-
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der antiviralen
Therapie. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die
Behandlung, nachdem das Rabies-Virus (Tollwut-Virus) auf
einen neuen Wirtsorganismus übertragen worden ist.
-
Rabies (Tollwut) bleibt in der Welt der Entwicklungsländer
eine bedeutende Krankheit des Menschen. In Indien zum
Beispiel werden etwa 500 000 Menschen (Steele, H.H., 1988,
"Rabies in the Americas and Remarks on Global Aspects", Rev.
Infect. Dis. 10 (Suppl. 4), 585) gegen Rabies behandelt und es
wird von etwa 40 000 bis 50 000 Menschen berichtet, die pro
Jahr an Rabies sterben (Baer, G.M., 1988, "Research Towards
Rabies Prevention: Overview", Rev. Infect. Dis. 10 (Suppl.
4), 576).
-
Eine wirksame Behandlung von Rabies nach einer Exposition,
wie sie von der WHO (Weltgesundheitsorganisation) empfohlen
wird, umfaßt die umgehende Verwendung von Anti-Rabies
Immunglobulinen des Menschen oder des Pferdes (HRIG bzw. ERIG)
zusammen mit der Verabreichung von Vakzine. Tierexperimente
haben gezeigt, daß die Behandlung mit Vakzine allein im
Anschluß an die Exposition eine lethale Rabies-Virus-Infektion
nicht verhindert (Koprowski, H. und J. Van Der Scheer, 1950,
"Use of Hyperimmune Anti-rabies Serum Concentrates in
Experimental Rabies", Am. J. Med. 8 412; Sikes, R.K., W.F.
Clearly, H. Koprowski, T.J. Wiktor, und M. Kaplan, 1971,
"Effective Protection of Monkeys Against Death by Street Virus by
Post-Exposure Administration of Tissue Culture Rabies
Vaccine, Bull. WHO 45, 1). Anti-Rabies-Antikörper scheinen ein
wesentlicher Bestandteil für die Behandlung von Rabies zu sein.
Die genaue Rolle dieser Antikörper bei der Behandlung nach
der Exposition ist jedoch nicht klar.
-
Mögliche Mechanismen der Wirkungsweise der das Rabies-Virus
neutralisierenden Antikörper (VNA), einzig gerichtet gegen
das Glykoprotein (G Protein) des Rabies-Virus, umfassen die
Neutralisierung von extrazellulärem Rabies-Virus, die
Komplement-vermittelte Lyse von Rabies-Virus infizierten Zellen
und Antikörper abhängige zelluläre Toxizität (Davis, D.R. und
H. Metzger, 1983, "Structural Basis of Antibody Function",
Ann. Rev. Immunol. 1, 87). Neben diesen Effektor-Funktionen
der VNA sind auch andere Antikörper einschließlich solcher,
die gegen das innere Nukleokapsid-Protein (RNP) gerichtet
sind, in der Lage, die Immunantwort der T Lymphocyten zu
regulieren (Celis, E., Wiktor, T.J., Dietzschold, B. und
Koprowski, H., 1985, "Amplification of Rabies Virus-Induced
Stimulation of Human T-cell Lines ans Clones by
Antigen-Specific Antibody", J. Virol. 56, 426 - 433). Kürzlich ist
gezeigt worden, daß Antikörper, die das G Protein oder RNP
Proteine erkennen, bei der Potenzierung der Antigen induzierten
proliferativen Antwort und der Produktion von
Gamma-Interferon (IFN-γ) durch Rabies-Virus spezifische T Lymphocyten eine
bedeutsame Rolle spielen. Zudem wurde gezeigt, daß IFN-γ beim
Schutz vor lethaler Rabies-Virus-Infektion eine Rolle spielt
(Dietzschold, B., M. Gore, H. Ertl, E. Celis, J. Otvos, Jr.
und H. Koprowski, 1989, "Analysis of Protective Immune
Mechanisms Induced by Rabies Nucleoprotein", in: Genetics and
Pathogenicity of Negative Strand Viruses, B.W.J. Mahy und D.
Kalakowsky, Hrsg., Elsevier, New York, 295).
