DE60120356T2

DE60120356T2 - Verbesserte galactosylierung von rekombinanten proteinen

Info

Publication number: DE60120356T2
Application number: DE60120356T
Authority: DE
Inventors: Thomas San Mateo RYLL; Frank S. Morrisville WANG
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 2000-02-08
Filing date: 2001-02-07
Publication date: 2007-06-14
Anticipated expiration: 2021-02-08
Also published as: CA2399266A1; WO2001059089A2; EP1254216A2; US20030211573A1; IL151131A0; AU783973B2; EP1254216B1; ATE329018T1; ES2266159T3; AU3490301A; WO2001059089A3; JP2003521942A; DE60120356D1; US20070111284A1

Description

Diese Anmeldung wird von GENENTECH INC., gegründet und mit Sitz in den Vereinigten Staaten, als PCT-Anmeldung eingereicht, wobei alle Staaten bestimmt werden.
Verwandte Anmeldungen
Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der provisorischen US-Anmeldung mit der Seriennummer 60/181.108, eingereicht am 8. Februar 2000, sowie der provisorischen US-Anmeldung mit der Seriennummer 60/191.641, eingereicht am 23. März 2000.
Fachgebiet der Erfindung
Diese Erfindung bezieht sich auf die Glykosylierung von rekombinanten Glykoproteinen, im Speziellen betrifft sie ein Produktionsverfahren für Glykoproteine in Zellen mit erhöhter CAD-Aktivität.
Hintergrund der Erfindung
Rekombinante Glykoproteine, die von Fremdgenen in Wirtszellen exprimiert werden, sind für die wissenschaftliche Gemeinschaft von großem Interesse aufgrund ihres potenziellen Werts als Prophylaktika und Therapeutika. Rekombinante Glykoproteine bestehen aus Aminosäureketten, die eine Reihe komplexer und unterschiedlicher Oligosaccharidstrukturen aufweisen. Obwohl die Aminosäuresequenz rekombinanter Glykoproteine beständig reproduziert werden kann, sind die Oligosaccharidseitenketten sowohl in ihrer Zusammensetzung als auch in ihrer Struktur oftmals heterogen. Rademacker et al., Annu. Rev. Biochem. 57, 785–838 (1988); Spellman et al., J. Biol. Chem. 264(24), 14100–14111 (1989); Spellman et al., Biochemistry 30, 2395–2406 (1991); Kagawa et al., J. Biol. Chem. 263(33), 17508–17515 (1988).
Eine heterogene Oligosaccharidstruktur kann unerwünschte Auswirkungen auf die Eigenschaften eines Glykoproteins haben, unter anderem: Glykoproteinfunktion, Konformation, Löslichkeit, spezifische Aktivität, Antigenität und Immunogenität: Wittwer et al., Biochem. 29, 4175–4180 (1990); Hart, Curr. Op. Cell Biol. 4, 1017–1023 (1992); Parekh Curr. Op. Struct. Biol. 1, 750–754 (1991). Die Aufmerksamkeit der wissenschaftlichen Gemeinschaft liegt daher auf der Produktion rekombinanter Glykoproteine, die sowohl die korrekte Aminosäuresequenz als auch ein weniger heterogenes Oligosaccharidprofil aufweisen, und zwar vorzugsweise eines, das dem nativen Protein entspricht. Dies ist besonders wichtig bei der Produktion von Therapeutika, bei denen laut Anforderungen der Food und Drug Administration das gleiche Oligosaccharidmuster bei jeglichen biologischen Therapeutika gegeben sein muss.
Es wurden mehrere Strategien angewandt, um die Zusammensetzung von Oligosacchariden bei rekombinanten Glykoproteinen zu beeinflussen, unter anderem Folgendes umfassen: (1) Produktion von rekombinanten Wirtszellinien, die bestimmte Glykosyltransferasen mit dem Ziel einer verbesserten Biosynthese überexprimieren; (2) Verhindern des Oligosaccharidabbaus der Wirtszellen durch Regulierung glykohydrolytischer Enzyme; und (3) Kultivierung von rekombinanten glykoproteinproduzierenden Wirtszellen in Gegenwart von freien Zuckern und anderen Substraten, die für die Oligosaccharidproduktion notwendig sind. Es gibt jedoch einige Nachteile bei diesen Strategien. So sind beispielsweise Glykosyltransferasen lediglich so effizient wie die Menge an Oligosaccharidsubstrat in der Zelle; es könnte sein, dass die Regulierung des Oligosaccharidabbaus nicht wirkt, wenn Proteine inkorrekt glykosyliert werden; weiters können verschiedene vorgeschlagene Vorgehensweisen zur Ernährung aufgrund der Kosten abschreckend sein und zu einer nachteiligen Feedbackhemmung der relevanten Glykosyltransferasen führen. Auf dem Gebiet der rekombinanten Glykoproteine besteht weiterhin ein Bedarf an einer kostengünstigen Methode zur Produktion rekombinanter Glykoproteine mit einheitlichen Oligosaccharidprofilen. Vor diesem Hintergrund wurde die vorliegende Erfindung entwickelt.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ermöglicht eine verbesserte Galactosylierung und Sialylierung von rekombinanten Glykoproteinen durch eine verbesserte De-novo-Pyrimidin-Biosynthese mittels verbesserter Carbamoylphosphatsynthase II-(CPS II-)/Aspartat transcarbamoylase-(ATCase-)/Dihydro-Orotase-(CAD-)Aktivität. Es ist ein Merkmal der vorliegenden Erfindung, dass Glykoproteine, die in Zellen mit erhöhter CAD-Aktivität produziert wurden, verbesserte Galactosylierung aufweisen. Die Erfindung ist für die Expression von Glykoproteinen aus endogenen Genen oder Nucleinsäuren nützlich, die unter geeigneten Bedingungen in die Zellen eingeführt wurden. Die vorliegende Erfindung ist daher besonders nützlich bei der rekombinanten Expression von Proteinen mit Galactoseresten, die für die gewünschte enzymatische, immunologische oder eine andere biologische Aktivität oder für die Clearanceeigenschaften des Proteins notwendig sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Glykoproteine in Zellen produziert, die auf erhöhte CAD-Aktivität selektiert wurden. So werden zum Beispiel Zellen durch Inkubation mit einem CAD-Inhibitor wie zum Beispiel N-Phosphonacetyl-L-aspartat (PALA) auf erhöhte CAD-Aktivität selektiert. Zellen, die auf PALA-Resistenz selektiert wurden, zeigen erhöhte CAD-Aktivität.
Generell stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Produktion von Glykoproteinen mit erhöhter Glykosylierung bereit, das den Schritt der Expression des Glykoproteins in einer Wirtszelle mit erhöhter intrazellulärer CAD-Aktivität im Vergleich zu Kontrollwirtszellen umfasst. In bevorzugten Ausführungsformen führt erhöhte intrazelluläre CAD-Aktivität zu erhöhter intrazellulärer Konzentration von UTP, was zu verbesserter Galactosylierung von rekombinant produzierten Glykoproteinen führt. Weiters werden hierin Wirtszellen und Zelllinie mit erhöhter intrazellulärer CAD-Aktivität sowie Glykoproteine mit verbesserter Galactosylierung beschrieben, die durch Expression einer heterologen Nucleinsäuresequenz, die für das Glykoprotein in einer Zelle mit erhöhter CAD-Aktivität kodiert, produziert wurde.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
Die 1A und 1B sind schematische Darstellungen des De-novo-Biosynthesewegs von Pyrimidin.
2 ist eine schematische Darstellung jenes Verfahrens, das zur Selektion auf CHO-Zellen mit hoher CAD-Aktivität mittels PALA angewandt wird.
3 ist ein Balkendiagramm, das die CPS-II-Aktivität der PALA-selektierten CHO-Zellen im Vergleich mit Kontrollzellen zeigt.
4 zeigt ein Gel, das CAD-Expression in PALA-selektierten CHO-Zellen darstellt.
