DE68907280T2

DE68907280T2 - Avirulenter Tollwut-Impfstoff.

Info

Publication number: DE68907280T2
Application number: DE89401925T
Authority: DE
Inventors: Patrice Coulon; Anne Flamand; Florence Lafay; Helene Leblois; Marie-Christine Tuffereau
Original assignee: Virbac SA
Current assignee: Virbac SA
Priority date: 1988-07-05
Filing date: 1989-07-05
Publication date: 1993-12-02
Anticipated expiration: 2009-07-06
Also published as: ES2058570T3; FR2633832B1; DK331589A; EP0350398A1; DK331589D0; DK170393B1; ATE90878T1; EP0350398B1; DE68907280D1; FR2633832A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen Tollwut- Impfstoff.
Das Tollwut-Virus ist ein Rhabdovirus, das aus fünf Proteinen besteht, darunter einem externen Glykoprotein, das die Synthese von neutralisierenden Antikörpern bei inokulierten Tieren auslöst. Die Injektion von gereinigtem Glykoprotein schützt das Tier vor einer Überinfektion. Die am häufigsten verwendeten Stämme des Tollwut-Virus, insbesondere der Stamm CVS und der Stamm ERA, von denen die SAD-Stämme, wie die Stämme SAD Bern und SAD B19, abgeleitet sind, sind in "Rabies Viruses" von H.F. Clark und T.J. Wiktor - Strains of Human Viruses, herausgegeben von Majer und Plotkin Karger, Basel, 1972, S. 177- 182, beschrieben. Die Aminosäuresequenz des Glykoproteins des Stamms CVS wurde von Yelverton et al. "Rabies virus glycoprotein analogs: Biosynthesis in Escherichia coli", Science 219, 614-620 beschrieben.
Dieses Glykoprotein weist drei unterschiedliche Antigenstellen auf (Stelle I, II und III), die Stelle III in der Position 330-340 enthält Arginin 333, das die Virulenz dieses Stamms bestimmt. Andere Arbeiten haben übrigens im Fall vom CVS- Stamm gezeigt, daß Arginin durch Lysin substituiert werden kann, ohne daß dabei die Erregerkraft des Virus verloren geht.
Die Aminosäuresequenz des Glykoproteins des Stamms SAD ist noch nicht zur Gänze erstellt. Man konnte jedoch feststellen, daß die Antigenstelle III des Glykoproteins des Stamms SAD Bern identisch mit jener des Glykoproteins des Stamms CVS ist.
Die derzeit verwendeten Tollwut-Impfstoffe sind entweder aus inaktivierten Viren hergestellte Vakzine oder Vakzine, die aus Virusstämmen bestehen, deren Virulenz abgeschwächt wurde.
Die Inaktivierung der Viren kann mit verschiedenen Verfahren bewerkstelligt werden, insbesondere mit chemischen Verfahren, wie der Behandlung mit Formol oder β-Propiolacton.
Der Hauptnachteil dieses Verfahrens zur Herstellung von Impfstoffen besteht in der Handhabung von virulenten Stämmen, die sehr strenge Durchführungsbedingungen erfordert und Gefahren der Kontamination des Herstellungspersonals in sich birgt.
Anderseits haben inaktivierte Vakzine, die auf oralem weg verabreicht werden, keine Schutzkraft.
Die Abschwächung der Virulenz von Virus stämmen ist eine bekannte Methode; sie kann beispielsweise durch aufeinanderfolgende Passagen der Virusstämme auf einen Wirt, der sich von der Trägergattung unterscheidet (z.B. Kaninchen oder Maus), oder in Zellkultur ausgeführt werden. Man erhält so Stämme, die an den ursprünglichen Wirt fehlangepaßt und daher für diesen weniger pathogen sind, dabei aber ihre Impfleistung beibehalten.
Die SAD-Stämme, wie die Stämme SAD B19 und SAD Bern, die der Öffentlichkeit zugänglich sind, sind natürlich attenuierte Stämme, die bereits in Europa bei der Impfung von Füchsen getestet wurden. Sie können zur Verabreichung auf oralem Weg zum Köder gemischt werden. Diese Stämme erwiesen sich jedoch als pathogen für andere Tierarten und den Menschen. Es besteht daher ein potentielles Kontaminationsrisiko, das die Bedeutung dieser Stämme für die orale Impfung beträchtlich verringert.
Tatsächlich bewirkte die orale Verabreichung des Stamms SAD Bern einer Gruppe von 23 wilden Nagetieren, ausgewählt aus Apodemus flavicolus und sylvaticus, Arvicola terrestris, Clethrionomys clareolus, Minotus agresti, den Tod zweier Tiere durch Tollwut.
Untersuchungen an der Maus haben auch gezeigt, daß der Stamm SAD Bern pathogen für diese Gattung sowohl auf intrazerebralem als auch auf intramuskulärem Weg ist, wie die Kurven der angeschlossenen Figuren 1a und 1b zeigen, u.zw. ist
