BR112019003181B1 - Composição para aumentar uma resposta imune em animal, método para induzir uma resposta imune protetora em um sujeito, e, uso da composição na preparação de um medicamento - Google Patents
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Abstract
A presente invenção se refere a uma composição para aumentar uma resposta imune em animal que diminui o risco de infecção por chicungunha e varíola, infecção por vírus da Zica e varíola, e/ou infecção por chicungunha, vírus da Zica e varíola. A composição compreende um carreador farmaceuticamente aceitável e um poxvírus atenuado, em que o genoma do poxvírus compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica a poliproteína subgenômica 26S do vírus da chicungunha e/ou o PrME do vírus da Zica.
Description
[001] A presente invenção se refere a uma vacina a base de vetor do pox vírus atenuado para proteção contra chicungunha e varíola, vírus da zica e varíola e/ou chicungunha, vírus da zica e varíola.
[002] Detalhes bibliográficos de referências no relatório descritivo em questão são listados no final do relatório descritivo.
[003] A referência neste relatório descritivo a qualquer publicação anterior (ou informação derivada dela, ou a qualquer matéria que é conhecida, não é, e não deve ser tomada como um reconhecimento ou admissão ou qualquer forma de sugestão desta publicação anterior (ou informação derivada dela) ou matéria conhecida forma parte do conhecimento geral comum no campo de diligência ao qual este relatório descritivo se refere.
[004] Todas as publicações mencionadas neste relatório descritivo estão aqui incorporadas pela referência na sua íntegra.
[005] A família do pox vírus compreende duas subfamílias, a Chordopoxvirinae e a Entomopoxvirinae. A Chordopoxvirinae compreende oito gêneros incluindo a Ortopoxviridae compreendendo espécies que infectam ser humano (por exemplo, vírus da varíola, o agente causador de varíola, vírus da varíola bovina (que formou a vacina contra varíola original reportada por Jenner em 1796), vírus vaccínia (usado como uma vacina contra varíola de segunda geração) e vírus da varíola dos macacos), e os vírus Avipoxviridae compreendendo espécies que infectam pássaros, tais como os vírus da varíola aviária e varíola dos canários. Além do seu uso como antígenos em vacinas contra varíola, existe muito interesse no uso dos vírus a base de vaccínia e vírus da varíola das aves recombinantes como vetores da “espinha dorsal”. Como vetores intracitoplásmicos, os Ortopoxviridae são capazes inter alia de dispensar antígenos estranhos ao citoplasma hospedeiro e caminhos de processamento de antígeno que processam antígenos em peptídeos para apresentação na superfície da célula. Tais vetores que expressam antígenos estranhos são usados no desenvolvimento de vacinas para doenças tais como AIDS, tuberculose, malária e câncer que demonstraram dificuldade de tratar por outras estratégias de vacinação.
[006] Chordopoxvirinae têm genomas de DNA de fita dupla lineares variando em tamanho de 130kb em parapoxvirus até acima de 300kb em vírus da varíola aviária e seu ciclo de vida no hospedeiro é gasto totalmente no citoplasma da célula hospedeira. Os vírus da varíola operam de forma substancialmente independente de sua célula hospedeira e moléculas de célula hospedeira, especialmente para processos envolvidos em síntese de RNAm precoce. Entretanto, moléculas hospedeiras parecem ser usadas para o início ou término de transcrição viral intermediária e tardia. Os vírus da varíola produzem “fatores da gama de hospedeiros” estruturalmente diversos que especificamente alvejam e manipulam caminhos de sinalização de hospedeiro para permitir condições celulares que permitem replicação viral. A maioria dos vírus da varíola pode se ligar e infectar células de mamífero, mas, se infecção subsequente é ou não permissiva (capaz de produzir viriões infecciosos) ou não permissiva (substancialmente incapaz de produzir viriões infecciosos) depende do poxvírus específico e tipo de célula específico envolvidos. Existe atualmente um entendimento relativamente fraco no nível molecular de interações pox vírus-hospedeiro, em particular, genes da gama de hospedeiros, e quais fatores são necessários para modular o relacionamento para facilitar a propagação tanto viral quanto celular. Para uma revisão de genes da gama de hospedeiros, referência pode ser feita a Werden et al. 2008 incorporada aqui na sua íntegra.
[007] Observações a respeito das cepas de vaccínia relevantes para seu uso como vacinas contra varíola, e subsequentemente como vetores virais, foram publicadas desde o início dos anos sessenta até o presente dia. Certas cepas de vaccínia, incluindo cepas empregadas como vacinas contra varíola, são capazes de propagar em células humanas e, portanto, representam riscos para a saúde, tal como o desenvolvimento de encefalite viral. Com uma vista no desenvolvimento de uma vacina mais segura, uma cepa de vaccínia da Ankara (referida como “CVA”) foi passada mais que 500 vezes em células não humanas. Durante este processo, o genoma de vaccínia mudou substancialmente envolvendo o desenvolvimento de pelo menos seis principais deleções, comparado com o genoma de CVA original. O vírus modificado foi menos patogênico no homem, mas ainda capaz de gerar uma resposta imune protetora. Este vírus vaccínia atenuado é referido como MVA (Vaccínia Ankara Modificado) e é também categorizado pelo número de passagens, já que os vírus com diferentes números de passagens foram considerados genética e fenotipicamente distintos. Entretanto, por número de passagem 515 MVA515 foi entendido ser geneticamente estável. No início dos anos noventa, observou-se que cepas de MVA, como MVA572, e seu derivado, MVA F6 foram capazes de expressar proteínas de vaccínia e proteínas heterólogas (recombinantes) a altos níveis em células não permissivas (nas quais o vírus não propagará), permitindo o desenvolvimento de MVA como um vetor para moléculas heterólogas de interesse, tais como aqueles que codificam antígenos para vacina ou dispensação de terapia.
[008] Mais recentemente, foram feitas tentativas de produzir um vírus vaccínia modificado com as qualidades de MVA introduzindo as seis grandes deleções conhecidas de MVA em CVA. Interessantemente, isso não resultou em um vírus com as qualidades atenuadas de MVA. Foi proposto que a ausência de genes da gama de hospedeiros pode ser responsável pela atenuação observada, entretanto, isso não foi substanciado (vide, por exemplo, Meyer et al., Journal of General Virology (1991) 72:1031-1038.
[009] Os poxvírus constituem uma grande família dos virus distinguida por um genoma de dsDNA grande, linear, um sítio citoplásmico de propagação e uma morfologia de virião complexa. O vírus vaccínia é o vírus representativo deste grupo de vírus e o mais estudado em termos de morfogênese viral. Viriões do vírus vaccínia aparecem como partículas ligadas a membrana em “formato de tijolo” ou “ovoide” com uma estrutura interna complexa parecendo com um núcleo bicôncavo cercado de paredes flanqueado por “corpos laterais”. O caminho de montagem do virião envolve uma fabricação de membrana contendo crescentes que desenvolvem em viriões imaturos (IVs), e então evoluíram para viriões maduros (MVs). Mais de 70 produtos genéticos específicos são contidos o virião do vírus vaccínia, onde os efeitos de mutações em mais de 50 genes específicos na montagem do vírus vaccínia são agora descritos.
[0010] Vírus vaccínia entra nas células por fusão de suas membranas superficiais com a membrana do plasma da célula hospedeira, liberando o núcleo (e corpos laterais) no citoplasma e ativando o programa transcricional do vírus. Os núcleos do virião contêm o complemento total de enzimas codificadas por vírus exigido para síntese e modificação de RNAm precoce. Genes precoces codificam enzimas exigidas para propagação de DNA, e assim como picos de expressão de gene precoce, propagação de DNA viral resulta em sítios citoplásmicos denominados “fábricas”. Genes precoces também codificam fatores de transcrição intermediários, e genes intermediários, por sua vez, codificam fatores de transcrição posteriores, de maneira que genes intermediários e posteriores são expressos em sucessão após a iniciação do pré-requisito de propagação de DNA viral. Assim, o complemento total de genes virais é transcrito em uma cascata temporal, com as classes precoces, intermediárias e posteriores sendo distinguidas por promotores transcricionais específicos da classe e fatores de transcrição viralmente codificados. Além do mais, apenas genomas propagados são moldes competentes para transcrição intermediária e posterior. Essas duas classes de genes codificam conjuntamente proteínas estruturais de virião, enzimas de virião, e fatores de montagem e são exigidos para montagem de novas partículas de vírus progênie.
[0011] Imediatamente após captação viral e expressão precoce, domínios citoplásmicos específicos de infecção formam dentro da célula que são uniformes em densidade e são algumas vezes circundados por cisternas derivadas de retículo endoplásmico (ER) que aumentam em tamanho com o tempo. Esses domínios representam sítios de propagação de DNA viral e são frequentemente chamados “fábricas virais”.
[0012] A montagem viral começa com a formação de estruturas modeladas crescentes rígidas (cúpulas em três dimensões) dentro das fábricas virais. Em micrografia eletrônica de alta resolução, a camada externa dessas estruturas em forma de meia-lua é composta de projeções regularmente espaçadas denominadas “espículas”. As meias-luas aparentemente aumentam de comprimento, mantendo ainda a mesma curvatura, até se tornarem círculos fechados (esferas em três dimensões) chamados viriões imaturos (IV). IV são cheios com material “viroplasma” que é de densidade uniforme, mas de forma visível eletronicamente mais denso do que a fábrica circundante. À medida que os IVs se formam, a captação de DNA envolto por capsídeo também ocorre: esses são vistos em micrografia eletrônica como elétron denso, subdomínio redondo ou ovoide dentro dos IVs chamado um “nucleoide”. IVs que contêm nucleoides de DNA condensado que são frequentemente referidos como “IVN”. Maturação de diversos precursores de proteína de virião por meio de clivagem proteolítica é exigida para a morfogênese de IVN em viriões maduros (MV). A maioria dos viriões maduros é encontrada fora das fábricas e pode existir em agrupamentos tanto na periferia de uma fábrica quanto aparentemente separados por uma distância significante da fábrica mais próxima.
[0013] Viriões de poxvírus existem em três formas infecciosas: viriões maduros (MV), viriões revestidos (WV), e viriões extracelulares (EV). MV, a forma mais simples do vírus, são partículas revestidas por membrana contendo um núcleo contendo DNA bicôncavo, flanqueado por corpos laterais, que preenchem as concavidades do núcleo. MV são normalmente encontrados exclusivamente dentro das células e são liberados apenas por lise celular. WV consistem de MV que são circundados por duas bicamadas de lipídio adicionais derivadas de cisternas trans-Golgi. WV, cujas membranas externas contêm proteínas virais características, são precursores de EV e são também encontrados dentro da célula. EV consistem de WV que foram exocitosados por meio de fusão da membrana de WV mais externa com a membrana do plasma, deixando um MV revestido em uma membrana adicional. Uma fração de EV é encontrada afixada à superfície da célula, enquanto alguns são encontrados livres no meio extracelular. EV são considerados importantes para espalhamento do vírus dentro de um organismo.
[0014] Chicungunha é uma infecção causada pelo vírus da chicungunha. Ela caracteriza febre de início de ação repentino normalmente durando dois a sete dias, e dores na junta tipicamente durando semanas ou meses, mas algumas vezes anos. A taxa de mortalidade é um pouco menos que 1 em 1.000, com maior probabilidade e morte em idoso.
[0015] O vírus é passado para humanos por mosquitos. Os reservatórios animais do vírus incluem macacos, pássaros, gado e roedores. Isso é contrário à dengue, para a qual apenas primatas são hospedeiros.
[0016] O melhor meio de prevenção é controle geral do mosquito e prevenção de picadas por mosquitos em países onde a doença é comum. Entretanto, uma vacina que provê proteção dessa doença seria muito desejável.
[0017] Vírus da zica (ZIKV) é um membro do gênero Flavivirus da família Flaviviridae e é um vírus de RNA de fita única positivo que é transmitido principalmente pelo mosquito Aedes aegypti, que também carrega os vírus da dengue e chicungunha. A uma menor extensão, Zica pode também ser espalhada por Aedes albopictus, cuja distribuição vai até zonas temperadas.
[0018] Vírus da zica foi primeiro descoberto em um macaco na floresta Zica de Uganda em 1947 e este vírus foi até recentemente pouco mais que uma curiosidade científica. Em torno de 80% daqueles infectados parecem não mostrar nenhum sintoma, e o restante não tem mais que uma indisposição branda resolve dentro de poucos dias. Originalmente restrito a pequenos surtos na África e Ásia, o vírus espalhou no Pacífico em 2007 até a ilha de Yap na Micronésia. Em 2013, um surto na Polinésia Francesa causou 28.000 infecções. Considera-se que o surto atual nas Américas veio da Polinésia. O vírus pode ter sido introduzido no Brasil durante a Copa do Mundo da FIFA em 2014 ou uma prova de canoagem onde atletas polinésios competiram. Desde então, o vírus espalhou através de diversos países latino- americanos, incluindo Colômbia, México, Paraguai e Venezuela.
[0019] Duas linhagens genéticas de ZIKV foram até então descritas, Africanas e Asiáticas. As cepas isoladas de amostras no Brasil entre 2015 e 2016 pareciam às cepas Asiáticas, particularmente a cepa da Polinésia Francesa [Baronti et al., 2014, Complete coding sequence of Zika virus from a French Polynesia outbreak in 2013. Genome Announc 2: e00500-e00514; Brasil et al., 2016, Zika virus outbreak in Rio de Janeiro, Brazil: Clinical characterization, epidemiological and virological aspects. PLoS Negl Trop Dis 10:e0004636; Faria et al., 2016, Zika virus in the Americas: Early epidemiological and genetic findings. Science 352:345-349; Giovanetti et al., 2016, Zika virus complete genome from Salvador, Bahia, Brazil. Infect Genet Evol.].
