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DE60209345T2 - Leporipox-basierende vektorvakzine - Google Patents

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DE60209345T2
DE60209345T2 DE60209345T DE60209345T DE60209345T2 DE 60209345 T2 DE60209345 T2 DE 60209345T2 DE 60209345 T DE60209345 T DE 60209345T DE 60209345 T DE60209345 T DE 60209345T DE 60209345 T2 DE60209345 T2 DE 60209345T2
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virus
exogenous dna
recombinant
leporipox
antigen
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Akzo Nobel NV
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Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung eines Leporipox-Virusvektor-Impfstoffs in nicht-suszeptiven Wirtsspezies sowie auf lebende, rekombinante Leporipoxviren.
  • Vektor-Impfstoffe, die auf Orthopox- und Avipoxviren basieren, und deren Potential als rekombinante virale Vektoren für Impfungen sind beschrieben worden. Das US-Patent 5759841 beschreibt ein rekombinantes Vacciniavirus, welches in einer nicht-essentiellen Region des Vacciniavirus-Genoms eine Morbilli-(Masern)-Virus-DNA enthält, die für wenigstens ein Glykoprotein kodiert, sowie einen Promotor zur Expression der DNA. Das rekombinante Vacciniavirus kann in Impfstoffen verwendet werden, um in Hunden eine Immunantwort auf Morbillivirus zu induzieren. Das rekombinante Vaccinia-Vektor-Virus ist jedoch in einer grossen Zahl von verschiedenen Spezies, einschliesslich des Menschen, permissiv, und daher weist das beschriebene Vaccinia-Vektor-Virus das potentielle Risiko auf, eine unkontrollierte Infektion im geimpften Wirt zu verursachen oder von einem geimpften Wirt auf einen ungeimpften Wirt übertragen zu werden.
  • WO 9527780 beschreibt ein rekombinantes Avipoxvirus, welches aufgrund seines eingeschränkten Wirtsspektrums eine attenuierte Virulenz in einem nicht-avianen Wirt aufweist. Die rekombinanten Avipoxviren enthalten exogene DNA in einer nicht-essentiellen Region des Virus-Genoms, wobei die exogene DNA für wenigstens ein Antigen des Hundestaupevirus (engl. Canine Distemper Vi rus, CDV) oder ein M- oder N-Antigen des Masernvirus (MV) kodiert. Diese Viren können verwendet werden, um eine antigene oder immunologische Antwort in Kaninen (Hunden) und anderen Karnivoren wie auch im Menschen zu erzeugen. Die rekombinanten Avipoxviren sind auf ihren natürlichen Wirt beschränkt, und Impfung von nicht-avianen Spezies mit diesen Vektorviren führt zur Expression des exogenen Antigens ohne produktive Replikation des Virus. Das Expressionsniveau des exogenen Antigens bleibt jedoch nach Impfung mit dem Avipoxvirus-Vektor niedrig. Es besteht daher ein Bedürfnis nach verbesserten Expressionsniveaus des exogenen Antigens. Zudem führt eine Immunisierung mit Avipoxvirus-Vektor nicht immer zu genügend neutralisierenden Antikörpern gegen das exogene Antigen. Impfung von Katzen mit einem Kanarienpocken-basierten FeLV-Vektorimpfstoff führte nicht zur Produktion von neutralisierenden anti-FeLV-Antikörpern (J. Tartaglia et al., 1993, J. Virol. 67, S. 2370–2375). Neugeborene Kätzchen sind besonders suszeptiv für eine FeLV-Infektion. Da sie in den ersten Wochen nach der Geburt noch nicht über ein ausgereiftes Immunsystem verfügen, müssen sich neugeborene Kätzchen zum Schutz vor einer FeLV-Infektion auf die mütterlicherseits hergestellten Antikörper verlassen. Falls die Impfung die Mutter nicht mit neutralisierenden Antikörpern ausgestattet hat, werden die Kätzchen nicht gegen FeLV geschützt sein und der Infektion unterliegen.
  • Überraschend wurde herausgefunden, dass ein lebendes rekombinantes Leporipoxvirus, welches exogene DNA umfasst, die für wenigstens ein Antigen kodiert, verwendet werden kann, um eine antigene oder immunogene Antwort in einem Wirt hervorzurufen, der normalerweise nicht für eine reproduktive Infektion mit Leporipoxviren empfänglich ist, d.h., das Leporipoxvirus ist nicht in der Lage, nach der Infektion in dem Wirt zu replizieren. Produktive Infektion mit Leporipox-Viren ist allein auf Leporiden-Spezies beschränkt. Folglich wird eine Infektion einer nichtleporiden Spezies mit einem Leporipoxvirus nicht zur Replikation des Leporipoxvirus führen. Es war daher überraschend, dass herausgefunden wurde, dass ein lebendes rekombinantes Leporipoxvirus fähig war, einen nicht-suszeptiven Wirt zu infizieren und das genannte Antigen in dem ge nannten Wirt zu exprimieren, und zwar in Abwesenheit von produktiver Replikation des Virus, was dadurch belegt wird, dass eine Übertragung des Virusvektors auf andere Kontakttiere nicht erfolgt. Noch überraschender war es, dass die Infektion eines nichtleporiden Wirts mit dem genannten Leporipoxvirus-Vektor zur Expression hoher Niveaus des durch die exogene DNA kodierten Antigens führte, obwohl keine produktive Replikation des Virus in dem genannten Wirt beobachtet wurde. Dagegen findet Wachstum des viralen Vektors in vitro in einigen Säugetier-Zelllinien statt. Zudem wird wegen der Abwesenheit von produktiver Replikation des Leporipoxvirus-Vektors in einem nicht-suszeptiven Wirt das Leporipoxvirus in den nichtleporiden Spezies nicht pathogen sein, was diese Virusvektoren noch geeigneter für eine Impfung macht.
  • Impfung mit einem rekombinanten Myxomvirus, das exogene DNA umfasst, wurde in FR-A-2736358 beschrieben. Das rekombinante Myxomvirus wurde benutzt, um Hasen gegen Myxomatose und Infektionskrankheiten, die von anderen Hasen-Pathogenen verursacht werden, zu impfen. Die FR-A-2736358 schlägt nirgends die Verwendung eines lebenden, rekombinanten Myxomvirus als viralem Vektor vor, um eine antigene oder immunogene Antwort in nicht-suszeptiven Spezies zu induzieren, insbesondere in nichtleporiden Spezies.
  • So bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung eines lebenden, rekombinanten Leporipoxvirus, das exogene DNA umfasst, welche zusammenwirkend mit mindestens einem Expressions-Kontrollelement verbunden ist, und welche in einer nicht-essentiellen Region des Virusgenoms eingebaut ist, zur Herstellung eines Vektorimpfstoffs zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Infektionskrankheiten in nichtleporiden Spezies. Vorzugsweise wird ein lebendes, rekombinantes Myxomvirus, welches exogene DNA umfasst, welche zusammenwirkend mit mindestens einem Expressions-Kontrollelement verbunden ist und welche in einer nicht-essentiellen Region des Virusgenoms eingebaut ist, zur Herstellung eines Vektorimpfstoffes zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Infektionskrankheiten in nicht-leporiden Spezies verwendet. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung des genannten lebenden, rekombinan ten Leporipoxvirus zur Herstellung eines Vektorimpfstoffes zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Infektionskrankheiten in avianen, felinen, kaninen, porzinen, ovinen, bovinen, equinen und menschlichen Spezies. Vorzugsweise wird das erfindungsgemässe lebende rekombinante Leporipoxvirus zur Herstellung eines Vektorimpfstoffes für die Behandlung von Infektionskrankheiten in kaninen und felinen Spezies verwendet.
