DE68906261T2

DE68906261T2 - Somatropine.

Info

Publication number: DE68906261T2
Application number: DE89910508T
Authority: DE
Inventors: Gwen Krivi; Michael Schlittler; Bernard Violand
Original assignee: Monsanto Co
Current assignee: Monsanto Co
Priority date: 1988-08-29
Filing date: 1989-08-28
Publication date: 1993-11-11
Anticipated expiration: 2009-08-29
Also published as: HUT54409A; NZ230458A; EP0363342A1; JPH03501856A; ES2054096T3; AU4316089A; BG60324B2; AU614879B2; IL91457A; DE68906261D1; ZA896557B; JP2784232B2; CA1340122C; EP0403601A1; IL91457A0; US5089473A; BR8907068A; ES2016069A4; WO1990002182A1; EP0403601B1

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf Somatotropine (Wachstumshormone) und insbesondere auf Varianten von Somatotropinen mit erhöhter Stabilität.

Hintergrund der Erfindung

Somatropine sind Proteine, die von Lebewesen produziert werden und wegen ihrer Wirkung auf das Wachstum von Lebewesen allgemein als "Wachstumshormone" bezeichnet werden. Historisch wurden Wachstumshormone (Somatotropine) aus Hypophysenextrakten gewonnen und gereinigt. Mit dem Aufkommen der rekombinanten DNA- Technologie können Somatotropine nun in einer Menge produziert werden, die frei von anderen Proteinen natürlichen Ursprungs ist.
Durch rekombinante DNA-Technologie in Bakterien produzierte Somatrotropine werden im allgemeinen in unlöslichen zerbrechlichen Körpern im Zytoplasma der Wirtszelle akkumuliert. Die Gewinnung von Somatotropin in seiner aktiven Form erfordert Renaturierung, die Solubilisierung, Faltung und Oxidation des Proteins in seine native Konfiguration mit sich bringt. Beispiele von Renaturierungsverfahren sind im einzelnen in EP-A-114 506 und EP-A-192 629 beschrieben. Diese Verfahren und nachfolgende Reinigungsverfahren werden gewöhnlich bei hohem pH durchgeführt. Somatotropine sind unter diesen Bedingungen instabil, was zu Ausbeuteverlusten führt, insbesondere wenn sie während längerer Zeiträume gelagert werden. Abbau ist auch temperaturabhängig, wobei Raumtemperatur schlechter ist als 4ºC (die für die Verarbeitung angewandte übliche Temperatur), es wäre aber, wenn es kein Stabilitätsproblem gäbe, das Arbeiten bei Raumtemperatur vom Verarbeitungsstandpunkt aus besser.
Es wurde nun gefunden, daß die beiden Hauptzersetzungsprodukte von Somatotropin unter diesen Bedingungen (1) eine Isoform von Somatotropin mit einer β-gekoppelten Asparaginsäure, gebildet von einem ungefähr in der Mitte der Proteinkette (Stellungen 95-101) befindlichen Asparagin, und (2) eine Zweikettenform des Moleküls, die durch einen Bruch der Polypeptidkette verursacht ist, der an dem ungefähr in der Mitte der Proteinkette, d.h. Stellungen 95-101, befindlichen Asparagin auftritt, sind. Der Bruch resultiert daraus, daß das Asparagin in eine Succinimidylgruppe übergeführt wird. Diese Formen werden während der Verarbeitung oft entfernt, was zu einem Ausbeuteverlust führt.