[0020] A cepa de ZIKV de referência da linhagem Africana MR766 difere da linhagem Asiática em que o sítio de glicosilação conserva a ASN 153/154 da proteína envelope foi deletado (vide Fig 3 de Sirohi et al 2016, The 3.8 Â resolution cryo-EM structure of Zica virus. Science, 352 (6284): 467-70) dando origem a uma proteína E não glicosilada na cepa MR766. Essa falta de glicosilação parece não afetar a infetividade do vírus da zica, mas pode desempenhar um papel em virulência e pode prover um motivo por que as cepas Asiáticas parecem ser mais virulentas do que MR766, entretanto, até hoje isso não foi provado.
[0021] Para o projeto das vacinas a base da SCV, as sequências antigênicas para essas vacinas foram baseadas na linhagem Asiática. A sequência de poliproteína PrME (prMembrane mais envelope) foi usada como o antígeno de vacina da vacina.
[0022] Os presentes inventores observaram que, pelo uso um pox vírus atenuado que foi geneticamente modificado de maneira tal que seu genoma compreendesse uma sequência de ácido nucleico que codifica a poliproteína subgenômica 26S do vírus da chicungunha e/ou o PrME do vírus da Zica, pode ser obtida uma composição que diminui o risco de infecção por chicungunha e varíola, infecção por vírus da Zica e varíola, e/ou infecção por chicungunha, vírus da Zica e varíola.
[0023] Dessa maneira, em um primeiro aspecto, a presente invenção provê uma composição para aumentar uma resposta imune em animal que diminui o risco de infecção por chicungunha e varíola, a composição compreendendo um carreador farmaceuticamente aceitável e um poxvírus atenuado, em que o genoma do poxvírus compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica a poliproteína subgenômica 26S do vírus da chicungunha.
[0024] Em um segundo aspecto, a presente invenção provê uma composição para aumentar uma resposta imune em animal que diminui o risco de infecção por infecção por vírus da Zica e varíola, a composição compreendendo um carreador farmaceuticamente aceitável e um poxvírus atenuado, em que o genoma do poxvírus compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica a poliproteína PrME do vírus da zica.
[0025] Em um terceiro aspecto, a presente invenção provê uma composição para aumentar uma resposta imune em animal que diminui o risco de chicungunha e infecção por vírus da Zica e varíola, a composição compreendendo um carreador farmaceuticamente aceitável e um poxvírus atenuado, em que o genoma do poxvírus compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica a poliproteína subgenômica 26S do vírus da chicungunha e uma sequência de ácido nucleico que codifica a poliproteína PrME do vírus da zica.
[0026] Em um quarto aspecto, a presente invenção provê um método para induzir uma resposta imune protetora em um indivíduo contra chicungunha e varíola, infecção por vírus da varíola e zica e/ou infecção por vírus da chicungunha, varíola e zica, o método compreendendo administrar ao indivíduo a composição do primeiro, segundo ou terceiro aspecto da presente invenção.
[0027] Em um quinto aspecto, a presente invenção provê o uso da composição do primeiro, segundo ou terceiro aspecto da presente invenção na preparação de um medicamento para induzir uma resposta imune protetora em um indivíduo contra chicungunha e varíola, infecção por vírus da varíola e zica e/ou infecção por vírus da chicungunha, varíola e zica.
[0028] Figura 1. Cassete de recombinação homóloga da SCV301A.
[0029] Figura 2. F1 e F2 alvo para recombinação homóloga em genoma de VACV-COP.
[0030] Figura 3. Sítio de inserção de CHIKV-26S da SCV301A.
[0031] Figura 4. Deleção de Ecogpt e EGFP por recombinação homóloga.
[0032] Figura 5. Mapa de Plasmídeo de pTC29.
[0033] Figura 6. Cassete HR de deleção.
[0034] Figura 7. Cassete HR de deleção de B7R-B8R.
[0035] Figura 8. Método de ação de recombinação homóloga com seleção transdominante.
[0036] Figura 9. Cassete HR de ZIKR.
[0037] A invenção em questão não é limitada a procedimentos ou agentes particulares, formulações específicas de agentes e várias metodologias médicas, como tal pode variar. A terminologia usada aqui tem o propósito de descrever modalidades particulares apenas, e não deve ser limitante. A menos que de outra forma definida, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm os mesmos significados comumente entendidos pelos versados na técnica aos quais esta invenção diz respeito.
[0038] Quaisquer materiais e métodos similares ou equivalentes aos descritos aqui podem ser usados para praticar ou testar a presente invenção. Especialistas são particularmente direcionados a: Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, Plainsview, N.Y.; Ausubel et al. (1999) Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 47), John Wiley & Sons, New York; Murphy et al. (1995) Virus Taxonomy Springer Verlag:79-87, Mahy Brian WJ and Kangro O Hillar (Eds): Virology Methods Manual 1996, Academic Press; and Davison AJ and Elliott RM (Eds): Molecular Virology, A practical Approach 1993, IRL Press at Oxford University Press; Perkus et al., Virology (1990) 179(1):276-86 ou definições e termos da técnica e outros métodos conhecidos pelos versados na técnica.
[0039] Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos aqui possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, métodos e materiais preferidos são descritos. Para os propósitos da presente invenção, os termos seguintes são definidos a seguir.
[0040] Por toda esse relatório descritivo, a menos que o contexto exija de outra forma, as palavras “compreendem”, “compreende” e “compreendendo” serão entendidos de forma a implicar a inclusão de uma etapa ou elemento ou grupo de etapas ou elementos estabelecidos, mas não a exclusão de qualquer outra etapa ou elemento ou grupo de etapas ou elementos. Assim, uso do termo “compreendendo” e similares indica que os elementos listados são exigidos ou mandatórios, mas que outros elementos são opcionais e podem ou não estar presentes. No contexto de vetores de ortopox atenuado, os vetores em questão são modificados para atenuação compreendendo deleção de um gene de maturação ou montagem essencial, entretanto, modificação adicional tais como para vetorizar um antígeno ou outra proteína é englobada.
[0041] “Consistindo de” significa incluindo, e limitado a, o que quer que siga a frase “consistindo de”. Assim, a frase “consistindo de” indica que os elementos listados são exigidos ou mandatórios, e que nenhum outro elemento pode estar presente. “Consistindo essencialmente de” quer dizer incluindo quaisquer elementos listados após a frase, e limitado a outros elementos que não interferem ou contribuem para a atividade ou ação especificada na descrição para os elementos listados. Assim, a expressão “consistindo essencialmente de” indica que os elementos listados são exigidos ou mandatórios, mas que outros elementos são opcionais e podem ou não estar presentes dependendo se eles afetam ou não a atividade ou ação dos elementos listados.
[0042] Como usado aqui, as formas singulares “um”, “uma” e “o”, “a” incluem aspectos plurais, a menos que o contexto claramente dite de outra forma. Assim, por exemplo, referência a “uma célula” inclui uma única célula, bem como duas ou mais células; referência a “um organismo” inclui um organismo, bem como dois ou mais organismos; e assim por diante. Em algumas modalidades, “um” significa “um ou mais que um”.
[0043] Como usado aqui, “e/ou” se refere a e engloba toda e qualquer combinação possível de um ou mais dos itens listados associados, bem como a falta de combinação quando interpretada na alternativa (ou).
[0044] “Atenuação” ou “atenuado” como usado aqui significa uma redução de virulência do vetor viral. Virulência é definida como a capacidade de um vírus causar doença em um hospedeiro particular. Um vetor poxviral que é incapaz de produzir vírus infecciosos pode inicialmente infectar células, mas é incapaz substancialmente de replicar por si mesmo totalmente ou propagar dentro do hospedeiro ou causar uma condição. Isto é desejável uma vez que o vetor entrega sua proteína ou ácido nucleico ao citoplasma da célula hospedeira, mas não prejudica o indivíduo.
[0045] “Elemento de controle” ou “sequência de controle” significa sequências do ácido nucleico (por exemplo, DNA) necessárias para expressão de uma sequência de codificação operacionalmente ligada em um poxvirus, vetor, plasmídeo ou célula particulares. Sequências de controle que são adequadas para células eucarióticas incluem sequências de controle transcricionais tais como promotores, sinais de poliadenilação, intensificadores transcricionais, sequências de controle translacionais tais como intensificadores translacionais e sítios de ligação de ribossoma internos (IRES), sequências do ácido nucleico que modulam estabilidade de RNAm, bem como sequências de alvejamento que alvejam um produto codificado por um polinucleotídeo transcrito em um compartimento intracelular dentro de uma célula ou no ambiente extracelular.
[0046] Onde sequências são providas, sequências correspondentes são englobada. “Corresponde a” “correspondendo” ou “correspondendo a” significam uma sequência de ácido nucleico que exibe identidade de sequência substancial com uma sequência de ácido nucleico de referência (por exemplo, pelo menos cerca de 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 97, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% ou mesmo até 100% de identidade de sequência com toda ou uma porção da sequência de ácidos nucleicos de referência) ou uma sequência de aminoácidos que exibe similaridade ou identidade de sequência substancial com uma sequência de aminoácidos de referência (por exemplo, pelo menos 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 97, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% ou mesmo até 100% de similaridade ou identidade de sequência com toda ou uma porção da sequência de aminoácidos de referência).
[0047] “Quantidade efetiva”, no contexto para tratar ou prevenir uma condição ou para modular uma resposta imune a um antígeno ou organismo alvo significa a administração de uma quantidade de um agente (por exemplo, um vetor de ortopox atenuado como descrito aqui) ou composição compreendendo mesma a um indivíduo que necessita de tal tratamento ou profilaxia, tanto em uma dose única quanto como parte de uma série, que é efetiva para prevenir incorrer em um sintoma, manter sob controle tais sintomas e/ou tratar os sintomas existentes, desta condição ou para modular a resposta imune ao antígeno ou organismo alvo. A quantidade efetiva variará dependendo da saúde e condição física do indivíduo a ser tratado, do grupo taxonômico do indivíduo a ser tratado, da formulação da composição, da avaliação da situação médica, e outros fatores relevantes. Espera-se que a quantidade caia em uma faixa relativamente ampla que pode ser determinada através de experimentos de rotina.
[0048] Como usadas aqui, as expressões “codifica”, “que codifica” e similares se referem à capacidade de um ácido nucleico prover um outro ácido nucleico ou um polipeptídeo. Por exemplo, uma sequência de ácido nucleico é dita “codificar” um polipeptídeo se ela puder ser transcrita e/ou traduzida para produzir o polipeptídeo ou se ela puder ser processada em uma forma que pode ser transcrita e/ou traduzida para produzir o polipeptídeo. Uma sequência de ácido nucleico como essa pode incluir uma sequência de codificação ou tanto uma sequência de codificação quanto uma sequência de não codificação. Assim, as expressões “codifica”, “que codifica” e similares incluem um produto de RNA resultante de transcrição de uma molécula de DNA, uma proteína resultante de tradução de uma molécula de RNA, uma proteína resultante de transcrição de uma molécula de DNA para formar um produto de RNA e a tradução subsequente do produto de RNA, ou uma proteína resultante de transcrição de uma molécula de DNA para prover um produto de RNA, processamento do produto de RNA para prover um produto de RNA processado (por exemplo, RNAm) e a tradução subsequente do produto de RNA processado.
[0049] O termo “endógeno” se refere a um gene ou sequência ou segmento de ácido nucleico que é normalmente encontrado em um organismo hospedeiro.
[0050] Os termos “expressível”, “expresso” e variações dos mesmos se referem à capacidade de uma célula transcrever uma sequência de nucleotídeos para RNA e opcionalmente traduzir o RNAm para sintetizar um peptídeo ou polipeptídeo que provê uma função biológica ou bioquímica.
[0051] Como usado aqui, o termo “gene” inclui uma molécula de ácido nucleico ser capaz de ser usada para produzir RNAm opcionalmente com a adição de elementos para assistir neste processo. Genes podem ou não ser capazes de ser usados para produzir uma proteína funcional. Genes podem incluir tanto regiões de codificação quanto de não codificação (por exemplo, íntrons, elementos regulatórios, promotores, intensificadores, sequências de terminação e regiões não traduzidas 5’ e 3’).
[0052] As expressões “sequência de ácidos nucleicos heteróloga”,“sequência de nucleotídeos heteróloga”, “polinucleotídeo heterólogo”, “polinucleotídeo estranho”, “polinucleotídeo exógeno” e similares são usadas indiferentemente para se referirem a qualquer ácido nucleico (por exemplo, uma sequência de nucleotídeos compreendendo um IRES) que é introduzido no genoma de um organismo por manipulações experimentais e podem incluir sequências genéticas encontradas neste organismo, desde que o gene introduzido contenha alguma modificação (por exemplo, uma mutação de ponto, deleção, substituição ou adição de pelo menos um nucleotídeo, a presença de um sítio de clivagem de endonuclease, a presença de um sítio de loxP, etc.) relativo à sequência genômica viral antes da modificação.
[0053] As expressões “polipeptídeo heterólogo”, “polipeptídeo estranho” e “polipeptídeo exógeno” são usadas indiferentemente para se referir a qualquer peptídeo ou polipeptídeo que é codificado por uma “sequência de ácidos nucleicos heteróloga”, “sequência de nucleotídeos heteróloga”, “polinucleotídeo heterólogo”, “polinucleotídeo estranho” e “polinucleotídeo exógeno”, como definido anteriormente.
[0054] A expressão “resposta imune protetora” significa uma resposta imune que previne, ou diminui o risco ou gravidade de infecção por chicungunha e/ou por varíola.
[0055] O vetor do pox vírus da presente invenção é preferivelmente propagado em uma célula de mamífero. Detalhes das células de mamífero que podem ser usadas na presente invenção são providos em PCT/AU2014/050330, cuja descrição está incorporada aqui por referência cruzada.
[0056] Em algumas modalidades, a célula de mamífero é uma célula de humano, uma célula de primata, uma célula de hamster ou uma célula de coelho.
