KR20040091008A

KR20040091008A - 재조합 태반성장인자의 제조방법

Info

Publication number: KR20040091008A
Application number: KR10-2004-7012056A
Authority: KR
Inventors: 도메니코 마그리온; 마우로 바티스티; 에토레 콘티; 기우세페 살비아; 마리나 투씨
Original assignee: 게이모나트 에스.피.에이.
Priority date: 2002-02-05
Filing date: 2002-02-05
Publication date: 2004-10-27
Also published as: DK1472286T3; MXPA04007589A; CY1106681T1; CZ2004892A3; CN100588661C; CN1620465A; HUP0500029A3; SI1472286T1; DE60219361D1; HU229056B1; AU2002236197A1; CA2475235C; JP4458850B2; US20050070696A1; EE05407B1; EE200400108A; HUP0500029A2; ATE358681T1; EP1472286B1; SK3282004A3

Abstract

본 발명은 Ⅰ) 원핵세포를 발효배양시키는 단계, Ⅱ) 인클루젼 바디(inclusion bodies)를 추출 및 정제하는 단계, Ⅲ) 발현 단백질을 탈변성(renaturation)시키는 단계, Ⅳ) 이온-교환 크로마토그래피 단계, Ⅴ) 역상 크로마토그래피 단계를 포함하는 변형 원핵세포에서 유도가능 발현 시스템으로 발현된 재조합 태반성장인자(PLGF)를 추출 및 정제하는 방법에 관한 것이다.

Description

재조합 태반성장인자의 제조방법{Production process of recombinant placental growth factor}

태반성장인자(Placental Growth Factor)(PLGF)는 혈관내피성장인자(Vascular Endothelial Growth Factor)(VEGF)와 유사한 구조를 갖는 호모다이머 당단백질이다. PLGF 단백질을 코딩하는 전체 폴리뉴클레오타이드 서열은 매크리온 및 페르시코의 1990년 9월27일의 이탈리아 우선권을 주장하는 유럽특허 제550 519호(WO-A-92/06194)에 기술되어 있다. PLGF의 ARN의 교차 스플라이싱(alternative splicing) 과정으로 세 종류의 동종 형태 태반성장인자, 구체적으로 PLGF-1, PLGF-2 및 PLGF-3이 생성되며, 이들은 다른 폴리펩타이드 서열을 갖고 있음이 기술되어 있다.

상기 특허는 또한 인간 PLGF 유전자가 유도가능한 프로모터의 조절하(직접적으로 또는 간접적으로)에 삽입된 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포로 특징되는 유도가능한 원핵세포 발현 시스템 사용을 포함하는 PLGF 인자의 제조방법에 대해 기술하고 있다. 적절한 활성제로 PLGF 발현을 유도한 후, 상기 세포를 배양하고, 분리하여 용균시킨다(lysis).

상기 획득한 용균물은 소량의 발현 PLGF 단백질을 함유하고 낮은 특이적 활성을 갖는 복합 단백질의 혼합물이다. 사실, 알려진 방법에서, 상기 단백질 발현은 낮은 세포 밀도를 함유하는 배양물에서 유도되는데, 유도시 낮은 흡광도, 즉 600㎚에서 0.2 내지 0.6 OD로 확인되었다. 또한, 선행 자료에 기술된 방법은 발현 단백질을 추가적으로 정제하는 단계를 포함하지 않는다. 이러한 이유로, 상기 국제공개출원 제92/06194호에 따라 얻은 용균물은 약물 제조에 직접 사용하는 데는 부적절하다.

동일한 태반인자를 정제하기 위한 보다 복잡한 방법이 마그리온 등의 "Il Farmaco" 55(2000), 페이지 165 내지 167에 기술되어 있다. 그러나, 상기에서 개시된 방법은 약제학적 사용에서 요구되는 순도 및 용량으로 PLGF 단백질을 얻기 위해 필수적인 조건 및 실험적인 구체적 설명을 기술하지 않고 단지 알려진 응용 기술의 단순 기재에 불과하였다.

본 발명의 범주는 고순도이면서 약물 제조에서 산업적으로 이용하기 적합한 수율로 얻을 수 있는, 박테리아 세포에서 발현된 재조합 PLGF를 추출 및 정제하는 새로운 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 범주는 주로 다이머(적어도 70%) 및 멀티머 형태로 구성되며 잔여의 모노머 형태(거의 불활성)는 1.5% 미만으로 함유하는 실질적으로 활성 형태(98.5% 이상)인 PLGF 단백질을 얻는 것이다.

-발명의 요약-

본 발명은 박테리아 세포에서 발현되는 인간 PLGF의 추출 및 정제에 특히 적합한 정제 기술의 순서를 확인한 것에 기초한다. 또한 본 발명은 단일 기술 및 정제하기 위한 물질의 화학적-물리적 특성에 대한 최적의 조작 조건을 결정한 것에 기초한다.

따라서, 본 발명의 목적은 Ⅰ) 원핵세포를 발효배양시키는 단계, Ⅱ) 인클루젼 바디(inclusion bodies)를 추출 및 정제하는 단계, Ⅲ) 발현 단백질을 탈변성(renaturation)시키는 단계, Ⅳ) 이온-교환 크로마토그래피 단계, Ⅴ) 역상 크로마토그래피 단계, 및 선택적으로 Ⅵ) 한외여과, 제제화 및 가압동결건조하는 최종 단계를 포함하는 유도가능한 원핵세포 발현 시스템을 통해 발현된 재조합 태반성장인자(PLGF)를 추출 및 정제하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 방법에 따르면, 상기 발효배양은 유도 단계가 진행되기 전, 배지에서 높은 박테리아 밀도를 얻을 때까지 수행되는데, 이는 배지의 높은 흡광도로 알수 있다. 상기 단계 (Ⅱ)는 박테리아 용균(lysis), DNA 파열 및 인클루젼 바디의 분리 단계를 포함한다. 상기 발현된 단백질의 탈변성(단계 Ⅲ)은 상기 인클루젼 바디를 변성 완충용액에 용해시키고 적어도 부분적으로 발현 단백질을 다이머 형태로 변형시켜서 얻게된다. 마지막으로, 단계 (Ⅳ) 및 (Ⅴ)에서 상기 다이머 및 멀티머 형태의 발현 단백질을 모노머 형태와 분리하여 순수한 형태로 분리하고, 이후 한외여과시키고 일반적인 가압동결건조 및 제제 첨가제 존재하에서 가압동결건조시킨다.

본 발명의 특별한 목적은 인간 유래의 PLGF-1 단백질을 추출 및 정제하는 상술한 방법을 제공하는 것이며, 실질적으로 또한 동물 유래의 PLGF-1도 유효하다.

