DE3704868C2

DE3704868C2 - Reinigung von rekombinantem Human-Interleukin-1

Info

Publication number: DE3704868C2
Application number: DE3704868A
Authority: DE
Inventors: Alvin Seth Stern
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1986-02-18
Filing date: 1987-02-16
Publication date: 1995-09-21
Anticipated expiration: 2007-02-17
Also published as: FR2595714B1; BE1000636A5; GB8703663D0; JP2590085B2; DK77387D0; NL8700397A; US5831022A; IT8719420A0; DK171419B1; GB2186580B; GB2186580A; DK77387A; FR2595714A1; CH676008A5; JPS62209097A; DE3704868A1; IT1202565B

Description

Zwei Gene, welche für die α- und die β-Form von Human -Interleukin-1 codieren, sind in der Literatur beschrieben, so z. B. von March et al., Nature 315, 641-647 (1985). Die europäische Patent-Anmeldung, Publikations-Nr. 200.986, publiziert am 12. November 1986, mit den Erfindern Gubler et al., beschreibt die Klonierung und Expression von rekombi nantem Human-Interleukin-1, d. h. einem Human-Interleukin-1, das mikrobiell hergestellt wurde. Beim darin beschriebenen Reinigungsverfahren ist ein Problem aufgrund der Unlöslich keit dieses Proteins innerhalb der bakteriellen Wirtszellen erkennbar. Es wird angenommen, daß dieses Problem zurückzu führen ist auf die Produktion großer Mengen von Protein in einer Umgebung, die anscheinend für die richtige Faltung des Proteins nicht geeignet ist. Die Probleme bei der Faltung des Proteins manifestieren sich in der Bildung von Ein schlüssen innerhalb der Bakterien. Diese Einschlußkörper (inclusion bodies) konnten nur in stark denaturierenden Agenzien wie Harnstoff und Guanidin-Hydrochlorid aufgelöst werden.

Die Reinigungsverfahren, bei denen diese stark dena turierenden Agenzien verwendet werden, liefern gereinigtes rekombinantes Human-Interleukin-1. Aus Gründen, die nicht klar erkennbar sind, jedoch möglicherweise mit der Faltung des Proteins in dieser nicht-biologischen Umgebung zusammen hängen, überschritt das beobachtete spezifische Aktivitäts niveau gereinigter Moleküle 6×10⁶ Einheiten/mg nicht. Daher war das Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Reinigungsverfahren für rekombinantes Human-Interleukin-1, insbesondere für rekombinantes Human-Interleukin-1α, zu entwickeln, welches die Reinigung und Solubilisierung des gewünschten Proteins in einem biologisch kompatiblen Puffer system erlaubt und ein Produkt mit erhöhter spezifischer Aktivität ergibt.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von rekombinantem Human-Inter leukin-1, insbesondere Human-Interleukin-1α, speziell von Human-Interleukin-1α mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 1 als ein im wesentlichen homogenes Protein, im wesentlichen endotoxinfrei mit erhöhter spezifischer Aktivi tät von mindes tens 5×10⁷ Einheiten/mg. Außerdem bezieht sich die Erfindung auf rekombinantes Human-Interleukin-1, das durch das erwähnte Verfahren hergestellt wird, nämlich ein Human -Interleukin-1 welches mikrobiell hergestellt wird, als ein im wesentlichen homogenes Protein, das im wesentlichen endotoxinfrei ist und eine spezifische Aktivität von mindestens 5×10⁷ Einheiten/mg aufweist.

Ferner betrifft die Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen, die dieses Human-Inter leukin-1 enthalten. Aus Gründen, die dem Fachmann klar er sichtlich sind, kann das Human-Interleukin-1 der vor liegen den Erfindung einen zusätzlichen Methioninrest am N-Terminus aufweisen.

Ein wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung beruht auf der unerwarteten Entdeckung, daß ein beträchtlicher Teil des in einem bakteriellen Wirt, z. B. in E. coli, expri mierten rekombinanten Human-Interleukins-1 in der löslichen Zytosolfraktion enthalten ist, obwohl die spezifische Akti vität in dieser Fraktion weit unter derjenigen von mit Harnstoff extrahierten Einschlußkörpern liegt. Überdies ist es so, daß Human-Interleukin-1 nicht nur im Zytosol enthalten ist, sondern überraschenderweise wurde gefunden, daß es aus dem Zytosol durch eine einfache zwei- oder gegebenenfalls drei-stufige Säulen-Chromatographie gereinigt werden kann.

Im ersten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens erhält man eine lösliche Zellfraktion durch Aufbrechen von transformierten mikrobiellen Wirtszellen, die unter Bedingungen aufwuchsen, die die Expression des eingeführten Genes für Human-Interleukin-1 bewirkten, und Abtrennung des unlöslichen Zellmaterials einschließlich der Einschlußkörper, in denen gemäß Stand der Technik der größte Teil des exprimierten Human-Interleukin-1 (rHIL-1) vorliegen soll.