5 zeigt ein HPLC-Chromatogramm von intrazellulären Nukleotiden und Nukleotidzuckern einschließlich UTP und UDP-Galactose in Kontroll- und PALA-selektierten CHO-Zellen.
6 ist ein Diagramm, das die Stabilität von UTP und UDP-Galactose-Spiegeln in PALA-selektierten CHO-Zellen über einen Zeitraum von 90 Tagen darstellt.
7 ist ein Diagramm, das UTP-Spiegel in CHO-Zellen darstellt, die in unterschiedlichen Mengen an Uridin kultiviert wurden.
Die 8A und 8B sind Balkendiagramme, die UTP- (8A) und UDP-Galactosespiegel (8B) in CHO-Zellen darstellen, die mit Uridin, Galactose und sowohl Uridin als auch Galactose inkubiert wurden.
9 ist eine schematische Darstellung des Zusammenspiels zwischen CAD, Uridin, UTP, Galactose und UDP-Galactose.
10 ist ein Diagramm, das den Galactosegehalt eines CD20-Antikörpers, der in mit Uridin inkubierten CHO-Zellen produziert wurde, im Vergleich mit Kontrollzellen darstellt.
Detailierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Definitionen
Der Begriff "eukaryotische Zelle" oder Zelllinie wird zur Beschreibung von Zellen verwendet, die in Ex-vivo-Kulturen gezüchtet wurden. Charakteristisch für die eukaryotische Zelle der vorliegenden Erfindung ist die Tatsache, dass sie ein bestimmtes, relevantes Glykoprotein exprimiert oder dazu in der Lage ist. Eukaryotische Zellen, die zur Produktion eines gewünschten Proteinprodukts verwendet werden, sind in der Lage, Proteine durch Hinzufügung von Oligosaccharidseitenketten zu glykosylieren. In bestimmten Ausführungsformen besitzen solche Zellen auch die Fähigkeit, einen Teil oder die ganze Oligosaccharidseitenkette von Glykoproteinen enzymatisch zu entfernen und/oder zu modifizieren.
Beispiele für geeignete eukaryotische Wirtszellen im Kontext der vorliegenden Erfindung sind unter anderem Insekten- und Säugerzellen. Zu den Beispielen für Wirtszellen gehören SF9-Insektenzellen (Summers & Smith, Texas Agriculture Experiment Station Bulletin 1555 (1987); und Insect Cell Culture Engineering, Goosen Daugulis & Faulkner (Hrsg.), Dekker, New York); Chinahamster-Eierstockzellen (CHO-Zellen) (Puck et al., J. Exp. Med. 108, 945–955 (1958); Puck, Molecular Cell Genetics, S. 37–64, Gottersman MM (Hrsg.) Wiley Intersciences (1985)), einschließlich CHO-Zellen, die TNFR-IgG und Anti-CD20 exprimieren; die Affennieren-CV1-Linie, transformiert mit SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); die menschliche Embryonalnierenlinie (Graham et al., J. Gen Virol. 36, 59 (1977)); Babyhamster-Nierenzellen (BHK, ATCC CCL 10); und menschliche Zervixkarzinomzellen (HELA, ATCC CCL 2). Die obenstehende Liste ist lediglich zur Veranschaulichung gedacht und soll in keiner Weise den Umfang der vorliegenden Erfindung einschränken.
Der Begriff "Kontrollzellen", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine Zelle, die parallel zu einer anderen, unter den angegebenen Versuchsbedingungen behandelten Zelle kultiviert wurde; im Gegensatz zur behandelten Zelle wird die Wirtszelle jedoch nicht den angegebenen Versuchsbedingungen ausgesetzt. Kontrollzellen stellen die Basis für Vergleiche dar.
Der Begriff "Nucleinsäuresequenz" bezieht sich auf die Reihenfolge oder Abfolge von Desoxyribonucleotiden entlang eines Desoxyribonucleinsäurestrangs. Die Reihenfolge dieser Desoxyribonucleotide bestimmt die Reihenfolge von Aminosäuren entlang der Polypeptidkette. Die Desoxyribonucleotidsequenz kodiert somit für die Aminosäuresequenz.
Der Begriff "Expressionsvektor" bezieht sich auf ein Stück DNA, üblicherweise doppelsträngig, das in sich ein Stück DNA insertiert haben kann, zum Beispiel ein Stück Fremd-DNA. Fremd-DNA ist als heterologe DNA definiert, also DNA, die in der Natur nicht in der Wirtszelle vorkommt und zusätzliche Kopien von natürlich im Wirtsgenom vorhandenen Genen einschließt. Der Vektor wird verwendet, um die Fremd- oder heterologe DNA in eine geeignete Wirtszelle zu transportieren. Einmal in der Wirtszelle angelangt, ist der Vektor in der Lage, sich in die Chromosomen der Wirtszelle zu integrieren. Der Vektor enthält die notwendigen Elemente, um Zellen zu selektieren, die sowohl die integrierte DNA als auch Elemente zur Förderung der Transkription polyadenylierter Messenger-RNA (mRNA) aus der transfizierten DNA enthalten. Daher können rasch viele Moleküle des Polypeptids, für das die Fremd-DNA kodiert, synthetisiert werden.
Der Begriff "Expression" oder "exprimiert" wird hierin verwendet, um sich auf die Transkription und Translation innerhalb einer Wirtszelle zu beziehen. Das Expressionslevel eines Produktgens in einer Wirtszelle kann entweder auf Basis der Menge der entsprechenden mRNA, die in der Zelle vorhanden ist, bestimmt werden, oder aber durch die von der Zelle produzierte Menge an Protein, für welches das Produktgen kodiert. So wird zum Beispiel mRNA, die von einem Produktgen transkribiert wird, am besten durch Northern-Hybridisierung quantifiziert. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, S. 7.3–7.57, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Ein von einem Produktgen kodiertes Protein kann entweder durch Untersuchungen auf die biologische Aktivität des Proteins oder durch die Verwendung von Tests quantifiziert werden, die unabhängig von solcher Aktivität sind, wie z.B. Western-Blotting oder Immuntests unter Verwendung von Antikörpern, die mit dem Protein reagieren können. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, S. 18.1–18.88, Cold Spring Harbor Laboratry Press (1989).
Wie hierin verwendet, bezieht sich "Glykoprotein" generell auf Peptide und Proteine mit mehr als etwa 10 Aminosäuren und zumindest einem Kohlenhydrat. Die Glykoproteine können zur Wirtszelle homolog oder – vorzugsweise – heterolog, d.h. wirtszellenfremd sein. Beispiele für Glykoproteine, die unter Anwendung einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung exprimiert werden könnten, umfassen unter anderem Moleküle wie Cytokine und deren Rezeptoren, chimäre Proteine, Tumornekrosefaktor-α und -β, Tumornekrosefaktorrezeptoren, menschliche Wachstumshormone, Rinderwachstumshormone, Nebenschilddrüsenhormon, Schilddrüsenstimulierendes Hormon, Lipoproteine, α-1-Antitrypsin, Insulin-A-Kette, T-Zellenrezeptoren, Oberflächenmembranproteine, monoklonale Antikörper und Transportproteine. Die Liste der Beispiele dient lediglich der Veranschaulichung und soll in keiner Weise den Umfang der vorliegenden Erfindung einschränken.
Der Begriff "Glykoform" wird im Kontext der vorliegenden Erfindung verwendet, um ein Glykoprotein zu beschreiben, das eine oder mehrere bestimmte Kohlenhydratstrukturen aufweist.
Der Begriff "Glykosylierung" beschreibt im Kontext der vorliegenden Erfindung den Vorgang, durch den ein Protein kovalent mit einer oder mehreren Oligosaccharidketten verbunden wird. Der Begriff "Galactosylierung" bedeutet die Hinzufügung von Galactoseeinheiten zu einer Oligosaccharidkette an einem Glykoprotein, und "Sialylierung" bedeutet die Hinzufügung von Sialinsäure zu einer Oligosaccharidkette an einem Glykoprotein.