-
Auf Grund des potentiellen Risikos von allergischen
Reaktionen in Verbindung mit der Verwendung von ERIG wird
idealerweise nur HRIG für die Behandlung von Menschen nach der
Exposition empfohlen. Da jedoch HRIG sehr teuer ist, und da
menschliche Rabies-Expositionen sehr häufig sind, sind oft
nicht ausreichende Mengen an HRIG verfügbar, um die gesamte
empfohlene Behandlung nach der Exposition einzuleiten. Der
beschränkte Zugang zu HRIG ist wahrscheinlich ein
wesentlicher Faktor, der dazu beiträgt, daß die Behandlungen nach der
Exposition in zunehmendem Male scheitern (Anonym
(redaktionell), 1988, "Rabies Vaccine Failures", Lancet, 23. April,
912). Außerdem müssen die Aspekte der Sicherheit der
menschlichen Immunserum-Behandlung berücksichtigt werden, und zwar
auf Grund des potentiellen Risikos der Kontamination mit dem
Hepatitis B Virus und dem menschlichen Immunodefizienz-Virus
(HIV). Aus diesen Gründen besteht für die Wissenschaft der
Bedarf an einem sicheren und ohne weiteres erhältlichen
Ersatzprodukt für HRIG, das zusammen mit der Vakzine für die
Behandlung nach der Exposition mit Rabies verwendet werden
kann.
-
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine
Zusammensetzung für die Behandlung von Rabies-Infektionen nach der
Exposition zur Verfügung zu stellen.
-
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine
Zusammensetzung zur Verfügung zu stellen, die ein Gemisch von
monoklonalen Antikörpern enthält.
-
Diese und andere Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden
von einer oder mehreren der unten beschriebenen
Ausführungsformen gelöst. In einer Ausführungsform wird eine
Zusammensetzung zur Verfügung gestellt, die ein Gemisch von
monoklonalen Antikörpern des Isotyps IgG enthält, wobei wenigstens
zwei der Antikörper mit zwei verschiedenen Epitopen auf dem G
Protein des Tollwutvirus immunoreaktiv sind, wobei wenigstens
einer der Antikörper mit dem N Protein des Tollwutvirus
immunoreaktiv
ist, wobei wenigstens einer der Antikörper mit
allen Straßen- (street) und stabilen (fixed) Tollwutviren
immunoreaktiv ist, wobei wenigstens einer der Antikörper mit dem
Duvenhage-Virus immunoreaktiv ist, und wobei wenigstens einer
der Antikörper mit dem Mokola-Virus immunoreaktiv ist.
-
Die vorliegende Erfindung stellt dem Stand der Technik für
die Behandlung von Rabies-Infektionen nach der Exposition ein
sicheres und verläßliches Ersatzprodukt für HRIG zur
Verfügung.
-
Es ist die Entdeckung der vorliegenden Erfindung, daß ein
Cocktail von monoklonalen Antikörpern Säugetiere Schutz
bieten kann, die mit dem Rabies-Virus infiziert worden sind. Der
Cocktail kann monoklonale Antikörper des Menschen, der Maus
oder von anderen Spezies enthalten. Auf Grund der im
Vergleich zu gesamten hyperimmunen Antiseren im allgemeinen
höheren spezifischen Aktivität der Gemische der monoklonalen
Antikörper muß eine geringere Menge des Antikörper-Proteins
verabreicht werden. Das hat günstige Auswirkungen auf die
lokale Wundbehandlung, wenn nur kleine Volumina an der Stelle
des Bisses inokuliert werden können. Zusätzlich ist das
Risiko von anaphylaktischen Reaktionen und Hypersensibilisierung
im Vergleich zu dem gesamten heterologen Hyperimmun-Antiserum
geringer, da die Mengen, die verabreicht werden müssen, klein
sind.
-
Der Cocktail oder das Gemisch gemäß der vorliegenden
Erfindung besteht aus monoklonalen Antikörpern. Es spielt keine
wesentliche Rolle, von welcher Spezies die Antikörper
stammen, auch wenn die Verwendung homologer Antikörper das Risiko
eines anaphylaktischen Schocks und der Hypersensibilisierung
verringert. Verfahren zur Herstellung von monoklonalen
Antikörpern sind im Stand der Technik gut bekannt. Siehe z.B.
Wiktor et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 3938 - 3942
(1978). Bevorzugte Antikörper für die Verwendung gemäß der
vorliegenden Erfindung sind Antikörper der Maus.