본 발명의 방법으로 종래 방법보다 30 내지 50배 높은 발현 단백질 수율을얻을 수 있다. 본 발명의 방법으로 또한 높은 특이적 활성을 갖는 실질적으로 다이머 형태인 고 순도 단백질을 얻을 수 있다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 방법을 통해서 잔여 단백질 또는 다른 박테리아 오염물이 없고 잔존하는 모노머 형태가 1.5% 미만으로 함유된 활성 태반성장인자를 얻는 것이다.

본 발명은 유전적으로 변형된 세포로 부터 재조합 태반성장인자를 추출 및 정제하는 방법에 관한 것이다.

도 1은 단계 Ⅰ을 모니터하기 위해서 환원 조건하에서 SDS-PAGE 전기영동을 수행하여 얻은 결과를 나타내는 도면이다. Pre1 및 Pre2는 다음과 같이 준비된 유도 전 확인을 나타낸다. 유도하기 바로 전, 약 0.064units의 600㎚에서 측정된 흡광도를 얻고 물로 5배 희석하였다. 상기 희석액 20㎕를 취하여 20㎕의 환원 완충용액을 첨가하고 끓였다. 상기 최종 용액의 20㎕를 SDS-PAGE 메트릭스에 충진시켰다. Post 1 및 Post 2는 상술한 바와 같이 준비된 유도 후 확인을 의미한다. M은 분자량 마커 혼합물을 의미한다. 유도 후 컬럼(Post 1 및 Post 2)에서, 유도 전 컬럼(Pre 1 및 Pre 2)에서는 실질적으로 존재하지 않는 분자량 14.3의 표지 바로 위의 위치에 발현되어 인클루젼 바디와 분리된 PLGF-1 단백질에 상응하는 밴드가 나타났다.

도 2는 Q-세파로스 패스트 플로우 레진상의 음이온-교환 크로마토그래피의 크로마토그램을 모니터링한 그래프이다. X-축은 용리 부피(ML)를 나타내고, y-축은 흡광도(OD)를 나타낸다. 20%의 완충용액 B(NaCl 200mM)로 용리시켜 얻은 제1 용리피크는 실질적으로 다이머 형태인 PLGF-1 단백질에 상응하나, 이는 불순물 및 모노머 형태를 포함한다. 100%의 완충용액 B(NaCl 1M)로 용리시킨 다음 피크는 제거될불순물을 함유한다.

도 3은 RP 소스 30 레진의 역상 크로마토그래프에서 제1 용리 단계의 크로마토그램을 모니터링한 그래프이다. X-축은 용리 부피(㎖)를 나타내고, y-축은 흡광도(OD)를 나타낸다. 제1 용리 피크는 레진에 붙지 않은 다양한 불순물에 상응한다. 제2 용리 피크는 아이소크래틱 조건(약10 내지 15%의 완충용액 B에서 실험적으로 확인)하에서 용리된 모노머 형태의 PLGF 단백질에 해당한다.

도 4는 RP 소스 30 레진의 역상 크로마토그래피에서 제2 용리 단계의 크로마토그램을 모니터링한 그래프이다. X-축은 용리 부피(㎖)를 나타내고, y-축은 흡광도(OD)를 나타낸다. 상기 용리 피크는 다이머-멀티머 형태의 PLGF 단백질에 상응한다.

도 5는 전체 과정의 최종 모니터링을 위한 SDS-PAGE 전기영동의 결과를 나타낸 사진이다. Prerefol 및 Postrefol은 발현된 단백질의 탈변성(단계 Ⅲ) 전후 체크를 나타낸다. QFf는 주로 다이머 형태의 단백질을 함유하는 Q 세파로스 패스트 플로우 레진에서 용리된 피크를 나타낸다. Mon은 모노머 형태를 함유하는 피크를 나타낸다. Dim은 RP 소스 30의 역상 크로마토그래피의 제2 하위 단계에서 용리된 피크를 나타낸다. 탈변성 전, 발현 단백질은 주로 모노머 형태이다. 탈변성 후, 단백질의 일부는 다이머 형태이다. QFF 및 RF 30 크로마토그래피로 정제하여 고 순도의 PLGF-1 단백질을 얻을 수 있다.

박테리아 숙주 세포의 유전자 변형은 마그리온 등의 유럽특허 제0550519호(WO-A-92/06194)에 기술되어있다. 상기 목적을 위해서, 박테리아 세포에 PLGF-1 인자를 코딩하는 인간 유전자에 상응하는 삽입부를 포함하는 발현 벡터를 도입시켜 형질전환시킨다. 완벽한 유전자 서열이 문헌으로 알려졌으며 쉽게 얻을 수 있다. 상기 서열을 함유하는 플라즈미드가 수탁번호 제ATCC 40892호로 ATCC에 기탁되어 있다. 발현은 T7 파지의 RNA 폴리머라제의 조절 시스템하에서 수행되고 IPTG(아이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드)로 유도된다.

그러나, 다른 유도가능한 원핵세포 발현 시스템도 사용가능하다. 이러한 시스템은 구입가능하며, 다음과 같다:

1) pBAD 발현 시스템(인비트로젠 BV) : 여기서 단백질의 합성은 araBAD 프로모터의 조절하에 위치하고 아라비노스에 의해 다양한 E.coli 균주에서 유도시킬 수 있다.

2) T7 발현 시스템(인비트로젠 BV 또는 프로메가사) : 여기서는 단백질 합성이 T7 파지의 RNA 폴리머라제 프로모터에 의해 조절되며 락토스 또는 이의 동종물(IPGT)로 유도시킬 수 있다. 이경우 락토스-유도가능 프로모터의 조절하에 있는 T7 파지의 RNA 프로모터 유전자의 카피를 함유하는 DE 타입의 E.Coli 유도체(BL21(DE3) 또는 JM109(DE3))를 필요로 한다.

3) Trc 발현 시스템(인비트로젠 BV) : 단백질 합성이 trc 하이브리드 프로모터의 조절하에 있게 된다. 상기 프로모터는 trp 프로모터 및 lac 프로모터를 용해시켜 얻을 수 있으며 락토스 또는 이의 동종물(IPTG)를 통해 다양한 E. coli 균주에서 유도시킬 수 있다.

4) Tac 발현 시스템(아머샴 바이오사이언스사) : 단백질 발현이 tac 프로모터 조절하에 있다. 상기 시스템에서 단백질 발현은 락토스 또는 이의 동종물(IPTG)에 의해 E.coli lacIq(JM105 타입) 균주에서 유도된다.

5) P_L발현 시스템 : 여기서는 단백질 합성이 PL 프로모터의 조절하에 있고 트립토판을 첨가하여 유도시킬 수 있다. 이 경우 트립토판-유도가능 프로모터의 조절하에 위치하는 람다 파지의 cI 리프레서(repressor)를 코딩하는 유전자 카피를 함유하는 E.coli 유도체(GI724)를 필요로 한다.

