DE60219321T2

DE60219321T2 - Einzelketten Kamel VHH Antikörper, Verfahren zu deren Herstellung in einem Säuger und deren Verwendung

Info

Publication number: DE60219321T2
Application number: DE60219321T
Authority: DE
Inventors: Frank Erasmus Universiteit Rotterdam GROSVELD
Original assignee: Erasmus University Medical Center
Current assignee: Erasmus University Medical Center
Priority date: 2001-04-24
Filing date: 2002-04-24
Publication date: 2008-03-20
Anticipated expiration: 2022-04-25
Also published as: CN1518559A; JP2005503128A; ES2284863T3; WO2002085944A3; US20040137570A1; WO2002085945A3; JP2010013479A; BR0209207A; EP1381630A2; CN1520424A; GB0110029D0; PT1414858E; WO2002085944A2; US20040142432A1; JP2005503129A; US20110004948A1; CY1107669T1; US8502014B2; CA2445253A1; CA2445255A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Erzeugung von Einzel-Kette-Immunoglobulinen in einem Säuger. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Erzeugung von Einzel-Kette-Camelidae-VHH-Antikörpern in einem Säuger. Einzel-Kette-Antikörper, erzeugt unter Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung, und deren Verwendungen sind ebenso beschrieben.
Hintergrund der Erfindung
Die Antigen-Bindungsdomäne eines Antikörpers umfaßt zwei separate Bereiche: eine variable Domäne der schweren Kette (VH) und eine variable Domäne der leichten Kette (V_L: das entweder V_kappa oder V_lambda sein kann). Die Antigenbindungsstelle selbst wird durch sechs Polypeptidschleifen gebildet: drei von der VH-Domäne (H1, H2 und H3) und drei von der V_L-Domäne (L1, L2 und L3). Ein anderes primäres Repertoire von V-Genen, die die VH- und V_L-Domänen kodieren, wird durch die kombinatorische Umlagerung von Gensegmenten hergestellt. Das VH-Gen wird durch die Rekombination von drei Gensegmenten, VH, D und J_H, hergestellt. Bei Menschen gibt es ungefähr 51 funktionelle VH-Segmente (Cook and Tomlinson (1995) Immunol Today, 16: 237), 25 funktionelle D-Segmente (Corbett et al. (1997) J. Mol. Biol., 268: 69) und 6 funktionelle J_H-Segmente (Ravetch et al. (1981) Cell, 27: 583), in Abhängigkeit des Haplotyps. Das VH-Segment kodiert den Bereich der Polypeptidkette, der die erste und die zweite Antigenbindungsschleife der VH-Domäne (H1 und H2) bildet, während sich die VH-, D- und J_H-Segmente vereinigen, um die dritte Antigenbindungsschleife der VH-Domäne (H3) zu bilden. Das V_L-Gen wird durch die Rekombination von nur zwei Gensegmenten, V_L und J_L, hergestellt. Bei Menschen gibt es ungefähr 40 funktionelle V_k-Segmente (Schäble und Zachau (1993) Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 374: 1001), 31 funktionelle Vλ-Segmente (Williams et al. (1996) J. Mol. Biol., 264: 220; Kawasaki et al. (1997) Genome Res., 7: 250), 5 funktionelle J_K-Segmente (Hieter et al. (1982) J. Biol. Chem., 257: 1516) und 4 funktionelle J_λ-Segmente (Vasicek and Leder (1990) J. Exp. Med., 172: 609), in Abhängigkeit des Haplotyps. Das V_L-Segment kodiert den Bereich der Polypeptidkette, der die erste und die zweite Antigenbindungsschleife der V_L-Domäne (L1 und L2) bildet, während sich die V_L- und J_L-Segmente vereinigen, um die dritte Antigenbindungsschleife der V_L-Domäne (L3) zu bilden. Es wird angenommen, daß Antikörper, ausgewählt aus diesem primären Repertoire, ausreichend verschieden sind, um beinah alle Antigene mit mindestens mäßiger Affinität zu binden. Antikörper mit hoher Affinität werden hergestellt durch „Affinitätsreifung" der umgelagerten Gene, wobei Punktmutationen erzeugt und durch das Immunsystem auf der Grundlage verbesserter Bindung selektiert werden.
Der schwere-Kette-Lokus enthält eine große Anzahl an variable-Kette-Genen (VH; tatsächlich keine vollständigen Gene, aber umfassend ein erstes Kodierungsexon plus Transkriptionsstartstelle), die an zwei kurze Kodierungsbereichen D und J (bekannt als VDJ-Rekombination) rekombiniert werden, so daß die Exons entstehen, die für den konstanten Bereich der schweren Kette Cμ kodieren, wodurch ein vollständiges Antikörper-schwere-Kette-Gen, bekannt als IgM, erhalten wird. Anschließend findet ein Klassenwechsel statt, wo der variable Teil mit einem anderen konstanten Bereich rekombiniert wird, der stromabwärts des IgM-konstanten Bereiches lokalisiert ist, um IgD, IgG, IgA und IgE zu erhalten (kodiert durch die Exons der verschiedenen Cδ, Cγ, Cα, Cε, lokalisiert stromabwärts des Gens für Cμ). Die dazwischenliegenden konstanten Bereiche werden in dem Verfahren gelöscht. Ein ähnliches Verfahren findet in den leichten Genloki statt, zunächst in dem κ-Lokus, und wenn dies nicht zu einem produktiven Antikörper führt, in dem λ-Lokus (zum Überblick siehe Rajewski, K., Nature 381, S. 751–758, 1996; für einen umfassenden Überblick siehe das Lehrbuch Immunobiology, Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Capra. J., Current Biology Publications/Churchill Livingstone/Garland Publishing, 4. Auflage, 1999, ISBN 0-8153-3217-3).
Camelidae (Kamele, Dromedare und Lamas) enthalten zusätzlich zu normalen schwere- und leichte-Kette-Antikörpern (2 leichte Ketten und 2 schwere Ketten in einem Antikörper) Einzel-Kette-Antikörper (enthaltend nur schwere Ketten). Diese werden kodiert durch eine bestimmte Gruppe von VH-Segmenten, die als VHH-Gene bezeichnet werden. Die Antigenbindung bei Einzel-Kette-Antikörpern unterscheidet sich von der, die bei konventionellen Antikörpern beobachtet wird, aber eine hohe Affinität wird in derselben Weise erhalten, d. h. durch Hypermutation des variablen Bereiches und Selektion der Zellen, die diese Antikörper mit hoher Affinität exprimieren (Affinitätsreifung). VH und VHH sind in das Genom eingestreut (d. h., sie erscheinen miteinander gemischt). Die Identifikation eines identischen D-Segments in einer VH- und VHH-cDNA läßt auf die übliche Verwendung des D-Segments für VH und VHH schließen. Natürlichen VHH-enthaltenden Antikörpern fehlt es an der gesamten C_H1-Domäne des konstanten Bereiches der schweren Kette. Das Exon, das für die C_H1-Domäne kodiert, liegt in dem Genom vor, wird aber aufgrund des Verlusts einer funktionellen Spleißakzeptorsequenz an der 5'-Seite des C_H1-Exons herausgespleißt. Infolgedessen wird der VDJ-Bereich auf dem C_H2-Exon gespleißt. Wenn ein VHH auf diesen konstanten Bereichen (C_H2, C_H3) rekombiniert wird, wird ein Antikörper hergestellt, der als ein Einzel-Kette-Antikörper fungiert (d. h. ein Antikörper mit zwei schweren Ketten ohne eine Leichtketteninteraktion). Die Bindung eines Antigens unterscheidet sich von der, die bei einem konventionellen Antikörper beobachtet wird, aber eine hohe Affinität wird in derselben Weise erhalten, d. h. durch Hypermutation des variablen Bereiches und Selektion der Zellen, die diese Antikörper mit hoher Affinität exprimieren.
Die Struktur von isolierten VH-Domänen ist bestimmt worden unter Verwendung von NMR- und Röntgenkristallographietechniken (Spinell et al, (1996), Nat Structural biol. 3, 752). Daten zeigen, daß die Immunoglobulin-Faltung gut in Camelidae-VHH-Domänen konserviert ist. Zwei Beta-Faltblätter (eines mit vier und eines mit fünf Beta-Strängen) werden gegeneinander gepackt und durch eine konservierte Intradomäne-Disulfidbindung zwischen C22 und C92 stabilisiert. Die Seite der Kamel-VHH-Domäne, die der VL-Grenzfläche des normalen VH in einem Fv entspricht, weist einen völlig anderen Aufbau auf. Im Vergleich zu dem humanen VH sind in dieser Region vier Aminosäuresubstitutionen lokalisiert.
Aus einer Durchsicht aller humanen und Maus-VH-Antigenbindungsschleifenstrukturen wird offensichtlich, daß es nur eine beschränkte Anzahl an möglichen Konformationen gibt. Drei und vier unterschiedliche Konformationen werden für die erste bzw. die zweite Antigenbindungsschleife beschrieben. Diese kanonischen Strukturen werden durch die Länge der Schleife und die Gegenwart von speziellen Resten an Schlüsselpositionen bestimmt. Die H3-Schleife ist extrem variabel hinsichtlich ihrer Länge und Sequenz (Wu et al. (1993) Proteins: structure, funct and genet., 16, 1). Überraschenderweise weicht die Antigenbindungsschleife von Kamel-VH-Domänen von den kanonischen Schleifendefinitionen von humanen und Maus-VHH-Domänen ab. Diese Abweichung konnte nicht vorhergesagt werden, da die Schleifenlänge und die Reste an den Schlüsselpositionen zwischen Kamel-VH und humanem VH sehr ähnlich sind. Die zusätzlichen kanonischen Schleifenstrukturen in Kamel-VH-Domänen machen das strukturelle Repertoire ihres Paratops größer als das von VH-Domänen in Fv-Fragmenten aus konventionellen Antikörpern. Außerdem ist der hypervariable Bereich um die erste Antigenbindungsschleife herum im Vergleich zu humanen oder Maus-Antikörpern größer. Es wird angenommen, daß die Verlängerung des ersten hypervariablen Bereiches und der gleichzeitig vergrößerten Antigenbindungsoberfläche im Vergleich zu der eines VH in einem konventionellen Antikörper die Abwesenheit einer VL-Domäne teilweise kompensiert (Riechmann, L. & Muyldermans, S (1999), 231 25–38).
Ein Einzeldomäne-Camelidae-VHH-Antikörper, der ebenso für die Strukturanalyse als die größeren schwere- und leichte-Kette-Antikörpermoleküle stärker geeignet ist, stellt ebenso eine kleine und effiziente Antigenbindungseinheit bereit. Ein solcher Antikörper weist ein großes und verändertes therapeutisches Potential auf. Außerdem ist herausgefunden worden, daß Camelidae-Einzel-Kette-Antikörper Antigene binden können, die für Antikörper unzugänglich sind, welche sowohl schwere als auch leichte Ketten besitzen. Es wird angenommen, daß diese Fähigkeit auf der Gegenwart einer großen vorstehenden dritten hypervariablen Schleife mit 10 Aminosäuren oder mehr basiert, die in Hohlräume von Antigenoberflächen eindringen kann. Dies ist besonders deshalb signifikant, da die katalytische Stelle eines Enzyms oftmals an dem größten Hohlraum auf seiner Proteinoberfläche lokalisiert ist. (La dowski, R. A (1996). Protein Science 5, 2438). Diese Stellen sind normalerweise nicht immunogen für konventionelle s-Antikörper (Novotny, J et al., (1986) Proc Nat Acad Sci USA, 83, 226). In der Struktur des Kamel-VHH-cAb-Lys3 dringen die 24 Reste der H3-Schleife tief in die aktive Stelle von Lysozym ein (Transue, T. R et al. (1998) Prot: Structure, Funct and Genet, 32, 515), was zeigt, daß Kamel-schwere-Kette-Antikörper das Potential aufweisen, spezifische Enzyminhibitoren zu bilden.
Kürzlich sind isolierte Camelidae-VHH-Domänen in Bakterien erzeugt worden (Riechmann, L et al. Journal of Immunological Methods 231 (1999), 25–38). Jedoch haben die bakteriellen Expressionssysteme den Nachteil, daß sie keine posttranslationellen Modifikationen durchführen. Diese Modifikationen, insbesondere Glycosylierungsvorgänge, sind für die effektive Funktion von Antikörpern entscheidend, speziell in einer In-vivo-Umgebung.
