DE3786771T2

DE3786771T2 - Für inaktivierte IMP-Dehydrogenase kodierende DNS.

Info

Publication number: DE3786771T2
Application number: DE87311199T
Authority: DE
Inventors: Hiroyuki Kimura; Kenichiro Miyagawa; Yasuhiro Sumino
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1986-12-26
Filing date: 1987-12-18
Publication date: 1993-11-11
Anticipated expiration: 2007-12-19
Also published as: CN87101275A; EP0273660A3; ES2058133T3; ATE92101T1; JPH01174385A; DE3786771D1; KR880007735A; EP0273660B1; CN1018846B; EP0273660A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Herstellungsverfahren für Inosin, einer bedeutenden Substanz als Ausgangsmaterial für die Synthese von 5'-Inosinsäure, neuer Mikroben, die zu seiner Herstellung verwendet werden und neuer DNAs, die zur Erschaffung der neuen Mikroben verwendet werden.
Bezüglich der Herstellung von Inosin durch Fermentation sind Verfahren bekannt, die einen Bacilluss Stamm (Japanische veröffentlichte geprüfte Patentanmeldung Nr. 2956/1980, Japanische veröffentlichte geprüfte Patentanmeldung Nr. 41915/1982, Japanische veröffentlichte ungeprüfte Patentanmeldung Nr. 42895/1984) einen Brevibacterium Stamm 8Japanische veröffentlichte geprüfte Patentanmeldung Nr. 5075/1976, Agricultural Biological Chemistry, 42, 399 (1978)] oder dergleichen verwenden, der entweder einen Adeninbedarf oder verschiedene Medikamentenresistenzen wie auch einen Adeninbedarf hat. Von diesen Bakterienstämmen nimmt man an, daß ihr Purin-Nucleotid-Biosynthesesystem gestärkt wurde.
Andererseits wurde das Gewinnen von IMP-Dehydrogenase- Mangelstämmen in einem Verfahren zur Massenspeicherung von Inosin für nützlich gehalten, weil erwartet wird, daß, wenn IMP-Dehydrogenase (5'-Inosinsäuredehydrogenase) defekt ist, 5'-Inosinsäure, ein Zwischenprodukt der Inosinherstellung, sich selbst wirksam in Inosin umwandelt, ohne sich selbst in 5'-Guanylsäure umzuwandeln. Zu diesem Zweck sind Xanthin- oder Guanin erfordernde Stämme herkömmlicherweise unter Verwendung der Replica-Methode oder dergleichen auf dem Wege der mutagenen Behandlungen, wie z. B. Ultraviolettbestrahlung und Nitrosoguanidin(NTG)behandlung ausgewählt worden.
Jedoch haben auxotrophe Organismen, die auf diese Weise erhalten wurden, einige Nachteile; z. B. ist ihre Produktivität in einigen Fällen wegen der Mutationen in anderen Regionen als denen des relevanten Enzyms auf dem Chromosom, geringer als die ihrer Elternstämme, und ihre Produktivität schwankt oft abnehmend wegen der Rückmutation bei der Fermentation.
Im Licht dieser Umstände erforschten die Erfinder der vorliegenden Erfindung wie IMP-Dehydrogenase-Mangelstämme zu erhalten sind; als Ergebnis gelang es den Erfindern der vorliegenden Erfindung neue Mikroben unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken zu konstruieren, die eine chromosomale DNA der Struktur aufweisen, in der eine eine IMP-Dehydrogenase codierende Gen-DNA ein geeignetes DNA-Fragment einschließt, das von außerhalb der Gen-DNA ausgewählt ist. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung fanden, daß die neuen Mikroben, die unter Verwendung der genannten Techniken aus Empfängermikroben induziert wurden, die aus den Adeninerfordernden Bacillus-Bakterien ausgewählt wurden, wiederholt zur hoch stabilen Inosinherstellung verwendet werden können, da sie eine große Menge Ionsin anhäufen und die Rückmutationsrate für die IMP-Dehydrogenase-Aktivität während der Fermentation nicht über der Nachweisgrenze liegt. Die vorliegende Erfindung wurde auf diesem Befund basierend vervollständigt.
Das heißt, die vorliegende Erfindung umfaßt:
1. Eine DNA, die eine inaktivierte IMP-Dehydrogenase codiert, die hoch homolog zu der einer IMP-Dehydrogenasegenregion von Bacillus-Stämmen und/oder ihren flankierenden Regionen ist.
2. DNA, wie in Punkt (1) oben definiert wurde, worin die DNA eine IMP-Dehydrogenase-Genregion hat, in die ein DNA-Fragment inseriert ist, um das Gen zu inaktivieren.
3. DNA, wie in Punkt (2) oben definiert wurde, worin das DNA-Fragment ein anderes Gen als ein IMP-Dehydrogenase- Gen ist.
4. DNA, wie in Punkt (3) oben definiert wurde, worin das andere Gen ein Selektionsmarkergen ist.
5. DNA, wie in Punkt (1) oben definiert wurde, worin die DNA eine ist, bei der ein Teil oder die gesamte IMP-Dehydrogenase-Genregion deletiert ist.
6. Vektoren, die eine DNA enthalten, wie in den Punkten (1), (2), (3), (4) oder (5) oben definiert wurde.
7. Ein Bacillusstamm, der mit der DNA, wie in den Punkten (1) bis (5) oben definiert wurde, oder Vektoren, wie in dem Punkt (6) oben definiert wurde, transformiert ist und
8. ein Verfahren zur Herstellung von Inosin, umfassend das Kultivieren eines IMP-Dehydrogenase-Mangelstamm-Bacillus, der mit DNA transformiert ist, die eine inaktivierte IMP-Dehydrogenase codiert, die hoch homolog zu derjenigen einer IMP-Dehydrogenase-Genregion und/oder ihren flankierenden Regionen ist oder eines Vektor, in den die DNA inseriert ist und der befähigt ist, Inosin zu bilden, in einem Medium, und das Ernten des so in dem Kulturmedium gebildeten Inosins.
Als DNA, die eine IMP-Dehydrogenase-Genregion für die vorliegende Erfindung enthält, kann eine DNA verwendet werden, die aus mikrobieller, chromosomaler DNA mittels einer herkömmlichen Methode unter Verwendung eines Restriktionsenzyms herausgeschnitten ist. Z.B. kann eine DNA, die mit dem in der Japanischen veröffentlichten, ungeprüften Patentanmeldung Nr. 156388/1985 und der entsprechenden Europäischen Patentanmeldung Nr. 0 151 341 beschriebenen Verfahren isoliert und geclont wurde, verwendet werden. In diesem Fall ist es wünschenswert, daß die DNA sowohl die gesamte Region einer IMP-Dehydrogenase-codierenden DNA, als auch einige flankierende Regionen davor und dahinter enthält; jedoch können auch DNAs, die sowohl einen Teil der Region eines IMP-Dehydrogenase-Gens oder sowohl einen Teil der Region des Gens, als auch seiner flankierenden Regionen enthalten, verwendet werden.
In der obigen Definition kann jede beliebige DNA für die gesamte Region einer IMP-Dehydrogenase-codierenden DNA verwendet werden, solange sie 1,85 Kilobasenpaare des Xba-I-Hin CII-Fragments hat.
Als Donor eines IMP-Dehydrogenase-Gens kann im Prinzip jede beliebige Mikrobe ohne irgendeine besondere Begrenzung ihres Ursprungs verwendet werden, solange die Basensequenz des IMP-Dehydrogenase-Gens des relevanten Bakterienstammes hoch homolog zu der des IMP-Dehydrogenase-Gens auf dem Chromosom des Bacillusstammes ist, der als Rezipient, wie im folgenden beschrieben wird, dient. Besonders ist die Verwendung eines Bacillusstammes auch vom Standpunkt der Handhabung aus, wegen des sogenannten Selbstclonens, bevorzugt; zusätzlich wird erwartet, daß der so erhaltene Transformant stabil ist. Für den Donor ist es nicht immer erforderlich, eine Fähigkeit der Bildung von Inosin, Guanosin, Xanthosin oder ihrer Purinbasen zu haben, aber die Verwendung eines Mikroorganismus, der keinen Mangel an IMP-Dehydrogenase hat, ist bevorzugt. Als Beispiele solcher DNA-Donoren können Bacillusstämme, wie z. B. Bacillus subtilis, Bacillus pumilus und Bacillus licheniformis erwähnt werden. Bakterienstämme, die verwendet werden können, schließen die folgenden, bekannten Mikroorganismen ein:
Bacillus subtilis NA-6011(IFO 14189, FERM BP-291)
Bacillus subtilis NA-6012(IFO 14190, FERM BP-292)
Bacillus subtilis NA-7821(IFO 14368, FERM BP-618)
Bacillus subtilis NA-6128(IFO 14373, FEPM BP-617)
Bacillus subtilis Nr. 115 (IFO 14187)
Bacillus subtilis Nr. 168 (BGSC Nr. 1A1)
Bacillus subtilis MI114 [Gene, 24, 255 (1983)]
Bacillus pumilus (FERM P-2116)
Bacillus pumilus (FERM P-4832)
Bacillus pumilus (FERM P-4829)
Bacillus licheniformis ATCC8480
Bacillus licheniformis IF012485
BGSC The Bacillus Genetic Stock Center
IFO Zugangsnummer bei Institute for Fermentation, Osaka (IFO), 17-85 Juso-honmachi 2 chome Yodogawa-ku, Osaka 532, Japan
FERM P Zugangsnummer bei Fermentation Research Institute (FRI), Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, 1-3 Higashi 1-chome, Yatabemachi, Tsukuba-gun, Ibaragi-ken, Japan
FERM BP FRI Zugangsnummer basierend auf dem Budapester Vertrag.