Ausdrücke wie "für eine bestimmte Zeitspanne und unter bestimmten Bedingungen, so dass das Zellwachstum maximiert wird" und dergleichen beziehen sich auf Kulturbedingungen, die für eine bestimmte Zelllinie als optimal für Zellwachstum und -teilung bestimmt wurden. Normalerweise werden die Zellen während der Zellkultivie rung in einem Nährmedium, das die notwendigen Zusatzstoffe enthält und normalerweise bei etwa 30–40°C gehalten wird, in einer befeuchteten, kontrollierten Atmosphäre gezüchtet, so dass für diese spezielle Zelllinie optimales Wachstum erzielt wird.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "ausreichend lange kultiviert, um Selektion zu ermöglichen" auf den Akt des physischen Kultivierens von eukaryotischen Wirtszellen auf dem Selektionsmittel, bis resistente Klone herausgefunden und auf die relevanten Eigenschaften getestet wurden.
Wie hierin verwendet, werden die Begriffe "Protein", "Peptid" und "Polypeptid" austauschbar gebraucht, um ein Aminosäurepolymer oder einen Satz aus zwei oder mehr wechselwirkenden oder gebundenen Aminosäurepolymeren zu beschreiben.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "CAD" auf den Mehrfachenzym-Polypeptidkomplex (Carbamoyl-Phosphat-Synthetase (CPS II), Aspartat Transcarbamoylase und Dihydro-Orotase), der die ersten drei Reaktionen in der De-novo-Biosynthese von Pyrimidinen katalysiert (siehe 1A). Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt für die Pyrimidin-Biosynthese ist die Synthese von Carbamoylphosphat aus Bicarbonat, ATP und Glutamin durch CPS II (eine der mit CAD assoziierten Enzymaktivitäten) (Irvine et al., Eur. J. Biochem 247, 1063–1073 (1997)). Schlussendlich liefert CAD zusammen mit zwei anderen Enzymen, Orotat-Phosphoribosyl-Transferase und Orotidylat-Decarboxylase, UMP, das schließlich in UTP übergeführt wird.
Wie hierin verwendet umfassen CAD-Inhibitoren alle Substanzen, von denen bekannt ist, dass sie die Aktivitäten des CAD-Enzymkomplexes hemmen. Zu den CAD-Inhibitoren gehören N-(Phosphoacetyl)-L-Aspartat (siehe 1B).
Arten der Durchführung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung basiert unter anderem auf der unerwarteten Entdeckung, dass die Produktion von Glykoproteinen in Wirtszelllinien generell zu unterglykosylierten Oligosaccharid-Glykoproteinprofilen führt. Gemäß vorliegender Erfindung führt die Expression von Glykoproteinen in einer Wirtszelle mit erhöhter CAD-Aktivität in jenen Fällen, in denen die Wirtszelle fähig ist, das relevante Glykoprotein zu exprimieren, zu durchwegs erhöhten Oligosaccharid-Glykoproteinprofilen.
Erhöhte CAD-Aktivität
Die Selektion auf erhöhte CAD-Aktivität innerhalb einer Wirtszelle, die ein relevantes Glykoprotein exprimiert oder dazu in der Lage ist, kann auf jede nach dem Stand der Technik bekannte Art und Weise erfolgen. In einer speziellen Ausführungsform können Zellen mit einem CAD-Inhibitor behandelt werden und die überlebenden, resistenten Zellen werden dann auf erhöhte CAD-Aktivität selektiert. Der CAD-Inhibitor kann ein beliebiger, nach dem Stand der Technik bekannter sein. Ein bevorzugter CAD-Inhibitor zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist P-(Phosphonacetyl)-L-aspartat (PALA). PALA-behandelte Zellen werden typischerweise unter Verwendung von Endkonzentrationen von PALA zwischen 2 und 10 mM selektiert.
Eine Zelle, vorzugsweise eine Säugerzelle oder Insektenzelle, insbesondere eine Chinahamster-Eierstockzelle (CHO), wie zum Beispiel CHO-DP12, CHO-DG44 oder CHO-K1, wird unter dem Druck eines CAD inhibierenden Faktors wie zum Beispiel PALA selektiert. Die Zellen werden in einem Basismedium, wie z.B. einer Formulierung auf DMEM/HAM-F-12-Basis, gezüchtet (bezüglich der Zusammensetzung der Medien DMEM und HAM 12 siehe "Culture Media Formulations" im American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas, 6. Aufl., S. 346–349 (1988)) (die Formulierung des Mediums wie im US-Patent 5.122.469 beschrieben ist besonders gut geeignet), das den geeigneten CAD-Inhibitor zusammen mit modifizierten Konzentrationen einiger Komponenten wie zum Beispiel Aminosäuren, Salzen, Zuckern und Vitaminen enthält und das gegebenenfalls Glycin, Hypoxanthin und Thymidin; rekombinantes menschliches Insulin, hydrolysiertes Pepton wie z.B. Primaton HS oder Primaton RL (Sheffield, England) oder ein Äquivalent; einen Zellschutzstoff wie zum Beispiel Pluronic F68 oder das äquivalente Pluronic-Polyol; Gentamycin; sowie Spurenelemente enthält.
Die überlebenden Zellen, die unter CAD-Inhibitor-Selektion gezüchtet wurden, d.h. CAD-Inhibitor-resistente Zellen, werden mittels beliebiger, nach dem Stand der Technik bekannter Untersuchungen auf CAD-Aktivität getestet. Beispiele sind unter anderem die Ammoniak-abhängige Teilreaktion (Shaw et al., Eur. J. Biochem. 207, 957–965 (1992)) sowie das radiometrische Verfahren (Guy et al., JBC 272(46), 29255–29262 (1997).
Erhöhte intrazelluläre CAD-Aktivität kann auch durch CAD-Überexpression innerhalb einer Zelle erzielt werden. Menschlicher CAD wurde bereits kloniert (Iwahana et al., Biochemical and Biophysical Research Comm. 219, 249–255 (1996)) wie auch die enzymatischen Domänen von Hamster-CAD. Davidson et al., Plenum Press, New York, 591–595 (1995). Überexpression kann sich entweder auf das ganze CAD-Protein beziehen oder auf einen beliebigen Teil davon, der ausreichende CAD-Aktivität für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bereitstellt. Hier können bekannte Verfahren zum Einführen von Nucleinsäuresequenzen, die für CAD kodieren, in Zellen verwendet werden. Dazu gehören Plasmidvektoren, virale Vektoren sowie andere Methoden, um genetisches Material in eine Wirtszelle einzuführen. Es ist notwendig, dass das CAD-Gen auf eine solche Art und Weise eingeführt wird, dass die Wirtszelle das Protein exprimiert. Überexpression von CAD wird bevorzugt. Die Techniken zur Überexpression eines Proteins innerhalb einer Wirtszelle werden untenstehend im Kontext der Glykoproteinproduktion detaillierter beschrieben.
Eine weitere geeignete Methode zur Erhöhung der intrazellulären CAD-Aktivität ist die Expression von mutiertem CAD, bei der die Mutation die inhibitierende Regulierung durch die Enzymprodukte verringert, zum Beispiel durch UTP oder UTP-Analoge. Nucleinsäuresequenzen mit einer oder mehreren Mutationen an der UTP-Bindungsstelle des CAD sind nützlich, obwohl die Mutation überall in der Nucleinsäure sequenz auftreten kann, wenn sie ausreicht, um die UTP-Regulierung des kodierten mutierten CAD-Proteins zu zerstören.
Erhöhte UTP- und UDP-Galactosespiegel
Erhöhte intrazelluläre CAD-Aktivität führt zu erhöhten intrazellulären UTP- und UDP-Galactosekonzentrationen. Zellen mit erhöhter CAD-Aktivität werden anhand von nach dem Stand der Technik bekannten, geeigneten Verfahren auf UTP- und UDP-Galactosespiegel analysiert, wie z.B. anhand des Verfahrens von Ryll und Wagner, J. Chromatography 570, 77–88 (1991).