Zusammenfassung der Erfindung

Es wurde nun gefunden, daß Variantenformen von Säugersomatotropinen, in welchen das zwischen den Stellungen 95-101 befindliche Asparagin durch Glutamin ersetzt wurde, bei hohem pH und bei erhöhter Temperatur erhöhte Stabilität zeigen, während sie eine Bioaktivität äquivalent den entsprechenden nichtmutierten Somatotropinen beibehalten. Jedes Säugersomatotropin kann gemäß dieser Erfindung mutiert werden, indem das in der 95-101 Region befindliche Asparagin durch Glutamin ersetzt wird. Jedes Säugersomatotropin mit im wesentlichen homologen Aminosäuresequenzen in der 95-101 Region kann durch Überführen des Asparagins in Glutamin in dieser Region stabilisiert werden. Beispiele geeigneter Somatotropine sind menschliches Somatotropin, Rindersomatotropin, Schweinesomatotropin, Schafsomatotropin, Pferdesomatotropin, Rattensomatotropin und Affensomatotropin.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Jedes Säugersomatotropin ist für die Durchführung dieser Erfindung auf Grund der anerkannten Homologie von Säugersomatotropinen geeignet. Hinsichtlich Beispielen bekannter Somatotropinaminosäuresequenzen siehe EP-A-192 629, eingereicht am 27. August 1986, Seeberg et al., DNA Bd. 2, Nr. 1, 5.37-45, 1983, und Abdel-Meguid et al., Proc.Natl.Acad.Sci., USA, Bd. 84, S.6434-6437, Sept. 1987, welche Sequenzen hier durch Bezugnahme eingeschlossen sind. Bevorzugte Somatotropine dieser Erfindung sind Rinder- und Schweinesomatotropin.
Illustrative Beispiele der Aminosäuresequenzen der Zielregion der Varianten-Soinatotropine dieser Erfindung sind in Tabelle 1 gezeigt. Die unterstrichenen Glutamine sind Asparagine in den nicht-mutierten Somatotropinen. Die Zahlen stellen die Aminosäurestellungen dar, gezählt vom Aminoterminus des Proteins, wobei die Aminosäure in Position 1der illustrierten Hormone Phenylalanin ist. Die Abkürzungen stehen für Rindersomatotropin (BGH), Schweinesomatotropin (PGH), Schafsomatotropin (OHG), Pferdesomatotropin (EGH), Rattensomatotropin (RGH), menschliches Somatotropin (HGH) und Affensomatotropin (MGH). Tabelle 1 Aminosäuresequenzen der Zielregion
Die Varianten dieser Erfindung, d.h. Proteine, in denen das Asparagin in der 95-101 Region in Glutamin geändert ist, sind nicht auf native Somatotropine beschränkt, sondern schließen Analoga, Mutanten (z.B. Somatotropine enthaltend geänderte Aminosäuren an einer anderen Stelle als das Asparagin in der 95-101 Region), allele Formen und andere Varianten einschließlich Extensionen und Deletionen von Somatotropinen, welche Varianten die Bioaktivität von Somatotropin zeigen und zusätzlich erhöhte Stabilität bei hohem pH und hoher Temperatur zeigen, die durch die Mutation dieser Erfindung verliehen wird. Beispielsweise schließen zufriedenstellende allele Variantenformen von BGH und PGH ein, in welchen Leucin 126 durch Valin ersetzt ist.
