DE2632255A1 - Neues rabiesvirusvakzin und verfahren zu dessen herstellung - Google Patents

Description

Vakzine mehrerer Rabiesvirusstämme wurden bereits zur Immunisierung von Tieren verwendet.

Einer der für diesen Zweck verwendeten Stämme ist der bekannte Flury-Stamm, der zur Immunisierung von Hunden angewendet wird. Der Flury-Stamm ist durch Durchgang eines Straßenkotvirus durch Hühnergehirn isoliert und dieser Stamm wurde dazu angepaßt, in befruchteten Eiern zu wachsen.

Vakzine, die den Flury-Stamm des Rabiesvirus enthalten, eignen sich zur Anwendung bei der Immunisierung von Hunden gegen Rabies. Das Flury-Vakzin weist jedoch bestimmte Nachteile auf. Es enthält eine verhältnismäßig große Menge unerwünschter Eiweiße, gegen die das zu behandelnde Tier empfindlich sein kann, und es enthält eine verhältnismäßig geringe Menge des wirksamen Virus.

Der ERA-Stamm des Rabiesvirus ist von dem SAD-Virus, d.h. von einem Virus-Fixe-Stamm abgeleitet, der ursprünglich aus einem tollen Hund isoliert und im Mäusegehirn und Hamsternierenzellen fortgepflanzt und dann primären Schweinenierenzellen angepaßt wird. Eine Probe des ERA-Stammes des Rabiesvirus ist bei der American Type Culture Collection, Washington D.C., am 29. Oktober 1964 deponiert und wurde dort unter Nr. VR 332 eingetragen.

Vakzine, die den ERA-Stamm enthalten, der primären Schweinenierenzellen angepaßt ist, werden vielfach zur Immunisierung von verschiedenen Tierarten, wie Hunden, Katzen und Vieh, gegen Rabies verwendet.

Um zu bestimmen, ob das Rabiesvirus imstande ist, eine genügende Anzahl von Rabies-Antikörpern zu erzeugen, wenn es in Form eines Vakzins bei Tieren eingespritzt wird, wird der Serumtiter der vakzinierten Tiere ermittelt. Um einen derartigen Titer zu ermitteln, muß ein viel Zeit beanspruchendes und aufwendiges Verfahren verwendet werden, bei dem Serumvirusneutralisierungsversuche dadurch durchgeführt werden, daß

Verdünnungsreihen des Virus hergestellt und mit einer tödlichen Rabiesvirusmenge gemischt werden, das Gemisch von Virus und Serum während 1,5 Stunden bei einer Temperatur von 37°C inkubiert wird, um es den Rabies-Antikörpern zu ermöglichen, das Virus zu neutralisieren, und dann das Gemisch von Serum und Virus in das Gehirn junger Mäuse inokuliert wird. Das Überleben der inokulierten Mäuse im Vergleich zu Kontrolltieren ist ein Maß für die Menge an Rabies Antikörpern.

Beim Durchgang durch primäres Schweinenierengewebe führte der ERA-Stamm des Rabiesvirus dann und wann einige geringe zytopathogene Änderungen in den Gewebekulturen herbei. Die Zytopathologie war aber unregelmäßig und es wurde keine Korrelation zwischen zytopathogenen Änderungen und Virustiter gefunden. (Abelseth, Can. Vet. Jour., Band 5, Nr. 4, April 1964, S. 84 - 87 und insbesondere S. 86).

Daher ist es nicht möglich, durch Beobachtung zytopathogener Effekte den Titer des ERA-Stammes des Rabiesvirus zu ermitteln oder Serumantikörper in Gewebekultursystemen zu messen.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen verbesserten Rabiesvirusstamm, auf einen derartigen Stamm enthaltende Vakzine und auf den Gebrauch solcher Vakzine zur Vermeidung von Rabies bei Tieren.

Die Erfindung bezweckt, einen neuen und verbesserten Rabiesvirusstamm zu schaffen.

Weiter bezweckt die Erfindung, einen Rabiesvirusstamm zu schaffen, der imstande ist, einen signifikant reproduzierbaren zytopathogenen Effekt herbeizuführen, der direkt mit dem Titer des Virus korreliert.

Außerdem bezweckt die Erfindung, ein verbessertes lebendes geschwächtes Rabiesvirusvakzin zu schaffen.

Nachstehend folgt eine detailliertere Erläuterung.

