-
Die
vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Analyse von kleinen
biologischen oder chemischen Proben und insbesondere Vergleiche
der Transmissions- oder Emissions-Spektren im nahen Infraroten,
um die Degradation von Lösungen
der in Mikroröhrchen
gelagerten Verbindungen zu messen.
-
In
einem System, wo eine sehr grosse Anzahl von sehr kleinen Proben über verlängerte Zeitdauern
gelagert werden, besteht ein Risiko, dass einige der Proben sich über die
Zeit durch den Zufluss von ungewünschten
Unreinheiten wie Wasser verschlechtern können,. Es ist vorteilhaft,
in einer nicht-intrusiven Art und Weise fähig zu sein, zu überprüfen, ob
eine Probe kontaminiert worden ist.
-
US-A-4,675,390
beschreibt ein universelles Spektrometersystem mit einer modularen
Probenkammer, die in getrennter Weise konstruiert worden ist, eingeschlossen
in eine modulare Einheit, die in einfacher Weise an eine Gehäusewand
befestigbar und lösbar
ist, welche die Basiseinheit des Spektrometers ausmacht, und welche
ein Interferometer enthält,
einen oder mehr Detektoren und andere Anteile des Systems.
-
Die
US-A-3,748,044 beschreibt eine digitale chemische Analysevorrichtung
zum Evaluieren von Reaktionsraten und Endpunktbestimmungen, die
innerhalb einer Vielzahl von individuellen Mustern stattfinden.
-
WO
99/12017 beschreibt ein Verfahren einer Vorrichtung zum Identifizieren
von Wirkstoffen, um die Formation von Komplexen zwischen Reaktanten zu
bestimmen.
-
Gemäss der vorliegenden
Erfindung ist ein Infrarot-Analysesystem zur Analyse von Proben
vorgesehen, um eine Degradation während des Speicherns zu erfassen,
wobei die Proben in transparenten oder durchscheinenden Behältern angeordnet sind,
wobei das System umfasst: eine infrarote Lichtquelle, eine behälterlokalisierende
Vorrichtung zum Lokalisieren eines Behälters in einer bekannten Position
relativ zur infraroten Lichtquelle, ein Spektrometer, das ausgestaltet
ist, um infrarotes Licht von den Behältern zu empfangen, Mittel
zum Lesen der Identität
eines Behälters,
Mittel, die ausgestaltet sind, um von dem Spektrometer aufgezeichnete
Spektren an eine Datenbank zu übermitteln,
Mittel, die ausgestaltet sind, um die Spektren und die Identität des Behälters in
der Datenbank in einem Datensatz aufzuzeichnen; und Mittel, die
ausgestaltet sind, um von dem Spektrometer aufgezeichnete Spektren
mit einem zuvor aufgezeichnetem Spektrum zu vergleichen, welches
in der Datenbank für
denselben Behälter
abgespeichert ist.
-
Vorzugsweise
bewirkt die behälterlokalisierende
Vorrichtung, dass die Röhre
gedreht wird, während
sie ihre Position relativ zur infraroten Lichtquelle beibehält.
-
Die
behälterlokalisierende
Vorrichtung kann ausgestaltet sein, um eine Mikroröhre oder
eine Kulturplatte zu halten.
-
Das
Spektrometer kann so angeordnet sein, um Licht aufzunehmen, welches
von dem Behälter durchgelassen
oder reflektiert worden ist.
-
1 ist
eine schematische Ansicht der Vorrichtung, um Spektren zu erhalten,
-
2 ist
ein Bildschirmausdruck, der Spektren verschiedener Komponenten zeigt,
die in der Mikroröhre 14 gefunden
werden,
-
3 ist
ein Bildschirmausdruck, der ein Spektrum zeigt, welches von einer
unbekannten Substanz erhalten wird, welche Dimethylsulfoxid (DMSO)
ist,
-
4 ist
ein Bildschirmausdruck, der ein Spektrum zeigt, welches aus DMSO
mit einer Unreinheit erhalten worden ist, die dadurch imitiert wurde, das
Licht durch eine Plastikfolie geleitet wurde.
