JPH04502465A - ヒトインシュリン類似物質 - Google Patents
ヒトインシュリン類似物質Info
- Publication number
- JPH04502465A JPH04502465A JP2501698A JP50169890A JPH04502465A JP H04502465 A JPH04502465 A JP H04502465A JP 2501698 A JP2501698 A JP 2501698A JP 50169890 A JP50169890 A JP 50169890A JP H04502465 A JPH04502465 A JP H04502465A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- group
- asp
- thr
- asn
- ser
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Obesity (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Fats And Perfumes (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ヒトインシュリン類似物質
技術分野
本発明は溶液において低い会合能力を示す新規ヒトインシュリン類似物質、この
ようなインシュリン類似物質の調製方法、本発明のヒトインシュリン類似物質を
含むインシュリン製剤およびこれらのヒトインシュリン[1物質を使用する糖尿
病の処置方法に関する。
背景技術
1922年のインシュリン発見以来ずっと、多くの異なったタイプのインシュリ
ン製剤が糖尿病の治療に使用されてきている。当初はインシュリン活性を迅速に
開始しそして比較的迅速に終わらせるインシュリン溶液のみを使用していたが、
後にはたとえば亜鉛塩および/またはプロタミンのような添加剤を用いてインシ
ュリンの溶解性を低めることにより得られたより広い活性プロフィールを示すイ
ンシュリン製剤が作られるようになった。入手性の理由からこれに使用されるイ
ンシュリンは家畜たとえば最も頻繁にはウシ、ブタおよびヒツジからの膵臓から
取り出されていたが、しかしながら最近ではバイオチクノロシイによるヒトイン
シュリンを含む製剤もまた市場に現われてきている。
ヒトインシュリンの構造は以下の式で示される:B−鎖(続き)
ある種の家畜からのインシュリンはヒトインシュリンと構造的に非常に似ている
。すなわちイヌおよびブタインシュリンはB鎖の30位にAlaを含むことだけ
がヒトインシュリンと異なり、ウサギインシュリンは同じ位置にSetを含むこ
とだけが異なる。これらのインシュリンは、モリハラら(Mortharaet
、al)、 Nature 280 (1979)、 412 413およびマ
ルクッセンMarcussen (米国特許第4.343,898号)により記
載された半合成法によりB50−アミノ酸残基をThrで置換することによりヒ
トインシュリンへ転化されうる。
このようなインシュリンが生理学的pH値で溶解する場合、濃度依存性会合平衡
は単量体、二量体、四量体、六量体の間および重合体インシュリンの間でも確立
される。平衡は、たとえば超遠心分離、浸透圧法またはゲル濾過法により測定さ
れ、これはたとえばアール、ヴアルデスジュニア(R,ValdesJr、)お
よびシイ、ニー、アッカーズG、A、^ckersS”メリーズインエンザイモ
ロジ4 (Methods in enzy*ology)’、Vol、61(
エンザイムストラクチュアEnzy+we 5tructure、バートH0著
:ヒルスアンドティマシェフ旧rs & Timasheff) 、アカデミツ
クブレス1979. p125−142を参照せよ。インシュリン製剤の一般的
配合においてこの平衡は非常に高程度のインシュリンが六量体形であるようにシ
フトされる。
インシュリン分子における置換基は、糖尿病の治療においてインシュリンの活性
プロフィールを向上する目的で導入されうる。すなわち、公開国際出願筒No
86105497号には、インシュリン分子における中性アミノ酸残基によるG
luの1個以上の置換が、注射後のゆっくりした放出が得られるようにインシュ
リンの沈澱ゾーンのシフトを起こすことが記載されている。
さらに、公開ヨーロッパ出願第F!P 21411126号には注射後に特に迅
速に吸収されるインシュリン類似物質が記載されている。この効果は、インシュ
リン分子にて89−812の領域およびB26−828位における特にある種の
置換基によりインシュリンの会合傾向が抑制されやすく、このためほとんど単量
体または二量体として存在することの結果である。しかしながらこれらインシュ
リン類似物質の多くは低い生物活性を示す。
長年の間、活性における構造の影響を明らかにする目的で、非常に多数の人工的
に作られたヒトインシュリン類似物質が記載されており、これらはたとえばメル
ケら(Mirke et al、)、Hoppe−5eyler’s Z、Ph
ysiol、Che+++、 360 (1979)、1619−1632を参
照せよ、レセプター結合におけるインシュリンの(B22−826)−配列での
置換基の影響の研究は、前記配列がインシュリンレセプターに対する結合の実質
的部位であると考えられそして天然産生突然変異体が前記部位において置換基を
備えていることが見出されたので、特に興味深いものである。
たとえばニス、シェールソンら(S、5hoelson et al、) 、P
NAS80 (1983)、 7390−7394およびエム、コバヤシら(M
、Kobayashiet al、) : Biomed、Res、5 (3)
(1984)、 267−272を参照せよ。
非常に低い生物学的活性がPhe (B24)またはPhe (825)が置換
された類似物質について見出され、したがってこれら2つのアミノ酸の存在がレ
セプター結合に対しきわめて重要であることが結論された。
本発明は、アミノ酸残基(p he l l a )または〔Phe′〕の1つ
が存在しないある種のヒトインシュリン類似物質が溶液において低い会合傾向を
示し、同時にヒトインシュリンよりもインビトロでの生物学的活性が変わらない
かまたはそれ以上であるという驚くべき認識に基づ<、(Phe”’ )または
(Phe”’ )のいずれかの欠失は(Ly s * ” q )が(Lysl
!I )へ移動するという効果を有する。ヒトインシュリン分子におけるこの部
位での陽電荷の位置は本発明の重要な見地であると考えられる。
発明の要約
最も広い見地において、本発明は828位すなわち(に1ylffio)から計
算してB鎖における8番目の位置において陽性に帯電されたアミノ酸残基、すな
わちLysまたはArgが存在するヒトインシュリン類似物質に関連する。
本発明インシュリン類似物質は驚くべきことに低い会合傾向を有し、同時に低会
合傾向を有する他のインシュリン類似物質と比べて向上した物理的安定性を示す
、828位における陽電荷の導入は2つの方法で行なわれる。ヒトインシュリン
分子におけるB24 、 B25 、 B26 、 B27または828位のア
ミノ酸残基の1つを欠失して828位にLysを有するヒトインシュリン類似物
質とするかまたはヒトインシュリン分子における〔Proltl′〕をLysま
たはArgで置換するかのいずれかである。Argが828位で好ましい場合、
B24 、 B25 、 B26 、 B27または828におけるアミノ酸残
基の1つの欠失をもとからの〔LysI1g′〕のArg残基との置換と組合わ
せる。
本発明ヒトインシュリン類似物質はさらにヒトインシュリンと比べてB鎖のC末
端に1つ以上の変性を含む。すなわち、B25から827位のアミノ酸残基およ
び(Lys”” )または(A、gl!l )に続くアミノ酸残基を天然産生ア
ミノ酸残基の間から任意に選択するかまたはB29もしくはB30またはその両
方ともを欠失させてもよい。
本発明の一つの見地において、(Tyr”’ )は、側鎖における二番目の炭素
原子(Cr)がsp冨−ハイブリッド化された(結合は平面構造を有する)別の
非帯電アミノ酸残基により置換されてもよい。
化学的分解に対し分子を安定化する目的で、A21位および/または83位にお
けるAsnをさらに別のアミノ酸残基で置き換えてもよい。
本発明インシュリン類似物質は、次式I:B−鎖(続き)
Xr−Xz−Xs−Xa−Xs−Xh
(式中、Xl、Xz、Xx、Xs、Y+およびYtはいずれかの天然産生アミノ
酸残基であり、X4はLysまたはArgであり、X。
はC末端ヒドロキシ基を有する天然産生アミノ酸残基または−OHであり、また
はXsおよびXhは一緒になってC末端ヒドロキシ基を形成する)で表わされる
ことが特徴的である。
天然産生アミノ酸残基からなる群から選択される。
上記式においてYlおよび/またはY2は一実施態様において^snを除くいず
れかの天然産生アミノ酸残基からなる群から選択される。
上記式IにおいてXlは特にPhe、 Ala、 Hts+ Thr、 Ser
。
AsnまたはTyrであり、
X2は特にTyr、 Thr、 Glu、^Sp+^la、旧s、 Serまた
はPheであり、
X、は特にPro、 G1u+^sp、 Ser、 Thrまたは旧Sであり、
X、は特にLys、 Thr、 Ser、^la、 AspまたはGluであり
、X6は特にThr−OR、5er−OR、^1a−OH、Asp−OR。
Glu−OHまたは一〇Hであり、
Yl はAsn、 Glu、 ASI)、 HISI Ser、 Thr、 V
al+ Leu、 Ile。
^1a、 Met、 Trp、 Tyr、 GinまたはGty、特に好ましく
はGuy。
Asp、 GluまたはAlaであり、Ytは^sn+ Glu、 Asp、
Ris、 Ser+ Thr、 Val+ Leu、 lie。
Ala、 Met+ Trp+ Tyr+ GlnまたはGuy 、特に好まし
くはGluまたはAspである。
本発明ヒトインシュリン類似物質の一群は、B24または825位におけるアミ
ノ酸残基の1つが欠失し、826位におけるアミノ酸残基が場合によりγ位の炭
素原子が−s p 1−混成である別の非帯電アミノ酸残基により置換され、場
合によりA21 、 B 3および830位のアミノ酸残基の1つ以上がヒトイ
ンシュリンにおける相当する位置でのアミノ酸残基と異なり、そして場合により
830位にアミノ酸残基が存在しないようなものが特徴的である。
より簡単な定義によれば、このような類似物質は[7yr1m&]が存在せず、
(p he l t S )が1位の炭素原子がs p 2−混成である別の非
帯電アミノ酸残基により場合により置換され、A21 、 B 3および830
位のアミノ酸残基の1つ以上が場合によりヒトインシュリンにおけるアミノ酸残
基と異なり、そして場合により830位におけるアミノ酸残基が存在しないヒト
インシュリン類似物質である。
C1がs p R−混成である非帯電アミノ酸残基の例はTyr。
Phe、 His、 Trpおよび^snである。
特性がほとんど変わらない場合、上述のヒトインシュリン類似物質において別の
置換または誘導化を導入することもできる。このような別の誘導化はカルボキシ
ル基のエステル化もしくはアミド化、アミノ−もしくはヒドロキシル基のアシル
化もしくはアルキル化であるか、またはカルボキサミド基の脱アミド化である。
別の置換は旧Sによる( Thr”)の交換またはAspによる( H4511
113の交換である。さらに、好ましくはB鎖のC末端および/またはN末端で
のアミノ酸残基の1個または多数個を添加または欠失することもできる。
本発明によるヒトインシュリン類似物質の一群は、以下の式■で示される構造を
有するもので、該式中XはTyr、 His+Pheまたは^snを意味し、Y
はThr+ Ser+ A1a+ AspもしくはGluまたは欠失を意味しそ
して場合により下線を引いたAsnの1つまたは両方ともが置換または脱アミド
化によりAspへ変えられるかまたはA鎖における下線を引いたAsnがcty
であるものである。
H−Phe−Va 1−Asn−Gin−H1s−Leu−Cys−Gly−S
er−His−Leu−Va IB−鎖(続き)
X−Thr−Pro−Lys−Y−OH本発明による好ましいヒトインシュリン
類似物質は次のものである:
デス(p he I t % )−ヒトインシュリンデス(7y、1t& )−
ヒトインシュリンデス〔ThrI!7〕−ヒトインシュリンデス(Pro″!I
I )−ヒトインシュリンデス(phel、s )−ブタインシュリンデス(p
ro■17 )−ブタインシュリンデス(proI!I )−ウサギインシュリ
