DE60219361T2

DE60219361T2 - Verfahren zur rekombinanten herstellung von plazenta wachstumsfaktor

Info

Publication number: DE60219361T2
Application number: DE60219361T
Authority: DE
Inventors: Domenico Maglione; Mauro Battisti; Ettore Conti; Giuseppe Salvia; Marina Tucci
Original assignee: Geymonat SpA
Current assignee: Geymonat SpA
Priority date: 2002-02-05
Filing date: 2002-02-05
Publication date: 2007-12-13
Anticipated expiration: 2022-02-06
Also published as: DK1472286T3; MXPA04007589A; CY1106681T1; CZ2004892A3; CN100588661C; CN1620465A; HUP0500029A3; SI1472286T1; DE60219361D1; HU229056B1; AU2002236197A1; CA2475235C; JP4458850B2; US20050070696A1; EE05407B1; EE200400108A; HUP0500029A2; ATE358681T1; EP1472286B1; SK3282004A3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Extrahieren und Aufreinigen des rekombinanten Plazentaren Wachstumsfaktors aus genetisch modifizierten Zellen.
STAND DER TECHNIK
Der Plazentare Wachstumsfaktor (PLGF) ist ein homodimeres Glycoprotein mit einer Struktur, die dem Vaskulären Endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) ähnelt. Die vollständige Nucleotidsequenz, die das PLGF-Protein codiert, wurde von Maglione und Persico in dem Patent EP-B-550 519 (WO A 92/06194) beschrieben, welches die italienische Priorität vom 27.09.1990 beansprucht. Alternative Spleißvorgänge der PLGF-RNA erzeugen drei homologe Formen des Plazentaren Wachstumsfaktors, genau gesagt PLGF-1, PLGF-2 und PLGF-3, welche unterschiedliche Polypeptidsequenzen aufweisen und alle in der Literatur beschrieben sind.
Das vorstehend erwähnte Patent beschreibt auch ein Verfahren zur Herstellung des PLGF-Faktors, das die Verwendung eines induzierbaren prokaryontischen Expressionssystems umfasst, welches durch Wirtszellen gekennzeichnet ist, die mit einem Expressionsvektor modifiziert sind, in dem das menschliche PLGF-Gen unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors integriert ist (direkt oder indirekt). Nachdem die PLGF-Expression mit einem geeigneten Aktiviator induziert worden ist, werden die Zellen inkubiert, isoliert und einer Lyse unterzogen.
Das so erhaltene Rohlysat ist ein komplexes Gemisch von Proteinen, das geringe Mengen des exprimierten PLGF-Proteins enthält und welches eine niedrige spezifische Aktivität aufweist. In der Tat wird in dem bekannten Verfahren die Proteinexpression in Kulturen induziert, die eine geringe Zelldichte aufweisen, wie es aus der geringen optischen Dichte zum Zeitpunkt der Induktion ersichtlich ist, welche zwischen 0,2 und 0,6 OD bei 600 nm liegt. Des Weiteren umfasst das in dem vorhergehenden Dokument beschriebene Verfahren keine weiteren Reinigungsschritte des exprimierten Proteins. Aus diesem Grund sind die gemäß der Anmeldung WO A 92/06194 erhaltenen Lysate als solche nicht dazu geeignet, direkt bei der Herstellung von Medikamenten eingesetzt zu werden.
Ein komplexeres Verfahren zur Aufreinigung desselben plazentaren Faktors wird von Maglione et al. in „II Farmaco" 55 (2000), Seite 165 bis 167 vorgesehen. Nichtsdestotrotz stellt die Methoden-Offenbarung nur eine einfache Auflistung bekannter anwendbarer Techniken bereit, ohne Bedingungen und experimentelle Einzelheiten davon zu beschreiben, welche unabdingbar sind, um das PLGF-Protein in der Reinheit und Menge zu erhalten, die für eine pharmazeutische Verwendung notwendig ist.
Der Zweck der vorliegenden Erfindung ist es, ein neues Verfahren zum Extrahieren und Aufreinigen des in bakteriellen Zellen exprimierten rekombinanten PLGF bereitzustellen, welches es ermöglicht, PLGF in einem hohen Reinheitsgrad und in Ausbeuten zu erhalten, die geeignet sind, industriell bei der Herstellung von Medikamenten eingesetzt zu werden.
Ein weiterer Zweck der Erfindung ist es, das PLGF-Protein in im Wesentlichen aktiver Form zu gewinnen (mehr als 98,5%), welche vor allem aus dimeren (nicht weniger als 70%) und multimeren Formen zusammengesetzt ist und einen Rest von nicht mehr als 1,5% der monomeren Form (wenig oder nicht aktiv) aufweist.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung basiert auf der Identifizierung einer Folge von Aufreinigungsmethoden, die besonders für die Extraktion und die Aufreinigung von menschlichem PLGF geeignet ist, das in bakteriellen Zellen exprimiert wird. Die Erfindung basiert weiter auf der Bestimmung der optimalen operativen Bedingungen im Hinblick auf die die einzelnen Methoden und die chemisch-physikalischen Eigenschaften des aufzureinigenden Stoffs.
Außerdem ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Extrahieren und Aufreinigen von rekombinantem Plazentarem Wachstumsfaktor (PLGF) in dimerer und multimerer aktiver Form, welche nicht mehr als 1,5% der monomeren Form enthält, mittels Expression in einem induzierbaren Expressionssystem in modifizierten prokaryontischen Zellen, umfassend die folgenden Schritte: (I) Fermentation der prokaryontischen Zellen, II) Extraktion und Aufreinigung der Einschlusskörper, III) Renaturierung des exprimierten Proteins, IV) Ionenaustausch-Chromatographie, V) Umkehrphasen-Chromatographie, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt (I) durchgeführt wird, bis eine optische Dichte des Kulturmediums von 14 bis 50 bei 600 nm (OD₆₀₀ 14–50) erhalten wird, gefolgt von Induktion; dass Schritt (II) Lyse der Kulturzellen, Zerstören der DNA und Isolieren der Einschlusskörper umfasst, dass in Schritt (III) die Einschlusskörper in denaturierendem Puffer solubilisiert werden und das exprimierte Protein zumindest teilweise zurück in die dimere Form gebracht wird, dass in Schritt (IV) die dimeren und multimeren Formen des exprimierten Proteins von der monomeren Form durch Anionenaustausch-Chromatographie abgetrennt werden, dass in Schritt (V) die dimeren und multimeren Formen des exprimierten Proteins weiter durch Umkehrphasen-Chromatographie mit zwei aufeinander folgenden Elutionsschritten mit ansteigenden Gradienten von organischem Lösungsmittel abgetrennt werden, die durch einen Elutionsschritt unter isokratischen Bedingungen getrennt sind, und letztendlich isoliert werden.
Eine spezifische Aufgabe der Erfindung ist das vorstehend erwähnte Verfahren zum Extrahieren und Aufreinigen des PLGF-1-Proteins menschlichen Ursprungs, im Wesentlichen aber auch für PLGF-1 tierischen Ursprungs.
Das beanspruchte Verfahren ermöglicht vorteilhafterweise das Erhalten von 30 bis 50-fach höheren Produktionsausbeuten des exprimierten Proteins als den Ausbeuten, die gemäß dem beschriebenen Verfahren im vorstehenden Stand der Technik erhalten wurden. Das beanspruchte Verfahren ermöglicht darüber hinaus das Erhalten des hochreinen Proteins mit hoher spezifischer Aktivität und in im Wesentlichen dimerer Form.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist der aktive Plazentare Wachstumsfaktor, der mit Hilfe des Verfahrens der Erfindung erhalten werden kann, frei von jeglichem restlichen Protein oder anderen bakteriellen Kontaminanten, und der nicht mehr als 1,5% verbleibende monomere Form enthält.
Beschreibung der Figuren
1: Die Figur zeigt die Ergebnisse der SDS-PAGE-Elektrophorese under reduzierenden Bedingungen zur Überwachung von Schritt I. Pre1 und Pre2 stellen die Prä-Induktions-Kontrollen dar, die wie folgt hergestellt sind. Kurz vor der Induktion werden etwa 0,064 Einheiten der bei 600 nm gemessenen optischen Absorption (OD₆₀₀) entnommen und 5-fach mit Wasser verdünnt. Von dieser Verdünnung werden 20 μl genommen, welche zu 20 μl an reduzierendem Puffer hinzugefügt und gekocht werden. 20 μl von dieser letzteren Lösung werden auf die SDS-PAGE-Matrix aufgeladen. Post1 und Post2 stellen die Post-Induktions-Kontrollen dar, die wie vorstehend hergestellt werden. M bezeichnet das Gemisch von Molekulargewichtsmarkern. In den Post-Induktions-Säulen (Post1 und Post2) ist eine Bande gerade oberhalb des Molekulargewichtsindikators 14,3 zu sehen, die in den Prä-Induktions-Säulen (Pre1 und Pre2) praktisch nicht vorkommt und welche dem PLGF-1-Protein entspricht, das exprimiert wird und innerhalb der Einschlusskörper abgesondert wird.
2: Die Figur zeigt das Kontroll-Chromatogramm der Anionenaustausch-Chromatographie auf Q-Sepharose-Fast Flow-Harz. Die x-Achse zeigt das Elutionsvolumen (ml), die y-Achse zeigt die Einheiten der optischen Absorption (OD). Der erste Peak der Elution, den man durch Eluieren mit 20% Puffer B (200 mM NaCl) erhält, entspricht dem PLGF-1-Protein in im Wesentlichen dimerer Form, aber er enthält Verunreinigungen und die monomere Form. Der folgende Peak, der bei 100% Puffer B eluiert wird (1 M NaCl), enthält Verunreinigungen, die beseitigt sind.
3: Die Figur zeigt das Kontroll-Chromatogramm des ersten Elutionsschritts bei der Umkehrphasenchromatographie auf RP Source 30-Harz. Die x-Achse zeigt das Elutionsvolumen (ml), die y-Achse zeigt die Einheiten der optischen Absorption (OD). Der erste große Elutions-Peak entspricht den verschiedenen Verunreinigungen, die nicht an das Harz binden. Der zweite Elutions-Peak entspricht dem PLGF-Protein in monomerer Form, das unter isokratischen Bedingungen eluiert wird (experimentell bestimmt bei etwa 10%–15% Puffer B).
4: Die Figur zeigt das Kontroll-Chromatogramm des zweiten Elutionsschritts bei der Umkehrphasenchromatographie auf RP Source 30-Harz. Die x-Achse zeigt das Elutionsvolumen (ml), die y-Achse zeigt die Einheiten der optischen Absorption (OD). Der Elutions-Peak entspricht dem PLGF-Protein in dimerer-multi merer Form.
5: Die Figur zeigt die Ergebnisse, die bei der SDS-PAGE-Elektrophorese für die Schlusskontrolle des gesamten Prozesses erhalten wurden. Prerefol und Postrefol stellen die Kontrollen vor und nach der Renaturierung des exprimierten Proteins dar (Schritt III). QFF entspricht dem Peak, der von dem Q Sepharose Fast Flow-Harz eluiert worden ist und welcher das Protein hauptsächlich in dimerer Form enthält. Mon entspricht dem Peak, welcher die monomere Form enthält. Dim entspricht dem Peak, der in dem zweiten Unterschritt der Umkehrphasenchromatographie auf RP Source 30-Harz eluiert worden ist. Es wird festgestellt, dass das exprimierte Protein vor der Renaturierung hauptsächlich in monomerer Form vorliegt. Nach der Renaturierung liegt ein Teil des Proteins in dimerer Form vor. Die folgende Aufreinigung mittels QFF und RF 30-Chromatographie ermöglichen die Gewinnung von PLGF-1-Protein mit hohem Reinheitsgrad.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die genetische Modifikation der bakteriellen Wirtszellen wird von Maglione et al. in dem vorhergehenden Patent EP-B-0550519 (WO-A-92/06194) beschrieben. Zu diesem Zweck transformiert man bakterielle Zellen, indem man einen Expressionsvektor einführt, der eine Insertion enthält, welche dem menschlichen Gen entspricht, das den PLGF-1 Faktor codiert. Die vollständige Gensequenz ist in der Literatur bekannt und ist frei zugänglich. Ein Plasmid, welches eine solche Sequenz enthält, wurde unter der Hinterlegungsnummer ATCC 40892 bei der ATCC hinterlegt. Die Expression wird unter der Kontrolle des Systems der RNA-Polymerase des T7-Phagen durchgeführt und wird mit IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) induziert.
Nichtsdestotrotz können andere induzierbare prokaryontische Expressionssysteme verwendet werden. Beispiele für solche Systeme, die auf dem Markt erhältlich sind, sind repräsentiert durch:

1) Das pBAD-Expressionssystem (Invitrogen BV), in dem die Synthese eines Proteins unter die Kontrolle des araBAD-Promotors gebracht ist und das in verschiedenen E. coli-Stämmen mittels Arabinose induziert werden kann.
2) Das T7-Expressionssystem (Invitrogen BV oder Promega), in dem die Synthese eines Proteins von dem Promotor der RNA-Polymerase des Phagen T7 kontrolliert wird und das mit Hilfe von Lactose oder Analoga davon (IPTG) induziert werden kann. In diesem Fall ist die Verwendung der E. coli-Derivate von DE3 (vom Typ BL21 (DE3) oder JM 109 (DE3)) notwendig, welche nämlich eine Kopie des RNA-Polymerase-Gens vom Phagen T7 enthalten, das unter der Kontrolle eines Lactose-induzierbaren Promotors steht.
3) Das Trc-Expressionssystem (Invitrogen BV), in dem die Synthese eines Proteins unter der Kontrolle des trc-Hybridpromotors steht. Ein solcher Promotor ist erhalten worden, indem man den trp-Promotor und den lac-Promotor miteinander verschmolzen hat, und er kann in verschiedenen Stämmen von E. coli mit Hilfe von Lactose oder Analoga davon (IPTG) induziert werden.
4) Das Tac-Expressionssystem (Amersham Biosciences), in dem die Synthese eines Proteins unter der Kontrolle des tac-Promotors steht. In diesem System wird die Synthese eines Proteins in Stämmen von E. coli lacIq (Typ JM 105) mit Hilfe von Lactose oder Analoga davon (IPTG) induziert.
5) Das P_L-Expressionssystem, in dem die Synthese eines Proteins unter der Kontrolle des P_L-Promotors steht und durch die Zugabe von Tryptophan induziert werden kann. In diesem Fall ist die Verwendung von E. coli-Derivaten (Gl724) notwendig, welche eine Kopie des Gens enthalten, welches den cl-Repressor des Phagen Lambda codiert, der unter der Kontrolle eines Tryptophaninduzierbaren Promotors steht.