-
Die
schematische Darstellung der 1 zeigt
eine Lichtquelle 10 im nahen Infraroten (NIR), innerhalb
einer Lampenfassung. Das Licht verlässt die Fassung durch eine Öffnung und
wird durch eine Linse 12 auf einer zu analysierenden Probe
fokussiert, die von einer transparenten oder durchscheinenden Mikroröhre 14 gehalten
wird, an ihrer Position durch einen Röhrenhalter 15 gehalten,
welcher eine optische Faserschnittstelle 16 zu einem Spektrometer 17 aufweist.
Die Faseroptik 16 reduziert die Wirkungen der Beugung und
Brechung auf die an das Spektrometer 17 gesandten Daten.
-
Die
Mikroröhre 14 kann
an Ort und Stelle durch einen Roboter gehalten werden, der auch
die Mikroröhre 14 drehen
kann, während
er sie an ihrer Position relativ zur Lichtquelle 10 hält. Dies
vermindert Fehler, die als Ergebnis von Mängeln der Ausgestaltung der
Mikroröhre 14 auftreten
können.
Alternativ kann die Probe 13 auch in einer Kulturplatte
gehalten werden, eher als in einer Mikroröhre 14. Dies ist insbesondere
geeignet, wenn die Probe 13 lebende Zellen umfasst, die
daher in situ auf den Platten getestet werden können, auf welchen sie wachsen. Falls
das Spektrum einer biologischen Probe auf einer Kulturplatte erhal ten
wird, ist es dann möglich, das
Spektrum zu einer späteren
Zeit zu vergleichen, um zu sehen, ob die Platte durch Produkte kontaminiert
worden ist, die annehmen lassen, dass unprogrammierter Zelltot,
oder Nekrose, stattgefunden hat. Falls dies der Fall ist, können die
Zellen lysieren und Produkte abgeben, von denen das Spektrum erfassbar
ist.
-
Die
Lichtquelle 10 ist eine 12V-Hallogenlampe mit einem Aluminiumreflektor.
Solch eine Lampe hat eine gleichmässige Lichtabgabe über die
Wellenlänge
des nahen Infraroten, die im Spektrometer 17 eingesetzt
werden, und hat auch den Vorteil, dass das Meiste des Lichts nach
vorne abgegeben wird. Das Projizieren des Lichts des nahen Infraroten durch
die Blende liefert eine gleichmässige
Punktlichtquelle und gestattet die Bündelung des Strahls. Der Einsatz
einer Linse 12, um das Licht zu fokussieren, gewährleistet,
dass das Licht in die Mikroröhre 14 im
wesentlichen senkrecht zu den Wänden
eintritt, um den optischen Weg durch die Wände der Mikroröhre zu minimieren
und den Weg durch die Inhalte zu maximieren, was also unerwünschte Linseneffekte
vermindert, die durch die gekrümmten
Wände der Mikroröhre bewirkt
werden. Der Röhrenhalter 15 in Gestalt
einer V-förmigen Öffnung mit
der Faseroptik 16 an seiner Spitze, gestattet ein einfaches
und wiederholbares Positionieren der Mikroröhre 14 relativ zur
Lichtquelle 10 und der faseroptischen Schnittstelle 16.
Die Mikroröhrenprobe 13 enthält eine
Verwendung, die im Allgemeinen in DMSO aufgelöst ist und die Lösung wird
einen Anteil der nahinfraroten Strahlung absorbieren. Die Menge
an Strahlung, die bei jeder Wellenlänge absorbiert wird, ist abhängig von
der jeweiligen Substanz, die in der Mikroröhre 14 ist, und abhängig von
der chemischen Zusammensetzung der Mikroröhre 14 und dem Lösungsmittel
und der Strahlung, die durch die Röhre 14 hindurchgelassen wird,
und der Inhalte, die vom Spektrometer 17 festgestellt werden.
