimmt und Fraktionen, die den Hauptprotein- Peak enthielten, wurden vereinigt. Das Protein wurde nach Entfernen des Ethanols in vacuo bei pH 5,4 ausgefällt.
80 mg menschliches [AsnB25],des[TyrB26],des[ThrB30]-Insulin wurden durch Lyophilisation isoliert.
Die Identität des Produktes wurde durch Aminosäureanalyse und sequentiellen Edman-Abbau der abgetrennten vinylpyridylierten A- und B-Ketten bestätigt.

BEISPIEL XI

Herstellung von menschlichem [AspA21],des[PheB25],des[ThrB30]-Insulin.

50 mg menschliches Des[PheB25],des[ThrB30]-Insulin, hergestellt durch die in Beispiel VI beschriebenen Verfahren, wurden in 10 ml Wasser durch Einstellen des pH-Wertes mit 1 M HCl auf 2 gelöst. Die Lösung wurde dann 16 Tage bei 30ºC stehengelassen. Nach Abkühlen (auf 20ºC) wurden 7,5 g Harnstoff zugegeben und der pH-Wert wurde mit 1 M NaOH auf 8,1 eingestellt. Die Lösung wurde dann auf eine 1,6 · 20 cm Q-Sepharose®FF- Säule aufgetragen, die zuvor mit 20 mM Tris(hydroxymethyl)-aminomethan- HCl, 7 M Harnstoff, pH 8,1, bei 4ºC äquilibriert worden war, und mit einem linearen NaCl-Gradienten in dem gleichen Puffer, ansteigend von 0 auf 0,05 M über 24 h, mit einer Fließgeschwindigkeit von 40 ml/h eluiert. Die vereinigten Fraktionen, die das Protein des letzten eluierten Peaks enthielten, wurden auf einer Säule aus Sephadex®G25 in 1 M Essigsäure entsalzt und lyophilisiert.
30 mg menschliches [AspA21],des[PheB25],des[ThrB30]-Insulin wurden erhalten.
Die Identität des Produktes wurde durch Aminosäureanalyse, durch 5-Schritt- Edman-Abbau und durch C-terminale Analyse unter Verwendung von Carboxypeptidase A bestätigt.

BEISPIEL XII

Herstellung von menschlichem [SerA21],des[ProB28]-Insulin.