Schritt I: Fermentation und Induktion
Der erste Schritt des beanspruchten Prozesses besteht aus der Fermentation eines funktionell modifizierten bakteriellen Stammes, welcher dem in dem vorhergehenden Europäischen Patent (vorstehend) beschriebenen gleichwertig ist. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Mikroorganismus um einen Abkömmling von E. coli, der mit einem Expressionsplasmid modifiziert worden ist, welches das menschliche PLGF-Gen umfasst. Ein bevorzugter Mikroorganismus ist der, der BL21(DE3)pLysS PLGF-1 genannt wird, welchen man erhält, indem man das menschliche PLGF-1-Gen in den im Handel erhältlichen Stamm BL-21(DE3) pLysS (Promega Corp., USA) integriert. Die vorliegende Erfindung ist nichtsdestotrotz nicht auf den menschlichen PLGF-1-Faktor beschränkt, sondern betrifft auch den tierischen Ursprungs (Affe, Maus, Kaninchen etc.). Die vorliegende Erfindung ist auch nicht so sehr auf die Verwendung eines E. coli-Abkömmlings beschränkt, sondern umfasst die Verwendung eines beliebigen prokaryontischen Mikroorganismus, der sich genetisch modifizieren lässt und in der Lage ist, heterologe Proteine in Form von Einschlusskörpern zu exprimieren.
Die Stämme, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren als Inokulum verwendet werden, werden vor ihrem Gebrauch in lyophilisierter Form aufbewahrt, um deren Expressionsfähigkeit zu konservieren. Bei Gebrauch wird das lyophilisierte Material wieder in Lösung gebracht, indem man einen geeigneten Puffer verwendet.
Obwohl es eine große Auswahl bekannter Kulturmedien gibt, die auf dem Markt verfügbar sind und die effektiv verwendet werden können, wird der Fermentationsschritt gemäß der Erfindung bevorzugt in einem Medium durchgeführt, das von jeglichem Material tierischen oder menschlichen Ursprungs frei ist, um jegliches Infektionsrisiko zu vermeiden. Hefeextrakte (Difco), zu denen ein oder mehrere geeignete Antibiotika hinzugefügt werden, stellen das am besten geeignete Mittel für den Prozess dar. In der bevorzugten Ausführungsform wird ein Medium verwendet, das erhalten worden ist, indem man unter sterilen Bedingungen eine erste Lösung (A), enthaltend Hefeextrakte, Glycerin und Ammoniumsulfat, mit einer zweiten Lösung (B) mischt, die Phosphatpuffer enthält. Das Gemisch wird dann mit Ampicillin und Chloramphenicol oder gleichwertigen Antibiotika kombiniert. Geeignete Antibiotika-Konzentrationen liegen in einem Bereich von 50 bis 300 μg/ml Ampicillin, bevorzugt 100 bis 200 μg/ml, und von 10 bis 100 μg/ml Chloramphenicol, bevorzugt 30 bis 40 μg/ml.
Dem Fermentationsschritt kann ein Vorinokulationsschritt vorangehen, in dem der lyophilisierte Mikroorganismus in dem Medium aufgenommen wird und aufeinander folgenden Inkubations- und Verdünnungsschritten unterzogen wird, welche darauf abzielen, die optimale Menge an Zellen des Mikroorganismus in Kultur zu haben. Bevorzugt wird der Mikroorganismus für eine Nacht bei 37°C inkubiert, dann verdünnt und wieder für einige Stunden inkubiert. Das gewählte Vorinokulationsvolumen wird anschließend zentrifugiert und wieder in der Kulturlösung aufgenommen, die mit Ampicillin angereichert ist, und für den Fermentationsschritt in das Fermentationsgefäß eingeimpft.
Die Fermentation wird in dem vorstehend erwähnten Medium, zu welchem Ampicillin und Chloramphenicol hinzugefügt worden sind, bei einer Temperatur, die für den Mikroorganismus geeignet ist, üblicherweise bei etwa 37°C, in Gegenwart von einem prozentualen Anteil an gelöstem O₂ im Verhältnis zur Sättigung mit Luft von 20% bis 40%, bevorzugt 30%, durchgeführt. Der pH-Wert während der Fermentation wird bei neutralen oder schwach sauren Werten gehalten (6,4 bis 7,4). Des Weiteren sollen bevorzugt Mittel gegen Schaumbildung eingesetzt werden, da der Fermentationsprozess unter Rühren stattfindet.
Der Fermentationsprozess wird von einem Anstieg in der optischen Dichte des Mediums begleitet. Aus diesem Grund ist die optische Dichte der Parameter, der gemäß der Erfindung verwendet wird, um den Fortschritt der Fermentation zu überwachen. Messungen bei 600 nm sind besonders geeignet.
Ein wesentliches Merkmal der Erfindung ist die hohe zelluläre Dichte, die in der Kultur zum Zeitpunkt der Induktion der Expression erreicht wird. Dank der Kulturmedien der Erfindung können optische Dichten bei 600 nm (OD₆₀₀) von 14 bis 50 erreicht werden. Nichtsdestotrotz sind Dichten von mehr als 18 bevorzugt, um die hohen Produktionsmengen zu erhalten, die für das beanspruchte Verfahren typisch sind. Dichten zwischen 16 und 20 sind besonders bevorzugt, um den produzierenden Bakterienstamm zu induzieren, und ergaben optimale Ergebnisse. Die Fermentation wird dann unter den vorstehend erwähnten Bedingungen gehalten, bis man solche Werte der optischen Dichte erreicht, dann geht man weiter, die Proteinexpression zu induzieren.
Man kann ein beliebiges Agens oder eine beliebige chemisch-physikalische Bedingung vorteilhafterweise dazu einsetzen, die Maschinerie der Expression des heterologen Proteins in den Zellen des verwendeten Mikroorganismus zu induzieren. In dem speziellen Fall, in dem der bakterielle Stamm BL21(DE3)pLysS verwendet wird, der mit einem Expressionsplasmid modifiziert ist, welches den Promotor des Phagen T7 enthält, wird die Expression mit Lactose oder mit den Derivaten davon wie z.B. mit Isopropyl-β-thiogalactosid (IPTG) in einer geeigneten Konzentration, nämlich etwa 1 mM, induziert. Die Dauer der Induktion kann je nach Bedarf variieren. Gute Ergebnisse werden für Zeiträume von einigen Stunden erhalten, bevorzugt 3 bis 4 Stunden; in dem optimalen Prozess wird die Induktion für 3 Stunden und 20 Minuten durchgeführt, wobei man einen prozentualen Anteil von gelöstem O₂ einsetzt, der bei etwa 10% liegt.
Zellproben werden vor und nach der Induktion entnommen und analytischen Kontrollverfahren wie SDS-PAGE-Elektrophorese unterzogen, um das Ergebnis der Induktion zu bestimmen.
Wenn die Proteinexpression die gewünschten Spiegel erreicht, wird die Kultur abzentrifugiert und die Zellen werden zu dem nächsten Schritt geführt.
Schritt II: Extraktion und Aufreinigung