Das Spektrometer 17 gestattet es, die Menge an Strahlung, die
an einer Anzahl von verschiedenen zu messenden Wellenlängen absorbiert worden
sind, zu messen, um eine chemische Signatur der Mikroröhre 14 und
der Probe 13 abzugeben. Die Signatur wird in einer Datenbank
gespeichert und kann zu einem späteren
Zeitpunkt abgefragt werden, um mit einer neuen Lesung verglichen
zu werden, die durch das erneute Vorlegen der selben Mikroröhre 14 und
der Probe 13 in dem Röhrenhalter 15 erhalten worden
ist. Jegliche Änderungen
in den Messungen sind Änderungen
in entweder der Mikroröhre 14 oder der
Probe 13 zuzuschreiben. Diese Änderungen können analysiert werden, um
die Quelle der Degradation zu bestimmen.
-
Eine
bestimmte Quelle der Degradation einer Probe 13 kann der
Zufluss von Wasser in die Mikroröhre 14 sein.
-
Ein
Beispiel eines Spektrometers, welches hier geeignet ist, ist das
Zeiss MMS Near-InfraRed-Spectrometer. Das Spektrometer benutzt eine 128-elementige
Matrix, die Wellenlängen
zwischen 0.9 und 1.7μm
abdeckt.
-
Das
System wird durch das Erhalten von weissen Spektren über 20 Integrationswerte
zwischen 0.8 und 51ms für
alle Werte, die nicht saturiert sind, kalibriert. Die Matrizen werden
dann gegen den tatsächlichen
Zählwert
gegen die Integrationszeit für 128
Wellenlängen
aufgebaut. Ausgleichswerte werden dann auf allen dieser Matrizen
berechnet, um Gleichungen zu erhalten, die sich für jede Wellenlänge auf
den Signalwert zur Integrationsdauer beziehen. Diese Gleichungen
können
eingesetzt werden, um vorherzusagen, was das weisse Spektrum bei
einer gegebenen Integrationszeit sein würde, falls der Detektor gegenüber Sättigung
immun wäre.
Sobald das weisse Referenzspektrum berechnet worden ist, wird die
zu messende Substanz in das System eingelassen und ein Satz von
Spektren wird über
die gesamte Breite der erlaubten Integrationszeiten aufgenommen.
Das Spektrometer 17 erzeugt einen Vektor von 128 Integern,
die die Intensität
zu verschiedenen Wellenlängen
in ungefähren
Inkrementen von 6 Nanometer darstellen. Um diese Integerzahlen in
Transmissionswerte zu wandeln, ist es zuerst notwenig, die Spektren
zu erkennen, die für
null und volle Transmission erzeugt werden. Es wird dann angenommen, dass
das Spektrometer eine lineare Antwort über den betreffenden Bereich
aufweist und Werte so skaliert werden können, dass schwarze Werte 0
und ungehinderte Werte 1 werden.
-
Die
Datenaufnahme wird durch zwei speziell ausgestaltete Karten erreicht.
Die Ausgabe des Spektrometers 17 ist in Gestalt einer Abfolge
von analogen Differenzspannungen, die proportional zur Intensität des Lichtes
sind, welches auf die innere CCD-Matrix während einer vordefinierten
Integrationszeit fällt.
Die Ausgangsspannungen werden in eine 14-bit Digitalzahl auf einer
Front End Electronics-Karte gewandelt, die lokal an dem Spektrometer vorgesehen
ist, um Rauschinterferenz auf empfindlichen analogen Leitungen zu
vermindern. Diese digitalen Daten werden dann seriell an die Spektrometersteuerkarte übermittelt,
die in einem entfernt stehenden PC angeordnet ist, welcher wiederum
die Daten direkt in den RAM-Speicher des PC's über
DMA übermittelt.
Diese Karten steuern auch die digitale Steuerung und Taktsignale,
die vom Spektrometer 17 angefordert sind. Die Integrationszeit
des Spektrometers 17 kann auch von dem PC aus gesteuert
werden durch Beschreiben eines Registers innerhalb der Karte.