Zusätzlich können bereits geclonte IMP-Dehydrogenase-Gene eines Bacillusstammes sicherlich auch als Donoren für DNA in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, welches Wirt- Vektorsystem auch immer verwendet wurde. Als Beispiel solch eines geclonten IMP-Dehydrogenase-Gens kann pEX 117 erwähnt werden, das aus der Clonierung einer IMP-Dehydrogenase-Genenthaltenden DNA resultiert, die von einem Bacillus subtilis Stamm NA-6012 auf pBR 322 (Japanische veröffentlichte ungeprüfte Patentanmeldung Nr. 156388/1985) abgeleitet ist. pEX 117 kann aus Esherichia coli TEX 117 extrahiert werden, der das Plasmid durch das in "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", T. Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory, veröffentlicht durch University of Tokyo Press, 1982, S. 86 bis 93 beschriebene Verfahren trägt.
Für den Aufbau und das Isolieren der DNAs in der vorliegenden Erfindung, ist die Verwendung rekombinanter DNA-Techniken geeignet. Für das zu diesem Zweck verwendete Wirt-Vektorsystem, können EK-Systeme in geeigneter Weise verwendet werden, d. h. Stämme, die in geeigneter Weise als Wirte verwendet werden, schließen Stämme ein, die sich vom Esherichia coli Stamm K-12, wie z. B. Esherichia coli C600 ("Molecular Cloning", S. 504), Esherichia coli JA 221 (IFO 14359) und Esherichia coli 294 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73, 4174 (1976)] und von Stämmen ableiten, die hiervon abgeleitet sind [z. B. Esherichia coli X-895 (IFO 14308, FERM BP-614), der durch den C600 Stamm induziert ist] und Vektoren, die in geeigneter Weise verwendet werden können, umfassen pBR 322, pACYC 184, pACYC 177, pUC 18, pUC 19, pHSG 396 und pHSG 298.
Die neuen DNAs der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung des unten gezeigten Verfahrens aus Plasmiden aufgebaut und isoliert werden, die ein IMP-Dehydrogenase-Gen enthalten.
Die gewünschte DNA kann durch Aufschließen eines Plasmids, das ein IMP-Dehydrogenase-Gen enthält, mit einem Restriktionsenzym mit einem herkömmlichen Verfahren, indem das mit Restriktionsenzymen nach einem herkömmlichen Verfahren zu inserierende DNA-Fragment getrennt geschnitten wird, durch Extrahieren und Isolieren des Schnittes nach der Trennung z. B. durch Agarosegelelektrophorese falls erforderlich, durch Mischen der beiden und ihrem Zusammenligasieren unter Verwendung von T4 DNA-Ligase, entweder direkt, in Fällen wo ihre klebrigen Enden untereinander gleich sind, oder nach dem Konvertieren ihrer klebrigen Enden in glatte Enden unter Verwendung von T4 DNA-Polymerase, in Fällen, wo die klebrigen Enden verschieden von einander sind, erhalten werden.
Als Restriktionsenzym zum Aufschließen eines Plasmids, das ein IMP-Dehydrogenase-Gen enthält, kann jedes beliebige Restriktionsenzym verwendet werden, solange es einige Restriktionsstellen auf der relevanten Gen-DNA aufweist; jedoch ist zu bevorzugen, daß ein Restriktionsenzym, das eine kleine Zahl an Restriktionsstellen auf dem relevanten Gen hat und das nicht irgendeine andere Region des relevanten Plasmids aufschließt, ausgewählt wird. Z.B. können Afl II, Apa I, Axy I, Bam HI, Bcl I, Bgl II, Bst EII, Cla I, Eco RI, Eco 81I, Hpa I, Hin dIII, Kpn I, Mlu I, Nco I, Pst I, Sac I, Sac II, Sal I, Sma I, Sph I, Spl I, Ssp I, Stu I, Xba I und Xho I in geeigneter Weise verwendet werden.
In der vorliegenden Erfindung kann als das in die IMP-Dehydrogenase-Genregion zu inserierende DNA-Fragment jedes beliebige DNA-Fragment, gleich, welchen Ursprungs, verwendet werden, solange es das Gen inaktiviert, einschließlich der DNA-Fragmente von Prokaryonten und Eukaryonten. Normalerweise ist es für die praktische Anwendung vorteilhaft, ein DNA-Fragment zu verwenden, das ein Selektionsmarkergen enthält, so daß IMP-Dehydrogenase inaktiviert ist und die Tranformantenselektion einfacher wird.
Jedes beliebige Gen kann als solch ein Selektionsmarker verwendet werden, solange es sich selbst in einem Bacillusstamm exprimiert, aber es ist bevorzugt, daß sich das Markergen in Esherichia coli selbst exprimiert. In diesem Fall kann die Markergenexpression in einem Bacillusstamm und die in Esherichia coli vom "Überlesen"-Typ sein; es ist daher nicht immer erforderlich, daß das zu inserierende DNA-Fragment einen Promotor hat, der sich selbst in dem relevanten Wirt exprimiert.
Als Beispiele für solche Markergene wurden Medikamentenresistenzgene, Aminosäurebiosynthesegene, Nucleinsäurebiosynthesegene und Vitaminbiosynthesegene erwähnt. Als Beispiele für Medikamentenresistenzgene kann das Bacillus pumilus Chloramphenicol-Acetyltransferase-Gen [D. M. Williams et al., J. Bacteriol., 146, 1162 (1981)], das Plasmid pC 194 Chloramphenicol-Acetyltransferase-Gen [S. Horinouchi und B. Weisblum, J. Bacteriol. 150, 815 (1982)] und das Plasmid pUB 110 Kanamycin-Nucleotidyltransferase-Gen [M. Matsumura et al., J. Bacteriol., 160, 413 (1984)] erwähnt werden. Als Beispiele für Aminosäurebiosynthesegene können Bacillus subtilis Leucin-Gen [T. Tanaka und K. Sakaguchi, Molec. Gen. Genet. 165, 269 (1978)] und Bacillus amyloliquifacience Tryptophan-Gen [K. Yoshimura et al., J. Bacteriol., 159, 905 (1984)] erwähnt werden; als Beispiel für ein Nucleinsäuregen kann Esherichia coli Thymidinsynthetase-Gen [Rubin et al., Gene, 10, 227 (1980)] erwähnt werden; als ein Beispiel eines Vitamingens kann Maus-Dihydrofolatreductase [D. M. Williams et al., Gene, 16, 199 (1981)] erwähnt werden.
Transformanten mit einem inserierten und inaktivierten IMP-Dehydrogenase-Gen können leicht entweder durch Hinzufügen des relevanten Antibiotikums zum Selektionsmedium in Fällen, wo z. B. eine DNA, die ein Medikamentenresistenzgen enthält, verwendet wird, oder durch Komplementieren von Auxotrophie in Fällen, wo ein Biosynthesegen als Marker verwendet wird, selektiert werden.
Der Aufbau eines Selektionsmarkergen-DNA-Fragments kann, wie unten beschrieben wird, erreicht werden.
Eine Selektionsmarkergen-DNA kann aus einem kleinen Teil Agarosegel, das die DNA enthält, gemäß einem publizierten Verfahren, wie z. B. dem Verfahren, das in Molecular Cloning, S. 164 bis 166 beschrieben ist, nach dem Fraktionieren mittels Agarosegelelektrophorese der Fragmente, die durch Aufschließen eines das Gen enthaltenden Rekombinanten mit einem passend ausgewählten Restriktionsenzym, erhalten wurden, isoliert werden. Als das in diesem Fall verwendete Restriktionsenzym wird vorzugsweise ein Restriktionsenzym ausgewählt, das keine Restriktionsstelle auf dem relevanten Gen hat und das ein das Gen enthaltendes Fragment, das so klein wie möglich ist, zur Verfügung stellt. Zwei geeignete Restriktionsenzyme können nach Bedarfin Kombination verwendet werden. In Fällen, wo kein Ende des so erhaltenen Selektionsmarkergen-DNA-Fragments an das klebrige Ende der Restriktionsstelle des IMP-Dehydrogenase-Gens paßt, in das das DNA-Fragment inseriert werden soll, kann die Ligasierung ermöglicht werden, indem das klebrige Ende in ein glattes Ende umgewandelt wird.
Andererseits kann in der vorliegenden Erfindung die DNA, die einen Teil oder die gesamte IMP-Dehydrogenase-Genregion deletiert und flankierende Regionen des Gens hat, folgendermaßen erhalten werden:
Das das IMP-Dehydrogenase-Gen enthaltende Plasmid wird völlig oder teilweise mit dem Restriktionsenzym aufgeschlossen, dessen Spaltstelle(n) auf der relevanten Genregion ist/sind. Die gewünschte DNA wird durch Religasieren der oben aufgeschlossenen DNA erhalten, nachdem ihre klebrigen Enden in glatte Enden umgewandelt waren. Die flankierenden Regionen schließen DNAs ein, die etwa 0,05 Kilobasenpaare oder mehr, vorzugsweise etwa 0,1 bis 10 Kilobasenpaare außer denen der betreffenden 5'-Stromaufwärts und 3'-Stromabwärts der IMP-Dehydrogenase-Genregion haben.
Das Verfahren, um die DNA der vorliegenden Erfindung unter Verwendung eines Restriktionsenzyms zu erhalten, das z. B. zwei Spaltstellen auf der relevanten IMP-Dehydrogenase-Genregion hat, wird weiter im Einzelnen erklärt.
Das rekombinante Plasmid, das das relevante Gen enthält, wird mit dem Restriktionsenzym aufgeschlossen und dann wird das Enzym durch ein Verfahren, wie z. B. Erwärmen, inaktiviert. Die DNA wird mit Phenol gereinigt, mit kaltem Ethanol ausgefällt und mit einer T4 DNA-Ligase religasiert.