-
Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung verwendet
Antikörper des Isotyps IgG. IgM Antikörper sind wohl nicht
geeignet. Verfahren zur Bestimmung des Isotyps eines
Antikörpers sind im Stand der Technik gut bekannt. Zur Bestimmung
des Isotyps sind zum Beispiel kommerzielle Antikörper
erhältlich. Die immunologische Spezifität der Antikörper der
vorliegenden Erfindung ist, in Bezug auf die Anzahl der
Virustypen, mit denen sie reagieren, vorzugsweise so breit wie
möglich. Es ist wünschenswert, daß wenigstens einer der
Antikörper mit dem Rabies verwandten Duvenhage-Virus immunoreaktiv
ist, und daß wenigstens einer der Antikörper mit dem Rabies
verwandten Mokola-Virus immunoreaktiv ist. Es ist außerdem
wünschenswert, daß ein breiter Bereich von Straßen- und
stabilen Rabies-Viren in dem Immunoreaktivitätsspektrum der
Antikörper des Cocktails vertreten ist. Vorzugsweise sind alle
Straßen- und stabilen Rabies-Viren vertreten. Stabile Viren
sind durch serielle Passagen in Labortieren modifiziert.
Straßenviren sind Wildtyp-Viren.
-
Die Epitop-Spezifität der Antikörper des Gemisches ist
wünschenswerterweise so verschieden (divers) wie möglich.
Wünschenswerterweise sind einige Antikörper immunorektiv mit dem
G Protein (Glykoprotein) des Tollwutvirus, während einige
Antikörper mit dem N Protein (Nukleoprotein) des Tollwutvirus
immunoreaktiv sind. Vorzugsweise werden mindestens zwei
verschiedene Anti-G Antikörper verwendet, wobei jeder der beiden
gegen ein anderes Epitop des G Proteins gerichtet ist. In
einer bevorzugten Ausführungsform sind jeweils die antigenen
Stellen I, IIc und IIIb des G Proteins in der Immunspezifität
des Gemisches vertreten. Spezielle Antikörper, die für die
Reaktion mit diesen Epitop-Stellen verwendet werden können,
sind MAb 509-6 (Flamand et al., J. Gen. Virol. 48, 105
(1980)), MAb 1112-1 (Dietzschold, Review of Infections
Disease, Bd. 10, 785ff (1988)) und MAb 523-11 (Flamand et al., J.
Gen. Virol. 48, 105 (1980)). Wenn mehr als ein Anti-N
Antikörper verwendet wird, dann sollten auch die N Protein
Epitope, mit denen sie reagieren, divers sein. Die
Epitop-Stellen
II und III werden zum Beispiel durch MAb 801-1 und MAb
502-2 (LaFon et al., J. Gen. Virol. 66, 2125 (1985) und
Flamand et al., J. Gen. Virol. 48, 97 (1980)) vertreten.
-
Die schützende Dosis des Gemisches aus Antikörpern wird im
allgemeinen auf einmal verabreicht. Eine Wiederholung ist
nicht erforderlich. Die Dosis ist im allgemeinen zwischen
etwa 50 und etwa 200 I.E./kg Körpergewicht. Es wird angenommen,
dar höheren Dosen erwünscht sind, wenn der Zeitraum zwischen
Exposition und Therapie grob ist. Wenn die Therapie innerhalb
einiger Stunden erfolgt, können geringere Dosen verwendet
werden. Wenn jedoch einige Tage seit der Exposition vergangen
sind, sind höhere Dosen angezeigt.
-
Es ist wie auch bei den therapeutischen Behandlungen, die
ERIG oder HRIG verwenden, in den meisten Fällen erwünscht,
eine Rabies-Vakzine mit dem Gemisch der Antikörper der
vorliegenden Erfindung zu verabreichen. Jede herkömmliche
Rabies-Vakzine kann verwendet werden, so wie es dem Stand der
Technik entspricht. Im allgemeinen sind dies Rabies-Viren,
die abgeschwächt worden sind, obgleich auch Rabies Proteine,
erhalten mittels genetischer Techniken, oder synthetische,
immunogene Peptide verwendet werden können.
-
Die folgenden Beispiele stellen lediglich Erläuterungen
besonderer Ausführungsformen dar. Sie sollen des Umfang der
oben beschriebenen Erfindung und der dazugehörenden
Patentansprüche nicht einschränken.
Beispiel 1
-
Dieses Beispiel beschreibt die Eigenschaften der
Antikörper, die aus dem schützenden Cocktail der vorliegenden
Erfindung ausgewählt worden sind.