단계 Ⅰ : 발효배양 및 유도 단계

청구한 방법의 첫번째 단계는 전술한 유럽특허에 기술된 균주와 동등하게 기능적으로 변형된 박테리아 균주의 발효배양 단계로 이루어진다. 바람직한 일 실시예에서 상기 미생물은 PLGF의 인간 유전자를 포함하는 발현 플라스미드로 변형된 대장균 유도체이다. 바람직한 미생물은 인간 PLGF-1 유전자를 구매가능한 균주[B12(DE3)pLysS](프로메가사, 미국)에 도입시켜 얻은 [B12(DE3)pLysS PLGF-1]이다. 본 발명에서는 그러나, 상기 인간 PLGF-1 인자에 제한되는 것이 아니며, 다른 동물 유래(원숭이, 쥐, 토끼등)도 가능하다. 본 발명은 E.coli 유도체의 사용에만 제한되지 않으며, 유전적으로 변형가능하고 인클루젼 바디 형태의 이종 단백질을 발현시킬 수 있는 모든 원핵세포인 미생물의 사용을 포함한다.

본 발명에서 접종하여 사용되는 균주들의 발현능을 보존시키기 위해 감압동결건조된 형태로 사용전까지 유지시킨다. 사용시, 상기 감압동결건조물을 적절한 완충용액을 사용하여 용해시킨다.

구매가능한 효과적으로 사용할 수 있는 다양한 종류의 배양 배지가 존재하나, 본 발명에 따른 발효배양단계는 바람직하게 감염 위험을 피하기 위해서 동물 또는 인간 유래의 모든 물질이 없는 배지에서 수행된다. 하나 이상의 적절한 항생제가 첨가된 효모 추출물(디프코사)이 본 단계에서 가장 적절하다. 바람직한 일 실시예에서 효모 추출물, 글리세롤 및 암모늄설페이트를 함유하는 제1 용액(A)을 포스페이트 완충용액을 함유하는 제2 용액(B)과 멸균 조건하에서 혼합한 배지를 사용한다. 상기 혼합물에 이후 앰피실린 및 클로람페니콜 또는 이와 동등한 항생제를 첨가한다. 적절한 항생제 농도는 앰피실린은 50 내지 300㎍/㎖, 바람직하게는 100 내지 200㎍/㎖, 및 클로람페니콜은 10 내지 100㎍/㎖, 바람직하게는 30 내지 40㎍/㎖이다.

상기 발효배양 단계는 배지에 감압동결건조형태의 미생물을 현탁시키는 예비접종(preinoculum) 단계가 선행되고 이후 연속적인 배양 단계 및 최적의 양으로 미생물 세포 배양물을 얻기 위한 희석 단계를 거치게 된다. 바람직하게, 상기 미생물을 37℃에서 하룻밤 동안 배양하고 희석한 후 몇 시간 동안 다시 배양시킨다. 선택된 예비-접종 부피를 이후 원심분리하고, 앰피실린을 강화시킨 배양 용액에 다시 현탁시키고 발효배양 단계용 발효 베슬(vessel)에 접종한다.

상기 발효배양은 앰피실린 및 클로람페니콜이 첨가된 상술한 배지에서 미생물에 적절한 온도, 일반적으로 37℃에서 용존 O₂존재하에서, 즉, 포화공기에 대해 20 내지 40%, 바람직하게는 30% 존재하에서 수행된다. 발효배양 동안 pH는 중성 또는 약 산성(6.4 내지 7.4)으로 유지시킨다. 또한, 발효배양은 교반상태에서 진행되므로, 바람직하게, 거품억제제를 사용한다.

발효배양 과정은 배지의 흡광도가 증가되면서 수행된다. 이러한 이유로, 상기 흡광도는 발효배양의 진행정도를 모니터하기 위해 본 발명에서 사용되는 변수가 된다. 구체적으로 600㎚에서 읽는 것이 적절하다.

본 발명의 본질적인 특징은 발현 유도 시에 배양물에서 높은 세포 밀도를 얻는 것이다. 600㎚에서 1 내지 50의 흡광도(0D600)를 본 발명의 배양 배지로 부터 얻을 수 있다. 그러나, 18보다 큰 밀도를 본 발명에 따른 방법의 통상적인 고생산 수준으로 얻는 것이 바람직하다. 16 내지 20 밀도가 박테리아 균주 생산을 유도하고 최적 결과를 얻는 데 특히 바람직하다. 이후, 발효배양을 상술한 조건에서 상기 흡광도를 얻을 때까지 유지시키고 단백질 발현을 유도시킨다.

사용되는 미생물 세포에서 유도시킬 수 있는 모든 제제 또는 화학-물리적 조건을 이종 단백질의 발현 체계에서 바람직하게 사용할 수 있다. 특별한 경우 T7 파지 프로모터를 함유하는 발현 플라스미드로 형질전환된 박테리아 균주 BL21(DE3)pLysS를 사용하며, 상기 발현을 락소스 또는 적절한 농도, 즉, 약 1mM의 아이소프로필-β-티오갈락토피라노사이드(IPTG)와 같은 락토스 유도체로 유도시킨다. 상기 유도 기간은 필요에 따라 다양하다. 좋은 결과를 얻기 위해서는 몇 시간, 바람직하게는 3 내지 4시간이고; 최적의 과정에서는 유도과정을 약 10의 용존 O₂를 사용하여 3시간 20분간 유지시킨다.

세포 샘플을 유도 전 후에 취하여 유도 결과를 확인하기 위해 SDS-PAGE 전기영동같은 분석법에 사용한다.

단백질 발현이 바람직한 수준에 도달하면, 배양물을 원심분리하고 세포에 다음 단계를 수행한다.

단계 Ⅱ : 추출 및 정제 단계

박테리아 균주에서 발현된 이종 단백질은 인클루젼 바디의 형태로 세포 자체 내에서 분리된다. 따라서, 본 발명의 방법은 세포 용균, 추출된 핵산 물질(DNA)의 파열 및 인클루젼 바디의 회수 및 세척 단계를 제공한다.

필수적이지는 않으나, 상기 세포를 세척하고 적절한 농도의 유제, 바람직하게는 0.5 내지 1%의 Triton X100을 함유하는 용액에 현탁시키고, 세포막을 용균시킨다. 상기 용균 과정은 동결/융해, 프렌치 프레스(French press), 초음파처리 또는 다른 유사 방법으로 수행된다.