Konstruktion eines Expressionsplasmids, das zur Herstellung von menschlichem [SerA21],des[ProB28]-Insulin und Gewinnung von [SerA21],des[ProB28]- Insulin verwendet werden kann.
Ein Derivat des Plasmids pUC-19, pKFN-864, das dieses Analog kodierte, wurde durch die sog. "Gapped-Duplex Mutagenesis" (Y. Morinaga et al., Biotechnology 2 (1984), 636-639) des Plasmids pKFN-734 unter Verwendung der beiden Mutagenese-Primer NOR-648 CTAGAGCCTGCGGGCTGCGTC- TAGCTGCAGTAG und Nor-745 ATTGTTCGACAATACCCTTAGCAGCCT- TGGTGTAGAAGAAACCTCTTTCACC konstruiert. Das Plasmid pKFN-734 wurde konstruiert durch Ligieren des 0,4 kb EcoRI-XbaI-Fragments, kodierend eine synthetische Hefe-Signal-Leitsequenz, im Leserahmen fusioniert an ein synthetisches Insulin-Vorläufer-Gen B(1-29)-AlaAlaLys-A(1-21) aus Plasmid pLaC212spx3, an das 2,7 kb EcoRI-XbaI-Fragment von pUC-19 (C. Yannisch-Perron et al., Gene 33 (1985), 103-119).
Plasmid pLaC212spx3 wird in Beispiel 3 und in Fig. 6 und 13 der internationalen Patentanmeldung, Veröffentlichung Nr. WO 89/02463 beschrieben.
Die DNA-Sequenz des 0,4 kb EcoRI-XbaI-Fragments von pKFN-864, die Signal-Leitsequenz-Insulin B(1-29, des28 Pro)-AlaAlaLys-A(1-21, 21 Ser) kodiert, wird in Fig. 3 wiedergegeben.
pKFN-864 wurde mit EcoRI und XbaI geschnitten, und das 0,5 kb umfassende Fragment wurde an das 9,5 kb NcoI-XbaI-Fragment von pMT636 und das 1,4 kb NcoI-EcoRI-Fragment von pMT636 ligiert, was zu dem Plasmid pKFN-866 führte, siehe Fig. 4. Das Plasmid pMT636 wurde konstruiert aus pMT608 nach Deletion des LEU-2-Gens und aus pMT479, siehe Fig. 4. pMT608 wird in EP 195 691 beschrieben. pMT479 wird in EP 163 529 beschrieben. pMT479 enthält das Schizosaccharomyces pombe TPI-Gen (POT), den S. cerevisiae Triosephosphatisomerase-Promoter und - Terminator, TPIp und TPIT (Alber, T. and Kawasaki, G., J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982), 419-434). Das Plasmid pKFN-866 enthält die folgende Sequenz:
TPIP-Signal-Leitsequenz-Insulin B(1-29, des28 Pro)-AlaAlaLys-A(1-21, 21 Ser)-TPIT.
Der S. cerevisiae-Stamm MT663 (E2-7B XE11-36 a/α, ΔtpiΔtpi, pep 4- 3/pep 4-3) wurde auf YPGaL (1% Bacto-Hefeextrakt, 2% Bacto-Pepton, 2% Galactose, 1% Lactat) auf eine O. D. bei 600 nm von 0,6 wachsen gelassen.
100 ml der resultierenden Kultur wurden durch Zentrifugation geerntet, mit 10 ml Wasser gewaschen, rezentrifugiert und resuspendiert in 10 ml einer Lösung, die 1,2 M Sorbit, 25 mM Na&sub2;EDTA pH = 8,0, und 6,7 mg/ml Dithiotreitol enthielt. Die Suspension wurde bei 30ºC für 15 Minuten inkubiert, zentrifugiert und die Zellen wurden in 10 ml einer Lösung resuspendiert, die 1,2 M Sorbit, 10 mM Na&sub2;EDTA, 0,1 M Natriumcitrat pH = 5,8, und 2 mg Novozym® 234 enthielt. Die Suspension wurde bei 30ºC für 30 Minuten inkubiert, die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt, in 10 ml 1,2 M Sorbit und 10 ml CAS (1,2 M Sorbit, 10 mM CaCl&sub2;, 10 mM Tris-HCl (Tris = Tris(hydroxymethyl)-aminomethan), pH 7,5, gewaschen und in 2 ml CAS resuspendiert. Zur Transformation wurden 0,1 ml CAS-resuspendierte Zellen mit etwa 1 ug des Plasmids pKFN-866 gemischt und bei Raumtemperatur 15 Minuten stehengelassen. 1 ml von (20% Polyethylenglycol 4000, 10 mM CaCl&sub2;, 10 mM Tris-HCl, pH = 7,5) wurden zugesetzt und das Gemisch wurde für weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Das Gemisch wurde zentrifugiert und das Pellet in 0,1 ml SOS (1,2 M Sorbit, 33% (Vol./Vol.) YPD, 6,7 mM CaCl&sub2;, 14 ug/ml Leucin) resuspendiert und bei 30ºC für 2 Stunden inkubiert. Die Suspension wurde dann zentrifugiert und das Pellet wurde in 0,5 ml 1,2 M Sorbit resuspendiert. Dann wurden 6 ml Top-Agar (das SC- Medium von Sherman et al., (Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981), das 1,2 M Sorbit plus 2,5% Agar enthält) bei 52ºC zugegeben und die Suspension wurde auf die Oberfläche der Platten gegossen, die das gleiche Agar-verfestigte, Sorbit enthaltende Medium enthielten. Transformanten-Kolonien wurden nach 3 Tagen bei 30ºC "gepickt", reisoliert und verwendet, um Flüssigkulturen anzuimpfen. Eine derartige Transformante, KFN-883, wurde zur weiteren Charakterisierung ausgewählt.
Der Hefestamm KFN-883 wurde auf YPD-Medium (1% Hefeextrakt, 2% Pepton (von Difco Laboratories), und 2% Glucose) wachsen gelassen. Eine 10 ml-Kultur des Stamms wurde bei 30ºC bis zu einer O. D. bei 600 nm von 20 geschüttelt. Nach Zentrifugation wurde der Überstand, wie beschrieben, durch HPLC analysiert (L. Snel et al., Chromatographia 24 (1987), 329-332). Die Ausbeute betrug etwa 0,14 mg/l Insulin B (1-29, des28 Pro)- AlaAlaLys-A(1-21, 21 Ser).
Der Einzelketten-Insulin-Vorläufer wurde aus dem Fermentations-Überstand durch Adsorption an eine Ionenaustausch-Säule bei niedrigem pH-Wert, Desorption bei hohem pH-Wert und Ausfällen des Pools durch Zinkionen isoliert. Die Transpeptidierung des Vorläufers zu menschlichem [SerA21], des[ProB28], [ThrB30-OMe]-Insulin geschah wie folgt:
10 mmol (2,35 g) Threoninmethylester und Eisessig wurden in DMF unter Erhalt von 5 ml gelöst, 2,5 ml 76,5% (Vol./Vol.) DMF in Wasser wurden zugesetzt und 0,5 g Vorläufer wurden in dem Gemisch gelöst, das auf 12ºC gehalten wurde; dann wurden 50 mg Trypsin in 1,25 ml 0,05 M Calciumacetat zugegeben und nach 24 Stunden bei 12ºC wurde das Reaktionsgemisch zu 100 ml Aceton zur Ausfällung der Peptide zugegeben, die dann abzentrifugiert und in vacuo getrocknet wurden.
Der isolierte Insulin-Analog-Ester wurde auf einer präparativen HPLC-Säule unter Verwendung einer Kieselgel-C18-Matrix bei saurem pH gereinigt. Dann wurde der gereinigte Ester in wäßrigem Medium bei pH 10 und 25ºC für 24 Stunden hydrolisiert. Das geformte menschliche [SerA21],des[ProB28] Insulin wurde bei neutralem pH mit Zinkionen ausgefällt. Der Niederschlag wurde durch Anionenaustausch-Chromatographie gereinigt und anschließend durch Gelfiltration entsalzt. Die Ausbeute an lyophilisiertem menschlichen [SerA21],des[ProB28]-Insulin betrug 102 mg.