Das exprimierte heterologe Protein in Bakterienstämmen ist innerhalb der Zelle selbst in Form von Einschlusskörpern abgesondert. Daher stellt das erfindungsgemäße Verfahren Passagen der Zelllyse, des Aufbrechens des extrahierten Nucleinsäurematerials (DNA) und der Gewinnung und des Waschens der Einschlusskörper bereit.
Die Zellen werden gewaschen, wenn das auch nicht unbedingt notwendig ist, und in Lösungen aufgenommen, die Emulgatoren in geeigneter Konzentration enthalten, bevorzugt Triton X-100 in Konzentrationen von 0,5% bis 1 %, dann werden sie einer Lyse der Zellmembran unterzogen. Der Prozess der Lyse kann mit Hilfe von Einfrieren/Auftauen, French Press, Ultraschallbehandlung oder anderen ähnlichen bekannten Verfahren durchgeführt werden. Nichtsdestotrotz ist das bevorzugte Verfahren für den Bakterienstamm BL21(DE3)pLysS die Einfrieren/Auftauen-Methode, welche in der am stärksten bevorzugten Ausführungsform mindestens für zwei aufeinander folgende Zyklen wiederholt wird. Nach der mechanischen Lyse wird der Lyse-Schritt für ein paar Minuten bei Raumtemperatur unter Rühren in der Lyse-Lösung fortgesetzt.
Die Freisetzung der Einschlusskörper in das Lyse-Medium wird begleitet von der Freisetzung von verschiedenen Bestandteilen und zellulären Stoffen des Mikroorganismus, vor allem von Nucleinsäurematerial. Diese Stoffe könnten den folgenden Proteinaufreinigungsprozess stören und gefährden. Aus diesem Grund wird die mittels Lyse erhaltene Suspension/Lösung einem Aufbrechen von solchem Nucleinsäurematerial, speziell DNA, mit Hilfe von enzymatischen Mitteln wie z.B. DNase (natürlichen oder rekombinanten wie z.B. die Benzonase), chemischen Mitteln wie z.B. Desoxycholsäure oder physikalisch-mechanischen Mitteln wie z.B. Ultraschallbehandlung oder Hochenergie-Rühren mit Hilfe von Flügelblättern, z.B. in einem Mischer unterzogen. Das Aufbrechen von DNA, das zum Beispiel in einem Mischer durchgeführt wird, wird an lysierten Zellen durchgeführt, die in geeigneten Volumina von Waschlösungen resuspendiert worden sind, welche Chelat-bildende Mittel oder Tenside enthalten, zum Beispiel EDTA und Triton X-100. Es wird bevorzugt für mehrere Zyklen, bevorzugt 2, abwechselnd mit Verdünnungsschritten in Waschlösung, Zentrifugation und Entfernen des Überstands wiederholt, um Bestandteile und zelluläre Stoffe von der Fraktion zu entfernen, die die Einschlusskörper enthält.
Schritt III: Renaturierung (Rückfaltung) des Proteins
Die Fraktion, die die gereinigten Einschlusskörper von PLGF-1 enthält, wird dann in einem denaturierenden Puffer solubilisiert, der bekannte Denaturierungsmittel wie z.B. Harnstoff, Guanidinisothiocyanat, Guanidinhydrochlorid enthält. Bevorzugt handelt es sich bei der Denaturierungslösung um eine Harnstofflösung in einer denaturierenden Konzentration, zum Beispiel 8 M. Um den Solubilisierungsprozess zu beschleunigen, kann man die Fraktion vorteilhafterweise einer Homogenisierung oder einer Ultraschallbehandlung unterziehen. Nach der Solubilisierung der Einschlusskörper wird die Lösung mit demselben Denaturierungspuffer verdünnt, bis man eine bei 280 nm gemessene optische Dichte von etwa 0,8 (OD₂₈₀ von 0,8) erreicht. Anschließend wird die Lösung weiter mit einem Verdünnungspuffer bis zu einer OD₂₈₀ von 0,5 verdünnt. Geeignete Verdünnungslösungen enthalten Salze und Polyethylenglycol (PEG) und weisen einen basischen pH-Wert auf (etwa 8). Die Renaturierung des PLGF-1-Proteins in verdünnter Lösung erhält man, indem man zu der Lösung geeignete Konzentrationen von Oxidations/Reduktionspaaren hinzufügt, gefolgt von einer Inkubation unter Rühren für 10 bis 30 Stunden, bevorzugt 18 bis 20, bei einer Temperatur von 10°C bis 30°C, bevorzugt 20°C. Beispiele solcher Paare sind: Cystin/Cystein, Cystamin/Cysteamin, 2-Hydroxyethyldisulfid/2-Mercaptoethanol. Ein bevorzugtes Beispiel für ein Oxidations/Reduktionspaar ist das Glutathion in seiner oxidierten bzw. reduzierten Form in Konzentrationen zwischen 0,1 mM und 2,5 mM (bevorzugt 0,5 mM) und zwischen 0,25 mM und 6,25 mM (bevorzugt 1,25 mM). Durch die Renaturierung wird das im Wesentlichen in monomerer Form exprimierte PLGF-1-Protein teilweise in die dimere Form zurückgebracht (5).
Schritt IV: Anionenaustauschchromatographie
Die aus dem vorhergehenden Schritt, bevorzugt durch Zentrifugation und/oder Filtration hervorgehende Lösung, welche das Protein hauptsächlich in monomerer Form und teilweise in dimerer Form enthält, wird auf ein Anionenaustausch-Harz aufgetragen, um das Gemisch mit der dimeren Form anzureichern und um es von bakteriellen Verunreinigungen zu reinigen. Jede beliebige, im Handel erhältliche Matrix, welche sich für Anionenaustauschchromatographie eignet, kann ebenfalls in dem Maß eingesetzt werden, wie. deren Eigenschaften bezüglich der Kapazität, der Beladung und der Fließgeschwindigkeit ähnlich denjenigen des Q-Sepharose Fast Flow-Harzes (Amersham Biosciences) sind, abgesehen davon, dass sie sich für einen industriellen Prozess eignen sollte. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Harz mit hoher Flussrate eingesetzt, zum Beispiel Q-Sepharose Fast Flow (Amersham), oder ein gleichwertiges Harz. Das Harz wird gewaschen und mit Lösungen äquilibriert, welche eine geringe Ionenstärke aufweisen. Ein Beispiel für eine solche Lösung umfasst Ethanolamin-HCl pH 8,5 mit geringem oder nicht vorhandenem Salzgehalt. Man kann dieselbe Lösung für das Beladen, die Bindung und das Waschen des aufzureinigenden Proteingemisches verwenden. Die verwendeten Harze erlauben das Beladen mit großen Volumina an Proteinlösung mit einem Verhältnis von Ladevolumen zu Säulenvolumen, das von 1:1 bis 10:1 variiert. Vol. zu Vol.-Verhältnisse in der Nähe von 10:1 werden bevorzugt, da diese eine optimale Nutzung der Säule erlauben. Verhältnisse höher als 10:1 sollten jedoch vermieden werden, da diese auf Grund der Sättigung der Adsorptionskapazität der Matrix zu einem hohen Verlust der dimeren Form des Proteins führen.