Die Somatotropine dieser Erfindung können durch chemische Synthese hergestellt werden. Es wird aber auf Grund der großen Größe des Somatotropinmoleküls bevorzugt, sie durch rekombinante DNA-Technologie herzustellen. Dies kann auf herkömmliche Weise durch Konstruieren eines Gens, das das gewünschte Varianten- Somatotropin mit Glutamin anstelle von Asparagin in der 95-101 Region codiert, erfolgen. Ein zweckmäßiger Weg des Konstruierens des Varianten-Somatotropin-Gens ist durch herkömmliche oligonucleotid-gerichtete Sequenzspezifische Mutagenese des Ausgangs- Gens. Das mutierte Gen wird dann in einen geeigneten Vektor kloniert, welcher Vektor danach zum Transformieren eines geeigneten Expressionswirts, wie Bakterien (z.B. E. coli oder Pseudomonas), Hefe (z.B. S. cerevisiae) oder Säugerzellen (z.B. C127 oder CHO), verwendet wird. Das Varianten-Somatotropin wird dann auf herkömmliche Weise exprimiert und gewonnen.
Eine Ausführungsform der Erfindung ist auf neue DNA- Sequenzen gerichtet, die für Säugersomatotropine codieren, worin das Codon für zwischen den Stellungen 95-101 befindliches Asparagin eines nativen Säugersomatotropins durch ein Codon für Glutamin ersetzt ist, d.h. CAA oder CAG. Die DNA-Sequenzen werden auf. herkömmliche chemische oder enzymatische Weise, beispielsweise durch Synthese durch eine Gen-Maschine oder durch oligonucleotidgerichtete sequenzspezifische Mutagenese eines Somatotropin-Gens hergestellt.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zum Verbessern des Wachstums von Säugetieren, vorzugsweise Rindern und Schweinen, welches Verfahren die Behandlung eines Säugers mit einer wirksamen Menge eines Säugersomatotropins dieser Erfindung umfaßt.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zum Erhöhen der Milchproduktion in weiblichen Säugetieren, wie Zuchtsäuen und vorzugsweise Milchkühen, welches Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge Somatotropin dieser Erfindung umfaßt.
Die Somatotropine dieser Erfindung zeigen im wesentlichen die gleiche Wirksamkeit wie die entsprechenden asparaginhaltigen Somatotropine. Demgemäß ist sind eine wirksame Dosis und Verabreichungsweise für die Somatotropine dieser Erfindung ähnlich jenen, die für bekannte Wachstumshormone angewandt werden. Jedoch wird es bei der Durchführung bevorzugt, endogenes Somatotropin für die Behandlung der Ausgangsarten von Säugern zu verwenden.
Im allgemeinen beträgt der wirksame Dosierungsbereich 1 bis 200 mg pro Tier pro Tag. Die Wirksamkeit variiert in Abhängigkeit von der Größe und Reife des Tieres, von der verabreichten Somatotropinmenge und der Art des verwendeten Abgabesystems. Typischerweise ist, je größer die verabreichte Somatotropinmenge ist, desto größer die resultierende Wachstumserhöhung, Futtereffizienz, das Fleisch/Fettverhältnis, die Laktation oder Proliferation von Milchdrüsenparenchymzellen. Vorzugsweise variiert die Dosierung zwischen 10 und 50 mg pro Tier pro Tag.
Die Somatotropine dieser Erfindung können durch bekannte Techniken verabreicht werden, die zur Abgabe der gewünschten Dosis an das Tier wirksam sind. Diese schließen intramammäre, intramuskuläre oder subkutane Injektionen ein oder die Verwendung von Implantaten mit geregelter Freisetzung. Die Somatotropine dieser Erfindung können auf gleiche Weise wie bekannte Somatotropine formuliert werden. Solche Formulierungen weisen üblicherweise einen Puffer und einen inerten Träger auf.

Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen

Beispiel 1: Herstellung von BGH- und PGH G1n- Varianten-Genen

Die Asparaginreste in Stellung 98 der BGH- und PGH-Strukturgene, beschrieben in P.H. Seeburg et al., 1983, DNA 2:37-45, werden durch oligonucleotidgerichtete sequenzspezifische Mutagenese in Glutamin geändert. Oligonucleotid-Mutageneseprimer werden auf einem Applied Biosystems DNA Synthesizer gemäß dem vom Hersteller, Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA) angegebenen Verfahren synthetisiert. Die Sequenz der Mutageneseprimer ist:
BGH 5'-AAACACCAAGCTCTGGGTGAAGACTCT-3'
PGH 5'-AGGGTCTTCACCCAGAGCCTGGTGTTT-3'
Die Unterstreichung gibt das Codon an, das das Wiltyp- Asparagin in Glutamin ändert
Das als Matrizen-DNA verwendete BGH-Gen bestand aus dem BGH- Gen, beschrieben in Seeberg et al., kloniert in den M13mp18- Vektor (Bethseda Research Laboratory, Gaithersburg, MD) als EcoRI/HindIII-Fragment. Als eine Matrize wird auch das N-Alanyl, Valin (126)-BGH-Gen, beschrieben in EP-A-193 515, veröffentlicht am 3. September 1986, kloniert in den M13mp18-Vektor als ein CoRI/HindIII-Fragment, verwendet. Das als Matrizen-DNA verwendete PGH-Gen war das N-Alanyl-PGH-Gen, beschrieben in EP-A- 193 515, kloniert in den M13mp19-Vektor (BRL) als ein EcoRI/HindIII-Fragment. Vor der Mutagenese des N-Alanyl-PGH-Gens in Stellung 98 wurde das 5'-Ende des Gens zum Schaffen einer NcoI- Stelle mutagenisiert, um das später Subklonieren in das Expressionsplasmid zu erleichtern. Der für diese Mutagenese verwendete Primer wurde wie oben synthetisiert und weist die Struktur von
5'-CAGTGAATTCTCCATGGCCTTCCCAGCC3'
auf. Das Mutageneseverfahren für die NcoI-Stellen-Addition ist von Kunkel, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 82, 422-492 (1985), beschrieben. Alle Restriktionsenzyme und Modifizierungsenzyme (T4 DNA-Ligase und Polynucleotid-Kinase) werden von New England Biolabs (Beverly, MA) gekauft und gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet.
Die Mutagenese wird unter Verwendung des Amersham (Arlington Heights, IL) oligonucleotid-gerichteten in vitro-Mutagenesesystems gemäß den Instruktionen des Herstellers durchgeführt. Nach der Mutagenese werden positive Mutantengene durch DNA- Sequenzanalyse unter Verwendung des Sequenase -DNA-Sequenziersystems von United States Biochemical Corporation (Cleveland, Ohio) gemäß den Anweisungen des Merstellers identifiziert. Die mutierten Gene werden dann als EcoRI/HindIII-Fragmente in E. coli-Expressionsvektoren pMON2534 für die BGH-und N-Alanyl- BGH-Gene und pMON5585 für das N-Alanyl-PGH-Gen kloniert. Plasmid pMON2534 ist ein Derivat von pBGHex-1 (Seeburg et al.) mit einem an der HindIII-Stelle von PBGHex-1 insertierten Tandem lacUV5-Promotor als Transkriptionsterminator. Die Sequenz des Tandem lacUV5- Promotors als ein EcoRI-Fragment ist in Bogosian et al., Nucleic Acid Research, 15, 7185, beschrieben. Das EcoRI- Fragment wird durch Füllen in die EcoRI-Überhänge und Anfügen von HindIII-Linkern in ein HindIII-Fragment übergeführt. Diese Manipulationen ergeben die Sequenzen, die an den Enden des HindIII-Fragmentes gefunden werden. Am Stromaufwärtsende produziert der an das aufgefüllte EcoRI-Ende (AATTCT...) ligasierte HindIII-Linker (AAGCTT) die Sequenz AAGCTTAATTCT...; das CT in den Stellungen 11 und 12 stellt die rechte Hälfte der AluI-Stelle vom ursprünglichen lacUV5-Promotorfragment dar. Am Stromabwärtsende ist die produzierte Sequenz ..AGAATTAAGCTT; das AG in den Stellungen -12 und -11 stellt die linke Hälfte der AluI-Stelle vom ursprünglichen lacUV5-Promotorfragment dar. Zusätzlich weist pMON2534 die EcoRI-Stelle am 5'-Terminus des ptrp-Fragments von pBVGHex-1 und die HindIII-Stelle am 3'- Terminus des Tandem lacUV5- Promotor/Operatorfragments, entfernt durch Verdau der Überhang-EcoRI-und HindIII-Enden unter Verwendung von SI Nuclease und Ligasierung glatter Enden mit T&sub4; DNA-Ligase, auf. Plasmid pMON5585 ist ein pBR327-Plasmid enthaltend E. coli recA-Promotor, eine G10L-Sequenz und T&sub7; Transkriptionsterminationssequenz, wie in der am 14. Oktober 1987 veröffentlichten EP-A-241 446 beschrieben. Die in die betreffenden Expressionsplasmide klonierten BGH-, N-Alanyl-BGH-und N- Alanyl-PGH-Mutantengene werden pMON3050, pMON3066 bzw. pMON3299 bezeichnet. Die pMON3050- und pMON3066-Plasmide werden in E. coli Stamm W3110 (ATCC Nr. 39936) insertiert. pMON3299 wird in E. coli Stamm W3110 insertiert, der durch Deletion von fhuA-Gen durch Standardverfahren modifiziert ist (Maniatis et al., Rerausg., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York).