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines modifizierten geschwächten Rabiesvirusstammes, der imstande ist, einen signifikant reproduzierbaren zytopathogenen Effekt auf eine ausgewählte Zellenlinie und insbesondere einen zytopathogenen Effekt auf die Zellenlinie herbeizuführen, der dem Virustiter entspricht.

Weiterhin bezieht die Erfindung sich auf Rabiesvakzine, die den modifizierten Rabiesvirusstamm nach der Erfindung enthalten. Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird ein verbesserter geschwächter Rabiesvirusstamm erhalten, der einen signifikant reproduzierbaren zytopathogenen Effekt herbeiführt. Die zytopathogene Wirkung dieses Virus steht direkt im Zusammenhang mit dem Titer des Virus, so daß ein einzigartiges Mittel erhalten wird, durch das bestimmt werden kann, wenn ein Vakzin der gewünschten Stärke erzeugt ist. Vakzine, die den modifizierten Virusstamm nach der Erfindung enthalten, sind sehr wirksam zum Erhalten von Immunität gegen Rabiesinfektionen, was mit der Erzeugung eines Mindestmaßes an unerwünschten Nebenwirkungen verbunden ist, wenn das Vakzin Tieren verabreicht wird.

Der verbesserte Rabiesvirusstamm nach der Erfindung wird, ausgehend von dem ERA-Stamm des Rabiesvirus hergestellt. Der ERA-Rabiesstamm ist von Abelseth, M.K., "Propagation of Rabies Virus in Pig Kidney Cell Cultures", Can. Vet. J. 5, 84 - 87 (1964) und Abelseth, M.G., "An Attenuated Rabies Vaccine for Domestic Animals Produced in Tissue Culture", Can. Vet. J. 5, 279 - 286 (1964) identifiziert und ist von dem Rabiesvirus abgeleitet, das von Fenje, P., "Propagation of Rabies Virus in Cultures of Hamster Kidney Cells", Can. J. Microbiol., 6, 379-484 (1960) beschrieben ist. Dieser ERA-Stamm des Rabiesvirus ist bei der American Type Culture Collection, Washington D.C., am 29. Oktober 1964 deponiert und wurde dort unter Nr. VR 332 eingetragen.

Wie von Abelseth in Can. Vet. J. 5, 86 beschrieben wurde, erzeugt der ERA-Stamm beim Durchgang durch primäre Schweinenierenzellen dann und wann zytopathogene Änderungen in den Zellen, ohne daß irgendwelche Korrelation mit dem Virustiter besteht.

Nach der vorliegenden Erfindung wird ein neuer Rabiesvirusstamm durch Reihendurchgang des ERA-Stammes durch die PK[tief]2A-stabile Schweinenierenzellenlinie entwickelt. Dieser neue Stamm wird nachstehend als PRI-Stamm identifiziert. Dieser neue PRI-Stamm weist einen signifikant reproduzierbaren zytopathogenen Effekt auf, der für routinemäßige Antikörperermittlungen von Virus und Serum verwendet werden kann.

Diese Eigenschaft des neuen Stammes geht mit dessen Brauchbarkeit für die Herstellung von Vakzinen zur Immunisierung von Tieren gegen virulente Rabies einher.

Die PK[tief]2-A-Schweinenierenzellenlinie wurde im November 1955 von E. Stice von Cutter Laboratories in Gang gesetzt, wobei von der Niere eines erwachsenen Schweines ausgegangen wurde. Die Zellenlinie wurde von den Naval Biological Laboratories, San Diego, California, erhalten.

Es wurde nun gefunden, daß nach etwa 60 bis 70 Reihendurchgängen ein signifikant reproduzierbarer zytopathogener Effekt erhalten wird, der direkt mit dem Titer des Virus korreliert. Es wurde gefunden, daß für befriedigende Ergebnisse 90 oder mehr Reihendurchgänge durch die PK[tief]2-A-Zellenlinie erwünscht sind.

Im allgemeinen werden Durchgänge durch die

PK[tief]2A-Zellenlinie bei einer Temperatur von etwa 37°C durchgeführt. Es können aber Temperaturen von etwa 35 bis 39°C verwendet werden.

Dieser neue Rabiesstamm, der nach Durchführung der gewünschten Anzahl von Reihendurchgängen durch die PK[tief]2A-Zellenlinie erhalten wird, ist sehr immunogen und ist nicht pathogen für Tiere und kann für die Herstellung von Rabiesvakzin verwendet werden, das für die Immunisierung von Tieren, wie Hunden, Katzen, Rindvieh, Pferden und Schweinen, geeignet ist.