그러나, 박테리아 균주 BL21(DE3)pLysS에 바람직한 방법은 동결/융해 방법이며, 가장 바람직한 일 실시예에서는 적어도 두번 연속적으로 반복된다. 기계적 용균 이후, 상기 용균 단계를 교반하면서 상온에서 용균 완충용액에서 수분간 계속수행한다.

용균 배지로 인클루젼 바디를 방출하는 것은 다른 성분 및 세포 물질, 상술한 모든 핵산 물질의 방출과 함께 일어난다. 상기 물질들은 이후 단백질 정제 과정을 방해한다. 따라서, 용균으로 얻은 현탁/용액은 DNAse(벤조나제같은 천연 또는 재조합 형태)같은 효소제, 데옥시콜린산 등의 화학제제, 또는 초음파 처리 또는 블레이드(blade), 예를 들어 믹서를 통한 높은 에너지와 같은 기계적 제제를 통해 핵산 물질, 특히 DNA를 파열시킨다. 상기 예를 들어 믹서에서 수행된 DNA 파열은 예를 들어, EDTA 및 Triton X-100 같은 킬레이팅(chelating)제 및 세제를 함유하는 적절한 부피의 세척 용액에 재 현탁된 용균 세포에서 수행한다. 바람직하게는 여러번, 바람직하게는 2 주기로 반복하며, 인클루젼 바디를 함유하는 분획으로 부터 나머지 성분 및 세포 물질을 제거하기 위해서 교대로 세척 용액, 원심분리 및 상층액의 분리로 희석 단계를 반복하면서 수행된다.

단계 Ⅲ : 단백질의 탈변성 ( 리폴딩 (refolding))

PLGF-1의 정제된 인클루젼 바디를 함유하는 분획을 우레아, 구아니딘 이소티오시아네이트, 구아니딘-하이드로클로라이드 등의 변성제를 포함하는 변성 완충용액에 용해시킨다. 바람직하게, 상기 변성 용액은 예를 들어, 변성 농도 8M의 우레아 용액이다. 용해를 촉진시키기 위해서, 상기 분획을 바람직하게 균질화 또는 초음파 처리한다. 상기 인클루젼 바디를 용해시킨 후, 280㎚에서 측정된 흡광도가 약 0.8(OD280 0.8)이 될 때까지 상기 용액을 동일한 변성 완충용액으로 희석시킨다. 이후, 상기 용액을 OD280이 0.5가 될 때까지 더욱 희석시킨다. 바람직한 희석 용액은 염 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 함유하며 염기성 pH(약 8)를 갖는다. 희석 용액에서 PLGF-1의 탈변성은 상기 용액에 적절한 농도의 산화/환원제 쌍을 첨가하고, 이후 교반하면서 10 내지 30시간, 바람직하게는 18 내지 20시간 동안 10 내지 30℃, 바람직하게는 20℃에서 항온반응시켜 얻을 수 있다. 상기 산화/환원제 쌍의 예는 시스틴/시스테인, 시스타민/시스티아민, 2-하이드록시에틸디설파이드/2-머캅토-에탄올이다. 상기 산화/환원제 쌍의 바람직한 예는 산화 형태 및 환원 형태의 글루타치온이며, 각각 0.1 내지 2.5mM(바람직하게는 0.5mM) 농도 및 0.25 내지 6.25mM(바람직하게는 1.25mM) 농도이다. 탈변성을 통해서, 본질적으로 모노머 형태로 발현된 PLGF-1 단백질을 부분적으로 다이머 형태로 되돌렸다(도 5).

단계 Ⅳ : 음이온-교환 크로마토그래피

전 단계에서 얻은 상기 용액, 바람직하게는 주로 모노머 형태이고 부분적으로 다이머 형태인 단백질을 함유하며 원심분리 및/또는 여과를 통해 얻은 용액을 상기 혼합물에 다이머 형태를 보강시키고 박테리아 오염물로 부터 이를 정제하기 위해 음이온-교환 레진에 충진시켰다. 음이온-교환 크로마토그래피에 적절한 모든 구매가능한 메트릭스를 사용하는 데, 이는 수용능, 충진 및 유속이 Q 세파로스 패스트 플로우 레진(Q Sepharose fast flow resin)(아머샴 바이오사이언스사)과 유사하며, 산업적 단계에 적절한 것과는 별개이다. 바람직한 일 실시예에 있어서, 빠른-흐름 레진을 사용하는 데, 예를 들어 Q-세파로스 패스트 플로우(아머샴 바이오사이언스사) 또는 이의 동등물이 있다. 상기 레진을 세척하고 저이온강도의 용액으로 평형화시켰다. 상기 용액은 예를 들어, 염 함유가 낮거나 또는 없는 pH8.5의 에탄올아민-HCl을 포함한다. 동일한 용액을 사용하여 충진, 흡착 및 정제할 단백질 혼합물을 세척한다. 사용된 레진은 1 : 1 내지 10 : 1로 다양한 충진 부피/컬럼 부피 비율로 많은 부피의 단백질 용액을 충진시킬 수 있게 한다. 컬럼 사용을 최적화시키기 때문에 상기 부피/부피 비는 10 : 1 이 바람직하다. 그러나, 상기 비율이 10 : 1보다 큰 것을 피해야하는데, 이는 메트릭스의 흡착능이 포화되어, 다이머 형태의 단백질 손실이 높아지기 때문이다.

반면 모노머 형태의 PLGF-1 단백질은 저이온강도의 세척 단계에서 이미 걸러지고, 다이머 및 멀티머 형태의 용리물은 개시 용액의 이온 강도를 증가시켜서 얻을 수 있다. 상기 이온강도의 증가는 1M NaCl을 함유하는 증가된 미리 정해진 비율의 제2 용액과 평형 용액을 혼합하여 얻을 수 있다. 바람직한 일 실시예에 있어서, 상기 단백질은 200mM 농도 NaCl의 아이소크래틱 조건(isochratic condition)에서 용리시킨다. 상기 다양한 종류의 용리물은 280㎚에서 흡광도를 측정하여 자동적으로 모니터된다(도 2). 다이머 형태의 PLGF-1 단백질을 함유하는 회수된 분획을 이후 SDS-PAGE 전기영동으로 확인하였다(도 5). 바람직하게, 전체 크로마토그래피 단계는 적절한 프로그램, 예를 들어 소프트웨어 FPCL 디렉터 시스템(아머샴 바이오사이언스사)의 조절하에 작동되는 컴퓨터화된 시스템을 통해 자동적으로 수행된다.

단계 Ⅴ : 역-상 크로마토그래피

활성 형태로 보강된 PLGF-1 단백질을 함유하는 전 단계에서 얻은 분획을 회수하고, 적절한 완충용액으로 희석하여 역상 크로마토그래피 컬럼에 충진하여 활성 형태의 단백질을 더욱 정제하고자 하였다. 상기 충진시킨 용액의 양은 크로마토그래피 메트릭스 밀리리터 당 4.5 내지 5.5 OD280에 상응한다. 상기 양은 최대 양으로 간주된다.