[0057] Células podem ser unicelulares, ou podem ser crescidas em cultura de tecido como culturas líquidas, monocamadas ou similares. Células hospedeiras podem também ser derivadas direta ou indiretamente de tecidos ou podem existir dentro de um organismo incluindo animais.
[0058] Deve-se entender que “induzir” uma resposta imune como contemplado aqui inclui elicitar ou estimular uma resposta imune e/ou intensificar uma resposta imune previamente existente.
[0059] A expressão “operacionalmente conectado” ou “operacionalmente ligado” como usada aqui se refere a uma justaposição em que os componentes assim descritos são em um relacionamento que permite que eles funcionem em sua maneira pretendida. Por exemplo, uma sequência de controle transcricional “operacionalmente ligada” a uma sequência de codificação se refere ao posicionamento e/ou orientação da sequência de controle transcricional com relação à sequência de codificação para permitir expressão da sequência de codificação em condições compatíveis com a sequência de controle transcricional. Em um outro exemplo, um IRES operacionalmente conectado a uma sequência de codificação de vírus ortopox se refere a posicionamento e/ou orientação do IRES com relação à sequência de codificação de vírus ortopox para permitir tradução cap-independente da sequência de codificação de vírus ortopox.
[0060] Como usado aqui, as expressões “quadro de leitura aberta” e “ORF” são usadas indiferentemente aqui para se referir à sequência de aminoácidos codificados entre início de tradução e códons de terminação de uma sequência de codificação. As expressões “códon de iniciação” (por exemplo, ATG) e “códon de terminação” (por exemplo, TGA, TAA, TAG) se referem a uma unidade de três nucleotídeos adjacentes (‘códon’) em uma sequência de codificação que especifica iniciação e terminação de cadeia, respectivamente, de síntese de proteína (tradução de RNAm).
[0061] As expressões “polinucleotídeo”, “sequência de polinucleotídeos”, “sequência de nucleotídeos”, “ácido nucleico” ou “sequência de ácido nucleico” como usadas aqui designam RNAm, RNA, cRNA, cDNA ou DNA. As expressões tipicamente se referem à forma polimérica de nucleotídeos de pelo menos 10 bases de comprimento, tanto ribonucleotídeos ou deoxinucleotídeos quanto uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo. As expressões incluem formas de fita única e dupla de RNA ou DNA.
[0062] “Polipeptídeo”, “peptídeo”, “proteína” e “molécula proteinácea” são usados indiferentemente aqui para se referirem às moléculas compreendendo ou consistindo de um polímero de resíduos de aminoácido e às variantes e análogos sintéticos das mesmas. Assim, esses termos se aplicam aos polímeros de aminoácidos nos quais um ou mais resíduos de aminoácido são aminoácidos de ocorrência não natural sintéticos, tais como um análogo químico de um aminoácido de ocorrência natural correspondente, bem como aos polímeros de aminoácido de ocorrência natural.
[0063] Como usado aqui, entende-se que o termo “recombinante” como aplicado a “moléculas de ácido nucleico”, “polinucleotídeos” e similares significa estruturas de ácido nucleico artificial (isto é, cDNA ou RNA não replicante; ou replicões, cDNA ou RNA autorreplicante) que podem ser transcritas e/ou traduzidas em células hospedeiras ou sistemas isentos de célula descritos aqui. Moléculas de ácido nucleico recombinantes ou polinucleotídeos podem ser inseridos em um vetor. Vetores não virais tais como vetores de expressão de plasmídeo ou vetores virais podem ser usados. O tipo de vetores e a técnica de inserção do construto do ácido nucleico de acordo com essa invenção é conhecido pelos versados na técnica. Uma molécula de ácido nucleico ou polinucleotídeo de acordo com a invenção na ocorre na natureza no arranjo descrito pela presente invenção. Em outras palavras, uma sequência de nucleotídeos heteróloga não é naturalmente combinada com elementos de um genoma de vírus pai (por exemplo, promotor, ORF, sinal de poliadenilação, ribozima).
[0064] Como usada aqui, a expressão “vírus recombinante” será entendida como uma referência a um “vírus pai” compreendendo pelo menos uma sequência de ácidos nucleicos heteróloga.
[0065] A expressão “identidade de sequência” como usada aqui se refere à extensão que sequências são idênticas em uma base de nucleotídeo- por-nucleotídeo ou uma base aminoácido-por-aminoácido em uma janela de comparação. Assim, uma “porcentagem de identidade de sequência” é calculada comparando duas sequências alinhadas de forma ideal na janela de comparação, determinando o número de posições nas quais a base de ácido nucleico idêntica (por exemplo, A, T, C, G, I) ou o resíduo de aminoácido idêntico (por exemplo, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys e Met) ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições conjugadas, dividindo o número de posições conjugadas pelo número total de posições na janela de comparação (isto é, o tamanho de janela), e multiplicando o resultado por 100 para produzir a porcentagem de identidade de sequência. Para os propósitos da presente invenção, “identidade de sequência” será entendido como a “porcentagem de pareamento” calculada pelo programa de computador DNASIS (Version 2.5 para Windows; disponível pela Hitachi Software engineering Co., Ltd., São Francisco do Sul, Califórnia, USA) usando normas padrões como usadas no manual de referência que acompanha o software.
[0066] As expressões “sequência sinal” ou “peptídeo sinal” se referem a um peptídeo curto (cerca de 3 a cerca de 60 aminoácidos de comprimento) que direciona transporte co- ou post-translacional de uma proteína do citosol para certas organelas tais como o núcleo, matriz mitocondrial, e retículo endoplásmico, por exemplo. Para proteínas tendo um peptídeo sinal que alveja ER, os peptídeos sinais são tipicamente clivados pela forma precursora por peptidase sinal após as proteínas serem transportadas para o ER, e as proteínas resultantes se movem ao longo do caminho secretório para suas localizações intracelulares (por exemplo, o aparelho Golgi, membrana da célula ou parede da célula) ou extracelulares. “Peptídeos sinais que alvejam ER”, como usados aqui incluem sequências hidrofóbicas amino-terminais que são normalmente removidas enzimaticamente depois da inserção de parte ou toda a proteína através da membrana do ER no lúmen do ER. Assim, é conhecido na técnica que uma forma precursora de sinal de uma sequência pode estar presente como parte de uma forma precursora de uma proteína, mas no geral estará ausente da forma madura da proteína.
[0067] “Similaridade” se refere ao número de porcentagem de aminoácidos que são idênticos ou constituem substituições conservadoras como definido na Tabela A a seguir. Similaridade pode ser determinada usando programas de comparação de sequência tal como GAP (Deveraux et al. 1984, Nucleic Acids Research12: 387-395). Desta maneira, sequências de um comprimento similar ou substancialmente diferente daquelas citadas aqui podem ser comparadas por inserção de lacunas no alinhamento, tais lacunas sendo determinadas, por exemplo, pelo algoritmo de comparação usado por GAP.TABELA A: Substituições Conservadoras de Aminoácido Exemplares
[0068] O alinhamento ideal de sequências para alinhar uma janela de comparação pode ser conduzido por implementações computadorizadas de algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USA) ou por inspeção e o melhor alinhamento (isto é, que resulta na porcentagem de homologia mais alta na janela de comparação) gerado por qualquer dos vários métodos selecionados. Referência também pode ser feita à família BLAST de programas como, por exemplo, descrito por Altschul et al., 1997, Nucl. Acids Res.25:3389. Uma discussão detalhada de análise de sequência pode ser encontrada em Unit 19.3 de Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons Inc, 19941998, Chapter 15.
[0069] Os termos “sujeito”, “paciente”, “hospedeiro” ou “indivíduo” usados indiferentemente aqui se referem a qualquer sujeito, particularmente um sujeito vertebrado, e ainda mais particularmente um sujeito mamífero, para o qual a terapia ou profilaxia é desejada. Animais vertebrados adequados que caem no escopo da invenção incluem, mas são não restritos a, qualquer membro do subphylum Chordata incluindo primatas (por exemplo, humanos, macacos e bugios, e inclui espécies de macacos como do gênero Macaca (por exemplo, macacos cinimolgos tal como Macaca fascicularis, e/ou macacos resos (Macaca mulatta)) e balbuíno (Papio ursinus), bem como saguis (espécies do gênero Callithrix), macacos esquilos (espécies do gênero Saimiri) e saguins (espécies do gênero Saguinus), bem como espécies de bugios tais como chimpanzés (Pan troglodytes)), roedores (por exemplo, camundongos, ratos, porquinhos-da-índia), lagomorfos (por exemplo, coelhos, lebres), bovinos (por exemplo, gado), ovinos (por exemplo, ovelha), caprinos (por exemplo, cabras), porcinos (por exemplo, porcos), equinos (por exemplo, cavalos), caninos (por exemplo, cães), felinos (por exemplo, gatos), aves (por exemplo, galinhas, perus, patos, gansos, pássaros de estimação tais como canários, periquitos etc.), mamíferos marinhos (por exemplo, golfinhos, baleias), répteis (cobras, sapos, lagartos, etc.) e peixe. Um sujeito preferido é um humano que necessita de tratamento ou profilaxia de uma condição. Entretanto, deve-se entender que os termos supramencionados não implicam que sintomas estejam presentes.
[0070] O termo “transgene” é usado aqui para descrever material genético que foi ou está prestes a ser artificialmente introduzido em um genoma de um organismo hospedeiro e que é transmitido para a progênie deste hospedeiro. Em algumas modalidades, ele confere uma propriedade desejada a uma célula de mamífero ou um vetor ortopox no qual ele é introduzido, ou de outra forma leva a um resultado terapêutico ou diagnóstico desejado.
[0071] Como usado aqui, os termos “tratamento”, “tratando”, e similares, se referem a obtenção de um efeito farmacológico e/ou fisiológico desejado. O efeito pode ser profilático em termos de prevenir completa ou parcialmente uma doença ou sintoma dos mesmos e/ou pode ser terapêutico em termos de uma cura parcial ou completa para uma doença e/ou efeito adverso atribuível à doença. “Tratamento”, como usado aqui, cobre qualquer tratamento de uma doença em um mamífero, particularmente em um humano, e inclui: (a) prevenir a ocorrência da doença em um sujeito que pode ser predisposto à doença mas ainda não foi diagnosticado como a mesma; (b) inibir a doença, isto é, deter seu desenvolvimento; e (c) aliviar a doença, isto é, causar regressão da doença.
[0072] As expressões “tipo selvagem”, “natural”, “nativo” e similares com respeito a um organismo, polipeptídeo, ou sequência de ácidos nucleicos, que o organismo polipeptídeo, ou sequência de ácido nucleico é de ocorrência natural ou disponível em pelo menos um organismo de ocorrência natural que não é mudado, mutado, ou de outra forma manipulado pelo homem.
[0073] Variantes incluem moléculas de ácido nucleico suficientemente similares a uma molécula referenciada ou suas formas complementares em toda ou parte das mesmas, de maneira tal que hibridização seletiva pode ser obtida em condições de média ou alta rigorosidade, ou que têm cerca de 60% a 90% ou 90 a 98% de identidade de sequência com a sequência de nucleotídeos que define um fator da gama de hospedeiros de poxvírus referenciado em uma janela de comparação compreendendo pelo menos cerca de 15 nucleotídeos. Preferivelmente, a região de hibridização tem cerca de 12 a cerca de 18 nucleobases ou mais de comprimento. Preferivelmente, a porcentagem de identidade entre uma sequência de nucleotídeos particular e a sequência de referência é pelo menos cerca de 80%, ou 85%, ou mais preferivelmente cerca de 90% similar ou mais, tal como cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais. Identidades de porcentagem entre 80% e 100% são englobadas. O comprimento da sequência de nucleotídeos depende de sua função proposta. Homólogos são englobados. As expressões “homólogo”, “genes homólogos” ou “homólogos” se referem no geral a moléculas funcional e estruturalmente relacionadas incluindo aquelas de outras espécies. Homólogos e hortólogos são exemplos de variantes.
[0074] Identidade de sequência de ácido nucleico pode ser determinada da seguinte maneira. A sequência de ácido nucleico objeto é usada para pesquisar uma base de dados da sequência de ácido nucleico, tal como a base de dados GenBank (acessível no endereço de rede http://www.ncbi.nln.nih.gov/blast/), usando o programa BLASTM versão 2.1 (baseado em Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Research 25:3389-3402). O programa é usado no modo não controlado. Filtragem padrão é usada para remover homologias de sequência devido a regiões de baixa complexidade. Os parâmetros padrões de BLASTM são usados.
[0075] Identidade de sequência de aminoácidos pode ser determinada da seguinte maneira. A sequência de polipeptídeos objeto é usada para pesquisar uma base de dados de sequência de polipeptídeos, tal como a base de dados GenBank (acessível em web site http://www.ncbi.nln.nih.gov/blast/), usando o programa BLASTP. O programa é usado no modo não controlado. Filtragem padrão é usada para remover homologias de sequência devido a regiões de baixa complexidade. Os parâmetros padrões de BLASTP são utilizados. Filtragem quanto a sequências de baixa complexidade pode usar o programa SEG.
[0076] Sequências preferidas hibridizarão em condições rigorosas em uma sequência de referência ou seu complemento. A expressão “hibridiza em condições rigorosas”, e equivalentes gramaticais da mesma, se refere à capacidade de uma molécula de ácido nucleico hibridizar com uma molécula de ácido nucleico alvo (tal como uma molécula de ácido nucleico alvo imobilizada em um DNA ou RNA blot, tal como um Southern blot ou Northern blot) em condições definidas de temperatura e concentração de sal. Com respeito às moléculas de ácido nucleico maiores que cerca de 100 bases de comprimento, condições de hibridização rigorosas típicas não são mais que 25°C a 30°C (por exemplo, 10°C) abaixo da temperatura de fusão (Tm) do duplex nativo (vide no geral, Sambrook et al., (supra); Ausubel et al., (1999)). Tm para moléculas de ácido nucleico maiores que cerca de 100 bases pode ser calculada pela fórmula Tm=81,5+0,41% (G+C-log (Na+)). Com respeito às moléculas de ácido nucleico tendo um comprimento menor que 100 bases, condições de hibridização rigorosas exemplares são 5°C a 10°C abaixo da Tm.