Fig. 1a die Mortalitätskurve der erwachsenen Maus als Funktion der intrazerebral verabreichten Dosen (in bereichsbildenden Einheiten); und
Fig. 1b die Mortalitätskurve der erwachsenen Maus als Funktion der intramuskulär verabreichten Dosen (in bereichsbildenden Einheiten.).
Auf oralem Weg wurde bei der Maus eine Mortalität von 10 % in einer Dosis von 105,5 PFU notiert.
Der Stamm SAD Bern als solcher kann somit nicht in einer Impfkampagne für Füchse eingesetzt werden, ohne die anderen Wildtiere und den Menschen in Gefahr zu bringen. Dasselbe gilt für den Stamm SAD B19.
Es ist daher unumgänglich, einen Tollwut-Impfstoff zu finden, der für die Verabreichung auf oralem Weg eingesetzt werden kann und dabei für andere Tiergattungen unschädlich ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft einen wirksamen Impfstoff, mit dem die obigen Nachteile vermieden werden können.
Der erfindungsgemäße Impfstoff besteht aus einer avirulenten Mutante eines SAD-Stamms des Rabiesvirus, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie anstelle des Arginins 333 des Glykoproteins eine andere natürliche Aminosäure als Lysin besitzt.
Man weiß, daß die Substitution von Arginin 333 durch Isoleucin, Glycin oder Glutamin im Glykoprotein des CVS-Stamms oder des ERA-Stamms die Virulenz dieses Stamms modifiziert. Es war jedoch keinesfalls klar, daß eine solche Mutation bei einem SAD-Stamm, wie z.B. beim SAD Bern, auch die Virulenz desselben aufhebt, dabei aber eine immunogene Kraft beibehält, die mindestens ebenso hoch wie jene des Mutterstamms ist.
Die Mutanten, die für Zwecke der Erfindung in Frage kommen, sind avirulente Mutanten mit hoher Schutzwirkung, die aus einem SAD-Stamm des Rabiesvirus mit Hilfe von neutralisierenden monoklonalen Antikörpern selektioniert werden.
Die zur Selektion der erfindungsgemäßen Mutanten eingesetzten monoklonalen Antikörper werden durch Verschmelzen von Myelomzellen mit antivirale Antikörper erzeugenden Zellen nach der von Köhler und Milstein in Nature, Bd. 256, 495-497 (1975) beschriebenen Hybridisierungsmethode erhalten, welche Methode dem Fachmann heutzutage wohlbekannt ist.
Gemäß dieser Methode kann man Zellen, die von unterschiedlichen Spezies stammen, verschmelzen, doch ist es vorteilhaft, Zellen zu verwenden, die von ein- und derselben Tiergattung kommen. Beispielsweise verwendet man vorzugsweise Mäusemyelomzellen und anderseits Mäusemilzzellen, die zuvor mit einem Tollwutvirusstamm nach dem oben definierten Protokoll immunisiert wurden.
Gemäß einem allgemeinen Aspekt umfaßt dieses beschriebene Hybridisierungsverfahren unter Bezugnahme auf Mäusezellen die folgenden Stufen:
1) Mäuseimmunisierung mit einer bestimmten Menge an mit β- Propiolacton inaktiviertein Virus;
2) Entnahme der Milz von immunisierten Mäusen und Abtrennung der Splenozyten;
3) Verschmelzung der so erhaltenen Splenozyten mit Mäusemyelomzellen in Gegenwart eines Verschmelzungsförderers:
4) Kultivierung der erhaltenen Hybridzellen in einem selektiven Medium, bei dem keine nicht verschmolzenen Myelomzellen entstehen, und in Gegenwart von geeigneten Nährmedien;
5) Selektion der den gewünschten Antikörper erzeugenden Zellen und Klonierung dieser Zellen.
Das Immunisationsprotokoll umfaßt die Injektion von 100 ug mit β-Propiolacton inaktiviertem Virus in Balb-C-Mäuse auf intraperitonealem Weg mit komplettem Freund-Adjuvans und einer Wiederholung auf intravenösem weg 4 Tage vor der Verschmelzung nach einer Ruhezeit von 12 Monaten.
Die Splenozyten der immunisierten Mäuse werden nach der Entnahme der Milz nach der klassischen Arbeitsweise gesammelt.
Die zur Bildung der neutralisierenden monoklonalen Antikörper verwendeten Mäusemyelomzellen sind Myelomzellen von Balb- C-Mäusen, die von der Linie SP&sub2;O stammen. Diese Myelomzellen wurden wegen ihrer Sensibilität gegenüber Aminopterin ausgewählt und in einem geeigneten Medium, wie dem essentiellen Eagle- Medium, modifiziert von Dulbecco (Dulbecco Modified Eagle Medium), welches im folgenden DMEM-Medium genannt wird und dem 15 % Fohlenserum zugesetzt worden war, kultiviert.
Die Verschmelzung der Myelomzellen mit den Splenozyten wurde durch Mischen von 5.10&sup5; Myelomzellen mit 5.10&sup5; Milzzellen von immunisierten Mäusen in Gegenwart eines Verschmelzungsförderers, wie z.B. Polyethylenglykol, ausgeführt.