Der PRI-Stamm kann einem Reihendurchgang durch primäre Hundenierenzellen, die keine Nebenprodukte enthalten, unterworfen werden, um Vakzine zu erhalten, die auf optimale Weise frei von derartigen Produkten sind. Im allgemeinen werden 10 oder mehr Reihendurchgänge durchgeführt; gewöhnlich beträgt die Anzahl durchgeführter Reihendurchgänge 30 bis 60.

Vakzine, die den PRI-Rabiesvirusstamm enthalten, können mit destilliertem Wasser oder mit einer anderen pharmazeutisch akzeptablen Injektionsflüssigkeit, wie einer physiologischen Salzlösung, verdünnt werden. Außerdem kann ein Stabilisator, wie hydrolisiertes Gelatin oder N-Z-Amin, in einer Menge von etwa 1 Gewichtsteil zu 4 Gewichtsteilen Virus im Vakzin verwendet werden.

Die neuen Vakzine nach der Erfindung können den Tieren durch intramuskulare Injektion verabreicht werden.

Die Titrierung der Vakzine nach der Erfindung in Hunden, Katzen und anderen Tieren zeigt, daß ein konstanter Schutz vor Infektion (challenge) mit virulenten Rabiesvirusstämmen, wie dem Stamm CVS-31 und Straßenkotvirus (Speicheldrüse NCDC #1545), erhalten wird.

Bei sorgfältiger Kontrolle der Tiere konnte in keinem einzigen Falle irgendeine nachfolgende bedeutende Reaktion oder Krankheit infolge des Vakzins selber nachgewiesen werden.

Herstellung der PK[tief]2A-Zellenkultur:

Eine fünf- bis siebentätige Monoschichtkultur der PK[tief]2A-Schweinenierenzellenlinie, die von Naval Biological Laboratories, San Diego, California, stammt, wurde in Flaschen von 1 Liter gewachsen und dann wurde unter Verwendung einer Trypsin-Versene-Lösung gezüchtet. Anschießend wurden die Zellen in einer Menge von 250 000 Zellen pro 1,0 ml LHE (Earles' Balanced Salt Solution und 0,5 % Lactalbuminhydrolysat und 10 % Kalbserum eines erwachsenen Tieres oder eines Fötus in mit je einer Kapselschraube versehenen Rohren mit Abmessungen von 16 x 125 mm ausgesät. Das Kalbserum war zuvor auf Rabies-Antikörper und Inhibitoren geprüft worden.

Reproduktion des PRI-Rabiesvirus:

Eintägige PK[tief]2A-Rohre wurden mit 0,2 ml von Virusverdünnungen inokuliert. Dann wurden die Rohre bei Zimmertemperatur vor Licht geschützt, stehengelassen, ehe sie bei 37°C inkubiert wurden, um Absorption des Virus an den Zellenmonoschichten zu ermöglichen.

Einen Tag nach der Inokulation wurde das Medium in den Rohren durch ein frisches Medium ersetzt, das aus LHE + 8 % Kalbserum bestand und einen pH von 7,4 bis 7,6 aufwies. Danach wurde das Medium in den Rohren jeden zweiten Tag durch ein frisches Medium ersetzt, das aus LHE + 4 % Kalbserum bestand und einen pH-Wert von 7,6 bis 7,8 aufwies.

Vom vierten Tag an bis den siebenten Tag einschließlich wurde der zytopathogene Effekt (CPE) abgelesen. Die Entwicklung des Rabies-CPE wurde zuerst durch das Abtragen von Gruppen von Zellen verschiedener Abmessungen und Distribution abgerundeter Zellen aus der üblichen Zellenmonoschicht nachgewiesen. Mit zunehmender Infektion der Rohre nahm auch der CPE zu. Die Bildung von Löchern und das Abreißen der Zellenschicht wurden deutlicher bei stark infizierten Rohren und wiesen bei genügend langer Beobachtung eine Ausbreitung von 70 bis 90 % über die Zellenschicht auf.

Reihendurchgänge wurden in PK[tief]2A-Zellen durchgeführt und durch Titrierung in Mäusen nach in V-64 und WHO Monograph Nr. 23, "Laboratory Techniques in Rabies", WHO, Genf (1966) beschriebenen Verfahren auf Infektivität geprüft.