Während das PLGF-1-Protein in monomerer Form bereits in den Waschschritten mit geringer Ionenstärke durchfließt, erhält man die Elution der dimeren und der multimeren Formen durch Erhöhen der Ionenstärke der Ausgangslösung. Eine solche Erhöhung erhält man, indem man die Äquilibrierungslösung mit steigenden und zuvor ausgetesteten prozentualen Anteilen einer zweiten Lösung mischt, die 1 M NaCl enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Protein in dimerer Form mit Lösungen eluiert, die zwischen 15% und 25% der 1 M NaCl-Lösung enthalten, was einer NaCl-Konzentration von 150 bis 250 mM entspricht. In der besten Ausführungsform wird das Protein unter isokratischen Bedingungen bei NaCl-Konzentrationen von 200 mM eluiert. Die Elution der verschiedenen Formen wird automatisch verfolgt, indem die optische Extinktion bei 280 nm gemessen wird (2). Die gesammelten Fraktionen, die das PLGF-1-Protein in dimerer Form enthalten, werden anschließend durch SDS-PAGE-Elektrophorese überprüft (5). Vorteilhafterweise wird der gesamte chromatographische Prozess automatisch mit einem computerisierten System durchgeführt, das unter der Steuerung eines geeigneten Programms arbeitet, zum Beispiel des Software FPLC Director-Systems (Amersham Biosciences).
Schritt V: Umkehrphasenchromatographie
Die aus dem vorhergehenden Schritt hervorgehenden Fraktionen, die das PLGF-1-Protein enthalten, das mit den aktiven Formen angereichert ist, werden gesammelt, mit geeignetem Puffer verdünnt und auf eine Umkehrphasenchromatographie-Säule geladen, um das Protein in der aktiven Form weiter aufzureinigen. Die Menge der aufgetragenen Lösung entspricht einer OD₂₈₀ zwischen 4,5 und 5,5 pro Milliliter der chromatographischen Matrix. Derartige Mengen sollten als Maximalmengen angesehen werden.
Man kann jede beliebige im Handel erhältliche chromatographische Matrix, die für den beabsichtigten Zweck geeignet ist, verwenden, solange deren Eigenschaften in Bezug auf die Ladekapazität und die Flussgeschwindigkeit mit den Prozesserfordernissen kompatibel sind. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Harz verwendet, das solche Partikelgrößen aufweist, dass die beste Ausnutzung der Bindekapazität zusammen mit der Einfachheit der Packung der Säule selbst gewährleistet ist. Beispiele für solche Matrices sind die Harze RP Source 15 oder RP Source 30 (Amersham Biosciences). Alle Lösungen für die Äquilibrierung, die Beladung, das Waschen des Harzes und die Elution sind hydro-organische Lösungen, die unterschiedliche prozentuale Anteile von organischen Lösungsmitteln enthalten. Beispiele für solche Lösungen sind Lösungen, die Ethanol, Methanol oder Acetonitril enthalten. Bevorzugt werden hydro-alkoholische Lösungen eingesetzt, die steigende prozentuale Anteile von Ethanol enthalten. In einer Ausführungsform der Erfindung werden zweckdienliche Mengen von zwei Pufferlösungen gemischt, wobei die erstere Puffer A, d.h. 40% Ethanol und 0,1% TFA (Trifluoressigsäure), der letztere Puffer B, d.h. 70% Ethanol und 0,1 % TFA, umfasst.
Das auf das Harz aufgetragene und ordentlich gewaschene Proteinmaterial wird dann durch einen Elutionsprozess eluiert, der zwei aufeinander folgende Schritte umfasst, in denen Elutionslösungen verwendet werden, die einen ansteigenden Gradienten an organischem Lösungsmittel enthalten. Der erste Schritt wird unter Bedingungen eines ansteigenden Gradienten von organischem Lösungsmittel durchgeführt, bis man den Elutionspeak der monomeren Form erhält. Einen solchen Gradienten erhält man, indem man den Puffer B in prozentualen Anteilen von 4% bis 40% zu dem Puffer A hinzufügt, mit einem um 3% steigenden Anteil von Puffer B für jedes eluierte Säulenvolumen. Sobald der Elutionspeak erscheint, der der monomeren Form des Proteins entspricht, wird die Elution unter isokratischen Bedingungen fortgeführt, bis der Elutionspeak der monomeren Form erschöpft ist. Die so gesetzten isokratischen Bedingungen bewirken die größtmögliche Trennung der chromatographischen Peaks, die der monomeren und der dimeren Form entsprechen, und somit der besten Auflösung, die sich für einen industriellen und nicht analytischen Prozess erhalten lässt. Der zweite Schritt wird wiederum unter Bedingungen eines ansteigenden Gradienten von organischem Lösungsmittel durchgeführt, bis eine vollständige Elution des Proteins hauptsächlich in dimerer Form erreicht ist. In diesem zweiten Schritt erhält man den Gradienten, indem man den Puffer B in prozentualen Anteilen von 10% bis 100% zu dem Puffer A hinzufügt, wobei der Anteil von Puffer B um 40,9% für jedes eluierte Säulenvolumen zunimmt. Die Elution der verschiedenen Formen des PLGF-1-Proteins wird automatisch überwacht, indem die optische Extinktion bei 280 nm gemessen wird (3 und 4). Die gesammelten Fraktionen, die das PLGF-1-Protein in im Wesentlichen dimerer Form enthalten, werden anschließend durch SDS-PAGE-Elektrophorese (5) überprüft. Vorteilhafterweise wird der gesamte Umkehrphasenchromatographie-Prozess automatisch mit Hilfe eines computerisierten Systems durchgeführt, das unter der Steuerung eines geeigneten Programms arbeitet, zum Beispiel des Software FPLC Director-Systems (Amersham Biosciences).
Die Ergebnisse der Elektrophorese zeigen, dass das aus dem zweiten Schritt der Umkehrphasenchromatographie erhaltene PLGF-1-Protein in hochreiner aktiver Form vorliegt, d.h. es umfasst das Protein in dimerer und teilweise in multimerer Form, aber es ist im Wesentlichen frei von jeglicher Kontamination mit der monomeren Form. Das so erhaltene Produkt umfasst nicht weniger als 98,5% der aktiven Form, bevorzugt nicht weniger als 99,5%, wobei nicht weniger als 70% in der dimeren Form vorliegen. Die verbleibende monomere Form liegt in einem prozentualen Anteil von nicht mehr als 1,5% vor. Man erhält das Protein in der aktiven Form in durchschnittlichen Mengen von 160 mg pro Liter Bakterienkultur. Das reine Protein, das gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren erhalten wurde, kann zusätzlichen Aufarbeitungsschritten unterzogen werden, wie z.B. einer Ultrafiltration auf einer Membran. In diesem Fall wird das Produkt auf einer Membran gefiltert, die eine Ausschlussgrenze von 30 kD oder weniger aufweist, und es wird einer Diafiltration gegen mit TFA angesäuertes Wasser unterzogen, bis zu einem Verdünnungsfaktor von 1:106. Das so erhaltene Endprodukt kann mit Lyophilisierungszusätzen ordnungsgemäß formuliert und lyophilisiert werden, um seine beste biologische Aktivität zu erhalten.
Die Erfindung wird hier nachstehend anhand von Beispielen beschrieben, die jedoch nur der Veranschaulichung dienen und nicht als Beschränkung zu verstehen sind.
Beispiel 1: Fermentation