[0077] O termo “deleção” no presente contexto significa remoção de toda ou parte da região de codificação do gene alvo. O termo também engloba qualquer forma de mutação ou transformação que remove expressão genética do gene alvo ou remove ou substancialmente infra-regula o nível ou atividade da proteína codificada.
[0078] Referência ao “gene” inclui DNA correspondente aos éxons ou o quadro de leitura aberta de um gene. Referência aqui a um “gene” é também feita para incluir: um gene genômico clássico consistindo de sequências regulatórias transcricionais e/ou translacionais e/ou uma região de codificação e/ou sequências não traduzidas (isto é, íntrons, sequências não traduzidas 5’- e 3’-); ou RNAm ou cDNA correspondente às regiões de codificação (isto é, éxons) e sequências não traduzidas 5’- e 3’- do gene.
[0079] As expressões “elemento regulatório” ou “sequência regulatória” significam sequências do ácido nucleico (por exemplo, DNA) necessárias para expressão de uma sequência de codificaçãooperacionalmente ligada em uma célula hospedeira particular. As sequências regulatórias que são adequadas para células procarióticas, por exemplo, incluem um promotor, e opcionalmente uma sequência de ação cis tais como uma sequência operadora e um sítio de ligação de ribossoma. Sequências de controle que são adequadas para células eucarióticas incluem promotores, sinais de poliadenilação, intensificadores transcricionais, intensificadores translacionais, sequências líder ou final que modulam estabilidade de RNAm, bem como sequências de alvejamento que alvejam um produto codificado por um polinucleotídeo transcrito para um compartimento intracelular dentro de uma célula ou para o ambiente extracelular.
[0080] Construtos quiméricos adequados para efetuar as presentes células de mamífero modificadas compreendem uma sequência de ácido nucleico que codifica um fator da gama de hospedeiros de ortopox, que é operacionalmente ligado a uma sequência regulatória. A sequência regulatória compreende adequadamente sequências de controle transcricionais e/ou translacionais, que serão compatíveis para expressão na célula. Tipicamente, as sequências regulatórias de controle transcricionais e translacionais incluem, mas não se limitando a, uma sequência promotora, uma região de não codificação 5’, uma região regulatória em cis tal como um sítio de ligação funcional para proteína regulatória transcricional ou proteína regulatória translacional, um quadro de leitura aberta à montante, sequências de ligação ribossomais, sítio de iniciação transcricional, sítio de iniciação translacional, e/ou sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência líder, códon de terminação, sítio de parada translacional e uma região não traduzida 3’. Promotores constitutivos ou indutíveis como conhecido na técnica são contemplados. Os promotores podem ser tanto promotores de ocorrência natural, quanto promotores híbridos que combinam elementos de mais que um promotor.
[0081] Sequências promotoras contempladas podem ser nativas para células de mamífero ou podem ser derivadas de uma fonte alternativa, onde a região é funcional no organismo escolhido. A escolha de promotor diferirá dependendo da célula hospedeira pretendida. Por exemplo, promotores que podem ser usados para expressão em células de mamífero incluem o promotor metalotioneína, que pode ser induzido em resposta a metais pesados tal como cádmio, o promotor β-actina bem como promotores virais tais como o promotor de antígeno T grande SV40, promotor precoce imediato (IE) de citomegalovírus de humano (CMV), promotor LTR do vírus do sarcoma de Rous, o promotor LTR do vírus de tumor mamário de camundongos, o promotor posterior principal de adenovírus (Ad MLP), o promotor do vírus de herpes simplex, e um promotor HPV, particularmente a região regulatória à montante HPV (URR), entre outros. Todos esses promotores são bem descritos e facilmente disponíveis na técnica.
[0082] Elementos intensificadores podem também ser usados aqui para aumentar os níveis de expressão dos construtos de mamífero. Exemplos incluem o intensificador do gene precoce SV40, como descrito, por exemplo, em Dijkema et al. (1985) EMBO J. 4:761, o intensificador/promotor derivado da repetição terminal longa (LTR) do Vírus do Sarcoma de Rous, como descrito, por exemplo, em Gorman et al., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777 e elementos derivados de CMV de humano, como descrito, por exemplo, em Boshart et al. (1985) Cell 41:521, tais como elementos incluídos na sequência A do íntron de CMV.
[0083] O construto quimérico pode também compreender uma sequência não traduzida 3’. Uma sequência não traduzida 3’ se refere àquela porção de um gene compreendendo um segmento de DNA que contém um sinal de poliadenilação e quaisquer outros sinais regulatórios capazes de efetuar processamento de RNAm ou expressão genética. O sinal de poliadenilação é distinguido efetuando a adição de tratos do ácido poliadenílico à extremidade 3’ do precursor de RNAm. Sinais de poliadenilação são comumente reconhecidos pela presença de homologia à forma canônica 5’ AATAAA-3’ embora variações não sejam incomuns. A sequência de DNA regulatória não traduzida 3’ preferivelmente inclui de cerca de 50 a 1.000 nts e pode conter sequências de terminação transcricionais e translacionais além de um sinal de poliadenilação e quaisquer outros sinais regulatórios capazes de efetuar processamento de RNAm ou expressão genética.
[0084] Em algumas modalidades, o construto quimérico contém adicionalmente um gene marcador selecionável para permitir seleção de células contendo o construto. Genes de seleção são bem conhecidos na técnica e serão compatíveis para expressão na célula de interesse.
[0085] Em uma modalidade, expressão do gene estrutural ou de montagem ortopox está sob o controle de um promotor. Em uma modalidade não limitante o promotor é um promotor constitutivo celular, tais como alfa EF1 de humano (promotor do gene alfa 1 do fator de alongamento de humano), DHFR (promotor do gene di-hidrofolato redutase) ou PGK (promotor do gene fosfoglicerato quinase) que direciona expressão de um nível suficiente de CP77 para sustentar propagação viral na ausência de efeitos tóxicos significantes na célula hospedeira. Promotores podem também ser indutíveis, tal como o promotor indutível celular, promotores virais MTH (de um gene de metalotioneína) são também empregados em células de mamífero, tais como CMV, RSV, SV-40 e MoU3.
[0086] A presente invenção provê uma composição compreendendo um poxvírus atenuado que pode ser usado como uma vacina para induzir proteção contra infecção por vírus de Chicungunha e Varíola. Os termos “atenuação”, “atenuado” e similares, como usados aqui, significam uma redução de virulência do vetor viral. Virulência é tipicamente definida como a capacidade de um vírus causar doença em um hospedeiro particular. Por exemplo, um poxvírus que é incapaz de produzir vírus infecciosos pode inicialmente infectar células, mas é substancialmente incapaz de replicar por si mesmo totalmente ou propagar dentro do hospedeiro ou célula hospedeira ou causar uma doença ou condição. Isso é desejável, uma vez que o vetor de poxvírus pode dispensar ácido nucleico ao hospedeiro ou célula hospedeira, mas tipicamente não prejudica o hospedeiro ou célula hospedeira.
[0087] A família poxvírus compreende duas subfamílias, a Chordopoxvirinae e a Entomopoxvirinae. A Chordopoxvirinae compreende oito gêneros incluindo a Ortopoxviridae compreendendo espécies que infectam o homem enquanto a Entomopoxvirinae infecta insetos. A Ortopoxviridae inclui, por exemplo, vírus da varíola que é o agente causador de varíola, vírus da varíola bovina que formou a vacina original contra varíola reportada por Jenner em 1796, e vírus vaccínia que foi usado como uma vacina contra varíola de segunda geração. O vírus Avipoxviridae compreende espécies que infectam pássaros, tais como os vírus da varíola aviária e varíola dos canários. Além do seu uso como antígenos em vacinas contra varíola, existe muito interesse no uso de vírus a base de vaccínia recombinante e os vírus da varíola das aves como vetores para dispensar e/ou que expressar genes heterólogos de interesse. Como vetores intra-citoplásmicos, os Ortopoxviridae são capazes de dispensar antígenos estranhos ao citoplasma hospedeiro e caminhos que processam antígeno que processa antígenos em peptídeos para apresentação na superfície da célula. Tais vetores que expressam antígenos estranhos são adequados para uso em terapia genética e o desenvolvimento de vacinas para uma ampla faixa de condições e doenças.
[0088] Os poxvírus constituem uma grande família dos vírus distinguidos por um genoma de dsDNA grande, linear, um sítio citoplásmico de propagação e uma morfologia de virião complexa. Vírus vaccínia é o vírus representativo deste grupo dos vírus e um dos mais estudados em termos de morfogênese viral. Viriões do vírus vaccínia aparecem como partículas ligadas a membrana em “formato de tijolo” ou “ovoide” com uma estrutura interna complexa parecendo com um núcleo bicôncavo cercado de paredes flanqueado por “corpos laterais”. O caminho de montagem do virião envolve uma fabricação de membrana contendo crescentes que desenvolvem em viriões imaturos (IVs), e então se desenvolve em viriões maduros (MVs). Mais de 70 produtos de gene específicos são contidos no virião do vírus vaccínia, onde os efeitos de mutações em mais de 50 genes específicos na montagem do vírus vaccínia são agora descritos.
[0089] Os poxvírus atenuados adequados seriam conhecidos pelos versados na técnica. Exemplos ilustrativos incluem atenuado Vaccínia Ankara Modificado (MVA), NYVAC, avipox, varíola dos canários e varíola aviária. Assim, em uma modalidade descrita aqui, o poxvírus atenuado é selecionado do grupo que consiste de Vaccínia Ankara Modificado (MVA), NYVAC, avipox, varíola dos canários e varíola aviária. Em uma modalidade, o poxvírus atenuado é um vírus vaccínia atenuado. Exemplos ilustrativos de cepas de vaccínia Copenhagen (COP), Western Reserve (WR), Wyeth, ACAM2000, LC16m8 e Connaught Laboratories (CL).
[0090] Versados na técnica entenderiam que outras cepas ortopoxvírus podem ser modificadas para produzir um poxvírus atenuado. Em um exemplo ilustrativo, um poxvírus atenuado pode ser produzido modificando (por exemplo, deletando, substituindo ou de outra forma interrompendo a função de) um gene do genoma do poxvírus que codifica uma proteína de montagem ou maturação essencial endógena. Assim, em uma modalidade descrita aqui, o poxvírus atenuado é um ortopoxvirus modificado, em que a modificação compreende deleção de um gene que codifica uma proteína de montagem ou maturação essencial endógena.
[0091] Em uma modalidade, o poxvírus atenuado é um vírus vaccínia modificado em que a modificação compreende deleção de um gene do genoma do vírus vaccínia que codifica (ou de outra forma a interrupção da função) uma proteína de montagem ou maturação endógena e em que a modificação transforma um vetor de vaccínia que propaga (ou que pode propagar) em uma célula hospedeira (por exemplo, uma célula de humano) em um vetor de vaccínia atenuado que é substancialmente não replicativo na célula hospedeira. Em uma modalidade, o gene de montagem ou maturação endógeno essencial é selecionado do grupo que consiste de COP-A2.5L, COP-A3L, COP-A4L, COP-A7L, COP-A8R, COP-A9L, COP-A10L, COP- A11R, COP-A12L, COP-A13L, COP-A14L, COP-A14.5L, COP-A15L, COP-A16L, COP-A17L, COP-A21L, COP-A22R, COP-A26L, COP-A27L, COP-A28L, COP-A30L, COP-A32L, COP-D2L, COP-D3R, COP-D6R, COP-D8L, COP-D13L, COP-E8R, COP-E10R, COP-E11L, COP-F10L, COP-F17R, COP-G1L, COP-G3L, COP-G4L, COP-G5R, COP-G7L, COP- G7L, COP-H1L, COP-H2R, COP-H3L, COP-H4L, COP-H5R, COP-H6R, COP-I1L, COP-I2L, COP-I6L, COP-I7L, COP-I8R, COP-J1R, COP-J4R, COP-J6R, COP-L1R, COP-L3L, COP-L4R e COP-L5R.
[0092] Em uma modalidade preferida a modificação compreende deleção do gene D13L e/ou do gene K1L e/ou do gene A39R e/ou dos genes B7R-B8R.
[0093] Em uma modalidade preferida adicional, a modificação compreende deleção do gene D13L, do gene A39R e dos genes B7R-B8R.
[0094] Em um primeiro aspecto, a presente invenção provê uma composição para aumentar uma resposta imune em animal que diminui o risco de infecção por chicungunha e varíola, a composição compreendendo um carreador farmaceuticamente aceitável e um poxvírus atenuado, em que o genoma do poxvírus compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica a poliproteína subgenômica 26S do vírus da chicungunha.
[0095] Em um segundo aspecto, a presente invenção provê uma composição para aumentar uma resposta imune em animal que diminui o risco de infecção por infecção por vírus da Zica e varíola, a composição compreendendo um carreador farmaceuticamente aceitável e um poxvírus atenuado, em que o genoma do poxvírus compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica a poliproteína PrME do vírus da zica.
[0096] Em um terceiro aspecto, a presente invenção provê uma composição para aumentar uma resposta imune em animal que diminui o risco de chicungunha e infecção por vírus da Zica e varíola, a composição compreendendo um carreador farmaceuticamente aceitável e um poxvírus atenuado, em que o genoma do poxvírus compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica a poliproteína subgenômica 26S do vírus da chicungunha e uma sequência de ácido nucleico que codifica a poliproteína PrME do vírus da zica.
[0097] Em um quarto aspecto, a presente invenção provê um método para induzir uma resposta imune protetora em um sujeito contra chicungunha e varíola, infecção por vírus da varíola e zica e/ou infecção por vírus da chicungunha, varíola e zica, o método compreendendo administrar ao sujeito a composição do primeiro, segundo ou terceiro aspecto da presente invenção.