Die Daten, die in der nachstehenden Tabelle A erwähnt sind, dienen zum Vergleich des Titers von Rabiesvakzin, ausgehend von der Infektivität in Mäusen (MLD[tief]50), mit dem Titer von Rabiesvakzin in PK[tief]2A-Gewebekulturen (TCID[tief]50), ausgehend von zytopathogenen Effekten des PRI-Virus.

Tabelle A

Vergleich von Titrierung von Rabiesvirusvakzin in Mäusen und Gewebekultur

Titer/ml(log[tief]10)

Durchgang oder Charge MLD[tief]50/ml TCID[tief]50/ml

17PK[tief]2A 10[hoch]5,7 10[hoch]6,5

43PK[tief]2A 10[hoch]5,2 10[hoch]5,5

52PK[tief]2A 10[hoch]6,7 10[hoch]6,8

78PK[tief]2A 10[hoch]7,0 ---

82PK[tief]2A 10[hoch]7,5 ---

86PK[tief]2A 10[hoch]7,0 ---

88PK[tief]2A 10[hoch]7,3 ---

88PK[tief]2A PEK1 10[hoch]7,3 10[hoch]7,0

148PK[tief]2A 10[hoch]5,7 10[hoch]6,5

149PK[tief]2A --- 10[hoch]6,2

96PK[tief]2A DK[tief]6 10[hoch]6,1 10[hoch]7,0

" DK[tief]17 10[hoch]5,9 10[hoch]7,0

" DK[tief]23 10[hoch]5,4 10[hoch]7,0

" DK[tief]33 --- 10[hoch]6,0

" DK[tief]36 --- 10[hoch]7,0

" DK[tief]40 10[hoch]5,1 10[hoch]6,3

" DK[tief]46 10[hoch]5,3 10[hoch]6,2

" DK[tief]48 10[hoch]4,2 10[hoch]4,3 (FD)

" DK[tief]56 10[hoch]4,9 10[hoch]6,2

" DK[tief]49 --- 10[hoch]6,5 (naß) Charge 12 Durchg. 101

" " 10[hoch]5,5 10[hoch]5,9 (trocken)

" " --- 10[hoch]6,0 (naß) Charge 13 Durchg. 102

" " 10[hoch]5,0 10[hoch]5,9 (trocken)

" " --- 10[hoch]6,3 (naß) Charge 14 Durchg. 103

" " 10[hoch]5,5 10[hoch]5,1 (trocken)

Wie aus der Tabelle A ersichtlich ist, wird bei der Anwendung des PK[tief]2A-Zellensystems ein deutliches Verfahren erhalten, durch das bestimmt werden kann, wenn eine genügende Potenz erreicht ist, dadurch, daß der zytopathogene Effekt auf die Gewebekultur beobachtet wird, wobei Titrierung in Mäusen nicht erforderlich ist.

Serumneutralisationsversuche:

Serumverdünnungen von NCDC Burroserum mit einem Serumneutralisationstiter von 1-8000 zu 32 MLD[tief]50 des CVS-Stammes des Rabiesvirus wurden mit gleichen Volumina an PRI-Rabiesvirus infiziert (challenged), die etwa 100 bis 500 TCID[tief]50 pro 0,25 ml enthielten.

Wie aus den Daten der nachstehenden Tabelle B hervorgeht, wird der PRI-Virusstamm durch Neutralisation des zytopathogenen Effekts durch NCDC spezifisches immunes Rabies-Antiserum und Neutralisation der Sterblichkeit bei den Mäusen als Rabies identifiziert.

Tabelle B

Neutralisation von PRI Rabiesvirusvakzin durch spezifisches Rabies-Antiserum

Virus Titer/ml (Log[tief]10)

PK[tief]2A DK[tief]49 10[hoch]6,5 TCID[tief]50

" (neutralisiert) < 10[hoch]1 TCID[tief]50

PK[tief]2A DK[tief]49 10[hoch]6,0 MLD[tief]50

" < 10[hoch]1 MLD[tief]50

PK[tief]2A DK[tief]49 - Charge 8, Ernte 9

Spezifisches Antiserum: NCDC Burro Serum mit einem Serumneutralisationstiter von 1-8000 zu 32 MLD[tief]50 von CVS-Virus.

Herstellung des Vakzins:

Gleiche Mengen an PRI-Rabiesvirus mit einem Titer von etwa 10[hoch]4 TCID[tief]50 pro ml wurden mit einem Stabilisator gemischt, wodurch eine Endkonzentration von 80 % Virus und 20 % Stabilisator erhalten wurde. Bernsteinvakzinflaschen von 2 ml wurden dann bis zu 1,2 ml gefüllt und anschließend einer Gefriertrocknungsbehandlung unterworfen.