-
Fünf immune MAbs wurden ausgewählt aus einer Liste von 76
MAbs, die für das G Protein und RNP spezifisch sind (Tabelle
1). Die Auswahlkriterien waren Isotyp, Antigen- und Epitop-
Spezifität, Virusstamm-Spezifität, Affinität und Virus
neutralisierende Aktivität. Wie in Tabelle 1 gezeigt wird, sind
drei der Antikörper spezifisch für das G Protein: die anderen
beiden nicht neutralisierenden Antikörper sind spezifisch für
RNP. Jeder der drei für das G Protein spezifischen Antikörper
erkennt eine andere antigene Stelle auf dem G Protein; das
Epitop, das von MAb 509-6 erkannt wird, liegt innerhalb der
Stelle I, das Epitop für MAb 1112-1 liegt innerhalb der
Stelle IIc, und das Epitop für MAb 523-11 liegt innerhalb der
Stelle IIIb (Dietzschold, B., Rupprecht, C.E., Tollis, M.,
Lafon, M., Mattei, J., Wiktor, T.J. und Koprowski, H., 1988,
"Antigenic diversity of the glycoprotein and nucleoprotein of
rabies and rabies-related viruses: Implications for
Epidemiology and Control of Rabies", Review of Infectious Diseases,
Bd. 10 (Suppl. 4), 5785 - 5798). Alle drei für das G Protein
spezifische MAbs sind in der Lage, alle stabilen
Rabies-Virus-Stämme und die meisten der Feld-Rabies-Virus-Isolate in
vitro zu neutralisieren (Dietzschold, B., Rupprecht, C.E.,
Tollis, M., Lafon, M., Mattei, J., Wiktor, T.J. und
Koprowski, H., 1988, "Antigenic diversity of the glycoprotein and
nucleoprotein of rabies and rabies-related viruses:
Implications for Epidemiology and Control of Rabies", Review of
Infectious Diseases, Bd. 10 (Suppl. 4), 5785 - 5798). Außerdem
neutralisierte MAb 1112-1 die Rabies verwandten Stämme
Duvenhage 1-6, und MAb 523-11 neutralisierte das Mokola-Virus
(Dietzschold, B., Rupprecht, C.E., Tollis, M., Lafon, M.,
Mattei, J., Wiktor, T.J. und Koprowski, H., 1988, "Antigenic
diversity of the glycoprotein and nucleoprotein of rabies and
rabies-related viruses: Implications for Epidemiology and
Control of Rabies", Review of Infectious Diseases, Bd. 10
(Suppl. 4), 5785 - 5798).
-
Es kann Tabelle 1 entnommen werden, daß die drei für das G
Protein spezifischen MAbs in ihrer Virus neutralisierenden
Aktivität deutlich verschieden sind. Die
Virus-Neutralisierung wurde mittels einer Modifikation des schnellen
fluoreszierenden Fokus inhibierenden Tests, wie kürzlich
beschrieben,
ermittelt (Wiktor, T.J. et al., 1984, "Antigenic
Analysis of Rabies and Mokola Virus from Zimbabwe Using Monoclonal
Antibodies", Dev. Biol. Stand. 57:199). Eine Reduzierung des
viralen Titers von mehr als 100 infektiösen Einheiten wurde
als positive Virus-Neutralisierung angesehen. Während die
spezifischen Virus neutralisierenden Aktivitäten von MAb 509-
6 und 523-11 sehr hoch sind (1667 I.E./mg bzw. 8242 I.E./mg),
ist die Virus neutralisierende Aktivität von MAb 1112-1 in
vitro niedrig (62 I.E./ug). Die spezifische Virus
neutralisierende Aktivität aller drei MAbs ist jedoch mit Sicherheit
höher als die von HRIG, die nämlich nur 1,13 I.E./mg Protein
beträgt.
-
Die für RNP spezifischen MAbs 802-1 und 502-2 erkennen
Epitope, die innerhalb der Stellen II bzw. III des N Proteins
liegen (Dietzschold, B. et al., 1988, "Antigenic Diversity of
the Glycoprotein and Nucleoprotein of Rabies and
Rabies-Related Viruses: Implications for Epidemiology and Control of
Rabies", Review of Infectious Disease, Bd. 10 (Suppl. 4), 5785
- 5798). MAb 502-2 reagiert mit allen bekannten Rabies und
Rabies verwandten Virusstämmen (Dietzschold, B. et al., 1988,
"Antigenic Diversity of the Glycoprotein and Nucleoprotein of
Rabies and Rabies-Related Viruses: Implications for
Epidemiology and Control of Rabies", Review of Infectious Disease,
Bd. 10 (Suppl. 4), 5785 - 5798).