[0098] Em um quinto aspecto, a presente invenção provê o uso da composição do primeiro, segundo ou terceiro aspecto da presente invenção na preparação de um medicamento para induzir uma resposta imune protetora em um sujeito contra chicungunha e varíola, infecção por vírus da varíola e zica e/ou infecção por vírus da chicungunha, varíola e zica.
[0099] Em formas preferidas da invenção atual, o poxvírus atenuado é selecionado do grupo que consiste de vaccínia, varíola bovina, Vaccínia Ankara Modificado (MVA), NYVAC, avipox, varíola dos canários e varíola aviária. Prefere-se que o poxvírus atenuado seja um ortopoxvirus modificado, em que a modificação compreende deleção de um gene que codifica uma proteína de montagem ou maturação essencial endógena. Prefere-se que a modificação compreenda deleção do gene D13L e preferivelmente compreenda adicionalmente a deleção do gene K1L.
[00100] Em certas modalidades, o carreador farmaceuticamente aceitável compreende um adjuvante. Prefere-se que o adjuvante seja selecionado do grupo que consiste de hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, sulfato de potássio e alumínio, hidróxido fosfato de cálcio, adjuvante completo de Freund, Montanide®, adjuvante incompleto de Freund, iscoms, matriz de iscom, adjuvante ISCOMATRIX™, adjuvante Matriz M™, adjuvante Matriz C™, adjuvante Matriz Q™, adjuvante AbISCO®-100, adjuvante AbISCO®-300, ISCOPREP™, um derivado de ISCOPREP™, adjuvante contendo ISCOPREP™ ou um derivado de ISCOPREP™, QS-21, um derivado de QS-21, e um adjuvante contendo QS- 21 ou um derivado de QS21.
[00101] As várias modalidades habilitadas aqui são descritas adicionalmente pelos seguintes exemplos não limitantes.
[00102] Três Vírus da SCV foram construídos antes da construção da SCV1002, a única vacina contra CHIK/ZICA vetorizada. SCV301C foi construído substituindo o A39R ORF de cepa do vírus vaccínia Copenhagen com um cassete de expressão de CHIKV-26S junto com cassetes de expressão de EGFP e Ecogpt. SCV302 foi criado deletando os cassetes de EGFP e Ecogpt da SCV301C. SCV305, a vacina SCV-CHIK, foi então criada deletando os B7R-B8R ORFs e D13L ORFs da SCV302. Finalmente, SCV1002, vacina SCV-CHIK/ZICA, foi criada substituindo os B7R-B8R ORFs da SCV302 com um cassete de expressão de ZIKV-prME e deletando o D13L ORF.
[00103] O cassete de expressão do antígeno de vacina contra chicungunha em SCV301C (CHIKV-26S) consiste do elemento seguinte em um arranjo linear: • vaccínia promotor precoce/posterior, • sequência de codificação de proteína de CHIKV para a poliproteína subgenômica 26S da cepa virulenta de Reunion 06_21, pox vírus • e uma sequência de parada transcricional precoce de poxvírus.
[00104] A poliproteína subgenômica de CHIKV 26S quando expressa será processada nos genes estruturais individuais necessários para a formação de partículas de vírus. Uma vez que todo o genoma de CHIKV não está presente e o RNA subgenômico não conterá o 5’ UTR e 3’ UTR, nenhum RNA viral transcrito será empacotado nas partículas virais recém-formadas - em essência, expressão de apenas a poliproteína subgenômica 26S dará origem à partícula tipo vírus (VLP) desprovida de RNA genômico viral. A expressão in vivo da poliproteína subgenômica que leva a formação de VLP mediante vacinação será favorável para neutralizar estímulo de anticorpo - uma correlação chave de imunidade para vacinação profilática contra CHIKV.
[00105] A sequência de aminoácidos para a poliproteína subgenômica 26S no cassete de expressão de CHIKV-26S foi retirada da cepa virulenta de Reunion que mudou geneticamente para ampliar sua gama de hospedeiros para um novo vetor de mosquito (Genbank, Número de Acesso: AM258992). Durante uma epidemia de Reunion entre 2005 e 2006, o vírus mutado para ampliar sua gama de hospedeiro-vetor para o mosquito tigre Asiático (Aedes albopictus). O mosquito tigre Asiático é o mosquito que espalha mais rápido no mundo. Extremamente bem adaptado para viver em torno das pessoas e conhecido por deslocar em pneus usados. Ele é encontrado em áreas rurais e urbanas verdes, quase por mundo todo, e é um picador diurno agressivo de humanos, animais domésticos e selvagens, e pássaros. Esse mosquito tem o potencial para espalhar Chicungunha no mundo todo. O projeto de sequência de nucleotídeos final da sequência de codificação de proteína de CHIKV-26S foi classificado quanto ao motivo transcricional precoce de pox vírus “TTTTTNT” — não foi encontrado nenhum. A sequência de parada transcricional precoce de Pox vírus TTTTTAT foi adicionada imediatamente após o códon de parada. A sequência para cassete de expressão de CHIKV- 26S descrita anteriormente é dada em SEQ ID NO:1.
[00106] Para criar SCV301C, um cassete de recombinação homóloga foi sintetizado por GeneArt GmbH que consistiu do cassete de expressão de CHIKV-26S, um cassete de expressão de proteína verde fluorescente intensificado, um cassete de expressão do Ecogpt todo flanqueado por braços esquerdo e direito de recombinação homóloga que alvejam as sequências à montante e à jusante de VACV-COP A39R ORF para recombinação homóloga como mostrado na Figura 1 e 2 a seguir. A Tabela 1 lista os recursos do cassete de recombinação homóloga da SCV301A e os detalhes da sequência são providos em SEQ ID NO:2.Tabela 1: Tabela de Recurso de Cassete de Recombinação Homóloga da SCV301C
[00107] SCV301A foi construído por inserção de o cassete de recombinação homóloga de CHIKV-26S na cepa Copenhagen do vírus vaccínia (VACV-COP) substituindo o A39R ORF por meio de recombinação homóloga entre o F1 e F2 com suas sequências homólogas com o genoma de VACV-COP como mostrado na Figura 2 anteriormente, que resulta na configuração de inserção mostrada na Figura 3.
[00108] SCV301C (VACV-CHIKV) foi construído por recombinação homóloga para substituir o A39R ORF de VACV com o cassete de recombinação homóloga de CHIKV-26S que foi sintetizado por GeneArt GmbH consistindo de cassete de expressão de poxvírus que expressa a poliproteína estrutural de CHIKV 26S (Número de Acesso do Genbank: AM258992), sob o controle de promotores de VACV (Chakrabarti et. al, 1997), junto com um cassete de expressão de poxvírus para a expressão da guanina fosforibosiltransferease de E. coli (Ecogpt). Recombinação homóloga e seleção positiva de vírus recombinantes contendo a co-inserção do cassete de expressão do Ecogpt foram realizadas como descrito no Protocolo 6 de Smith (1993) e publicado em Falkner et al (1988) e Boyle et al (1988), onde os braços de recombinação homóloga que flanqueiam os cassetes de expressão de CHIKV-26S e Ecogpt foram projetados para ser homólogos com as sequências que flanqueiam o A39R ORF. Resumidamente, recombinação homóloga foi realizada em células BHK21 que foram infectadas a um Moi de 0,01 pfu/célula por 1 hora com VACV-COP seguido por transfecção com o cassete de recombinação homóloga de CHIKV-26S. As células infectadas/transfectadas foram então incubadas por 2 a 3 dias até efeitos citopáticos brutos poder ser visto seguido por colheita e lise celular para produzir um extrato viral. SCV301C foi positivamente selecionado por seleção de fármaco de Ecogpt usando tratamento de MXHAT de células BHK21 como descrito no Protocolo 6 de Smith (1993), exceto que 20 rodadas de purificação de placa por diluição limitada em 48WP foram realizadas para eliminar traços de VACV-COP parental como avaliado por análise PCR específica de A39R. Um clone candidato foi então amplificado em células BHK21 sem tratamento de MXHAT para produzir um estoque de semente de vírus do qual bateladas da SCV301C para estudos de vacinação foram derivadas. A sequência do genoma da SCV301C é dada em SEQ ID NO:3. Referências: Chakrabarti, S, Sisler, JR, and Moss, B (1997). Compact, synthetic, vaccinia virus early/late promoter for protein expression. Biotechniques 23: 1094-1097. Smith, GL (1993)In: Davison, AJ and Elliotand, RM (eds). Expression of genes by vaccinia virus vectors in "Molecular Virology a Practical Approach". IRL Press at Oxford University Press. Falkner, FG, and Moss, B (1988). Escherichia coli gpt gene provides dominant selection for vaccinia virus open reading frame expression vectors. J Virol 62: 1849-1854. Boyle, DB, and Coupar, BE (1988). A dominant selectable marker for the construction of recombinant poxviruses. Gene 65: 123-128.
[00109] A fim de construir SCV305, os cassetes de expressão de EGFP e Ecogpt precisam ser deletados da SCV301C para criar SCV302 uma cepa do vírus vaccínia Copenhagen recombinante que contém somente o cassete de expressão de poliproteína 26S de Chicungunha inserido no A39R ORF. Esse vírus foi construído deletando os cassetes de expressão repórteres de Ecogpt/EGFP da SCV301C por recombinação homóloga com pTC29 e contrasseleção com relação aos vírus com expressão do Ecogpt functional como mostrado a seguir na Figura 4.
[00110] pTC29 é um clone de plasmídeo que contém os braços de recombinação homóloga, A39R-F1 e SCV301C-F2, exigidos para a deleção dos cassetes de expressão de EGFP e Ecogpt da SCV301C por recombinação homóloga como mostrado na Figura 4. Os detalhes de sequência de pTC29 são dados em SEQ ID NO:4 e um Mapa de Plasmídeo é mostrado na Figura 5. Metodologia
[00111] Os cassetes de expressão do Ecogpt e EGFP foram removidos do SCV301C por uma recombinação homóloga e contrasseleção contra expressão do Ecogpt como descrito no protocolo 7 de Smith (1993) e publicado em Isaacs et. al (1990) por meio do qual os braços de recombinação homóloga foram projetados para ser homólogos às sequências que flanqueiam os cassetes de expressão do Ecogpt e EGFP dentro do genoma de VACV- CHIK recombinante. Após recombinação homóloga, SCV302 foi adicionalmente purificado na placa em uma linhagem celular hrpt- na presença de 6-tioguanina (6-TG) para coantrasselecionar contra vírus contaminantes que expressam Ecogpt, isto é, a SCV301C original. Referências Chakrabarti, S, Sisler, JR, and Moss, B (1997). Compact, synthetic, vaccinia virus early/late promoter for protein expression. Biotechniques 23: 1094-1097. Smith, GL (1993)In: Davison, AJ and Elliotand, RM (eds). Expression of genes by vaccinia virus vectors in “Molecular Virology a Practical Approach”. IRL Press at Oxford University Press. Falkner, FG, and Moss, B (1988). Escherichia coli gpt gene provides dominant selection for vaccinia virus open reading frame expression vectors. J Virol 62: 1849-1854. Boyle, DB, and Coupar, BE (1988). A dominant selectable marker for the construction of recombinant poxviruses. Gene 65: 123-128.
[00112] SCV305 foi construído removendo simultaneamente o D13L e B7R-B8R ORFs do SCV302 em uma única reação de recombinação homóloga com cassete de Recombinação Homóloga de Deleção (HR) de D13L (deleção de D13L com seleção de CP77/DsRed transdominante) e cassete de Recombinação Homóloga de Deleção (HR) de B7R-B8R (deleção de B7R-B8R com seleção transdominante de Ciano/Zeocina). Detalhes da configuração de cada cassete são mostrados nas Figuras 6 e 7 e detalhe da sequência são dados em SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO:6.Tabela 2: Tabela de Recurso de Cassete HR de Seleção de D13LTabela 3: Tabela de Recurso do Cassete HR de Deleção de B7R-B8R
[00113] A fim de selecionar quanto ao vírus com um Deleção de D13L, linhagens celulares que expressam proteína D13 foram usadas: CHO+D13 (linhagem celular CHO que expressa proteína D13) e CHO+D13+CP77 (linhagem celular CHO que expressa proteína D13 e CP77). O motivo para empregar duas tais linhagens celulares é que expressão de CP77 por vírus habilita propagação em células CHO e foi, portanto, usada como uma ferramenta de seleção positiva. A substituição do D13L ORF com o cassete de expressão de CP77/DsRed habilita amplificação de vírus deletado de D13L em células CHO-D13 que pode ser verificada por fluorescência vermelha de células infectadas. A fim de deletar o cassete repórter de CP77/DsRed após a deleção de D13L ser confirmada, recombinação intramolecular foi projetada para deletar esse cassete quando expressão viral de CP77 não foi mais exigida. Isso foi feito amplificando o vírus deletado de D13L em CHO+D13+CP77 que não apenas expressa a proteína D13, mas também a proteína CP77 tornando a CP77 expressa viral redundantes e permitindo sua remoção por recombinação intramolecular como exemplificado na Figura 4.
[00114] A fim de selecionar em relação a vírus com deleção de B7R- B8R, um cassete repórter fluorescente resistente a Zeocina/Ciano foi usado para substituir esses ORFs por recombinação homóloga. Inserção de cassete de Zeocina/Ciano foi positivamente selecionada cultivando a células em Zeocina durante infecção e selecionando células fluorescentes de ciano. Uma vez que a deleção de B7R-B8R foi confirmada, a remoção deste repórter por recombinação intramolecular foi iniciada na ausência de zeocina durante infecção como exemplificado na Figura 8.