Ein anderes Verfahren kann auch angewandt werden: Nach Aufschließen mit dem Restriktionsenzym, wird das zu deletierende DNA-Fragment unter Verwendung der Agarosegelelektrophorese von dem aufgeschlossenen Produkt entfernt, und dann werden die verbleibenden DNAs mit einer T4 DNA-Ligase ligasiert. Auf diese Weise ergeben die obigen Verfahren die DNA der vorliegenden Erfindung, die ein kleines Fragment gemäß zwei Spaltstellen des Restriktionsenzyms auf der die IMP-Dehydrogenase codierenden DNA-Region deletiert.
In dem Fall, wo die gemäß der vorliegenden Erfindung unter Verwendung eines Restriktionsenzyms hergestellte DNA drei oder mehr Spaltstellen auf der IMP-Dehydrogenase-Genregion oder wenigstens eine Spaltstelle auf irgendeiner Region des die IMP-Dehydrogenase-Genregion enthaltenden Plasmids zusätzlich zu der (den) Spaltstelle(n) auf der relevanten Genregion hat, kann die gewünschte DNA durch Religasieren nach dem Teilaufschluß der Plasmid-DNA mit dem Restriktionsenzym erhalten werden. Weiter kann die DNA der vorliegenden Erfindung auch unter Verwendung eines Restriktionsenzyms erhalten werden, das die alleinige Spaltstelle auf der IMP-Dehydrogenase-Genregion hat. In diesem Fall wird die Start-DNA mit solch einem Restriktionsenzym aufgeschlossen und die resultierende, aufgeschlossene DNA wird, nachdem ihre klebrigen Enden, falls vorhanden, in glatte Enden umgewandelt waren, religasiert, um die gewünschte DNA zu ergeben. Das Hinzufügen eines Nucleotids zu den klebrigen Enden oder das Entfernen eines Nucleotids von den klebrigen Enden tritt bei der Gelegenheit der Konversion auf, und die gewünschte DNA kann erhalten werden. Deletion eines Fragments aus der IMP-Dehydrogenase-Genregion wird auch beim Verwenden von einem Paar verschiedener Arten von Restriktionsenzymen, von denen jedes eigene Spaltstellen auf der Genregion hat, erreicht.
Eine neue DNA der vorliegenden Erfindung kann in großer Menge durch Transformieren des Wirtstammes mit einer T4 DNA-Ligase Ligasierungsmischung, wie oben beschrieben wurde, um einen Transformanten zu gewinnen, der auf einem Selektionsmedium wächst, der dem inserierten Selektionsmarker entspricht und Weiterverarbeiten dieses Transformanten gemäß des per se bekannten Verfahrens, wie z. B. des oben erwähnten Verfahrens, das in "Molecular Cloning", S. 86 bis 93 beschrieben ist, erhalten werden.
Betreffend die Isolierung der Marker-inserierten IMP-Dehydrogenase-Genregion aus dem so erhaltenen Plasmid, kann die Genregion leicht unter Verwendung z. B. eines Elektroeluters, nachdem die Fragmente, die durch Spaltung des Plasmids mit einem Restriktionsenzym nach einem herkömmlichen. Verfahren durch Agarosegelelktrophorese getrennt worden waren, extrahiert und isoliert werden.
Andererseits kann eine DNA in einer großen Menge erhalten werden, die einen Teil oder das gesamte IMP-Dehydrogenase- Gen deletiert, durch Transformieren des Xanthin erfordernden Wirtstammes mit einer T4 DNA-Ligase Ligasierungsmischung wie oben beschrieben wurde, um einen Transformant zu erhalten, der befähigt ist, auf einem Minimalmedium, dem eine für das Wachstum des Wirtstammes essentielle Substanz und ein Selektionsmedikament zugegeben wurde, zu wachsen und unfähig ist, auf einem xanthinfreien Medium zu wachsen.
Das Verfahren des Aufbaus einer neuen Mikrobe durch Transformieren eines Bacillus Stammes mit der neuen, so erhaltenen DNA, wird nachfolgend beschrieben.
Jeglicher Mikroorganismus kann als Rezipient für diese Transformation verwendet werden, solange er eine Fähigkeit hat, eine lineare DNA aufzunehmen, die außerhalb der Bakterienzelle zur Verfügung gestellt wurde, gefolgt von der Rekombination in einer zu der Basensequenz der DNA auf dem Chromosom hoch homologen Region, um sich selbst zu tranformieren, d. h. was mit Transformationsfähigkeit bezeichnet wird; es ist nicht immer für den Rezipienten erforderlich, mit dem IMP-Dehydrogenase-Gendonor identisch zu sein, solange die Basensequenz seiner chromosomalen DNA eine hohe Homologie zu dem IMP-Dehydrogenase-Gen zeigt, das in der linearen DNA enthalten ist. Zum Zweck des Erhaltens von Tranformanten, die eine hohe Inosinproduktivität besitzen, werden Bacillusstämme, besonders Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis und dergleichen vom Standpunkt der Tatsache aus bevorzugt, daß von diesen Mikroben bekannt ist, daß sie wenigstens 1 der Purinsubstanzen, wie z. B. Inosin, Guanosin und Xanthosin speichern, eine Fähigkeit der Transformation besitzen, keine Pathogenität haben und auch im industriellen Maßstab sicher verwendet wurden.
Außerdem wenn eine dieser Mikroben, die vorher entweder mit 1 oder nicht weniger als 2 der bekannten Eigenschaften zur Verfügung gestellt wurden, die für die Speicherung von Purinsubstanzen, wie z. B. purinanaloge Resistenzen, einschließlich 8-Azaguaninresistenz, Nucleosid-Phospholylasemangel und Folatantagonist-Resistenz, für günstig gehalten wurden, als Rezipient verwendet wird, werden in vielen Fällen günstigere Ergebnisse für die Verbesserung der Inosinproduktivität erhalten.
Als Beispiele von Bacillusbakterien, die als Rezipienten verwendet werden können, können folgende erwähnt werden:
Bacillus subtilis (B.G.S.C. Nr. 1A3)
Bacillus subtilis BM 1032 (IFO 14559, FERM BP-1242;
hinterlegt am 25. Dezember 1986)
Bacillus subtilis NA-6011 (IFO 14189, FERM BP-291)
Bacillus subtilis NA-6012(IFO 14190, FERM BP-292)
Bacillus subtilis NA-6128(IFO 14373, FERM BP-617)
Bacillus subtilis NA-7821(IFO 14368, FERM BP-618)
Bacillus subtilis ATCC 19221
Bacillus subtilis ATCC 14662
Bacillus pumilus (FERM P-2116)
Bacillus pumilus (FERM P-4832)
Bacillus pumilus (FERM P-4829)
Bacillus licheniformis IFO12485
Wenn zur Transformation ein Bacillusstamm verwendet wird, kann eine neue DNA der vorliegenden Erfindung in der intakten Form eines Plasmids verwendet werden; jedoch ist normalerweise bevorzugt, entweder eine lineare DNA oder eine DNA der vorliegenden Erfindung, nachdem sie aus dem Plasmid aufgeschlossen wurde, zu verwenden.
Die Transformation eines Bacillusstammes mit einem linearen DNA-Fragment kann unter Verwendung eines veröffentlichten Verfahrens [C. Anagnostopouls und J. Spizizen; J. Bacteriol., 81, 741 (1961)] durchgeführt werden; der resultierende Transformant kann von der auf dem Selektionsmedium wachsengelassenen Kolonie unter Verwendung eines Selektionsmarkers aufgenommen werden. Wenn z. B. ein Medikamentenresistenzgen als Selektionsmarker inseriert wurde, kann der resultierende Transformant aus dem Selektionsmedium, das das relevante Medikament enthält, herausgenommen werden. Es kann beurteilt werden, ob der so erhaltene Transformant ein IMP-Dehydrogenase-Mangelstamm, wie es für die vorliegende Erfindung gewünscht ist, geworden ist oder nicht, indem sein Wachstum auf jedem der Minimalmedien, die die essentiellen Wachstumssubstanzen des Rezipienten enthalten und einem Xanthin ergänzten Medium, das aus dem Minimalmedium hergestellt wurde, untersucht wird.
Es kann durch Spalten der chromosomalen DNA des Transformanten mit einem geeigneten Restriktionsenzym bewiesen werden, daß der Transformant eine neue Mikrobe ist, indem die so erhaltenen Fragmente nach Agarosegelelektrophorese und alkalischer Denaturierung auf Nitrocellulosefilter transferiert werden, das DNA-Fragment, das für die Insertion verwendet wird, getrennt mit Radioaktivität markiert wird, z. B., ein DNA-Fragment, das ein Medikamentenresistenzgen enthält, und die Southern-Hybridisierung durchgeführt wird, wobei dieses DNA-Fragment als Sonde verwendet wird. Das heißt, es kann leicht beurteilt werden, ob der Transformant eine gewünschte Mikrobe der vorliegenden Erfindung ist, basierend auf der Tatsache, daß ein Fragment, das mit der Sonde hybridisiert, in der chromosomalen DNA des Transformanten vorhanden ist, während in der chromosomalen DNA des Rezipienten kein mit der Sonde hybridisierbares Fragment vorhanden ist.