Glykoprotein
Gemäß der Erfindung werden CAD-Inhibitor-resistente Wirtszellen, wie z.B. die oben beschriebenen, modifiziert, um ein endogenes Glykoprotein oder ein rekombinantes Glykoprotein funktionell zu exprimieren. Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt PALA-resistente CHO-Zellen bereit, die zur Expression von Glykoproteinen aus gentechnisch veränderten Vektoren in hoher Ausbeute eingesetzt werden. Das von der CHO-Zelle exprimierte Glykoprotein wird generell aus DNA produziert, die in die Zelle transfiziert wurde. Die Struktur und das Ausmaß des Kohlenhydratanteils des Glykoproteins wird durch die Zellmechanismen der Wirtszelle bestimmt, in diesem Fall der PALA-resistenten CHO-Zelle.
Nucleinsäuresequenzen, die für ein endogenes Wirtszellenprotein oder für ein heterologes rekombinantes Glykoprotein kodieren, sind dem Fachmann zugänglich und können zum Beispiel durch In-vitro-Synthesemethoden oder einfach aus cDNA-Banken erhalten werden. Die Verfahren zur synthetischen Erzeugung der DNA, entweder von Hand oder mit einem automatisierten Gerät, sind dem durchschnittlichen Fachmann bekannt. Beispiele für aktuelle Verfahren zur Polynucleotidsynthese sind etwa in Maniatis et al., Molecular Cloning – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1984), und Horvath et al., An Automated DNA Synthesizer Employing Deoxynucleotide 3'-Phosphoramidites, Methods in Enzymology 154, 313–326 (1987), die ausdrücklich durch Verweis hierin aufgenommen sind. Alternativ wird die Gen sequenz, die für das rekombinante Glykoprotein kodiert, unter Anwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren aus der cDNA-Bank kloniert. So können zum Beispiel Polymerase-Kettenreaktionsverfahren angewandt werden, wodurch eine spezielle Nucleinsäuresequenz amplifiziert wird. Oligonucleotidprimer, die auf Sequenzen basieren, die den 3'- und 5'-Enden des DNA-Segments entsprechen, das amplifiziert werden soll, werden unter den entsprechenden Bedingungen hybridisiert, und das Enzym Taq-Polymerase oder ein äquivalentes Enzym wird verwendet, um Kopien der DNA, die zwischen den Primern liegt, zu synthetisieren.
Welches Verfahren jeweils für die funktionelle Expression des rekombinanten Glykoproteins angewandt wird, ist für die Erfindung nicht entscheidend. So kann beispielsweise jedes beliebige Verfahren zur Einführung von Nucleotidsequenzen in Wirtszellen angewandt werden. Dazu gehört unter anderem die Verwendung von Plasmidvektoren, viralen Vektoren und anderen Verfahren zur Einführung von genetischem Material in eine Wirtszelle. Es ist notwendig, dass das Gen oder die Nucleinsäure, das/die exprimiert werden soll, auf solche Weise eingeführt wird, dass die Wirtszelle das Protein exprimiert. Überexpression wird bevorzugt.
So wird Expression typischerweise dadurch erzielt, dass das geeignete Glykoprotein zusammen mit einem anderen Gen, das für einen selektierbaren Marker kodiert und normalerweise als selektierbares Gen bezeichnet wird, in die Zellen eingeführt wird. Ein selektierbarer Marker ist ein Protein, das für das Wachstum oder das Überleben einer Wirtszelle unter den jeweils gewählten Kulturbedingungen notwendig ist, wie z.B. ein Enzym, das Resistenz gegen ein Antibiotikum oder ein anderes Arzneimittel verleiht, oder ein Enzym, das einen metabolischen oder katabolischen Defekt in einer Wirtszelle kompensiert. Häufig verwendete selektierbare Gene, die für eukaryotische Zellen verwendet werden, sind zum Beispiel die Gene für Aminoglykosid-Phosphotransferase (APH), Hygromycin-Phosphotransferase (hyg), Dihydrofolat-Reductase (DHFR), Thymidin-Kinase (tk), Neomycinresistenz, Puromycinresistenz, Glutamin-Synthetase und Asparagin-Synthetase. Bei der Wahl eines geeigneten Expressionssystems wird ein selektierbarer Marker für das Glykoprotein ausgewählt um, falls notwendig, eine zweite Transfektion mit einem zweiten geeigneten amplifi zierbaren Marker für die Expression eines zweiten Glykoproteinprodukts zu ermöglichen, oder aber, um funktionelle Modifikationen der Wirtszelle zu ermöglichen. Zu solchen Modifikationen zählen unter anderem die Erhöhung anderer Aktivitäten, die mit der Verbesserung des Zellmetabolismus der Quantität oder Qualität der rekombinanten Produktexpression in Verbindung stehen.
Das Expressionslevel eines Gens, das in eine eukaryotische Wirtszelle der Erfindung eingeführt wird, hängt von vielen verschiedenen Faktoren ab, unter anderem von der Genkopiezahl, der Effizienz der Transkription, der Boten-RNA-(mRNA-)Prozessierung, der Stabilität und der Translationseffizienz. Ebenso umfasst die Überexpression eines gewünschten Glykoproteins gemäß vorliegender Erfindung typischerweise die Optimierung eines oder mehrerer dieser Faktoren.
Weiters kann das Ausmaß der Glykoproteinproduktion gesteigert werden, indem die Kodierungssequenz des Gens kovalent an einen "starken" Promotor oder Enhancer gebunden wird, der ein hohes Maß an Transkription ermöglicht. Promotoren und Enhancer, die in einer PALA-resistenten Wirtszelle spezifisch mit Proteinen wechselwirken, die an der Transkription beteiligt sind, sind im Kontext der vorliegenden Erfindung als geeignet anzusehen. Zu den eukaryotischen Promotoren, die als starke Promotoren für Überexpression identifiziert worden sind und die im Kontext der vorliegenden Erfindung bevorzugt werden, zählen der frühe SV40-Promotor, der späte Adenovirus-Hauptpromotor, Maus-Metallothionein-1-Promotoren, lange terminale Wiederholung des Rous-Virus und der unmittelbar frühe Promotor des menschlichen Zytomegalievirus (CMV). Besonders nützlich für die Expression des gewünschten Glykoproteinprodukts sind starke virale Promotoren wie zum Beispiel das myeloproliferative Sarcom-Virus (Artel et al., Gene 68, 213–220 (1988)), der frühe SV40-Promotor (McKnight and Tijan, Cell 46, 795–805 (1986)).
Enhancer, welche die Transkription aus einem damit verbundenen Promotor stimulieren, sind im Kontext dieser Erfindung ebenso nützlich. Im Gegensatz zu Promotoren sind Enhancer aktiv, wenn sie stromab der Transkriptionsstartstelle oder auch in beträchtlichem Abstand zum Promotor liegen, obwohl Enhancer in der Praxis phy sisch und funktionell mit Promotoren überlappen können. So enthalten beispielsweise viele der oben genannten starken Promotoren auch starke Enhancer (Bendig, Genetic Engineering 7, 91 (1988)).
Das Ausmaß der Proteinproduktion oder Expression kann auch gesteigert werden, indem die Genkopiezahl in der Wirtszelle gesteigert wird. Eine Methode zum Erhalt höherer Genkopiezahlen besteht darin, mehrere Kopien des Gens direkt in die Wirtszelle einzuführen, beispielsweise unter Verwendung eines im Verhältnis zum selektierbaren Gen großen molaren Überschusses des Produktgens bei der Cotransfektion. Kaufman, Meth. Enzymol. 185, 537 (1990). Nach diesem Verfahren enthält jedoch nur ein kleiner Anteil der cotransfizierten Zellen das Produktgen in einer hohen Kopiezahl. Typischerweise werden Screeningmethoden angewandt, um die gewünschte hohe Kopiezahl der Transfektanten zu identifizieren.
Die Verwendung von Spleiß-Donor-artigen Vektoren, wie von Lucas et al., Nuc. Acid Res. 24(9), 1774–1779 (1996), und in der WO/9604391 beschrieben, wird ebenso bevorzugt.