In derselben Studie wurden die Gene für Kamel-VHH-Domänen in Expressionsvektoren eingeführt und in Cos-Zellen exprimiert, um Multi-Domänen-Proteine zu erzeugen. In einem Beispiel wurde nur ein intakter Einzel-schwere-Kette-Antikörper erzeugt durch Klonen eines speziellen Kamel-VHH in Gegenwart der hinge- und der Effektorfunktions-Domäne von humanem IgG1. Die Expression in Cos-Zellen hat den Vorteil gegenüber bakteriellen Expressionssystemen, daß posttranslationelle Modifikationsvorgänge in diesen Zellen stattfinden. Übereinstimmend damit war das Ergebnis, daß diese Antikörper bei der Antigenbindung vollständig aktiv waren. Die DNA für die Erzeugung dieser Konstrukte wird im allgemeinen aus vollständig entwickelten Antikörpern (d. h. aus denen, die der Affinitätsreifung unterlagen), die aus B-Zellen erzeugt werden, isoliert. Obwohl diese Einzel-Kette-Antikörper, exprimiert in Säugerzellen in einer In-vitro-Umgebung, an ein oder mehrere Antigene binden können, können sie nicht den Klassenwechselprozessen (Isotypwechselprozessen) und dem Affinitätsreifungsprozeß (Hypermutationsprozeß) unterliegen. Daher unterliegen die Einzel-Kette Antikörper, die in Cos-Zellen exprimieren, nicht dem Prozeß der Antikörperentwicklung, wie die natürlich vorkommenden Antikörper, die innerhalb eines Säugers erzeugt werden. Es ist dieser Prozeß der Antikörperentwicklung, der zur Produktion von spezifischen Antikörpern führt, die mit hoher Affinität binden. Daher bleibt der Bedarf in der Technik an einem Verfahren bestehen, welches die Erzeu gung von Einzel-Kette-VHH-Antikörpern in einem Säuger erlaubt, so daß die normalen Prozesse der Antikörperentwicklung stattfinden können.
Außerdem sind Camelidae-Einzel-Kette-Antikörper ebenso unter Verwendung der Phagenanzeigetechnologie selektiert und exprimiert worden. (Riechmann, L. & Davies, S. J. Biomol. NMR, 6, 141). Erneut werden die Antikörperkonstrukte aus Nukleinsäure, die aus vollständig entwickelten B-Zellen oder der Milz isoliert werden, erzeugt, und deshalb unterliegen, wie in dem obigen Fall, die exprimierten Antikörper keinem Klassenwechsel und keiner somatischen Hypermutation (Affinitätsreifung), die für die Produktion von spezifischen Antikörpern, die an ihr Antigen mit Selektivität und hoher Affinität binden, notwendig sind.
Die betreffenden Erfinder erkannten, daß, wenn sie den Mechanismus verstehen könnten, durch den Camelidae-Einzel-Kette-Antikörpermoleküle während der frühen Antikörperentwicklung in B-Zellen entwickelt werden (durch Klassenwechsel und Affinitätsreifung), dieses System dann in vivo wieder hergestellt werden kann. Dies würde die Erzeugung von großen Mengen eines entwickelten Einzel-Kette-Antikörpers für strukturelle, therapeutische und diagnostische Anwendungen erlauben.
Zusammenfassung der Erfindung
Antikörpermoleküle, die sowohl schwere als auch leichte Ketten umfassen, wechseln die Klassen während der B-Zellen-Entwicklung. Sich entwickelnde B-Zellen im Knochenmark exprimieren zunächst Membran-gebundenes IgM. Während der Entwicklung wird sekretorisches IgG exprimiert. Im Fall von Antikörpern, die sowohl leichte als auch schwere Ketten besitzen, wird ein J-Bereich auf einem Cμ-Bereich rekombiniert, um ein IgM herzustellen, umfassend VH-, D- und J-Bereiche. Die IgM-produzierende Zelle reift weiter durch Wechseln zu einem anderen schwere-Kette-konstanten-Bereich, um beispielsweise IgA herzustellen. Der Mechanismus der Rekombination umfaßt eine Pseudo-leichte-Kette, die mit dem VH-Teil von IgM rekombiniert, wobei die Pseudo-leichte-Kette während der frühen B-Zellabstammung vorliegt.
Die betreffenden Erfinder erkannten, daß das Verständnis des Mechanismus, durch den Einzel-Kette-Antikörper die Klassen wechseln und/oder der Affinitätsreifung (Antikörperentwicklung) während der Vor-B-Zellentwickung unterliegen, die Erzeugung eines VHH-Lokus, wie hierin definiert, erlauben würde, was zur Herstellung eines spezifischen Einzel-Kette-VHH-Antikörpers führt, der einem Entwicklungsprozeß unterliegt, der ähnlich oder gleich dem von cameliden Antikörpern ist, die in ihrer nativen Umgebung erzeugt werden.
Daher stellt in einem ersten Aspekt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines VHH-Einzel-schwere-Kette-Antikörpers in einem nicht-humanen transgenen Säuger bereit, umfassend den Schritt des Exprimierens eines heterologen VHH-schwere-Kette-Lokus in dem Säuger, wie in Anspruch 1 definiert.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines kamelisierten VH-Einzel-schwere-Kette-Antikörpers in einem nicht-humanen transgenen Säuger bereit, umfassend den Schritt des Exprimierens eines kamelisierten VH-schwere-Kette-Lokus in dem Säuger, wie im Anspruch definiert.
Bevorzugte Merkmale der Erfindung werden in den anhängenden Ansprüchen dargestellt.
Bevorzugt umfaßt der VHH-schwere-Kette-Lokus oder der kamelisierte VH-schwere-Kette-Lokus mindestens eine Rekombinationssequenz (rss), die einen J-Bereich direkt mit einem Cγ-konstante-schwere-Kette-Gen rekombinieren kann.
Bevorzugt umfaßt der kamelisierte VH-schwere-Kette-Lokus mindestns einen D-Bereich humanen Ursprungs und mindestens einen J-Bereich humanen Ursprungs.
Die betreffenden Erfinder haben gezeigt, daß im Fall von Einzel-schwere-Kette-Antikörpern ein Klassenwechsel stattfindet, um scAb zu bilden (eine vollständige Polypeptidkette eines Einzel-schwere-Kette-Antikörpers). Dieser Mechanismus umfaßt das Rekombinieren des J-Bereiches direkt mit einem Cγ-schwere-Kette-Bereich-Gen des konstante-schwere-Kette-Bereichs bevorzugt im Knochenmark, was zur Erzeugung eines scIgG (Einzel-Kette-IgG-Molekül) führt. Die Gegenwart einer Rekombinationssignalsequenz (rss) in dem Konstrukt erlaubt die direkte Verbindung des J-Bereiches mit dem Cγ-Gen.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung ist der Säuger kein Mensch. Es ist günstiger, wenn der transgene Säuger kleiner als ein Camelidae ist und leichter zu halten und mit den gewünschten Antigenen zu immunisieren ist. Idealerweise ist der transgene Säuger ein Nagetier, wie ein Kaninchen, ein Meerschweinchen, eine Ratte oder eine Maus. Mäuse sind besonders bevorzugt. Alternative Säuger, einschließlich Ziegen, Schafe, Katzen, Hunde und anderer Haustiere oder Wildsäuger, können ebenso eingesetzt werden.
Vorteilhafterweise werden schwere-Kette-Loki, die für den Säuger endogen sind, gelöscht oder stummgeschalten, wenn ein Einzel-Kette-Antikörper gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung exprimiert wird. Geeignete Techniken für das letztere sind in WO 00/26373 oder WO 96/33266 und (Li and Baker (2000) Genetics 156 (2): 809–821; Kitamura and Rajewsky (1992); Kitamura and Rajewsky, (1992) Nature 356, 154–156) beschrieben.
Der Ausdruck „VHH-Einzel-schwere-Kette-Antikörper" bedeutet ein Antikörpermolekül, das nur aus schweren Ketten (im allgemeinen zwei) besteht und keine leichten Ketten umfaßt. Jede schwere Kette umfaßt einen variablen Bereich (kodiert durch VHH-, D- und J-Exons) und einen konstanten Bereich. Der konstante Bereich umfaßt ferner eine Anzahl an CH (konstante-schwere-Kette-Domänen) und umfaßt vorteilhafterweise zwei: eine CH2-Domäne und eine CH3-Domäne, kodiert durch ein konstante-Bereich-Gen. Ein VHH-Einzel-Kette-Antikörper, wie hierin definiert, besitzt keine funktionelle CH1-Domäne, und es mangelt ihm ebenso an einer funktionellen CH4-Domäne. Es ist der Mangel an einer funktionellen CH1-Domäne (die in konventionellen Antikörpern den Verankerungsplatz für die konstante Domäne der leichten Kette besitzt), der die Unfähigkeit des schwere-Kette-Antikörpers, sich mit leichten Ketten unter Bildung konventioneller Antikörper zu verbinden, begründet.
Der Ausdruck „kamelisierter VH-Einzel-schwere-Kette-Antikörper" bedeutet ein Antikörpermolekül, das nur aus schweren Ketten (im allgemeinen zwei) besteht und keine leichten Ketten umfaßt. Jede schwere Kette umfaßt einen variablen Bereich (kodiert durch ein kamelisiertes VH-Exon/s, D- und J-Exon/s) und einen konstanten Bereich. Der konstante Bereich umfaßt mindestens ein konstante-Bereich-Gen. Jedes konstante-Bereich-Gen umfaßt eine Anzahl von konstante-Bereich-Exons, wobei jedes Exon eine konstante-Bereich-CH-Domäne kodiert. Im allgemeinen umfaßt der konstante Bereich zwei CH-Domänen: eine CH2-Domäne und eine CH3-Domäne. Ein kamelisierter VH-Einzel-Kette-Antikörper, wie hierin definiert, besitzt keine funktionelle CH1-Domäne, außerdem mangelt es ihm ebenso an einer funktionellen CH4-Domäne. Es ist der Mangel an einer funktionellen CH1-Domäne (die in konventionellen Antikörpern den Verankerungsplatz für die konstante Domäne der leichten Kette besitzt), der die Unfähigkeit des schwere-Kette-Antikörpers, sich mit leichten Ketten unter Bildung konventioneller Antikörper zu verbinden, begründet.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck ,heterolog' einen VHH-schwere-Kette-Lokus, wie hierin beschrieben, der für den Säuger nicht endogen ist. Das heißt in dem Fall, wo der Säuger ein Camelidae, d. h. ein Kamel oder ein Lama, ist, erfolgt die Expression von einem VHH-Lokus, der normalerweise nicht in einem Kamel bzw. einem Lama gefunden wird.
Ein ,VHH-schwere-Kette-Lokus' besteht im Kontext der vorliegenden Erfindung aus einem ,VHH-Bereich', einem ,J-Bereich', einem ,D-Bereich' und einem ,konstante-schwere-Kette-Bereich'. Jeder VHH-Bereich umfaßt ein VHH-Exon, jeder J-Bereich ein J-Exon und jeder D-Bereich ein D-Exon, und jeder konstante-schwere-Kette-Bereich umfaßt ein oder mehrere schwere-Kette-konstante-Bereich-Gene. Außerdem umfaßt im wesentlichen nicht jeder VHH-Bereich ein oder mehrere funktionelle VH-Exons.
Ein ,VHH-Exon/Bereich' beschreibt im Kontext der vorliegenden Erfindung eine natürlich vorkommende VHH-Kodierungssequenz, wie die, gefunden in Camelidae und jedem Homologon, Derivat oder Fragment davon, so lange das/der resultierende Exon/Bereich mit einem D-Exon/Bereich, einem J-Exon/Bereich und einem konstan te-schwere-Kette-Bereich (der mehrere Exons umfaßt) gemäß der vorliegenden Erfindung rekombiniert, um einen VHH-Einzel-Kette-Antikörper zu erzeugen, wie hierin definiert, wenn die Nukleinsäure exprimiert wird.
Ein ,kamelisierter VH-schwere-Kette-Lokus' besteht aus einem „kamelisierten VH-Bereich', wie hierin definiert, einem ,J-Bereich', einem ,D-Bereich' und einem ,konstante-schwere-Kette-Bereich'. Jeder kamelisierte VH-Bereich umfaßt ein kamelisiertes VH-Exon, jeder J-Bereich ein J-Exon und jeder D-Bereich ein D-Exon, und jeder konstante-schwere-Kette-Bereich umfaßt ein oder mehrere konstante-schwere-Kette-Bereich-Exons.