Nach der Inkubation bei 37ºC werden die Zellen in DMEM- Medium gewaschen und neuerlich in Suspension gebracht, dann über einem selektiven, nur für das Wachstum der Hybridzellen ausgelegten Medium kultiviert. Ein solches Medium enthält Aminoxanthin, Aminopterin und Thymidin.
Danach selektioniert man die überstände der Kulturen 7 bis 20 Tage nach der Verschmelzung, indem man die Überstände mit einer Suspension von CVS-Virus in Kontakt bringt und die Antikörper zurückhält, die die Suspension neutralisieren.
Von diesen Antikörpern hält man danach die Antikörper zurück, die die avirulente Mutante TAG1, die vom CVS-Stamm abgeleitet und in der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (C.N.C.M.) - INSTITUT PASTEUR, Frankreich, am 12. April 1985 unter der Nr. I-433 hinterlegt wurde, nicht neutralisieren.
Die resultierenden monoklonalen Antikörper, die also den CVS-Stamm, nicht aber die avirulente Mutante TAG1 neutralisieren, gestatten die Selektionierung der avirulenten Mutanten aus jedem Rabiesvirusstamm, der durch diese monoklonalen Antikörper neutralisiert wird.
Die erfindungsgemäßen Mutanten sind avirulente Mutanten eines SAD-Stamms, wie insbesondere des Stamms SAD Bern, die beständig gegen die nach dem obigen Verfahren erhaltenen monoklonalen Antikörper sind.
Danach wird die pathogene Kraft dieser Mutanten durch intrazerebrale Injektion von 10&sup5; PFU in erwachsene Mäuse getestet. Die Mutanten, die bei dieser Dosis und auf dem Injektionsweg nicht zugrundegehen, werden als avirulent erachtet.
So werden die erfindungsgemäßen Mutanten aus einem SAD- Stamm des Rabiesvirus mit Hilfe der oben definierten monoklonalen Antikörper selektioniert, und ihre Avirulenz wird durch die obige Arbeitsweise kontrolliert.
Die erfindungsgemäßen Mutanten können außerdem noch andere Mutationen, wie beispielsweise die Beständigkeit gegen einen die virulenten SAD-Stämme neutralisierenden monoklonalen Antikörper enthalten, wodurch es möglich ist, eine eventuelle Reversion der Virulenz der zur oralen Impfung von Füchsen verwendeten SAD- Stämme zu erkennen.
Die erfindungsgemäßen Mutanten können an Nierenzellen von neugeborenen Hamstern BHK 21 in Gegenwart von GEM-Medium (essentielles Minimum-Modifikationsmedium Glasgow, vertrieben von FLOW) und 2 % Kälberserum bei 33ºC und in feuchter Atmosphäre mit 5 % CO&sub2; vervielfacht werden.
Sie werden nach üblichen Methoden titriert, z.B. durch Bestimmung der letalen Dosis 50 (DL&sub5;&sub0;) bei jungen Mäusen, durch Immunfluoreszenz oder durch Bestimmung der in Agar lysebildenden Bereiche. Sie können bei -70ºC konserviert werden.
Die Analyse der Aminosäuresequenz des Glykoproteins dieser Mutanten hat gezeigt, daß Arginin in 333 durch eine andere natürliche Aminosäure als Lysin ersetzt worden war. Diese Aminosäure kann beispielsweise Glutamin, Glycin, Isoleucin, Leucin, Serin und Methionin sein.
Diese Mutation rührt von einer einzigen Nucleotidveränderung im Codon von Arginin 333 her. Aufgrund der Tatsache, daß die Transversionen entsprechenden Mutationen zehnmal weniger häufig sind als Transitionen entsprechende Mutationen, werden Mutanten bevorzugt, deren Mutation aus einer Transversion resultiert. Die Häufigkeit der Reversion einer aus einer Transversion stammenden avirulenten Mutante ist nämlich geringer als bei einer Transitionsabstammung.
Die ein Serin anstelle des Arginins tragende Mutante (Mutation entsprechend einer Transversion), die nach dem obigen Verfahren aus dem Stamm SAD Bern erhalten wurde und im folgenden SAG1 genannt wird, wurde am 5. Juli 1988 unter der Nr. I-777 bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (C.N.C.M.) - INSTITUT PASTEUR, Frankreich, hinterlegt. Diese Mutante enthält eine zweite Mutation, nämlich die Beständigkeit gegen einen die virulenten SAD-Stämme neutralisierenden monoklonalen Antikörper, der nach dem klassischen Verfahren zur Herstellung von Hybridomen erhalten wurde.
Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die Mutante SAG1 genauer beschrieben, ohne dabei jedoch den Umfang derselben auf diese einzige Mutante einzuschränken.