[00115] A estratégia experimental para deletar simultaneamente D13L e B7R-B8R foi feita por (i) recombinação homóloga da SCV302 com D13L Cassete HR de deleção e B7R-B8R cassete HR em células CHO+D13, (ii) amplificação da SCV305 em células CHO+D13 tratadas com Zeocina, (iii) isolamento individualmente de células infectadas que cofluoresceram ciano e vermelho até que um duplo clone knockout foi isolado, e então (iv) iniciação de remoção de ambos os cassetes repórteres infectando células CHO+D13+CP77 sem tratamento com zeocina e isolando células infectadas não fluorescentes (com respeito a ciano e vermelho).
[00116] Clones identificados como sendo isentos de vírus contaminantes intermediários com os ORFs alvos deletados foram confirmados por PCR e análise de sequenciamento. A presença do cassete de expressão de CHIKV-26S no A39R ORF foi adicionalmente confirmado por análise PCR e de sequenciamento e proteínas de expressão de confirmada por análise western blot. Atenuação total da SCV305 foi verificada por um estudo de inefetividade em linhagens celulares permissivas do vírus vaccínia.
[00117] Cassetes HR tanto de Deleção de D13 HR quanto de Deleção de B7R-B8R foram sintetizados por GeneArt GmbH. Para gerar SCV305 (SCV-CHIK), o D13L ORF e B7R-B8R ORFs foram deletados do SCV302 por recombinação homóloga, no qual seleção positiva para deleções bem- sucedidas foi realizada por infecção de células CHO que expressam apenas a proteína D13 (CHO-D13) na presença de Zeocina. Em virtude de CHO ser não permissivo para infecção por VACV, seleção positiva para vírus deletado de D13L foi obtida substituindo o D13L ORF com um cassete de expressão que codifica para proteína CHO do vírus da varíola bovina da gama de hospedeiros CP77. Um plasmídeo de recombinação homóloga foi construído que consistiu de um cassete de expressão de CP77 e um cassete de expressão de proteína fluorescente dsRed flanqueado por braços esquerdo e direito de recombinação que foram homólogos às sequências que flanqueiam o D13L ORF no SCV302. O cassete de expressão de dsRed foi adicionado, em virtude de CP77 que expressa VACV não formar placas líticas em CHO; portanto, infecção foi monitorada pela presença de fluorescência vermelha. Para ajudar na remoção dos cassetes de expressão de CP77 e dsRed que substituíram o D13L ORF e o cassete de expressão de AmCyanZeo que substituiu os B7R- B8R ORFs, uma sequência de repetição do braço esquerdo de recombinação homóloga foi colocada à jusante dos cassetes de expressão de CP77 e dsRed e à jusante do cassete de expressão de AmCyanZeo, mas à montante do braço direito de recombinação homóloga em ambos os cassetes de recombinação homóloga. Recombinação homóloga foi realizada transfectando os cassetes de recombinação homóloga que deletam D13L e B7R-B8R em CHO-D13 previamente infectada com VACV-CHIK a um MOI de 0,01 PFU/célula. SCV305 foi enriquecido pela infecção de recombinação homóloga amplificando o vírus em CHO-D13 tratado com Zeocina, seguido por infecção um conjunto fresco de células CHO-D13 tratadas com Zeocina com o vírus amplificado. Essas células infectadas foram recuperadas e produzidas em uma suspensão de única célula por digestão TrypLE Select (Thermo Fisher Sientific) e então de única célula classificada de maneira que uma célula fluorescente vermelho e ciano foi semeada em 1 poço de um poço de 96 placas contendo células CHO-D13 cultivadas tratadas com Zeocina usando um citômetro de fluxo FACSAria Fusion (BD Biosciences). O poço de 96 placas semeada com célula fluorescente vermelho/ciano foi então incubado a 37 °C/5% CO2 até focos fluorescentes vermelho e ciano de infecção poderem ser vistos em qualquer dos poços da placa de 96 poço. Poços contendo um único foco de infecção foram colhidos e ressuspensos como suspensões de única célula antes de classificar e semear a única célula na placa de 96 poços de células CHO-D13 frescas tratadas com Zeocina. Este processo de classificação de única célula foi repetido cinco vezes para eliminar contaminação traço com a SCV302 original e produzir SCV305 clonal. Inúmeros SCV305 candidatos clonalmente purificados foram amplificados em células CHO-D13 tratadas com Zeocina e então testados por análise PCR quanto a presença da SCV302 contaminante e para confirmar substituição de D13L pelos cassetes de expressão de CP77 e dsRed e substituição do B7R- B8R com cassete de expressão de AmCyanZeo. O melhor clone foi então amplificado na linhagem CHO+D13+CP77 (que expressa proteínas tanto de CP77 quanto de D13) para encorajar recombinação intramolecular entre as sequências de recombinação homóloga esquerda e as sequências de repetição, em virtude de a dependência da expressão viral de CP77 não ser mais exigida e a necessidade da expressão de proteína resistente a Zeocina não ser mais exigida na ausência de Zeocina, resultando na deleção dos cassetes de expressão de CP77 e dsRed e do cassete de expressão de AmCyanZeo do SCV305. As células CHO+D13+CP77 infectadas foram colocadas em suspensão de única célula por digestão com TrypLE Select e célula classificada usando um citômetro de fluxo FACSAria Fusion, no qual células não fluorescentes foram classificadas em massa e retidas. O vírus SCV305 foi adicionalmente amplificado para produzir estoque de semente por infecções de células CHO+D13+CP77 ampliadas progressivas. Toda a sequência genômica da SCV305 é dada em SEQ ID NO:7.
[00118] SCV1002 é uma vacina contra o vírus de Chicungunha e da Zica multivalente vetorizada simples que consiste dos seguintes recursos: • Substituição do A39R ORF com um cassete de expressão subgenômico da SCV-CHIKV-26S- (CHIKV-26S) • Substituição do B7R-B8R ORFs com cassete de expressão da SCV-ZIKV-prME • Deleção do D13 ORF
[00119] SCV1002 foi construída substituindo os B7R-B8R ORFs da SCV302 com um cassete de expressão de poliproteína prME do vírus da Zica e deletando o D13L ORF. Os detalhes de sequência do cassete de expressão de prME dos vírus da Zica são dados em SEQ ID NO:8 onde a origem da sequência prME foi tomada da cepa brasileira ZikaSPH2015 (Genbank: KU321639). Um cassete de recombinação homóloga (HR) de ZIKV-prME foi sintetizado por GeneArt como mostrado na Figura 10 onde os detalhes de sequência são dados em SEQ ID NO:9.Tabela 4: Tabela de Recurso do Cassete HR de ZIKV prME
[00120] SCV1002 (SCV-CHIK/ZICA) foi construída substituindo o B7R-B8R ORF com um cassete de expressão de poxvírus para ZIKV prME (brasileiros isolaram ZikaSPH2015, Genbank: KU321639) e deletando o D13L ORF por recombinação homóloga. Para inserção do cassete de expressão de ZIKV prME substituindo os B7R-B8R ORFs, um cassete de recombinação homóloga foi sintetizado por GeneArt GmbH consistindo dos elementos seguintes: (i) recombinação homóloga F1 que alveja sequências à montante do gene B7R, (ii) um cassete de expressão consistindo de um promotor precoce/posterior do vírus vaccínia operacionalmente ligado a uma sequência de codificação de proteína para uma fusão de proteína fluorescente azul com proteína resistente a Zeocina (BFPzeo) e terminando com uma sequência de parada transcricional precoce de poxvírus, (iii) uma repetição do braço de recombinação homóloga F1, (iv) um cassete de expressão que consiste de um promotor precoce/posterior do vírus vaccínia operacionalmente ligado a uma sequência de codificação de proteína para ZIKV prME seguido por uma sequência de parada transcricional precoce de poxvírus e finalmente (v) recombinação homóloga F2 que alveja sequências à jusante do gene B8R. O D13L ORF foi removido como descrito na construção da SCV305 (SCV-CHIK).
[00121] Recombinação homóloga foi realizada transfectando tanto o cassete HR de ZIKV prME quanto Deleção de D13L HR nas células CHO+D13 previamente infectadas com SCV302 a um MOI de 0,01 PFU/célula. A SCV1002 resultante foi enriquecida pela infecção de recombinação homóloga amplificando o vírus em células CHO+D13 na presença de Zeocina (ThermoFisher Scientific) seguido por uma segunda infecção de um conjunto fresco de células CHO+D13 na presença de Zeocina com vírus amplificado. Essas células infectadas foram recuperadas e produzidas em uma suspensão de única célula por digestão TrypLE Select e então única célula classificada de maneira que uma única célula fluorescente azul e vermelho foi semeada em uma placa de um poço de 96 placas contendo células CHO+D13 usando citômetro de fluxo FACSAria Fusion (BD Biosciences). Após incubação na presença de Zeocina, poços contendo um único foco fluorescente azul e vermelho de infecção foram colhidos e ressuspensos como suspensões de única célula antes de classificação e semeadura de única célula nas placas de 96 poços de células CHO+D13 frescas. Essa classificação e cultivo de única célula na presença de Zeocina foram repetidas cinco vezes para eliminar contaminação traço com a SCV302 original e produzir SCV1002 clonal. Diversas SCV1002 clonalmente purificada foram amplificadas em células CHO+D13+CP77 na ausência de Zeocina e foram então sujeitas a análise PCR para confirmar inserção de ZIKV prME no locus B7R-B8R, retenção do cassete de expressão de CHIK no locus A39R, e ausência da SCV302 contaminante. Clones foram amplificados em células CHO+D13+CP77 na ausência de Zeocina para encorajar recombinação intramolecular entre a sequência de recombinação homóloga F1 e a sequência de repetição F1 resultando na deleção de cassetes de expressão tanto de BFPzeo quanto de DsRed/CP77. Suspensões de única célula dessas culturas foram classificadas em massa (FACSAria) e células não fluorescentes retidas. A PCR foi repetida para confirmar retenção de insertos e perda de BFPzeo, DsRed/CP77 e deleção do D13L ORF. Estoques de vacina SCV1002 foram preparados em células CHO-D13+CP77 e titulados. A sequência de todo o genoma da SCV1002 é dada em SEQ ID NO:10.
[00122] Grupos de camundongos C57BL/6 fêmeas de 6 a 8 semanas de idade (n=5 camundongos por grupo) foram vacinados i.p. com SCV305 (105, 106, 107 PFU) ou sham vacinados com PBS. Níveis de IgG específicos de vírus anti vaccínia determinados por ELISA ponto-final. Observou-se que vacinação com SC305 provê tituladores de anticorpo viral anti-vaccinia específicos substanciais que foram similares aos obtidos com vacinação de um vírus vaccínia de dose similar (VACV).
[00123] Após quatro semanas, camundongos foram desafiados com uma dose letal (50 LD50) de vírus da varíola de camundongo, Ectromelia (ECTV). ECTV é altamente infeccioso para camundongos e causa os mesmos sintomas em camundongos que a varíola causa em humanos.
[00124] Camundongos vacinados com 107, 106, e 105 PFU SCV305 ou 105 PFU VACV exibiram níveis similares de proteção contra perda de peso, sintomas clínicos, e mortalidade. Disseminação de ECTV para múltiplos órgãos foi também prevenida em todos os camundongos vacinados. Esses resultados ilustram que uma única vacinação com SCV305 provê proteção completa de um desafio de poxvírus letal, sugerindo que a SCV retém utilidade como uma vacina contra varíola.Uma única vacinação com SCV305 produz respostas ao anticorpo do vírus anti-chicungunha robustas e duráveis
[00125] Anticorpos são considerados críticos para proteção contra vírus da chicungunha (CHIKV), com anticorpos de humano e camundongo direcionados às glicoproteína superficial E2 de CHIKV mostrou mediar proteção. Aos camundongos foi dada uma dose única de vacina (105, 106 e 107 PFU da SCV-CHIK) e respostas a IgG específico de CHIKV E2 foram examinadas por ELISA. Um aumento dependente da dose e do tempo em níveis de IgG específicos de CHIKV-E2 foi observado, com camundongos dados 107 PFU mostrando cinética e magnitude de respostas a anticorpo similares às induzidas por camundongo vacinados com VACV-CHIK competente de replicação. Isso ilustrou que a vacina SCV305 inefetiva para multiplicação foi capaz para gerar respostas a anticorpo comparáveis a um imunógeno recombinante como vacina VACV-CHIK competente para multiplicação.
[00126] Respostas a anticorpo neutralizantes foram detectadas em 4/6 camundongos que recebem 105 PFU da vacina SCV305, enquanto que todos os 6 camundongos que recebem 106 PFU e 107 PFU da vacina SCV305 geraram respostas a anticorpo neutralizantes.
[00127] Níveis de IgG1 e IgG2c específicos de CHIKV foram examinados em soro de camundongos dia 30 pós-vacinação para prover uma indicação do ‘equilíbrio de Th1/Th2’ das respostas ao anticorpo. A 107 PFU, SCV305 estimulou respostas a IgG2c comparáveis àquelas induzidas por VACV-CHIK. Entretanto, SCV305 induziu maiores respostas a IgG1 do que VACV-CHIK, sugerindo a geração de uma resposta a Th1 (IgG2c) / Th2 (IgG1) mais equilibrada por SCV-CHIK, com VACV-CHIK sendo mais predisposta a Th1.
[00128] Para analisar a longevidade de respostas ao anticorpo induzido pela vacina SCV-CHIK, respostas ao anticorpo anti-CHIKV foram examinadas a 4 semanas, 6 meses e 1 ano pós-vacinação. Uma queda limitada em níveis de anticorpo anti-CHIKV foi observada neste período de tempo, com níveis de anticorpo permanecendo comparáveis entre camundongos vacinados com SCV305 e VACV-CHIK completamente. Além do mais, células secretoras de anticorpo específico de CHIKV E2 (ASC) e células produtoras de IFN-y específicas de CHIKV E2 / E1 e de capsídeo foram detectadas a 1 ano pós-vacinação em camundongos vacinados com SCV305 e VACV-CHIK.