Eine weitere Methode zum Erhalt von hohen Genkopiezahlen umfasst Genamplifikation in der Wirtszelle. Genamplifikation erfolgt in eukaryotischen Zellen auf natürliche Weise mit relativ geringer Häufigkeit (Schimke, J. Biol. Chem. 263, 5989 (1988)). Genamplifikation kann jedoch auch induziert werden, oder es kann zumindest darauf selektiert werden, indem Wirtszellen einem geeignet gewählten Druck ausgesetzt werden. So ist es beispielsweise in vielen Fällen möglich, ein Glykoprotein-Gen zusammen mit einem amplifizierbaren Gen in eine Wirtszelle einzuführen und danach auf Amplifikation des Markergens zu selektieren, indem die cotransfizierten Zellen aufeinander folgenden ansteigenden Konzentrationen eines selektiven Mittels ausgesetzt werden. Typischerweise wird das Produktgen mit dem Markergen unter solchen Bedingungen coamplifiziert.
Das meistverwendete amplifizierbare Gen für diesen Zweck ist ein DHFR-Gen, das für ein Dihydrofolat-Reductase-Enzym kodiert. Das Selektionsmittel, das zusammen mit einem DHFR-Gen verwendet wird, ist Methotrexat (MTX). In diesem Beispiel wird eine PALA-resistente Zelle mit dem Glykoprotein-Gen und einem DHFR-Gen cotransfiziert, und Transfektanten werden identifiziert, indem die Zellen zuerst in Kulturmedium, das MTX enthält, gezüchtet werden. Die transfizierten Zellen werden dann nacheinander steigenden Mengen an MTX ausgesetzt. Das führt zur Synthese mehrerer Kopien des DHFR-Gens und gleichzeitig zu mehreren Kopien des Glykoproteingens (Schimke, J. Biol. Chem. 263, 5989 (1988); Axel et al., U.S. Patent No. 4,399,216; Axel et al., U.S. Patent No. 4,634,655; Kaufman in Genetic Engineering, J. Setlow (Hrsg.), Vol. 9 (Plenum Press, New York) (1987); Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol. 159, 601 (1982); Ringold et al., J. Mol. Appl. Genet. 1, 165–175; Kaufman et al., Mol. Cell Biol. 5, 1750–1759; Kaetzel and Nilson, J. Biol. Chem. 263, 6244–6251 (1988); Hung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 261–264 (1986); Kaufman et al., EMBO J. 6, 87–93 (1987); Johnston and Kucey, Science 242, 1551–1554 (1988); Urlaub et al., Cell 33, 405–412 (1983).
Alternativ können Wirtszellen mit einem Glykoprotein-Gen, einem DHFR-Gen und einem dominanten selektierbaren Gen, zum Beispiel einem neo^r-Gen, cotransfiziert werden. Transfektanten werden identifiziert, indem die Zellen zuerst in Kulturmedium, das Neomycin (oder das verwandte Arzneimittel G418) enthält, kultiviert werden; die so indentifizierten Transfektanten werden dann auf Amplifikation des DHFR-Gens und des Produktgens selektiert, indem sie nacheinander steigenden Mengen an MTX ausgesetzt werden.
Ein weiteres Verfahren basiert auf der Verwendung von polycistronischen mRNA-Expressionsvektoren, die ein Produktgen am 5'-Ende der transkribierten Region und ein selektierbares Gen am 3'-Ende enthalten. Da die Translation des selektierbaren Gens am 3'-Ende der polycistronischen mRNA ineffizient ist, zeigen diese Vektoren bevorzugte Translation des Glykoproteingens und erfordern große Mengen an polycistronischer mRNA, um die Selektion zu überleben. Kaufman, Meth. Enzymol. 185, 487 (1990); Kaufman, Meth. Enzymol. 185, 537 (1990); Kaufman et al., EMBO J. 6, 187 (1987). Analog dazu können Zellen, die größere Mengen des gewünschten Proteinprodukts exprimieren, in durch Kultivieren der anfänglichen Transfektanten in einem Medium, welches das für die Verwendung mit einem bestimmten selektierbaren Gen geeignete Selektionsmittel enthält, einem einzigen Schritt erhalten werden.
Eine weitere Methode, die im Kontext der vorliegenden Erfindung Anwendung geeignet ist, ist die Integration der für das Glykoprotein kodierenden Gene in einen transkriptionsaktiven Teil des PALA-resistenten Zellgenoms. Derartige Vorgansgweisen werden in der Internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/US/04469 beschrieben.
Andere Säugerexpressionsvektoren, wie z.B. diejenigen, die einfache Transkriptionseinheiten enthalten, sind im Kontext dieser Erfindung ebenso von Nutzen. Es wurden retrovirale Vektoren erzeugt (Cepko et al., Cell 37, 1053–1062 (1984)), in denen eine cDNA zwischen den endogenen Spleißdonor des murinen Leukämievirus nach Moloney (M-MuLV) und Spleißakzeptorstellen eingefügt wurde, die von einem Neomycinresistenz-Gen gefolgt werden. Dieser Vektor wurde zur Expression vieler verschiedener Genprodukte nach retroviraler Infektion verschiedener Zelltypen verwendet.
Die Einführung der Nucleinsäuren, die für das Glykoprotein kodieren, wird durch dem Fachmann bekannte Verfahren erzielt. Für Säugerzellen ohne Zellwand kann das Calciumphosphat-Fällungsverfahren von Graham und Van der Eb, Virology 52, 456–457 (1978), angewandt werden. Allgemeine Aspekte von Säugerzellen-Wirtssystemtransformationen wurden von Axel in US-A-4.399.216, ausgegeben am 16. August 1983, beschrieben. Es können jedoch auch andere Verfahren zur Einführung von DNA in Zellen angewandt werden, zum Beispiel Zellkerninjektion, Protoplastenfusion oder Elektroporation (Chisholm et al., DNA Cloning IV: A Practical Approach, Mammalian Systems, S. 1–41, Glover and Hanes (Hrsg.) (1995)). In der bevorzugten Ausführungsform wird die DNA mittels Lipofektion in die Wirtszelle eingeführt. Siehe Andreason, J. Tiss. Cult. Meth. 15, 56–62 (1993), für einen Überblick über Elektroporationsverfahren, die für die praktische Ausführung der vorliegenden Erfindung von Nutzen sind.
Genamplifikation und/oder Expression kann durch eine Probe direkt gemessen werden, beispielsweise durch das herkömmliche Southern-Blotting-Verfahren, durch Northern-Blotting, um die Transkription der mRNA zu quantifizieren (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201–5205 (1980)), Dot-Blot (DNA- oder RNA-Analyse), RT-PCR oder In-situ-Hybridisierung, unter Verwendung einer geeignet markierten Sonde, die auf den hierin bereitgestellten Sequenzen basiert. Bei der Herstellung von Sonden können verschiedene Markierungen verwendet werden, meist Radioisotopen, insbesondere ³²P. Es können jedoch auch andere Verfahren angewandt werden, wie z.B. unter Verwendung von Biotin-modifizierten Nukleotiden zur Einführung in ein Polynucleotid. Das Biotin dient dann als Bindungsstelle für Avidin oder Antikörper, die mit einer Vielzahl von Markierungen markiert werden können, z.B. mit Radionucleotiden, Fluoreszenz, Enzymen oder dergleichen. Alternativ dazu können Antikörper eingesetzt werden, die bestimmte Duplexe erkennen, unter anderem DNA-Duplexe, RNA-Duplexe sowie DNA-RNA-Hybridduplexe oder DNA-Protein-Duplexe. Die Antikörper können ihrerseits markiert werden, und der Test kann durchgeführt werden, wenn der Duplex an eine Oberfläche gebunden wird, so dass bei der Bildung des Duplex an der Oberfläche die Gegenwart von an den Duplex gebundenen Antikörpern nachgewiesen werden kann.