Prüfung der Wirksamkeit bei Hunden:

Anfällige Hunde wurden mit Vakzinen vakziniert, die mit dem PRI-Rabiesvirusstamm hergestellt sind, und wurden dann durch interzerebrale Injektion mit einem Rabies-Fixe-Virus (CVS) infiziert (challenged).

Das Virus-Fixe wurde durch interzerebrale Inokulation von CVS-31 in einen kleinen Hund hergestellt. Sieben Tage nach der Inokulation und nachdem die Rabiessymptome festgestellt worden waren, wurde der Hund abgetötet. Anschließend wurde das Gehirn entfernt, gemahlen als eine 20%-ige Suspension in einer sterilen Salzlösung in Mengen von 2,0 ml verteilt, und bei -60°C stehengelassen.

Wie aus der nachstehenden Tabelle C hervorgeht, stellt sich bei Titrierung der PRI-Vakzine in Hunden heraus, daß diese Vakzine konstant vor dieser starken Infektion (challenge) schützen. Weiter ist aus dieser Tabelle ersichtlich, daß eine gute Korrelation zwischen der Antikörperreaktion und der Schutzwirkung besteht.

Tabelle C

Übersicht-Effektivität in Hunden Rabiesvirusvakzin gegen intrazerebrale Infektion mit Virus-Fixe (CVS)

Tabelle C (2)

(*) Messung von Antikörpern durch Serumneutralisation in Mäusen.

Eine andere Gruppe infektionsanfälliger Hunde wurde mit Verdünnungen eines gefriergetrockneten Vakzins (Durchgang PK[tief]2A96, DK[tief]48) vakziniert.

27 Tage nach der Vakzination wurden die vakzinierten Hunde und die Kontrolltiere mit einem Straßenkotvirus CNCPC 1545 mit einem Titer von 10[hoch]5,0MLD[tief]50/0,03 ml durch Inokulation in die beiden Kaumuskel infiziert (challenged).

Wie aus den Daten der nachstehenden Tabelle D hervorgeht, wird mit diesem Vakzin ein guter Schutz vor dieser Infektion (challenge) erhalten.

Tabelle D

Übersicht-Effektivität in Hunden-Rabiesvirusvakzin nach Infektion des Kaumuskels mit Virus-Fixe (CVS).

Rindvieh:

Die Wirksamkeit eines gefriergetrockneten PRI-Vakzins wurde in Rindvieh sechs Monate nach Vakzination durch intramuskulare Infektion (challenge) mit einem Straßenkotvirus NLDC #1545, das einem Reihendurchgang durch eine Speicheldrüse eines Hundes unterworfen worden war, geprüft.

Wie aus den Daten der nachstehenden Tabelle E hervorgeht, wurde mit dem verwendeten PRI-Vakzin ein guter Schutz bei einer Dosis von etwa 100 TCID[tief]50 erhalten.

Tabelle E

Effektivität von Rabiesvirusvakzin in Vieh gegen Infektion mit Straßenkotvirus *

(*) 6 Monate nach Vakzination infiziert

(**) Infiziert mit 10[hoch]6,06MLD[tief]50

(***) Getötet - gebrochenes Bein, vor der Infektion durch Rabies gestorben.

Vakz. = PK[tief]2A149.

Katzen:

Die Wirksamkeit des PRI-Rabiesvakzin in Katzen geht aus den serologischen Ergebnissen hervor, die in der nachstehenden Tabelle F erwähnt sind.

Tabelle F

Serologische Effektivität von PRI-Rabiesvirusvakzin in Katzen.

Tabelle F (2)

Vakz. = ERA + 96 Durchg. in PK[tief]2A + 23 Durchg. in DK

* 36 Tage nach Vakz.

** Infekt. nicht durchgeführt.

Sicherheit:

Um die Sicherheit des PRI-Vakzins festzustellen, wurden Hunde und Katzen vakziniert und auf Rabies und andere ungünstige Effekte geprüft. Während einer Periode von zwei Jahren wurden 914 Hunde und mehr als 100 Katzen vakziniert. Bei sorgfältiger Kontrolle konnten keine nachfolgenden Reaktionen oder Krankheit nachgewiesen werden.

Ähnliche Versuche mit Schweinen und anderen Vieh ergaben, daß die PRI-Rabiesvirusvakzine nach der Erfindung sicher sind und wirksame Vakzine zur Immunisierung von Tieren gegen Rabies bilden.