ンデス(Phe”’ ) 、デス〔Thr13o〕−ヒトインシュリンデス(1
yr1t& )、デス(rhrl!11 )−ヒトインシュリン(Se、All
)−デス(p 、o l * I )−ヒトインシュリン(Gly”’ )−
デス(Pro”″”〕−ヒトインシュリン(G 1 y A ! + )−デス
(p h e l t S )−ヒトインシュリン(As、All )−デス(
p h e m Z S )−ヒトインシュリン〔旧s15〕−デス(Tyr”
” ) 、デス(7hr136 )−ヒトインシュリン
〔^snl1gs〕−デス(7yrI!6 )、デス(7hrl!11 )−ヒ
トインシュリン
(As、All )−デス(Phe”’ ) 、デス(71,r136 )−ヒ
トインシュリン
(AspIt@ )−デス〔Phel125〕−ヒトインシュリン(Asp”)
−デス(p he 11 S )−ヒトインシュリン(LysI□z8〕−ヒト
インシュリン(ly’sl!II、 7hrl!! )−ヒトインシュリン(A
rg″ts )−デス〔Lyslt9〕−ヒトインシュリン本発明によるヒトイ
ンシュリン類似物質は、会合能力の低下により通常使用される皮下注射の後ばか
りでなく非−腸管外投与の後もまた本来のインシュリンに比べて血流により迅速
に吸収されるので、糖尿病の治療に有利に使用される。たとえば、公開国際出願
第−o 87106137号参照。またこれらの向上した物理的安定性により、
これらが糖尿病治療においてさらに有利になる。
本発明によるインシュリン類似物質は、所望のアミノ酸残基置換基をコードする
コドンにより天然ヒトプロインシュリン遺伝子における適当な部位のコドンを置
換するか、および/または所望の欠失に相当するコドンを欠失させることにより
プロインシュリン遺伝子を変化させることで調製される。
これとは別に、所望のインシュリン類似物質をコードする全DNA配列を合成す
ることもできる0次いで所望のインシュリン類似物質をコードする遺伝子を適当
な発現ベクターへ挿入し、これは適当な宿主微生物たとえば大腸菌、バチルス菌
または酵母へ移されると所望の産生物を生ずる0発現産生物は、これが細胞から
分泌されるか否かに応じて細胞からまたは培養ブロスから単離される。
新規インシュリン類似物質はまたメルキら(Mirki et al、)により
記載された方法(ホッペーセイラーズHoppe−Seyler’sZ、Phy
siol、Ches+、、 360(1979)、 1619−1632)によ
る化学的合成によっても調製される。これらはまた適当なアミノ酸残基置換基お
よび欠失を含む別々にインビトロで調製されたA鎖およびB鎖から形成され、そ
の後修飾されたA鎖およびBl[を公知方法によるジスルフィド橋を確立するこ
とにより一緒に結合する(たとえば、チャンスらChance et al、、
リックディエッチRick Dl、グロスイーGross E(著)ペプチド:
合成−構造−機能。Proceedings of the 5eventh
Americanpeptide syvposium、イリノイ州、pp72
1−728)。
インシュリン類似物質はさらにヨーロッパ特許出願第0163529A号と記載
された方法と同じ方法で調製され、この記載はここに参考として編入される。こ
のような方法により、82Bおよび829位の塩基性アミノ酸(もし最終生成物
がこの位置に塩基性アミノ酸を有すべき場合)がペプチド結合または可変長のペ
プチド鎖のいずれかによりに1.AIと結合しているヒトインシュリン類似物質
のインシュリン前駆体が正しい位置にジスルフィド橋を有して酵母により発現さ
れ分泌され、そして次いでモリハラ法(モリハラ、同上)またはいわゆるペプチ
ド転移反応(米国特許第4343898号参照)により所望のヒトインシュリン
類似物質へ転化される。
したがって本発明インシュリン類(以物質は、当該インシュリン類似物質の前駆
体をエンコードするDNA配列を、これが酵母へ移された時に適当な普通培地中
で形質転換された酵母菌株を培養するとペプチド結合まば次式■−R,,−R’
−(III)
(式中、Rはn個のアミノ酸残基を有するペプチド鎖であり、nはO〜33の整
数であり、R1はLysまたはArgである)で表わされるペプチド鎖により[
1ysl!II 3 、(4rgI!a )。
(Lysl!? )または(Arg”9]がに1yAl!l と接続するインシ
ュリン1!伯物質の前駆体を発現および分泌しうる適当な酵母発現ビヒクルへ挿
入することにより調製されるものである。
次いで前駆体を培養ブロスから回収し、米国特許明細書箱4.343.898号
(その記載は参考としてここに編入される)に記載のように、次式■
Q−OR” (IV)
(式中、Qは1個のアミノ酸残基好ましくはThrまたはジペプチドであり、R
rrはカルボキシ保護基(たとえばメチルまたはter t−ブチル基)である
)で表わされるアミノ化合物と水および有機溶媒の混液中触媒としてトリプシン
またはトリプシン様酵母を用いて反応させ、それからカルボキシ保護基を除き、
インシュリン類似物質を反応混合物から単離する。
インシュリン類似物質がB鎖においてC末端残基としてLysまたはArgと異
なるアミノ酸残基を含む場合、これらはまた公開ヨーロッパ出願第EP 195
691号に記載された方法と同じ方法により調製され、その記載は参考としてこ
こに編入される。この方法により塩基性アミノ酸(Lys、Arg)の1対から
なるA鎖およびB鎖間の橋を有するタイプのインシュリン類似物質前駆体が酵母
中で作られ次いで酵素転化によりインシュリン類似物質へ転化される。
BI[におけるC末端アミノ酸残基がLysまたはArgである場合、インシュ
リン類似物質はトリプシンを用いた酵素開裂により前記生合成前駆体から構成さ
れる装置換基がB鎖のC末端に最も近い最後のアミノ酸残基内にのみ存在する本
発明のヒトインシュリン類似物質はさらにそれ自体公知の方法でたとえばケイ、
イノウニら(K、rnoye etal、) : JACS 101 (3)、
(1979)、 751−752に記載のようにブタインシュリンからさらに調
製され、これによればブタインシュリンを最初にトリプシンで分裂させてデス−
(B 23−30)−ヒトインシュリンとしその後で後者を所望のアミノ酸配列
を有する合成ペプチドと酵素的に結合させる。
本発明インシュリン類似物質は、当該技術でこれまで知られているインシュリン
製剤中にヒトまたはブタインシュリンと置き換えられるべきインシュリン活性を
有する新規インシュリン製剤の調製に使用される。このような新規インシュリン
製剤は本発明によるインシュリン類似物質またはその薬剤上許容されうる塩を、
好ましくは中性pHにて水溶液または懸濁液中に含有する。水性媒体はたとえば
塩化ナトリウム、酢酸ナトリウムまたはグリセロールで等張化される。さらに、
水性媒体は亜鉛イオン、緩衝剤たとえば酢酸塩およびクエン酸塩および保存剤た
とえばm−クレゾール、メチルパラベンまたはフェノールを含む。調製剤のpH
値は所望の値に調整されそしてインシュリン製剤は滅菌濾過により滅菌される。
本発明インシュリン類似物質はまた遅延性インシュリン活性を有する別のインシ
ュリン類似物質と混合して迅速作用および遅延インシュリンの混合物からなるイ
ンシュリン製剤を調製する。
本発明のインシュリン製剤は公知インシュリン製剤の使用と同様に使用されうる
。
学術用語
アミノ酸について使用される記号はJ、Biol、Chem、 243(198
6)、 355Bに記載されたものである。アミノ酸はL型装置である。特記し
ない限り、ここに記載したインシュリンの種類はヒトである。
図面の簡単な説明
本発明は添付の図面を参考にしてさらに説明される。
第1図は発現プラスミドpYGABA 14276を表わし、第2図は酵母ベク
ターpAB24を表わし、第3図はプラスミドpKFN −864からの0.4
kb EcoRr−XbalフラグメントのDNA配列を表わし、
第4図は発現プラスミドpKFN−866の調製を表わす。
詳細な説明
修飾されたインシュリン前駆体をエンコードするDNA配列を、発現カセット中
で塩基とともに構築する。前記カセットは第1図に示すように発現プラスミドp
YGABAからのBamHI制限フラグメントに含まれ、1103塩基対の長さ
を有しそして実質的に次のものを含む(5′末端から出発して連続的に挙げるン
: GAPr)Hプロモーター(トラビスらTravis et al、、 J
。
Biol、Ches+、、 260 (1985)、 4384−4389)と
これに続(次のものからなるコード領域:クルジャンおよびヘルスコウィッッ(
Kurjan & Herskowitz)により記載されたように野生型酵母
DNA−配列によりエンコードされたMFIyl−リーダー配列の83N末端ア
ミノ酸とこれに続< LysおよびArgをエンコードする2つのコドンAAA
およびAGAおよび再びインシュリン前駆体一本鎖デス(7hrlffl+ 3
−ヒトインシュリン(SCI)に対するコード領域であって、これは好ましい酵
母コドンを用いて合成的に構築された遺伝子である。2つのストップコドンの後
に、5ail制限部位が位置し、そして配列の停止はターミネーター領域を含む
MP、1配列を構成する。配列は全く一般的な技術を用いて構築される。
使用した方法は“オリゴヌクレオチド特定部位の突然変異誘発”であり、これは
シラーとスミス(Zoller & Sm1th)、DAN、 Vo13. N
a6(1984)、479−488により記載されている。
方法を以下に簡単に記載し、例1において十分に記載する。
インシ工リン前駆体配列を発現プラスミドから単離しそして一重鎖ゲツム、環状
M13バクテリオファージベクターへ挿入する。化学的に合成された相補的DN
Aストランドをアニールして一重鎖ゲツムとする。DNAストランドは環状DN
Aにおいてインシュリン配列と完全に均質な配列により囲まれた所望の配列を含
む。次いでプライマーをタレノウポリメラーゼを用いて生化学的に環状ゲノムの
全長までインビトロで延長する。このストランドは一重鎖ファージのもとであり
、これを大腸菌中で増殖すると所望の配列を有する二重鎖DNAを単離すること
ができる。この二重鎖DNAから制限フラグメントを単離しそして発現ベクター
へ再度挿入する。
発明の実施態様
本発明をさらに次の例により説明する。
実施例1
デス(Phe”ゝ)−5CIを発現するために使用される発現プラスミドの構築
Bag旧制比制限フラグメント上現プラスミドpYGABA (第1図に示す)
に含まれる発現カセットを単離した二発現プラスミドを制限エンドヌクレアーゼ
Bam1ll とともにインキュベートした。条件は次のようであったニブラス
ミド20可、Ba*HI30単位、1005M Mace 、 50mmM ト
リス−HCl 、 pH?、5.10wMMgCI!□およびb++M口TT、
100I!!容量中。温度37°Cおよび反応時間2時間であった。2つのD
NA−フラグメントは1%アガロースゲル上で分離そして所望のフラグメントを
単離した。
M13ベクターM13鋼plBへの連結単離した制限フラグメントを、以下の反
応混合物中にて制限エンドヌクレアーゼBamHIで切断されたバタテリオファ
ージベクターM13mp18へ連結した二フラグメント0.2N、ベクター0.
02g 、 50111M トリス−HCl、 pH7,4,1(1wM Mg
Cj!z+ 10gMDTTおよび1mM ATP、 20111容量中、この
混合物5Iを大腸菌株JM 101へ形質転換した。ベクターにおけるフラグメ
ントの存在およびフラグメントの配向は、形質転換体から単離される二重11M
13−DNAにおける制限酵素マツピングにより測定された。
一重鎖(ss)DNA(鋳型)の単離
上記の形質転換体から、ss −DNAをメッシングMessing+Gene
、 19 (1982)、 269−276に記載された方法にしたがって単離
した。
突然変異体プライマーの5′ホスホリル化配列5 ’ −TTGGAGTGTA
GAAACCTCTT−3’を有する突然変異体プライマーを、70mM )リ
ス−〇Cf、pH7,0、10+++M MgCl t。
5mM口TT、 1mM ATP、 100100pオリゴヌクレオチドおよび
T4ポリヌクレオチドキナーゼ3.6単位を含む反応混合物30m中5′−末端
でホスホリル化した。反応を37°Cで30分間行なった0次いで65℃で10
分間反応混合物をインキュベートすることにより酵素を不活化した。
鋳型およびホスホリル化突然変異体プライマーのアニーリング
鋳型およびプライマーのアニーリングを、鋳型0.5ピコモル、プライマー5ピ
コモル、20IIMトリスー11cf、 pH7,5,105M MgCj!