-
Alle fünf MAbs wurden in einem MAb Cocktail verwendet, der
ein Gemisch aus 112,5 I.E./ml MAb 509-6, 10 I.E./ml MAb 1112-
1, 800 I.E./ml MAb 523-11, 0,04 mg/ml MAb 801-1 und 0,6 mg/ml
MAb 502-2 darstellt. Die spezifische Virus neutralisierende
Aktivität des Cocktails ist 1376 I.E./mg Protein.
Beispiel 2
-
Dieses Beispiel zeigt die prophylaktische Wirksamkeit der
einzelnen drei MAbs, die gegen das G Protein des Rabies-Virus
gerichtet sind. Darüber hinaus wird die Verwicklung des Fc
Teils der Antikörper in die prophylaktische Antwort
dargestellt.
-
Um die prophylaktische Wirksamkeit zu bestimmen, wurden
verschiedene Verdünnungen der einzelnen MAbs intramuskulär
(i.m.) in ICR Mäuse inokuliert. 24 Stunden später wurden die
Tiere intracerebral mit einer lethalen Dosis (5 x 10, der LD&sub5;&sub0;
für die Maus) des CVS 11 Stamms des Rabies-Virus
herausgefordert. Während die Vorbehandlung der Mäuse mit den für RNP
spezifischen Antikörpern keine Auswirkungen auf die
Überlebenschance (Daten nicht gezeigt) hatte, verhinderte die
Verabreichung der für das G Protein spezifischen Antikörper 24
Stunden vor der Herausforderung die lethale
Rabies-Virus-Infektion wirksam (Tabelle 2). Zwei I.E. von MAb 509-6 und 2,36
I.E. von MAb 523-11 waren nötig, um 50% der Mäuse zu
schützen. Obgleich die Virus neutralisierende Aktivität von MAb
1112-1 in vitro niedrig war, war die schützende Aktivität in
vivo außerordentlich hoch. Nur 0,03 I.E. dieses MAb genügten,
um eine lethale Rabies-Virus-Infektion in 50% der Tiere zu
verhindern. Die Erklärung für die Diskrepanz zwischen den
Aktivitäten von MAb 1112-1 in vitro und in vivo ist nicht klar.
Es ist wahrscheinlich, daß der Mechanismus der MAbs in vivo
im Gegensatz zur Neutralisierung in vitro sehr komplex ist
und wahrscheinlich nicht nur auf der Neutralisierung von
extrazellulärem Virus beruht.
-
Um zu zeigen, daß die konstante Region des Antikörpers, der
das Fc Fragment enthält, eine wichtige Rolle beim in vivo
Schutz gegen Rabies spielt, wurden Mäuse mit F(ab')&sub2;
Fragmenten (denen Fc fehlt) von MAb 523-11 behandelt. Tabelle 2
zeigt, daß die ED&sub5;&sub0; von F(ab')&sub2; Fragmenten 34,0 I.E. beträgt,
während die ED&sub5;&sub0; des intakten MAb 523-11 2,36 ist. Der gesamte
Antikörper ist also wesentlich wirksamer als die F(ab')&sub2;
Fragmente allein.
Beispiel 3
-
Dieses Beispiel zeigt, daß der Zeitraum, der zwischen der
Behandlung mit MAb und der Herausforderung durch das Virus
liegt einen starken Einfluß auf die schützende Aktivität des
Antikörpers hat.
-
Mäuse wurden intramuskulär mit 5 x 10&sup6; MIC LD&sub5;&sub0; (lethale Dosis
für 50% der Mäuse) von CVS 24 [erhalten aus der Sammlung des
Wistar-Instituts] herausgefordert. Zu verschiedenen Zeiten
vor und nach der Herausforderung mit dem Virus wurden
verschiedene Dosen des Cocktails mit den monoklonalen
Antikörpern verabreicht.
-
In Tabelle 3 wird gezeigt, daß die ED&sub5;&sub0; des MAb Cocktails 0,8
beträgt, wenn er 24 Stunden vor der Herausforderung
verabreicht worden ist, daß sie aber auf 2,36 ansteigt, wenn die
MAbs 2 Stunden vor der Herausforderung verabreicht werden.
Wenn der Cocktail der Antikörper 2 Stunden nach der
Herausforderung injiziert wird, sind sogar 42,8 I.E. nötig, um 50%
der Mäuse zu schützen.
Beispiel 4
-
Dieses Beispiel belegt, daß die Stelle, an der die virale
Herausforderung verabreicht wird, einen dramatischen Effekt
auf die gemessene Wirksamkeit des Cocktails aus monoklonalen
Antikörpern hat.