-
Sobald
die Daten gesammelt worden sind, kann eine Anzahl von Operationen
durchgeführt
werden, um die Inhalte der Mikroröhre 14 zu bestimmen. Die
Transmission von Licht durch eine Substanz wird einer exponentiellen
Abschwächung
der Form: T = eklog (t) unterworfen,
wobei T die Transmission von k Einheiten der Substanz mit einer
einzelnen Einheitstransmission von t ist. Der Algorithmus arbeitet
von einem betrachteten Spektrum ausgehend und versucht, es als eine
Kombination von Referenzspektren auszudrücken. Das Spektrometer nimmt
Licht in 128 verschiedenen Wellenlängenintervallen auf und daher müssen 128
Gleichungen gleichzeitig gelöst
werden. Dies wird getan durch das Levenberg-Marquardt-Verfahren. Dies kann eingesetzt
werden, um die Menge von jedem Referenzspektrum zu finden, welches
die nächste
Approximierung an das betrachtete Spektrum bietet. Es ist möglich, den
Wechsel in der Menge einer bekannten Substanz selbst dann zu messen,
falls die Identität
der zuvor in dem Behälter vorhandenen
Substanzen nicht bekannt ist. Dies erfordert, dass sich die Substanzen
in dem Behälter nicht
verändern,
sondern Wissen, was genau sie sind, nicht notwendig ist. Beispielsweise
seien zwei Spektren der selben Probe gegeben, von denen beide einen
bestimmten Anteil von Absorption einer unbekannten Substanz Tc enthalten, ist es möglich, den Wechsel in der Menge
einer Substanz festzustellen, welche ein bekanntes Spektrum Tb hat, durch Analyse des Verhältnisses
der Spektren. Das ursprüngliche
Spektrum, welches von einem Behälter
erhalten wird Tl = tc.
Ein nachfolgendes Spektrum von dem Behälter ist T2 =
tb·tc. Das Verhältnis T1/T2 ist tb.
-
Zu
jeder Stufe innerhalb des Verfahrens können die Daten in grafischer
Form entweder als rohe Signalzahl oder als Transmission auf der
Ordinate dargestellt werden und die Kanalnummer des Spektrometers 17 auf
der Abszisse. Die Kanalnummer bezieht sich auf die Wellenlänge des
Lichtes und kleinere Kanalnummern entsprechen längeren Wellenlängen.
-
Die
Begrenzungen der Matrix der internen CCD des Spektrometers und die
Optiken können eine
Verschlechterung an jedem Ende des Spektrums in dem Masse bewirken,
dass das Signalrauschverhältnis
die Daten unzuverlässig
macht. Um diesen Nachteil auszugleichen, können die ersten und letzten
wenigen Datenpunkte für
jedes Spektrum weggelassen werden.
-
Um
systematische Fehler innerhalb des Systems zu entfernen, ist es
wichtig, Änderungen
aufgrund der Drift des Dunkelreferenzpunktes über die Zeit zu entfernen.
Dies wird durch eine flache Faltungsoperation durchgeführt, wobei
ein Algorithmus eingesetzt wird, um ein dunkles und ein helles Spektrum
zu kombinieren, um die Wirkungen von Nichtlinearitäten des
Spektrometers zu vermindern.
-
Die
Wirkungen der Selbstlinseneigenschaften um die Mikroröhre 14 kann
auch ohne Einführung von
spezifischer Software durch Einführung
eines spezifischen Spektrums behandelt werden, welches "grey.nir" genannt wird. Dies
ist ein simuliertes Spektrum, welches 0% Absorption enthält. Die
Linsenwirkung führt
dazu, dass das gesamte Signal mit einem unbekannten Wert zu multiplizieren
ist, welcher tatsächlich
das Weissniveau nach oben bzw. unten verschiebt. Das Liefern eines
gleichförmigen
Absorptionsspektrums gestattet es dem Algorithmus, das Weissniveau
zurück
auf 1.0 zu bringen durch Multiplizieren des gesamten Spektrums durch
eine geeignete Zahl.