Ein ,kamelisiertes/r VH-Exon/Bereich' beschreibt im Kontext der vorliegenden Erfindung eine natürlich vorkommende VH-Kodierungssequenz, abgeleitet aus anderen Säugern als Camelidae, beispielsweise einem Mensch, der so mutiert worden ist, daß die Sequenz dieselbe wie die eines cameliden Exons ist. Ein kamelisiertes VH-Exon umfaßt innerhalb seines Umfangs ebenso jedes Homologon, Derivat oder Fragment des Exons, so lange das/der Exon/Bereich mit einem D-Bereich/Exon, einem J-Bereich/Exon und einem konstante-schwere-Kette-Breich, umfassend ein oder mehrere Exons, rekombinieren kann, um einen kamelisierten VH-Einzel-Kette-Antikörper, wie hierin definiert, zu erzeugen.
VHH- und VH-Exons können von natürlich vorkommenden Quellen abgeleitet werden, oder sie können unter Verwendung von Verfahren, ähnlichen denen in der Technik oder den hierin beschriebenen, synthetisiert werden.
Ebenso umfassen im Kontext der vorliegenden Erfindung die Ausdrücke ,D-Exon' und ,J-Exon' natürlich vorkommende Sequenzen von D- und J-Exons, die in Camelidae oder anderen Säugerspezies gefunden werden. Die Ausdrücke D-Exon und J-Exon umfassen ebenso innerhalb ihres Umfangs Derivate, Homologa und Fragmente davon, wenn das resultierende Exon mit den restlichen Komponenten eines schwere-Kette-Antikörper-Lokus, wie hierin beschrieben, rekombinieren kann (entweder kamelisiertes VH oder VHH), um einen Einzel-Kette-Antikörper, wie hierin beschrieben, zu erzeugen. D- und J-Exons/Bereiche können aus natürlich vorkommen den Quellen stammen, oder sie können unter Verwendung von Verfahren, ähnlich denen in der Technik und den hierin beschriebenen, synthetisiert werden.
Außerdem umfaßt ein schwere-Kette-Antikörper-Lokus (entweder VHH oder kamelisiertes VH) einen Bereich an DNA, der ein konstante-schwere-Kette-Polypeptid (einen konstante-schwere-Kette-Bereich) kodiert.
Jeder konstante-schwere-Kette-Bereich umfaßt im wesentlichen mindestens ein konstante-Bereich-schwere-Kette-Gen, das Cγ ist, so daß die Erzeugung von Einzel-Kette-IgG stattfinden kann. Jedes konstante-schwere-Kette-Gen umfaßt ein oder mehrere konstante-schwere-Kette-Exons, die cameliden oder nicht-cameliden Ursprungs sein können und aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus Cδ, Cγ_1-4, Cε und Cα_1-2. Bevorzugt ist mindestens ein schwere-Kette-konstante-Bereich-Exon in einem schwere-Kette-Antikörper-Lokus humanen, Maus- oder Kaninchenursprungs. Vorteilhafterweise ist mindestens ein Cγ-schwere-Kette-Exon humanen Ursprungs. Wenn exprimiert, mangelt es dem konstante-schwere-Kette-Bereich an einer funktionellen CH1- und CH4-Domäne, die in Doppelkette-Antikörpern vorliegt. Vorteilhafterweise liegen nur ein oder mehrere Cγ2- und/oder Cγ3-Gene mit modifizierten (nicht-funktionellen) CH1-Domänen in dem konstante-schwere-Kette-Bereich vor.
Ein ,konstante-schwere-Kette-Bereich-Exon' (,C_H-Exon'), wie hierin definiert, umfaßt die Sequenzen von natürlich vorkommenden CH-Exons, wie die, die bei Camelidae oder Menschen oder anderen Säugern, einschließlich Kaninchen und Mäusen, gefunden werden. Der Ausdruck ,C_H-Exon' umfaßt innerhalb seines Umfangs ebenso Derivate, Homologa und Fragmente davon, insofern das C_H-Exon befähigt ist, einen funktionellen Einzel-schwere-Kette-Antikörper zu bilden (umfassend entweder Bereiche, kodiert durch VHH-Exons oder kamelisierte VH-Exons), wie hierin definiert, wenn es eine Komponente eines konstante-schwere-Kette-Bereiches ist.
Im allgemeinen umfassen C_H-Gene drei oder vier Exons (C_H1–C_H4), die unterschiedliche Domänen von jedem konstante-schwere-Kette-Polypeptid kodieren, wobei im allgemeinen zwei Polypeptide einen Einzel-schwere-Kette-Antikörper, wie hierin beschrieben, bilden. Jedoch besitzen, wie zuvor erläutert, VHH- und kamelisierte VH-Einzel-Kette-Antikörper kein funktionelles CH1 (enthaltend den leichte-Kette-Domäne-Verankerungsbereich) oder CH4. Daher besitzen Einzel-schwere-Kette-Antikörper-Loki ein oder mehrere Gene, die keine funktionellen CH1- oder CH4-Domänen exprimieren. Dies kann durch Mutation, Deletion, Substitution oder eine andere Behandlung der CH1- und CH4-Exons des konstante-schwere-Kette-Bereich-Gens auftreten.
Bevorzugt umfaßt ein Einzel-Kette-VHH-Lokus mindestens ein konstante-schwere-Kette-Gen, wobei die Nukleinsäure, die die CH1- und CH4-Domäne kodiert, mutiert, gelöscht oder substituiert oder anderweitig behandelt ist, so daß die konstante schwere Kette des exprimierten VHH-Einzel-Kette-Antikörpers, wie hierin definiert, keine funktionelle CH1-Domäne und CH4-Domäne enthält.
Zur Vermeidung von Zweifeln bedeutet der Ausdruck ,Kaninchenursprung' oder ,humaner Ursprung', wie oben bezeichnet, daß die Nukleinsäuresequenz von einem oder mehreren Exons, umfassend einen schwere-Kette-Antikörper-Lokus (entweder kamelisiertes VH oder VHH), dieselbe ist wie ein oder mehrere natürlich vorkommende Kaninchen- oder Mensch-Antikörper-Lokus-Exons. Ein Fachmann wird erkennen, daß diese Exons von natürlichen Quellen stammen können oder unter Verwendung von Verfahren synthetisiert werden können, die dem Fachmann vertraut sind und hierin beschrieben werden.
Jedes VHH oder jeder ,kamelisierter VH-Bereich' umfaßt ein VHH-Exon bzw. ,kamelisiertes VH-Exon'. Jeder J-Bereich und D-Bereich umfaßt ein J- bzw. D-Exon. Bevorzugt umfaßt jeder schwere-Kette-Lokus mehr als ein, mehr als 2, mehr als 3, mehr als 4, mehr als 5, mehr als 6 J- und/oder D-Bereiche/Exons. Am stärksten bevorzugt umfaßt ein VHH-Lokus oder kamelisierter VH-Lokus dieselbe Anzahl an VHH-Exons/Bereichen und/oder D-Exons/Bereichen und/oder J-Exons/Bereichen, wie die, die in einem Camelidae gefunden werden.
Vorteilhafterweise ist das Verfahren der vorliegenden Erfindung für die Herstellung eines Einzel-Kette-Antikörpers durch die Expression eines VHH-schwere-Kette- Lokus oder kamelisierten VH-schwere-Kette-Lokus gedacht, umfassend ein oder mehrere konstante-schwere-Kette-Exons humanen, Kaninchen- oder Maus-Ursprungs, wie hierin definiert. Das heißt, bevorzugt wird ein Einzel-schwere-Kette-Antikörper durch die Expression eines hybriden cameliden/humanen Lokus oder eines hybriden cameliden/Kaninchen-Lokus oder eines hybriden cameliden/Maus-Lokus erzeugt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform von diesem Aspekt der Erfindung umfaßt der Einzel-schwere-Kette-Lokus, exprimiert gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung, alle VHH-Exons cameliden Ursprungs und alle D-, J- und konstante-schwere-Kette-Bereich-Exons humanen, Kaninchen- oder Maus-Ursprungs. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt der Einzel-schwere-Kette-Lokus, exprimiert gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung, alle kamelisierten VH-Exons und alle D-, J- und konstante-schwere-Kette-Bereich-Exons humanen, Kaninchen- oder Maus-Ursprungs.
Bevorzugt umfaßt der schwere-Kette-Lokus ferner eine oder mehrere Kassettenstellen, die das direkte Übertragen des Lokus von einem Vektor zu einem anderen als Kassette ermöglichen. Vorteilhafterweise sind eine oder mehrere Kassettenstellen in der 5'-Leitsequenz des Lokus und/oder dem 3'-untranslatierten Bereich des Lokus lokalisiert. Bevorzugt sind eine oder mehrere Kassettenstellen sowohl in der 5'-Leitsequenz des Lokus als auch in dem 3'-untranslatierten Bereich des Lokus lokalisiert. Die direkte Übertragung als Kassette erlaubt beispielsweise die Bewegung einer Nukleinsäure in einen bakteriellen Expressionsvektor für die Addition von Markierungen und Signalen.
Dieser Ansatz zum Erzeugen hybrider Einzel-schwere-Kette-Antikörper, wie oben beschrieben, kann von besonderem Nutzen bei der Erzeugung von Antikörpern für die humane therapeutische Verwendung sein, da oftmals die Verabreichung von Antikörpern an eine Spezies der Wirbeltiere, die anderen Ursprungs als die Quelle der Antikörper ist, zum Ausbruch einer Immunantwort gegen diese verabreichten Antikörper führt. Hybride camelide/humane Einzel-Kette-Antikörper sind deshalb möglicherweise weniger immunogen als camelide Einzel-Kette-Antikörper, wenn sie an einen Menschen verabreicht werden.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung umfaßt dasselbe im wesentlichen dasselbe. Im wesentlichen dasselbe bedeutet mehr als 80 % homolog, bevorzugt mehr als 85 %, 90 %, 95 % homolog. Stärker bevorzugt mehr als 96, 97, 98 % homolog. Am stärksten bevorzugt bedeutet im wesentlichen dasselbe, daß der mutierte humane VH-Bereich mehr als 99 % homolog zu einem kameliden VHH-Bereich ist.
Antikörper, die gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, haben den Vorteil gegenüber denen des Standes der Technik, daß sie einem Verfahren des Klassenwechsels unterliegen, das ähnlich dem oder dasselbe wie das eines Einzel-Kette-Camelidae-Antikörpers ist, der in seiner normalen Umgebung erzeugt wird. Antikörper, die gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung erhältlich sind, können monoklonale oder polyklonale Antikörper sein. Vorteilhafterweise sind sie monoklonale Antikörper. Antikörper können unter Verwendung der Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, erzeugt werden. Vorteilhafterweise können Hybridome zum Erzeugen monoklonaler Antikörper verwendet werden. Techniken sind dem Fachmann vertraut und sind hierin beschrieben.
In noch einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Vektor bereit, umfassend einen VHH-schwere-Kette-Lokus gemäß der vorliegenden Erfindung.
In noch einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Vektor bereit, umfassend einen kamelisierten VH-schwere-Kette-Lokus gemäß der vorliegenden Erfindung.
Geeignete Vektoren sind dem Fachmann vertraut. Vorteilhafterweise ist ein Vektor, der zum Einführen großer Mengen von Nukleinsäure geeignet ist, die ausreichend sind, um einen vollständigen Immunoglobulin-schwere-Kette-Lokus zu kodieren, bevorzugt. Geeignete Vektoren umfassen Hefe- und bakterielle künstliche Chromosomen, wie YACs und BACs. Vorteilhafterweise werden die Vektoren so konstruiert, daß eine direkte Übertragung von Nukleinsäure, die einen Einzel-schwere-Kette-Antikörper-Lokus kodiert, wie hierin definiert, in einen anderen Vektor als Kassette durchgeführt werden kann. Beispielsweise kann die reverse transkripierte cDNA, die für einen Einzel-schwere-Kette-Antikörper kodiert, in einen bakteriellen Expressions vektor ,als Kassette übertragen" werden, was die Addition von Markierungen, Signalen oder Epitopen erlaubt.
In noch einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Wirtszelle bereit, transformiert mit einem VHH-Lokus gemäß der vorliegenden Erfindung.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung umfaßt der Ausdruck ,transgener Säuger' innerhalb seines Umfangs keinen transgenen Menschen. Bevorzugt ist ein transgener Säuger kleiner als ein Camelidae. Bevorzugt wird er aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus: einer Maus, einer Ratte, einem Meerschweinchen, einem Hamster, einem Affen und einem Kaninchen. Günstigerweise ist er eine Maus.