Die folgende Prozedur betrifft das Fermentationsverfahren und die Induktion des genetisch modifizierten Mikroorganismus (MOGM) [BL21(DE3)pLysS PLGF-1] in einem Fermentationsgefäß, wobei 1 mM IPTG eingesetzt wird. Materialien:

SBM-Lösung zusammengesetzt aus:
Lösung A (pro 1 Liter)
Bacto Hefe-Extrakt (Difco)	34 g
Ammoniumsulfat	2,5 g
Glycerin	100 ml
H₂O	auffüllen auf 900 ml
Lösung B (10 x) (pro 100 ml)
KH₂PO₄	1,7 g
K₂HPO₄-3H₂O	20 g oder
K₂HPO₄	15,26 g
H₂O	auffüllen auf 100 ml

Die Lösungen A und B werden getrennt autoklaviert und bei Gebrauch unter sterilen Bedingungen gemischt. Alternativ werden die Lösungen A und B gemischt und unter sterilen Bedingungen gefiltert.
200 mM IPTG (200 x) wird hergestellt, indem 5 g der reinen Substanz in 100 ml destilliertem Wasser gelöst werden. Die Lösung wird mit Hilfe eines 0,22 μm-Filters gefiltert, in Aliquots aufgeteilt und bei –20°C eingefroren.
Bei dem verwendeten Antischäumungsmittel handelt es sich um Antifoam O-10 (kein Silikon), Sigma Katalog-Nr. A-8207.
Der verwendete Bakterienstamm ist [BL21 pLysS PLGF-1 WCB] (Arbeits-Zellbank).
Vorinokulum:
Ein Röhrchen von lyophilisiertem genetisch modifiziertem Mikroorganismus (MOGM) WCB wird genommen und in 1 ml SBM + 100 μg/ml Ampicillin + 34 μg/ml Chloramphenicol suspendiert.
Die Suspension wird in 30 ml SBM + 100 μg/ml Ampicillin + 34 μg/ml Chloramphenicol verdünnt.
Die Suspension wird für eine Nacht (ÜN) bei 37°C inkubiert. Am Tag danach werden die 30 ml der ÜN-Kultur in 800 ml SBM + 100 μg/ml Ampicillin + 34 μg/ml Chloramphenicol verdünnt und in 4 1-Liter-Erlenmayerkolben aufgeteilt, von denen jeder 200 ml enthält.
Der Inhalt eines jeden Kolbens wird für 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Der Inhalt der 4 Kolben wird gemischt und die OD₆₀₀ wird gemessen, indem man 1/20 in Wasser verdünnt (50 μl + 950 μl Wasser).
Ein vorher bestimmtes Volumen des Vorinokulums wird dann für 10 Minuten bei 7.500 × g und 4° C in sterilen Röhrchen abzentrifugiert.
Die Bakterien werden dann in 20 ml SBM + 200 μg/ml Ampicillin + 10 μg/ml Chloramphenicol pro Liter der Fermentation resuspendiert, indem man für 20 Minuten bei RT und 420 UpM rührt. Zur gleichen Zeit wird das Fermentationsgefäß vorbereitet und die Sauerstoffsonden werden kalibriert.
Die Sauerstoffsonden werden bei einer Temperatur von 37°C bei 0% mit Stickstoff, dann bei 100% mit Luft ohne Antischäumungsmittel unter Rühren bei 600 UpM kalibriert.

Die Fermentation wird unter den folgenden experimentellen Bedingungen durchgeführt:

Medium:	SBM + 200 μg/ml Ampicillin und 10 μg/ml Chloramphenicol.
Temperatur:	37°C
% gelöstes O₂:	30% (bezogen auf die Sättigung mit Luft)
pH:	von 6,4 bis 7,4
Antischäumungsmittel:	1:10, wird mit Wasser verdünnt; wobei stark gerührt wird, bevor es in Mengen von 140 μl pro 750 ml Medium hinzugefügt wird.

Induktion:
Die Induktion wird unter den folgenden experimentellen Bedingungen durchgeführt:

OD₆₀₀ bei Induktion: 16–20

Induktionsmittel: IPTG, Endkonzentration 1 mM

% gelöstes O₂: 10% (bezogen auf die Sättigung mit Luft)

Induktionsdauer: 3 Stunden und 20 Minuten
Unmittelbar vor der Induktion werden 20 μl Bakterien entnommen, zu 80 μl Wasser hinzugegeben und für die Präinduktions-Kontrolle aufbewahrt.
Zum Zeitpunkt der Induktion wird IPTG in einer Endkonzentration von 1 mM hinzugefügt.
Der prozentuale Anteil an gelöstem O₂ wird auf 10% gebracht.
Am Ende der Induktion wird die finale OD₆₀₀ abgelesen und das Gesamtvolumen wird gemessen.
Dann werden 10 μl Bakterien entnommen, zu 90 μl Wasser hinzugegeben und für die Postinduktions-Kontrolle aufbewahrt.
Die Induktion wird mit Hilfe einer SDS-PAGE-Elektrophorese überprüft, indem 20 μl der zwei zuvor gekochten Proben aufgetragen werden.
Das Medium, das die induzierten Bakterien enthält, wird dann bei 7.500 × g für 10 min oder bei 3.000 × g für 25 min bei 4°C abzentrifugiert und der Überstand wird verworfen.
Ergebnisse:
Die Ergebnisse der Induktion werden, wie in 1 gezeigt, mittels SDS-PAGE-Elektrophorese überprüft.
Beispiel 2: Extraktion und Aufreinigung der Einschlusskörper.

Die folgende Prozedur betrifft die Herstellung und die Rückfaltung der Einschlusskörper von PLGF-1. Mit Hilfe der Rückfaltung wird das bakterielle PLGF-1-Protein teilweise in die dimere Form zurückgebracht. Material:

Mischer mit entsprechender Kapazität
Lyse-Lösung:	1 mM Mg₂SO₄ + 20 mM Tris-HCl, pH 8 + 1 % Triton X – 100
Waschlösung:	0,5 % Triton X – 100 + 10 mM EDTA, pH 8.
BD (Denaturierungspuffer):	8 M Harnstoff, 50 mM Tris, pH 8, 20 mM Ethylendiamin.
Lösen und mit H₂O auf das Volumen bringen.
200 × oxidiertes Glutathion:	100 mM in H₂O.
200 × reduziertes Glutathion:	250 mM in H₂O.
Verdünnungspuffer:	600 μM Endkonz. PEG 4000 (2,4 g/l), 50 mM Tris-HCl, pH 8, 20 mM NaCl.
Antischäumungsmittel:	Antifoam O-10 (kein Silikon) Sigma.

Herstellung der PLGF-1-Einschlusskörper.
Die Lyse- und Waschlösungen werden bei Raumtemperatur (RT) äquilibriert. Es werden zwei Einfrier/Auftau-Zyklen bei –80°C/37°C durchgeführt.
Das bakterielle Pellet wird in 1 ml Lyse-Lösung pro jeweils 450 OD₆₀₀ an Bakterien lysiert.
Es wird dann für 30 min bei RT unter Rühren (250 UpM) inkubiert.
Die Lösung wird in einen Mischer mit entsprechender Kapazität geschüttet und eine Menge von 3 ml Waschlösung pro jeweils 450 OD₆₀₀ an Bakterien wird hinzugefügt.
Gegebenenfalls werden 0,4 μl unverdünntes Antischäumungsmittel für jeden Milliliter Probe hinzugefügt.
Die Lösung wird bei maximaler Geschwindigkeit für 1 Minute zentrifugiert oder bis die Probe völlig homogen ist.
Der Inhalt des Mischers wird dann in einen Behälter mit entsprechender Kapazität überführt und es werden 6,5 ml Waschlösung pro jeweils 450 OD₆₀₀ an Bakterien hinzugegeben. Er wird für 45 min bei RT unter Rühren inkubiert.
Die so erhaltene Suspension wird für 45 min bei 13.000 × g und 25°C zentrifugiert und der Überstand wird verworfen.
Das abgesetzte Pellet wird in 4 ml Waschlösung pro jeweils 450 OD₆₀₀ an Bakterien resuspendiert und der Zyklus in dem Mischer ein zweites Mal wiederholt. Die Suspension wird in einen Behälter mit entsprechender Kapazität überführt, mit 6,5 ml Waschlösung pro jeweils 450 OD₆₀₀ verdünnt und für 30 min bei RT unter Rühren inkubiert.
Die Zentrifugation unter den vorstehend dargestellten Bedingungen wird dann wiederholt und der Überstand wird verworfen.
Beispiel 3: Renaturierung des Proteins
Die Einschlusskörper werden in 7 ml Denaturierungspuffer BD (enthält 8 M Harnstoff) solubilisiert und bis zu einer OD₂₈₀ von 0,8 weiter in BD verdünnt. Anschließend werden 0,6 Volumina Verdünnungspuffer zugegeben, um die Endkonzentration an Harnstoff auf 5 M zu bringen.
Danach werden 1/200 reduziertes Glutathion (200 ×, Endkonzentration 1,25 mM) und 1/200 oxidiertes Glutathion (200 ×, Endkonzentration 0,5 mM) hinzugegeben. Es wird eine 15 μl-Kontrollprobe (prerefol) entnommen und die Lösung wird dann für 18–20 Stunden bei 20°C unter Rühren inkubiert.
Am Ende der Inkubation wird das Medium für 10 min bei 20°C, 10.000 × g abzentrifugiert, mit Hilfe eines 0,45 oder 0,8 μm-Filters filtriert und es wird eine 15 μl Kontrollprobe entnommen (postrefol).
Ergebnisse: Die 15 μl-Kontrollproben der Prä- und Post-Rückfaltungslösung werden mit Hilfe einer SDS-PAGE-Elektrophorese überprüft (5).
Beispiel 4: Anionenaustauschchromatographie
Die folgende Prozedur betrifft den ersten Schritt der Aufreinigung des PLGF-1 Proteins nach der Rückfaltung. Nach dem Laden der Probe auf die Säule wird es einen hohen Verlust von nicht adsorbiertem PLGF-1-Monomer geben. Die geladene Menge darf nicht über dem 10-fachen des Säulenvolumens liegen, weil dies einen erheblichen Verlust an PLGF-1-Dimer nach sich ziehen würde.
Die Elution wird unter isokratischen Bedingungen bei 20% Puffer B durchgeführt (siehe nachstehend), was einer NaCl-Konzentration von 200 mM entspricht.