Das Aufbrechen der Zellen kann durch allgemein bekannte Techniken erreicht werden, wie z. B. durch enzymatischen Abbau, z. B. durch Lysozym-Behandlung, durch physikalische Spaltung unter Verwendung einer Kugelmühle oder einer ähn lichen Vorrichtung, oder vorzugsweise durch Ultraschallbe handlung. Die Abtrennung des löslichen Zytosols vom unlös lichen Zellmaterial wird am einfachsten durch Zentrifugie ren, z. B. bei 20 000×g während ca. 30 Minuten, erreicht. Der Überstand mit der Zytosolfraktion, welcher lösliches rHIL-1 enthält, wird dann einer Gelfiltration unterzogen, bei der eine gepufferte Salzlösung zur Elution verwendet wird. Eine für diesen Verfahrensschritt geeignete Säule ist eine Sephacryl® S-200 Säule (Pharmacia Feinchemikalien AB. Uppsala, Schweden).

Die Gel-Chromatographie-Fraktionen in der gepufferten Salzlösung, vorzugsweise in einer mit Tris/HCl, pH 8,0 gepufferten NaCl-Lösung, die einen Protein-Stabilisator wie Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA) enthalten kann, werden untersucht. Die kombinierten biologisch aktiven Fraktionen werden mit zusätzlicher gepufferter Salzlösung verdünnt und im zweiten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet.

Die Untersuchung der chromatographischen Fraktionen kann mit allgemein bekannten Methoden durchgeführt werden. Eine geeignete Analysemethode ist die Maus-Thymozytenprolifera tions-Analyse (LAF-Analyse) wie von Mizel et al., J. Immunol. 120, 1497-1508 (1978), beschrieben.

Der zweite Verfahrensschritt umfaßt eine Ionenaus tausch-Chromatographie, vorzugsweise auf einer DEAE-Zellu lose-Säule, unter Verwendung eines Gradienten von ansteigen der Salzkonzentration in einer gepufferten Lösung. In einer bevorzugten Ausführungsform ist dieser Gradient ein 0-800 mM NaCl Gradient in 25 mM Tris/HCl, pH 8,1 Puffer.

Bei der Reinigung in großem Maßstab werden nach dem Zentrifugieren zur Entfernung der Zellbruchstücke die Nukleinsäuren in der Zytosolfraktion durch eine Strepto mycin-Sulfat-Präzipitation entfernt. Ein Zehntelvolumen (des Überstandes) einer 10% w/v Streptomycin-Sulfat-Lösung wird hinzugefügt. Der pH-Wert wird mit 1N Essigsäure bei 6,2-6,4 gehalten. Die Suspension wird bei 20 000×g während 30 Minuten zentrifugiert. Die Proteine in der resultierenden Überstandslösung werden durch Hinzufügen von Ammoniumsul fat, bis zu 60%-iger Sättigung, konzentriert. Die Suspension wird bei 20 000×g während 30 Minuten zentrifugiert und das resultierende Sediment in einem Minimalvolumen 25 mM Tris/HCl. pH 8,0, 800 mM NaCl aufgelöst.

In einigen Fällen, insbesondere bei der Durchführung des Verfahrens in größerem Maßstab, kann die Endotoxin-Menge bei diesem Schritt über das zulässige Maß hinaus erhöht sein. Demzufolge kann gegebenenfalls ein dritter Schritt zur Entfernung des Endotoxins eingeführt werden. Allgemein bekannte Verfahren können zu diesem Zweck angewendet werden, wenngleich das bevorzugte Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung einen Durchgang der Lösung (1 : 1 v/v verdünnt mit 25 mM Tris/HCl, pH 8,1) von der DEAE-Säule durch eine DetoxiGel®-Säule umfaßt, nach den Anweisungen des Herstellers.

Das gereinigte Human-Interleukin-1 der vorliegenden Erfindung kann in bekannter Art und Weise als Pharmazeutikum verwendet werden, um das Immunsystem eines Patienten zu stimulieren, z. B. indem die Immunantwort auf Pathogene verbessert wird, indem es als Vakzin-Adjuvans wirkt und indem es die Abwehr gegen neoplastische Krankheiten ver stärkt. Andere klinische Verwendungszwecke umfassen die Förderung der Wundheilung durch Stimulation des Wachstums der Fibroblasten und die Verbesserung der Genesung von kritisch kranken, proteinunterernährten Patienten.