의도하는 용도에 적절한, 모든 구매가능한 크로마토그래피 메트릭스를 상기 과정의 필수조건에 적합한 충진능 및 유속 특징에 따라 사용할 수 있다. 바람직한 일 실시예에 있어서, 레진(resin)은 흡착능의 최상 이용과 함께 컬럼 자체의 패킹(packing)이 용이할 수 있는 비드-크기를 갖는 것을 사용한다. 이와 같은 메트릭스의 예로는 RP 소스(Rource) 15 또는 RP 소스 30(아머샴 바이오사이언스사) 레진이 있다. 평형화, 충진, 레진 세척 및 용리를 위한 모든 용액은 다른 비율의 유기 용매를 포함하는 하이드로-유기 용액이다. 상기 용액의 예로는 에탄올, 메탄올 또는 아세토니트릴을 포함하는 용액이다. 바람직하게, 에탄올을 증가비율로 포함하는 하이드로-알콜 용액을 사용한다. 본 발명의 일 실시예에서, 적절한 양의 두 완충용액을 혼합하는데, 전자는 완충용액 A, 즉, 40% 에탄올 및 0.1%의 TFA(트리플루오로아세트산)을 포함하며, 후자는 완충용액 B, 즉, 70% 에탄올 및 0.1% TFA를 포함한다.

레진에 충진시키고 적절하게 세척한 단백질 물질은 이후 두개의 연속적인 단계를 포함하는 용리 과정을 통해 용리되는 데, 증가구배의 유기 용매를 함유하는 용리 용액을 사용한다. 제1 단계는 모노머 형태의 용리 피크를 얻을 때 까지 증가 구배의 유기 용매 조건하에서 수행된다. 상기 구배는 각 용리 컬럼 부피에 대해 완충용액 B가 3% 증가되도록 4 내지 40% 비율로 완충용액 A에 완충용액 B를 첨가하여 얻을 수 있다. 모노머 형태의 단백질에 상응하는 용리 피크가 나타나면, 상기 용리 단계는 모노머 형태의 용리 피크가 없어질 때 까지 아이소크래틱 조건하에서 계속된다. 상기 아이소크래틱 조건은 두 모노머 및 다이머 형태에 해당하는 크로마토그래피 피크의 분리를 야기하고, 이후, 산업적으로 최상의 해상도에 상응하나, 분석적 타입은 아니다. 제2 단계는 주로 다이머 형태의 단백질을 모두 용리할 때까지 유기용매의 증가 구배 조건하에서 다시 수행된다. 상기 제2 단계에서, 상기 구배는 각 용리 컬럼 부피에 대해 완충용액 B가 40.9%의 증가 비율이 되도록, 10 내지 100% 비율로 완충용액 A에 완충용액 B를 첨가하여 얻을 수 있다. 상기 다양한 형태의 PLGF-1 단백질의 용리는 280㎚에서 측정한 흡광도를 통해 자동적으로 모니터된다(도 3 및 도 4). 본질적으로 다이머 형태의 PLGF-1 단백질을 함유한 회수 분획은 이후 SDS-PAGE를 통해 조절된다(도 5). 바람직하게, 상기 전체 역상 크로마토그래피 단계는 적절한 프로그램, 예를 들어, 소프트웨어 FPCL 디렉터 시스템(아머샴 바이오사이언스사) 조절하에서 작동되는 컴퓨터화 시스템을 통해 자동적으로 수행된다.

상기 전기영동 결과는 역상 크로마토그래피의 제2 단계에서 얻은 PLGF-1 단백질이 고 순도의 활성 형태, 즉, 다이머 형태 및 부분적으로 멀티머 형태의 단백질을 포함하나, 본질적으로 모든 모노머 형태의 오염물은 없는 형태임을 보여준다. 상기에서 얻은 산물은 98.5%, 바람직하게는 99.5% 이상의 활성 형태를 포함하며, 다이머 형태는 70% 이상이다. 잔여의 모노머 형태는 1.5% 미만이다. 활성 형태의단백질은 박테리아 배양물 리터 당 평균 160㎎의 양으로 얻었다. 본 발명에 따라 얻은 순수 단백질은 멤브레인을 이용한 한외여과같은 단계가 더욱 수행될 수 있다. 이 경우 상기 산물을 30kD 이하를 분리하는 멤브레인에 여과시키고 1 : 106 배로 희석될 때 까지 TFA 산성화 물에 대해 여과(diafiltration)시킨다. 상기 최종 산물을 동결건조제로 적절하게 제제화시키고 최적의 생물학적 활성을 유지하도록 감압동결건조시킨다.

이하 실시예를 통해 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명하나, 이에 본 발명의 범주가 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 발효배양

1mM IPGT를 사용하여 발효 베슬에서 유전적으로 변형된 미생물(MOGM)[Bl21(DE3)pLysS PlGF-1]의 발효배양 및 유도 방법을 다음과 같이 나타내었다

물질 :

용액 A(1리터 당)

박토 효모 추출물(디프코) 34g

암모늄 설페이트 2.5g

글리세롤 100㎖

H₂O q.s. at : 900㎖

용액 B(10×)(100㎖ 당)

KH₂PO₄1.7g

K₂HPO₄-3H₂O 20g, 또는

K₂HPO₄15.26g

H₂O q.s. at 100㎖

을 포함하는 용액 SBM.

상기 용액 A 및 B는 각각 분리하여 고압멸균하고 멸균 조건하에서 사용 전 혼합한다. 다른 방법으로는, 상기 용액 A 및 B를 혼합하고 멸균조건하에서 여과시킨다.

100㎖의 증류수에 순수한 물질 5g을 용해시켜서 200mM(200×)의 IPTG를 만든다. 상기 용액을 0.22-㎛ 필터로 여과시키고, 나눠서 -20℃에 동결시킨다.

사용되는 거품제거제는 안티폼 O-10(실리콘성이 아님)(시그마 카탈로그 번호 A-8207)이다.

사용되는 박테리아 균주는 [BL21pLysS PlGF-1 WCB](이용가능한 세포 은행)이다.

예비접종: 감압동결건조된 유전자 변형 미생물(MOGM) WCB의 튜브를 취하여 1㎖의 SBM + 100㎍/㎖ 앰피실린 + 34㎍/㎖ 클로람페니콜에 현탁시킨다.

상기 현탁액을 30㎖의 SBM + 100㎍/㎖ 앰피실린 + 34㎍/㎖ 클로람페니콜에 희석시킨다.