[00129] O modelo de desafio de vacinação-CHIKV foi pilotado demonstrando que camundongos vacinados com VACV-CHIK (107 PFU) e desafiados com CHIKV (isolado de Reunion Ilha; LR2006-OPY1, 104 CCID50) foram completamente protegidos contra viremia e artralgia. Uma vez que a vacina SCV-CHIK induziu respostas ao anticorpo neutralizante comparáveis a VACV-CHIK na mesma dose de 107 PFU, a eficácia protetora da vacina SCV305 foi avaliada a doses menores (105 e 106 PFU). Camundongos vacinados com SCV305 a 106 PFU e desafiados 40 dias mais tarde (com o isolado da Reunion Ilha; LR2006-OPY1, 104 CCID50) não mostraram viremia ou inchaço no pé detectável. Camundongos vacinados com uma dose 10 vezes menor (105 PFU) foram parcialmente protegidos, com uma redução 4-log aproximada em viremia e inchaço no pé significativamente reduzido comparado com camundongos infectados com VACV de controle. Estudos de longevidade confirmaram que camundongos vacinados com SCV305 foram protegidos contra desafio de CHIKV um ano pós-vacinação.
[00130] A persistência de RNA genômico de CHIKV, particularmente nos tecidos da junta foi associada com doença de atrite crônica depois de infecção por CHIKV em humanos e no modelo de camundongo. A 30 dias pós-desafio, camundongos vacinados com 106 PFU da vacina SCV305, mostraram uma redução significante para níveis de fundo no nível de RNA viral persistente, ilustrando que vacinação com SCV305 pode prevenir estabelecimento de RNA de CHIKV persistente em tecidos da junta.
[00131] Consideradas juntas, essas verificações demonstram a capacidade da vacina SCV305 elicitar uma resposta a anticorpo específica de CHIKV robusta, equilibrada e durável, e prover proteção contra viremia, artrite aguda, e persistência de RNA viral depois do desafio de CHIKV. EXEMPLO 3
[00132] Durante combinação de diferentes vacinas virais atenuadas vivas, competição entre os vírus é o problema mais frequentemente observado. Ela pode ser evitada aumentando a dose da vacina de combinação ou ajustando a dosagem de cada componente da vacina para superar competição dos componentes da(s) vacina(s) dominante(s).
[00133] Competição antigênica por ‘interferência imunológica’ foi reportada entre componentes da vacina contra difteria-pertussis-tétano trivalente, entre bacterinas de cinomose canina e vírus vivo de cinomose canina e quando Bordatella é usado como um diluente para vírus vivo de cinomose de combinação, vacinas contra vírus adenovírus tipo 2, parvovírus e parainfluenza (Hunt et al, 2001). Nesses exemplos, inoculação com a vacina multicomponentes elicita menos anticorpo do que quando os componentes são administrados sozinhos. Em alguns casos, a resposta a um antígeno domina, enquanto as respostas a outros são suprimidas. Em outros casos, onde competição mútua ocorre, a resposta a todos os componentes é reduzida.
[00134] O grau de competição antigênica mostrou ser dependente de inúmeros parâmetros de vacinação, incluindo os sítios relativos de inoculação dos antígenos competentes, o intervalo de tempo entre administração dos antígenos e a dose do antígeno dominante com relação ao antígeno suprimido.
[00135] Mesmo que o exposto possa ser resolvido expressando os antígenos de imunização de diversos agentes causadores de doença do mesmo vetor, por meio disso assegurando representação igual de cada antígeno de imunização ao sistema imune e com um único vetor para dispensação de antígeno apenas pela via ideal de vacinação para o único vetor que precisa ser considerado, existe o risco de que interferência de antígeno possa ocorrer por captura de antígeno preferencial e apresentação de MHC por células que apresentam antígeno tais como células B e células dendríticas. Um antígeno com epítopos da célula B e ou célula T domina produzirá uma resposta imune mais forte do que um antígeno que tem epítopos da célula B e ou célula T subideais. Portanto, isso levaria a uma resposta imune tendenciosa para o antígeno mais dominante quando vacinados com um único vetor que expressa múltiplos antígenos de múltiplos agentes causadores de doença. Espera-se que um antígeno expresso de um vetor que também expressa outros antígenos de outras doenças, por exemplo, antígeno de chicungunha expresso junto com antígeno do vírus da Zica, pode não produzir uma resposta de imunização tão forte quanto um vetor de imunização que expressa apenas o antígeno de chicungunha.
[00136] Um estudo foi realizado para determinar se a expressão de múltiplos antígenos dominantes de múltiplos vírus causadores de doença interferirá na resposta imune um do outro. Por exemplo, proteína E2 de chicungunha é muito potente no estímulo de uma resposta neutralizante muito boa a anticorpo que pode neutralizar infecção por chicungunha. Igualmente, proteína A do vírus da Zica também estimula uma resposta neutralizante potente a anticorpo para neutralizar a infecção por vírus da Zica. Entretanto, expressão desses dois antígenos dominantes do mesmo vetor pode interferir na capacidade um do outro para estimular uma resposta imune potente a seus respectivos vírus, isto é, um antígeno dominante pode ter mais dominância sobre o outro.
[00137] Para determinar se expressão de múltiplos antígenos dominantes do mesmo vetor não é detrimental no estímulo de respostas imunes ideais comparada com a expressão de cada antígeno dominante vetorizada simples, um estudo de vacinação em camundongos foi realizado comparando SCV1002 (vacina contra CHIK/ZICA) com SCV305 (vacina contra CHIK) com respeito ao estímulo de anticorpos de neutralização específicos de chicungunha.
[00138] Camundongos C57BL/6 tipo selvagem e camundongos deficientes de receptor de interferon (IFNAR) fêmeas foram vacinados uma vez tanto com a vacina contra CHIKV/ZIKV vetorizada simples (SCV1002), CHIKV apenas (SCV305) quanto controle de vetor vazio (SCV105) em grupos de 6 camundongos por grupo de tratamento. Todos os grupos de tratamento receberam 106 pfu/camundongos de vacina por meio de injeções intraperitoneais e sangrados a 2 e 4 semanas pós-vacinação. Todos os camundongos foram desafiados a 6 semanas pós-vacinação.
[00139] Níveis de anticorpos de neutralização são frequentemente usados como correlação de proteção. Portanto, os níveis de anticorpos de neutralização foram calculados antes do desafio em todos os grupos de vacina, ZIKV/CHIKV (SCV1002), CHIKV apenas (SCV305) ou controle de vetor vazio (SCV105) usando um ensaio de microneutralização padrão em células Vero contra a cepa de Reunion de chicungunha. Resumidamente, soros foram inativados termicamente (56 ◦C por 30 min) soro de cada camundongo foi diluído em série em duplicata em placas de 96 poços e incubado com 100 CCID50 unidades de vírus e incubação por 1 hora a 37°C. Após essa etapa de neutralização, as células Vero recém-divididas foram sobrepostas (104 células por poço) na mistura de soro/vírus e incubadas por 5 dias até efeitos citopáticos ficarem visualizados em um microscópio. A diluição de soro dando 100% de proteção contra efeito citopático foi determinada usando manchamento com violeta cristalino.
[00140] Ambas as vacinas candidatas que expressam antígenos de CHIKV não induziram anticorpos de neutralização contra vírus da chicungunha após uma única administração de vacina.
[00141] Entretanto, uma única administração da vacina contra CHIK/ZICA vetorizada simples induz níveis muito maiores de anticorpos de neutralização de CHIKV apesar de doses equivalentes usadas para vacinação. Conclusão
[00142] Este estudo de vacinação mostrou que quando camundongos foram vacinados com uma única aplicação de doses equivalentes da SCV305 (apenas vacina contra CHIK) e SCV1002 (vacina contra CHIK/ZICA vetorizada simples) a vacina vetorizada simples (SCV1002) deu melhores respostas neutralizantes específicas de chicungunha ao anticorpo. Isso foi inesperado já que percebeu-se que expressão do outro antígeno dominante, isto é, a proteína A do vírus da Zica competiria com respostas imunes e assim amortecer ou mesmo eliminar a resposta imune a ambos os antígenos dominantes de Chicungunha (antígeno E2 os anticorpos neutralizantes alvos) e Vírus da zica (antígeno E os anticorpos neutralizantes alvos). Isto não parece ser o caso e pode ser considerado que expressão do antígeno do vírus da Zica teve um efeito adjuvante para ajudar a aumentar a resposta imune aos antígenos de chicungunha que são esperados para VLPs de chicungunha mediante vacinação.
[00143] As principais complicações de um surto do vírus da Zica em progresso nas Américas e Ásia são defeitos congênitos causados pela capacidade do vírus de cruzar a placenta e infectar o cérebro fetal. Setoh et al (2017, De Novo Generation and Characterization of New Zika Virus Isolate Using Sequence Data from a Microcephaly Case. mSphere 2:e00190-17. https://doi.org/10.1128/mSphereDirect.00190-17) descreve um modelo de camundongo onde cepa de ZIKV-Natal pode ser usada para estabelecer um modelo de infecção do cérebro fetal em camundongos IFNAR -/- (incluindo restrição de crescimento intrauterino) sem causar infecções sintomáticas nas fêmeas.
[00144] O objetivo desse estudo foi mostrar que vacinação prévia de camundongos fêmeas com SCV1002 (ZICA/CHIK vetorizada simples) antes da prenhez pode disponibilizar proteção contra infecção por vírus da Zica de seus fetos por nascer.
[00145] Este estudo foi realizado vacinando IFNAR -/- fêmea com tanto com SCV1002 (vacina contra CHIK/ZICA vetorizada simples) quanto SCV105 (apenas vetor) seguido conjugando com camundongo IFNAR macho. Camundongos prenhes foram então infectados com cepa do vírus da Zica-natal como descrito por Setoh et al (2017). Programa de vacinação: • Camundongos deficientes de receptor de interferon fêmeas de seis a oito semanas (IFNAR -/-) foram vacinados uma vez por meio da via intramuscular tanto com a vacina vetorizada simples, ZIKV/CHIKV (SCV1002) quanto com a vacina de controle vazia (SCV105) na semana 0 a 106 por camundongo • Grupos de camundongo foram sangrados a 4 semanas pós- vacinação para verificar quanto a seroconversão na vacina • A 6 semanas pós-vacinação, acasalamento sincronizado foram iniciados para induzir prenhez em camundongos vacinados. Camundongos fêmeas foram verificados diariamente quanto a evidência da prenhez bem sucedida (tampões vaginais) • No dia 6.5 embriônico, camundongos prenhes foram infectados com cepa de Zica Natal a 104 CCID50 unidades por meio de infecção subcutânea • Após a infecção, camundongos prenhes foram sangrados diariamente entre dias 1 a 5 para verificar quanto a viremia • No dia 17.5 embriônico, camundongos prenhes foram separados, placenta maternal e cabeças fetais colhidos para avaliar quanto a ZIKV infeccioso como descrito por Setoh et al (2017).
[00146] Camundongos fêmeas prenhas previamente vacinadas com SCV1002 (vacina contra CHIK/ZICA) antes de ficar prenhes foram capazes de prevenir replicação do vírus da Zica durante desafio com vírus da cepa de Zica Natal como mostrado por nenhuma detecção de viremia pós-desafio. Entretanto, como previsto, os camundongos vacinados com SCV105 (SCV apenas vetor) não foram capazes de prevenir replicação viral com vírus da Zica como mostrado pelo alto nível de viremia visto nos primeiros 5 dias após desafio.
[00147] Camundongos fêmeas que foram previamente vacinados com uma única aplicação da SCV1002 (vacina contra CHIK/ZICA) antes de acasalamento e prenhez não mostraram níveis detectáveis do vírus da Zica após o desafio em suas placentas e nos cérebros dos fetos. Vacinação previne vírus de desafio de infectar a placenta e assim procedendo bloqueou a transmissão para frente do vírus da Zica para os fetos vulneráveis.
[00148] Entretanto, isso não foi o caso para camundongos fêmeas previamente vacinadas com apenas vetor SCV onde após desafio durante prenhez algumas das placentas ficam infectadas e transmissão do vírus da Zica infecções a alguns dos cérebros dos fetos ocorreu.
[00149] Camundongos fêmeas prenhes previamente vacinados com uma única aplicação de vacina contra CHIK/ZICA vetorizada simples foram protegidos de um desafio de ZIKV comparado com a vacina de controle como mostrado pelos resultados de viremia.
[00150] Vacinação das mães antes da prenhez proporcionou proteção sua aos fetos por nascer impedindo que o vírus de desafio do vírus da Zica infecte a placenta maternal e bloqueando transmissão avançada ao cérebro fetal.
[00151] Esses resultados demonstram neste modelo preclínico que transmissão para frente do vírus de desafio da Zica ao feto pode ser bloqueada por vacinação anterior da mãe antes da prenhez.
[00152] Chicungunha (CHIKV) pertence ao grupo Alfaviruses onde um outro membro deste grupo é Vírus Ross River (RRV). RRV, é endêmico nas partes norte e central da Austrália bem como nas regiões do Pacífico. RRV e CHIKV são transmitidos por mosquitos e podem causar tanto poliartrite quanto levar a infecções persistentes em humanos. Entretanto, os vetores de mosquito para vírus da chicungunha são Aedes aegypti e Aedes albopictus enquanto que os principais vetores de mosquito para Vírus Ross River são dois mosquitos procriados charco salino Aedes camptorhynchus e Aedes vigilax e o mosquito procriado em água doce Culex annulirostris.
[00153] Um estudo de vacinação em uma cepa de camundongos (IRF3/7 knockout) que é letalmente suscetível a RRV foi realizado para determinar se o antígeno de vacina contra chicungunhas da SCV1002 poderia proporcionar total proteção contra um desafio letal com RRV seis semanas pós-vacinação com SCV1002 (vacina contra CHIK/ZICA).
[00154] Esse estudo de vacinação e desafio foi realizado em camundongos knockout IRF3/7 que são suscetíveis a infecção tanto por chicungunha quanto por Vírus Ross River onde a infecção com esses vírus é letal nessa cepa de camundongos.