z、50mM Maceおよび1mM DTTを含む10p!容量中10分間6
5℃にて加熱し、その後O″Cまで冷却することにより実施した。
延長/連結反応:
上記反応混合物へ、以下の混合物10illを加えた: 0.3mMdA丁P、
0.3讃M dCTP、0.3mM dGTP、0.3mM TTP、1s+M
ATP、20+sMトリスーHC1,pH1,5,10wM HgC1t、
105M DTT、T4 DNAリガーゼ3単位およびタレノウポリメラーゼ2
.5単位0次いで反応を16時間16°Cで行なった。
JM 101の形質転換
上記反応混合物を標準的技術を用いてCaCj!z処理大腸菌JM 101細胞
へ異なった稀釈度で形質転換し、2XYT寒天プレート上の2xYT)ツブ寒天
にプレートした。(2XYT=)リブトン16g#!酵母抽出物10g//!、
NaCf 5g/1.2XYT)ツブ寒天=0.4%アガロースを添加しそして
オートクレーブした2XYT。
2XYT寒天プレ一ト=2%寒天を添加しそしてオートクレーブした2XYT、
)プレートを37°Cで一晩インキユベートした。
陽性クローンの同定化
使用された方法はプラーク−リフトハイブリッド法であり、これは次のように記
載されている:ニトロセルロースーフィルターを適当なプラーク密度を有するプ
レート上に置き、これによりフィルターを湿らせた。次いでフィルターを以下の
溶液中に浸した: 1.5M NaCj!、 0.5M Na0fl 30秒間
、1.5MNaC1,0,5M)リス−HIJ、 pi(8,0、1分間、2x
ssc(0,3M ’NaCj! 、 0.03Mクエン酸ナトリウム)後で使
用するまで。フィルターを3MM濾紙上で乾燥しそして真空炉中80℃で2時間
焼付けた。
配列5 ’ TTGGAGTGTAGAAACCTCTT−3’を有する突然変
異プライマーを、701℃MトリスーHCj!、 pH7,5,IO+mM M
gC1g、 5sPIDTT、 10ピコモルオリゴヌクレオチド、20ピコモ
ルrsap−ATPおよびT4ポリヌクレオチドキナーゼ365単位を含む30
d容量中にて5′末端に放射活性を標識化した。混合物を30分間37°Cでイ
ンキュベートし次いで100℃で5分間インキュベートした。
乾燥したフィルターを、5 X5SC,0,2%ウシ−血清アルブミン、062
%フィコール、0.2%ポリビニルピロリドン、0.2%ナトリウム−ドデシル
−スルフェート(SO5)および50n/dサーモン精子DNA中で65°Cに
て2時間プレハイブリッド化した。次いで、標識化されたプローブを含む反応混
合物を新しいハイブリッド化した混合物15dへ加え、フィルターをおだやかに
振とうしなから28°Cで一晩これへ浸した。ハイブリッド化後、フィルターを
それぞれ15分間2 X5SC40,1%SDS中で3回洗浄し、オートラジオ
グラフィを行なった。
同じ溶液でしかしながら今回は52°Cで洗浄し別のオートラジオグラフィを行
なった後、突然変異体プライマーに対し相補的なりNA配列を含むプラークを同
定した。
陽性クローンの再スクリーニング:
同定されたクローンがへテロ二重鎖の結果のため、プラークを再びプレートした
。ハイブリッド法および同定を繰り返した。
二重鎖M13−ファージDNAの精製
再スクリーンしたクローンを大腸菌株JM 101の感染に使用した。はぼ10
”個のファージとJM 101のコロニー5個を含む培養物を2XYT培地5d
中37℃にて5時間増殖した0次いで二重鎖の環状DNAを、ビルンボイムとド
リー(Birnboim &Doly) 、Nucleic Ac1ds Re
s、、2 (1979)、 1513により記載された方法にしたがってペレッ
トから精製した。
修飾インシュリン前駆体を含む制限フラグメントの単離上述で単離されたDNA
調製物(約51!g)を、100*M NaCl 。
50mM )リス−HCl 、 pH7,5、10wM MgCj! tおよび
1mM口TTの60d中2時間37°Cにて制限エンドヌクレアーゼBa5HI
10単位で消化した。DNA生成物をアガロース−ゲル上で分離し、フラグメ
ントをゲルから精製した。
酵母ベクターpAB24 (第2図)への連結:単離した制限フラグメントを、
以下の反応混合物中にて制限エンドヌクレアーゼBag旧で消化された酵母ベク
ターpAB24と連結した:フラグメント0.2 n、ベクター0.02q 、
50mM トリス−HCl 、 pH7,4、10wM MgCj! 、、
10mM DTT、 1mM ATP、総量201.この反応混合物5Iを大腸
菌株MC1061の形質転換に使用し、ここで修飾された発現プラスミドを同定
し増殖させた。プラスミドは欠失したコドンを除いてpYGABAと同じであっ
た。
酵母の形質転換
酵母菌株サッカロミセスセレヴイシアエSaccharomycescerev
isiae JC482ΔpepΔLeu 2cir’ (a + his4+
peptura3+ 1eu2+ cir” )への発現プラスミドの形質転
換は、イトウら(Ito et al、)、J、Bact、、 Vol、153
. No、1.(1983)、 163−168に記載のように実施された。形
質転換された細胞を、ブラスミ含有細胞を選択するために、SC−ura培地(
0,7%酵母窒素塩基、2.0%グルコース、0.5%カサミノ酸、2.0%寒
天)上にプレートした。
例■
デス(Tyr”’ )−5CIの調製に使用されうる発現プラスミドの構築
使用される方法は実質的に例■に記載されたものと同じであるが、ただし突然変
異誘発プライマーが配列5 ’ −ACCCTTTGGAGTGAAGAAAC
CTCT−3’を有し、ハイブリッド化温度は36°Cであり、ハイブリッド化
後の洗浄温度は60°Cであった。修飾されたプラスミドは欠失されたコドンを
除いてpYGABAと同一の配列を有する。
例■
〔旧5wff1s )、デス(Tyr”’ )−5CIの調製に使用されうる発
現プラスミドの構築
使用した方法は例Iに記載されたものとほぼ同じであるが、しかし突然変異誘発
プライマーは配列5 ’ −AATACCCTTTGGAGTGTGG^^^C
CTCTTTCACC−3’であり、ハイブリッド化温度は43°Cであり、ハ
イブリッド化後の洗浄温度は66°Cであった。
修飾されたプラスミドは、修飾されたおよび欠失したコドンを除いてpYGAB
Aと同じ配列である。
例■
(Asn″is )、デス[Tyr”6)−5CIの調製に使用されうる発現プ
ラスミドの構築
使用した方法は例Iに記載されたものとほぼ同じであるが、しかし突然変異誘発
プライマーは配列5′−^ATACCCTTTGGAGTGTTGAAACCT
CTTTCACC−3’であり、ハイブリッド化温度は42°Cであり、ハイブ
リッド化後の洗浄温度は65°Cであった。
修飾されたプラスミドは、修飾されたおよび欠失したコドンを除いてpYGAB
Aと同じ配列である。
例■
前駆体の発現および培養基からの単離
例■〜■に記載のように形質転換された酵母をウラシル不含有最少培地を含むペ
トリ皿上で30°Cにて48時間増殖した。
ウラシル不含有最少培地+5g/2カサミノ酸+10g/lコハク酸+30 g
/ ffiグルコース、pH5,0を含む100d振とうビンに、ペトリ皿か
らの1つのコロニーを接種した。次いでインキュベーター中30°Cにて72時
間ビンを振とうした。
遠心分離後プールした上澄Ifを濾過により滅菌し、5MHCfと水の添加によ
りPH4−4,5および伝導率< 10m5に調整した。予め505M酢酸、5
0%(容量)エタノールNa0)1でpH4,0まで調節したもので平衡化した
S/セファロースOFFの1.6X6CIカラムへ流速120d/hにて上澄を
施こした。カラムを緩衝液60mで洗浄し、次いで前駆体を、緩衝液360d中
にNaCf! O〜0.35Mの直線状勾配液を用い流速10d/hにて溶出し
た。溶出液を4dのフラクションに分け、UV吸収率を検出した。前駆体含有フ
ラクションをRP −HPLC分析により同定しプールした。1M酢酢酸上セフ
ァデックス0G25カラムで脱塩後、前駆体を凍結乾燥により単離した。
例■
デス(pheItB )、デス(ThrI+3” )−ヒトインシュリンの調製
例■およびVに記載された方法により調製されたデス(Phe”’ ) −5C
i 400■を401dの50mM )リス−(ヒドロキシメチル)アミノメタ
ン、20%(容量)エタノールHC1でpH9まで調節したものに溶かし、同じ
緩衝液中に固定化したトリプシン32ffigを含むセファロース@40id
(沈でん容量)を加えた。懸濁液を緩やかに撹拌しなから8−10°Cにて24
時間懸濁液を放置し、次いで濾過した。ゲルを緩衝剤40dで洗浄し、プールし
た溶液を、予め50IIMトリスー(ヒドロキシメチル)アミノメタン、50%
(容量)エタノール、81でpH8,0まで調節したもので平衡化したQ−セフ
ァロースOFFの2.6×7.5c■カラムへ施こした。次いで、流速225d
/hで6時間にわたって、同じ緩衝液中のNaCl O=0.15M直線状勾配
液でカラムを溶出した。溶出液をUV吸収について検知し、主要タンパク質ピー
クを含むフラクションをプールした。減圧下にエタノールを除去後、タンパク質
をpH5,4で沈でんさせた。
デス(Phe”’ ) %デス(7h、11111 )−ヒトインシュリン25
01gを凍結乾燥により単離した。
生成物の同定を、アミノ酸分析、プラズマディソープション質量分析および別々
にビニルピリジル化したAllおよびB鎖の逐次エドマン分解により確認した。
例■
、”ス(Phe”’ )−ヒトインシュリンの調製例■で記載した方法により調
製されたデス(p he 1 t % )、デス(71,rIll(1)−ヒト
インシュリン200■を、トレオニンメチルエステル400■、エタノール2.
0 dおよび水0.8 dを含む混合物中に溶解した。pH値を酢酸で6.3に
調整し、固定化トリプシン3.2■を含むセファロース@4dで(沈でん容量)
を加えた。緩やかに撹拌しながら20°Cで2時間放置後、ゲルを濾去し、2−
プロパツールIO容量を添加することによりタンパク質を沈でんさせた。風乾し
た沈でん物を20曽iトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン/llc/!、
60%(容りエタノール、pH8,25に再溶解し、そして予め前記緩衝液で平
衡化した2、 6 XgOcm Q−セファロースのFFカラムへ施こし、同じ
緩衝液中O〜0.1 Mへ増加する直線状NaCl−勾配液を用いて15時間か
け流速125d/hで溶出した。デス[Phe”’)−ヒトインシュリン−(B
2O−メチルエステル)ヲ含む7’ −ルされたフラクションから減圧下にエタ
ノールを除き、pH6、1でタンパク質を沈でんした。懸濁液を遠心分離し、沈
でん物を凍結乾燥した。次いで冷0. ]、 M NaOH中タンパク質濃度1
0■/dにて10分間メチルエステルを加水分解した。PFI値を8.5に調節
することにより反応を停止し、20mM )リス(ヒドロキシメチル)−アミノ
メタン/HCl 、 pH8,5の2容量を加えた。次いで溶液を2.6 X2
0cm Q−セファロース@FFカラムへ施こし、上述のように溶出した。エタ
ノールを減圧下に除去後pH5,5にてタンパク質が沈でんした。
凍結乾燥後にデス(ph812% )−ヒトインシュリン80■が得られた。
生成物の同定は、アミノ酸分析、プラズマディソープション質量分析および別々
にビニルピリジル化したA鎖およびB鎖の逐次エドマン分解により確認された。
例■
デス(7yrl!& )、デス(Thr13(1)−ヒトインシュリンの調製
例■およびVに記載した方法により調製されたデス(Tyr”’ ) −5CI
250+1gを、5011Mトリス (ヒドロキシメチル)アミノメタン、2
0%(容I)エタノール、HCfでpH9まで調節したちの25ydに溶かし、
同じ緩衝液中固定化トリプシン20■を含むセファロース@25IIR(沈でん
容量)を加えた。
緩やかに撹拌しながら懸濁液を24時間8−10°Cにて放置し次いで濾過した
。ゲルを緩衝液25dで洗浄し、予め50mMFリスー(ヒドロキシメチル)ア
ミノメタン、50%(容量)エタノール、HCfでPH8,0まで調整したもの
で平衡化したQ−セファロースΦFFの2.6 X 7.5 cmカラムヘブー
ルした濾液を施こした。次いで同じ緩衝液中のNaCj! 0〜0.15Mの直
線状勾配液を用いて6時間にわたり流速225d/hでカラムを溶出した。溶出
液をUV−吸収について検知し、主なタンパク質ピークを含むフラクションをプ
ールした。エタノールを減圧下に除去後たんばく質はpH5,4で沈でんした。
凍結乾燥によりデス〔Tyr1116〕、デス(7hr @ 30 )−ヒトイ
ンシュリン130■が単離した。
生成物の同定はアミノ酸分析および別々にビニルピリジル化されたA鎖およびB
鎖の逐次エドマン分解により確認された。
例■
〔旧5Ills )、デス(Tyr”6) 、デス(7h、!130 )−ヒト
インシュリンの調製
例■および■に記載した方法により調製した( Hlsmis )、デス(Ty
rl!” ) −5C14501gを、45dの50mM トリス−(ヒドロキ
シメチル)アミノメタン、20%(容量)エタノールpH9までHCfで調節し
たものに溶かし、同じ緩衝液中に固定化トリプシン36■を含むセファロース@
45d (沈でん容量)を加えた。緩やかに撹拌しながら24時間8−10°C
にて懸濁液を放置し、次いで濾過した。緩衝液40dでゲルを洗浄し、予め50
mM トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、50%(容量)エタノール、
[1でpng、oまで調整したもので平衡化したQ〜セファロース@FP 2.