Der eluierte Peak enthält noch die für die Rückfaltung verwendeten Glutathione, die etwa 50% zur OD₂₈₀ beitragen.

Material und Parameter:
FPLC-System:	Amersham Biosciences, gesteuert von der FPLC Director genannten Software.
Überwachungsparameter:
U.V.:	Wellenlänge = 280 nm; Skalenmaximalwert = 2.
Temperatur:	20°C (Minimum 15, Maximum 25)
Harz:	Q-Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences)
Säulenvolumen/-höhe:	Volumen: 1/10 des Volumens der zu ladenden Probe; Höhe: zwischen 13 und 16 cm.
Äquilibrierung:	2 Säulenvolumina (CV) Puffer B, dann 1,5 CV Puffer A.
Probe:	Renaturiertes, zentrifugiertes und/oder filtriertes PLGF-1. Davon nicht mehr als 10 CV laden.
Puffer A:	20 mM Ethanolamin-HCl, pH 8,5
Puffer B:	Puffer A + 1 M NaCl.
Injektionsgeschwindigkeit:	1 cm/min (auf kleinen Säulen getestete Maximalgeschwindigkeit = 1,887 cm/min; minimale getestete Geschwindigkeit = 0,5 cm/min).
Elutionsgeschwindigkeit:	1 cm/min (auf kleinen Säulen getestete Maximalgeschwindigkeit = 1,887 cm/min; minimale getestete Geschwindigkeit = 0,5 cm/min).
Waschvorgänge nach der Injektion:	1,5 CV mit 0% Puffer B.
Gesammelter Peak:	Der unter isokratischen Bedingungen bei 20% Puffer B eluierte Peak, laufend für etwa 3 CV.
Finaler Waschvorgang:	2 CV bei 100% B.

Prozedur:
Der unter isokratischen Bedingungen bei 20% Puffer B eluierte Peak wird gesammelt, dann werden dazu 0,271 Volumina Wasser, 0,0045 Volumina TFA und 0,225 Volumina Ethanol hinzugegeben. Auf diese Weise wird die Probe im Endergebnis 1,5 Mal verdünnt und enthält 15% Ethanol und 0,3% TFA. Die Zugabe dieser zwei Stoffe erleichtert die Bindung von PLGF-1 an das Umkehrphasen-Harz (siehe Beispiel 5).
Ergebnisse:
Der Chromatographie-Schritt wird fortlaufend überwacht, indem die optische Dichte bei 280 nm, wie in 2 dargestellt, verfolgt wird.
Die Reinheit des isolierten Proteinmaterials wird mit Hilfe von SDS-PAGE-Elektrophorese untersucht (5).
Beispiel 5: Umkehrphasenchromatographie
Die folgende Prozedur kann mit RP Source-Harz mit einer durchschnittlichen Partikelgröße von 15 Mikron oder 30 Mikron durchgeführt werden. Das 30 Mikron-RP Source-Harz erlaubt jedoch, obgleich es keine Änderung in dem Aufreinigungsprozess beinhaltet, eine ökonomische Ersparnis des Harzes selbst (etwa 50%), eine größere Leichtigkeit in der Packprozedur der Säule und einen geringeren Gegendruck.

Die Prozedur betrifft den zweiten Schritt der Aufreinigung des PLGF-1-Proteins nach dem Lauf über das QFF-Harz. Während der Injektion der Probe ist eine hohe Absorption zu sehen und diese entspricht dem nicht adsorbierten Peak der Glutathione, die nicht an das Harz binden. Diese Prozedur besteht aus zwei Unterschritten, wobei der erste, RPCmon genannte, dazu verwendet wird, den Großteil des monomeren Bestandteils von PLGF-1 zu beseitigen, wohingegen der letztere, RPCdim genannte, dazu verwendet wird, den im Wesentlichen dimeren Bestandteil des Proteins zu eluieren.

Erster Unterschritt (RPCmon)
Material und Parameter:
FPLC-System:	Amersham Biosciences, gesteuert von der FPLC Director genannten Software.
Überwachungsparameter:
U.V.:	Wellenlänge = 280 nm; Skalenmaximalwert = 0,05.
Temperatur:	20°C (Minimum 15, Maximum 25)
Harz:	Umkehr-Source 30 (Amersham Biosciences)
Säulenvolumen/-höhe:	Volumen: 1/5 – 1/6 der Gesamt-OD₂₈₀ der zu ladenden Probe; Höhe: zwischen 27 und 33 cm.
Äquilibrierung:	2 Säulenvolumina (CV) Puffer B, dann 2 CV Puffer A.
Probe:	Aus dem vorhergehenden Schritt (Beispiel 4) kommender PLGF-1, der 1,5 Mal verdünnt ist und 15% Ethanol und 0,3% TFA enthält. Maximale Beladung 4,5 bis 5,5 OD₂₈₀ pro ml Harz.
Puffer A:	40% Ethanol + 0,1 % TFA
Puffer B:	70% Ethanol + 0,1 % TFA
Injektionsgeschwindigkeit:	1,887 cm/min
Elutionsgeschwindigkeit:	1,887 cm/min
Waschvorgänge nach der Injektion:	1,5 CV mit 4% Puffer B.

Monomer-Peak:
Ein Gradient, der von 4 bis 40% B reicht, in 12 CV (3% B/CV) Unmittelbar nach dem Beginn der Elution des Peaks, bei Erreichen einer OD₂₈₀ von 25% des Maximalwerts der Skala, wird die Elution unter isokratischen Bedingungen fortgesetzt, mit der Konzentration von Puffer B, die in diesem Moment erreicht ist, bis die Elution des Peaks vollständig ist (etwa 2,5–3,5 CV).
Ablauf
Eine geeignete Menge der Lösung, die dem „Monomer"-Peak entspricht, wird entnommen und für die Kontrolle aufkonzentriert (mon in 5)
Zweiter Unterschritt (RPCdim)
Material und Parameter:
Ohne die Säule zu reäquilibrieren, sondern einfach durch Verschieben des Skalenbereichs des UV-Monitors auf den Wert 2, wird in 2,2 CV ein Gradient gefahren, der von 10% bis 100% Puffer B reicht (40,9% B/CV).
Ablauf:
Die Fraktionen, die dem „Dimer"-Peak entsprechen, werden entnommen. 4 veranschaulicht ein Beispiel davon. Diese werden gesammelt, und das Volumen und die optische Dichte bei 280 nm werden gemessen.
Die Gesamtausbeute (ausgedrückt in mg), die vor der Lyophilisierung erhalten wird, wird berechnet, indem man die OD₂₈₀ mit dem Volumen und der Verdünnung malnimmt. Der durchschnittliche Wert einer solchen Ausbeute beträgt 164 mg reines PLGF-1 pro Liter Bakterienkultur mit einer Standardabweichung von 23,21. Sie kann auch in mg pro 1000 OD₆₀₀ an fermentierten Bakterien ausgedrückt werden, was 5,58 mg reinem PLGF-1 pro 1000 OD₆₀₀ an fermentierten Bakterien ergibt, mit einer Standardabweichung von 0,8.
Die so erhaltene Dimerlösung wird bis zur Ultradiafiltration und Lyophilisierung bei –20°C aufbewahrt. Eine Probe einer solchen Lösung wird einer SDS-PAGE-Elektrophorese unterzogen, wie in 5 veranschaulicht.