Es kann bewiesen werden, daß das DNA-Fragment auf dem IMP- Dehydrogenase-Gen inseriert wurde, auf der Tatsache basierend, daß, wenn die Southern-Hybridisierung unter Verwendung von IMP-Dehydrogenase, die von dem Donor isoliert wurde, als Sonde durchgeführt wird, das Fragment, das mit der Sonde der chromosomalen DNA des Transformanten hybridisiert, um die Länge des inserierten DNA-Fragments größer als das des Rezipienten geworden ist. Ähnlich kann der Transformant, der durch die Verwendung der DNA erhalten wurde, die einen Teil oder das gesamte IMP-Dehydrogenase-Gen deletiert, durch den Vergleich der Länge der DNA-Fragmente, nach der Hybridisierung bewiesen werden.
Der obige Transformant, dessen chromosomale DNA ein IMP-Dehydrogenase-Gen hat, auf dem ein Markergen inseriert ist, ist wegen der Expression des Markergens Medikamenten-resistent geworden, wenn das Markergen z. B. ein Medikamentenresistenz-Gen ist, und er ist wegen der Insertion des Markergens ein IMP-Dehydrogenase-Mangel- und ein Xanthin erfordernder Transformant geworden; jedoch ist der Transformant von dem Rezipienten vor der Tranformation in irgendeiner anderen bakteriologischen Eigenschaft nicht verschieden.
Der Transformant ist auch dadurch gekennzeichnet, daß die Rückmutationsrate für Xanthinerfordernis bei oder unterhalb der Nachweisgrenze liegt.
Die Rückmutationsrate kann in dem Verhältnis der Koloniewachstumszahl auf einem Plattenagarmedium, das kein Xanthin enthält, zu der Zahl der Bakterienzellen, die auf dem Plattenagarmedium verteilt wurden, gezeigt werden. Jedoch ist die Rückmutationsrate des Transformanten extrem gering; es tritt kein Revertant auf, selbst wenn der Transformant der Subkultur oder Behandlung mit einem mutagenen Mittel unterworfen wird.
Als Beispiele für solche Transformanten der vorliegenden Erfindung kann Bacillus subtilis BM 1041 (IFO 14560; FERM BP-1243, hinterlegt am 25. Dezember 1986), Bacillus subtilis NA-6141 (IFO 14561; FERM BP-1244, hinterlegt am 25. Dezember 1986), Bacillus subtilis BM-1403 (IFO 14655; FERM BP-1501, hinterlegt am 7. Oktober 1987) erwähnt werden, wie in den unten folgenden Beispielen gezeigt wird.
Indem geeignete Markergene und Rezipienten ausgewählt werden, können verschiedene Transformanten sicherlich leicht aufgebaut werden, die auch mit dem in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Verfahren übereinstimmen.
Als nächstes wird, zur Herstellung von Inosin unter Verwendung eines durch die vorliegende Erfindung erhaltenen Transformanten ein Verfahren verwendet, das dem herkömmlichen Kultivierungsverfahren für Inosin-bildende Mikroorganismen ähnlich ist, außer daß eine Quelle für Xanthin, einer von dem Transformanten geforderten Substanz, dem Medium hinzugefügt wird.
Das bedeutet für das Medium, daß die Medien eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und Metallionen und wo erforderlich, Nährstoffe, wie z. B. Aminosäuren, Nucleinsäuren und Vitamine enthalten. Kohlenstoffquellen, die verwendet werden können, umfassen Glucose, Sucrose, Maltose, Stärke, verzuckerte Stärkelösung und Melassen. Stickstoffquellen, die verwendet werden können, entweder einzeln oder in Kombination, umfassen anorganische Stickstoffquellen, wie z. B. Ammoniumsalze der Schwefelsäure, Salpetersäure, Salzsäure und Kohlensäure, Ammoniakgas und wäßrige Ammoniaklösung, sowie organische Stickstoffquellen, wie z. B. Pepton, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl, Hefen und Harnstoff. Was andere Nährstoffe anbelangt, werden verschiedene Mineralien, Aminosäuren, Vitamine und dergleichen, die für das Bakterienwachstum essentiell sind, entweder einzeln oder in Kombination nach genauer Auswahl, verwendet. Substanzen, die als Xanthinquellen verwendet werden können, umfassen nicht nur Xanthin, Xanthosin, Xantylsäure und deren Ersatzstoffe, wie z. B. Guanin, Guanosin, Guanylsäure und Nucleinsäure, sondern auch mikrobielle Zellen, die sie enthalten und Extrakte solcher mikrobieller Zellen. Substanzen, die als Adeninquellen verwendet werden können, umfassen nicht nur Adenin, Adenosin, Adenylsäure und Nucleinsäure, sondern auch mikrobielle Zellen, die sie enthalten und Extrakte solcher mikrobieller Zellen.
Zusätzlich können Antischaummittel oder Tenside, wie z. B. Siliconöl und Polyalkylenglycolether dem Medium bei Bedarf hinzugegeben werden.
Das Kultivieren wird normalerweise unter aeroben Bedingungen durchgeführt, wie z. B. als Schüttelkultur und aerober Submerskultur. Normalerweise ist bevorzugt, daß der pH des Mediums im Bereich zwischen 4 bis 9 liegt. In Fällen, wo eine pH-Schwankung während des Kultivierens festgestellt wird, kann Schwefelsäure, Calciumcarbonat, Natriumhydroxid, Ammoniakgas, wäßrige Ammoniaklösung oder dergleichen gezielt zugegeben werden, um den pH in einen bevorzugten Bereich zu bringen. Was die Kultivierungstemperatur anbelangt, wird eine sowohl für das Wachstum der verwendeten Mikrobe, als auch die Inosinanhäufung geeignete Temperatur aus dem Bereich zwischen 20 und 40ºC ausgewählt. Das Kultivieren wird durchgeführt, bis die Menge des angehäuften Inosins tatsächlich ihr Maximum erreicht, aber normalerweise wird dieser Zweck bei 24 bis 144 Stunden des Kultivierens erreicht.
Zum Trennen und Ernten des Inosins aus der Kultur, können bereits veröffentlichte, gewöhnliche Reinigungsmethoden, wie z. B. das Ausfällen und chromatographische Techniken, die Ionenaustauscherharze oder Aktivkohle verwenden, angewandt werden.
Durch die vorliegende Erfindung kann Inosin, das Ausgangsmaterial für 5'-Inosinsäure, eine bedeutende Würzsubstanz, industriell in hoher Ausbeute günstig hergestellt werden. Das heißt, neue IMP-Dehydrogenase-Mangel-Bakterienstämme mit hoher Inosinproduktivität können durch Transformieren von Bacillus Stämmen, die zur Bildung von wenigstens einem Inosin, Xanthosin und Guanosin befähigt sind, als Rezipienten unter Verwendung der DNAs der vorliegenden Erfindung erhalten werden. Die so erhaltenen, Inosin-bildenden Stämme sind sowohl in der Anhäufung von Inosin hoch, als auch hoch stabil, weil sie keine Rückmutation haben; daher sind sie, auch vom Standpunkt der Bildungskontrolle aus gesehen, sehr günstig.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt das Herstellungsverfahren von pEX 203, wie es in den Beispielen erhalten wird. In der Figur stellen P, Sm, X, S, B, H beziehungsweise E die Restriktionsstellen der Restriktionsenzyme Pst I, Sma I, Xba I, Sac II, Bam HI, Hin cII und EcoRI dar. S/P bedeutet, daß das klebende Ende von Sac II und das von Pst I nach der Umwandlung in ein glattes Ende mittels T4 DNA-Polymerase, zusammen ligasiert wurden. Der schraffierte Teil in der Figur stellt die IMP-Dehydrogenase-Genregion und der Balken stellt die Chloramphenicol- Acetyltransferase-Genregion dar.
Die oberen Diagramme in Fig. 2 schematisieren entsprechend die Strukturen der chromosomalen DNA von Bacillus subtilis BM 1032 und der chromosomalen DNA von Bacillus subtilis BM 1041; in den Diagrammen stellen Sm, B, die Figuren, der schraffierte Teil, beziehungsweise der ausgefüllte Balken die Sma I Restriktionsstelle, die Bgl II Restriktionsstelle, die Anzahl der Basenpaare (Kilobasenpaare), die IMP-Dehydrogenase-Genregion und die Chloramphenicol-Acetyltransferase-Genregion dar. Die unteren Diagramme A, beziehungsweise B der Fig. 2 zeigen die Hybridisierung der Sma I-Bgl II doppelt aufgeschlossenen Produkte der chromosomalen DNA von Bacillus subtilis BM 1032 und Bacillus subtilis BM 1041 mit der ³²P-markierten pBTM 124 Chloramphenicol-Acetyltransferase-Gen-DNA und die Hybridisierung des Sma I-Bgl II doppelt aufgeschlossenen Produkts der chromosomalen DNAs von Bacillus subtilis BM 1032 und Bacillus subtilis BM 1041 mit der ³²P-markierten pEX 117 IMP-Dehydrogenase-Genregion.
Fig. 3 zeigt das Herstellungsverfahren von p EX 181, wie es in Beispiel 5 beschrieben ist. In der Figur stellen III, X, beziehungsweise P, Hind III, Xba I und Pst I dar.
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden in mehr Einzelheiten beschrieben, mit einigen Bezugsbeispielen und Beispielen für Ausführungsformen, aber die vorliegende Erfindung ist nicht auf diese Fälle begrenzt. Wenn nicht anders dargelegt ist, wurden die Reaktionen unter Verwendung von Restriktionsenzymen (alle wurden von Nippon Gene K.K hergestellt) oder Modifikationsenzymen, die in den Bezugsbeispielen oder unten aufgeführten Beispielen beschrieben sind, unter den Bedingungen durchgeführt, die von den jeweiligen Enzymherstellern beschrieben sind.