  • Die Erfindung stellt zudem ein lebendes rekombinantes Leporipoxvirus zur Verfügung, welches exogene DNA umfasst, die zusammenwirkend mit mindestens einem Expressions-Kontrollelement verbunden ist, wobei diese exogene DNA für mindestens ein Antigen eines Pathogens kodiert, welches eine Infektionskrankheit in Nichtleporiden hervorruft. Insbesondere kodiert die exogene DNA vorzugsweise für mindestens ein Antigen eines Pathogens, welches eine Infektionskrankheit in menschlichen, bovinen, avianen, felinen, kaninen, porzinen, equinen oder ovinen Spezies hervorruft. Vorzugsweise kodiert die exogene DNA für ein Antigen eines felinen oder kaninen Pathogens. Erfindungsgemäss kann das Pathogen viralen, bakteriellen oder parasitischen Ursprungs sein, abhängig von der Krankheit, gegen welche das Subjekt geimpft werden soll. Falls das Pathogen ein RNA-Genom aufweist, kann das interessierende Antigen durch cDNA, welche dem Gen entspricht, kodiert sein. Die exogene DNA kann für zwei oder mehr Antigene kodieren, welche vom selben Pathogen oder von verschiedenen Pathogenen abgeleitet sein können.
  • Eine geeignete exogene DNA zur Verwendung in einem rekombinanten Leporipoxvirus kodiert vorzugsweise für virale Glykoproteine, virale Hüllproteine, virale Matrixproteine, bakterielle äussere Membranproteine (engl. Outer Membrane Proteins), bakterielle Enterotoxine, bakterielle Fimbrien oder parasitische Proteine. Insbesondere kodiert die exogene DNA für das Hüllprotein des felinen Leukämievirus (FeLV) (Stewart et al. (1986) J. Virol. 58, S. 825–834) oder dessen Matrixprotein (Donahue et al., 1988, J. Virol. 62, S. 722–731), das „Major Guter Membrane Protein" von felinen oder Schafschlamydien (GenBank Zugangsnummern CPFPNMOMP bzw. CHTMOMPX), das VP2-Protein des felinen Pan leukopenievirus (FPV) (Carlson J et al., 1985, J. Virol. 55, S. 574–582), Kapsidprotein des felinen Calicivirus (M.J. Carter at al., 1992, J. Arch. Virol. 122, S. 223–235), Gag-, Pol-, Rev-, Tat- oder Vif-Proteine des felinen Immunschwächevirus (FIV) (R.I. Talbot et al., 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86, S. 5743–5747; T.R. Philips et al., 1990, J. Virol. 64, S. 4605–4613; K.M. Lockridge et al., 1999. J. Virol. 261, S. 25–30), das Membran-, Nukleokapsid- oder Spikeprotein des felinen infektiösen Peritonitisvirus (FIPV) (R.J. de Groot et al., 1987, J. Gen. Virol. 68, S. 2639–2646; H. Vennema et al., 1991, Virology, 181, S. 327–335), das Env-, HA-, Fusions- oder Nukleokapsidprotein des Hundestaupevirus (engl. Canine Distemper Virus) (M. Sidhu et al., 1993, Virology 193, S. 66–72; U. Gassen, et al. 2000, J. Virol. 74, S. 10737–10744), das VP2-Protein des kaninen Parvovirus (Reed, P. et al., 1988, J. Virol. 62, S. 266–276), Tollwutvirus-Glykoprotein G (T.J. Wiktor, et al. 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, S. 7194–7198), das Spike-Protein des kaninen Coronavirus (B. Horsburgh, et al. 2000, J. Gen. Virol. 73, S. 2849–2862). Ausser Genen, die für immunogene Proteine von nichtleporiden Pathogenen kodieren, kann die exogene DNA auch Gene umfassen, die für Zytokine kodieren wie z.B. INFγ (GenBank Zugangsnr. D30619), IL-1β (GenBank Zugangsnr. M92060), IL-2/15 (GenBank Zugangsnr. AF054601), IL-4, IL-5 (GenBank Zugangsnr. AF025436), IL-6, IL-12 (GenBank Zugangsnr. 083184 und 083185), IL-16 (GenBank Zugangsnr. AF003701) oder IL-18 (GenBank Zugangsnr. ABO46211), oder chemotaktische Zytokine wie die α-Chemokine IL-8 (GenBank Zugangsnr. XM003501), GROα, GROβ, NAP-2, PF-4, IP10, CTAP-III, β-TG und die β-Chemokine MCP-1 (GenBank Zugangsnr. NM002982), MIP-1α, MIP-1β, RANTES (GenBank Zugangsnr. XM012656), MCP-2 (GenBank Zugangsnr. AJ251190), MCP-3 (GenBank Zugangsnr. NM 006273), MCP-4 (GenBank Zugangsnr. AJ251191). Vorzugsweise werden die Gene, welche erfindungsgemäss für geeignete Zytokine kodieren, von der selben Spezies abgeleitet wie diejenige, welcher der Impfstoff verabreicht wird.
  • Die exogene DNA ist zusammenwirkend mit mindestens einem Expressions-Kontrollelement verbunden, welches die Expression der genannten exogenen DNA kontrollieren und regulieren wird. In einer bevorzugten Ausführungsform wird jedes in der exogenen DNA vorhandene Gen durch ein getrenntes und unterschiedliches Expressions-Kontrollelement kontrolliert. Expressions-Kontrollelemente sind in der Fachwelt bekannt und schliessen Promotoren ein. Geeignete Promotoren für die Expression der exogenen DNA gemäss der Erfindung sind virale oder synthetische Promotoren, welche geeignet sind, die Expression im Zytoplasma zu modulieren. Promotoren, welche in der vorlegenden Erfindung nützlich sind, sind Pockenvirus-Promotoren, vorzugsweise ein Vaccinia-Promotor (siehe die DE-A-19627193; Mackett et al., „DNA Cloning Volume III", ed. D.M. Glover, 1985, IKL Press Ltd.). Bevorzugte Promotoren gemäss der vorliegenden Erfindung sind synthetische Promotoren, stärker bevorzugt synthetische Early- oder Early/Late-Promotoren. Synthetische Early/Late-Promotoren für das Vacciniavirus sind in Chakrabati et al., BioTechniques 23, Vol. 6, S. 1094–1097, 1997 beschrieben. Die Promotoren können unter Verwendung von Standardtechniken des Fachgebiets synthetisiert werden, wie zum Beispiel in Chakrabati et al., 1997, a.a.o. beschrieben.
  • Geeignete Leporipoxviren, die gemäss der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen, aber sind nicht beschränkt auf, Myxomviren oder Shope-Fibrom-Viren. Geeignete Myxomvirusstämme umfassen den Lausanne-Stamm (von ATCC), SG33 (Mainil, M.D. et al. 2000, J. Comp. Pathol. 122, S. 115–122), Borghi und Boerlage (Fenner & Fantini, „Biological Control of Vertebrate Pests", CABI Publishing 1999, ISBN 0 85199 323 0 und darin genannte Literaturstellen). Geeignete Shope-Fibrom-Virusstämme umfassen den Original-A-Stamm (ATCC Katalog-Nr. VR-112) und den Kasza-Stamm (ATCC Katalog-Nr. VR-364). Vorzugsweise ist das lebende rekombinante Leporipoxvirus gemäss der vorliegenden Erfindung von einem Myxomvirus abgeleitet. Dank seiner Wirts-Beschränkung auf Leporiden-Spezies ist das Leporipoxvirus in einem nichtleporiden Wirt nicht virulent. Es ist jedoch bevorzugt, ein attenuiertes Leporipoxvirus zu verwenden, um die lebenden rekombinanten Viren der Erfindung zu generieren. Für die Zwecke der Erfindung ist ein attenuiertes Leporipoxvirus definiert als ein Leporipoxvirus, welches in seinem leporiden Zielwirt zur produktiven Replikation fähig ist, ohne eine Krankheit zu verursachen. Eine Attenuierung von Leporipoxvirusstämmen kann durch eine serielle Passage des Stammes oder durch die Entfernung von einem oder mehreren virulenten Genen, die nicht für die virale Replikation essentiell sind, durchgeführt werden. Die komplette DNA-Sequenz des Leporipoxvirus-Genoms, seine genomische Organisation und die Lokalisation aller offenen Leseraster (engl. Open Reading Frames, ORF's) ist in Cameron et al., Virology 264, S. 298–318 (1999) dargestellt. Die komplette DNA-Sequenz des Shope-Fibrom-Virus-Genoms, seine genomische Organisation und die Lokalisation aller offenen Leseraster (engl. Open Reading Frames, ORF's) ist in Willer et al., Virology 264, S. 319–343 (1999) dargestellt.