6X 7.5 cmカラムへ施こした。次いで同じ緩衝液中のNaCf! O〜
0.15Mの直線状勾配液で6時間にわたって流速225ad!/hで溶出した
。溶出液をUV吸収について検知し、主なタンパク質ピークを含むフラクション
をプールした。エタノールを減圧除去後タンパク質がpH5,4で沈でんした。
(H45Its )、デス〔Tyr!It6〕、デス(7hr1311 )−ヒ
トインシュリン200■を凍結乾燥により単離した。
生成物の同定はアミノ酸分析および別々にビニルピリジル化したA鎖およびB鎖
の逐次エドマン分解により確認された。
例X
(Asn1!5 ]、デス(7yrI!& )、デス(Thr″311 )−ヒ
トインシュリンの調製
例■およびVに記載された方法により調製された(Asn1!5)、デス(Ty
r”’ ) −5CI 15011gを、15〆の50+++M )リス−(ヒ
ドロキシメチル)アミノメタン、20%(容量)エタノールHC2でpH9まで
調節したものに溶かし、同じ緩衝液中固定化トリプシン12■を含むセフ10−
ス@15d (沈でん容量)を加えた。懸濁液を緩やかに撹拌しなから8−1θ
℃にて24時間放置し、次いで濾過した。ゲルを緩衝液40dで洗浄し、予め5
0wM )リス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、50%(容量)エタノール
、H(JでpH8,0まで調整したもので平衡化されたQ−セファロースOFF
の1.6 X 10cmカラムへ施こした。次いで同じ緩衝液中のNaClの0
−0.15の直線状勾配液で6時間かけて流速90d/hにてカラムを溶出した
。溶出液をUV吸収について検出しそして主なタンパク質ピークを含むフラクシ
ョンをプールした。M圧下にエタノール除去後pH5,4にてタンパク質が沈で
んした。
凍結乾燥により〔^5nIts )、デス(Tyr”’ ) 、デス(T hr
11@ )−ヒトインシュリン80■が単離した。
生成物の同定はアミノ酸分析および別々にビニルピリジル化されたAMおよびB
鎖の逐次エドマン分解により確認された。
例XI
〔AspAffiI〕、デス(phe05 )、デス(t h r 136 )
−ヒトインシュリンの調製
例■に記載された方法により調製されたデス(Phe”’ )、デス(7hr
131’ )−ヒトインシュリン50■を、IMI((/!でpH値を2に調節
することにより水10dに溶かした0次いで溶液を30°Cで16時間放置した
。冷却(20″Cまで)後、尿素7.5gを加え、I M NaOHでpH値8
.1まで調節した。次いで、4°Cにて予め20+++M )リス(ヒドロキシ
メチル)−アミノメタン/H(/!、7M尿素、pH8,1で平衡化した1、
6 X20CI Q−セファロースOFFカラムへ溶液を施こし、同じ緩衝液中
0〜0.05Mの直線状NaCf勾配液で24時間かけて流速40id/ hに
て溶出した。最後の溶出ピークからタンパク質を含有するプールしたフラクショ
ンを、IM酢酢酸上セファデックス0625カラムて脱塩化しそして凍結乾燥し
た。
(AspIl+ 3、デス(Phe”’ ) 、デス(T hr 130 )−
ヒトインシュリン30■が得られた。
生成物の同定はアミノ酸分析、5段階エドマン分解およびカルボキシペプチダー
ゼAを用いたC末端分析により確認された。
例X■
(Set”’ ) 、デス(Proo”)−ヒトインシュリンの調製に使用され
うる発現プラスミドの構築および(5etA!I )、デス[pr0128 ]
−ヒトインシュリンの調製この類似物質をエンコードするpoc−19由来プラ
スミド、pKFN −864は、2つの突然変異プライマーN0R−648CT
AGAGCCTGCGGGCTGCGTCTAGCTGCAGTAGおよびNo
r −745^TTGTTCGACAATACCCTTAGCAGCCTTGG
TGTAGAAGAAACCTCTTTCACCを用いてプラスミドpKFN
−734のギャップした二重突然変異誘発(ワイ。
モリナガら、Y、Morinaga at al、、 Biotechnolo
gy Z (1984L636−639)により構築された。プラスミドpKF
N −734は、プラスミドpLac212spx3からの合成インシュリン前
駆体遺伝子B(1−29) −Ala Ala Lys−A(1−21)に骨格
融合した合成酵母のシグナル−リーダーをエンコードする0、4kb EcoR
I −Xba IフラグメントをpUc−19からの2.7kb EcoRI−
Xblフラグメントに連結することにより構築された(ヤニッシューベロンらY
annisch−Perron et al、、 Gene 33(1985)
+ 103−119LプラスミドpLac212spx3は例3に記載されてお
り、国際特許出願公開第一089102463号の第6図および第13図に記載
されている。
シグナルリーダーインシュリンB(1−29、デス2B Pro) −Ala^
la Lys −A(1−21、215et)をエンコードするpKFN −8
64からの0.4 kb EcoRI−XbalフラグメントのDNA配列を第
3図に示す。
pKFN −864をEcoRIとXba Iで切断し、0.5kbフラグメン
トをpMT 636からの9.5kb Ncol−XbalフラグメントとpM
T 636からの1.4kb Ncol −EcoRIフラグメントに連結する
とプラスミドpKFN −866が得られ、第4図を参照せよ。プラスミドpM
7636は、LED−2遺伝子欠失後の9M7608と9M7479から構築さ
れ、第4図を参照せよ。9M7608はヨーロッパ特許第195691号に記載
されている。pMT 479はヨーロッパ特許第163529号に記載されてい
る。9M7479はシゾサツカロミセスボンベ(Schizosaccharo
+l1yces pombe)TPI遺伝子(POT) 、サッカロミセスセレ
ヴイシアエ(S、cerevisiae) )リオースホスフヱートイソメラー
ゼプロモーターおよびターミネータ−1TPI、およびTPbを含む(アルバー
、ティ、 Alber、T、およびカワサキ、シイ、Kawasaki、G、
J、Mo1.Appl、Gen、上(19B2) 。
419−434)。プラスミドpKPN −866は次の配列を含む:TPIF
−シグナルーリーダーインシュリンB(1−29、デス28Pro)−^1a^
Ia Lys−A(1−21、215er) ・TPItサッカロミセスセレヴ
イシアエ菌株MT 663 (E2−7BXE11−36a/a、Δtpi Δ
tpi、 pep 4 3 /pep4−3)は、YPGaL(1%バクト酵母
抽出物、2%バクトペプトン、2%ガラクトース、1%ラクテート)中で600
Mmでの0.D、が0゜6まで増殖した。
得られた培養物100dを遠心分離により採取し、水1(ldで洗浄し、再度遠
心分離にかけ、1.2Mソルビトール、25+++MNa、EDT^pH−8,
0および6.7erg/dジチオトレイトールを含む溶液10ae中に再度懸濁
させた。懸濁液を15分間30°Cでインキュベートし、遠心分離しそして細胞
を1.2 Mソルビトール、10mM NaJDTA、0.1 Mクエン酸ナト
リウム、Pt1=5.8、および2■ノボザイム■234を含む溶液10mに再
度懸濁した。懸濁液を30℃で30分間インキュベートし、細胞を遠心分離によ
り集め、1.2Mソルビトール10 allとCAS(1,2Mソルビトール、
105M CaC1,z、105M )リス1(Cf()リス−トリス (ヒド
ロキシメチル)アミノメタン) pH=7.5)10ad!中で洗浄し、CAS
2d中に再度懸濁した。形質転換のためにCAS−再懸濁化細胞0.1 dを
プラスミドpKFN −866はぼ1nとともに混合し、室温で15分間放置し
た。 (20%ポリエチレングリコール4000゜10mM CaCl z、1
0mM トリスHCI 、 pH=7.5) 1 dを加え、混合物を室温でさ
らに30分間放置した。混合物を遠心分離しそしてベレットを5O5(1,2M
ソルビトール、33%v/vYP口、 6.7mMCaC1!+ 14g/dロ
イシン)0.1dに再懸濁させて、30゛Cで2時間インキュベートした。次い
で懸濁液を遠心分離し、ペレットを1.2Mソルビトール0.5 d中に再懸濁
した。次いでトップ寒天(シェアマンら5her++an et al、、のS
C培地(メリーズインイーストジェネティックスMethods in Yea
stGenetics、コールドスプリングハーバーラボラトリイColdSp
ring Harbor Laboratory+ 1981)1.2Mソルビ
トール+2.5%寒天を含む)6dを52°Cで添加し、懸濁液を同じ寒天固化
ソルビトール含有培地を含むプレートの表面へ注入した。形質転換体コロニーを
30°Cで3日後採取し、再度単離し液体培養を開始するために使用した。この
ような形質転換体にFN−883の1つが別の特性決定のために選択された。
酵母菌株KFN −883をYPD培地(1%酵母抽出物、2%ペプトン(ディ
フコラボラトリイーズから)および2%グルコース)上で増殖した。菌株の培養
物10dを、600n−〇〇、D。
が20になるまで30℃で振とうした。遠心分離後、上澄を記載(エル、スネル
らり、5nel et al、、 Chrowatographia 24(1
987)+329−332)のようにHPLCにより分析した。収率はインシュ
リンB(1−29、デス2B Pro)−八!a^la Lys −A(121
,21Set)約0.14■//!であった。
一本鎖インシュリン前駆体は、低pHでイオン交換カラムへ吸着させ、高pHで
脱着させ、プールしたものを亜鉛イオンにより沈でんさせることにより発酵上澄
液から単離した。前駆体の(Ser”’ ) 、デス〔Pro11′〕、(Th
r”’ −OMe )−ヒトインシュリンへのペプチド転移反応は次のようであ
った:
トレオニンメチルエステル10ミリモル(2,35g )および氷酢酸をDMF
中に溶かして51I11.とし、76.5%v/vDMF水溶液2.5 dを加
えそして前駆体0.5gを混合物中に溶かし、これを12°Cに保持した;次い
で0.05M酢酸カルシウム1.25.d中のトリプシン50IIgを加え、1
2°Cで24時間後に反応混合物をペプチド沈でんのためにアセトン100dへ
添加し、これを回転させ減圧下に乾燥させた。
単離したインシュリン類似物質エステルを、酸性pHにてシリカ−C1Bマトリ
ツクスを用いて調製用HPLCカラム中で精製した。次いで精製したエステルを
pH10で25℃にて24時間水性媒体中で加水分解した。形成された[ Se
r”’ ) 、デス(prol!11 )−ヒトインシュリンを、中性pHにて
亜鉛イオンを用いて沈でんさせた。陰イオン交換クロマトグラフィを行ない次い
でゲル濾過により脱塩することにより沈でん物を精製した。凍結乾燥した〔5e
rA!1〕、デス(pr01!l )−ヒトインシュリンの収量は102gであ
った。
例X■
デス(7h、l!? )−ヒトインシュリンの調製亜鉛不含有ブタインシュリン
IgをpH値9に調節した水40dに溶かし、そしてアンモニア溶液でpH9に
調節した0、25M炭酸水素アンモニウム10d中にブタトリプシン50■が溶
解した液を加えた0次いで溶液を4℃で放置し、48時間後にHPLC分析によ
り収率65%が見出された。次いで、4°Cにて0.05M炭酸水素アンモニウ
ムにおけるセファデックス@G50スーパーファイン5X90C11カラム中で
流速90d/hにて反応混合物をゲル濾過した。主なタンパク質ピークを含むフ
ラクションをプールし凍結乾燥した。収量はデス(B23−B30)−ヒトイン
シュリン520■であった。
配列Gly−Phe −Phe −Tyr −Pro −Lys−Thrを有す
るペプチドを、PAM樹脂中にて保護された対称性アミノ酸無水物を用いアプラ
イドバイオシステム社製のペプチド合成装置を用いて合成した。最後に、0°C
にて無水フッ化水素によリペプチドを樹脂から分割し、その際残存する保護基も
同時に除かれた。
デス(B23−B30)−ヒトインシュリン200■およびペプチド400■を
、ジメチルホルムアミド2.40jlfと水1.20mの混液に溶かし、そして
混液のpHをトリエチルアミンで6.5に調節した。水0.20jd中のブタト
リプシンlO■を加え、反応混合物を20℃で4時間放置した。次いで2−プロ
パツール25mを添加することにより反応を停止し、遠心分離により沈でんした
タンパク質を単離した。排水した沈でん物を1M酢酸10dに再度溶解し、予め
30%(容量)エタノール中の0.5mM塩酸、0.1M塩化ナトリウムで平衡
化したりクロプレツブ@ RP−18(25−40,a)の2.6X20Qlカ
ラムへ施こした。次いで20℃で流速20d/hにて同じ緩衝液であるがただし
24時間にわたってエタノール含有量を50%まで直線状に増加するもので溶出
した。溶出液をUV吸収についてモニターし、主なタンパク質ピークを含むフラ
クションを集めた。同量の水で希釈しそして水酸化ナトリウム溶液でpH値5.