-
Zwei Gruppen von herausgeforderten Mäusen wurden mit
Verdünnungen des MAb Cocktails behandelt und 24 Stunden später
intracerebral (i.c.) oder über den Fußballen (footpad) (i.f.)
mit einer lethalen Dosis (5 x 10&sup4; MIC LD&sub5;&sub0;) Rabies-Virus (CVS
11) herausgefordert. Selbst wenn 200 I.E. 24 Stunden vor der
Herausforderung verabreicht wurden, überlebte nur eine von
sieben Mäusen eine i.c. Herausforderung (siehe Tabelle 4).
Die Unwirksamkeit der MAb Behandlung gegen eine i.c.
Herausforderung ist verwunderlich, da Mäuse, die 200 I.E. MAb
erhielten, 24 Stunden nach der Injektion einen Titer von
zirkulierendem VNA von 3992 (GMT) hatten, dennoch aber nicht
geschützt wurden. Im Gegensatz dazu hatten die meisten Mäuse,
die mit durch Beta-Propiolakton (BPL) inaktiviertem Rabies-
Virus immunisiert worden waren, einen Titer von
zirkulierendem VNA von nur 767 (GMT) und überlebten die i.c.
Herausforderung (Tabelle 4).
-
Wenn die herausfordernde Infektion in den Fußballen gegeben
wurde (Daten nicht dargestellt), waren 4 I.E. MAb Cocktail,
verabreicht 24 Stunden vor der Herausforderung, nötig, um 50%
der Mäuse gegen eine i.f. Herausforderung zu schützen. Die
ED&sub5;&sub0; von MAbs gegen eine i.f. Herausforderung ist also fünfmal
höher als die ED&sub5;&sub0; derselben MAbs gegen eine i.m.
Herausforderung (siehe Tabelle 3).
Beispiel 5
-
Dieses Beispiel zeigt, daß das Gemisch der monoklonalen
Antikörper der Maus gemäß der vorliegenden Erfindung wirksam
ist, um Mortalität zu verhindern, selbst wenn es erst nach
der Exposition mit Rabies-Virus verabreicht wird.
-
Da die meisten pathogenen Rabies-Virus-Stämme in Mäusen eine
sehr kurze Inkubationszeit haben (klinische Anzeichen treten
bereits 5 bis 6 Tage nach der Infektion auf), ist es
schwierig, an Mäusen Versuche zu einer Behandlung nach der
Exposition vorzunehmen. Da die Inkubationszeit bei Hamstern
wesentlich länger ist (10 bis 14 Tage), stellen diese Tiere ein
besseres Tiermodell für Versuche zu einer Behandlung nach der
Exposition dar.
-
Um die Wirksamkeit von MAbs in einer Situation nach der
Exposition zu ermitteln, wurden Gruppen von je 5 Hamstern i.m.
mit einem Rabies-Virus des Straßentyps (NYC Stamm)
inokuliert. Zwei, drei und 36 Stunden nach der Infektion wurden 5
Hamster i.m. mit 1550 oder 150 I.E./kg des MAb Cocktails
behandelt. Tabelle 5 zeigt, daß alle Hamster, die den
Antikörper zwei oder drei Stunden nach der Herausforderung
erhielten, überlebten, während 80% der unbehandelten Kontrolltiere
der Rabies-Infektion erlagen. Die Behandlung mit dem MAb
Cocktail 36 Stunden nach der Infektion führte zu einer
Überlebensrate
von 80%.
Angewandte experimentelle Verfahren
-
Virus-Stämme. Die stabilen Stämme CVS 11, ERA und PM des
Rabies-Virus und auch die Isolate von Rabies-Virus des
Straßentyps und die Rabies verwandten Duvenhage-6 (DUV-6) und
Mokola (MOK) Viren wurden in BHK-21 Monolayer-Zellkulturen
vermehrt, wie es kürzlich beschrieben worden ist (Wiktor, T.J.
1977, "Induction and Biological Properties of Defective
Interfering Particles of Rabies Virus", J. Virol. 21, 626).
-
Monoklonale Antikörper (MAbs). Hybridome, die MAbs
sekretieren, die für das Rabies Glykoprotein (G Protein) und
Nukleoprotein (RNP) spezifisch sind, wurden durch die Fusion
von P3 x 63 Ag8 oder 654 Myelomzellen mit Milzzellen aus
BALB/c Mäusen, die mit verschiedenen Stämmen des Rabies-Virus
immunisiert worden waren, hergestellt (Wiktor, T.J., 1978,
"Monoclonal Antibodies Against Rabies Virus Produced by
Somatic Cell Hybridization Detection of Antigenic Variants",
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 3938 - 3942).