Beispiel 2: Produktion von BHG- und PGH Gln-Mutantenproteinen

Die die pMON3050, pMON3066 oder pMON3299-Expressionsplasmide tragenden E. coli-Zellen werden unter Bedingungen gezüchtet, die Expression der BGH- oder PGH-Mutantencodiersequenzen und daher Produktion der BGH- oder PGH-Mutantenproteine durch die transformierten E. coli bewirken. Die Wachstumsmedien für die E.coli und die Bedingungen für Selektion von einen Ampicillinresistenz (ampr)-Marker enthaltenden Bakterienzellen sind in Maniatis et al. (1982) beschrieben. Bei Verwendung für Proteinexpression werden E.coli in Luria Broth (LB) oder M9 Minimal Medium (Maniatis et al., 1982), ergänzt mit 100 µg/ml Ampicillin, gezüchtet. Induktion von Transkription vom recA-Promotor in pMON3299 wird wie folgt durchgeführt. Übernachtkulturen von Expressionsplasmide tragenden E. coli-Wirtszellen werden auf 20 bis 25 Klett-Einheiten (gemessen mit einem Klett-Summerson- Messer unter Verwendung eines Grünfilters, Klett Mfg.Co., New York, New York) in M9 Minimal Media, ergänzt mit 0,25 % (G/V) Glukose und 1 % (G/V) Casaminosäuren und 0,25 % µg/ml Thiamin verdünnt und auf eine Zelldichte von 150 bis 180 Klett-Einheiten gezüchtet. Die Zellen werden dann durch Zusatz von Nalidixinsäure zu den Wachstumsmedien auf eine Endkonzentration von 50 µg/ml induziert. Das Züchten wird einige Stunden bei 37ºC fortgesetzt wobei aliguote Mengen 2 oder 3 Tage nach Induktion für heterologe Proteinanalyse genommen werden. Ein hoher Belüftungsgrad wird während der Züchtung aufrechterhalten, um Höchstproduktion des gewünschten Genproduktes zu erzielen. Die Induktion von Transkription vom ptrp-Promotor in pMON3050 und pMON3066 ist, wie in Seeburgt et al, 1983, und Calcott et al., 1988, Developments in Industrial Microbiology 29, 257-266, beschrieben.
Nach der Produktion in E. coli werden die BGH- und PGH- Mutantenproteine unter Verwendung von von Sigma (St. Louis, MO) gekauften Reagentien, wenn nichts anderes angegeben, gereinigt. Die rekömbinanten E. coli-Zellen werden unter Verwendung eines Ultra-Turrax (Tekmar Co., Cincinnati, OH) homogenisiert. Die Zellen werden dann durch Durchgang durch einen vorgekühlten Manton Gaulin (APV Gaulin, Everett, MA) dreimal bei 258 263 bis 332 053 Newton/m² lysiert und dann 20 min bei 4ºC bei 25 000 UpM zentrifugiert. Die isolierten Pellets werden gespült und homogenisiert, wie oben beschrieben, und Harnstoff wird auf eine Endkonzentration von 4,5 M Harnstof zugesetzt. Die PGH-Mischung enthält auch 90 mM Tris-Base. Der pH wird dann mit NaOH auf 11,3 eingestellt und das BGH- und PGH-Protein werden etwa 2 ½ Tage bei 4ºC unter Rühren falten gelassen. Die Mischung wird 30 min bei 4ºC bei 25 000 UpM zentrifugiert, um jeglichen verbliebenen Niederschlag zu entfernen. Die BGH- und PGH-Mutantenproteine werden dann unter Verwendung von DE-52-Chromatographie von E. coli-Kontaminierungen abgetrennt. Die GH-Proteine werden von der Säule mit einem HCl-Leitfähigkeitsgradienten von 350 bis 1000 Jun Semens/cm eluiert. Die gereinigten BGH- und PGH-Mutantenproteine enthaltende Fraktionen (bestimmt durch HPLC auf einer C-8-Säule, Al1tech Assoc., Deerfield, IL) eluierten mit einem Gradienten von 50 bis 65 % (V/V) Acetonitril enthaltend 0,1 % (V/V) TFA und wurden vereinigt und über YM10-Membranen in einer Rührzellenapparatur (Amicon, Danvers, MA) konzentriert.
Die BGH Gln-Mutantenproteine werden gegen 4 Wechsel von 25 mM NaHCO&sub3;, pH 10, gefolgt von 4 Wechseln Wasser, vor Lyophilisierung auf einem Virtis Freezemobile 24 (Gardiner, NY), dialysiert.
Der PGH Gln-Mutantenprotein wird gegen 4 Wechsel 25 mM NaHC0&sub3;, pH 10, vor Lyophilisierung dialysiert. Lyophilisierte Proteine werden vor dem Test bei -20ºC gelagert.
Tests, insbesondere ein in vitro-Leberradiorezeptortest unter Anwendung der Methode von Haro et al., Mol.Cell.Endocrinol. 38, 109-116 (1984), und ein in vitro-Test zum Messen der Inhibierung von insulinstimuliertem C14-Glukoseeinbau in Lipide durch die Methode von Glenn et al., J.Cell.Biochem. 37, 371-383 (1988), zeigen, daß die Gln98-Somatotropine dieser Erfindung im wesentlichen äquivalente biologische Aktivität aufweisen wie die entsprechenden nicht-mutierten Somatotropine.
In vivo-Tests in Ratten unter Anwendung eines Gewichtszunahmetests zeigen ebenfalls im wesentlichen äquivalente biologische Aktivität für die Gln98-Somatotropine dieser Erfindung.