5に調節することによりタンパク質を沈でんさせ、4℃で1時間放置後、遠心分
離および凍結乾燥により単離した。
収量はデス(Thr B27)−ヒトインシュリン80■であり、これは別々に
ビニル−ピリジル化されたA鎖およびB鎖の逐次エドマン分解により同定された
。
例■
注射溶液の配合
本発明によるヒトインシュリン類似物質60マイクロモルを0.1?I HCf
fi 41dに溶かし、1.5%請−クレゾール20M1を加えた。ここで溶液
を4%グリセロール40mと65aeMリン酸水素二ナトリウム20mとともに
混合し、pH値を7.3まで調節した。
最後に溶液を水で100dまで調節し、滅菌濾過を行なった。
例V
会合度の評価
セファデックス@G−75の2.6 C1l X 88C11カラムを、13s
+Mリン酸ナトリウム緩衝液PIT7.3で流速22d/hにて平衡化した。
デス−(オクタペプチド−1312−30)−ヒトインシュリン、チトクローム
C、リボヌクレアーゼおよび分子量マーカーとして単量体と二量体ミオグロビン
を施こすことにより、溶出量の関数としての分子量を表わす曲線が描かれた。
0.6mM Zn不含有ヒトインシュリンまたは0.6+sMインシュリン類値
物質を含みそして例X■に記載のように調製された溶液1Mlを施こすことによ
り、Zn不含有ヒトインシュリンが例■〜Xに記載されたように調製された!1
(Ii動物質見掛の分子量Z 5 kDを有する対称的ピークとして溶出した。
これらの結果として本発明によるヒトインシュリン類似物質がpH7,3で溶液
中で実質的に単量体であり、一方同じ条件下で高い程度までの普通のヒトインシ
ュリンが二量体またはそれ以上のオリゴマーの混合物として現われることが示さ
れる。
例XVI
生物学的活性の評価
インビトロでの生物学的活性は、実質的にジエイ、グリーマンJ、G目ella
flL ニス、ガーメルトフトS、Ga+w+++el tof t : Di
a−beto1ogia旦(1974)、 105−113に記載されたように
、単離したラットのアジボサイトおよびヘパトサイトへのインシュリンレセプタ
ーとの結合親和性を測定することにより決定された。
インシュリンIf(E物質を半合成ヒトインシュリンと比較し、その力を100
%とし、結果を以下の表に示すニアシボサイト へパトサイト
デス(p he 1 R% )、デス(7hr130 )−ヒトインシュリン
223% 201%デス(p h e 12 S )−ヒトインシュリン 22
5% 249%FIG、 1
FIG、 2
ル江LysA 1 aVa I PheLe uVa l Leus@ rLa
u I 1 eG 1yPheCysTrpA 1 aGl nProVa 1
ThrG 1 yAgpGl userserVa I Glu I 1 eP
roGl uGl us■窒kaul 1 @X 1 e
^1aG1uAsnThrThrLeuAla^IBy+Val入1aU工A1
aLys^rgPheVal^5nG1n)tfsLauCysGlyserH
isl、auVaIGluA1aLauTyrLeuvalcysGlyG1u
ArgG1yPhaPhaTyrThrLysA1a^1 aLysG 1 y
I l era IGI uGl nCy 5CysTh rserl 1
ecysse@rLeuTyrGl n
FIG、 3
FIG、 ’1
FIG、 q(つづ合)
国際調査報告
一一一一一一一 PCTloK 1197002%国際調査報告
Th&+w−ha−−−nkkaosllwmamma−一−b he−一一−
wydh−
Claims (48)
- 1.B28位、すなわち〔GlyB20〕から計算してB鎖における8位におい て陽性に帯電したアミノ酸残基すなわちLysまたはArgを有し、場合により さらに〔PheB24〕からC末端アミノ酸残基にかけてのB鎖のC末端におい て修飾され、ただしB29位にはProはなくそして場合によりA21および/ またはB3はAsnとは異なることからなるヒトインシュリン類似物質。
- 2.これらが次式: A−鎖 【配列があります】 B−鎖【 配列があります】 A−鎖(続き) 【配列があります】 B−鎖(続き) 【配列があります】 B−鎖(続き) 【配列があります】 (式中、X1,X2,X3,X5,Y1およびY2はいずれかの天然産生アミノ 酸残基であり;X4はLysまたはArgであり;X6はC末端ヒドロキシ基を 有するいずれかの天然産生アミノ酸残基または−OHであり、またはX5および X6は一緒になってC末端ヒドロキシ基を形成する)を有するヒトインシュリン 類似物質。
- 3.X5がProを除いたいずれかの天然産生アミノ酸残基からなる群から選択 される請求項2に記載のヒトインシュリン類似物質。
- 4.Y1および/またはY2がAsnを除いたいずれかの天然産生アミノ酸残基 からなる群から選択される請求項2または3に記載のヒトインシュリン類似物質 。
- 5.X1がPhe,Ala,His,Thr,Ser,AsnまたはTyrから なる群から選択され; X2がTyr,Thr,Glu,Asp,Ala,His,SerまたはPhe からなる群から選択され; X3がPro,Glu,Asp,Ser,ThrまたはHisからなる群から選 択され; X5がLys,Thr,Ser,Ala,AspまたはGluからなる群から選 択され; X6がThr−OH,Ser−OH,Ala−OH,Asp−OH,Glu−O Hまたは−OHからなる群から選択され、またはX5およびX6は一緒になって C末端ヒドロキシ基を形成し;Y1がAsn,Asp,Gly,Ser,Glu またはAlaからなる群から選択され; Y2がAsn,Gln,GluまたはAspからなる群から選択される 請求項2に記載のヒトインシュリン類似物質。
- 6.X1がPhe,Ala,His,Thr,Ser,AsnまたはTyrから なる群から選択され; X2がTyr,Thr,Glu,Asp,Ala,His,SerまたはPhe からなる群から選択され; X3がPro,Glu,Asp,Ser,ThrまたはHisからなる群から選 択され; X5がLys,Thr,Ser,Ala,AspまたはGluからなる群から選 択され; X6が−OHであり; Y1がAsn,Asp,Gly,Ser,GluまたはAlaからなる群から選 択され; Y2がAsn,Gln,GluまたはAspからなる群から選択される、 請求項2に記載のヒトインシュリン類似物質。
- 7.X1がPhe,Ala,His,Thr,Ser,AsnまたはTyrから なる群から選択され; X2がTyr,Thr,Glu,Asp,Ala,His,SerまたはPhe からなる群から選択され; X3がPro,Glu,Asp,Ser,ThrまたはHisからなる群から選 択され; X5およびX6が一緒になってC末端ヒドロキシ基を形成し; Y1がAsn,Asp,Gly,Glu,SerまたはAlaからなる群から選 択され; Y2がAsn,Gln,GluまたはAspからなる群から選択される 請求項2に記載のヒトインシュリン類似物質。
- 8.X1がPheであり;X2がTyrであり;X3がThrであり;X5がL ysであり;X6がThr−OHであり;Y1がAsn,Asp,Serまたは Glyからなる群から選択されそしてY2がAsn,Gln,AspまたはGl uからなる群から選択される請求項2に記載のヒトインシュリン類似物質。
- 9.X1がTyrであり;X2がThrであり;X3がProであり;X5がT hrであり;X6が−OHであり;Y1がAsn,Asp,SerまたはGly からなる群から選択され;そしてY2がAsn,Gln,AspまたはGluか らなる群から選択される請求項2に記載のヒトインシュリン類似物質。
- 10.X1がPheであり;X2がThrであり;X3がProであり;X5が Thrであり;X6が−OHであり;Y1がAsn,Asp,SerまたはGl yからなる群から選択され;そしてY2がAsn,Gln,AspまたはGlu からなる群から選択される請求項2に記載のヒトインシュリン類似物質。
- 11.X1がPheであり;X2がTyrであり;X3がProであり;X5が Thrであり;X6が−OHであり;Y1がAsn,Asp,SerまたはGl yからなる群から選択され;そしてY2がAsn,Gln,AspまたはGlu からなる群から選択される請求項2に記載のヒトインシュリン類似物質。
- 12.前記X1アミノ酸が非帯電であり、sp2混成である炭素原子をγ位に有 し、X6が−OHである請求項2に記載のヒトインシュリン類似物質。
- 13.Y1およびY2がAsnを除くいずれかの天然産生アミノ酸残基からなる 群から選択され、X5がThrを除くいずれかの天然産生アミノ酸残基からなる 群から選択される請求項12に記載のヒトインシュリン類似物質。
- 14.X5およびX6が一緒になって−OHを形成する請求項12に記載のヒト インシュリン類似物質。
- 15.次式: A−鎖 【配列があります】 B−鎖 【配列があります】 A−鎖(続き) 【配列があります】 B−鎖(続き) 【配列があります】 B−鎖(続き) 【配列があります】 (式中、X1,X2,X3,X5,Y1およびY2はいずれかの天然産生アミノ 酸残基であり;X4はLysまたはArgであり;そしてX6はC末端ヒドロキ シ基を有するいずれかの天然産生アミノ酸残基または−OHでありまたはX5お よびX6は一緒になってC末端ヒドロキシ基を形成する)を有するヒトインシュ リン類似物質またはその薬剤上許容されうる塩と薬剤上許容されうる担体とから なる薬剤組成物。
- 16.前記インシュリン類似物質がpH7.3で低溶解度を示す請求項15に記 載の薬剤組成物。
- 17.前記インシュリン類似物質が実質的に単量体である請求項16に記載の薬 剤組成物。
- 18.前記薬剤組成物が水溶液として配合される請求項15に記載の薬剤組成物 。
- 19.前記薬剤組成物が水性懸濁液として配合される請求項15に記載の薬剤組 成物。
- 20.前記薬剤上許容されうる担体が水性の等張溶液である請求項15に記載の 薬剤組成物。
- 21.前記水溶液、水性懸濁液または水性等張溶液がさらに亜鉛イオンおよび/ または緩衝剤たとえば酢酸塩もしくはクエン酸塩および/または保存剤たとえば m−クレゾール、メチルパラベンもしくはフェノールを含む請求項18,19ま たは20に記載の薬剤組成物。
- 22.前記薬剤組成物がインシュリン類似物質1つ以上を含む請求項15に記載 の薬剤組成物。
- 23.前記薬剤組成物が粘膜または経皮投与用に配合される請求項15に記載の 薬剤組成物。
- 24.前記薬剤組成物が腸管外投与用に配合される請求項15に記載の薬剤組成 物。
- 25.X5がProを除くいずれかの天然産生アミノ酸残基からなる群から選択 される請求項15に記載の薬剤組成物。
- 26.Y1および/またはY2がAsnを除くいずれかの天然産生アミノ酸残基 からなる群から選択される請求項15または25に記載の薬剤組成物。
- 27.X1がPhe,Ala,His,Thr,Ser,AsnまたはTyrか らなる群から選択され; X2がTyr,Thr,Glu,Asp,Ala,His,SerまたはPhe からなる群から選択され; X3がPro,Glu,Asp,Ser,ThrまたはHisからなる群から選 択され; X5がLys,Thr,Ser,Ala,AspまたはG1uからなる群から選 択され; X6がThr−OH,Ser−OH,Ala−OH,Asp−OH,Glu−O Hまたは−OHからなる群から選択され;またはX5およびX6は一緒になって C末端ヒドロキシ基を形成し;Y1がAsn,Asp,Gly,Ser,Glu またはAlaからなる群から選択され; Y2がAsn,Gln,GluまたはAspからなる群から選択される 請求項15に記載の薬剤組成物。
- 28.X1がPhe,Ala,His,Thr,Ser,AsnまたはTyrか らなる群から選択され; X2がTyr,Thr,Glu,Asp,Ala,His,SerまたはPhe からなる群から選択され; X3がPro,Glu,Asp,Ser,ThrまたはHisからなる群から選 択され; X5がLys,Thr,Ser,Ala,AspまたはGluからなる群から選 択され; X6が−OHであり; Y1がAsn,AsP,Gly,Ser,GluまたはAlaからなる群から選 択され; Y2がAsn,Gln,GluまたはAspからなる群から選択される、 請求項15に記載の薬剤組成物。
- 29.X1がPhe,Ala,His,Thr,Ser,AsnまたはTyrか らなる群から選択され; X2がTyr,Thr,Glu,Asp,Ala,His,SerまたはPhe からなる群から選択され; X3がPro,Glu,Asp,Ser,ThrまたはHisからなる群から選 択され; X5およびX6が一緒になってC末端ヒドロキシ基を形成し; Y1がAsn,Asp,Gly,Glu,SerまたはAlaからなる群から選 択され; Y2がAsn,Gln,GluまたはAspからなる群から選択される 請求項15に記載の薬剤組成物。
- 30.X1がPheであり;X2がTyrであり;X3がThrであり;X5が Lysであり;X6がThr−OHであり;Y1がAsn,Asp,Serまた はGlyからなる群から選択されそしてY2がAsn,Gln,AspまたはG luからなる群から選択される請求項15に記載の薬剤組成物。
- 31.X1がTyrであり;X2がThrであり;X3がProであり;X5が Thrであり;X6が−OHであり;Y1がAsn,Asp,SerまたはGl yからなる群から選択され;そしてY2がAsn,Gln,AspまたはGlu からなる群から選択される請求項15に記載の薬剤組成物。
- 32.X1がPheであり;X2がThrであり;X3がProであり;X5が Thrであり;X6が−OHであり;Y1がAsn,Asp,SerまたはGl yからなる群から選択され;そしてY2がAsn,Gln,AspまたはGlu からなる群から選択される請求項15に記載の薬剤組成物。
- 33.X1がPheであり;X2がTyrであり;X3がProであり;X5が Thrであり;X6が−OHであり;Y1がAsn,Asp,SerまたはGl yからなる群から選択され;そしてY2がAsn,Gln,AspまたはGlu からなる群から選択される請求項15に記載の薬剤組成物。
- 34.前記X1アミノ酸が非帯電であり、sp2混成である炭素原子をγ位に有 し、X6が−OHである請求項15に記載の薬剤組成物。
- 35.Y1およびY2がAsnを除くいずれかの天然産生アミノ酸残基からなる 群から選択され、X5がThrを除くいずれかの天然産生アミノ酸残基からなる 群から選択される請求項34に記載の薬剤組成物。
- 36.X5およびX6が一緒になって−OHを形成する請求項34に記載の薬剤 組成物。
- 37.次式: A−鎖 【配列があります】 B−鎖 【配列があります】 A−鎖(続き) 【配列があります】 B−鎖(続き) 【配列があります】 B−鎖(続き) 【配列があります】 (式中、X1,X2,X3,X5,Y1およびY2はいずれかの天然産生アミノ 酸残基であり;X4はLysまたはArgであり;そしてX6はC末端ヒドロキ シ基を有するいずれかの天然産生アミノ酸残基または−OHでありまたはX5お よびX6は一緒になってC末端ヒドロキシ基を形成する)を有するヒトインシュ リン類似物質またはその薬剤上許容されうる塩と薬剤上許容されうる担体とを含 む薬剤組成物を実施される個人に対し提供することからなる糖尿病の治療方法。
- 38.前記インシュリン類似物質がpH7.3で低溶解度を示す請求項37に記 載の方法。
- 39.前記インシュリン類似物質が実質的に単量体である請求項38に記載の方 法。
- 40.前記薬剤組成物が水溶液として配合される請求項37に記載の方法。
- 41.前記薬剤組成物が水性懸濁液として配合される請求項37に記載の方法。
- 42.前記薬剤上許容されうる担体が水性の等張溶液である請求項37に記載の 方法。
- 43.前記水溶液、水性懸濁液または水性等張溶液がさらに亜鉛イオンおよび/ または緩衝液たとえば酢酸塩またはクエン酸塩;および/または保存剤たとえば m−クレゾール、メチルパラベンまたはフェノールを含む請求項40,41また は42に記載の方法。
- 44.前記薬剤組成物が1つ以上のインシュリン類似物質を有する請求項37に 記載の薬剤組成物。
- 45.前記薬剤組成物が粘膜または経皮投与用に配合される請求項37に記載の 薬剤組成物。
- 46.前記薬剤組成物が腸管外投与用に配合される請求項37に記載の方法。
- 47.次式: A−鎖 【配列があります】 B−鎖 【配列があります】 A−鎖(続き) 【配列があります】 B−鎖(続き) 【配列があります】 B−鎖(続き) 【配列があります】 (式中、X1,X2,X3,X5,Y1およびY2はいずれかの天然産生アミノ 酸残基であり;X4はLysまたはArgであり;そしてX6はC末端ヒドロキ シ基を有するいずれかの天然産生アミノ酸残基または−OHでありまたはX5お よびX6は一緒になってC末端ヒドロキシ基を形成する)で表わされるヒトイン シュリン類似物質の調製方法であって、当該インシュリン類似物質の前駆体をエ ンコードするDNA配列を、酵母へ移した場合ペプチド結合または次式III− R(n)−R(1)− (式中、Rはn個のアミノ酸残基を有するペプチド鎖であり、nは0〜33の整 数であり、R(1)はLysまたはArgである)で表わされるペプチドにより 〔LysB28〕,〔ArgB28〕,〔LysB29〕または〔ArgB29 〕がGlyA1に結合しているインシュリン類似物質の前駆体を発現および分泌 しうる適当な酵母発現ビヒクルへ移し、形質転換された酵母菌株を適当な普通培 地中で培養し、前駆体を培養ブロスから回収し、そして次式IV Q−QR′′ (式中、Qは1個のアミノ酸残基であり、R′′はカルボキシ保護基たとえばメ チルまたはtert−ブチル基である)で表わされるアミノ化合物と、触媒とし てトリプシンまたはトリプシン様酵素を用い、水と有機溶媒の混液中にて反応さ せ、その後カルボキシ保護基を除き、インシュリン類似物質を反応混合物から単 離するか、または C末端アミノ酸がLysまたはArgと異なるインシュリン類似物質前駆体であ って該前駆体がC末端とGlyA1との間にLysおよびArgからなる群から 選択される一対の塩基性アミノ酸の橋を有するものを単離し、次いでトリプシン およびカルボキシペプチダーゼBを用いて酵素処理することによりインシュリン 類似物質へ転化することからなる前記ヒトインシュリン類似物質の調製方法。
- 48.次式: A−鎖 【配列があります】 B−鎖 【配列があります】 A−鎖(続き) 【配列があります】 B−鎖(続き) 【配列があります】 B−鎖(続き) 【配列があります】 (式中、X1,X2,X3,X5,Y1およびY2はいずれかの天然産生アミノ 酸残基であり;X4はLysまたはArgであり;そしてX6はC末端ヒドロキ シ基を有するいずれかの天然産生アミノ酸残基または−OHでありまたはX5お よびX6は一緒になってC末端ヒドロキシ基を形成する)で表わされるヒトイン シュリン類似物質の調製方法であって、デス(B23−B30)−ヒトインシュ リンをトリプシンでインシュリンを処理して(B23−B30)−アミノ酸を開 裂除去することにより調製し、5〜7個のアミノ酸の所望のペプチドを合成し、 得られたペプチドをデス(B23−B30)−ヒトインシュリンと結合し、そし て得られたインシュリン類似物質を反応混合物から単離することからなる前記ヒ トインシュリン類似物質の調製方法。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DK7215/88 | 1988-12-23 | ||