  • Die exogene DNA gemäss der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise in eine nichtessentielle Genregion des Leporipoxvirus-Genoms eingesetzt. Stärker bevorzugt ist die exogene DNA in eine nichtessentielle Genregion eingesetzt, die an der Virulenz des Leporipoxvirus beteiligt ist. Geeignete nichtessentielle Genregionen des Myxomvirus-Genoms oder des Shope-Fibrom-Virus-Genoms sind das TK-Gen, welches für Thymidin-Kinase kodiert, das M11L-ORF, die SERP-1, -2 und -3 ORF's und das MGF-ORF (Cameron et al., 1999, a.a.o.; Willer et al., 1999, a.a.o.). Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden eines oder mehrere der nichtessentiellen viralen Gene entfernt, gefolgt vom Einsetzen der exogenen DNA und des Promotors. Die Entfernung wenigstens eines Teils des MGF-ORF ist besonders bevorzugt, da dieses ORF für einen Virulenzfaktor kodiert und nicht für das Wachstum in vitro oder in vivo essentiell ist (Graham et al., Virology 191, S. 112–124, 1992). Die Entfernung des MGF-ORF führt zu einer verringerten Virulenz des Leporipoxvirus.
  • Das lebende rekombinante Leporipoxvirus gemäss der vorliegenden Erfindung kann durch Verwendung der in-vivo-Rekombinationstechnik hergestellt werden, die das Einsetzen von exogener DNA durch ortsspezifische Rekombination in das Leporipoxvirus-Genom umfasst. Dies kann durch ein Verfahren ähnlich den Verfahren, die für die Herstellung von rekombinanten Vacciniaviren und rekombinanten Geflügelpockenviren beschrieben wurden, erreicht werden (siehe USP 4,603,112; USP 5,093,258; Guo, P.X.; J. Virol. 63: 4189–4198 (1990); Mackett et al., "Construction And Characterization of Vaccinia Virus Recombinants Expressing Exogenous Genes", in "DNA Cloning Volume III" ed. D.M. Glover, 1985, IRL Press Ltd.). Im allgemeinen kann das lebende, rekombinante Leporipoxvirus gemäss der vorliegenden Erfindung durch die Verwendung von ortsspezifischer Rekombination zwischen einem parentalen Leporipoxgenom und einem DNA-Vektor, welcher die exogene DNA trägt, unter Kontrolle von wenigstens einem Expressions-Kontrollelement hergestellt werden. Geeignete DNA-Vektoren für die Verwendung in der ortsspezifischen Rekombination können aus jedem Plasmid abgeleitet werden, welches eine multiple Klonierungsstelle aufweist. Der DNA-Vektor umfasst die exogene DNA, die mit mindestens einem Expressions-Kontrollelement verbunden ist und zwischen viralen DNA-Sequenzen angeordnet ist, die zu einer Region des Leporipoxgenoms homolog sind, in welches die exogene DNA eingesetzt werden soll. Die viralen DNA-Sequenzen, welche die exogene DNA flankieren, sind vorzugsweise aus einer Region ausgewählt, die nichtessentiell für die Replikation des Leporipoxvirus ist. Der DNA-Vektor für die Rekombination mit dem Leporipoxgenom kann zusätzlich ein Gen umfassen, welches für einen Selektionsmarker unter der Kontrolle eines Pockenvirus-Promotors kodiert. Das zusätzliche Gen und der Promotor sind ebenfalls zwischen den viralen DNA-Sequenzen, welche aus dem Leporipoxgenom abgeleitet sind, angeordnet. Der DNA-Vektor wird in Wirtszellen transfiziert, welche mit einem parentalen Leporipoxvirus infiziert sind. Geeignete Wirtszellen sind eukaryote Zellen, welche für das Leporipoxvirus permissiv sind und welche durch den DNA-Vektor transfizierbar sind. Beispiel für Wirtszellen sind die Hasen-Nierenzellen LLC-RK1 und RK13, Hasen-Lungenzellen R9ab, Hasen-Hautzellen SF 1 Ep, DRS und RAB-9, Hasen-Korneazellen SIRC, Hasen-Karzinomzellen Oc4T/cc, Hasen-Haut-/Karzinomzellen CTPS, Verozellen, alle von ATCC erhältlich.
  • Parentale Leporipoxviren, welche geeignet sind, die lebenden, rekombinanten Leporipoxviren der vorliegenden Erfindung zu erzeugen, sind Myxomvirusstämme wie der Lausanne-Stamm (von ATCC), SG33 (Mainil, M.D. et al., 2000, J. Comp. Pathol. 122, S. 115–122), Borghi und Boerlage (Fenner & Fantini, „Biological Control of Vertebrate Pests", CABI Publishing 1999, ISBN 0 85199 323 0 und darin genannte Literaturstellen) und Shope-Fibrom-Virusstämme einschliesslich Original-A-Stamm (ATCC Katalog-Nr. VR-112) und der Kasza-Stamm (ATCC Katalog-Nr. VR-364). Vorzugsweise werden Myxomvirusstämme verwendet, um das lebende rekombinante Leporivirus gemäss der Erfindung herzustellen. Vorzugsweise ist das parentale Leporipoxvirus einen attenuiertes Virus, das heisst ein Leporipoxvirus, welches fähig ist, produktiv in seinem leporiden Zielgast zu replizieren, ohne eine Krankheit zu verursachen. Eine Attenuierung von Leporipoxvirusstämmen kann durch serielle Passage des Stamms oder durch Entfernung von einem oder mehreren virulenten Genen, die nicht für die virale Replikation essentiell sind, durchgeführt werden (für die komplette Genomsequenz und die Lokalisation der Gene siehe Cameron et al. 1999, a.a.o. und Willer et al., 1999, a.a.o.).
  • Dem Virus wird erlaubt, in der Wirtszelle zu replizieren, währenddessen eine Rekombination zwischen den Leporipox-DNA-Sequenzen auf dem DNA-Vektor und der entsprechenden DNA auf dem parentalen Leporipoxgenom stattfindet. Die Rekombination führt zur Insertion der exogenen DNA, die mit dem/den Expression-Kontrollelement(en) verbunden ist, in das Leporipoxgenom. Die rekombinanten Leporipoxviren werden selektiert und gereinigt unter Verwendung von üblichen Selektions- oder Screeningverfahren, wie sie im Fachgebiet wohlbekannt sind und welche eine Detektion der integrierten exogenen DNA durch Hybridisierung mit Sonden, die zur exogenen DNA homolog sind, Detektion der Expression des Selektionsmarkers, welcher mit der exogenen DNA gemeinsam integriert wurde, und Detektion der Abwesenheit des Expressionsprodukts des entfernten Leporipoxgens, in welches die exogene DNA eingesetzt wurde, einschliessen. Die Insertion der exogenen DNA in das Genom des rekombinanten Leporipoxvirus kann durch eine Analyse mittels Polymerase-Kettenreaktion bestätigt werden.