Bezugsbeispiel 1

Isolierung des Plasmids p EX 117, das ein Bacillus subtilis IMP-Dehydrogenase-Gen enthält:
Aus dem Transformanten Esherichia coli TEX 117 (Japanische veröffentlichte, ungeprüfte Patentanmeldung Nr. 156388/- 1985), der das rekombinante Plasmid pEX 117 trägt, das eine IMP-Dehydrogenase-Genregion enthält, die vom Bacillus subtilis Stamm NA-6012 (IFO 14190, FERM BP-292) abgeleitet ist, wurde das Plasmid gemäß dem Verfahren, das in "Molecular Cloning", S. 86 bis 93 beschrieben ist, extrahiert. Das heißt, ein LB Medium (10 g/l Bacto Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l Natriumchlorid) wurde mit Esherichia coli TEX 117 inokuliert, und es wurde Chloramphenicol zu einer Konzentration von 140 ug/ml zur Plasmidamplifikation hinzugegeben, gefolgt von einem Kultivieren über Nacht, dann wurden die Bakterienzellen geerntet und gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden durch Hinzufügen von Lysozym lysiert und weiter wurde 0,2 N Natriumhydroxidlösung hinzugegeben, die 1% Natriumlaurylsulfat enthielt, gefolgt von dem Hinzufügen von 5 M Kaliumacetat, danach wurde über eine Zentrifugation ein das Plasmid enthaltender Überstand gewonnen. Zu dem resultierenden Überstand wurde 0,6 des Volumens Isopropanol hinzugegeben, um die Plasmid-DNA auszufällen, die dann mit Ethanol gewaschen und in einer TE-Pufferlösung (10 mM Tris- Hydrochloridpufferlösung, 1 mM EDTA, pH 8,0) gelöst wurde. Zu der resultierenden Lösung wurde Caesiumchlorid zu einem spezifischen Gewicht von 1,60 hinzugegeben und Ethidiumbromid wurde zu einer Endkonzentration von 600 ug/ml hinzugefügt. Mittels einer Ultrazentrifuge (Rotor V&sub6;&sub5; Ti) wurde die Zentrifugation 12 Stunden bei 20ºC und 50 000 Upmin durchgeführt; die im Ultravioletten nachweisbare Plasmidbande wurde abgenommen und das Ethiniumbromid wurde extrahiert und mit n-Butanol entfernt, gefolgt von einer Dialyse gegen eine TE-Pufferlösung; als Ergebnis wurde das rekombinante Plasmid pEX 117 in einer Menge, die etwa 200 ug entspricht, aus 300 ml Kulturnährbouillon erhalten. Das pEX 117 wurde mit verschiedenen Restriktionsenzymen gespalten, und die in Fig. 1 dargestellte Restriktionskarte wurde nach dem Agarosegelelektrophoresemuster der so erhaltenen Plasmidfragmente hergestellt, das auf dem Molekulargewicht der Lambdaphagen-DNA basiert, die mit Hin dIII aufgeschlossen worden war. Das pEX 117 ist ein rekombinantes Plasmid, in das ein etwa 6,4 Kilobasenpaar-DNA-Fragment an der Pst I Stelle des pBR 322 inseriert worden war.
3 ug von pEX 117 wurden teilweise mit dem Restriktionsenzym Hin dIII aufgeschlossen. Das pBR 322 wurde getrennt vollständig mit Hin dIII aufgeschlossen. Die beiden Aufschlüsse wurden gemischt und miteinander nach dem oben beschriebenen Verfahren ligasiert. Diese DNA-Lösung wurde zur Transformation von Esherichia coli X-895 nach dem oben beschriebenen Verfahren verwendet. Auf diese Weise wurden Tetracyclinresistente Stämme erhalten, und aus ihnen wurde ein Transformant erhalten, der nicht mehr Xanthin erforderte, d. h. Esherichia coli TEX-147. Etwa 220 ug des rekombinanten Plasmids wurden von dem Transformant mittels Plasmidextraktion mit den oben beschriebenen Verfahren erhalten. Das Plasmid wurde pEX 147 genannt. Die Restriktionsenzymspaltungskarte von pEX 147 ist in Fig. 3 dargestellt. Das pEX 147 ist ein rekombinantes Plasmid, das sich von pBR 322 durch Insertion eines 2,9 Kilobasenpaar-DNA-Fragments an dessen Hin dIII Stelle ableitet.