Zum Züchten der PALA-resistenten Zellen, die das gewünschte Protein exprimieren und die wie beschrieben für die vorliegende Erfindung modifiziert wurden, können zahlreiche Kulturbedingungen eingesetzt werden, wobei besonderes Augenmerk auf die resistenten Zellen, die gezüchtet werden, zu legen ist. Für eukaryotische Zellen geeignete Bedingungen sind aus dem Stand der Technik allgemein bekannt (J. Immunol. Methods 56, 221–234 (1983)) oder können vom Fachmann leicht bestimmt werden (siehe zum Beispiel Animal Cell Culture: A Practical Approach, 2. Aufl., Rickwood, D. and Hames, B. D. (Hrsg.), Oxford University Press, New York (1992)), und variieren je nach der gewählten Zelle.
Für die Produktion der gewünschten Glykoproteine ist eine Produktion durch Züchten der Wirtszellen der vorliegenden Erfindung unter verschiedenen Zellkulturbedingungen typisch. So sind beispielsweise Zellkulturverfahren für die Proteinproduktion in großem oder kleinem Maßstab im Kontext der vorliegenden Erfindung potentiell nützlich. So können etwa – jedoch nicht ausschließlich – folgende Verfahren einge setzt werden: Fließbettbioreaktoren, Hohlfaserbioreaktoren, Rollflaschenkulturen oder Rührkesselbioreaktorsysteme, wobei die zwei letztgenannten Systeme mit oder ohne Mikroträger eingesetzt werden können, und sie alle können alternativ im Chargen-, Fed-Batch- oder kontinuierlichen Modus betrieben werden.
Nach der Glykoprotein-Produktionsphase wird das gewünschte Polypeptid aus dem Kulturmedium anhand von nach dem Stand der Technik gut bekannten Verfahren gewonnen.
Das gewünschte Polypeptid wird vorzugsweise als sekretiertes Polypeptid aus dem Kulturmedium gewonnen, obwohl es auch aus Zelllysaten gewonnen werden kann.
Als erster Schritt wird das Kulturmedium oder Lysat zentrifugiert, um teilchenförmige Zelltrümmer zu entfernen. Das Polypeptid wird danach von kontaminierenden löslichen Proteinen und Polypeptiden gereinigt, wobei die folgenden Verfahren Beispiele für geeignete Reingungsvorgänge sind: Fraktionierung auf Immunaffinitäts- oder Ionenaustauschersäulen; Ethanolfällung, Umkehrphasen-HPLC; Chromatographie auf Kieselgel oder einem Kationenaustauschharz wie zum Beispiel DEAE; Chromatofokussierung; SDS-PAGE; Ammoniumsulfatfällung; Gelfiltration, z.B. unter Verwendung von Sephadex G-75; und Protein-A-Sepharose-Säulen, um Verunreinigungen wie etwa IgG zu entfernen. Ein Proteaseinhibitor, wie z.B. Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), kann ebenso nützlich sein, um proteolytischen Abbau während der Reinigung zu hemmen.
Glykosylierung eines Glykoproteins
Der komplexe Kohlenhydratteil des durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung produzierten Glykoproteins ist – wenn dies gewünscht wird – durch herkömmliche Methoden der Kohlenhydratanalyse leicht zu analysieren, um den Oligosaccharidgehalt des Glykoproteins zu bestätigen. So zeigen nach dem Stand der Technik gut bekannte Verfahren wie Lectin-Blotting oder Monosaccharid-Analyse Anteile an ter minaler Mannose, N-Acetylglucosamin, Sialsäure oder anderen Zuckern wie etwa Galactose.
Die resultierenden Kohlenhydrate können durch jedes bekannte Verfahren analysiert werden, einschließlich der hierin beschriebenen Methoden. Es sind auf dem Gebiet einige Methoden der Glykosylierungsanalyse bekannt, die im Kontext der vorliegenden Erfindung von Nutzen sind. Diese Verfahren liefern Informationen über die Identität und Zusammensetzung des an das Peptid gebundenen Oligosaccharids. Zu den Methoden der Kohlenhydratanalyse, die für die vorliegende Erfindung von Nutzen sind, zählen unter anderem – jedoch nicht ausschließlich – Kapillarelektrophorese (Rassi and Nashabeh, High Performance Capillary Electrophoresis of Carbohydrates and Glycoconjugates, in: Carbohydrate Analysis (Z. EI Rassi (Hrsg.)) 58, 267–360 (1995)), Fluorophor-gestützte Kohlenhydratelektrophorese (Starr et al., J. Chrom. A 720, 295–321 (1996)), Anionenaustauschchromatographie bei hohem pH mit gepulster arnperometrischer Detektion ("High pH anion exchange chromatography pulsed amperometric detection", HPAEC-PAD) (Lee, J. Chrom. A 720, 137–151 (1996)), matrixbasierte Laser-Desorptions/Ionisations-Flugzeitmassenspekrometrie (Harvey, J. Chrom. A 720, 429–447 (1996); Papac et al., Anal. Chem. 68, 3215–3223, 81996); Field et al., Anal. Biochem. 239, 92–98 (1996); Hooker et al., Biotechnology and Bioeng. 48, 639–648 (1995)), Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (EI Rassi, Reversed phase and hydrophobic interaction chromatography of carbohydrates and glycoconjugates. In, Carbohydrate Analysis (Z. EI Rassi (Hrsg.)) 58, 267–360 (1995)), Elektrosprayionisierungs-Massenspektrometrie, Roberts G. D. Anal. Chem. 67, 3613–3625 (1995)).
Neutral- und Aminozucker können mittels Hochleistungs-Anionenaustauschchromatographie, kombiniert mit gepulster amperometrischer Detektion (HPAE-PAD Carbohydrate System, Dionex Corp.) bestimmt werden. So können Zucker beispielsweise durch Hydrolyse in 20 Vol.-% Trifluoressigsäure bei 100 EC für 6 h freigesetzt werden. Die Hydrolysate werden dann durch Lyophilisierung oder mit einem Speed-Vac (Savant Instruments) getrocknet. Rückstände werden dann in einer 1%igen Natrium acetat-trihydrat-Lösung gelöst und auf einer HPLC-AS6-Säule analysiert, wie beschrieben von Anumula et al. (Anal. Biochem. 195, 269–280 (1991)).
Alternativ dazu kann eine Immunoblot-Kohlenhydratanalyse durchgeführt werden. Nach diesem Verfahren werden proteingebundene Kohlenhydrate mittels des handelsüblichen Glykandetektionssystems (Boehringer) detektiert, das auf dem oxidativen Immunoblot-Verfahren beruht, das von Haselbeck und Hosel beschrieben wurde (Haselbeck et al., Glycoconjugate J. 7, 63 (1990)). Die vom Hersteller empfohlene Färbevorschrift wird befolgt, mit der Ausnahme, dass das Protein auf eine Polyvinylidendifluorid-Membran anstatt auf eine Nitrocellulosemembran übertragen wird und dass die Blockierungspuffer 5% Rinderserumalbumin in 10 mM tris-Puffer, pH 7,4 mit 0,9% Natriumchlorid enthalten. Die Detektion erfolgt durch Anti-Digoxigenin-Antikörper, die mit einem alkalischen Phosphatasekonjugat (Boehringer) verbunden sind, bei 1:1000 Verdünnung in Tris-gepufferter Salzlösung unter Verwendung der Phosphatasesubstrate 4-Nitroblautetrazoliumchlorid, 0,03% (w/v) und 5-Brom-4 chlor-3-indoylphosphat 0,03% (w/v) in 100 mM Tris-Puffer, pH 9,5, mit 100 mM Natriumchlorid und 50 mM Magnesiumchlorid. Die Kohlenhydrat enthaltenden Proteinbanden werden normalerweise nach etwa 10 und 15 min sichtbar.
Das Kohlenhydrat kann auch durch Verdau mit Peptid-N-Glykosidase F analysiert werden. Gemäß diesem Verfahren wird der Rückstand in 14 Fl eines Puffers, der 0,18% SDS, 18 mM β-Mercaptoethanol, 90 mM Phosphat, 3,6 mM EDTA enthält, bei einem pH-Wert von 8,6 3 Minuten lang auf 100 EC erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wird die Probe in zwei gleich große Teile geteilt. Ein aliquoter Teil wird nicht weiter behandelt und dient als Kontrolle. Der zweite Teil wird auf etwa 1% Detergens NP-40 eingestellt, gefolgt von 0,2 Einheiten Peptid-N-Glykosidase F (Boehringer). Beide Proben werden 2 Stunden lang auf 37°C erwärmt und dann mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert.