Das Human-Interleukin-1 der vorliegenden Erfindung kann warmblütigen Säugern für die oben genannten klinischen Verwendungszwecke verabreicht werden. Die Verabreichung kann durch jegliche konventionelle Methode erfolgen, wie durch parenterale Applikation entweder intravenös, subkutan oder intramuskulär. Es ist klar, daß die benötigte Dosis von den besonderen Umständen abhängt, von der Schwere der Erkrankung, der Dauer der Behandlung und-der Methode der Verabreichung. Eine geeignete Dosierungsform für die pharma zeutische Verwendung kann erhalten werden, indem steril filtriertes, lyophilisiertes Human-Interleukin-1 vor der Verwendung auf bekannte Art und Weise rekonstituiert wird. Der Zusatz von Puffern, Stabilisatoren, Bakteriostatika und anderer Zusatzmittel die üblicherweise in pharmazeutischen parenteralen Dosierungsformen verwendet werden, kann gemäß dem allgemeinen Fachwissen erfolgen.

Beispiel 1

E. coli-Zellen, transformiert mit einem Expressions vektor, welcher für rekombinantes Human-Interleukin-1α (rHIL-1α) codiert, wurden unter Bedingungen wachsen gelassen, welche die Expression des rHIL-1α erlauben. Die Zellen wurden gesammelt und gefroren. Für die Reinigung des rHIL-1α wurden die gefrorenen E. coli Zellen in 30 mM Tris/HCl (pH 8,0), 5 mM EDTA (in einem Verhältnis von 1 : 5 w/v) aufgetaut. Die resuspendierten Zellen wurden mit einem Branson Zellzertrümmerer 350 (Sonicator) aufgebrochen. Die aufgebrochenen Zellen und <<unlösliches" rHIL-1α in Form von Einschlußkörpern wurde durch Zentrifugation bei 20 000×g entfernt. Der lösliches rHIL-1α enthaltende Überstand wurde auf eine Sephacryl® S-200 Säule (Fig. 2) aufgetragen. Die Säule wurde mit 30 mM Tris/HCl (pH 8,0). 800 mM NaCl, 5 mM EDTA äquilibriert. Die biologisch aktiven Fraktionen wurden vereinigt, im Verhältnis 1 : 3 (v/v) mit 30 mM Tris/HCl (pH 8,0) verdünnt und auf DEAE-Zellulose (Anionen-Austauscher DE 53, Whatman Ltd.) unter Verwendung eines linearen Gradienten von 0-800 mM NaCl in 25 mM Tris/HCl (pH 8,1) chromatographiert (Fig. 3). Mehr als 50% der biologischen Aktivität wurden zurückgewonnen bei einer spezifischen Aktivität von 0,4 bis 1,0×10⁷ Einheiten/mg Protein. Die Reinheit des Proteins wurde mittels SDS-Poly acrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) nach Laemmli et al., Nature 227, 680-685 (1970), (Fig. 4), sowie mittels Umkehr phasen-HPLC bestätigt. Nach der Sephacryl® S-200 Chromatographie war das rHIL-1α mit 1000-2000 Endotoxin Einheiten/ml verunreinigt, aber die DEAE-Chromatographie bewirkte eine 99%ige Reduktion des Endotoxins. Die biolo gische Aktivität erwies sich für mindestens 3 Monate stabil, wenn das Protein bei 4°C gelagert wurde.

Beispiel 2

Obiges Verfahren wurde in vergrößertem Maßstab durch geführt, um 32 mg im wesentlichen reines rHIL-1α herzu stellen. Einhundert (100) g Zellmasse wurde mit einem Manton-Gaulin (Meth. Enzymology 22, 482-484 [1971]) aufge schlossen und das resultierende lösliche Produkt wurde mit Streptomycinsulfat und Ammoniumsulfat behandelt, um Nuklein säuren zu entfernen und die Proteine zu konzentrieren. Das resultierende resolubilisierte Protein wurde in gepufferter Salzlösung an einer 10 l Sephacryl® S-200 Säule chroma tographiert. Das gereinigte Material wurde dann an einer DEAE-Zellulose-Säule chromatographiert. Das Protein war zu mehr als 95% rein, wie durch SDS-PAGE festgestellt werden konnte. Die gesamte Aktivität, die erhalten wurde, betrug 1,6×10⁹ Einheiten mit einer durchschnittlichen spezifi schen Aktivität von 5×10⁷ Einheiten/mg. Im Gegensatz zum eigentlichen Pilotversuch war dieses Material jedoch ein wenig mit Endotoxin verunreinigt (bis zu 500 Endotoxin-Ein heiten/ml). Diese Endotoxinverunreinigung konnte leicht entfernt werden, indem die Proteinlösung über eine mit DetoxiGel® gepackte Säule geführt wurde, wobei die Anweisungen des Herstellers befolgt wurden.

Beschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt die Aminosäuresequenz von Human-Inter leukin-1α.

Fig. 2 zeigt ein Chromatogramm der Gelfiltration von E. coli Zytosol mit löslichem rHIL-1α auf Sephacryl® S-200. Das Elutionsmittel ist 30 mM Tris/HCl (pH 8,0), 800 mM NaCl. In einer Teilmenge der Fraktionen wurde mittels LAF-Analyse die Interleukin-1 Aktivität bestimmt.

Fig. 3 zeigt ein Chromatogramm der DEAE-Zellulose- Chromatographie der vereinigten Interleukin-1 aktiven Fraktionen der Sephacryl® S-200 Säule. rHIL-1α wurde mit einem Salz-Gradienten von 0-800 mM NaCl in 25 mM Tris/HCl (pH 8,1) eluiert. Proben jeder Fraktion wurden mittels LAF-Analyse auf biologische Aktivität geprüft.

Fig. 4 zeigt die Reinigung von rHIL-1α. Proben von verschiedenen Stufen der Reinigung von rHIL-1α wurden mittels SDS-PAGE analysiert.

(A) M: Größen-Markierungsproteine; P: Sediment nach der Zentrifugation der Ultraschall-behandelten Zellsuspension; S: Zytosolfraktion; Fraktionen 64-69 und Fraktionen 70-77: Fraktionen 64 bis 77 der Sephacryl® S-200 Chromatographie einzeln aufgetragen (markiert durch |).
(B) M: Größen-Markierungsproteine; 0: vereinigte Frak tionen der Sephacryl® S-200 Säulen-Chromatographie; O*: vereinigte Fraktionen der Sephacryl® S-200 Säulen-Chro matographie 1 : 3 (v/v) verdünnt mit 30 mM Tris/HCl, pH 8,1; Fraktionen 60-65 und Fraktionen 66-73: Fraktionen 60 bis 73 der DEAE-Zellulose-Chromatographie einzeln aufgetragen (markiert durch |).

Die elektrophoretischen Mobilitäten der Größen-Markierungsproteine in M (Phosphorylase B, [M_r =94′000], Rinder serumalbumin [M_r =67′000], Ovalbumin [M_r =43′000], Carbo anhydrase [M_r =30′000], Sojabohnen Trypsin-Inhibitor [M_r =20′000] und α-Lactalbumin [M_r =14′000] und deren M_r-Werte (×10³) sind mit Pfeilen markiert.

Claims

1. Mikrobiell hergestelltes Human-interleukin-1 als ein im wesentlichen homogenes Protein, dadurch gekennzeichnet, daß es im wesentlichen endotoxin-frei ist und eine spezifische Aktivität von mindestens 5×10⁷ Einheiten/mg aufweist.

2. Human-Interleukin-1 gemäß Anspruch 1, welches Human-Interleukin-1a ist.

3. Human-Interleukin-1 gemäß Anspruch 1 mit der in Fig. 1 gezeigten Aminosäuresequenz, wobei Fig. 1 Bestandteil des Anspruchs ist.

4. Verfahren zur Herstellung von Human-Interleukin-1 gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß Mikrobenzellen, transformiert mit einem Expressions vektor, welcher das Gen für rekombinantes Human-Inter leukin-1 enthält, und zur Expression des genannten Gens induziert, aufgebrochen werden, unlösliches Zellmaterial von einer Zytosolfraktion abgetrennt wird, diese Zytosolfraktion unter Verwendung einer gepufferten Salzlösung einer Gelfil tration unterworfen wird, die biologisch aktiven Fraktionen der Gelfiltration vereinigt werden und diese einer Ionenaus tausch-Chromatographie unter Verwendung eines Gradienten steigender Salzkonzentration in einer gepufferten Lösung unterworfen werden.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, worin die Mikroben zellen mittels Ultraschallbehandlung aufgebrochen werden.

6. Verfahren gemäß Anspruch 4 oder 5, worin die genannte Gelfiltration auf einer Sephacryl® S-200 Säule durchgeführt wird und die gepufferte Salzlösung eine Tris/HCl gepufferte NaCl-Lösung ist.

7. Verfahren gemäß den Ansprüchen 4 bis 6, worin die genannte Ionenaustausch-Chromatographie unter Verwendung einer DSAE-Zellulose-Säule erfolgt und der genannte Gradient steigender Salzkonzentration in einer gepufferten Lösung ein 0-800 mM NaCl-Gradient in Tris/HCl-Puffer ist.

8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 4 -7, da durch gekennzeichnet, daß gegebenenfalls eine weitere, an sich bekannte Entfernung von Endotoxinen erfolgt.

9. Pharmazeutische Zusammensetzungen, welche ein Human- Interleukin-1 gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 enthalten.