Vorteilhafterweise werden schwere-Kette-Loki, endogen für das transgene Tier, in einem transgenen Säuger, der in dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, gelöscht oder stummgeschaltet. Geeignete Techniken für letzteres sind in WO 00/26373 oder WO 96/33266 und (Li and Baker (2000) Genetics 156 (2): 809–821; Kitamura and Rajewsky (1992); Kitamura and Rajewsky, (1992) Nature 356, 154–156) beschrieben.
Antikörper-produzierende Zellen können von transgenen Tieren abgeleitet und beispielsweise bei der Herstellung von Hybridomen zur Herstellung von VHH-Einzel-Kette-Antikörpern, wie hierin definiert, verwendet werden. Außerdem oder alternativ können Nukleinsäuresequenzen aus transgenen Säugern isoliert werden und verwendet werden, um Einzel-Kette-Antikörper unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken herzustellen, die dem Fachmann bekannt sind. Alternativ oder außerdem können spezifische Einzel-Kette-Antikörper durch Immunisieren eines transgenen Tieres, wie hierin beschrieben, erzeugt werden.
Daher ist hierin ein Verfahren zur Herstellung von Einzel-Kette-Antikörpern durch Immunisieren eines transgenen Säugers, wie hierin beschreiben, mit einem Antigen beschrieben.
Bevorzugt ist der Säuger eine Maus.
Der Ausdruck „Immunisieren" eines Säugers bedeutet das Verabreichen eines Antigens an einen transgenen Säuger, so daß eine Immunantwort gegen das Antigen ausgelöst wird. Geeignete Verfahren zur Immunisierung von Säugern sind dem Fachmann vertraut und sind hierin beschrieben. Geeignete Antigene können natürlich vorkommen oder synthetisch sein. Natürlich vorkommende Antigene umfassen Proteine, die beispielsweise Enzyme oder Cofaktoren, Peptide und Nukleinsäuremoleküle sein können. Ein Fachmann wird erkennen, daß diese Liste nicht ausschließlich sein soll.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt einen bevorzugten Einzel-Kette-Antikörper-Lokus.
Definitionen
Ein ,Gen' umfaßt ein oder mehrere Exons, die für eine vollständige mRNA kodieren. Ein ,Antikörpergen' umfaßt V-, D-, J-Exons, die rekombinieren, um einen VDJ-kodierenden Bereich zu bilden, und die dann weiter mit einem konstante-schwere-Kette-Bereich rekombinieren, umfassend ein oder mehrere konstante-schwere-Kette-Exons. Es gibt viele Untergruppen von V-, D-, J- und C-Exons. Ein besonderer V-Bereich weist ein Exon auf, ein D-Bereich weist ein Exon auf, ein J-Bereich weist ein Exon auf und ein C-Bereich weist mehrere Exons auf. Zusammen bilden sie ein vollständiges Gen nach der Rekombination, wenn ein V-Exon, ein D-Exon, ein J-Exon und ein C-Bereich selektiert worden sind.
,Exon' und ,Intron'. Ein Exon ist eine kodierende oder Messenger-Sequenz aus Desoxynucleotiden. Das heißt, es ist jede Sequenz von DNA in Eukaryoten, die schließlich in vollständig entwickelten mRNA- oder rRNA-Molekülen exprimiert wird. Exons werden üblicherweise mit Introns durchsetzt. Introns sind nicht-kodierende DNA-Sequenzen. Das heißt, sie sind DNA-Sequenzen, die schließlich nicht in einem vollständig entwickelten RNA-Molekül exprimiert werden.
Introns werden aus neu transkripierter RNA herausgespleißt, um vollständig entwickelte mRNA zu erzeugen.
Ein ,VHH-schwere-Kette-Lokus' besteht im Kontext der vorliegenden Erfindung aus einem ,VHH-Bereich', einem ,J-Bereich/Exon', einem ,D-Bereich/Exon' und einem ,konstante-schwere-Kette-Bereich'. Jeder VHH-Bereich umfaßt ein VHH-Exon, jeder J-Bereich ein J-Exon und jeder D-Bereich ein D-Exon, und jeder konstante-schwere-Kette-Bereich umfaßt ein oder mehrere konstante-schwere-Kette-Bereich-Exons.
Ein ,VHH-Exon' beschreibt im Kontext der vorliegenden Erfindung eine natürlich vorkommende VHH-kodierende Sequenz, wie die, die in Camelidae und in jedem Homologon, Derivat oder Fragment davon gefunden werden, so lange das resultierende Exon, wenn es ein Bestandteil eines VHH-Bereiches ist, wie hierin definiert, mit mindestens einem D-Bereich, mindestens einem J-Bereich und mindestens einem konstante-schwere-Kette-Bereich rekombinieren kann, um einen VHH-Einzel-Kette-Antikörper zu erzeugen, wie hierin definiert, wenn die Nukleinsäure exprimiert wird.
Ein ,kamelisierter VH-schwere-Kette-Lokus' besteht im Kontext der vorliegenden Erfindung aus einem oder mehreren ,kamelisierten VH-Bereich/en', wie hierin definiert, einem oder mehreren ,J-Bereich/en', einem oder mehreren ,D-Bereich/en' und einem ,konstante-schwere-Kette-Bereich'. Jeder kamelisierte VH-Bereich umfaßt ein kamelisiertes VH-Exon, jeder J-Bereich ein J-Exon und jeder D-Bereich ein D-Exon, und jeder konstante-schwere-Kette-Bereich umfaßt ein oder mehrere konstante-schwere-Kette-Bereich-Gene.
Ein ,kamelisiertes VH-Exon' beschreibt im Kontext der vorliegenden Erfindung eine natürlich vorkommende VH-kodierende Sequenz, abgeleitet von anderen Säugern als Camelidae, beispielsweise einem Menschen, der mutiert worden ist, so daß die Sequenz dieselbe wie die eines Camelidae-Exons ist. Ein kamelisiertes VH-Exon umfaßt ebenso innerhalb seines Umfangs jedes Homologon, Derivat oder Fragment davon, so lange das resultierende Exon, wenn es ein Bestandteil eines VH-Bereiches, wie hierin definiert, ist, mit mindestens einem D-Bereich, mindestens einem J-Bereich und mindestens einem konstante-schwere-Kette-Bereich rekombinieren kann, um einen VHH-Einzel-Kette-Antikörper, wie hierin definiert, zu erzeugen.
Ein ,konstante-schwere-Kette-Exon' (,C_H-Exon'), wie hierin definiert, umfaßt die Sequenzen von natürlich vorkommenden CH-Exons, wie die, die in Camelidae oder Menschen oder anderen Säugern, einschließlich Kaninchen und Mäusen, gefunden werden. Der Ausdruck ,C_H-Exon' umfaßt ebenso innerhalb seines Umfangs Derivate, Homologa und Fragmente davon, insofern das C_H-Exon befähigt ist, einen funktionellen Einzel-schwere-Kette-Antikörper zu bilden, wie hierin definiert, wenn es eine Komponente eines konstante-schwere-Kette-Bereiches ist. Im allgemeinen sind C_H-Exons von vier unterschiedlichen Typen (C_H1–C_H4), die unterschiedliche Teile (Domänen) von jedem konstante-schwere-Ketten-Polypeptid kodieren. Jedoch besitzen die VHH- und kamelisierten VH-Einzel-Kette-Antikörper weder eine funktionelle CH1-Domäne (enthaltend den leichte-Kette-Domäne-Verankerungsbereich) noch eine funktionelle CH4-Domäne. Es gibt eine Vielzahl von Untergruppen von konstante-schwere-Kette-Bereich-Exons. Unterschiedliche Antikörperklassen besitzen beispielsweise unterschiedliche CH-Exons, IgM-Moleküle besitzen ein oder mehrere Cμ-konstante-Bereich-Exons, und IgG-Moleküle besitzen ein oder mehrere Cγ-Exons.
Der Ausdruck ,VHH-Einzel-schwere-Kette-Antikörper' bedeutet im Kontext der vorliegenden Erfindung ein Antikörpermolekül, das nur aus schweren Ketten (im allgemeinen zwei) besteht und keine leichten Ketten umfaßt. Jede schwere Kette umfaßt einen variablen Bereich (kodiert durch VHH-, D- und J-Exons) und einen konstanten Bereich. Der konstante Bereich umfaßt ferner eine Anzahl an CH-Domänen, kodiert durch konstante-schwere-Kette-Bereich-Exons und umfaßt im allgemeinen zwei: eine CH2-Domäne und eine CH3-Domäne. Ein VHH-Einzel-Kette-Antikörper, wie hierin definiert, besitzt weder eine funktionelle CH1-Domäne noch eine funktionelle CH4-Domäne. Es ist der Mangel an einer funktionellen CH1-Domäne (die in konventionellen Antikörpern den Verankerungsplatz für die konstante Domäne der leichten Kette besitzt), der die Unfähigkeit der schwere-Kette-Antikörper, sich mit leichten Ketten zu verbinden, um konventionelle Antikörper zu bilden, begründet. Die Unterklasse von Antikörpern, bekannt als scIgG2 und/oder scIgG3, umfaßt nur Cγ2- und/oder Cγ3-Gene.
Der Ausdruck ,kamelisierter VH-Einzel-schwere-Kette-Antikörper' bedeutet im Kontext der vorliegenden Erfindung ein Antikörpermolekül, das nur aus schweren Ketten (im allgemeinen zwei) besteht und keine leichten Ketten umfaßt. Jede schwere Kette umfaßt einen variablen Bereich (kodiert durch ein ,kamelisiertes VH-Exon', D- und J-Exon/s) und einen konstanten Bereich. Der konstante Bereich, kodiert durch konstante-Bereich-Exons, kodiert ferner eine Anzahl an CH-Domänen und umfaßt im allgemeinen zwei: eine CH2-Domäne und eine CH3-Domäne. Ein kamelisierter VH-Einzel-Kette-Antikörper, wie hierin definiert, besitzt keine funktionelle CH1-Domäne oder keine funktionelle CH4-Domäne. Es ist der Mangel an einer funktionellen CH1-Domäne (die in konventionellen Antikörpern den Verankerungsplatz für die konstante Domäne der leichten Kette besitzt), der die Unfähigkeit der schwere-Kette-Antikörper, sich mit leichten Ketten zu verbinden, um konventionelle Antikörper zu bilden, begründet.
,Antikörper' wie hierin verwendet, beziehen sich auf Antikörper oder Antikörperfragmente, die an ein ausgewähltes Target binden können, und umfassen monoklonale und polyklonale Antikörper, konstruierte Antikörper, einschließlich chimärer, CDR-gepfropfter und humanisierter Antikörper, und künstlich gewählte Antikörper, hergestellt unter Verwendung von Phagenanzeige- oder alternativen Techniken. Kleine Antikörperfragmente besitzen vorteilhafte Eigenschaften für diagnostische und therapeutische Anwendungen wegen ihrer kleinen Größe und folglich besseren Gewebeverteilung.
,Antikörperentwicklung' beschreibt den Prozeß des Klassenwechsels und der Affinitätsreifung (somatische Hypermutation), die während der Antikörperentwicklung auftreten und die zur Erzeugung von Antikörpern führen, die selektiv und mit hoher Affinität binden.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Allgemeine Techniken
Wenn nicht anders angegeben, haben alle technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke, die hierin verwendet werden, dieselbe Bedeutung, wie üblicherweise durch einen Fachmann verstanden wird (z. B. in Zellkultur, Molekulargenetik, Nukleinsäurechemie, Hybridisierungstechniken und Biochemie). Standardtechniken werden für molekulare, genetische und biochemische Verfahren (siehe im allgemeinen Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. und Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999), 4. Aufl., John Wiley & Sons, Inc.) und chemische Verfahren verwendet. Außerdem beziehen sich Harlow & Lane., A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor, N. Y, auf Standardimmunologietechniken.
VH/h-schwere-Kette-Loki der vorliegenden Erfindung
In einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines VHH-Einzel-schwere-Kette-Antikörpers in einem Säuger bereit, umfassend den Schritt des Exprimierens eines heterologen VHH-schwere-Kette-Lokus in diesem Säuger.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines kamelisierten VH-Einzel-schwere-Kette-Antikörpers in einem Säuger bereit, umfassend den Schritt des Exprimierens eines kamelisierten VH-schwere-Kette-Lokus in diesem Säuger.