상기 현탁액을 37℃에서 하룻밤(O/N) 배양시킨다. 다음날 30㎖의 O/N 배양물을 800㎖의 SBM + 100㎍/㎖ 앰피실린 + 34㎍/㎖ 클로람페니콜에 희석시키고 각각 200㎖을 함유하는 41-리터 얼렌메이어 플라스크(Erlenmeyer flasks)에 나눠놓는다.

상기 각 플라스크의 내용물을 37℃에서 24시간 동안 배양시킨다. 상기 4개 플라스크의 내용물을 혼합하고 물로 1/20희석(50㎕ + 950㎕의 물)하여 OD600을 측정하였다.

정해진 부피의 예비 접종을 이후 멸균 튜브에서 10분간 7,500 ×g로 4℃에서 원심분리시킨다.

상기 박테리아를 420rpm으로 상온에서 20분간 교반시키면서 발효배양 각 1리터 당 20㎖의 SBM + 200㎍/㎖ 앰피실린 + 10㎍/㎖ 클로람페니콜에 재현탁시킨다. 동시에 발효 베슬을 준비하고 산소 프로브(probes)를 조정한다.

상기 산소 프로브를 37℃에서 0%의 질소에서 조정하고, 이후 거품제거제없이 600rpm에서 교반하면서 100% 공기로 조정한다.

발효 배양은 다음과 같은 실험 조건하에서 수행하였다.

배지 : SBM + 200㎍/㎖ 앰피실린 + 10㎍/㎖ 클로람페니콜

온도 : 37℃

용존 O₂의 % : 30%(공기 포화에 대해)

pH : 6.4 내지 7.4

거품제거제 : 물에 1 : 10으로 희석시킴 ; 750㎖의 배지 당 140㎕의 양으로 첨가하기 전에 강하게 교반시킨다.

유도

유도는 다음과 같은 조건으로 수행하였다.

유도 OD600 : 16 내지 20

유도제 : 최종 1mM의 IPTG

용존 O₂의 % : 10%(공기 포화에 대해)

유도 시간 : 3 시간 20분.

유도 직전에 20㎕의 박테리아를 취하여, 80㎕의 물을 첨가하고 유도 전 확인을 위해 보관하였다.

유도 단계 시, IPTG를 최종 농도 1mM로 첨가하였다.

용존 O₂의 비율은 10%였다.

유도 단계 종료 시 최종 OD600을 측정하고 전체 부피를 측정하였다.

이후, 10㎕의 박테리아를 취하여, 90㎕의 물을 첨가하고 유도 후 확인을 위해 보관하였다.

상기 유도 단계는 2개의 사전에 끓인 샘플 20㎕를 충진한 SDS-PAGE 전기영동을 통해 확인하였다.

유도시킨 박테리아를 함유한 배지를 7,500×g에서 10분간, 또는 3000×g에서 25분간 4℃에서 원심분리하고 상층액을 제거하였다.

결과: 상기 유도 결과는 도 1에 나타낸 바와 같이 SDS-PAGE 전기영동을 통해 확인하였다.

실시예 2 : 인클루젼 바디의 추출 및 정제

PLGF-1의 인클루젼 바디를 준비하고 리폴딩하는 과정에 관한 것이다. PLGF-1 박테리아 단백질을 리폴딩하여서 부분적으로 다이머 형태로 복귀시켰다.

물질 :

적절한 용량의 믹서.

용균 용액 : 1mM Mg₂SO4 + 20mM Tris-HCl pH8 + 1%의 Triton X100.

세척 용액 : 0.5% triton X100 + 10mM EDTA pH 8.

BD(변성 완충용액) : 8M 우레아, 50mM Tris pH8, 20mM 에틸렌디아민.

용해시키기 위한 H₂O.

산화 글루타치온 200× : H₂0에 100mM;

환원 글루타치온 200× : H₂O에 250mM.

희석 완충용액 : 최종 600μM PEG4000(2.4g/ℓ), 50mM Tris-HCl pH8, 20mM NaCl.

거품제거제 : 안티폼 O-10(실리콘성 아님)(시그마사).

PLGF-1 인클루젼 바디의 준비.

상기 용균 및 세척 용액을 상온에서 평형화시켰다.

-80/37℃에서 두 주기의 동결/용해를 수행하였다.

상기 박테리아 펠렛(pellet)을 각각 450 OD600의 박테리아 당 1㎖의 용균 용액으로 용균시켰다.

이후 상온에서 30분간 교반하면서(250rmp) 항온반응시켰다.

상기 용액을 적절한 용량의 믹서에 붓고 각각 450 OD600의 박테리아에 3㎖의 세척 용액을 첨가하였다.

필요할 경우, 0.4㎕의 희석하지 않은 거품제거제를 각 샘플 밀리리터 당 첨가하였다.

상기 용액을 최대 속도로 1분간 또는 샘플이 균질화될 때 까지 섞었다.

상기 믹서의 내용물을 이후 적적한 용량의 컨테이너에 옮기고 각각 450 OD600의 박테리아 당 6.5㎖의 세척 용액을 첨가하였다. 교반하면서 45분간 상온에서 배양하였다.

상기 현탁액을 13,000×g로 45분간 25℃에서 원심분리시키고 상층액을 제거하였다.

상기 펠렛을 각 450 OD600의 박테리아 당 4㎖의 세척 용액에 재현탁시키고 믹서에서 상기 과정을 두 번 반복하였다.

상기 현탁액을 적절한 용량의 컨테이너로 옮기고, 450 OD600의 박테리아 당 6.5㎖의 세척 용액으로 희석하고 교반하면서 30분간 상온에서 배양하였다.

상술한 조건으로 원심분리를 반복하고 상층액을 제거하였다.

실시예 3 : 단백질의 탈변성

상기 인클루젼 바디를 7㎖의 변성 완충용액 BD(8M 우레아 함유)에 용해시키고 OD280이 0.8이 될 때 까지 더욱 BD로 더욱 희석시킨다. 이후, 희석 완충용액의 0.6 부피를 첨가하여 최종 우레아 농도가 5M이 되도록 한다.

이후 1/200의 환원 글루타치온 200×(최종 농도 1.25mM) 및 1/200의 산화 글루타치온 200×(최종 농도 0.5mM)을 첨가하였다. 확인을 위한 15㎕의 샘플(prerefol)을 취하고 상기 용액을 이후 교반하면서 20℃에서 18 내지 20시간 동안 항온반응시켰다.

상기 항온반응 종결시, 배지를 10분간 20℃에서, 10,000×g로 원심분리하고0.45 또는 0.8㎛ 필터로 여과 시키고 확인을 위해 15㎕ 샘플(postrefol)을 취하였다.

결과 : 상기 전후 탈변성 용액의 15㎕ 샘플을 SDS-PAGE 전기영동을 통해 분석하였다(도 5).