Claims

Verfahren zum Extrahieren und Aufreinigen von rekombinantem plazentarem Wachstumsfaktor (PLGF) in dimerer und multimerer aktiver Form, die nicht mehr als 1,5% der monomeren Form enthält, durch Expression in einem induzierbareni Expressionssystem in modifizierten prokaryontischen Zellen, umfassend die folgenden Schritte: I) Fermentation der prokaryontischen Zellen, II) Extraktion und Aufreinigung der Einschlusskörper, III) Renaturierung des exprimierten Proteins, IV) Ionenaustauschchromatographie, V) Reversphasenchromatographie, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt (I) durchgeführt wird, bis eine optische Dichte des Kulturmediums von 14 bis 50 bei 600 nm (OD⁶⁰⁰ 14–50) erhalten wird, gefolgt von Induktion, dass Schritt (II) Lyse der Kulturzellen, Zerstören der DNA und Isolieren der Einschlusskörper umfasst, dass in Schritt (III) die Einschlusskörper in denaturierendem Puffer solubilisiert werden und das exprimierte Protein zumindest teilweise zurück in die dimere Form gebracht wird, dass in Schritt (IV) die dimeren und multimeren Formen des exprimierten Proteins von der monomeren Form durch Anionenaustauschchromatographie abgetrennt werden, dass in Schritt (V) die dimeren und multimeren Formen des exprimierten Proteins weiter von der monomeren Form durch Reversphasenchromatographie mit zwei aufeinander folgenden Elutionsschritten mit ansteigendem Gradienten von organischem Lösungsmittel abgetrennt werden, die durch einen Elutionsschritt unter isokratischen Bedingungen getrennt sind, und letztendlich isoliert werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der plazentare Wachstumsfaktor (PLGF) menschlicher PLGF-1 oder tierischen Ursprungs ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die prokaryontischen Zellen bakterielle Zellen sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt I in einem Medium durchgeführt wird, das es erlaubt, eine hohe Dichte der Bakterien im Fermentationsschritt zu erreichen, und das frei ist von jeglichem Material tierischen oder menschlichen Ursprungs.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt I in einem Medium durchgeführt wird, das eines oder mehrere Selektionsagenzien, Hefeextrakt, Glycerol und Ammoniumsalze enthält.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das induzierbare Expressionssystem das T7-Expressionssystem ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Bakterienzellen ein von E. coli abgeleiteter Stamm sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Bakterienstamm E. coli {B121(DE3)pLysS} ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression mit Hilfe von Lactose, Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) oder funktionell äquivalenter Analoga induziert wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die optische Dichte der Kultur zur Zeit der Induktion 14 bis 30 OD bei 600 nm (14–30 OD⁶⁰⁰), vorzugsweise 16 bis 20 (16–20 OD⁶⁰⁰) ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt I einen vorausgehenden Schritt der Vorinokulation umfasst.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt II die Zelllyse mit Hilfe von Gefrieren/Auftauen, French Press oder anderen äquivalenten Techniken durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt II die DNA-Zerstörung mit Hilfe von aus Extraktion oder rekombinantem Ursprung erhaltener DNAse durchgeführt wird, vorzugsweise durch die Benzonase, oder durch chemisch-mechanische Einwirkung.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt II die DNA-Zerstörung mit Hilfe eines Mischers durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt II die Einschlusskörper durch mindestens zwei Zyklen aus Zentrifugation und Waschen in einen geeigneten Puffer isoliert werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt III die Einschlusskörper in denaturierendem Puffer solubilisiert werden, der Harnstoff, Guanidinisothiocyanat, Guanidinhydrochlorid oder ein beliebiges anderes Denaturierungsmittel enthält, und danach gegebenenfalls homogenisiert oder mit Ultraschall behandelt werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt III nach der Solubilisierung der Einschlusskörper die Lösung verdünnt wird und das Proteinmaterial durch Hinzufügen von oxidierenden/reduzierenden Agenzien zur Lösung und durch Inkubation für 10 bis 30 Stunden, vorzugsweise 18 bis 20 Stunden, bei einer Temperatur von 10 bis 30°C, vorzugsweise 20°C, unter Rühren renaturiert wird.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung verdünnt wird, bis eine optische Dichte bei 280 nm (OD²⁸⁰) von 0,01 bis 2, vorzugsweise 0,5, erhalten wird, dass die oxidierenden/reduzierenden Agenzien oxidiertes und reduziertes Glutathion in solchen Verhältnissen und Konzentrationen sind, dass dies die maximale Bildung der dimeren Form erlaubt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt IV die aus dem vorhergehenden Schritt kommende Lösung auf eine Anionenaustauschersäule geladen wird mit einem Verhältnis geladenes Volumen/Säulenvolumen von 1:1 bis 10:1.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis geladenes Volumen/Säulenvolumen 10:1 ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein mit Ethanolamin-HCl, NaCl-Puffer eluiert wird, und dass das Protein in monomerer Form hauptsächlich in den Fraktionen enthalten ist, die das Material enthalten, das nicht an das Harz gebunden hat, wohingegen das Protein in dimerer Form hauptsächlich in den nachfolgenden Fraktionen enthalten ist, die bei einer NaCl-Konzentration von 150 bis 250 mM eluiert werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt V die im vorhergehenden Schritt bei einer NaCl-Konzentration von 150 bis 250 mM eluierte Lösung verdünnt und auf eine Reversphasenchromatographiesäule geladen wird, in einer Menge, die einer optischen Dichte von 4,5 bis 5,5 OD bei 280 nm pro ml Harz entspricht.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 22, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Elutionsstufe unter Bedingungen eines ansteigenden Gradienten von organischem Lösungsmittel durchgeführt wird, bis der Elutionspeak der monomeren Form erscheint, es unter isokratischen Bedingungen fortgesetzt wird, bis der Elutionspeak der monomeren Form erschöpft ist, und dass die zweite Stufe unter Bedingungen eines ansteigenden Gradienten von organischem Lösungsmittel bis zur vollständigen Elution des Proteins in hauptsächlich dimerer Form durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass der Elutionspuffer Ethanol, Methanol oder Acetonitril enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass der Elutionspuffer eine hydroalkoholische Lösung ist, die ansteigende prozentuale Anteile an Ethanol enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Reversphasenchromatographie an einem Harz mit Partikeln mit 30 Mikron mittleren Durchmessers durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend einen zusätzlichen Ultrafiltrationsschritt gefolgt von Lyophilisierung in Anwesenheit oder Abwesenheit geeigneter Additive.
Plazentarer Wachstumsfaktor in aktiver Form, erhältlich mit Hilfe des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass er frei von Kontaminationen des Wirtsstamms ist und dass er die monomere Form in einem prozentualen Anteil von nicht höher als 1,5% enthält und dass er hauptsächlich in dimerer und multimerer Form vorliegt.