BEISPIEL XIII

Herstellung von menschlichem Des[ThrB27]-Insulin.

1 g Zn-freies Schweine-Insulin wurde in 40 ml Wasser gelöst, indem der pH-Wert auf 9 eingestellt wurde, und eine Lösung von 50 mg Schweine- Trypsin in 10 ml 0,25 M Ammoniumhydrogencarbonat, mit Ammoniaklösung auf pH 9 eingestellt, wurde zugegeben. Die Lösung wurde dann bei 4º stehengelassen und nach 48 Stunden stellte man eine Ausbeute von 65% durch HPLC-Analyse fest. Das Reaktionsgemisch wurde dann bei 4ºC über eine 5 · 90 cm-Säule aus Sephadex®G50 Superfine in 0,05 M Ammoniumhydrogencarbonat mit einer Flußgeschwindigkeit von 90 ml/h gelfiltriert. Fraktionen, die den Hauptprotein-Peak enthielten, wurden vereinigt und lyophilisiert. Die Ausbeute betrug 520 mg an menschlichem Des(B23-B30)- Insulin.
Ein Peptid mit der Sequenz Gly-Phe-Phe-Tyr-Pro-Lys-Thr wurde auf einem PAM-Harz mittels geschützter symmetrischer Aminosäureanhydride mit Hilfe eines Peptidsynthesegerätes von Applied Biosystems synthetisiert. Schließlich wurde das Peptid durch wasserfreies Hydrogenfluorid bei 0ºC von dem Harz abgespalten, wodurch die übrigen Schutzgruppen gleichzeitig entfernt wurden.
200 mg menschliches Des(B23-B30)-Insulin und 400 mg Peptid wurden in einem Gemisch von 2,40 ml Dimethylformamid und 1,20 ml Wasser gelöst und der pH-Wert des Gemischs wurde mit Triethylamin auf 6,5 eingestellt. Es wurden dann 10 mg Schweine-Trypsin in 0,20 ml Wasser zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde bei 20ºC 4 Stunden stehengelassen. Die Reaktion wurde dann durch Zugabe von 25 ml 2-Propanol beendet und die ausgefällten Proteine wurden durch Zentrifugation isoliert. Der entwässerte Niederschlag wurde in 10 ml 1 M Essigsäure erneut gelöst und auf eine 2,6 · 20 cm-Säule aus Lichroprep® RP-18 (25-40 um) aufgebracht, die zuvor mit 0, 5 mM HCl, 0,1 M Natriumchlorid in 30% (auf das Volumen bezogen) Ethanol äquilibriert worden war. Die Säule wurde dann bei 20ºC mit einer Fließgeschwindigkeit von 20 ml/h mit dem gleichen Puffer, aber mit einem linearen Anstieg des Ethanolgehalts auf 50% über 24 Stunden eluiert. Die UV-Absorption des Eluats wurde verfolgt und Fraktionen, die den Hauptprotein-Peak enthielten, wurden vereinigt. Das Protein wurde durch Verdünnung mit dem gleichen Volumen an Wasser und Einstellen des pH- Wertes auf 5,5 mit einer Natriumhydroxid-Lösung ausgefällt. Nach einem Stehenlassen bei 4ºC für 1 Stunde wurde der Niederschlag durch Zentrifugation und Lyophilisation isoliert.
Die Ausbeute betrug 80 mg menschliches Des[ThrB27]-Insulin, das dann durch sequentiellen Edman-Abbau der abgetrennten vinylpyridylierten A- und B-Ketten identifiziert wurde.