Beispiel 3: Stabilität von Gln-Mutantenproteinen

Die Lösungsstabilität von Somatotropinen wird bei pH 10 und 11 während Zeiträumen von 3 und 7 Tagen bestimmt. Proben werden durch Lösen von 2 mg/ml eines Testsomatotropins in 25 millimolarem NaHCO&sub3; beim gewünschten pH bei 22ºC hergestellt. Der pH wird durch Zusetzen von 2,5 molarem NaoH auf 10 oder 11 eingestellt. Die Proben werden bei 22ºC gehalten und Proben werden am Beginn und nach 3 und 7 Tagen durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie analysiert. Die bei pH 10 und pH 11 erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 bzw. 3 angegeben. Die Daten sind als Flächen-% angegeben. Nicht-nachweisbare Mengen sind durch nd angezeigt. Peak 1 zeigt die Menge der Zweikettenform des Somatotropins an, das bei Asparagin 98 gespalten wurde. Peak 2 zeigt die Menge von β-gekoppeltem Asparaginsäure-Somatotropin beim Rest 98 an. Die Zusammensetzung von Peak 3 ist unbekannt. Sowohl das BGH- als auch das BGH-Gln98-Somatotropin haben ein Methionin in Stellung -1. Sowohl das PGH- als auch das PGH-Gln98-Somatotropin haben ein Alanin bei -1. Tabelle 2 Stabilität bei pH 10 Zeit Peak (Tage) Tabelle 3 Stabilität bei pH 11 Zeit Peak (Tage)
Die Daten zeigen, daß übliche Somatotropine bei hohem pH instabil sind, wobei sich signifikante Mengen von Zweikettenund β-gekoppelten Nebenprodukten mit der Zeit bilden, während die Daten zeigen, daß die Gln98-Somatotropine stabil sind, ohne daß sich nachweisbare Mengen von Zweiketten- oder β-gekoppelten Nebenprodukten bilden.

Claims

1. Varianten-Somatotropin, in dem das sich zwischen den Stellungen 95-101 befindliche Asparagin eines Säugersomatotropins durch Glutamin ersetzt ist.