  • Der rekombinante Leporipoxvirus-Vektor gemäss der vorliegenden Erfindung ist besonders geeignet für die Verwendung als Immunisierungsmittel in Nichtleporiden, weil in vivo Expressionsniveaus des Antigens erzielt werden können, welche für eine Immunisierung des Wirts ausreichend sind. Durch sein eingeschränktes Wirtsspektrum wird das Virus in einem nichtleporiden Wirt attenuiert, und daher besteht kein Risiko, dass durch das Leporipoxvirus eine Krankheit verursacht wird. Die Einschränkung der Wirte wird zudem verhindern, dass sich Leporipoxviren gemäss der vorliegenden Erfindung zwischen Wirten ausbreiten, welche nicht für eine Impfung vorgesehen sind. In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung somit eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verfügung, stärker bevorzugt einen Impfstoff, welcher einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und ein lebendes rekombinantes Leporipoxvirus umfasst, welches exogene DNA umfasst, welche zusammenwirkend mit wenigstens einem Expressions-Kontrollelement verbunden ist und in eine nichtessentielle Region des Virusgenoms eingesetzt ist, wobei die genannte exogene DNA für mindestens ein Antigen eines Pathogens kodiert, welches eine Infektionskrankheit in Nichtleporiden hervorruft. Der erfindungsgemässe Impfstoff umfasst vorzugsweise einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und ein lebendes rekombinantes Myxomvirus gemäss der vorliegenden Erfindung, welches wenigstens ein immunogenes Protein eines nichtleporiden Pathogens exprimiert. Ein rekombinantes Leporipoxvirus gemäss der vorliegenden Erfindung, welches zwei oder mehr immunogene Proteine exprimiert, ist besonders geeignet für die Erstellung eines multivalenten Impfstoffes.
  • Impfstoffzusammensetzungen gemäss der vorliegenden Erfindung können hergestellt, indem Standardprozeduren gefolgt wird. Das rekombinante Leporipoxvirus kann auf einer Zellkultur gezüchtet werden, für welche das Virus permissiv ist, wie zum Beispiel Hasen-Nierenzellen LLC-RK1 und RK13, Hasen-Lungenzellen R9ab, Hasen-Hautzellen SF 1 Ep, DRS und RAB-9, Hasen-Korneazellen SIRC, Hasen-Karzinomzellen Oc4T/cc, Hasen-Haut-/Karzinomzellen CTPS, Verozellen, alle von ATCC erhältlich. Die so gezüchteten Viren können geerntet werden, indem die Gewebe-Zellkultur-Flüssigkeiten und/oder Zellen gesammelt werden. Optional kann während der Ernte die Aus beute an Viren durch Techniken verbessert werden, welche die Ablösung der infektiösen Teile vom Wachstumssubstrat verbessern, zum Beispiel Ultraschallbehandlung und Gefrier/Auftauvorgänge. Der Lebendimpfstoff kann in Form einer Suspension hergestellt werden oder kann lyophilisiert werden.
  • Pharmazeutisch annehmbare Träger, welche für die Verwendung in einem Impfstoff gemäss der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind steriles Wasser, Kochsalzlösung, wässrige Puffer wie PBS usw. Zusätzlich kann der erfindungsgemässe Impfstoff andere Additive wie zum Beispiel Adjuvantien, Stabilisatoren, Antoxidantien usw. enthalten.
  • Geeignete Stabilisatoren sind zum Beispiel Kohlenhydrate einschliesslich Sorbitol, Mannitol, Stärke, Sukrose, Dextran und Glukose, Proteine und deren Abbauprodukte, einschliesslich, aber nicht beschränkt auf Albumin und Kasein, proteinhaltige Stoffe wie bovines Serum oder entrahmte Milch, und Puffer, einschliesslich, aber nicht beschränkt auf Alkalimetall-Phosphate. In lyophilisierten Impfstoffzusammensetzungen ist es bevorzugt, einen oder mehrere Stabilisatoren zuzugeben.
  • Geeignete Adjuvantien umfassen, aber sind nicht beschränkt auf, Aluminiumhydroxid, -phosphat oder -oxid, Amphigen, Tocophenole, Monophosphenyllipid A, Muramyl-Dipeptid, Ölemulsionen, Glucane, Carbomere, Block-Copolymere, Zytokine und Saponine wie z.B. Quil A. Die Menge an zugegebenem Adjuvans hängt von der Art des Adjuvans selbst ab. Zytokine wie INFγ, IL-12, IL18 sind für die Verwendung in einem Impfstoff gemäss der vorliegenden Erfindung sehr geeignet.
  • Bevorzugt werden die rekombinanten Leporipoxviren gemäss der vorliegenden Erfindung den nichtleporiden Spezies über parenterale Verabreichungswege einschliesslich, aber nicht beschränkt auf intramuskuläre, intradermale oder subkutane Wege verabreicht. Alternativ kann der Impfstoff über nicht-parenterale Verabreichungswege wie zum Beispiel orale, Spray-, intraokulare, intranasale oder in-ovo Verabreichung gegeben werden.
  • Im allgemeinen wird das rekombinante Leporipoxvirus gemäss der vorliegenden Erfindung in einer Menge gegeben, die effektiv ist, um adäquate Expressionsniveaus des exogenen Proteins zu induzieren. Die Dosis wird allgemein vom Verabreichungsweg, der Zeit der Verabreichung wie auch vom Alter, der Gesundheit und Ernährung des zu impfenden Tieres abhängen. Das rekombinante Leporipoxvirus kann in einer Menge zwischen 102 und 1011 pfu/Dosis pro Subjekt, vorzugsweise zwischen 104 und 109 pfu/Dosis pro Subjekt, und stärker bevorzugt zwischen 106 und 107 pfu/Dosis pro Subjekt verabreicht werden (pfu bedeutet "Plaque Forming Units").
  • Die Impfstoffe gemäss der vorliegenden Erfindung können auch gleichzeitig oder zusammen mit anderen Lebend- oder inaktivierten Impfstoffen gegeben werden. Diese zusätzlichen Impfstoffe können nicht-parenteral oder parenteral verabreicht werden. Bevorzugt sind die zusätzlichen Impfstoffe für parenterale Verabreichung empfohlen.
  • Die folgenden Experimente sind für die Erfindung illustrativ und beschränken die Erfindung nicht auf die beschriebenen besonderen Ausführungsformen.
  • Beschreibung der Zeichnungen
  • 1: Schematische Darstellung der Konstruktion der intermediären Plasmide pVL und PVEL. RHD bezeichnet cDNA des Hasen-haemorrhagischen Virus. ab(5') und cd(3') bezeichnen die MGF-flankierenden Regionen des Myxomvirus. Promotor bezeichnet synthetischen Late- bzw. Early/Late-Promotor. "mcs" bezeichnet eine Nukleotidsequenz, die multiple Klonierungsstellen für die Einfügung exogener DNA umfasst.
  • 2: Die verschiedenen rekombinanten DNA-Plasmide, die auf pVL und PVEL basieren und konstruiert wurden. P bezeichnet die synthetische Late-(pVL) oder Early-/Late(pVEL)-Promotorregion; ab(5') und cd(3') bezeichnen die MGF-flankierenden Regionen des Myxomvirus. RHDV Vp60 bezeichnet das Gen, das für das RHDV VP60-Protein kodiert. FeLV gp85 bezeichnet das env-Gen des felinen Leukämievirus. FCV Vp60 bezeichnet das Gen, das für das Kapsidprotein des felinen Calicivirus kodiert. FPL Vp2 bezeichnet das vp2-Gen des felinen Panleukopenievirus. CPV VP2 bezeichnet das vp2-Gen des kaninen Parvovirus. GFP bezeichnet das Gen, das für grün fluoreszierendes Protein kodiert. Alle Plasmide enthalten Ampr als Selektionsmarker (nicht dargestellt).
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1: Herstellung von intermediären DNA-Plasmiden pVL und PVEL
  • Das Anfangsplasmid für das Verfahren war das kommerziell erhältliche Plasmid pCITE 2-b (Novagen inc.), welches eine cDNA des Virus für Hasenhaemorrhagische Erkrankung (engl. rabbit haemorrhagic disease virus) enthielt (Meyers G., et al. 1991, Virology 184, p. 664–676), die in die SalI- und HincII-Stellen des Vektors eingesetzt war. Dieses Plasmid wird als pCITE/RHD bezeichnet.