A - Mortalitätstests

1) Bei der erwachsenen Maus

Die Mutante SAG1 wurde auf ihre Avirulenz durch intrazerebrale Injektion von 10&sup5; PFU in erwachsene Mäuse getestet, die diese Injektion überlebt haben. Diese Mutante ist somit avirulent.
Weiters bewirkte die orale Injektion von SAG1 keine Mortalität, wie die Resultate der nachstehenden Tabelle zeigen: SAG1 auf oralem Weg (PFU) log Mortalität bei der erwachsenen Maus

2) Bei den Nagern Apodemus flavicolus und sylvaticus

Die Mutante SAG1 wurde 20 Nagetieren Apodemus flavicolus und sylvaticus in einer Dosis von 10&sup5; PFU auf oralem Weg verabreicht. Durch die Verabreichung dieser Dosis wurde keine Mortalität verursacht.

B - Wirksamkeit der Mutante SAG1 bei der oralen Impfung des Fuchses

Gruppen von 4 Füchsen wurden auf intramuskulärem Weg auf J30 mit 103,4 PFU des wilden Stamms GS getestet.
Die erzielten Resultate scheinen in der nachstehenden Tabelle auf. Sie zeigen, daß die Mutante SAG1 eine Impfkraft hat, die ähnlich jener des Stamms SAD Bern ist. Impfdosis in PFU Mortalität in % Mittlerer Titer gegen J 30 in neutralisierenden Antikörpern Mutante Kontrollen
Die erfindungsgemäßen Mutanten können als Lebendvakzine über sämtliche überlicherweise zur Impfung verwendeten Verabreichungsarten, insbesondere auf intramuskulärem oder oralem Weg, verabreicht werden. Die Mutanten werden vorteilhafterweise in einem pharmazeutisch akzeptablen inerten Vehikel, wie Physiologischen Serum, verdünnt.

Claims

Avirulenter Tollwut-Impfstoff, dadurch gekennzeichnet, daß er aus einem avirulenten mutierten Virus eines desaktivierten, avirulenten Stamms (SAD-Stamm) des Tollwutvirus besteht, dessen Gly oprotein auf Position 333 eine andere natürliche Aminosäure als Lysin oder Arginin besitzt.
2. Impfstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäure auf Position 333 Methionin, Glutamin, Glycin, Isoleucin, Leucin oder Serin ist.
3. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäure auf Position 333 Serin ist.
4. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das mutierte Virus ein Virus des SAD-Stamms Bern ist.
5. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das mutierte Virus das am 5. Juli 1988 unter der Nr. I-777 bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes - INSTITUT PASTEUR (C.N.C.M) FRANCE eingereichte mutierte Virus ist.
6. Avirulentes mutiertes Virus des SAD-Stamms Bern, unter der Nr. I-777 eingereicht am 5. Juli 1988 bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes - INSTITUT PASTEUR (C.N.C.M) FRANCE.