DK721588A DK721588D0 (da) | 1988-12-23 | 1988-12-23 | Humaninsulinanaloger |
DK477789A DK477789D0 (da) | 1989-09-28 | 1989-09-28 | Nye polypeptider |
DK4777/89 | 1989-11-28 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH04502465A true JPH04502465A (ja) | 1992-05-07 |
Family
ID=26067619
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2501698A Pending JPH04502465A (ja) | 1988-12-23 | 1989-12-15 | ヒトインシュリン類似物質 |
Country Status (17)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5164366A (ja) |
EP (3) | EP0861851B1 (ja) |
JP (1) | JPH04502465A (ja) |
KR (1) | KR910700262A (ja) |
CN (1) | CN1043719A (ja) |
AT (3) | ATE178908T1 (ja) |
AU (1) | AU641631B2 (ja) |
CA (1) | CA2006578A1 (ja) |
DE (4) | DE68928917T2 (ja) |
ES (1) | ES2134669T3 (ja) |
FI (1) | FI913037A0 (ja) |
HU (1) | HUT56857A (ja) |
IL (1) | IL92853A0 (ja) |
NO (1) | NO301483B1 (ja) |
NZ (1) | NZ231936A (ja) |
WO (1) | WO1990007522A1 (ja) |
YU (1) | YU243689A (ja) |
Cited By (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH083067A (ja) * | 1994-06-16 | 1996-01-09 | Eli Lilly & Co | インスリン類似化合物製剤 |
WO2006093222A1 (ja) * | 2005-03-02 | 2006-09-08 | Ajinomoto Co., Inc. | インスリンの多量体形成阻害剤 |
JP2009539778A (ja) * | 2006-06-08 | 2009-11-19 | ダイアベコア メディカル インコーポレイテッド | インスリンオリゴマー誘導体 |
JP2012505852A (ja) * | 2008-10-17 | 2012-03-08 | サノフィ−アベンティス・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | インスリン及びglp−1アゴニストの組み合わせ |
JP2012532177A (ja) * | 2009-07-06 | 2012-12-13 | サノフィ−アベンティス・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | 熱及び振動安定性インスリン製剤 |
JP2017508741A (ja) * | 2014-02-28 | 2017-03-30 | ノヴォ ノルディスク アー/エス | リシン22のイプシロン位においてアシル化された、A22K、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン類似体 |
JP2018526001A (ja) * | 2015-08-28 | 2018-09-13 | ハンミ ファーマシューティカル カンパニー リミテッド | 新規なインスリンアナログ及びその用途 |
US11396534B2 (en) | 2016-09-23 | 2022-07-26 | Hanmi Pharm. Co., Ltd. | Insulin analogs with reduced affinity to insulin receptor and use thereof |
US11752216B2 (en) | 2017-03-23 | 2023-09-12 | Hanmi Pharm. Co., Ltd. | Insulin analog complex with reduced affinity for insulin receptor and use thereof |
Families Citing this family (138)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK336188D0 (da) * | 1988-06-20 | 1988-06-20 | Nordisk Gentofte | Propeptider |
US6875589B1 (en) * | 1988-06-23 | 2005-04-05 | Hoechst Aktiengesellschaft | Mini-proinsulin, its preparation and use |
US5514646A (en) * | 1989-02-09 | 1996-05-07 | Chance; Ronald E. | Insulin analogs modified at position 29 of the B chain |
US5126249A (en) * | 1989-05-09 | 1992-06-30 | Eli Lilly And Company | Enzymatic removal of a protein amino-terminal sequence |
DK155690D0 (da) * | 1990-06-28 | 1990-06-28 | Novo Nordisk As | Nye peptider |
DK10191D0 (da) * | 1991-01-22 | 1991-01-22 | Novo Nordisk As | Hidtil ukendte peptider |
US5304473A (en) * | 1991-06-11 | 1994-04-19 | Eli Lilly And Company | A-C-B proinsulin, method of manufacturing and using same, and intermediates in insulin production |
DK72793D0 (da) * | 1993-06-21 | 1993-06-21 | Novo Nordisk As | Nyt produkt |
US6869930B1 (en) * | 1993-09-17 | 2005-03-22 | Novo Nordisk A/S | Acylated insulin |
US5461031A (en) * | 1994-06-16 | 1995-10-24 | Eli Lilly And Company | Monomeric insulin analog formulations |
US5504188A (en) * | 1994-06-16 | 1996-04-02 | Eli Lilly And Company | Preparation of stable zinc insulin analog crystals |
US5547929A (en) * | 1994-09-12 | 1996-08-20 | Eli Lilly And Company | Insulin analog formulations |
AU3562195A (en) * | 1994-10-04 | 1996-04-26 | Novo Nordisk A/S | Preparations containing aspb28 human insulin and nicotinamide |
US5597893A (en) * | 1994-10-31 | 1997-01-28 | Eli Lilly And Company | Preparation of stable insulin analog crystals |
US5631347A (en) * | 1995-06-07 | 1997-05-20 | Eli Lilly And Company | Reducing gelation of a fatty acid-acylated protein |
CN1069649C (zh) * | 1996-01-25 | 2001-08-15 | 中国科学院上海生物化学研究所 | [b9谷氨酸,b10门冬氨酸]人胰岛素 |
US5948751A (en) * | 1996-06-20 | 1999-09-07 | Novo Nordisk A/S | X14-mannitol |
DE19726167B4 (de) | 1997-06-20 | 2008-01-24 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Insulin, Verfahren zu seiner Herstellung und es enthaltende pharmazeutische Zubereitung |
WO1999021578A1 (en) | 1997-10-24 | 1999-05-06 | Eli Lilly And Company | Insoluble insulin compositions |
ES2230727T3 (es) * | 1997-11-12 | 2005-05-01 | Alza Corporation | Procedimiento de administracion dermal de polipeptidos. |
CO4970787A1 (es) * | 1997-12-23 | 2000-11-07 | Lilly Co Eli | Composiciones insolubles de insulina y derivados de insulina que controlan la glucosa sanguinea |
AUPP609198A0 (en) * | 1998-09-22 | 1998-10-15 | Curtin University Of Technology | Use of non-peptidyl compounds for the treatment of insulin related ailments |
US6933272B1 (en) | 1998-09-22 | 2005-08-23 | Erik Helmerhorst | Use of non-peptidyl compounds for the treatment of insulin related ailments |
US7169889B1 (en) | 1999-06-19 | 2007-01-30 | Biocon Limited | Insulin prodrugs hydrolyzable in vivo to yield peglylated insulin |
US6309633B1 (en) | 1999-06-19 | 2001-10-30 | Nobex Corporation | Amphiphilic drug-oligomer conjugates with hydroyzable lipophile components and methods for making and using the same |
US7022674B2 (en) * | 1999-12-16 | 2006-04-04 | Eli Lilly And Company | Polypeptide compositions with improved stability |
AU4935701A (en) | 2000-03-24 | 2001-10-08 | Genentech Inc | Use of insulin for the treatment of cartilagenous disorders |
US6867183B2 (en) | 2001-02-15 | 2005-03-15 | Nobex Corporation | Pharmaceutical compositions of insulin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith |
US7060675B2 (en) | 2001-02-15 | 2006-06-13 | Nobex Corporation | Methods of treating diabetes mellitus |
US7638618B2 (en) | 2001-02-20 | 2009-12-29 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Nucleic acids encoding a hirudin and pro-insulin as superscretable peptides and for parallel improvement of the exported forms of one or more polypeptides of interest |
US7202059B2 (en) | 2001-02-20 | 2007-04-10 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Fusion proteins capable of being secreted into a fermentation medium |
US6852694B2 (en) * | 2001-02-21 | 2005-02-08 | Medtronic Minimed, Inc. | Stabilized insulin formulations |
DE10114178A1 (de) | 2001-03-23 | 2002-10-10 | Aventis Pharma Gmbh | Zinkfreie und zinkarme Insulinzubereitungen mit verbesserter Stabilität |
US6835802B2 (en) * | 2001-06-04 | 2004-12-28 | Nobex Corporation | Methods of synthesizing substantially monodispersed mixtures of polymers having polyethylene glycol moieties |
US6828297B2 (en) | 2001-06-04 | 2004-12-07 | Nobex Corporation | Mixtures of insulin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same |
US6828305B2 (en) | 2001-06-04 | 2004-12-07 | Nobex Corporation | Mixtures of growth hormone drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same |
US6713452B2 (en) * | 2001-06-04 | 2004-03-30 | Nobex Corporation | Mixtures of calcitonin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same |
US7713932B2 (en) | 2001-06-04 | 2010-05-11 | Biocon Limited | Calcitonin drug-oligomer conjugates, and uses thereof |
US6858580B2 (en) * | 2001-06-04 | 2005-02-22 | Nobex Corporation | Mixtures of drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same |
US7166571B2 (en) | 2001-09-07 | 2007-01-23 | Biocon Limited | Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same |
US6770625B2 (en) | 2001-09-07 | 2004-08-03 | Nobex Corporation | Pharmaceutical compositions of calcitonin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith |
US7312192B2 (en) | 2001-09-07 | 2007-12-25 | Biocon Limited | Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same |
US7196059B2 (en) | 2001-09-07 | 2007-03-27 | Biocon Limited | Pharmaceutical compositions of insulin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith |
US6913903B2 (en) | 2001-09-07 | 2005-07-05 | Nobex Corporation | Methods of synthesizing insulin polypeptide-oligomer conjugates, and proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same |
US7030082B2 (en) * | 2001-09-07 | 2006-04-18 | Nobex Corporation | Pharmaceutical compositions of drug-oligomer conjugates and methods of treating disease therewith |
WO2003105768A2 (en) * | 2002-06-13 | 2003-12-24 | Nobex Corporation | Methods of reducing hypoglycemic episodes in the treatment of diabetes mellitus |