  • Der erste Schritt bestand im Einführen der MGF-flankierenden Sequenzen. PCR Primer myx a and myx b wurden verwendet, um die 5'-flankierende Sequenz zu amplifizieren.
    myx a: 5' TTCTCGGAAGTCATAGACGGTATT 3' (Seq. ID Nr. 1)
    myx b: 5' CATGCCAATGGCACATAAGAGAGTTGCGACTAGGTC 3' (Seq. ID Nr. 2)
  • Eine 2 μl Probe von auf einer Gewebekultur gewachsenem MR24 (106 pfu ml–1) wurde als Template für die PCR-Reaktion verwendet, welche unter Verwendung von PCR-Beads (Pharmacia) entsprechend den Anweisungen des Her stellers ausgeführt wurde. Das PCR-Fragment wurde unter Verwendung von Standard-Labormethoden als ein NcoI/blunt-Fragment in pCITE/RHD kloniert. Das pCITE/RHD wurde zunächst einer Verdauung mit KpnI unterworfen, gefolgt von "blunting" (Erzeugen glatter Enden) mit T4 DNA-Polymerase und anschliessender Verdauung mit NcoI. Das entstandene Plasmid wurde als pCITE/RHDab bezeichnet.
  • Eine zweite PCR-Reaktion mit einer identischen Template-Herstellung wurde mit den Primern
    myx c: 5' CGGCTCGAGCTAATTACCATTAAGTAACCCGTTTTACA 3' (Seq. ID Nr.3) XhoI
    myx d: 5' GCTCTAGATATATCGTGTACGTAGTTCCCAAAAC 3' (Seq. ID Nr. 4) XbaI
    durchgeführt, um die 3'-flankierende Sequenz herzustellen. Das PCR-Fragment wurde als ein XhoI/XbaI Fragment in XhoI/XbaI-geschnittenes pCITE/RHDab kloniert. Das resultierende Plasmid wurde als pCITE/RHDabcd bezeichnet.
  • Synthetische Pockenvirus-Promotoren wurden dann durch Hybridisierung der folgenden Oligonukleotide hergestellt:
    Vp3: 5' CTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGATCTTAAATGCC 3' (Seq. ID Nr. 5)
    Vp4: 5' CATGGGCATTTAAGATCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGTA 3' (Seq. ID Nr. 6)
  • Diese beiden komplementären Oligonukleotide anelieren gegenseitig unter Entstehung von kohäsiven Enden, die mit KpnI- and NcoI-Restriktionsstellen kompatibel sind. Ebenfalls anelieren die folgenden zwei Oligonukleotide gegenseitig unter Entstehung eines KpnI/NcoI-kompatiblen Fragments.
    Vp5: 5' CAAAAATTGAAATTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAAATAC 3' (Seq. ID Nr. 7)
    Vp6: 5' CATGGTATTTATATTCCAAAAAAAAAAAATAAAATTTCAATTTTTGGTAC 3' (Seq. ID Nr. 8)
  • Vp5 and Vp6 bilden zusammen einen Early/Late-Promotor, während Vp3 und Vp4 einen Late-Promotor darstellen (Chakrabarti et al. Biotechniques 23, S. 1094–1097, 1997). Das eine oder das andere der anelierten Oligonukleotidpaare wurde dann in KpnI/NcoI-geschnittenes pCITE/RHDabcd kloniert, wodurch pVP/RHD (Late-Promotor) oder pEL/RHD (Early/Late-Promotor) entstand. Weil das RHD-Kapsidgen nicht auf demselben Rahmen liegt wie das erste Methionin in den beiden Konstrukten (pVP/RHD und pEL/RHD), war es notwendig, das RHD-Kapsidgen (Vp60) erneut zu klonieren und die dazwischenliegende Sequenz zu entfernen, um Expression zu erhalten. Die Plasmide pVP/RHD and pEL/RHD wurden mit NcoI und EcoRI geschnitten, um die Vp60-kodierende Sequenz und die nichtkodierende Sequenz, die 5' zum initiierenden ATG gelegen ist, zu entfernen. Das Vp60-Gen wurde dann durch ein PCR-generiertes Fragment ersetzt, das mit den folgenden Oligonuklotiden produziert wurde:
    5' GCTCCATGGAGGGCAAAGCCCGTG 3' (Seq. ID Nr. 9) NcoI
    5' TTGCTCAGGACACCGGCACCTGC 3' (Seq. ID Nr. 10)
  • Das Template für die PCR-Reaktion war pCITE/RHD. Das PCR-generierte Fragment wurde mit NcoI and EcoRI verdaut und in das hergestellte pVP/RHD and pEL/RHD kloniert. Die resultierenden Plasmide wurden als pVP/Vp60 und pEL/Vp60 bezeichnet. Um die Einfügung von Genen, die von anderen Restriktionsstellen flankiert sind, zu erlauben, wurde eine multiple Klonierungsstelle unterhalb der eindeutigen NcoI-Stelle in pVP/Vp60 und pEL/Vp60 eingefügt. Die folgenden Oligonukleotide:
    mcs A: 5' CATGGATCGATGTCGACGGATCCACTAGTGAATTCACGCGTC 3' (Seq. ID Nr. 11)
    mcs B: 5' TCGAGACGCGTGAATTCACTAGTGGATCCGTCGACATCGATC 3' (Seq. ID Nr, 12)
    anelieren unter Erzeugung überhängender Enden, die mit NcoI und XhoI Restriktions-Endonuklease-Stellen kompatibel sind. Ersatz des NcoI/XhoI Fragments, welches die gesamte RHD-assoziierte Sequenz trägt, durch die anelierten Oligonukleotide führt zu den folgenden Plasmiden: pVL und pVEL (siehe 1).
  • Die Plasmide pVL und pVEL wurden verwendet, um verschiedene rekombinante DNA-Plasmide zu konstruieren, welche die folgenden Gene enthalten: Hasenhaemorrhagische Krankheit (engl. Rabbit Haemorrhagic Disease)-Kapsidprotein VP60 (Meyers et al. 1991, a.a.o.), grün fluoreszierendes Protein (Clonetech Laboratories Inc, Palo Alto, California, USA), felines Leukämie-Hüllglykoprotein gp85 (Stewart et al., 1986, J. Virol. 58, S. 825–834), feline Leukämie-Matrix-(gag-)Proteine (Donahue et al., 1988, J. Virol. 62, S. 722–731), felines Calicivirus-Kapsidprotein (GenBank Accession Nrn. Z11536 und NC 001481), felines Panleukopenievirus-Kapsidprotein VP2 (Carlson J. et al. 1985, J. Virol. 55, S. 574–582), kanines Parvovirus-Kapsidprotein VP2 (Reed P. et al, 1988, J. Virol. 62, S. 266–276). Tabelle 1 führt die verschiedenen DNA-Plasmide auf, die konstruiert wurden, um die rekombinanten Myxomviren gemäss der vorliegenden Erfindung zu erzeugen. Jedes rekombinante Plasmid wurde auf dieselbe Weise konstruiert, indem das Zielgen entweder aus einem existierenden Plasmid ausgeschnitten wurde oder so mit PCR amplifiziert wurde, dass die Restriktionsen zymstellen an den Enden des Gens mit den Stellen in der mcs von pVL oder pVEL kompatibel waren.
  • Herstellung des DNA-Plasmids pVLGFP
  • Ein das GFP-Gen enthaltendes Plasmid wurde von Clonetech Laboratories, Inc, Palo Alto, California, USA erworben und mit NcoI und EcoRI verdaut, um das GFP-Gen aus dem Plasmid auszuschneiden. Das Gen wurde in pVL eingesetzt, wodurch PVLGFP entstand.
  • Herstellung des DNA-Plasmids pVELFeLVenv
  • Das Hüllgen wurde mit PCR aus pFGA5 (Stewart et al. 1986, a.a.o.) amplifiziert, unter der Verwendung der folgenden Oligonukleotide:
    5' CAC ATC GAT TGA TGG AAA GTC CAA CGC 3' (Seq. ID Nr. 13) ClaI
    5' TGG AAT TCA TGG TCG GTC CGG ATC GTA 3' (Seq. ID Nr. 14) EcoRI
  • Das PCR-Fragment wurde mit ClaI und EcoRI verdaut und in PVEL eingesetzt, wodurch PVELFeLVenv entstand.