[00155] Dois grupos de camundongos IRF3/7-/- onde tanto vacinação com uma única aplicação de 106 pfu por camundongo da SCV1002 (vacina contra CHIK/ZICA vetorizada simples) quanto SCV105 (apenas vetor SCV) por meio de via intramuscular.
[00156] A 6 semanas pós-vacinação todos os camundongos tiveram desafio com 104 CCID50 de Vírus Ross River (cepa TT) por meio de via subcutânea no topo dos pés como descrito por Rudd et al (2012).
[00157] Sobrevivência de desafio foi monitorada por 30 dias pós- desafio. Camundongos foram eutanizados quando os sintomas clínicos atingiram eticamente pontos finais definidos (como descrito em Rudd et al (2012) Interferon Response Factors 3 and 7 Protect against Chikungunya Virus Hemorrhagic Febre and Shock. J. Virol., 86 (18): 9888-9898)). Resultados
[00158] Observou-se que vacinação de IRF3/7-/- com SCV1002 mas não SCV105 provê total proteção de letal de desafio RRV. Isso demonstra que vacina SCV-CHIK/ZIKV (SCV1002) é protetiva cruzada para outros vírus no gênero Alfavírus.
[00159] Grupos de 6 camundongos fêmeas adultos de >6 semanas de idade foram injetados com 106 pfu/camundongos da SCV1002, SCZ305 ou SCV105 (vetor vazio SCV) por meio de injeção intraperitoneal. Camundongos foram monitorados quanto a qualquer efeito adverso após a vacinação.
[00160] Seis semanas pós-vacinação, grupos de camundongos foram desafiados com 103 CCID50/camundongos de cepa MR766 da Zica Africana adaptada aos camundongos por meio de injeção subcutânea na base da cauda.
[00161] Seis semanas pós-desafio do vírus da Zica, grupos de camundongos sobreviventes foram desafiados com 104 CCID50/camundongos da cepa de La Reunion do vírus da chicungunha (LR2006-OPY1) por meio de injeção subcutânea no topo do pé.
[00162] Camundongos vacinados com SCV1002 (vacina CHIK+ZIK vetorizada simples) foram totalmente protegidos pelo desafio do vírus da Zica, entretanto, camundongos vacinados com SCV305 (apenas vacina contra CHIK) e SCV105 (apenas vetor) todos sucumbiram à infecção por vírus da Zica no dia 9 após infecção.
[00163] Camundongos IFNAR -/-vacinados com SCV1002 (vacina CHIK+ZIK vetorizada simples) que foram primeiro desafiados com ZIKV e sobreviveram foram parcialmente protegidos, isto é, 33% de eficácia, contra um desafio extremamente letal com CHIKV que foi capaz de exterminar todos os camundongos não vacinados no dia 3 após o desafio.
[00164] Vacinação com SCV1002 de camundongos INFAR-/- com uma dose única a 106 pfu/camundongos proporcionou total proteção contra um desafio letal com uma cepa do vírus da Zica adaptada aos camundongos.
[00165] Camundongos sobreviventes subsequentemente desafiados com uma dose extremamente letal de CHIKV foram parcialmente protegidos, isto é, a vacina SCV1002 teve 33% de eficácia nesse modelo de camundongo quanto a infecção por CHIKV a 104 unidades infecciosas por camundongo. A dose de desafio de 104 infecciosos foi muito alta para este modelo de camundongo imune comprometido que não tem os receptores de interferon e assim foi incapaz de responder a interferon em um modo antiviral. A produção de interferons antivirais normalmente controlaria a infecção inicial enquanto a resposta imune adaptativa tem tempo de reagir à infecção viral invasora. Em percepção tardia essa dose para desafiar CHIKV neste modelo de camundongo foi muito alta uma vez que ela exterminou todos os camundongos não vacinados em 3 dias - um quadro de tempo muito curto para resposta anamnéstica antiviral a anticorpo ocorrer a fim de controlar e limpar a infecção viral invasora. Na situação antiviral, interferons naturais controlariam a infecção viral inicial longa o bastante para a resposta imuno adaptativa assumir o controle e neutralizar e limpar a infecção do hospedeiro. Apesar do nível não naturalmente alto de virulência de CHIKV em camundongos IFNAR, onde camundongos não vacinados foram exterminados no dia 3 após infecção com uma dose de 104 unidades infecciosas, vacinação com SCV1002 foi inesperadamente capaz de proporcionar alguma proteção nessa condição extrema destacando assim a alta potência imunogênica dessa vacina.
[00166] O objetivo deste estudo foi avaliar interferência de antígeno ou pecado original antigênico no contexto de infecção natural. Uma infecção natural prévia com vírus da chicungunha afetaria a indução de respostas imunes a vírus da Zica enquanto vacina induziu respostas intensificadoras a chicungunha ocorre após a vacinação com SCV1002 (vacina SCV- CHIK/ZICA).
[00167] Camundongos C57BL/6 tipo selvagem foram infectados com vírus da chicungunha, deixados depurar o vírus e então intensificados com a vacina contra CHIKV/ZIKV vetorizada simples. Camundongos foram sangrados antes do reforço da vacina e 4 semanas após vacinação para avaliar níveis de respostas a anticorpos anti-CHIKV e anti-ZIKV.
[00168] Grupos de 6 camundongos fêmeas adultos de > 6 semanas de idade foram injetados com 104 CCID50/camundongos da cepa de La Reunion do vírus da chicungunha (LR2006-OPY1) por meio de infecção subcutânea no topo do pé. Camundongos foram monitorados quanto a qualquer efeito adverso após a infecção e foram sangrados a 8 semanas após a infecção, antes da vacinação.
[00169] Oito semanas pós-infecção, camundongos foram intensificados com vacina contra CHIKV/ZIKV vetorizada simples (SCV1002) com 106 pfu/camundongos dispensados intraperitonealmente. Camundongos foram monitorados quanto a qualquer efeito adverso após a vacinação e quatro semanas após vacinação, camundongos foram sangrados novamente para comparar níveis de anticorpos anti-CHIKV e anti-ZIKV antes e após vacinação.
[00170] Vacinação com SCV1002 de camundongos tipo selvagem previamente expostos a infecção por CHIKV foi considerada induzir anticorpos anti-ZIKV a níveis similares vistos previamente sem infecção por CHIKV.
[00171] Pecado original antigênico é um fenômeno por meio do qual exposição a um antígeno pode inibir a capacidade de um segundo antígeno induzir uma resposta imune protetora. Sugere-se que o mecanismo por trás desse conceito envolva células B iniciadas no primeiro antígeno que são programadas para responder apenas ao primeiro antígeno. Quando um segundo antígeno é introduzido, essas células B essencialmente removem o segundo antígeno antes de uma resposta imune produtiva poder ser gerada, levando a imunidade muito baixa ou fraca. Este conceito foi testado neste estudo.
[00172] Entretanto, já que camundongos previamente infectados com vírus da chicungunha e então vacinados com vacina contra CHIKV/ZIKV foram capazes de induzir respostas imunes a CHIKV e ZIKV produtivas e similares àquelas vistas sem infecção anterior por CHIKV, pecado original antigênico não está em jogo neste ambiente. Isso é mais provável em virtude de CHIKV e ZIKV serem muito diferentes dos vírus vindos de duas famílias de vírus distintas. Esses dados sugeririam que a vacina dupla poderia ser usada em países com circulação anterior conhecida de CHIKV.
[00173] Vírus da Zica continua o único vírus transmitido por mosquito que pode também ser transmitido sexualmente. Vírus da Zica pode ser transmitido de macho para fêmea ou macho para macho e o vírus mostrou persiste em sêmen por até diversos meses após o início de ação de sintomas.
[00174] O objetivo deste estudo foi mostrar que vacinação com SCV1002 (ZICA/CHIK vetorizada simples) pode disponibilizar proteção contra infecção por vírus da Zica em camundongos machos.
[00175] Este estudo foi realizado vacinando IFNAR -/- macho tanto com SCV1002 (vacina contra CHIK/ZICA vetorizada simples) quanto com SCV105 (apenas vetor) seguido por infecção com cepa do vírus da Zica-natal como descrito por Setoh et al (2017) (De Novo Generation and Characterization of New Zika Virus Isolate Using Sequence Data from a Microcephaly Case. mSphere 2:e00190-17. https://doi.org/10.1128/mSphereDirect.00190-17).
[00176] Camundongos machos deficientes de receptor de interferon (IFNAR -/-), entre 6 - 8 semanas de idade foram vacinados por meio da via intramuscular tanto com a vacina vetorizada simples, ZIKV/CHIKV (SCV1002) quanto com a vacina de controle vazia (SCV105) na semana 0 a 106PFU por camundongo.
[00177] Grupos de camundongos foram sangrados a 4 semanas pós- vacinação para verificar quanto a seroconversão na vacina. A 6 semanas pós- vacinação, camundongos machos foram infectados com cepa de Zica Natal a 104 CCID50 unidades por meio de infecção subcutânea. Após a infecção, camundongos foram sangrados diariamente entre os dias 1 a 5 para verificar quanto a viremia
[00178] No dia 21 pós-infecção camundongos foram separados, testes foram colhidos para avaliar ZIKV RNA usando PCR em tempo real quantitativo usando oligonucleotídeos iniciadores que alvejam o gene prM. RNA foi extraído usando Trizol (Life Technologies) seguindo as instruções do fabricante. cDNA foi sintetizado usando a supermistura de transcriptase reversa Biorad iScript seguindo as instruções do fabricante. Tempo real quantitativo foi realizado usando o kit de supermistura verde Biorad iTaq Universal Sybr. Resultados de PCR em tempo real foram quantificados com ralação aos níveis do gene de manutenção RPL13.
[00179] Camundongos machos vacinados com SCV1002 (vacina contra CHIK/ZICA) não foram capazes de replicar vírus da Zica depois do desafio com vírus da cepa de Zica Natal como mostrado por detecção mínima de viremia pós-desafio. Entretanto, como previsto, os camundongos vacinados com SCV105 (apenas vetor SCV) foram capazes de replicar vírus da Zica como mostrado pelo alto nível de viremia visto nos primeiros 3 dias após desafio.
[00180] Vacinação com SCV1002 (CHIK/ZICA) foi também capaz de reduzir a quantidade de RNA viral visto em testes no Dia 21 comparado com camundongos vacinados com a vacina de controle, SCV105. BIBLIOGRAFIA Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Research 25:3389-3402 Ausubel et al. (1999) Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 47), John Wiley & Sons, New York Boshart et al. (1985) Cell 41:521 Brooks et al. (1995) J. Virol. 69(12):7688-7698 Dijkema et al. (1985) EMBO J. 4:761 Drillien R, et al. (1978) J Virol. 28(3):843-50 Gorman et al., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777 Ham RG. (1965) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53: 288-293 Hsiao JC, et al. (2006) J. Virol. 80(15):7714-28 Kibler et al. (2011) PLOSONE 6(11) Meisinger-Henschel et al. (2007) J. Gen. Virol. 88(12):3249- 3259 Murphy et al. (1995) Virus Taxonomy Springer Verlag:79-87 Puck TT, et al. (1958) J. Exp. Med. 108:945-956 Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, Plainsview, N.Y. Shisler et al. (2004) J. Virol. 78(7):3553-3560 Spehner D, et al. (1988) J Virol., 62(4):1297-1304 Werden SJ, et al. (2008) Chapter 3: Poxvirus Host Range Genes. In: Advances in Virus Research, 71
Claims (11)
1. Composição para aumentar uma resposta imune em animal que diminui o risco de infecção por vírus da Zica e infecção por varíola, caracterizada pelo fato de que a composição compreende um carreador farmaceuticamente aceitável e um poxvírus atenuado, em que o genoma do poxvírus compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica a poliproteína PrME do vírus da Zica e compreende adicionalmente a deleção de um gene que codifica uma montagem essencial endógena, proteína de maturação e/ou aumenta a imunogenicidade da composição, e em que o genoma do poxvírus é modificado para compreender a deleção de um gene que codifica um conjunto essencial endógeno, proteína de maturação e/ou aumenta a imunogenicidade da composição.
2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o genoma do poxvírus compreende ainda uma sequência de ácido nucleico que codifica a poliproteína subgenômica 26S do vírus chicungunha.
3. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o poxvírus atenuado é selecionado do grupo que consiste em Vaccínia Ankara Modificado (MVA), NYVAC, avipox, varíola dos canários e varíola aviária.
4. Composição de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a modificação compreende deleção do gene D13L.
5. Composição de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizada pelo fato de que a modificação compreende a deleção do gene K1L.
6. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações de 3 a 5, caracterizada pelo fato de que a modificação compreende a deleção do gene A39R.
7. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações de 3 a 6, caracterizada pelo fato de que a modificação compreende a deleção dos genes B7R-B8R.
8. Composição de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a modificação compreende deleção do gene D13L, do gene A39R e dos genes B7R-B8R.
9. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que o carreador farmaceuticamente aceitável compreende um adjuvante.
10. Composição de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é selecionado do grupo que consiste de hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, sulfato de potássio e alumínio, hidróxido fosfato de cálcio, adjuvante completo de Freund, adjuvante incompleto de Freund, iscoms e matriz de iscom, adjuvante ISCOMATRIX™, adjuvante Matrix M™, adjuvante Matrix C™, adjuvante Matrix Q™, adjuvante AbISCO®-100, adjuvante AbISCO®-300, ISCOPREP™, um derivado ISCOPREP™, adjuvante contendo ISCOPREP™ ou um derivado ISCOPREP™, QS-21, um derivado QS-21 e um adjuvante contendo QS-21 ou um derivado QS21.
11. Uso da composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que é para uso na indução de uma resposta imune protetora em um sujeito contra chicungunha e varíola, infecção por vírus da varíola e zica e/ou infecção por vírus da chicungunha, varíola e zica.
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