-
Reinigung der MAbs. Die MAbs wurden aus der Ascites
Flüssigkeit mit (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, wie beschrieben ausgefällt (Hughes, E.N.
et al., 1982, "Murine Cell Surface Glycoproteins:
Identification, Purification and Characterization of a Major Component
of 110,000 Daltons by Use of a Monoclonal Antibody", J. Biol.
Chem. 257, 3970 - 3977). Das Präzipitat wurde in PBS gelöst,
gegen 25 mM MES [2-(N-Morpholin)ethansulfonsäure] pH 5,5
dialysiert und der HPLC Ionenaustauscher-Chromatographie unter
Verwendung einer Baker Bound Abx 15u Prep Säule (Baker
Chemical Company) unterworfen. Die Bedingungen der Chromatographie
waren ähnlich den kürzlich beschriebenen Bedingungen (Nau, D.
R., 1986, "Rapid Antibody Purification: Bakerbond Abx, J.T.
Baker Product Information Bulletin Nr. 8506, J.T. Baker
Chemical Company). Lösungsmittel A war 25 mM MES pH 5,6,
Lösungsmittel B war 1 M Natriumacetat pH 7,0. Ein Gradient von
0 - 70% B wurde 60 Minuten mit einer Fließgeschwindigkeit von
3 ml/min bei Umgebungstemperatur gelaufen. Die Elution der
Proteine wurde mittels UV Absorption bei 280 nm kontrolliert.
Peak Fraktionen, die den MAb enthielten, wurden
zusammengegeben, gegen PBS dialysiert und mittels Ultrafiltration
konzentriert.
-
Herstellung von F(ab')&sub2;. F(ab')&sub2; Fragmente wurden wie
beschrieben von gereinigten MAbs hergestellt (Chang, T.W. et
al., 1982, "Cellular Origin and Interactions Involved in
Gamma-Interferon Production Induced by OKT3 Monoclonal
Antibody", J. Immunol. 128, 585). 15 mg MAb in 10 ml 0,1 mM
Natriumacetat-Puffer pH 4,5 wurden mit 0,15 mg Pepsin (Millpore
Corporation, USA) gemischt und 16 Stunden bei 37ºC inkubiert.
Das verdaute Gemisch wurde gegen PBS dialysiert und zur
Chromatographie auf eine Säule mit Protein A Sepharose CL-4B
gegeben. In der Präparation von F(ab')&sub2; war kein restliches
intaktes IgG nachweisbar, wenn die Analyse mittels
SDS-Polyacryjamidgel-Elektrophorese erfolgte.
-
In vivo Schutz-Experimente in Mäusen. Sechs Wochen alte
weibliche ICR Mäuse (Harlan Sprague-Dawley) in Gruppen von
sieben oder zehn wurden mit 0,1 ml von einer von fünf
seriellen Verdünnungen (100 I.E. - 0,16 I.E.) MAbs aus der Maus
intramuskulär (i.m.) in den rechten Gastronemius-Muskel
injiziert. 24 Stunden nach der Behandlung mit MAb wurden alle
Mäuse mit 10 MIC LD&sub5;&sub0; CVS-24 Virus i.m. in den linken
Gastronemius-Muskel herausgefordert. Die Tiere wurden drei Wochen
lang beobachtet, und täglich wurden tote Tiere gefunden. Die
effektive Dosis (ED&sub5;&sub0;) der MAbs wurde wie beschrieben
berechnet (Habel, K., 1966, "Procedure for Determining 50%
Endpoints of Habel-type Potency Test in Mice, in: Laboratory
Techniques in Rabies, 2. Aufl., WHO, Reihe der Monographien
Nr. 23, 142 - 143).
-
Behandlung von Hamstern mit MAbs aus der Maus nach der
Exposition. Syrian Hamster im Alter von 4 bis 6 Wochen wurden
für alle Experimente verwendet. Das Virus für die
Herausforderung
bestand aus einer 20% Speicheldrüsen-Suspension von
einem Rabies-Virus-Isolat des Straßentyps (Ursprung: Fuchs).