Bezugsbeispiel 2

Isolierung des Plasmids pBTM 124, das ein Chloramphenicol- Acetyltransferase-Gen enthält:
Das rekombinante Plasmid pBTM 124, das ein von Bacillus pulmilus abgeleitetes Chloramphenicol-Acetyltransferase-Gen enthält, wurde gemäß dem Verfahren von Williams et al. [J. Bacteriol., 146, 1162 (1981)] wie folgt hergestellt:
Eine DNA wurde aus Bacillus pumilus NCIB 8600 (IFO 12089, aufgeführt in der List of Cultures, 7. Auflage, ausgestellt vom Institute for Fermentation, Osaka) hergestellt. Die DNA (6,5 ug) wurde durch 1 Stunde Reagierenlassen mit 40 Einheiten des Restriktionsenzyms Eco RI bei 37ºC gespalten, gefolgt von 15 Minuten Erwärmen auf 68ºC und Ethanolfällung. Das Plasmid pUB 110 /2,0 ug) wurde getrennt durch 1 Stunde Reagierenlassen mit 20 Einheiten des Restriktionsenzyms Eco RI bei 37ºC gespalten, gefolgt von 15 Minuten Erwärmen auf 68ºC und Ethanolfällung.
Beide resultierenden Niederschläge wurden in Wasser gelöst und miteinander gemischt; eine Reaktionsflüssigkeit (100 ul), die durch Hinzufügen von 60 nMol ATP, 10 Einheiten von T4 DNA-Ligase und einer Ligasepufferlösung zu der so erhaltenen Mischung hergestellt wurde, wurde 30 Stunden bei 11ºC inkubiert, gefolgt von Ethanolfällung. Der resultierende Niederschlag wurde in einer TE-Pufferlösung (50 ul) gelöst. Unter Verwendung von 25 ul der resultierenden Lösung wurde Bacillus subtilis MI-114 [Gene, 24, 255 (1983)] transformiert, um einen Chloramphenicol-resistenten Transformanten zu erhalten. Von dem so erhaltenen, Chloramphenicol-resistenten Transformant wurde ein Plasmid hergestellt, das p BTM 124 genannt wurde. Das p BTM 124 ist ein rekombinantes Plasmid, in welchem ein etwa 2,1 Kilobasenpaar-DNA-Fragment, das ein Chioramphenicol-Acetyltransferase-Gen enthält, an der Eco RI Stelle des pUB 110 inseriert wurde.

Beispiel 1

30 ug von pBTM 124 wurden doppelt aufgeschlossen, indem es mit den Restriktionsenzymen Eco RI und Pst I 1 Stunde bei 37ºC reagierengelassen wurde, gefolgt von Agarosegelelektrophorese und das Agarosegel, das dem elektrophoretischen Abstand von 1,1 Kilobasenpaaren der DNA entsprach, wurde abgeschnitten. Unter Verwendung eines eindirektionalen Elektroeluters (hergestellt von International Biotechnologies, Inc.) wurde die relevante DNA von den obigen Agarosegelfragmenten extrahiert, gefolgt von einer Ethanolfällung; der resultierende Niederschlag wurde in einer TE-Pufferlösung (10 ul) gelöst. 3 ug pEX 117 wurden getrennt gespalten, indem sie mit dem Restriktionsenzym Sac II 1 Stunde bei 37ºC reagierengelassen wurden, gefolgt von 15 Minuten Erwärmen auf 65ºC und Ethanolfällung; der resultierende Niederschlag wurde in einer TE-Pufferlösung (10 ul) gelöst. Beide resultierende Lösungen wurden als nächstes miteinander gemischt; die resultierende Mischung wurde mit 2 nMol dNTP und 5 Einheiten T4 DNA-Polymerase (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) 20 Minuten bei 37ºC in einem TA-Puffer (33 mMol Trisacetat pH 7,9, 66 mMol Kaliumacetat, 10 mMol Magnesiumacetat, 0,5 mMol Dithiothreitol, 0,01% bovines Serumalbumin) reagierengelassen, gefolgt von 15 Minuten Erwärmen auf 65ºC, dann Phenolextraktion, und dann wurde die Ethanolfällung durchgeführt. Der resultierende Niederschlag wurde in einer TE-Pufferlösung gelöst; 30 ul der Reaktionsmischung, die durch Hinzufügen von 66 nMol ATP, 200 Einheiten T4 DNA-Ligase (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) und einer Ligase-Pufferlösung zu der so erhaltenen Lösung hergestellt wurde, wurde 1 Tag bei 16ºC inkubiert.
Unter Verwendung von 5 ul dieser Reaktionsmischung wurden kompetente Zellen von Esherichia coli Stamm X895 (IFO 14308, FERM BP-614) transformiert, um den Chloramphenicol-resistenten Transformant Esherichia coli X895 (pEX 203) zu erhalten. Diese Transformation wurde gemäß dem Verfahren von Cohen et al. [Proc. Nbtl. Acad. Sci. USA, 69, 2110, (1972)] durchgeführt.
Als nächstes wurde ein Plasmid aus dem Transformant Esherichia coli X895 (pEX 203) gemäß dem oben erwähnten Verfahren des Bezugsbeispiels 1 extrahiert und pEX 203 genannt. Das pEX 203 wurde mit verschiedenen Restriktionsenzymen gespalten und seine Restriktionskarte wurde aus dem Agarosegelelektrophoresemuster hergestellt, wobei das Molekulargewicht auf dem durch Hin dIII aufgeschlossenem Lambdaphagenprodukt (siehe Fig. 1) basierte.
100 ug pEX 203 wurden als nächstes mit dem Restriktionsenzym Pst I gespalten, gefolgt von Agarosegelelektrophorese; das Agarosegelfragment, das dem elektrophoretischen Abstand von einem 7,5 Kilobasenpaar der DNA entsprach, wurde abgeschnitten; unter Verwendung des oben erwähnten Elektroeluters wurde eine DNA extrahiert, um etwa 35 ug DNA zu isolieren. Basierend auf dem Restriktionsmuster, wurde bestätigt, daß die DNA ein 7,5 Kilobasenpaar-DNA-Fragment ist, das an der Pst I Stelle des pBR 322 inseriert wurde, und es hat eine Struktur, worin ein Bacillus pumilus NCIB 8600 Chloramphenicol-Acetyltransferase-Gen an der Sac II Stelle auf einem Bacillus subtilis IMP-Dehydrogenase-Gen inseriert wurde. Das Verfahren der Herstellung von pEX 203 und seine Restriktionskarte sind in Fig. 1 dargestellt.