BEISPIEL XIV

Formulierung einer injizierbaren Lösung.

60 umol eines erfindungsgemäßen Analogen von menschlichem Insulin wurden in 4 ml 0,1 M HCl gelöst und 20 ml 1,5% m-Kresol wurden zugegeben. Diese Lösung wurde nun mit 40 ml 4% Glycerin und 20 ml 65 mM Dinatriumhydrogenphosphat gemischt, und der pH-Wert wurde auf 7,3 eingestellt. Schließlich wurde die Lösung mit Wasser auf 100 ml eingestellt und durch Filtration sterilisiert.

BEISPIEL XV

Bewertung des Assoziationsgrades.

Eine 2,6 cm · 88 cm-Säule aus Sephadex®G-75 wurde mit 13 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,3, mit einer Fließgeschwindigkeit von 22 ml/h äquilibriert. Durch Aufbringen von menschlichem Des(octapeptid-B²³&supmin;³&sup0;)- Insulin, Cytochrome C, Ribonuklease und mono- und dimerem Myoglobin als Molekulargewichtsmarkern würde eine Kurve erstellt, die das Molekulargewicht als eine Funktion des Elutionsvolumens darstellt.
Durch Aufbringen von 1 ml Lösung, die 0,6 mM Zn-freies menschliches Insulin oder 0,6 mM Insulin-Analog enthielt und wie in Beispiel XII hergestellt wurde, wurde festgestellt, daß. Zn-freies menschliches Insulin als ein "tailing peak" mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 14 kD eluiert, und daß die Analogen, die wie in Beispielen VI bis X hergestellt worden waren, alle als ein symmetrischer Peak mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 5 kD eluiert wurden.
Diese Ergebnisse zeigen an, daß erfindungsgemäße Analoge von menschlichem Insulin in Lösung bei pH 7,3 im wesentlichen monomer sind, während normales menschliches Insulin unter den gleichen Bedingungen zu einem hohen Grad als ein Gemisch von Dimeren und höheren Oligomeren erscheint.

BEISPIEL XVI

Bewertung der biologischen Aktivität.

Die biologische Aktivität in vitro wurde bestimmt mittels Messen der Bindungsaffinität an die Insulinrezeptoren von isolierten Ratten-Adipozyten und -Hepatozyten, im wesentlichen wie in J. Gliemann, S. Gammeltoft: Diabetologia 10 (1974), 105-113 beschrieben.
Die Insulin-Analoge wurden mit semisynthetischem menschlichen Insulin verglichen, dessen Potenz zu 100% gesetzt wurde, und die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle gezeigt:
Die in der vorstehenden Beschreibung, den anschließenden Patentansprüchen und/oder den begleitenden Zeichnungen offenbarten Merkmale können sowohl getrennt oder in jeder beliebigen Kombination für die Realisierung der Erfindung in deren verschiedenen Formen wesentlich sein.

Claims

1. Analoga des menschlichen Insulin, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Position B28, das heißt in Position 8 in der B-Kette, gerechnet von [GlyB20], einen Lys-Rest aufweisen.

2. Die Analoga des menschlichen Insulin nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie in dem C-terminalen Ende der B-Kette von [PheB24] bis zum C-terminalen Aminosäurerest zusätzlich modifiziert sind.

3. Die Analoga des menschlichen Insulin nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Reste A21 und/oder B3 kein Asn sind.

4. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend ein Analogon des menschlichen Insulin nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder eines seiner pharmazeutisch verträglichen Salze und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

5. Die pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei das Analogon des Insulin bei pH 7,3 eine geringe Löslichkeit aufweist.

6. Die pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei das Anlogon des Insulin im wesentlichen monomer ist.

7. Die pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung als eine wäßrige Lösung formuliert ist.

8. Die pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung als eine wäßrige Suspension formuliert ist.

9. Die pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei der pharmazeutisch verträgliche Träger eine wäßrige isotonische Lösung ist.

10. Die pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei die wäßrige Lösung, die wäßrige Suspension oder die wäßrige isotonische Lösung weiterhin Zink-Ionen und/oder einen Puffer wie Acetat oder Citrat und/oder ein Koservierungsmittel wie m-Kresol, Methylparaben oder Phenol enthalten.

11. Die pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung mehr als ein Analogon des Insulin enthält.

12. Die pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung für die Verabreichung über die Schleimhaut (mucosale Verabreichung) oder die transcutane Verabreichung formuliert ist.

13. Die pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung für die parenterale Verabreichung formuliert ist.