Die Konstruktion der verschiedenen VHH-schwere-Kette-Loki sind wie in der Zusammenfassung der Erfindung beschrieben.
Vorteilhafterweise umfaßt ein Lokus ein oder mehrere FRT-Stellen (flp-Rekombinationstarget) und zwei oder mehrere LoxP-Stellen (die aus zwei dreizehn bp langen invertierten Wiederholungen bestehen, getrennt durch einen 8 bp asymmetrischen Spacerbereich (Brian Sauer, Methods of Enzymology; 1993, Bd. 225, 890–900).
Bevorzugt gibt es mindestens zwei IoxP-Stellen in einem Lokus. Die Gegenwart der FRT-Stelle/n in dem Lokus erlaubt die Produktion von Einzelkopie-transgenen Verbindungen, während die Gegenwart der Lox-Stellen die Deletion von IgM- und IgD-schwere-Kette-Genen, wenn erforderlich, erlaubt.
(A) Vektoren
Die vorliegende Erfindung stellt ebenso Vektoren, einschließlich eines Konstrukts der vorliegenden Erfindung, bereit. Im wesentlichen werden zwei Typen von Vektoren, Replikationsvektoren und Transformationsvektoren, bereitgestellt.
(I) Replikationsvektoren
Konstrukte können in einen rekombinanten replizierbaren Vektor wie einen BAC-Vektor eingeführt werden. Der Vektor kann verwendet werden, um das Konstrukt in einer kompatiblen Wirtszelle zu replizieren. Daher wird hierin ein Verfahren zum Herstellen von Konstrukten durch Einführen eines Konstrukts in einen replizierbaren Vektor, Einführen des Vektors in eine kompatible Wirtszelle und Züchten der Wirtszelle unter Bedingungen, die die Replikation des Konstrukts mit sich bringen, beschrieben. Das Konstrukt kann aus der Wirtszelle rückgewonnen werden. Geeignete Wirtszellen umfassen Bakterien-, wie E. coli-, Hefe-, Säugerzellinien und andere eukaryotische Zellinien, beispielsweise Insekten-Sf9-Zellen (Baculovirus).
(II) Transformationsvektoren
Die Konstrukte können ebenso in einen Vektor eingeführt werden, der das Konstrukt in ein Empfängergenom einführen kann und daher eine Transformation erreicht. Zusätzlich zu dem Konstrukt können diese Transformationsvektoren eine oder mehrere der folgenden Komponenten umfassen.
Promotoren
Der Promotor wird typischerweise aus Promotoren ausgewählt, die in Säugerzellen funktionell sind, obwohl prokaryotische Promotoren und Promotoren, die in anderen eukaryotischen Zellen funktionell sind, verwendet werden können. Der Promotor wird typischerweise von Promotorsequenzen von viralen oder eukaryotischen Genen abgeleitet. Beispielsweise kann es ein Promotor sein, abgeleitet von dem Genom einer Zelle, in der die Expression stattfinden soll. In bezug auf eukaryotische Promotoren können sie Promotoren sein, die in einer ubiquitären Weise (wie Promotoren von alpha-Actin, beta-Actin, Tubulin) oder alternativ in einer Gewebe-spezifischen Weise (wie Promotoren von Immunoglobulingenen) fungieren. Sie können ebenso Promotoren sein, die auf spezifische Reize reagieren, beispielsweise Promotoren, die Steroidhormonrezeptoren binden. Virale Promotoren können ebenso verwendet werden, beispielsweise der Moloney-Mausleukämie-Virus-lange-terminale-Wiederholung-(MMLV LTR-)-Promoter, der Rous-Sarkom-Virus-(RSV-)-LTR-Promotor oder der humane-Cytomegalovirus-(CMV-)-IE-Promotor. Es kann für die Promotoren ebenso vorteilhaft sein, induzierbar zu sein, so daß die Expressionsniveaus des heterologen Gens während der Lebenszeit der Zelle reguliert werden können. induzierbar bedeutet, daß die Expressionsniveaus, die unter Verwendung des Promotors erhalten werden, reguliert werden können.
Außerdem kann jeder dieser Promotoren durch die Addition von weiteren Regulationssequenzen, beispielsweise Enhancersequenzen, modifiziert werden. Gewebespezifische Enhancer, die die Expression in Antikörper-produzierenden Zellen regulieren können, sind bevorzugt. Insbesondere kann der schwere-Kette-Enhancer, der für die erfolgreiche Aktivierung des Antikörpergenlokus in vivo erforderlich ist (Serwe, M., und Sablitzky, F., EMBO J. 12, S. 2321–2321, 1993), einbezogen werden. Lokuskontrollbereiche (LCRs), speziell das Immunoglobulin LCR, können ebenso verwendet werden. Chimäre Promotoren können ebenso verwendet werden, umfassend Sequenzelemente aus zwei oder mehreren unterschiedlichen Promotoren.
Andere Vektorkomponenten
Zusätzlich zu einem Promotor oder dem Konstrukt enthalten die Vektoren der vorliegenden Erfindung bevorzugt andere Elemente, die für die optimale Funktion des Vektors in dem Säuger, in den der Vektor eingeführt wird, nützlich sind. Diese Elemente sind dem Fachmann allgemein bekannt und werden beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory Press, 1989, beschrieben.
Konstruktion von Vektoren
Vektoren, die zum Transformieren von Säugerembryos verwendet werden, werden unter Verwendung von Verfahren, die in der Technik allgemein bekannt sind, konstruiert, einschließlich ohne Einschränkung der Standardtechniken Restriktionsendonucleasedigestion, Ligation, Plasmid- und DNA- und RNA-Reinigung, DNA-Sequenzierung, wie beispielsweise in Sambrook, Fritsch und Maniatis, Hrsg. Molecular Cloning: A Laborstory Manual., (Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. [1989]) beschrieben. Im allgemeinen wird die Vektorkonstruktion die folgenden Schritte umfassen:

a) Der endogene Mauslokus wird inaktiviert, beispielsweise unter Verwendung eines der veröffentlichten Knockout-Verfahren (z. B. Kitamara, D. und Rajewski K., Nature 352, S. 154–156, 1992).
b) Der DJ- und IgM-Bereich eines geeigneten schwere-Kette-Bereichs, wie hierin beschrieben, wird als eine rekombinante DNA aus einer humanen PAC-, BAC- oder YAC-Bibliothek lokalisiert und als ein Restriktionsenzymfragment geklont, beispielsweise ein Sal1-Fragment. Dieser Bereich enthält ebenso den schwere-Kette-Enhancer, der für die erfolgreiche Aktivierung des Antikörpergenlokus in vivo erforderlich ist (siehe Serwe, M., Sablitzky, F., EMBO J. 12, S. 2321–2321, 1993).
c) Eine Anzahl von VHH- oder ,kamelisierten VH-Exons' wird zunächst als Cosmide durch die Konstruktion einer geeigneten genomischen DNA-Bibliothek durch konventionelle Techniken geklont. Da die VHH-Exons unter VH-Exons lokalisiert sind, wie hierin beschrieben, werden sie anschließend zusammen mit den VHH-Exons geklont. Daher wird eine Anordnung von VH- und VHH-Exons hergestellt. Diese Anordnung von Genen kann als ein MluI-Fragment (oder anderes Restriktionsenzym) isoliert werden.
d) Der 3'-humane Immunoglobulin-schwere-Kette-LCR, ein Kontrollbereich, der für die Expression des Lokus erforderlich ist, wird als ein SceI-Restriktionsfragment geklont.
e) Die konstante-Bereich-schwere-Kette-Exons werden als ein separates Restriktionsfragment geklont. Die C_H1- und/oder C_H4-Domänen, kodiert durch ihre jeweiligen Exons, werden durch homologe Rekombination in Bakterien (Imam et al., Nucleic Acid Research, 15; E65, 2000) durch Entfernen der Spleißakzeptorsequenzen des C_H1-Exons und/oder C_H4-Exons nicht-funktionell gemacht (Nguyen et al., Mol. Immunol, 36, 514–524, 1999).

Die Schritte b bis e stellen die Stücke für einen ,VHH-schwere-Kette-Lokus' oder einen ,kamelisierten VH-schwere-Kette-Lokus' (3) bereit, der die Funktion des inaktivierten Mauslokus, der unter a) beschrieben ist, übernehmen soll. Diese Loki werden durch Klonen von jedem der Fragmente in der entsprechenden Reihenfolge in einen geeigneten Vektor, beispielsweise einen BAC-Vektor, enthaltend einen Linkerbereich mit allen Restriktionsstellen, die oben beschrieben sind, konstruiert (1). Loki, die gemäß dem Verfahren erzeugt wurden, weisen im allgemeinen eine Größe in der Größenordnung von 200 bis 250 kB auf. Sie können isoliert und aus dem Vektor durch Standardlabortechniken gereinigt werden, was dem Fachmann bekannt sein wird. Die gereinigte Nukleinsäure, die den ,VHH-schwere-Kette-Lokus' oder ,einen kamelisierten VH-schwere-Kette-Lokus' (1) kodiert, kann anschließend in befruchtete Eier einer Maus aus in a) beschriebenen Knock-out-Mäusen durch Standardtechniken eingeführt werden, um transgene Mäuse zu erhalten, die einen oder mehrere Loki exprimieren.
Einzel-Kette-Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung
Es ist selbstverständlich, daß der Ausdruck ,Einzel-schwere-Kette-Antikörper' und ,VHH-schwere-Kette-Loki' ebenso homologes Polypeptid und Nukleinsäuresequenzen umfaßt, die aus jeder Quelle stammen, beispielsweise verwandte zelluläre Homologa, Homologa aus anderen Spezies und Varianten oder Derivate davon.
Daher werden ebenso Varianten, Homologa oder Derivate der Einzel-schwere-Kette-Antikörper und der VHH-schwere-Kette-Loki, wie hierin beschrieben, beschrieben.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung wird eine homologe Sequenz verwendet, die eine Aminosäuresequenz umfaßt, die zumindest zu 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5, 99,6, 99,7, 99,8, 99,9 % identisch, bevorzugt zumindest zu 98 oder 99 % identisch ist, auf der Aminosäureebene über mindestens 30, bevorzugt 50, 70, 90 oder 100 Aminosäuren. Obwohl die Homologie auch als Ähnlichkeit betrachtet werden kann (d. h. Aminosäurereste mit ähnlichen chemischen Eigenschaften/Funktionen), ist es im Kontext der vorliegenden Erfindung bevorzugt, die Homologie als Sequenzidentität auszudrücken.
Homologievergleiche können visuell durchgeführt werden, oder normalerweise mit Hilfe von ohne weiteres verfügbaren Sequenzvergleichsprogrammen. Diese kommerziell erhältlichen Computerprogramme können die prozentuale Homologie zwischen zwei oder mehreren Sequenzen berechnen.
Die prozentuale Homologie kann über benachbarte Sequenzen berechnet werden, d. h., eine Sequenz wird an einer anderen Sequenz angeordnet und jede Aminosäure in einer Sequenz direkt mit der entsprechenden Aminosäure in der anderen Sequenz Rest für Rest verglichen. Dies wird eine „lückenlose" Anordnung genannt. Typischerweise werden diese lückenlosen Anordnungen nur über eine relativ geringe Anzahl an Resten durchgeführt (beispielsweise weniger als 50 benachbarte Aminosäuren).
Obwohl dies ein sehr einfaches und konsistentes Verfahren ist, berücksichtigt es nicht, daß beispielsweise in einem ansonsten identischen Paar von Sequenzen eine Einführung oder Deletion bewirkt, daß die folgenden Aminosäurereste aus der Anordnung herausfallen, was möglicherweise zu einer starken Reduktion der prozentualen Homologie führt, wenn eine globale Anordnung durchgeführt wird. Folglich sind die meisten Sequenzvergleichsverfahren so gestaltet, daß sie die optimalen Anordnungen erzeugen, die mögliche Einführungen und Deletionen ohne übermäßige Benachteiligung der gesamten Homologiebewertung berücksichtigen. Dies wird durch Einführen von „Lücken" in die Sequenzanordnung erreicht, um eine Erhöhung der lokalen Homologie zu versuchen.