Beispiel 2

i) Derivatisieren eines neuen Bacillus Stammes mit einer chromosomalen DNA der Struktur, worin ein Chloramphenicol-Acetyltransferase-Gen auf einem IMP-Dehydrogenase- Gen inseriert wurde:
Bei der Verwendung von herkömmlichen Verfahren wurde, um auxotrophe Organismen zu erhalten, der Adenin-erfordernde B. subtilis Stamm BM 1032 (IFO 14559, FERM BP-1242) aus dem Bacillus subtilis MI-114 gewonnen.
Kompetente Zellen des Bakteriums wurden als nächste gemäß dem Verfahren von C. Anagnostpoulos und J. Spizizen hergestellt. Zu 1 ml einer Suspension der kompetenten Zellen wurden 7,5 Kilobasenpaare des in Beispiel 1 erhaltenen DNA-Fragments hinzugefügt, gefolgt von 1 Stunde Schütteln bei 37ºC. Die Suspension wurde danach auf ein LB-Agarmedium aufgebracht, das 10 ug/ml Chloramphenicol enthielt und einen Tag bei 37ºC inkubiert; aus der resultierenden Kolonie wurde der Chloramphenicol-resistente Transformant Bacillus subtilis BM 1041 (IFO 14560, FERM BP-1243) erhalten. Ein M-9 CATA-Medium (6 g/l Na&sub2;HPO&sub4;, 3 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 0,5 g/l NaCl, 1 g/l NH&sub4;Cl, 1 mMol MgSO&sub4;, 1 mMol CaCl&sub2;, 2 g/l Glucose, 2 g/l Casaminosäure, 50 mg/l Adenin, 50 mg/l Tryptophan, 15 g/l Agar, pH 7,2) und ein Medium, das durch weiteres Hinzufügen von Xanthin zum obigen Medium hergestellt wurde, wurden mit dem Transformant inokuliert, und es wurde sein Wachstum untersucht; als Ergebnis wurde bestätigt, daß der Chloramphenicol-resistente Transformant ebenfalls Xanthinerfordernis zeigte. Messungen der IMP-Dehydrogenase-Aktivität wurden gemäß dem Verfahren von Magasanik (Methods in Enzymology VI, 106 bis 110) durchgeführt, aber die Enzymaktivität war in diesem Bakterium nicht nachweisbar.
ii) Beweis, daß ein Chloramphenicol-Acetyltransferase-Gen in das Chromosom inseriert wurde:
Ein LB-Medium wurde mit einem Bacillus subtilis BM 1041 inokuliert und über Nacht bei 28ºC kultiviert, danach wurde aus den Bakterienzellen eine chromosomale DNA in 1 l der Kulturnährbouillon über das Reinigungsverfahren chromosomaler DNA mit Phenol [Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)] erhalten. 10 ug der so erhaltenen chromosomalen DNA wurde mit den Restriktionsenzymen Bgl II und Sma I doppelt aufgeschlossen, gefolgt von Agarosegelelektrophorese, danach wurden die resultierenden Schnitte auf Nitrocellulosefilter gemäß dem oben erwähnten Verfahren, das in "Molecular Cloning", S. 382 bis 386 beschrieben wurde, übertragen. Die durch Bgl II-Sma I aufgeschlossenen Fragmente der chromosomalen DNA des Bacillus subtilis BM-1032 wurden ebenfalls zur gleichen Zeit auf Nitrocellulosefilter übertragen. Ein
1,1 Kilobasenpaar des DNA-Fragments wurde getrennt
extrahiert und von pBTM 124 mittels dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren isoliert; dieses DNA-Fragment wurde danach mit ³²P-CTP markiert und als Sonde verwendet. Die Trennung der Sonde wurde unter Verwendung des Nick-Translations-Kits-2 (hergestellt von Nippon Gene) gemäß der von Hersteller ausgearbeiteten Vorschrift durchgeführt.
Danach wurde Southern Hybridisierung gemäß dem in "Molecular Cloning", S. 387 bis 389 beschriebenen Verfahren durchgeführt; als Ergebnis erschien eine Hybridisierungsbande an der Stelle, die dem Elektrophoreseabstand des 3,9 Kilobasenpaars der chromosomalen DNA von Bacillus subtilis BM-1041 entsprach. Mit der chromosomalen DNA von Bacillus subtilis BM 1032 wurde keine Hybridisierung bemerkt.
Danach wurden 30 ug von pEX 117 mit Xba I und Hin cII doppelt aufgeschlossen, gefolgt von Agarosegeleelektrophorese, dann wurde ein kleines Stück Agarosegel aus dem Teil herausgeschnitten, der dem Elektrophoreseabstand eines 1,85 DNA- Kilobasenpaars entspricht, und aus dem Agarosegelfragment wurde eine DNA extrahiert und mit Nick-Translation, wie oben beschrieben wurde, markiert. Unter Verwendung der markierten DNA als Sonde, wurde Southern Hybridisierung in der gleichen Weise, wie oben beschrieben wurde, durchgeführt; als Ergebnis erschienen Hybridisierungsbanden an den Stellen, die den Elektrophoreseabständen eines 2,1 Kilobasenpaars einer DNA und einem 3,0 Kilobasenpaar einer DNA im Falle der Hybridisierung mit der chromosomalen DNA von Bacillus subtilis BM 1032 entsprachen, während im Falle der Hybridisierung mit der chromosomalen DNA von Bacillus subtilis BM 1041, Hybridisierungsbanden an den Stellen erschienen, die den Elektrophoreseabständen eines 2,1 Kilobasenpaars einer DNA und einem 3,9 Kilobasenpaar einer DNA entsprachen. Fig. 2 zeigt diese Ergebnisse.
(iii) Rückmutation zum Xanthinerfordernis in Bacillus subtilis BM 1041:
In 20 ml eines Aussaatmediums, wie in Tabelle 1 beschrieben wurde, wurde eine Öse voll Bacillus subtilis BM 1041 inokuliert und 18 Stunden der Schüttelkultivierung bei 37ºC unterworfen, danach wurde 1 ml der Kulturnährbouillon in ein Hauptfermentierungsmedium (20 ml) überführt, das in Tabelle 1 beschrieben ist und 2 Tage einer Schüttelkultivierung bei 37ºC unterworfen. 1 ml der resultierenden Kulturnährbouillon wurde, wie in Tabelle 1 beschrieben ist, in ein Hauptfermentationsmedium überführt und 2 Tage bei 37ºC einer Schüttelkultivierung unterworfen. Nach 5 wiederholten Übertragungen, wie oben beschrieben wurde, wurde die lebensfähige Bakterienzellzahl in der Kulturbouillon untersucht; als Ergebnis war die Anzahl lebender Zellen pro 1 ml der Kulturbouillon 1·10&sup9;, von denen alle Xanthin erforderten und keine Revertanten bemerkt wurden.
Der Bacillus subtilis Stamm RN 63 (IFO 14307, FERM BP-613), ein Xanthin erfordernder Stamm, der mit einem herkömmlichen Verfahren zum Gewinnen von Transformanten induziert worden war, wurde getrennt dem gleichen Verfahren, wie oben beschrieben ist, unterworfen; als Ergebnis betrug die Zahl lebender Zellen pro 1 ml der Kulturbouillon 1·10&sup9;, von der 20% (2·10&sup8;) Revertanten waren, die kein Xanthinerfordernis zeigten. Tabelle 1 Mediumbestandteil Konzentration Aussaatmedium Fermentationsmedium Glucose Natriumglutamat Ammoniumsulfat Harnstoff Maisquellwasser Magnesiumsulfat Adenin Xanthin Dikaliummonohydrogenphosphat Kaliumchlorid Calciumchlorid Magnesiumsulfat Calciumcarbonat pH
iv) Inosinproduktivität von Bacillus subtilis BM 1041
Ein konischer Kolben von 1 l Fassungsvermögen, der 125 ml Aussaatmedium, wie in Tabelle 1 gezeigt wurde, enthielt, wurde mit einer Öse voll Bacillus subtilis Stamm BM 1041 inokuliert und 12 Stunden einer Schüttelkultivierung bei 37ºC unterworfen. Die Gesamtmenge der Kulturbouillon wurde in einen 5 l fassenden Glasfermenter überführt, der 2,5 l eines Hauptfermentationsmediums, wie in Tabelle 1 gezeigt wurde, enthielt, und 60 Stunden bei 37ºC kultiviert, während sowohl Xanthin mit einer Geschwindigkeit von 10 ug/ml·h kontinuierlich 5 bis 35 Stunden nach Starten des Kultivierens, als auch 100 ml einer gemischten Lösung, die 12,5% Ammoniumsulfat, und 6,25% Harnstoff enthielt, nach der 24. Stunde des Beginns der Hauptfermentationskultivierung hin zugefügt wurden. Nach Beendigung der Kultivierung wurden die Mengen des angehäuften Inosins und Guanosins mittels Hochleistungs-Flüssigchromatographie geprüft; als Ergebnis war Inosin in einem Verhältnis von 10,1 mg/ml angehäuft worden. Bacillus subtilis Stamm BM 1032 wurde unter den gleichen Bedingungen wie oben beschrieben, kultiviert; als Ergebnis wurde Inosin in einem Verhältnis von nur 5,2 mg/ml angehäuft.

Beispiel 3

Kompetente Zellen des Bacillus subtilis Stammes NA-6128 (IFO 14373, FERM BP-617) wurden gemäß dem Verfahren von Beispiel 2 hergestellt. Zu den so erhaltenen kompetenten Zellen wurden 7,5 Kilobasenpaare des in Beispiel 1 erhaltenen DNA-Fragments hinzugegeben, wonach sie 1 Stunde bei 37ºC für die Transformation geschüttelt wurden; als Ergebnis wurde der Chloramphenicol-resistente Transformant Bacillus subtilis NA-6141 (IFO 14561, FERM BP-1244) aus einer Kolonie erhalten, die auf einem LB-Medium mit 10 ug/ml Chloramphenicol wachsengelassen worden war.
Darauf basierend, ob Wachstum entweder auf einem M-9 CATA- Medium oder einem M-9 CATA-Medium, das weiter Xanthin enthielt, beschrieben wurde oder nicht, wurde gefunden, daß der Transformant Xanthin erforderte.
Southern Hybridisierung wurde nach dem gleichen Verfahren, wie in Beispiel 2 beschrieben war, durchgeführt; als Ergebnis wurde für die Hybridisierung mit der chromosomalen DNA des Bacillus subtilis Stammes NA-6128 keine Hybridisierungsbande festgestellt, wenn die 1,1 Kilobasenpaare des DNA-Fragments des pBTM 124 als Sonde verwendet wurde, während bei den 3,9 Kilobasenpaaren des Sma I-Bgl II-Fragments der chromosomalen DNA des Bacillus subtilis Stammes NA-6141 Hybridisierung festgestellt wurde. Zusätzlich, wenn die 1,85 Kilobasenpaare des Xba I-Hin cII-Fragments des pEX 117 als Sonde verwendet wurden, wurde bei den DNA-Fragmenten, die jeweils 2,1 Kilobasenpaaren und 3,0 Kilobasenpaaren von Sma I-Bgl II trag der chromosomalen DNA des Bacillus subtilis Stamms NA-6128 entsprachen, Hybridisierung festgestellt, während Hybridisierung bei den 2,1 Kilobasenpaaren und 3,9 Kilobasenpaaren der DNA-Fragmente der chromosomalen DNA von Bacillus subtilis Stamm NA-6141 festgestellt wurde.