  • Herstellung des DNA-Plasmids pVELFPL
  • Das FPL-Kapsidgen wurde durch PCR-Amplifikation aus DNA in replikativer
  • Form (rf) durch PCR mit den folgenden Primern erhalten:
    5' CACATCGATTGATGAGTGATGGAGCAG 3' (Seq. ID Nr. 15)
    5' CGGGAATTCTAGGTGCTAGTTGATATG 3' (Seq. ID Nr. 16)
  • Die rf-DNA wurde aus felinen Nierenzellen (CRFK) hergestellt, die mit einem Impfstamm des FPL mit Standardverfahren infiziert worden waren (Reed, P. et al. 1988, J. Virol. 62, S. 266–276)
  • Herstellung von DNA-Plasmid pVELFCV
  • Feline Nierenzellen (CRFK) wurden mit FCV-Stamm F9 mit einer Multiplizität von 0,1 pfu pro Zelle infiziert. Nach sechsunddreissig Stunden wurden die Zellen geerntet, und die totale RNA wurde unter Verwendung von Guanidinisothiocyanat (TRIzol Reagens GibCoBRL) präpariert. Erststrang-cDNA-Synthese wurde unter Verwendung von oligodt Primern (Superscript Choice GibCo BRL) ausgeführt. Die vollständige Nukleotidsequenz und genomische Organisation des F9-Stammes des FCV ist bekannt (GenBank Zugangsnr. M86379). Oligonukleotide wurden synthetisiert, um die Zweitstrang-DNA-Synthese zu primen und anschliessend das Kapsidgen mit PCR zu amplifizieren. Die folgenden Oligonukleotide wurden verwendet, um das Vp60-Kapsidprotein-Gen von FCV (F9-Stamm) zu erzeugen.
    5' GGATCGATGCGCGGATGACGGGTCAATC 3' (Seq. ID Nr. 17) ClaI
    5' GGGGACTAGTATTCATAACTTAGTCATGGG 3' (Seq. ID Nr. 18) SpeI
  • Das Vp60-Kapsidgen wurde in das mcs von pVL und pVEL eingesetzt, wodurch pVLFCV bzw. pVELFCV entstanden.
  • Herstellung des DNA-Plasmids pVELCPV
  • Das Gen, welches für das Kapsidprotein VP2 kodiert, wurde aus einem CPV-Impfstamm von Nobivac Parvo® PCR-amplifiziert, mit NcoI und EcoRI verdaut und in pVEL eingesetzt.
  • Beispiel 2: Herstellung von rekombinantem Myxomvirus
  • Ein nicht pathogener Stamm des Myxomvirus (als MR24 bezeichnet), welcher durch längere Passage in Hasen-Nierenzellen (RK13) attenuiert worden war, wurde ausgewählt. Es konnte gezeigt werden, dass dieses attenuierte Myxomvirus (MR24) nicht pathogen (0% Mortalität) in Hasen war, wenn es den Hasen auf subkutanem, intradermalem oder intramuskulärem Weg verabreicht wurde. MR24 ist ein Kandidat für einen Myxomatose-Impfstamm für die Verwendung in Hasen. Alle viralen Titrationen und Amplifikationen wurden in Hasen-Nierenzellen (RK-13) ausgeführt.
  • Rekombinante Myxomviren wurden hergestellt, indem den Verfahren gefolgt wurde, die für die Konstruktion von rekombinanten Vacciniaviren beschrieben wurden (Mackett et al. 1985, a.a.o.). Zu diesem Zweck wurden Hasen-Nierenzellen (RK13) mit Myxomvirus MR24 mit einer Multiplizität von 0,1 pfu pro Zelle infiziert. Nach zwei Stunden wurden dann die Zellen mit Plasmid-DNA transfiziert, wobei das Lipofektamin-Transfektionsreagens (GibCo BRL) verwendet wurde. Die Selektion von rekombinanten Viren basierte auf Grenzverdünnung und Identifikation durch Immunofluoreszenz.
  • Zweiundsiebzig Stunden nach der Transfektion wurden die infizierten/transfizierten Zellkulturen dreimal einem Gefrier-Auftauvorgang unterzogen, um das Virus freizusetzen. Diese primäre Mischung von Wildtyp- und rekombinantem Virus wurde 50-fach mit Zellkulturmedium verdünnt, und anschliessend wurden 10 Mikroliter der Virusmischung verwendet, um jede Vertiefung einer Zellkulturplatte mit 96 Vertiefungen, die zuvor mit RK13-Zellen belegt worden war, zu infizieren. Die Platte mit 96 Vertiefungen wurde dann für 72 Stunden inkubiert, damit Infektion und Propagation des Virus stattfinden konnte. Nach dieser Zeit wurde die Platte drei Gefrier/Auftauzyklen unterworfen, während der individuelle Status jeder Vertiefung der Platte beibehalten wurde. Diese Platte wurde zur Masterplatte der ersten Runde. Anschliessend wurden fünf Mikroliter des virushaltigen Mediums aus jeder Vertiefung auf eine zweite Platte mit 96 Vertiefungen, die mit RK13-Zellen belegt war, übertragen. Nach 48 Stunden wurde die zweite Platte mit eiskaltem Methanol fixiert, und die Platte wurde mittels Immunofluoreszenz auf Expression des rekombinanten Proteins untersucht.
  • Beispielsweise wurden die infizierten und mit pVELFeLVenv transfizierten Zellen auf die Produktion des FeLV-Hüllproteins wie folgt untersucht; Maus-Ascitesflüssigkeit mit monoklonalen Antikörpern 3–17 (European Veterinary Laboratory, Woerden, Niederlande) wurde 1000-fach verdünnt und anschliessend jeder Vertiefung der festen Platte mit 96 Vertiefungen zugegeben. Die Platte wurde bei 37 °C für eine Stunde inkubiert. Die Platte wurde anschliessend 5 mal mit PBS gewaschen und anschliessend mit FITC-markiertem Hasen-Antimaus-IgG (Sigma Chemical Co) inkubiert, wonach die Inkubation eine weitere Stunde weitergeführt wurde. Schliesslich wurde die Platte 5 mal mit PBS gewaschen und unter einem Fluoreszenzmikroskop untersucht. Vertiefungen, die fluoreszente Infektionsfoki enthielten, wurden identifiziert und notiert. Die entsprechenden Vertiefungen aus der Masterplatte der ersten Runde wurden dann über weitere mit RK-13 belegte Platten mit 96 Vertiefungen verdünnt, welche wiederum zu Masterplatten der zweiten Runde wurden. Das Verfahren allmählicher Anreicherung wurde weitergeführt, bis rekombinante Viren 20–50 Prozent des totalen Virusgehaltes darstellten. Die Expression des rekombinanten Proteins der anderen rekombinanten Myxomviren wurde auf eine ähnliche Weise untersucht.
  • Tabelle 1: DNA-Plasmide und die entsprechenden rekombinanten Myxomviren.
    Figure 00210001
  • Die Endreinigung der Rekombinanten wurde erreicht, indem individuelle Infektionsfoki aus Agar-belegten Kulturen ausgewählt wurden.
  • Beispiel 3: myxo/RHD in Hühnern
  • Um festzustellen, ob nichtleporide Spezies, die mit den rekombinanten Myxomviren infiziert wurden, eine Antikörperantwort zeigen würden, wurden Hühner mit myxo/RHD auf subkutanem oder intramuskulärem Weg infiziert. Die Vögel erhielten 105 pfu des Virus am Tag 0 und Tag 14 des Impfplans. Es wurden Blutproben an den Tagen 0, 14 und 28 genommen und auf Antikörper gegen RHDV untersucht, wobei die Ergebnisse in Tabelle 2 dargestellt sind. Alle Vögel blieben während des gesamten Experiments klinisch normal.
  • Tabelle 2: Ergebnisse einer Inokulation von Hühnern mit myxolRHD. Antikörperniveaus werden als Kehrwert derjenigen Verdünnung der Seren ausgedrückt, welche die Agglutination von roten Blutzellen von Hasen durch vier Einheiten des gereinigten RHDV-Antigens inhibieren.