Jedoch ordnen diese komplexeren Verfahren jeder Lücke „Lückenstrafen" zu, die in der Anordnung auftreten, so daß für dieselbe Anzahl an identischen Aminosäuren eine Sequenzanordnung mit so wenig Lücken wie möglich – was eine höhere Verwandtschaft zwischen den zwei verglichenen Sequenzen widerspiegelt – eine höhere Bewertung als eine mit vielen Lücken erreichen wird. „Kosten aufgrund affiner Lücken" werden typischerweise verwendet, die relativ hohe Kosten für die Existenz einer Lücke und eine kleinere Strafe für jeden nachfolgenden Rest in der Lücke nach sich ziehen. Dies ist das am meisten verwendete Lückenbewertungssystem. Hohe Lückenstrafen werden natürlich optimierte Anordnungen mit weniger Lücken erzeugen.
Die meisten Anordnungsprogramme erlauben die Modifikation der Lückenstrafen. Jedoch ist es bevorzugt, die Standardwerte zu verwenden, wenn diese Software für die Sequenzvergleiche verwendet wird. Beispielsweise beträgt, wenn GCG Wisconsin Bestfit package (siehe nachstehend) verwendet wird, die Standardlückenstrafe für Aminosäuresequenzen -12 für eine Lücke und -4 für jede Verlängerung.
Die Berechnung der maximalen prozentualen Homologie erfordert daher zunächst die Produktion einer optimalen Anordnung unter Berücksichtigung der Lückenstrafen. Ein geeignetes Computerprogramm zur Durchführung einer solchen Anordnung ist GCG Wisconsin Bestfit package (University of Wisconsin, USA.; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12: 387). Beispiele für andere Software, die Sequenzvergleiche durchführen können, umfassen das BLAST package (siehe Ausubel et al., 1999, ebenda – Kapitel 18), FASIA (Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403–410) und die GENEWORKS-Reihe von Vergleichstools, sind aber nicht darauf beschränkt. Sowohl BLAST als auch FASTA sind zur Offline- und Online-Forschung erhältlich (siehe Ausubel et al., 1999, ebenda, Seiten 7–58 bis 7–60). Jedoch ist es bevorzugt, das GCG-Bestfit-Programm zu verwenden.
Obwohl die endgültige prozentuale Homologie als Identität gemessen werden kann, basiert das Anordnungsverfahren selbst typischerweise nicht auf einem Alles-oder-nichts-Paarvergleich. Statt dessen wird im allgemeinen eine skalierte Ähnlichkeitsbewertungsmatrix verwendet, die jedem paarweisen Vergleich Bewertungen zuordnet, basierend auf chemischer Ähnlichkeit oder dem Evolutionsabstand. Ein Beispiel einer solchen Matrix, die üblicherweise verwendet wird, ist die BLOSUM62 Matrix – die Standardmatrix für die BLAST-Reihe von Programmen. GCG Wisconsin-Programme nutzen im allgemeinen entweder die öffentlichen Standardwerte oder eine übliche Symbolvergleichstabelle, wenn geliefert (siehe Benutzerhandbuch für weitere Einzelheiten). Es ist bevorzugt, die öffentlichen Standardwerte für das GCG package zu verwenden, oder im Fall von anderer Software die Standardmatrix, wie BLOSUM62.
Wenn die Software eine optimale Anordnung erzeugt hat, ist es möglich, die prozentuale Homologie, bevorzugt die prozentuale Sequenzidentität, zu berechnen. Die Software tut dies typischerweise als ein Teil des Sequenzvergleichs und erzeugt ein numerisches Ergebnis.
Verfahren zur Herstellung von Einzel-Kette-Antikörpern gemäß der vorliegenden Erfindung
(A) Transgene Tiere
Die Loki und Vektoren der vorliegenden Erfindung können in ein Tier eingeführt werden, um ein transgenes Tier zu erzeugen.
Das Einführen der Loki in das Genom eines Empfängertiers kann unter Verwendung jeder Technik, die dem Fachmann bekannt ist, beispielsweise Mikroinjektion, erreicht werden. Nach der Einführung von Nukleinsäure in ein befruchtetes Ei wird die Reimplantation unter Verwendung von Standardverfahren erreicht, die dem Fachmann bekannt sind. Normalerweise wird der Ersatzwirt anästhesiert, und die Eier werden in den Eileiter eingeführt. Die Anzahl an Eiern, die in einen speziellen Wirt eingepflanzt werden, wird variieren, wird aber normalerweise mit der Anzahl an Nachkommen, die die Spezies normalerweise hervorbringt, vergleichbar sein.
Alternativ kann die DNA in embryonale Stammzellen (ES-Zellen) eingeführt werden, die in einen Wirtsembryo eingeführt werden können, um transgene Mäuse durch eine Standardtechnik hervorzubringen.
In einer weiteren Ausführungsform kann die DNA in jede Zelle eingeführt werden. Die Kerne von diesen Zellen werden verwendet, um den Kern eines befruchteten Eis zu ersetzen, der von jeder Spezies sein kann, um transgene Tiere hervorzubringen. Diese Technik der nuklearen Übertragung ist dem Fachmann bekannt.
Transgene Nachkommen des Ersatzwirts können hinsichtlich der Gegenwart des Transgens durch jedes geeignete Verfahren gescreent werden. Das Screening wird oftmals durch Southern- oder Northern-Analyse unter Verwendung einer Sonde erreicht, die zu mindestens einem Teil des Transgens komplementär ist. Western-Blot-Analyse unter Verwendung eines Liganden, der für den Antikörper spezifisch ist, ko diert durch das Transgen, kann als ein alternatives oder zusätzliches Verfahren zum Screenen eingesetzt werden. Typischerweise werden die Gewebe oder Zellen, von denen angenommen wird, daß sie das Transgen auf den höchsten Niveaus exprimieren, getestet, obwohl jegliche Gewebe- oder Zelltypen für diese Analyse verwendet werden können.
Die Nachkommenschaft der transgenen Säuger kann durch Paarung des transgenen Säugers mit einem geeigneten Partner oder durch In-vitro-Fertilisation von Eiern und/oder Spermien, die aus dem transgenen Säuger erhalten werden, erhalten werden. Wo die In-vitro-Fertilisation verwendet wird, kann der befruchtete Embryo in einen Ersatzwirt eingepflanzt oder in vitro inkubiert werden, oder beides. Wo die Paarung verwendet wird, um transgene Nachkommenschaft zu erzeugen, kann der transgene Säuger mit einer Elternlinie rückgekreuzt werden. Unter Verwendung jedes Verfahrens kann die Nachkommenschaft hinsichtlich der Gegenwart des Transgens unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren oder anderer geeigneter Verfahren bewertet werden.
Das Tier kann verändert werden, vorausgesetzt, es ist ein nicht-menschlicher Säuger, wie ein Nagetier und bevorzugt eine Ratte oder Maus. In dieser Hinsicht ist es ebenso bevorzugt, daß das Empfängertier keine Antikörper produzieren kann, die leichte Ketten umfassen, oder zumindest eine verringerte Fähigkeit zur Produktion von Antikörpern aufweisen. Um dieses Ziel zu erreichen, kann das Empfängertier ein „Knock-out"-Tier sein, das ein oder mehrere der Gene haben kann, die für die Produktion von Antikörpern mit ausgeschalteten oder unterdrückten leichten Ketten erforderlich sind.
Unter Verwendung der Empfängertiere, die keine Antikörper produzieren können, die leichte Ketten umfassen oder zumindest nur eine verringere Fähigkeit, diese Antikörper zu produzieren, aufweisen, ermöglicht das Verfahren der vorliegenden Erfindung die effiziente Produktion von großen Mengen an Einzel-Kette-Antikörpern und Antikörper-produzierenden Zellen aus einem transgenen Tier bei der Reizung mit einem gegebenen Antigen.
(B) Phagenanzeigetechnik
Vektoren für die Phagenanzeige fusionieren das kodierte Polypeptid mit z. B. dem Gen-III-Protein (pIII) oder Gen-VII-Protein (pVIII) zur Anzeige auf der Oberfläche von filamentöser Phage, wie M13. Siehe Barbas et al., Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) (ISBN 0-87969-546-3); Kay et al. (Hrsg.), Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, San Diego: Academic Press, Inc., 1996; Abelson et al. (Hrsg.), Combinatorial Chemistry, Methods in Enzymology Bd. 267, Academic Press (Mai 1996).
Prokaryotische Wirte sind zur Herstellung von durch Phagen angezeigten Antikörpern besonders nützlich. Die Technik von durch Phagen angezeigten Antikörpern, in denen Antikörper-variable-Bereich-Fragmente fusioniert werden, beispielsweise an das Gen-III-Protein (pIII) oder Gen-VIII-Protein (pVIII) zur Anzeige auf der Oberfläche filamentöser Phage, wie M13, ist mittlerweile gut etabliert, Sidhu, Curr. Opin. Biotechnol. 11 (6): 610–6 (2000); Griffiths et al., Curr. Opin. Biotechnol. 9(1): 102–8 (1998); Hoogenboom et al., Immunotechnology, 4(1): 1–20 (1998); Rader et al., Current Opinion in Biotechnology 8: 503–508 (1997); Aujame et al., Human Antibodies 8: 155–168 (1997); Hoogenboom, Trends in Biotechnol. 15: 62-70 (1997); de Kruif et al., 17: 453–455 (1996); Barbas et al., Trends in Biotechnol. 14: 230–234 (1996); Winter et al., Ann. Rev. Immunol. 433–455 (1994), und Techniken und Protokolle, die erforderlich sind, um Antikörperfragmente aus diesen Bibliotheken zu erzeugen, zu vermehren, zu screenen (pan) und zu verwenden, sind kürzlich zusammengestellt worden, Barbas et al., Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) (ISBN 0-87969-546-3); Kay et al. (Hrsg.), Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, Inc. (1996); Abelson et al. (Hrsg.), Combinatorial Chemistry, Methods in Enzymology, Bd. 267, Academic Press (Mai 1996). Für die Phagenanzeige von Antikörpern, wie hierin beschrieben, einschließlich Fragmenten davon, werden sie vorteilhafterweise mit dem Phage-g3p-Protein fusioniert.
(C) Hybridome
Die rekombinante DNA-Technik kann verwendet werden, um Einzel-Kette-Antikörper unter Verwendung einer etablierten Verfahrensweise in Bakterien- oder bevorzugt in Säugerzellkultur zu produzieren. Das selektierte Zellkultursystem sekretiert bevorzugt das Einzel-Kette-Antikörperprodukt.
Die Multiplikation von Hybridomzellen oder Säugerwirtszellen in vitro wird in geeigneten Kulturmedien durchgeführt, die die üblichen Standardkulturmedien sind, beispielsweise Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) oder RPMI-1640-Medium, gegebenenfalls aufgefüllt durch ein Säugerserum, z. B. ein fetales Kälberserum, oder Spurenelemente und wachstumsfördernden Ergänzungsmitteln, z. B. Feeder-Zellen, wie normale Mausperitonealexsudatzellen, Milzzellen, Knochenmarksmakrophagen, 2-Aminoethanol, Insulin, Transferrin, Lipoprotein niedriger Dichte, Ölsäure oder dergleichen. Die Multiplikation von Wirtszellen, die Bakterienzellen oder Hefezellen sind, wird wahrscheinlich in geeigneten Kulturmedien durchgeführt, die in der Technik bekannt sind, beispielsweise für Bakterien in Medium LB, NZCYM, NZYM, NZM, Terrific Broth, SOB, SOC, 2 × YT oder M9 Minimal Medium und für Hefe in Medium YPD, YEPD, Minimal Medium oder Complete Minimal Dropout Medium.
Die In-vitro-Produktion stellt relativ reine Immunoglobulinpräparate bereit und erlaubt eine maßstäbliche Vergrößerung, um große Mengen der gewünschten Immunoglobuline zu erhalten. Techniken für Bakterienzell-, Hefe- oder Säugerzellkultivierung sind im Stand der Technik bekannt und umfassen homogene Suspensionskultur, z. B. in einem Airliftreaktor oder in einem kontinuierlichen Rührreaktor, oder immobilisierte oder eingeschlossene Zellkultur, z. B. in Hohlfasern, Mikrokapseln, auf Agarosemikrokügelchen oder Keramikpatronen.