실시예 4 : 음이온-교환 크로마토그래피

상기 탈변성 이후 PLGF-1 단백질을 정제하는 첫 단계에 관한 것이다. 컬럼에 샘플을 충진할 때, 흡착되지 않는 PLGF-1 모노머의 손실이 많았다. 상기 충진량은 컬럼 부피의 10배를 초과하지 말아야 하는데, PLGF-1 다이머의 손실이 클 수 있기 때문이다.

상기 용리는 200mM의 NaCl 농도에 상응하는 20%의 완충용액 B(하기 참조)에서 아이소크래틱 조건하에서 수행되었다. 상기 용리 피크는 OD280의 약 50%를 차지하는, 탈변성 단계에 사용된 글루타치온을 여전히 함유하고 있다.

물질 및 조건 :

FPLC 시스템 : FPLC 디렉터 소프트웨어로 조작됨. 아머샴-바이오사이언스사

모니터링 조건

U.V. : 파장 = 280㎚; 스케일 톱(scale top) = 2.

온도 : 20℃(최소 15, 최대 25)

레진 : Q-세파로스 패스트 플로우 (아머샴-바이오사이언스사).

컬럼 부피/높이 : 부피 : 충진 샘플 부피의 1/10; 높이 : 13 내지 16㎝.

평형화 : 2 컬럼 부피(CV)의 완충용액 B, 이후 1.5CV의 완충용액 A.

샘플 : 탈변성시키고, 원심분리 및/또는 여과시킨 PLGF-1. 10CV 충진.

완충용액 A : 20mM 에탄올아민-HCl pH 8.5.

완충용액 B : 완충용액 A + 1M NaCl.

주입 속도 : 1㎝/분(작은 컬럼에서 테스트한 최대 속도 = 1.887㎝/분; 테스트한 최소 속도 = 0.5㎝/분).

용리 속도 : 1㎝/분(작은 컬럼에서 테스트한 최대 속도 = 1.887㎝/분; 테스트한 최소 속도 = 0.5㎝/분).

세척

주입 : 1.5CV인 0%의 완충용액 B.

회수된 피크 : 20% 완충용액 B에서 아이소크래틱 조건에서 용리된 피크, 약 3CV로 흘림.

최종 세척 : 100% B에서 2CV.

과정:

20% 완충용액 B의 아이소크래틱 조건에서 용리한 피크를 회수하고, 0.271부피의 물, 0.0045부피의 TFA 및 0.225부피의 에탄올을 첨가하였다. 이러한 방법으로 상기 샘플을 1.5배 희석되었고 15%의 에탄올 및 0.3% TFA를 함유하게 되었다. 상기 두 물질의 첨가는 PLGF-1이 역상 레진에 결합되는 것을 촉진시켰다(실시예 5 참고).

결과: 상기 크로마토그래피 단계는 도 2에 나타낸 바와 같이 280㎚에서 흡광도를 모니터링하여 연속적으로 제어하였다.

분리된 단백질 물질의 순도는 SDS-PAGE 전기영동을 통해 분석하였다(도 5).

실시예 5 : 역상 크로마토그래피

이후 과정은 15마이크론 또는 30마이크론 평균 입경을 갖는 RP 소스 레진으로 수행되었다. 그러나, 30마이크론 RP 소스 레진은 정제 과정 중 어떠한 변경도 없으나, 레진 자체를 경제적으로 절약할 수 있고(약 50%), 컬럼 패키징 과정이 매우 용이하며 배압이 보다 낮다.

본 과정은 QFF 레진 통과 이후 PLGF-1 단백질을 정제하는 두번째 단계이다. 샘플 주입동안, 높은 흡착이 나타나고 레진에 붙지 않은 글루타치온의 비흡착 피크에 해당한다. 본 과정은 2개의 하위 단계로 이루어지는데, 전자는 RPCmon이라 불리며, PLGF-1 모노머 형태의 대부분을 제거하기 위한 단계이고, 반면, 후 단계는 본질적으로 다이머 성분의 단백질을 용리하기 위해 사용되며 RPCdim이라 한다.

첫번째 하위 단계(RPCmon)

물질 및 조건:

FPLC 시스템 : FPLC 디렉스 소프트웨어로 조작됨. 아머샴 바이오사이언스사

모니터링 조건

U.V. : 파장 = 280㎚; 전체 스케일 = 0.05.

온도 : 20℃ (최소 15, 최대 25).

레진 : 역상 소스 30 (아머샴 바이오사이언스사).

레진 부피/높이 : 부피 : 충진 샘플의 총 OD280의 1/5 - 1/6 ; 높이: 27 내지 33㎝.

평형화 : 2컬럼부피(CV)의 완충용액 B, 이후 2CV의 완충용액 A.

샘플 : 전 단계의 PLGF-1(실시예 4), 1.5배 희석되고 15% 에탄올 및 0.3% TFA를 함유함. 최대 충진량은 레진 ㎖ 당 4.5 내지 5.5 OD280.

완충용액 A : 40% 에탄올 + 0.1% TFA.

완충용액 B : 70% 에탄올 + 0.1% TFA.

주입 속도 : 1.887㎝/분.

용리 속도 : 1.887㎝/분.

이후 세척

주입 : 4% 완충용액 B로 1.5CV.

모노머 피크 : 12CV의 4 내지 40% 범위 구배(3%B/CV). 상기 피크의 용리를 시작한 직후, OD280이 전체 스케일의 25%에 도달하고, 상기 용리는 상기 피크 용리가 끝나는 시점(약 2.5 내지 3.5CV)에 도달한 완충용액 B 농도의 아이소크래틱 조건으로 계속하였다.

실시

"모노머" 피크에 해당하는 적절한 양의 용액을 취하고 농도를 확인하였다(도 5의 mon).

두번째 하위 단계 (RPCdim)

물질 및 조건:

컬럼을 재-평형화시키지 않고, 간단하기 UV 모니터의 스케일 범위를 2로 이동시키고, 10 내지 100% 범위의 완충용액 B 구배를 2.2CV로 흘려주었다(40.9%B/CV).

실시:

"다이머" 피크에 해당하는 분획을 취하였다. 도 4는 이의 예를 나타내었다. 이들을 회수하고 280㎚에서 흡광도를 측정하였다.

감압동결건조전에 얻은 총 수율(㎎으로 나타냄)을 OD280×부피×희석율로 산출하였다. 평균 수율 값은 박테리아 배양물 리터 당 164㎎의 순수 PLGF-1이며 표준편차는 23.21이었다. 또한 1000 OD600의 발효배양 박테리아 당 ㎎ 단위로 발현되며, 따라서 0.8의 표준편차를 가지며 각각 1000 OD600의 발효배양 박테리아 당 5.58㎎의 순수 PLGF-1을 얻었다.