Claims (10)

1. Verfahren zur Herstellung eines neuen lebenden Rabiesvirusstammes, der einen signifikant reproduzierbaren zytopathogenen Effekt aufweist, der mit dem Titer des Virus im Zusammenhang steht, dadurch gekennzeichnet, daß der ERA-Stamm des Rabiesvirus einer genügenden Anzahl von Gewebekulturdurchgängen durch PK[tief]2A-Zellen unterworfen wird, um diesen neuen Stamm zu entwickeln.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Durchgang der PK[tief]2A-Zellen mindestens 60 Male wiederholt wird.

3. Verfahren zur Herstellung eines neuen lebenden Rabiesvirus, das einen signifikant reproduzierbaren zytopathogenen Effekt in PK[tief]2A-Zellen aufweist, der direkt mit dem Titer des Virus im Zusammenhang steht, wobei dieser Rabiesvirus für die Immunisierung von Tieren gegen Rabies geeignet ist, dadurch gekennzeichnet, daß der ERA-Stamm des Rabiesvirus mindestens 60 Gewebekulturdurchgängen durch PK[tief]2A-Zellen unterworfen und dann der erhaltene Stamm an Durchgang durch Hundenierenzellen unterworfen wird.

4. Verfahren zur Herstellung eines neuen lebenden Rabiesvirus, das einen signifikant reproduzierbaren zytopathogenen Effekt in PK[tief]2A-Zellen aufweist, der mit dem Virustiter im Zusammenhang steht, dadurch gekennzeichnet, daß Zellen der PK[tief]2A-Zellenlinie mit lebendem Rabiesvirus des ERA-Stammes inokuliert wird, das Virus und die Zellen genügend lang in einem Gewebekulturnährmedium inkubiert werden, um das Wachstum und die Vermehrung des Virus zu gestatten, das Virus geerntet wird und das Inkubieren und das Ernten des Virus in mindestens 60 aufeinanderfolgenden Kulturen von PK[tief]2A-Zellen mit Intervallen von etwa 4 bis 7 Tagen wiederholt werden.

5. Verfahren zur Herstellung eines neuen Rabiesvirus, das einen signifikant reproduzierbaren zytopathogenen Effekt in PK[tief]2A-Zellen aufweist, der mit dem Titer des Virus im Zusammenhang steht, wobei das Virus sich zur Immunisierung von Tieren gegen Rabies eignet, dadurch gekennzeichnet, daß Zellen einer PK[tief]2A-Zellenlinie mit lebendem Rabiesvirus des ERA-Stammes inokuliert werden, die Zellen und das Virus in einem Gewebekulturmedium bei einer Temperatur von etwa 32 bis 39°C während einer genügend langen Zeit inkubiert werden, um das Wachstum und die Vermehrung des Virus zu gestatten, das Virus geerntet wird, das Inkubieren und das Ernten des Virus in mindestens 60 aufeinanderfolgenden Kulturen mit Intervallen von etwa 4 bis 7 Tagen wiederholt werden, Hundenierenzellen mit dem Virus inokuliert werden, das Virus und die Zellen in einem Gewebekulturmedium bei einer Temperatur von etwa 32 - 39°C während einer genügend langen Zeit inkubiert werden, um das Wachstum und die Vermehrung des Virus zu gestatten, das Virus aus den Hundenierenzellen geerntet wird, und dieses Inkubieren und dieses Ernten des Virus während mindestens fünf aufeinanderfolgender Kulturen der genannten Hundenierenzellen wiederholt werden.

6. Lebendes Rabiesvakzin, das sich zur Immunisierung von Tieren gegen Rabies eignet und das einen signifikant reproduzierbaren zytopathogenen Effekt auf PK[tief]2A-Zellen aufweist, der mit dem Titer des Virus im Zusammenhang steht, in einer injizierbaren pharmazeutisch akzeptablen Flüssigkeit.

7. Vakzin nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß darin ein Stabilisator vorhanden ist.

8. Neues lebendes Rabiesvakzin, dadurch gekennzeichnet, daß dieses Vakzin das lebende Rabiesvirus, das durch das Verfahren nach Anspruch 5 hergestellt ist, in einer injizierbaren pharmazeutisch akzeptablen Flüssigkeit enthält.

9. Neues lebendes Rabiesvakzin nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß darin ein Stabilisator vorhanden ist.

10. Ampulle mit einem durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 erhaltenen Vakzin.