Große Mengen der gewünschten Immunoglobuline können ebenso durch Multiplizieren der Säugerzellen in vivo erhalten werden. Für diesen Zweck werden Hybridomzellen, die die gewünschten Immunoglobuline produzieren, in histokompatible Säuger injiziert, um das Wachstum von Antikörper-produzierenden Tumoren hervorzurufen. Gegebenenfalls werden die Tiere mit einem Kohlenwasserstoff vorbereitet, insbesondere Mineralölen, wie Pristan (Tetramethyl-pentadecan), vor der Injektion. Nach ein bis drei Wochen werden die Immunoglobuline aus den Körperflüssigkeiten von diesen Säugern isoliert. Beispielsweise werden Hybridomzellen, erhalten durch Fusion von geeigneten Myelomzellen mit Antikörper-produzierenden Milzzellen aus Balb/c-Mäusen, oder transfektierten Zellen, abgeleitet von der Hybridomzellinie Sp2/0, die die gewünschten Antikörper produziert, intraperitoneal in Balb/c-Mäuse, gegebenenfalls vorbehandelt mit Pristan, injiziert, und nach ein bis zwei Wochen wird die Aszitesflüssigkeit aus den Tieren entnommen.
Die vorstehenden und andere Techniken werden beispielsweise in Kohler und Milstein, (1975) Nature 256: 495–497; US 4,376,110 ; Harlow and Lane, Antibodies: a Laboratory Manual, (1988) Cold Spring Harbor, erläutert. Techniken zur Herstellung von rekombinanten Antikörpermolekülen werden in den obigen Referenzen und ebenso beispielsweise in EP 0623679 ; EP 0368684 und EP 0436597 beschrieben.
Die Zellkulturüberstände werden hinsichtlich der gewünschten Antikörper gescreent, bevorzugt durch Immunofluoreszenzfärbung von Zellen, die das gewünschte Target exprimieren durch Immunoblotting, durch einen Enzymimmunoassay, z. B. einen Sandwich-Assay oder einen dot-Assay, oder einen Radioimmunoassay.
Zur Isolation der Antikörper können die in den Kulturüberständen oder in der Aszitesflüssigkeit konzentriert werden, z. B. durch Ausfällung mit Ammoniumsulfat, Dialyse gegen hygroskopisches Material, wie Polyethylenglycol oder Filtration durch selektive Membranen. Wenn notwendig und/oder gewünscht, werden die Antikörper durch die üblichen Chromatographieverfahren, beispielsweise Gelfiltration, Ionenaustauschchromatographie, Chromatographie über DEAE-Cellulose und/oder (Immuno-)affinitätschromatographie, z. B. Affinitätschromatographie mit dem Targetmolekül oder mit Protein-A gereinigt.
(3) Immunisierung eines transgenen Tieres
Die vorliegende Beschreibung beschreibt ebenso ein Verfahren zur Herstellung von Einzel-Kette-Antikörpern, umfassend das Verabreichen eines Antigens an ein transgenes Tier.
Die produzierten Einzel-Kette-Antikörper aus transgenen Tieren umfassen polyklonale und monoklonale Einzel-Kette-Antikörper und Fragmente davon. Wenn polyklona le Antikörper gewünscht sind, kann das transgene Tier (z. B. Maus, Kaninchen, Ziege, Pferd usw.) mit einem Antigen immunisiert werden und Serum aus dem immunisierten Tier gemäß bekannter Verfahrensweisen gesammelt und behandelt werden. Wenn Serum, enthaltend polyklonale Antikörper, Antikörper für andere Antigene enthält, können die polyklonalen Antikörper von Interesse durch Immunoaffinitätschromatographie und ähnlichen Techniken gereinigt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Techniken zum Herstellen und Verarbeiten polyklonaler Antiseren sind im Stand der Technik ebenso bekannt.
Verwendung von Einzel-Kette-Antikörpern gemäß der vorliegenden Erfindung
Einzel-Kette-Antikörper, einschließlich Fragmenten davon, können bei therapeutischen und bei prophylaktischen In-vivo-Anwendungen, diagnostischen In-vitro- und In-vivo-Anwendungen und In-vitro-Assays und Reagenzienanwendungen eingesetzt werden.
Therapeutische und prophylaktische Verwendungen von Einzel-Kette-Antikörpern umfassen die Verabreichung des obigen an einen Empfängersäuger, wie einen Menschen.
,Kamelisierte VH-Einzel-Kette-schwere-Kette-Antikörper" besitzen mehrere Vorteile gegenüber cameliden VHH-Einzel-Kette-Antikörpermolekülen bei der Behandlung von Menschen. Beispielsweise besitzen kamelisierte VH-Einzel-Kette-Antikörper eine Protein-A-Bindungsstelle im Fall von Antikörpern, die auf der VH3-Genfamilie basieren. Außerdem zeigen kamelisierte VH-Einzel-Kette-Antikörper erwartungsgemäß niedrigere Immunogenität als camelide VHH-Einzel-Kette-Antikörper, wenn sie an Menschen verabreicht werden.
Es wird ebenso erkannt, daß ,kamelisierte VH-Einzel-schwere-Kette-Antikörper' und ,camelide VHH-Einzel-schwere-Kette-Antikörper' einige andere physikalische Eigenschaften aufweisen als konventionelle Doppelkette-Antikörper. Beispielsweise binden aufgrund des Mangels an einer funktionellen CH1-schweren-Domäne die Antikörper der vorliegenden Erfindung kein komplementäres Molekül C1q, das bei der Komplementaktivierung auf dem klassischen Weg involviert ist.
Im wesentlichen sind reine Einzel-Kette-Antikörper, einschließlich Fragmenten davon, mit einer Homogenität von mindestens 90 bis 95 % zur Verabreichung an einen Säuger bevorzugt, und solche mit einer Homogenität von 98 bis 99 % oder mehr sind für pharmazeutische Verwendungen am stärksten bevorzugt, insbesondere wenn der Säuger ein Mensch ist. Sobald gereinigt, teilweise oder zur Homogenität, wenn gewünscht, können die Einzel-Kette-Antikörper, wie hierin beschrieben, diagnostisch oder therapeutisch (einschließlich extrakorporal) oder beim Entwickeln und Durchführen von Assayverfahren unter Verwendung von Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, verwendet werden.
Die ausgewählten Einzel-Kette-Antikörper werden typischerweise beim Vorbeugen, Unterdrücken oder Behandeln von Entzündungszuständen, allergischer Überempfindlichkeit, Krebs, bakterieller oder viraler Infektion und Autoimmunstörungen (die Diabetes Typ I, Multiple Sklerose, Rheumatoidarthritis, systemischer Lupus erythematodes, Crohn-Krankheit und Myasthenia gravis umfassen, aber nicht darauf beschränkt sind), und bei der Verhinderung einer Transplantatabstoßung Verwendung finden. Beispielsweise können die Verarmung an regulatorischen T-Zellen oder Interferenz mit ihrer Rekrutierung zu einer verbesserten Immunantwort führen, die bei der Behandlung von Infektionen, die andernfalls einer normalen Immunantwort entgehen, von besonderer Verwendung ist.
Außerdem können die ausgewählten Einzel-Kette-Antikörper, einschließlich Fragmenten davon, zum Modulieren einer Immunantwort in Bereichen eines Wirbeltieres nützlich sein, wo sie normalerweise nicht lokalisiert sind. Beispielsweise können ein oder mehrere Antikörper, die, wie hierin beschrieben, verwendet werden, unter Verwendung von Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, in ein Gewebe eines Wirbeltiers perfundiert, injiziert werden. Die Gegenwart eines Antikörpers, wie hierin beschrieben, in einer solchen ektopischen Umgebung kann bei der Modulation einer Immunantwort während beispielsweise der Transplantatabstoßung und dergleichen nützlich sein.
In der vorliegenden Anmeldung umfaßt der Ausdruck „Vorbeugung" die Verabreichung der Schutzzusammensetzung vor der Induktion der Krankheit. „Unterdrückung" bezieht sich auf die Verabreichung der Zusammensetzung nach einem induktiven Vorgang, aber vor dem klinischen Auftreten der Krankheit. „Behandlung" umfaßt die Verabreichung der Schutzzusammensetzung, nachdem sich die Krankheitssymptome manifestiert haben.
Tiermodellsysteme, die verwendet werden können, um die Wirksamkeit der selektierten Antikörper beim Schützen vor oder Behandeln der Krankheit zu screenen, sind verfügbar. Verfahren zum Testen von systemischen Lupus erythematodes (SLE) in anfälligen Mäusen sind in der Technik bekannt (Knight et al. (1978) J. Exp. Med., 147: 1653; Reinersten et al. (1978) New Eng. J. Med., 299: 515). Myasthenia Gravis (MG) wird in weiblichen SJL/J-Mäusen durch Induzieren der Krankheit mit einem löslichen AchR-Protein aus einer anderen Spezies getestet (Lindstrom et al. (1988) Adv. Immunol., 42: 233). Arthritis wird bei einem anfälligen Stamm von Mäusen durch Injektion von Kollagen vom Typ II induziert (Stuart et al. (1984) Ann. Rev. Immunol., 42: 233). Ein Modell, durch das adjuvante Arthritis bei anfälligen Ratten durch Injektion von mykobakteriellen Hitzeschockprotein induziert wird, ist beschrieben worden (Van Eden et al. (1988) Nature, 331: 171). Thyreoiditis wird bei Mäusen durch Verabreichung von Thyroglobulin, wie beschrieben, induziert (Maron et al. (1980) J. Exp. Med., 152: 1115). Insulinpflichtiger Diabetes Mellitus (IDDM) tritt natürlich auf oder kann in bestimmten Stämmen von Mäusen induziert werden, wie denen, die von Kanasawa et al. (1984) Diabetologia, 27: 113, beschrieben sind. EAE bei der Maus und Ratte dient als ein Model für MS bei Menschen. In diesem Model wird die Demyelinationskrankheit durch Verabreichung von basischem Myelinprotein induziert (siehe Paterson (1986) Textbook of Immunopathology, Mischer et al., Hrsg., Grune and Stratton, New York, S. 179–213; McFarlin et al. (1973) Science, 179: 478; und Satoh et al. (1987) J. Immunol., 138: 179).
Im allgemeinen werden die selektierten Einzel-Kette-Antikörper in gereinigter Form zusammen mit pharmakologisch geeigneten Trägern verwendet. Typischerweise umfassen diese Träger wässerige oder alkoholische/wässerige Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen, einschließlich jeweils Kochsalzlösung und/oder gepufferter Medien. Parenterale Vehikel umfassen Natriumchloridlösung, Ringer-Dextrose, Dextrose und Natriumchlorid und Ringer-Lactatlösung. Geeignete physiologisch akzeptable Hilfsmittel, wenn notwendig, um einen Polypeptidkomplex in Suspension zu halten, können aus Verdickungsmitteln, wie Carboxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Gelatine und Alginaten, ausgewählt werden.
Intravenöse Vehikel umfassen flüssige und nährstoffreiche Ergänzungsstoffe und Elektrolytergänzungsstoffe, wie die, basierend auf Ringer-Dextrose. Konservierungsmittel und andere Additive, wie antimikrobielle Mittel, Antioxidationsmittel, Chelatbildner und Inertgase, können ebenso vorliegen (Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Auflage).
Die selektierten Einzel-Kette-Antikörper, einschließlich Fragmenten davon, können als separat verabreichte Zusammensetzungen oder zusammen mit anderen Mitteln verwendet werden. Diese können verschiedene Immunotherapeutika, wie Cyclosporin, Methotrexat, Adriamycin oder Cisplatinum und Immunotoxine, umfassen. Pharmazeutische Zusammensetzungen können „Cocktails" von verschiedenen zytotoxischen und anderen Mitteln zusammen mit den selektierten Antikörpern oder T-Zellen oder sogar Kombinationen der selektierten Antikörper umfassen.
Der Verabreichungsweg von pharmazeutischen Zusammensetzungen kann jeder von denen sein, die dem Fachmann bekannt sind. Für die Therapie, einschließlich und ohne Einschränkung für die Immunotherapie, können die selektierten Antikörper, Rezeptoren oder Bindungsproteine davon an jeden Patienten gemäß den Standardtechniken verabreicht werden. Die Verabreichung kann auf jede geeignete Weise erfolgen, einschließlich parenteral, intravenös, intramuskulär, intraperitoneal, transdermal, über den pulmonalen Weg, oder ebenso geeignet durch direkte Infusion mit einem Katheter. Die Dosierung und Häufigkeit der Verabreichung wird von dem Alter, dem Geschlecht und dem Zustand des Patienten, der begleitenden Verabreichung von anderen Arzneimitteln, der Gegenindikationen und von anderen Parametern, die durch den Arzt berücksichtigt werden, abhängen.