상기 획득한 다이머 용액은 한외여과(ultradiafiltration) 및 감압동결건조까지 -20℃에 보관하였다. 상기 용액 샘플은 도 5에 나타낸 바와 같이 SDS-PAGE 전기영동하였다.

Claims

Ⅰ) 원핵세포를 발효배양시키는 단계, Ⅱ) 인클루젼 바디(inclusion bodies)를 추출 및 정제하는 단계, Ⅲ) 발현 단백질을 탈변성(renaturation)시키는 단계, Ⅳ) 이온-교환 크로마토그래피 단계, Ⅴ) 역상 크로마토그래피 단계를 포함하며, 상기 단계 (Ⅰ)은 600㎚에서 1 내지 50(OD⁶⁰⁰1 - 50)의 배양 배지 흡광도를 얻을 때까지 수행되고 유도 단계를 수행하며, 단계 (Ⅱ)는 배양 세포의 용균(lysis), DNA 파열 및 인클루젼 바디의 분리 단계를 포함하고, 단계 (Ⅲ)에서 상기 인클루젼 바디를 변성 완충용액에 용해시켜서 적어도 부분적으로 발현 단백질을 다이머 형태로 복귀시키며, 단계 (Ⅳ) 및 (Ⅴ)에서 상기 다이머 및 멀티머 형태의 발현 단백질을 모노머 형태와 분리시켜서 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 변형 원핵세포에서 유도가능 발현 시스템으로 발현된 재조합 태반성장인자(PLGF)를 추출 및 정제하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 태반성장인자(PLGF)는 인간 PLGF 1 또는 동물 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 원핵세포는 박테리아 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (Ⅰ)은 발효배양 단계에서 높은 박테리아 밀도를 얻을 수 있고, 동물 또는 인간 유래의 물질이 없는 배지에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (Ⅰ)은 하나 이상의 선택제, 효모 추출물, 글리세롤 및 암모늄염을 포함하는 배지에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 유도가능 발현 시스템은 발현 시스템 T7인 것을 특징으로 하는 방법.
전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 세포는 E.Coli로 부터 유래된 균주인 것을 특징으로 하는 방법.
전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 E.Coli{B121(DE3)pLysS}인 것을 특징으로 하는 방법.
전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 발현은 락토스, 이소프로필-β-티오갈락토피라노사이드(IPTG) 또는 기능적으로 이의 동종물에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는 방법.
전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 유도 시 배양물의 흡광도는 600㎚에서 14내지 30 OD(14 - 30 OD⁶⁰⁰), 바람직하게는 16 내지 20 (16 - 20 OD⁶⁰⁰)인 것을 특징으로 하는 방법.
전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (Ⅰ)은 예비접종(preinoculum)의 예비 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
전술한 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (Ⅱ)에서 세포용균은 동결/융해, 프렌치 프레스 또는 이와 동등한 다른 기술을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (Ⅱ)에서 DNA 파열은 추출 또는 재조합 유래의 DNAse, 바람직하게는 벤조나제, 또는 화학-기계적 수단에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (Ⅱ)에서 DNA 파열은 믹서를 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (Ⅱ)에서 인클루젼 바디는 적어도 두 주기의 원심분리 및 적절한 완충용액으로 세척시키는 단계를 통해 분리되는 것을 특징으로 하는 방법.
전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (Ⅲ)에서 인클루젼 바디는 우레아, 구아니딘 이소티오시아네이트, 구아니딘-하이드로클로라이드 또는 다른 변성제를 함유하는 변성 완충용액에 용해되고, 선택적으로 균질화 또는 초음파처리되는 것을 특징으로 하는 방법.
전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (Ⅲ)에서 인클루젼 바디를 용해시키, 상기 용액을 희석시키고 산화/환원제를 첨가하여 10 내지 30℃, 바람직하게는 20℃에서, 10 내지 30시간, 바람직하게 18 내지 10시간 동안 교반하면서 항온반응시켜 단백질 물질을 탈변성시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제17항에 있어서, 상기 용액은 280㎚에서의 흡광도(OD²⁸⁰)가 0.01 내지 2, 바람직하게는 0.5가 될 때까지 희석되며, 상기 산화/환원제는 다이머 형태의 형성이 최대가 되는 비율 및 농도로 글루타치온을 환원 및 산화시키는 것을 특징으로 하는 방법.
전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (Ⅳ)의 전 단계의 용액을 1 : 1 내지 10 : 1의 충진 부피/컬럼 부피 비율로 음이온-교환 컬럼에 충진시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제19항에 있어서, 상기 충진 부피/컬럼 부피 비율은 10 : 1인 것을 특징으로 하는 방법.
제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 단백질은 에탄올아민-HCl, NaCl 완충용액으로 용리되며, 모노머 형태의 단백질은 레진에 결합되지 않은 물질을 함유하는 분획에 주로 포함되는 반면, 다이머 형태의 단백질은 150 내지 250mM의 NaCl 농도에서 용리된 후속 분획에 실질적으로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (Ⅴ)에서 150 내지 250mM의 NaCl 농도로 전 단계에서 용리된 용액은 희석되고, 레진(resin) ㎖당 280㎚에서 4.5 내지 5.5 OD 흡광도에 상응하는 양으로 역상 크로마토그래피에 충진되는 것을 특징으로 하는 방법.
제22항에 있어서, 상기 단백질은 증가 구배의 유기 용매를 함유하는 용리 완충용액으로 두번의 연속적인 용리 단계를 통해 용리되는 것을 특징으로 하는 방법.
제23항에 있어서, 상기 첫번째 용리 단계는 모노머 형태의 용리 피크가 나타날 때 까지 증가 구배의 유기 용매 조건하에서 수행되고, 모노머 형태의 용리 피크가 사라질 때 까지 아이소크래틱(isochratic) 조건하에서 수행되며, 상기 제2 용리 단계는 주로 다이머 형태의 단백질이 완전하게 용리 될 때 까지 증가 구배의 유기용매 조건하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용리 완충용액은 에탄올, 메탄올 또는 아세토니트릴을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용리 완충용액은 증가 비율의 에탄올을 함유하는 하이드로알콜성 용액인 것을 특징으로 하는 방법.
제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 역상 크로마토그래피는 30-마이크론 입자의 평균 직경을 갖는 레진에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 적절한 첨가제의 존재 또는 부재하에서 한외여과되고 감압동결건조되는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
숙주 균주 오염물이 없고 1.5% 미만의 모노머 형태를 함유하며 실질적으로 다이머 및 멀티머 형태인 것을 특징으로 하는 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 방법을 통해 획득된 활성 형태의 태반성장인자.