Beispiel 4

Ein konischer Kolben von 1 l Fassungsvermögen, der 125 ml Aussaatmedium, wie in Tabelle 1 gezeigt wurde, enthielt, wurde mit einer Öse voll Bacillus subtilis Stamm NA-6141 inokuliert und 12 Stunden einer Schüttelkultivierung bei 37ºC unterworfen. Die Gesamtmenge der Kulturbouillon wurde in einen 5 l fassenden Glasfermenter überführt, der 2,5 l eines Hauptfermentationsmediums, wie in Tabelle 1 gezeigt wurde, enthielt, und 86 Stunden bei 37ºC kultiviert, während sowohl Xanthin mit einer Geschwindigkeit von 10 ug/ml·h kontinuierlich 5 bis 35 Stunden nach Starten des Kultivierens, und danach mit einer Geschwindigkeit von 5 ug/ml·h bis zur Beendigung des Kultivierens, als auch 100 ml einer gemischten Lösung, die 12,5% Ammoniumsulfat und 6,25% Harnstoff enthielt, nach der 24. und 48. Stunde folgend auf den Beginn der Hauptfermentationskultivierung hinzugefügt wurden. Die Mengen des Inosins und Guanosins, die in der Kulturbouillon angehäuft waren, wurden mittels Hochleistungs- Flüssigchromatographie nachgewiesen; als Ergebnis war gefunden worden, daß Inosin in einem Verhältnis von 35,0 mg/ml angehäuft worden war. Bacillus subtilis Stamm NA-6128 wurde unter den gleichen Bedingungen wie oben beschrieben, kultiviert; als Ergebnis wurde Inosin in einem Verhältnis von nur 19,8 mg/ml angehäuft.
Die Zahl lebender Zellen und die Zahl der Xanthin-erfordernden Revertanten in der obigen Kulturbouillon wurde untersucht; als Ergebnis betrug die Zahl lebender Zellen 4·10&sup8; pro 1 ml Kulturbouillon, und keine Xanthin-erfordernden Revertanten wurden darin nachgewiesen. Das Auftreten von Adenin-erfordernden Revertanten wurde zum Bezug auch untersucht; als Ergebnis waren solche Revertanten in einem Verhältnis von 4·10² pro 1 ml der obigen Kulturbouillon vorhanden. Aus dem Vergleich mit der Rückmutuationsrate ist die Wirkung der vorliegenden Erfindung offensichtlich.

Beispiel 5

i) 3 ug pEX 147 DNA wurden teilweise mit dem Restriktionsenzym Hin III (1 Einheit) aufgeschlossen und das Enzym wurde durch 10 Minuten Erwärmen auf 65ºC inaktiviert, und dann wurde die DNA durch Hinzufügen von kaltem Ethanol zu der Reaktionsmischung gefällt. Die gefällte DNA wurde durch Zentrifugieren gesammelt, in 20 ul einer TE-Pufferlösung gelöst und mit T4 DNA-Ligase religasiert. Die Ligationsmischung wurde verwendet, um Esherichia coli X 895 gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren zu transformieren, und die Zellsuspension wurde auf ein M-9 CATA Agarplattenmedium, das Ampicillin (25 ug/ml) und Xanthin enthielt, plattiert. Nach einer Inkubation über Nacht bei 37ºC, wurden die auf dem Agarplattenmedium gebildeten Kolonien auf ein M-9 CATA Agarplattenmedium überführt und die Inkubation weitere 24 Stunden fortgesetzt. Das Wachstum auf jedem Agarplattenmedium wurde untersucht und Ampicillin-resistente- und Xanthinerfordernde Transformanten, die Stamm TEX 181 genannt wurden, wurden selektiert. Von den Zellen des Stamms TEX 181 wurde ein Plasmid gemäß dem Verfahren, das im Bezugsbeispiel 1 beschrieben wurde, isoliert und pEX 181 genannt. Aufbau und Restriktionskarte von pEX 181 sind in Fig. 3 dargestellt.
Wie aus Fig. 3 hervorgeht, ist pEX 181 ein Plasmid mit der Deletion eines Hind III-Fragments, das etwa 0,25 Kilobasenpaare hat und in der Nähe des Zentrums des inserierten DNA-Fragments, das die IMP-Dehydrogenase-Genregion des pEX 147 enthält, lokalisiert und weist zu dem Xanthinerfordernis von Escherichia coli X 895 keine Komplementarität auf.
ii) Die durch Pst I aufgeschlossene DNA von pEX 181 (5 ug) wurde in eine kompetente Zellsuspension von Bacillus subtilis BM 1031 gegeben und 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Danach wurde die Suspension mit sterilem Wasser verdünnt und auf M-9 CATA Agarplattenmedium, das Xanthin enthielt, plattiert. Nach einer Inkubation über Nacht bei 37ºC, wurden die auf dem Plattenmedium gebildeten Kolonien auf M-9 CATA Agarmedium übertragen und weitere 24 Stunden inkubiert. Basierend auf dem Wachstum auf ein paar der oben erwähnten Medien, wurde ein Xanthin-erfordernder Stamm selektiert und Bacillus subtilis BM-1043 (IFO 14655, FERM BP-1501) genannt, IMP-Dehydrogenase-Aktivität dieses Stammes wurde nicht nachgewiesen.
iii) Ein LB-Medium wurde mit einer Öse voll Bacillus subtilis BM-1043 inokuliert und die Inkubation wurde über Nacht bei 28ºC durchgeführt. Aus den von der Kulturbouillon geernteten Zellen wurde chromosomale DNA durch Verwendung von Phenol mit dem Extraktionsverfahren gereinigt. Ein 10 ug Anteil der so erhaltenen chromosomalen DNA wurde mit Bgl II aufgeschlossen und mit Sma I aufgeschlossene Fragmente der chromosomalen DNA von Bacillus subtilis BM 1032 wurden ebenfalls auf Nitrocellulosefilter, in der gleichen Weise, wie oben beschrieben wurde, übertragen. Als nächstes wurde Southern Hybridisierung unter Verwendung des ³²P-markierten Xba I-Hinc II-Fragments als Sonde durchgeführt, die in Beispiel 2-ii hergestellt wurde. Als Ergebnis wurden Hybridisierungsbanden an der Stelle beobachtet, die dem elektrophoretischen Abstand von 2,1 und 3,0 Kilobasenpaaren im Falle der Bacillus subtilis BM-1043 chromosomalen DNA entsprachen.
iv) Rückmutation des Xanthinerfordernis von Bacillus subtilis BM-1043 wurde gemäß dem Verfahren, das in Beispiel 2 iii) beschrieben ist, untersucht, und es wurde kein Revertant beobachtet.
v) Die Erzeugung von Inosin durch Bacillus subtilis BM-1043 wurde mit dem in Beispiel 2-iv) beschriebenen Verfahren untersucht, und es wurde gefunden, daß 9,8 mg/ml Inosin in der Kulturbouillon angehäuft waren.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Inosin, umfassend das Kultivieren in einem Medium eines IMP-Dehydrogenase- Mangelstammes von Bacillus subtilis, der mit DNA transformiert ist, die eine inaktivierte IMP-Dehydrogenase codiert, worin die DNA eine DNA eines IMP-Dehydrogenase- Gens des Bacillus subtilis Stammes umfaßt, die wenigstens 1,85 Kilobasenpaare des Xba-I-Hin CII Fragments hat, und ein Selektions-Marker-Gen und das Ernten des so in dem Kulturmedium hergestellten Inosins.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das Selektions-Marker-Gen aus einem oder mehr Gliedern besteht, die aus der Gruppe, die aus Arzneimittelresistenz-Genen, Aminosäurebiosynthese-Genen, Nucleinsäurebiosynthese-Genen und Vitaminbiosynthese-Genen besteht, ausgewählt sind.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, worin das Arzneimittelresistenz-Gen ein Chloramphenicol-Acetyltransferase-Gen ist.

4. Verfahren gemäß irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, worin der IMP-Dehydrogenase-Mangelstamm von Bacillus subtilis befähigt ist, Inosin zu bilden und keine Rückmutation bei Xanthinbedarf zeigt.

5. Verfahren gemäß irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, worin der IMP-Dehydrogenase-Mangelstamm von Bacillus subtilis aus der Gruppe, die aus Bacillus subtilis NA-6141 (FERM BP-1244) und Bacillus subtilis BM 1041 (FERM BP-1243) besteht, ausgewählt ist.