DE10227232A1 (de) | 2002-06-18 | 2004-01-15 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Saure Insulinzubereitungen mit verbesserter Stabilität |
CN1247616C (zh) * | 2002-07-19 | 2006-03-29 | 上海中科生龙达生物技术(集团)有限公司 | 新的单体胰岛素,药物组合物及其制法 |
US7193035B2 (en) | 2002-10-29 | 2007-03-20 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Crystals of insulin analogs and processes for their preparation |
EP1959017A1 (en) | 2003-06-17 | 2008-08-20 | SemBioSys Genetics Inc. | Methods for the production of insulin in plants |
SI2107069T1 (sl) | 2003-08-05 | 2013-04-30 | Novo Nordisk A/S | Novi inzulinski derivati |
EP2264065B1 (en) | 2003-08-05 | 2017-03-08 | Novo Nordisk A/S | Novel insulin derivatives |
ES2727854T3 (es) | 2003-11-20 | 2019-10-21 | Novo Nordisk As | Formulaciones de péptidos que contienen propilenglicol que son óptimas para la producción y para su uso en dispositivos de inyección |
ATE517119T1 (de) | 2003-12-03 | 2011-08-15 | Novo Nordisk As | Einzelketteninsulin |
CN1909930B (zh) | 2004-01-21 | 2015-12-16 | 诺和诺德医疗保健公司 | 转谷氨酰胺酶介导的肽的接合 |
WO2006014673A2 (en) * | 2004-07-19 | 2006-02-09 | Nobex Corporation | Insulin-oligomer conjugates, formulations and uses thereof |
US7833513B2 (en) | 2004-12-03 | 2010-11-16 | Rhode Island Hospital | Treatment of Alzheimer's Disease |
EP2292653B1 (en) | 2005-02-02 | 2014-05-21 | Novo Nordisk A/S | Novel insulin derivatives |
WO2006082204A1 (en) | 2005-02-02 | 2006-08-10 | Novo Nordisk A/S | Insulin derivatives |
WO2007020256A1 (en) | 2005-08-16 | 2007-02-22 | Novo Nordisk A/S | Method for making mature insulin polypeptides |
ATE517919T1 (de) | 2005-09-14 | 2011-08-15 | Sanofi Aventis Deutschland | Spaltung von insulinvorstufen durch eine trypsinvariante |
JP4808785B2 (ja) | 2005-12-28 | 2011-11-02 | ノボ・ノルデイスク・エー/エス | インスリン組成物および組成物の製造方法 |
ES2387955T3 (es) | 2006-02-27 | 2012-10-04 | Novo Nordisk A/S | Derivados de insulina |
EP2241327A1 (en) | 2006-03-15 | 2010-10-20 | Novo Nordisk A/S | Mixtures of Amylin and Insulin |
ES2395738T3 (es) | 2006-05-09 | 2013-02-14 | Novo Nordisk A/S | Derivado de insulina |
EP2024390B1 (en) | 2006-05-09 | 2015-08-19 | Novo Nordisk A/S | Insulin derivative |
US9018161B2 (en) | 2006-09-22 | 2015-04-28 | Novo Nordisk A/S | Protease resistant insulin analogues |
US9387176B2 (en) | 2007-04-30 | 2016-07-12 | Novo Nordisk A/S | Method for drying a protein composition, a dried protein composition and a pharmaceutical composition comprising the dried protein |
CN101677944A (zh) | 2007-06-01 | 2010-03-24 | 诺沃-诺迪斯克有限公司 | 稳定的非含水药物组合物 |
EP2514406A1 (en) | 2007-06-01 | 2012-10-24 | Novo Nordisk A/S | Spontaneously dispersible preconcentrates including a peptide drug in a solid or semisolid carrier |
ES2744384T3 (es) | 2007-06-13 | 2020-02-24 | Novo Nordisk As | Formulación farmacéutica que comprende un derivado de insulina |
PL2203181T3 (pl) | 2007-10-16 | 2018-07-31 | Biocon Limited | Podawana doustnie stała kompozycja farmaceutyczna i jej sposób |
MX338336B (es) | 2007-11-20 | 2016-04-07 | Ambrx Inc | Polipeptidos de insulina modificados y sus usos. |
ES2613152T3 (es) | 2008-01-09 | 2017-05-22 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Nuevos derivados de insulina con perfil tiempo/acción extremadamente retardado |
CN101970477B (zh) | 2008-03-14 | 2014-12-31 | 诺沃-诺迪斯克有限公司 | 蛋白酶稳定的胰岛素类似物 |
PT2910570T (pt) | 2008-03-18 | 2017-01-24 | Novo Nordisk As | Análogos de insulina acilados, estabilizados contra proteases |
DE102009038210A1 (de) | 2009-08-20 | 2011-03-03 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Kombination von einem Insulin und einem GLP-1-Agonisten |
DE102008053048A1 (de) | 2008-10-24 | 2010-04-29 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Kombination von einem Insulin und einem GLP-1-Agonisten |
DE102008051834A1 (de) | 2008-10-17 | 2010-04-22 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Kombination von einem Insulin und einem GLP-1-Agonisten |
BRPI0919946A2 (pt) | 2008-10-30 | 2016-02-16 | Novo Nordisk As | tratamento de diabetes melito usando injeções de insulina com frequência de injeção menor que diariamente |
MX2012000304A (es) | 2009-07-06 | 2012-01-27 | Sanofi Aventis Deutschland | Preparaciones insulinicas que comprenden metionina. |
TW201113032A (en) | 2009-07-06 | 2011-04-16 | Sanofi Aventis Deutschland | Slow-acting insulin preparations |
WO2011012719A1 (en) | 2009-07-31 | 2011-02-03 | Ascendis Pharma As | Long acting insulin composition |
WO2011012718A1 (en) | 2009-07-31 | 2011-02-03 | Ascendis Pharma As | Prodrugs comprising an insulin linker conjugate |
NZ599847A (en) | 2009-11-13 | 2013-09-27 | Sanofi Aventis Deutschland | Pharmaceutical composition comprising a glp-1 agonist and methionine |
ES2534191T3 (es) | 2009-11-13 | 2015-04-20 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Composición farmacéutica que comprende un agonista de GLP-1, una insulina y metionina |
WO2011141407A1 (en) | 2010-05-10 | 2011-11-17 | Novo Nordisk A/S | Process for the preparation of insulin-zinc complexes |
PT3572091T (pt) | 2010-08-17 | 2024-03-01 | Ambrx Inc | Polipéptidos de relaxina modificados e as suas utilizações |
US20140148384A1 (en) | 2010-08-30 | 2014-05-29 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Use of ave0010 for the manufacture of a medicament for the treatment of diabetes mellitus type 2 |
EP2438930A1 (en) | 2010-09-17 | 2012-04-11 | Sanofi-Aventis Deutschland GmbH | Prodrugs comprising an exendin linker conjugate |
WO2012055967A2 (en) | 2010-10-27 | 2012-05-03 | Novo Nordisk A/S | Treating diabetes melitus using insulin injections administered with varying injection intervals |
DK2632478T3 (da) | 2010-10-27 | 2019-10-07 | Novo Nordisk As | Behandling af diabetes melitus under anvendelse af insulinindsprøjtninger indgivet med varierende indsprøjtningsintervaller |
US9821032B2 (en) | 2011-05-13 | 2017-11-21 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Pharmaceutical combination for improving glycemic control as add-on therapy to basal insulin |
HUE027989T2 (en) | 2011-08-29 | 2016-11-28 | Sanofi Aventis Deutschland | A pharmaceutical composition for use in glycemic control in patients with type 2 diabetes |
AR087744A1 (es) | 2011-09-01 | 2014-04-16 | Sanofi Aventis Deutschland | Composicion farmaceutica para uso en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa |
US9458219B2 (en) | 2011-12-15 | 2016-10-04 | Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd. | Human insulin analogue and acylated derivative thereof |
CA2872083A1 (en) | 2012-05-01 | 2013-11-07 | Novo Nordisk A/S | Pharmaceutical composition |
US20130315891A1 (en) | 2012-05-25 | 2013-11-28 | Matthew Charles | Formulations of human tissue kallikrein-1 for parenteral delivery and related methods |
EP2854841B1 (en) | 2012-06-04 | 2017-02-22 | Diamedica Inc. | Human tissue kallikrein 1 glycosylation isoforms |
CN104902922B (zh) | 2012-11-13 | 2017-12-12 | 阿道恰公司 | 包含经取代阴离子化合物的速效胰岛素制剂 |
US9867869B2 (en) | 2012-12-12 | 2018-01-16 | Massachusetts Institute Of Technology | Insulin derivatives for diabetes treatment |
US9707275B2 (en) | 2012-12-19 | 2017-07-18 | Wockhardt Limited | Stable aqueous composition comprising human insulin or an analogue or derivative thereof |
RU2015130613A (ru) | 2012-12-26 | 2017-01-31 | Вокхардт Лимитед | Фармацевтическая композиция |
KR20140088837A (ko) | 2013-01-03 | 2014-07-11 | 한미약품 주식회사 | N-말단 전하가 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체 |
TWI780236B (zh) | 2013-02-04 | 2022-10-11 | 法商賽諾菲公司 | 胰島素類似物及/或胰島素衍生物之穩定化醫藥調配物 |
WO2014177623A1 (en) | 2013-04-30 | 2014-11-06 | Novo Nordisk A/S | Novel administration regime |
AU2014326181A1 (en) | 2013-09-30 | 2016-03-17 | Wockhardt Limited | Pharmaceutical composition |
RU2673185C2 (ru) | 2013-10-07 | 2018-11-22 | Ново Нордиск А/С | Новое производное аналога инсулина |
BR112016013832A2 (pt) | 2014-01-09 | 2017-08-08 | Sanofi Sa | Uso de análogo e/ou derivado de insulina, formulação farmacêutica e processo para a preparação da mesma, kit e dispositivo médico |
CN112957455A (zh) | 2014-01-09 | 2021-06-15 | 赛诺菲 | 胰岛素类似物和/或胰岛素衍生物的稳定化药物制剂 |
RU2016132340A (ru) | 2014-01-09 | 2018-02-14 | Санофи | Стабилизированные фармацевтические составы на основе инсулина аспарта |
CN104017809A (zh) * | 2014-06-05 | 2014-09-03 | 山东省农业科学院生物技术研究中心 | 改造的人Insulin蛋白表达基因及表达方法 |
WO2016001862A1 (en) | 2014-07-04 | 2016-01-07 | Wockhardt Limited | Extended release formulations of insulins |