Die ausgewählten Antikörper können für die Lagerung lyophilsiert und in einem geeigneten Träger vor der Verwendung in Wasser aufgelöst werden. Bekannte Lyophilisierungs- und Rekonstitutionstechniken können eingesetzt werden. Es wird für den Fachmann selbstverständlich sein, daß die Lyophilisierung und Rekonstitution zu verändernden Graden an funktionellem Aktivitätsverlust führen kann, und daß höhere Verwendungsgehalte eingestellt werden müssen, um diesen zu kompensieren.
Außerdem können die Antikörper für diagnostische Zwecke verwendet werden. Beispielsweise können Antikörper, wie hierin beschrieben, gegen Antigene, die speziell während des Krankheitszustandes exprimiert werden oder deren Gehalte sich während eines gegebenen Krankheitszustandes verändern, erzeugt oder vermehrt werden.
Für bestimmte Zwecke, wie diagnostische Zwecke oder zur Nachverfolgung, können Markierungen hinzugefügt werden. Geeignete Markierungen umfassen die folgenden, sind aber nicht darauf beschränkt: radioaktive Markierungen, NMR-Spinmarker und fluoreszierende Markierungen. Mittel für die Detektion von Markierungen sind dem Fachmann bekannt.
Beispiele für geeignete radioaktive Markierungen umfassen Technetium 99m (^99mTc) oder Iod-123 (¹²³I). Markierungen, wie Iod-123, Iod-313, Indium-111, Fluor-19, Kohlenstoff-13, Stickstoff-15, Sauerstoff-17, Gadolinium, Mangan oder Eisen, erlauben die Detektion der Markierung unter Verwendung von NMR. Markierungen, wie 11C Methionin und FDG, sind zur Verwendung in der Technik der Positron-Emissionstomographie geeignet. Beschreibungen der Verfahrensweisen und Protokolle zur Verwendung von PET sind dem Fachmann bekannt.
Ein geeignetes Fluorophor ist GFP oder ein Mutant davon. GFP und seine Mutanten können zusammen mit den Antikörpern oder dem Targetmolekül durch Expression damit als ein Fusionspolypeptid gemäß den in der Technik allgemein bekannten Verfahren synthetisiert werden. Beispielsweise kann eine Transkriptionseinheit als eine In-frame-Fusion des gewünschten GFP und des Immunoglobulins oder Targets kon struiert und in einen Vektor, wie oben beschrieben, unter Verwendung konventioneller PCR-Klonierungs- und -Ligationstechniken eingeführt werden.
Antikörper, wie hierin beschrieben, können mit jedem Mittel, das ein Signal erzeugen kann, markiert werden. Das Signal kann jedes detektierbares Signal sein, wie die Induktion der Expression eines detektierbaren Genproduktes. Beispiele für detektierbare Genprodukte umfassen biolumineszierende Polypeptide, wie Luziferase und GFP, Polypeptide, detektierbar durch spezifische Assays, wie beta-Galactosidase und CAT, und Polypeptide, die die Wachstumsmerkmale der Wirtszelle modulieren, wie Enzyme, die für den Stoffwechsel erforderlich sind, wie HIS3 oder Antibiotika-Resistenzgene, wie G418.
Die Zusammensetzungen, enthaltend die selektierten Antikörper oder einen Cocktail davon, können für prophylaktische und/oder therapeutische Behandlungen verabreicht werden. Bei bestimmten therapeutischen Anwendungen wird eine angemessene Menge, um zumindest teilweise Inhibierung, Unterdrückung, Modulation, Tötung oder einige andere meßbare Parameter einer Population von selektierten Zellen zu erreichen, als eine „therapeutisch wirksame Dosis" definiert. Mengen, die benötigt werden, um diese Dosierung zu erreichen, werden von der Schwere der Krankheit und dem allgemeinen Zustand des Immunsystems des Patienten abhängen, liegen aber im allgemeinen in dem Bereich von 0,00005 bis 5,0 mg an selektiertem Einzel-Kette-Antikörper pro Kilogramm Körpergewicht, wobei Dosen von 0,0005 bis 2,0 mg/kg/Dosis üblicherweise verwendet werden. Für prophylaktische Anwendungen können Zusammensetzung, enthaltend die vorliegenden selektierten Polypeptide oder Cocktails davon, ebenso in ähnlichen oder leicht geringeren Dosen verabreicht werden.
Eine Zusammensetzung, enthaltend ein oder mehrere selektierte Antikörper, kann in prophylaktischen und therapeutischen Einstellungen verwendet werden, um die Alteration, Inaktivierung, Tötung oder Entfernung einer selektierten Zielzellpopulation in einem Säuger zu unterstützen. Außerdem können die selektierten Repertoires von hierin beschriebenen Polypeptiden extrakorporal oder in vitro selektiv verwendet werden, um eine Zielzellpopulation aus einer heterogenen Sammlung von Zellen zu töten, löschen oder anderweitig effektiv zu entfernen. Blut aus einem Säuger kann extrakorporal mit den selektierten Antikörpern, Zelloberflächenrezeptoren oder Bindungsproteinen davon kombiniert werden, wodurch die unerwünschten Zellen getötet oder anderweitig aus dem Blut zur Rückführung in den Säuger gemäß Standardtechniken entfernt werden.
Antikörper, wie hierin beschrieben, können in jedem Zelltyp exprimiert werden und können an jede intrazelluläre Komponente binden und deren Funktion beeinflussen. Intrazelluläre Komponenten können beispielsweise Komponenten des Zytoskeletts, Moleküle, die bei der Genexpression und/oder der Regulierung der Expression involviert sind, Enzyme oder Moleküle, die bei der Regulierung der Funktion von zellulären Komponenten involviert sind, sein. Ein Fachmann wird erkennen, daß die Aufzählung nicht ausschließlich sein soll. Wenn beispielsweise die Komponente ein Enzyminhibitor ist, kann ein Antikörper der vorliegenden Erfindung die Aktivität des Enzyms erhöhen oder verringern. Die aktive Stelle von Enzymen ist oftmals in dem größten Hohlraum auf der Proteinoberfläche lokalisiert. Diese Stellen sind normalerweise nicht immunogen für konventionelle Antikörper (Novotny et al., (1986) Proc. Nat. Acad USA, 83, 226). Die lange H3-Schleife von Einzel-Kette-Antikörpern dringt tief in die aktive Stelle von Enzymen ein, wodurch sie als effiziente Enzyminhibitoren fungieren können.
Insbesondere können die Einzel-Kette-Antikörper und/oder Fragmente und/oder Zusammensetzungen davon von besonderem Nutzen als Virostatika und/oder antibakterielle Mittel in externen Anwendungen, beispielsweise in Form von Cremes für die Haut, vaginale Anwendung und so weiter sein. Außerdem können die Antikörper, Fragmente und Zusammensetzungen Verwendung in der Behandlungsvorrichtung finden, wie an Stellen, wo opportunistische Infektionen vorherrschend sind. Beispielsweise können Antikörper, Fragmente davon und Zusammensetzungen in Krankenhausumgebungen und insbesondre auf Intensivstation von besonderem Nutzen sein. Außerdem können die Antikörper, Fragmente davon und Zusammensetzungen bei der Behandlung von Transplantationsmaterial, entweder künstliches oder natürliches Gewebe, Verwendung finden; beispielsweise Stents oder Knochenmark, infiziert mit CMV, oder andere Viren.
Außerdem können andere Funktionen zu Antikörpern, wie hierin beschrieben, hinzukommen, wie Transportpeptide und/oder funktionelle Komponenten, die eine enzymatische Aktivität bereitstellen, beispielsweise Kinasen, Proteasen, Phosphatasen, De-acetylasen, Acetylasen, Ubiquitinylierungsenzyme, Sumolationsenzyme, Methylasen usw. Außerdem können andere Antikörper an die Einzel-Kette-Antikörper oder Fragmente davon gebunden werden. Der Fachmann wird erkennen, daß diese Aufzählung nicht ausschließlich sein soll.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Einzel-VHH-schwere-Kette-Antikörpers in einem nicht-humanen transgenen Säuger, umfassend den Schritt des Exprimierens eines heterologen VHH schwere-Kette-Lokus in dem Säuger, wobei der VHH schwere-Kette-Lokus einen VHH-Bereich, einen J-Bereich, einen D-Bereich und einen konstante-schwere-Kette-Bereich umfaßt, wobei der konstante-schwere-Kette-Bereich, wenn expimiert, weder eine funktionsfähige CH1-Domäne noch eine funktionsfähige CH4-Domäne exprimiert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der VHH schwere-Kette-Lokus mindestens einen D-Bereich humanen Ursprungs und mindestens einen J-Bereich humanen Ursprungs umfaßt.
Verfahren zur Herstellung eines kamelisierten VH Einzel-schwere-Kette-Antikörpers in einem nicht-humanen transgenen Säuger, umfassend den Schritt des Exprimierens eines kamelisierten VH schwere-Kette-Lokus in dem Säuger, wobei der kamelisierte VH schwere-Kette-Lokus einen kamelisierten VH-Bereich, einen J-Bereich, einen D-Bereich und einen konstante-schwere-Kette-Bereich umfaßt, wobei der konstante-schwere-Kette-Bereich, wenn exprimiert, weder eine funktionsfähige CH1-Domäne noch eine funktionsfähige CH4-Domäne exprimiert.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei der kamelisierte VH schwere-Kette-Lokus mindestens einen D-Bereich humanen Ursprungs und mindestens einen J-Bereich humanen Ursprungs umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der konstante-schwere-Kette-Bereich einen oder mehrere konstante-schwere-Kette-Exons, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus C_δ, Cγ1–4, Cε und Cα1–2 umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei nur eine oder mehrere C_γ2 und/oder C_γ3 Gene mit nicht funktionsfähigen CH1-Domänen in dem konstante-schwere-Kette-Bereich vorliegen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der konstante-schwere-Kette-Bereich mindestens ein konstante-schwere-Kette-Gen umfaßt, welches von kamelidem Ursprung ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der konstante-schwere-Kette-Bereich mindestens ein konstante-schwere-Kette-Gen umfaßt, welches von nicht-kamelidem Ursprung ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der konstante-schwere-Kette-Bereich mindestens ein konstante-schwere-Kette-Gen umfaßt, welches von humanem Ursprung ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der VHH oder kamelisierte VH-schwere-Kette-Lokus weiter eine Rekombinationssequenz (rss) umfaßt, welche befähigt ist, einen J-Bereich direkt mit einem konstante-schwere-Kette-Gen zu rekombinieren.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der VHH oder kamelisierte VH-Lokus einen hybriden Einzel-schwere-Kette-Antikörper exprimiert.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei in dem Säuger endogene schwere-Kette-Loki gelöscht oder stummgeschaltet werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, weiter umfassend das Immunisieren des nicht-humanen transgenen Säugers mit einem Antigen, so daß eine Immunantwort gegen das Antigen hervorgerufen wird, welche in der Erzeugung eines affinitäts-gereiften spezifischen monoklonalen oder polyklonalen Einzel-schwere-Kette-Antikörpers resultiert.
Verfahren nach Anspruch 13, weiter umfassend die Herstellung von Hybridoma und die Herstellung und das Screenen von spezifische Einzel-schwere-Kette-Antikörper herstellenden Zellen.
Verfahren nach Anspruch 13, weiter umfassend das Isolieren von Nukleinsäuresequenzen von immunisierten transgenen Tieren für die Herstellung von spezifischen Einzel-schwere-Kette-Antikörpern oder Fragmenten davon, unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken.
Verfahren nach Anspruch 15, weiter umfassend die Verwendung von Phagentechniken und Protokollen, um spezifische Einzel-schwere-Kette-Antikörper oder Fragmente davon zu erzeugen, zu vermehren und zu screenen.
Verfahren nach Anspruch 15, weiter umfassend die Herstellung von großen Mengen spezifischer Einzel-schwere-Kette-Antikörper, oder Fragmenten davon, unter Verwendung einer Bakterien-, Hefe- oder Säugerzellkultur.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der nicht-humane transgene Säuger eine Maus ist.
Vektor, umfassend einen VHH schwere-Kette-Lokus oder einen kamelisierten VH schwere-Kette-Lokus, wie in einem der Ansprüche 1 bis 11 definiert.
Wirtszelle, welche mit einem VHH schwere-Kette-Lokus oder einem kamelisierten VH schwere-Kette-Lokus, wie in einem der Ansprüche 1 bis 11 definiert, transformiert ist.