Beispiele
Die folgenden Beispiele dienen einzig und allein zur Illustration dieser Erfindung und sollen nicht als Einschränkung des Schutzumfangs der Erfindung gedeutet werden.
Beispiel 1
PALA-resistente CHO-Zellen zeigen erhöhte
Carbamoylphosphat-Synthetase-II-Aktivität
CHO-DP12- und CHO-DG44-Ausgangszelllinien und CHO-DP-12, die TNFR-IgG und Anti-CD11a exprimiert, wurden sowohl mit als auch ohne P-Phosphonacetyl-L-aspartat (PALA) gezüchtet. Wie die schematische Darstellung in 2 zeigt, wurde jede Zelllinie bei 10% Konfluenz in 10-cm-Petrischalen unter Anwendung von Standard-Gewebekulturverfahren ausplattiert. Die Zellen wurden in serumhältigem Medium mit 0,1 mM PALA gezüchtet. Das Kulturmedium wurde wöchentlich ausgewechselt. Die überlebenden Klone wurden gepoolt und in steigenden Konzentrationen von PALA subkultiviert, bis die PALA-Zielkonzentration erreicht wurde, d.h., 2–10 mM PALA. Nach Selektion auf den PALA-Phänotyp (siehe unten) wurden die Zellen entweder in ein PALA-hältiges Medium oder in ein PALA-freies Medium transferiert und in Suspensions-Spinnerflaschen weiterkultiviert. Die Spinnerlaschen-Zellpopulationen wurden alle 4–7 Tage subkultiviert. Zellen, die in Gegenwart von PALA selektiert wurden, werden als PALA-resistente Zellen bezeichnet, während Zellen, die auf die oben beschriebene Art und Weise gezüchtet wurden, jedoch nicht mit PALA behandelt wurden, als Kontrollzellen bezeichnet werden.
CHO-Zellen, die mit 3 mM PALA behandelt worden waren, wurden nach dem von Mori und Tatibana allgemein beschriebenen Verfahren auf CPS-II-Aktivität, einem Indikator der CAD-Gesamtaktivität analysiert: Mori und Tatibana, Methods in Enzymology 51, 111–112 (1978). Zwei PALA-resistente CHO-Subkulturen, CHO-A und CHO-B, wurden analysiert, um sicherzustellen, dass die Ergebnisse dem PALA-resistenten Phänotyp entsprachen und nicht für eine Subpopulation der behandelten Zellen spezifisch waren.
Die Daten werden in 3 gezeigt. PALA-resistente Zellen zeigten gegenüber den Kontrollzellen erhöhte CPS-II-Aktivität. Im Besonderen zeigte die CHO-B-Zelllinie einen etwa zwanzigfachen Anstieg der CPS-II-Aktivität im Vergleich zu den Kontroll-CHO-Zellen.
Die Daten zeigen, dass PALA-resistente CHO-Zellen im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen erhöhte CPS-II-Aktivität und daher auch erhöhte CAD-Aktivität zeigen.
Beispiel II
PALA-resistente CHO-Zellen mit erhöhter CAD-Expression
Die in Beispiel 1 erhaltenen PALA-resistenten Zellen wurden verwendet, um festzustellen, ob die erhöhte CPS-II-Aktivität der PALA-resistenten Zellen ein Resultat erhöhter CAD-Expression in diesen Zellen war. Die CAD-Expression wurde an PALA-resistenten Zellen mittels eines RNase-Schutzversuchs ähnlich dem von Mahler und McGuire beschriebenen Verfahren gemessen: Mahlen and McGuire, J. Clin. Invest. 86, 1641–1648 (1990). Im Besonderen wurden TRY-Zellen unter Anwendung von 2 mM PALA selektiert und die CAD-mRNA-Expression mittels eines RNase-Schutzversuchs gemessen.
Die Daten werden in 4 dargestellt und zeigen, dass die erhöhte CPS-II-Aktivität in PALA-resistenten Zellen mit erhöhter CAD-Expression in diesen Zellen übereinstimmt. Im Vergleich zu den Kontrollzellen ist ein mehr als zweifacher Anstieg der CAD-mRNA in den PALA-behandelten Zellen festzustellen.
Beispiel III
Erhöhtes intrazelluläres UTP in Zellen mit erhöhter CAD-Aktivität
Die PALA-resistenten Zellen aus Beispiel 1 wurden verwendet, um festzustellen, ob PALA-resistente Zellen erhöhte UTP-Expression zeigen.
CHO-Zellen wurden mit 5 mM PALA behandelt, Zellextrakte wurden vorbereitet und Nukleotide mittels eines ähnlichen Verfahrens wie jenes von Ryll und Wagner gemessen: Ryll and Wagner, J. Chromatography 570, 77–88 (1991). Der Versuch wurde über einen Zeitraum von 10 bis 90 Tagen durchgeführt, und die Daten wurden als UTP-Gehalt PALA-resistenter Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen quantifiziert und dargestellt.
Wie 5 zeigt, weisen PALA-resistente Zellen mit erhöhter CAD-Aktivität deutlich erhöhte UTP-Elutionpeaks im Vergleich zum UTP-Elutionspeak bei den Kontrollzellen auf. 6 zeigt, dass die erhöhten UTP-Konzentrationen in den PALA-resistenten Zellen über einen Zeitraum von mindestens 90 Tagen stabil waren. PALA-resistente Zellen zeigten einen ungefähren Anstieg von 200–350% des UTP-Gehalts im Vergleich zu Kontrollzellen während der Gesamtdauer des Experiments.
Die Daten zeigen, dass Zellen mit erhöhter CAD-Aktivität auch erhöhte UTP-Spiegel aufweisen. Die CPS-II-Aktivität wird bekanntermaßen durch UTP negativ inhibiert (Carry, EMBO J. 4, 3735–3742 (1985); Chernova et al., MCB 18, 536–545 (1998)). Die CPS-II-Aktivität wird daher den Erwartungen zufolge bei hohen intrazellulären UTP-Konzentrationen niedrig (gehemmt) sein. Gleichermaßen wird die CPS-II-Aktivität bei niedrigen intrazellulären UTP-Levels erwartungsgemäß hoch (ungehemmt) sein. Wie die 5 und 6 jedoch zeigen, war dies überraschenderweise bei Zellen, die auf erhöhte CAD-Aktivität selektiert wurden, nicht der Fall. Zellen mit erhöhter CAD-Aktivität zeigten auch erhöhte intrazelluläre UTP-Spiegel. Dieser Phänotyp mit erhöhtem UTP-Niveau war ziemlich stabil, da die Zellen mit erhöhter CAD-Aktivität für einen Zeitraum von zumindest 90 Tagen erhöhte UTP-Spiegel zeigten.
Beispiel IV
Zellen mit erhöhter CAD-Aktivität weisen erhöhte UDP-Galactose-Spiegel und vermutlich erhöhte Glykosylierung auf
Die PALA-resistenten Zellen und Verfahren aus Beispiel 1 wurden verwendet, um herauszufinden, ob PALA-resistente Zellen erhöhte UDP-Galactose-Expression zeigten. Weiters wurden PALA-resistente CHO-DP12-Zellen, die TNFR-IgG exprimierten, bei 4 × 10⁶ Zellen pro ml in Spinnerflaschenkulturen überimpft und dann 6 Tage lang bei 31°C und 6 mM Butyrat inkubiert. Der Zellkulturüberstand wurde geerntet und TNFR-IgG durch das nach dem Stand der Technik bekannte Verfahren der Protein-A-Immunaffinitäts-Chromatographie gewonnen. N-gebundene Glykane wurden nach dem von Papac et al. allgemein beschriebenen Verfahren durch MALDI-Massenspektrometrie analysiert: Papac et al., Anal. Chem. 68, 3215–3223 (1996). Der Sialsäuregehalt des TNFR-IgG wurde unter Anwendung des von Anumula allgemein beschriebenen Verfahrens bestimmt: Anumula, Anal. Biochem. 230, 24–30 (1995).