-
Sobald
diese Wirkungen in Betracht gezogen sind, können die Daten weiter analysiert
werden. Das aus einer Mikroröhre
erhaltene Spektrum wird aus einer Anzahl von Komponenten hergestellt,
wie diejenigen, die in 2 dargestellt sind. Das nahe
Infrarote wird in verschiedenen Mengen durch jede der Komponenten
absorbiert werden, durch welche es hindurch geht. Das so erhaltene
Spektrum aus der Mikroröhre
wird so um verschiedene Mengen von jeder der in der Mischung vorhandenen
Substanzen reduziert, auch umfassend den Kunststoff, aus dem die Mikroröhre ausgebildet
ist. Das Spektrum wird analysiert, um festzustellen, welche Substanzen
in der Mischung vorhanden sind. Zuerst wird das Absorptionsspektrum
aus dem Transmissionsspektrum berechnet. Jegliche bekannten Komponenten
der Mischungen können
getrennt gemessen werden und die Daten ihrer Spektren können in
der Datenbank gespeichert werden, so dass geeignete Vergleiche durchgeführt werden
können.
Ein Algorithmus kann eingesetzt werden, um eine Ausgleichsanpassung
für die unbekannten
Bestandteile der Mikroröhre
zu erhalten, unter Betrachtung der Referenzabsorptionsspektren.
-
Die
Ausgleichsspektren werden erhalten durch Multiplikation der Absorptionsspektren
der Referenzproben durch eine Variable, welche den Anteil des gesehenen
Referenzspektrums darstellt. Bspw., falls das Referenzspektrum von
DMSO durch eine 3mm Probe aufgenommen worden ist, sollte der Algorithmus
eine "Menge an vorhandenem
DMSO"-Wert von 1.0
für 3mm
und von 0.1 für
0.3mm erzeugen. Wo Vielfachabsorptionsspektren vorhanden sind, sollten
die berechneten Werte das Verhältnis der
in der Probe vorhandenen Substanz multipliziert mit der Dicke der
Probe und geteilt durch die Dicke der Referenzprobe sein. Falls
alle Referenzproben auf die Dicke der einzusetzenden Behälter normalisiert
sind, werden die Ergebnisse das Verhältnis von jeder Substanz im
Behälter
ergeben.
-
Die 3 zeigt
ein von der Mikroröhre 14 erhaltenes
Spektrum. Es wird angenommen, dass sie DMSO enthält, und daher wird das erhaltene
Spektrum mit dem Referenzspektrum für DMSO verglichen. Der ChiQuadrat-Wert
ist klein (1.649), was eine gute Korrelation zwischen der Substanz
in der Mikroröhre
und dem Referenzspektrum für
DMSO bedeutet. Es ist daher möglich,
abzuleiten, dass die Mikroröhre
DMSO enthält.
-
Die 4 zeigt
ein scheinbar ähnliches Spektrum,
welches aus einer Mikroröhre
erhalten worden ist. In diesem Falle ist eine Unreinheit imitiert worden,
indem das Licht durch eine Plastikfolie hindurchgeleitet worden
ist. Obwohl die Mikroröhre
immer noch DMSO enthält,
ist der ChiQuadrat-Wert, der erhalten wird, wenn das Spektrum der
Mikroröhre mit
dem Referenzspektrum für
DMSO verglichen wird, sehr hoch, was vermuten lässt, dass neben DMSO auch etwas
anderes vorhanden ist.
-
Falls
beispielsweise vermutet wird, dass die Probe durch Wasser verunreinigt
worden ist, ist es möglich,
die Referenzdaten für
Wasser und für
die vorgängig
gemessenen Inhalte der Mikroröhre
zu vergleichen und die besten Ausgleichsgrade mit Fehlerstatistiken
zu betrachten. Falls der ChiQuadrat-Wert klein ist; dann ist die
Identifikation der Verunreinigung als Wasser wahrscheinlich richtig.
Falls der ChiQuadrat-Wert hoch ist; dann ist die Identifikation nicht
richtig oder unvollständig
gemacht worden. Der ChiQuadrat-Wert wird mit den individuellen Werten kombiniert,
um ein Ausgabewert zu erzeugen, der zwischen 1 und 10 liegt, wobei
1 darauf hinweist, dass eine exzellente Anpassung vorliegt, werte
um 5 eine schlechte Anpassung bedeuten und Werte um 10 keinerlei
Anpassung anzeigen.
-
Obwohl
das System in Bezug auf Transmissionsspektren ausgestaltet worden
ist, können,
falls die Substanzen opak sind, wie es häufig im Fall von Emulsionen
der Fall ist, anstelle dessen Reflektionsspektra eingesetzt werden
können.