    Figure 00220001
  • Beispiel 4: Myxo FCV in Katzen
  • Es wurde ein Experiment ausgeführt, um die Wirksamkeit eines Myxom/felines Calicivirus-Kapsid-rekombinanten Virus (myxo/FCV) bei der Erzeugung einer neutralisierenden Antikörperreaktion zu untersuchen und Katzen vor einem Challenge mit virulentem felinem Calicivirus zu schützen. Eine Gruppe von vier Katzen (Gruppe 1) wurde subkutan mit 5 × 106 fokusbildenden Einheiten (engl. focus forming units, ffu) des myxo/FCV immunisiert. Die Immunisierung wurde drei Wochen nach der ersten Immunisierung wiederholt. Vier ungeimpfte Kontrolltiere (Gruppe 2) wurden zusammen mit den Versuchstieren gehalten.
  • Vier Wochen nach der zweiten Immunisierung wurden alle Katzen intranasal einem Challenge mit 105.3 TCID50 eines virulenten Stamms des felinen Calicivirus ausgesetzt. Das Challenge-Virus wurde tropfenweise eingebracht, 0,5 ml in jedes Nasenloch.
  • Tabelle 3: Verfahrensablauf
    Figure 00230001
  • Tupferuntersuchungen wurden am Anfang des Experiments ausgeführt, um sicherzustellen, dass keines der Tiere felinen Calicivirus im Oropharynx vorliegen hatte. In ähnlicher Weise wurden Blutproben genommen, um sicherzustellen dass keines der Tiere Anti-FCV-Antikörper vor dem Beginn der Studie aufwies. Tupferuntersuchungen wurden nach dem Challenge ausgeführt, um die Exkretion des Virus zu untersuchen.
  • Während des Experiments genommene Blutproben wurden in Virus-Neutralisationsassays verwendet. Diese Assays bestimmen die Niveaus der zirkulierenden Antikörper in der Katze. Es ist wohlbekannt, dass die neutralisierenden Serumantikörper in rekonvaleszenten Tieren vorhanden sind, und dass zuvor existente neutralisierende Antikörper, die als Ergebnis einer Impfung bereitgestellt wurden, beim Schutz vor der Krankheit helfen (Hohdatsu, et. al. 1999 J. Vet. Med. Sci. 61, 299301).
  • Tabelle 4: Ergebnisse einer Inokulation (Serum-Neutralisationstiter) von Katzen mit myxolFCV (MS0013). Die Zahlen geben die maximale Serumsverdünnung an, bei der Virusneutralisation erhalten wird. Die Blutproben vor der Impfung ("Prebleed") zeigen keine Antikörper gegen FCV. Ein- bis vierfach verdünntes Serum wird eine unspezifische Inhibition des Viruswachstum in vitro zeigen.
    Figure 00250001
    • *Das verwendete klinische Scoringschema ist dasjenige, das im Europäischen Arzneibuch für die Herstellung eines felinen Calicivirus-Impfstoffs angegeben ist (3. Auflage Juni 1996 ISBN 92-871-2991-6). Dieses besagt, dass der Impfstoff den Test bestanden hat, wenn der klinische Score signifikant niedriger ist als derjenige der Kontrollsubjekte. In der vorliegenden Studie weist die geimpfte Gruppe einen mittleren klinischen Score von 4,5 gegenüber 34 für die Kontrollsubjekte auf.
  • Wenn man die Ergebnisse, die nach einer Impfung mit myxo-FCV (Tabelle 4) erzielt wurden, mit denjenigen von konventionellen Impfstoffen (Tabelle 5) vergleicht, wird klar, dass nach der ersten Impfung die Tiere der Gruppe 1 eine Antikörperantwort zeigen, die vergleichbar mit derjenigen von Tieren ist, denen zwei Dosen eines üblichen kommerziellen Impfstoffs verabreicht wurden. Nach der zweiten Impfung liegen die Antikörpertiter weit über denjenigen, die mit kommerziellen Impfstoff-Präparaten erhalten werden (Hohdatsu, et al. 1999 J. Vet. Med. Sci. 61, 299–301, DeSilver et al. 1997, Proc. 1 st Int. Symp. Calicivirus ESVV 131–143).
  • Tabelle 5. Neutralisierende Antikörpertiter kommerziell erhältlicher FCV-Impfstoff-Immunseren gegen FCV-Stämme
    Figure 00260001
    • a) Serum-Nummer
    • b) Neutralisationstiter
    • * aus Hohdatsu, et al. (1998)
  • Feline Herpesvirusvektoren, die FCV-Antigene exprimieren, induzieren ebenfalls sehr niedrige Titer für neutralisierende Serumantikörper (in der Gegend zwischen 2.5 und 3.0) vor dem Challenge, wie von Yokoyama et al. (1998) beschrieben wurde.
  • Literatur
    • Hohdatsu T, Sato K, Tajima T & Koyama H. Neutralizing feature of a commercially available feline calicivirus (FCV) vaccine immune sera against FCV field isolates. J Vet Med Sci 1999; 61:299–301.
    • Yokoyama N, Fujita K, Damiani et al. Further development of a recombinant feline herepesvirus type 1 vector expressing feline calicivirus immunogenic antigen. J of Vet Med Sci 1998; 60:717–723.
    • Reed U & Meunch H. A simple method of estimating fifty per cent end points. Am J of Hygiene 1938; 27:493–497.
  • Beispiel 5: Neutralisationsexperimente mit Myxo/FCV in Schweinen und Rindern.
  • Die Anwendbarkeit des Myxomvirus als einen eukaryoten Expressionsvektor für die Induktion einer protektiven Immunantwort in nicht-natürlichen Wirten, das heisst Rindern und Schweinen, wurde über den intradermalen und intramuskulären Injektionsweg überprüft.
  • Ein Myxomvirus-Vektor, welcher das feline Calicivirus-Genfragment enthielt, welches für die mature Form des Kapsid-Antigens kodiert, wurde sowohl in Kälbern als auch Schweinen verwendet. Zwei Gruppen, welche vier Kälber, die 12 Wochen alt waren, und vier Schweine, die 6 Wochen alt waren, umfassten, wurden in diese Studie aufgenommen.
  • Blutproben (10 ml/Tier) wurden eine Woche vor dem Beginn der Studie genommen, um zu überprüfen, ob die Tiere seronegativ auf felinen Calicivirus waren. Anschliessend wurde allen Tieren sowohl intradermal als auch intramuskulär jeweils 1 ml PBS mit 1 × 108 FFU des rekombinanten Myxomvirus/Injektionsweg/Tier injiziert. Die Tiere wurden als eine Gruppe pro Spezies gehalten. Nach vier Wochen wurden Blutproben (10 ml/Tier) genommen, und den Tieren wurde erneut intradermal und intramuskulär dieselbe Dosis des Myxomvirus injiziert, d.h. 1 ml mit 1 × 108 FFU des rekombinanten Myxomvirus/Injektionsweg/Tier. Zwei Wochen nach der letzten Injektion wurden Blutproben (10 ml/Tier) genommen, und die Tiere wurden gemäss den Richtlinien für GMO-Tests in vivo vernichtet. Die abgenommenen Proben wurden mittels eines Virus-Neutralisationsassays in vitro auf die Anwesenheit von Antikörpern getestet, welche gegen das Calicivirus gerichtet sind.
  • Tabelle 6. Experimentelles Design und Zeitrahmen: Gruppen bestehen entweder aus vier Schweinen oder vier Kälbern.
    Figure 00280001
  • Verfahren für das FCV-Serum-Neutralisationsassay
  • Serumneutralisation wurde mit CPE auf CrFK-Zellen beurteilt. Fünffache Replikate von zweihundert TCID50 des Virus wurden mit seriellen Verdünnungen (wobei bei 1:4 angefangen wurde) von Seren in einem Endvolumen von 600 Mikroliter gemischt. Virus-/Serumsmischungen wurden dann für 60 Minuten bei 37 °C in sterilen 5 ml Verdünnungsröhrchen inkubiert. 100 Mikroliter der Testmischungen wurden dann zu Gewebekulturgefässen mit 96 Vertiefungen, welche mit CrFK-Zellen in 100 Mikroliter Wachstumsmedium belegt waren, hinzugegeben. Inkubation wurde für fünf Tage fortgesetzt. Die TCID50-Werte wurden nach der Methode von Reed & Meunch [1] berechnet.