HUE062573T2 (hu) | 2014-12-12 | 2023-11-28 | Sanofi Aventis Deutschland | Glargin inzulin/lixiszenatid rögzített arányú készítmény |
AR102869A1 (es) | 2014-12-16 | 2017-03-29 | Lilly Co Eli | Composiciones de insulina de rápida acción |
TWI748945B (zh) | 2015-03-13 | 2021-12-11 | 德商賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 | 第2型糖尿病病患治療 |
TW201705975A (zh) | 2015-03-18 | 2017-02-16 | 賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 | 第2型糖尿病病患之治療 |
JO3749B1 (ar) | 2015-08-27 | 2021-01-31 | Lilly Co Eli | تركيبات إنسولين سريعة المفعول |
CN105440125B (zh) * | 2015-11-25 | 2019-09-24 | 华润昂德生物药业有限公司 | 地特胰岛素或其类似物的制备方法 |
GB201607918D0 (en) | 2016-05-06 | 2016-06-22 | Arecor Ltd | Novel formulations |
AU2017334290B2 (en) | 2016-09-29 | 2023-04-20 | Arecor Limited | Novel formulations |
IL300839B2 (en) | 2016-12-16 | 2024-04-01 | Novo Nordisk As | Pharmaceutical preparations containing insulin |
JP2020510023A (ja) | 2017-03-09 | 2020-04-02 | ダイアメディカ, インコーポレイテッド | 組織カリクレイン1の剤形 |
GB201707188D0 (en) | 2017-05-05 | 2017-06-21 | Arecor Ltd | Novel formulations |
GB201707189D0 (en) | 2017-05-05 | 2017-06-21 | Arecor Ltd | Novel formulations |
GB201707187D0 (en) | 2017-05-05 | 2017-06-21 | Arecor Ltd | Novel formulations |
US11207384B2 (en) | 2017-06-01 | 2021-12-28 | Eli Lilly And Company | Rapid-acting insulin compositions |
IL277721B2 (en) | 2018-04-04 | 2024-03-01 | Arecor Ltd | Medical infusion pump for administering an insulin compound |
CA3094308A1 (en) | 2018-04-04 | 2019-10-10 | Arecor Limited | Medical infusion pump system for the delivery of an insulin compound |
CN112004521A (zh) | 2018-04-04 | 2020-11-27 | 艾瑞克有限公司 | 用于递送胰岛素化合物的医用输注泵系统 |
WO2019223752A1 (zh) | 2018-05-24 | 2019-11-28 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 一种重组人胰岛素或其类似物的前体的制备方法 |
US10335464B1 (en) | 2018-06-26 | 2019-07-02 | Novo Nordisk A/S | Device for titrating basal insulin |
KR20220119730A (ko) | 2019-12-30 | 2022-08-30 | 간 앤 리 파마슈티칼스 컴퍼니, 리미티드 | 인슐린 유도체 |
MX2022008139A (es) | 2019-12-30 | 2022-10-03 | Gan & Lee Pharmaceuticals Co Ltd | Compuestos de glp-1 de acción prolongada. |
GB202004814D0 (en) | 2020-04-01 | 2020-05-13 | Arecor Ltd | Novel formulations |
CN114075275A (zh) * | 2020-08-17 | 2022-02-22 | 成都奥达生物科技有限公司 | 一种长效胰岛素类似物 |
WO2023143458A1 (zh) | 2022-01-28 | 2023-08-03 | 甘李药业股份有限公司 | 酰化胰岛素 |
CN115493919B (zh) * | 2022-11-21 | 2023-04-07 | 保定佳瑞源生物芯片有限公司 | 一种c肽和胰岛素检测试剂盒的校准品稀释液 |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB1426061A (en) * | 1972-12-28 | 1976-02-25 | Ici Ltd | Polypeptides |
JPS55138393A (en) * | 1979-04-13 | 1980-10-29 | Shionogi & Co Ltd | Semisynthesis of insulin |
DE3326472A1 (de) * | 1983-07-22 | 1985-02-14 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Neue insulin-derivate, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung sowie pharmazeutische mittel zur behandlung des diabetes mellitus |
DK347086D0 (da) * | 1986-07-21 | 1986-07-21 | Novo Industri As | Novel peptides |
PH25772A (en) * | 1985-08-30 | 1991-10-18 | Novo Industri As | Insulin analogues, process for their preparation |
DE10075034I1 (de) * | 1987-02-25 | 2001-05-23 | Novo Nordisk As | Insulinderivate |
DK257988D0 (da) * | 1988-05-11 | 1988-05-11 | Novo Industri As | Nye peptider |
IL93282A (en) * | 1989-02-09 | 1995-08-31 | Lilly Co Eli | Insulin analogues |
-
1989
- 1989-12-15 HU HU90984A patent/HUT56857A/hu unknown
- 1989-12-15 AU AU48344/90A patent/AU641631B2/en not_active Ceased
- 1989-12-15 KR KR1019900701869A patent/KR910700262A/ko not_active Application Discontinuation
- 1989-12-15 WO PCT/DK1989/000296 patent/WO1990007522A1/en active Application Filing
- 1989-12-15 JP JP2501698A patent/JPH04502465A/ja active Pending
- 1989-12-20 US US07/453,445 patent/US5164366A/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-12-21 EP EP97121214A patent/EP0861851B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-12-21 ES ES97121214T patent/ES2134669T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-12-21 DE DE68928917T patent/DE68928917T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-12-21 DE DE68928810T patent/DE68928810T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-12-21 AT AT97121214T patent/ATE178908T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-12-21 DE DE0861851T patent/DE861851T1/de active Pending
- 1989-12-21 EP EP97121213A patent/EP0837072B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-12-21 EP EP89313460A patent/EP0375437B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-12-21 AT AT89313460T patent/ATE170875T1/de active
- 1989-12-21 DE DE68928971T patent/DE68928971T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-12-21 NZ NZ231936A patent/NZ231936A/en unknown
- 1989-12-21 AT AT97121213T patent/ATE175974T1/de active
- 1989-12-22 IL IL92853A patent/IL92853A0/xx unknown
- 1989-12-22 YU YU02436/89A patent/YU243689A/xx unknown
- 1989-12-22 CA CA002006578A patent/CA2006578A1/en not_active Abandoned
- 1989-12-23 CN CN89109575A patent/CN1043719A/zh active Pending
-
1991
- 1991-06-20 FI FI913037A patent/FI913037A0/fi not_active Application Discontinuation
- 1991-06-21 NO NO912438A patent/NO301483B1/no unknown
Cited By (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH083067A (ja) * | 1994-06-16 | 1996-01-09 | Eli Lilly & Co | インスリン類似化合物製剤 |
JP2001199899A (ja) * | 1994-06-16 | 2001-07-24 | Eli Lilly & Co | インスリン類似化合物複合体 |
WO2006093222A1 (ja) * | 2005-03-02 | 2006-09-08 | Ajinomoto Co., Inc. | インスリンの多量体形成阻害剤 |
JP2009539778A (ja) * | 2006-06-08 | 2009-11-19 | ダイアベコア メディカル インコーポレイテッド | インスリンオリゴマー誘導体 |
JP2012505852A (ja) * | 2008-10-17 | 2012-03-08 | サノフィ−アベンティス・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | インスリン及びglp−1アゴニストの組み合わせ |
JP2012255040A (ja) * | 2008-10-17 | 2012-12-27 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | インスリン及びglp−1アゴニストの組み合わせ |
JP2012532177A (ja) * | 2009-07-06 | 2012-12-13 | サノフィ−アベンティス・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | 熱及び振動安定性インスリン製剤 |
JP2017508741A (ja) * | 2014-02-28 | 2017-03-30 | ノヴォ ノルディスク アー/エス | リシン22のイプシロン位においてアシル化された、A22K、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン類似体 |
JP2018526001A (ja) * | 2015-08-28 | 2018-09-13 | ハンミ ファーマシューティカル カンパニー リミテッド | 新規なインスリンアナログ及びその用途 |
JP2021168687A (ja) * | 2015-08-28 | 2021-10-28 | ハンミ ファーマシューティカル カンパニー リミテッド | 新規なインスリンアナログ及びその用途 |
US11396534B2 (en) | 2016-09-23 | 2022-07-26 | Hanmi Pharm. Co., Ltd. | Insulin analogs with reduced affinity to insulin receptor and use thereof |
US11752216B2 (en) | 2017-03-23 | 2023-09-12 | Hanmi Pharm. Co., Ltd. | Insulin analog complex with reduced affinity for insulin receptor and use thereof |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0861851A1 (en) | 1998-09-02 |
ATE170875T1 (de) | 1998-09-15 |
DE68928971T2 (de) | 1999-12-02 |
EP0837072A2 (en) | 1998-04-22 |
DE861851T1 (de) | 1999-04-22 |
ATE178908T1 (de) | 1999-04-15 |
DE68928971D1 (de) | 1999-05-27 |
DE68928917D1 (de) | 1999-03-04 |
CN1043719A (zh) | 1990-07-11 |
FI913037A0 (fi) | 1991-06-20 |
EP0837072B1 (en) | 1999-01-20 |
AU641631B2 (en) | 1993-09-30 |
NO912438L (no) | 1991-08-21 |
ATE175974T1 (de) | 1999-02-15 |
EP0861851B1 (en) | 1999-04-14 |
US5164366A (en) | 1992-11-17 |
NZ231936A (en) | 1992-04-28 |
DE68928917T2 (de) | 1999-08-05 |
CA2006578A1 (en) | 1990-06-23 |
HUT56857A (en) | 1991-10-28 |
EP0837072A3 (en) | 1998-08-19 |
ES2134669T3 (es) | 1999-10-01 |
IL92853A0 (en) | 1990-09-17 |
DE68928810D1 (de) | 1998-10-15 |
EP0375437A2 (en) | 1990-06-27 |
EP0375437B1 (en) | 1998-09-09 |
KR910700262A (ko) | 1991-03-14 |
WO1990007522A1 (en) | 1990-07-12 |
AU4834490A (en) | 1990-08-01 |
YU243689A (en) | 1991-10-31 |
NO912438D0 (no) | 1991-06-21 |
DE68928810T2 (de) | 1999-03-18 |
NO301483B1 (no) | 1997-11-03 |
EP0375437A3 (en) | 1991-09-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JPH04502465A (ja) | ヒトインシュリン類似物質 | |
JP2662390B2 (ja) | インシユリン類似体 | |
EP0419504B1 (en) | Insulin analogues | |
AU637365B2 (en) | Novel insulin compounds | |
US5716927A (en) | Insulin analogs having a modified B-chain | |
US5149777A (en) | Human insulin analogs and preparations containing them | |
JPH03504240A (ja) | インシュリン類似物質 | |
DK159856B (da) | Humaninsulinderivater og farmaceutiske praeparater, som indeholder disse derivater | |
RU2104305C1 (ru) | Аналоги инсулина человека, способ их получения, раствор для инъекций | |
DK166730B (da) | Humaninsulinanaloger og deres farmaceutisk tolerable salte samt farmaceutiske praeparater indeholdende disse | |
DD290426A5 (de) | Human insulin analoge |