Es wurden Verdünnungen hergestellt mit destilliertem Wasser,
das Pferdeserum enthielt. Für jeden Versuch wurden die
Hamster in Gruppen fünf aufgeteilt und erhielten 100 ul von
entweder PBS (Kontrolle) oder von monoklonalen Antikörper
(MAbs), wie folgt:
Versuch 1
-
Die Hamster erhielten 105,1 MIC LD&sub5;&sub0;/ml Rabies-Virus und
wurden mit monoklonalem Antikörper drei oder 36 Stunden
später mit MAbs aus der Maus behandelt (1535 I.E./ml).
Versuch 2
-
Die Hamster erhielten 104,6 MIC LD&sub5;&sub0;/ml Rabies-Virus und
wurden zwei Stunden später mit MAbs aus der Maus behandelt (155
I.E./ml).
-
Die Tiere wurden täglich auf eindeutige klinische Anzeichen
einer Rabies-Infektion untersucht und bei Vergiftung mit CO&sub2;
in extremis euthanisiert. Die Überlebenden wurden für
wenigstens 30 Tage nach der Inokulation mit dem Rabies-Virus
beobachtet und dann auf ähnliche Weise euthanisiert.
Tabelle 1
Monoklonale Antikörper aus der Maus, die für den passiven
Schutz gegen Rabies verwendet wurden
ISOTYP
Antigen-Spezifität
Spezif. Virus neutralisierende Aktivität (I.E./mg)
Virus-Stamm-Spezifität
MAb Cocktail*
Neutralisierung aller Stämme des Rabies-Virus des stabilen
und des Straßentyps, außer einiger Virus-Isolate von
Fledermäusen
Neutralisierung aller Stämme des Rabies-Virus des stabilen
und des Straßentyps und der Rabies verwandeten Duvenhage-
Stämme
Neutralisierung aller Stämme des Rabies-Virus des stabilen
und des Straßentyps, außer einiger Virus-Isolate des
Straßentyps von Fledermäusen und Füchsen
Bindung an aller Stämme des Rabies-Virus des stabilen und des
Straßentyps und an einige Rabies verwandete Viren
Bindung an alla Rabies- und Rabies verwandte Viren
*Der MAb Cocktail stellt ein Gemisch aus 112,5
I.E./ml von MAb 509-6, 10 I.E./ml von MAb 1112-1,
800 I.E./ml von MAb 523-11, 0,04 mg/ml von MAb
801-1 und 0,6 mg/ml von MAb 502-2 dar.
Tabelle 2
Passiver Schutz von ICR Mäusen mit dem MAb Cocktail
Sterblichkeit
Antikörper
Dosis (I.E.)
vor/nach der Herausforderung
Die Mäuse wurden i.c. mit 5 x 10&sup4; MIC LD&sub5;&sub0; CVS 11 herausgefordert
Tabelle 3
Passiver Schutz von ICR Mäusen mit dem MAb Cocktail
Sterblichkeit
Antikörper
Dosis (I.E.)
24 h vor der i.m. Herausforderung
Die Mäuse wurden i.m. mit 5 x 10&sup6; MIC LD&sub5;&sub0; CVS 24 herausgefordert
Tabelle 4
VNA Titer und Sterblichkeitsraten nach der Behandlung mit
MAb oder Immunisierung mit BPL inaktiviertem ERA Virus
Behandlung mit MAb* (200 I.E./Maus)
Immunisierung mit BPL ERA** (2 ug/Maus)
***VNA Titer Sterblichk. (GMT, n=7)
* Die Mäuse wurden mit 200 I.E. des MAb Cocktails
behandelt und 24 Stunden später i.c. mit 5 x 10&sup4; MIC LD&sub5;&sub0; CVS
11 herausgefordert
** Die Mäuse wurden an Tag 0 und 7 mit 2 ug BPL
inaktiviertem ERA Virus immunisiert und an Tag 14 i.c. mit 5 x 10&sup4;
MIC LD&sub5;&sub0; CVS 11 herausgefordert
*** Man lieb die Mäuse 2 Stunden vor der Herausforderung
bluten
Tabelle 5
Behandlung von Syrian Hamstern gegen Rabies mit monoklonalen
Antokörpern aud der Maus nach der Exposition*
Antikörper Dosis (I.E./kg)
Zeit der Behandlung nach der Herausforderung mit Virus (h)
Virus-Verdünnung bei der Herausforderung**
Morbidität
* Die Antikörper wurden i.m. verabreicht
** Die Hamster wurden i.m. mit einer Suspension einer
Speicheldrüse des Hundes, die mit dem NYC Stamm des Rabies-
Virus infiziert worden war, herausgefordert