  • Reed, L.J., und H. Meunch. 1938. A simple method of estimating fifty percent end points. Am. J. Hyg., 27:493–497
  • Tabelle 7. Ergebnisse von Sns gegen FCV in Seren aus Studie FMD004
    Figure 00290001
  • Beispiel 6: Wachstum von Myxomvirusstämmen in verschiedenen Zelltypen in vitro.
  • Zellen wurden mit rekombinanten Myxomviren, welche grün fluoreszierendes Protein exprimieren, und die aus 2 verschiedenen Stämmen des Myxomvirus konstruiert wurden, infiziert. Das Wachstum wurde durch die Zunahme der Anzahl fluoreszierender Zellen mit der Zeit überwacht.
  • Fluoreszenz wurde beobachtet, wenn das myxo/GFP rekombinante Virus auf verschiedene Zelltypen in Kultur aufgegeben wurde, wie in Tabelle 8 dargestellt. Dies zeigte, dass das Virus in der Lage war, in Nicht-Hasen-Zellen zu gelangen und dort das GFP-Gen zu exprimieren. Tabelle 8 zeigt, dass in einigen Zelltypen Wachstum des Virus in vitro beobachtet wurde, und dass das Muster für die beiden untersuchten Konstrukte unterschiedlich war.
  • Tabelle 8: Wachstum von Myxomvektoren in verschiedenen Zelltypen in vitro.
    Figure 00300001
  • Beispiel 8: ELISA auf Antworten auf kanine Parvovirus-Impfung
  • Um die Immunantwort, die durch die Impfung von Hunden mit einem rekombinanten Myxomvirus ausgelöst wird, welches kanines Parvovirus-Kapsidprotein Vp2 exprimiert, zu untersuchen, wurde ein ELISA aufgesetzt. Die Antworten auf die Impfung wurden mit denjenigen verglichen, die in konventionell geimpften Hunden gefunden wurden.
  • Materialien & Methoden:
    • Materialen:
    • TBS (50 mM Tris-gepufferte Kochsalzlösung):
    • 50 mM Tris-gepufferte Kochsalzlösung, pH 7.5
    • 6.35 g Tris-HCl
    • 1.18 g Tris-Base
    • 8.77 g NaCl
    • 800 ml dH2O
    • pH auf 7.5 eingestellt und Volumen mit dH2O auf 1 L gebracht.
    • TBS-Tween
    • TBS wurde wie oben hergestellt, anschliessend 0.5 mL TWEEN 20 zugeben. Gut vermischen.
  • Methoden
    • 1. Anti-CPV monoklonale Antikörper wurden in 0.1 M Na2CO3-Puffer pH9.6 bei einer Konzentration von 5–10 Mikrogramm/ml resuspendiert. Eine ELISA-Platte wurde über Nacht bei 40 °C mit 100 Mikroliter der Antikörpersuspension inkubiert.
    • 2. Nachdem überschüssige Antigen-Beschichtungslösung abgeschüttelt wurde, wurden die verbliebenen Bindungsstellen in jeder Vertiefung durch Inkubation mit 100 Mikroliter 1 % BSA und 2% Trockenmilchpulver in TBS bei Raumtemperatur für eine Stunde blockiert.
    • 3. Nachdem die Blockierungslösung abgeschüttelt wurde, wurde sie durch 100 Mikroliter Gewebekultur-Überstand, welcher Parvovirus bei einem Titer von ca. 107 p.f.u. ml–1 enthielt, ersetzt. Inkubation wurde bei Raumtemperatur für 1–2 Stunden durchgeführt.
    • 4. Die Platten wurden viermal mit TBS-Tween gewaschen.
    • 5. Serielle Verdünnungen des zu testenden Serums wurden in TBS hergestellt. 100 Mikroliter hiervon wurden in die Vertiefungen der ELISA-Platte zugegeben, und Inkubation wurde für 1–2 Stunden bei Raumtemperatur fortgesetzt.
    • 6. Anschliessend wurde die Platte viermal mit TBS-Tween gewaschen.
    • 7. Ein Anti-Hund-, alkalische-Phosphatase-konjugierter zweiter Antikörper (z.B. ICN Biomedical Research Products Kat. Nr. 675071) wurde in einer Verdünnung wie vom Hersteller angegeben zugegeben. Inkubation wurde bei Raumtemperatur für 1–2 Stunden durchgeführt.
    • 8. Die Platte wurde viermal mit TBS-Tween gewaschen.
    • 9. Das ELISA wurde durch Zusatz von Substrat PNPP (p-Nitrophenylphosphat, z.B. SIGMA Chemical Company Kat. Nummer N2770) entwickelt.
    • 10. Die Absorbanz wurde in einem Spektrophotometer bei 420 nm abgelesen. Ergebnisse sind in Tabelle 9 angegeben.
  • Tabelle 9: Ergebnisse des ELISA auf Antworten auf CPV
    Figure 00320001
  • Die ELISA-Ergebnisse zeigen klar, dass eine Verdünnung von 1:40 bei Seren konventionell geimpfter Hunde zum Hintergrundniveau der Absorbanz führt, d.h, zu demjenigen Niveau, das bei Seren ungeimpfter Hunde beobachtet wird. Dagegen wird bei Myxom-CPV(Vp2)-geimpften Hunden eine Verdünnung von 1:1280 benötigt, um dasselbe Hintergrundniveau zu erreichen.

Claims (11)

  1. Verwendung eines lebenden, rekombinanten Leporipoxvirus, der exogene DNA enthält, welche zusammenwirkend mit mindestens einem Expressions-Kontrollelement verbunden ist, und welche in eine nichtessentielle Region des Virusgenoms eingesetzt ist, zur Herstellung eines Vektorimpfstoffs für die Behandlung und/oder Prophylaxe von Infektionskrankheiten in nichtleporiden Spezies.
  2. Verwendung eines Virus gemäss Anspruch 1 zur Herstellung eines Vektorimpfstoffs zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Infektionskrankheiten in Felinen oder Kaninen.
  3. Impfstoff, welcher einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und ein lebendes rekombinantes Leporipoxvirus umfasst, welches exogene DNA umfasst, welche zusammenwirkend mit mindestens einem Expressions-Kontrollelement verbunden ist und welche in eine nichtessentielle Region des Virusgenoms eingesetzt ist, wobei die genannte exogene DNA für mindestens ein Antigen eines Pathogens, das eine Infektionskrankheit in Nichtleporiden hervorruft, kodiert.
  4. Lebendes, rekombinantes Leporipoxvirus, welches exogene DNA umfasst, welche zusammenwirkend mit mindestens einem Expressions-Kontrollelement verbunden ist und welche in eine nichtessentielle Region des Virusgenoms integriert ist, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte exogene DNA für mindestens ein Antigen eines nichtleporiden Pathogens kodiert.
  5. Virus gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Leporipoxvirus ein Myxomvirus ist.
  6. Virus gemäss Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die exogene DNA für mindestens ein Antigen eines felinen oder kaninen Pathogens kodiert.
  7. Virus gemäss Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die exogene DNA für mindestens ein Antigen eines felinen oder kaninen Virus kodiert.
  8. Virus gemäss einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die exogene DNA für das Hüllprotein des felinen Leukämievirus (FeLV), das Kapsidprotein des felinen Calicivirus (FCV), das VP2-Protein des felinen Panleukopenievirus (FPL) und/oder das VP2-Protein des kaninen Parvovirus (CPV) kodiert.
  9. Virus gemäss einem der Ansprüche 4 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die exogene DNA und das Expressions-Kontrollelement in das MGF-ORF des Virusgenoms eingesetzt ist.
  10. Virus gemäss einem der Ansprüche 4 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Expressions-Kontrollelement, welches zusammenwirkend mit der exogenen DNA verbunden ist, ein synthetischer Pockenvirus-Promotor ist.
  11. Virus gemäss Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Promotor ein Early/Late-Promotor ist.
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