2. Somatotropin nach Anspruch 1, in dem das Somatotropin ein Rindersomatotropin ist.

3. Somatotropin nach Anspruch 2, in dem das Asparagin in Stellung 98 durch Glutamin ersetzt ist.

4. Somatotropin nach Anspruch 3 mit einem Methionin und einem Phenylalanin in Stellung -1 bzw. 1.

5. Somatotropin nach Anspruch 3 mit einem Alanin und einem Phenylalanin in Stellung -1 bzw. 1.

6. Somatotropin nach Anspruch 5 mit einem Valin in Stellung 126.

7. Somatotropin nach Anspruch 1, in dem das Somatotropin Schweinesomatotropin ist.

8. Somatotropin nach Anspruch 7, in dem das Asparagin in Stellung 98 durch Glutamin ersetzt ist.

9. Somatotropin nach Anspruch 8 mit einem Alanin und einem Phenylalanin in Stellung -1 bzw. 1.

10. Verfahren zum Erhöhen des Wachstums von Säugetieren, das die Behandlung eines Säugetiers mit einer wirksamen Menge eines Säugersomatotropins, in dem das sich zwischen den Stellungen 95- 101 befindliche Asparagin durch Glutamin ersetzt ist, umfaßt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, in dem das Somatotropin Schweinesomatotropin und das Säugetier ein Schwein ist.

12. Verfahren nach Anspruch 10, in dem das Somatotropin Rindersomatotropin und das Säugetier ein Rind ist.

13. Verfahren zum Erhöhen der Milchproduktion in einem weiblichen Säugetier, das die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Säugersomatotropins, in dem das sich zwischen den Stellungen 95-101 befindliche Asparagin durch Glutamin ersetzt ist, umfaßt.

14. Verfahren nach Anspruch 13, in dem das Somatotropin Rindersomatotropin und das Säugetier eine Milchkuh ist.

15. DNA-Sequenz, die für ein Säugersomatotropin codiert, in dem das Codon für sich zwischen den Stellungen 95-101 befindliche Asparagin von Somatotropin durch ein Codon für Glutamin ersetzt ist.

16. DNA-Sequenz nach Anspruch 15, in der das Somatotropin ein Rindersomatotropin ist.

17. DNA-Sequenz nach Anspruch 16, die für Glutamin in Stellung 98 codiert.

18. DNA-Sequenz nach Anspruch 17, die für Methionin und Phenylalanin in Stellung -1 bzw. 1 codiert.

19. DNA-Sequenz nach Anspruch 18, die für Alanin und Phenylalanin in Stellung -1 bzw. 1 codiert.

20. DNA-Sequenz nach Anspruch 19, die für Valin in Stellung 126 codiert.

21. DNA-Sequenz nach Anspruch 15, in der das Somatotropin ein Schweinesomatotropin ist.

22. DNA-Sequenz nach Anspruch 21, die für Glutamin in Stellung 98 codiert.

23. DNA-Sequenz nach Anspruch 22, die für Alanin und Phenylalanin in Stellung -1 bzw. 1 codiert.

24. DNA-Sequenz nach Anspruch 15, in der das Codon für Glutamin CAA ist.

25. DNA-Sequenz nach Anspruch 15, in der das Codon für Glutamin CAG ist.

26. Verfahren zum Gewinnen eines Somatotropins aus Bakterien, die das Somatotropin durch die Expression eines das Somatotropin codierenden Gens produzierten, welches Verfahren die Solubilisierung, die Faltung, die Oxidation und die Reinigung des Somatotropins umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen ein Varianten-Somatotropin codiert, in dem das sich zwischen den Stellungen 95-101 eines natürlichen Säugersomatotropins befindliche Asparagin durch Glutamin ersetzt ist.

27. Verfahren zum Herstellen eines Somatotropins, das das Bewirken von Expression eines das Somatotropin codierenden Gens in einer transformierten Wirtszelle und das nachfolgende Gewinnen des produzierten Somatotropins umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß das Somatotropin ein Varianten-Somatotropin ist, in dem das sich zwischen den Stellungen 95-101 eines Säugersomatotropins befindliche Asparagin durch Glutamin ersetzt ist.