Die UTP-Galactosedaten werden in den 5 und 6 gezeigt. In 5 zeigten PALA-resistente Zellen mit erhöhter CAD-Aktivität im Vergleich zum UDP-Galactose-Elutionspeak der Kontrollzellen einen deutlich erhöhten UDP-Galactose-Elutionspeak. In 6 waren die erhöhten UDP-Galactosekonzentrationen in den PALA-resistenten Zellen über einen Zeitraum von mindestens 90 Tagen stabil. PALA-resistente Zellen zeigten im Vergleich zu den Kontrollzellen während der gesamten Versuchsdauer einen Anstieg des UDP-Galactosegehalts von etwa 200–350%. Weiters wird erwartet, dass sowohl die N-gebundenen Glykane als auch der Sialsäuregehalt des TNFR-IgG aus Zellen mit erhöhter CAD-Aktivität im Vergleich zu den Kontrollzellen erhöht ist.
Die Daten zeigen, dass PALA-resistente Zellen mit erhöhter CAD-Aktivität auch erhöhte intrazelluläre UDP-Galactosespiegel aufweisen. Der prozentuelle Anstieg ist ähnlich dem oben in Beispiel III angeführten UTP-Anstieg. Die UDP-Galactosekonzentrationen sind daher, wie UTP, in Zellen mit erhöhter CAD-Aktivität deutlich angestiegen. Da Fütterungsstudien gezeigt haben, dass erhöhte intrazelluläre UDP-Galactosekonzentrationen mit erhöhter Proteinglykosylierung korrelieren, deuten die vorliegenden Daten darauf hin, dass erhöhte CAD-Aktivität sowie erhöhte intrazelluläre UDP-Galactose in den selektierten Zellen zu erhöhter Glykosylierung von in den Zellen produzierten Proteinen führt. UDP-Galactose ist ein bekanntes Substrat im Glykosylierungs-Stoffwechselweg.
Beispiel V
Mit Uridin gefütterte Zellen weisen erhöhte UTP-Spiegel auf
CHO-Zellen wurden unter Anwendung von Standard-Gewebekulturverfahren sowohl mit als auch ohne 1 bis 20 mM Uridin 18 Stunden lang inkubiert und dann mittels eines Verfahrens ähnlich jenem von Ryll und Wagner auf ihre UTP-Konzentrationen getestet. Quantifizierte Daten der 0, 1, 2, 5, 10 und 20 mM Uridinkulturen wurden als Funktion der normalisierten intrazellulären UTP-Konzentrationen graphisch dargestellt. Alternativ dazu wurden CHO-Zellen in Gegenwart von 0,2 mM Uridin oder 11 mM Galactose kultiviert und nach dem Verfahren von Ryll und Wagner auf ihre UTP-Konzentrationen getestet.
Die Daten sind in den 7 und 8 dargestellt. In 7 zeigen die Daten, dass eine Fütterung der CHO-Zellen mit Uridin in Abhängigkeit von der Dosis zu einem Anstieg der UTP-Spiegel innerhalb der Zelle führt. In 8 bestätigen die Daten, dass eine Fütterung der CHO-Zellen mit Uridin zu einem dramatischen Anstieg der DTP-Spiegel innerhalb der Zelle führt. Weiters zeigen die Daten in 8, dass eine Fütterung der Zellen mit Galactose im Gegensatz zu Uridin nicht zu erhöhten UTP-Spiegeln innerhalb der Zelle, aber sehr wohl zu erhöhten UDP-Galactosespiegel in den Zellen führt.
Die Daten zeigen, dass eine Inkubation von CHO-Zellen in Uridin zu einem Anstieg der UTP-Spiegel innerhalb der Zellen führt. Dieser Anstieg der UTP-Spiegel war das Ergebnis der Behandlung mit Uridin, da eine Behandlung mit Galactose die zellulä ren UTP-Spiegel nicht beeinflusste (was das erwartete Ergebnis ist, da Galactose kein Substrat für die UTP-Produktion ist – siehe 9).
Beispiel VI
Mit Uridin gefütterte Zellen weisen erhöhte Galactosylierung auf
Eine CHO-Zelllinie, die ein rekombinantes Glykoprotein, nämlich den monoklonalen Antikörper (Mab) aCD20, produziert, wurde sowohl mit als auch ohne 0,5 bis 1,0 mM Uridin für einen Zeitraum von 7 Tagen kultiviert. Sekretierter aCD20-MAb wurde dann nach dem Verfahren von Ma & Nashabeh immunaffinitätsgereinigt: Ma & Mashabeh, Analytical Chemistry 71 (22), 5185–92 (1999). Gereinigter aCD20 wurde unter Anwendung des Kapillarelektrophoreseverfahrens von Ma & Nashabeh auf Galactosegehalt getestet und dann als prozentueller Galactosegehalt graphisch dargestellt.
Die Daten werden in 10 gezeigt. In 10 wies der aCD20-MAb aus mit Uridin behandelten Zellen einen viel höheren Galactosegehalt als der aCD20 aus nicht mit Uridin behandelten Kontrollzellen auf.
Die Daten zeigen, dass Zellen mit erhöhten UTP-Konzentrationen erhöhte Galactosylierung von in den Zellen produziertem Protein aufweisen.
Diese Beispiele zusammen zeigen, dass Zellen, die erhöhte CAD-Levels exprimieren, ausgezeichnete Wirte für die Expression endogener und heterologer Glykoproteinproduktion sind. Zellen mit erhöhter CAD-Aktvität haben erhöhte UTP-Pools und sind daher in der Lage, erhöhte Glykosylierung zu unterstützen. Zellen, die fähig sind, erhöhte Glykosylierung zu unterstützen, sind entscheidend für die Produktion von Glykoproteinen mit erhöhtem Oligosaccharidgehalt.
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Claims

Verfahren zur Herstellung von Glykoprotein mit erhöhter Glykosylierung in einer Zelle, umfassend: – das Exprimieren von Glykoprotein in Zellen mit verstärkter CAD-(Carbamoylphosphatasesynthetase-II (CPSII)/Aspartattranscarbamoylase (ATCase)/Dihydroorotase-Multienzympolypeptidkomplex-)Aktivität im Vergleich zu Kontroll-Wirtszellen; und – dadurch die Herstellung von Glykoproteinen mit erhöhter Glykosylierung im Vergleich zu Kontroll-Wirtszellen.
Verfahren zur Herstellung von Glykoprotein mit erhöhter Glykosylierung in einer Zelle, die folgenden Schritte umfassend: – das Selektieren von Zellen, die gegenüber einem CAD-Inhibitor resistent sind, und das Exprimieren von Glykoprotein in diesen resistenten Zeilen, worin diese Expression Glykoprotein bildet, das erhöhte Glykosylierung im Vergleich zu Kontroll-Wirtszellen aufweist.
Verfahren nach Anspruch 2, worin der CAD-Inhibitor N-Phosphonacetyl-L-aspartat ist.
Verfahren nach Anspruch 2, worin die resistenten Zellen CHO-Zellen oder Insektenzellen sind.
Verfahren nach Anspruch 2, worin die Expression Glykoproteine bildet, die erhöhte Glykosylierung und/oder Sialylierung im Vergleich zu Kontroll-Wirtszellen aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 1, worin erhöhte CAD-Aktivität durch die Überexpression von zumindest einem Teil von CAD bereitgestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin erhöhte CAD-Aktivität durch die Expression eines mutierten CAD bereitgestellt wird, worin die Mutation Inhibitionsregulation durch CAD-Produkte reduziert.
Verfahren nach Anspruch 7, worin der mutierte CAD Inhibitionsregulation durch UTP oder UTP-Analoga reduziert.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, weiters umfassend die Gewinnung des Glykoproteins aus dem Kulturmedium.