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CN102869784A - 高甘露糖聚糖 - Google Patents

高甘露糖聚糖 Download PDF

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CN102869784A
CN102869784A CN2011800223199A CN201180022319A CN102869784A CN 102869784 A CN102869784 A CN 102869784A CN 2011800223199 A CN2011800223199 A CN 2011800223199A CN 201180022319 A CN201180022319 A CN 201180022319A CN 102869784 A CN102869784 A CN 102869784A
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mannosidase
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C·J·鲍斯克斯
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J·马雅特
J·米德
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Momenta Pharmaceuticals Inc
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Abstract

在此描述了与高甘露糖聚糖有关的方法和组合物。

Description

高甘露糖聚糖
本申请要求2010年4月7日提交的美国申请序列号61/321,857的优先权。该在先申请的披露内容被视为本申请的披露内容的一部分（并且通过引用结合在此）。
发明背景
一种典型的糖蛋白产品就复杂性而言实质上不同于一种典型的小分子药物。附接至一种糖蛋白的氨基酸主链上的糖结构在可以在结构上以许多方式而变化，这些许多方式包括序列、分支、糖含量以及非均匀性。因此，糖蛋白产品可以是具有许多结构多样分子的复杂的非均匀混合物，这些结构多样分子自身具有复杂的聚糖结构。糖基化作用不仅增加了分子的结构复杂性，而且影响或调节了糖蛋白的许多生物和临床属性。
发明概述
本发明是基于，至少部分基于与糖蛋白上的高甘露糖聚糖结构（Man4、Man5、Man6、Man7、Man8和/或Man9结构）的分析和控制有关的方法和组合物。在图1显示了N-连接聚糖途径，该N-连接聚糖途径显示了高甘露糖和复杂聚糖结构的合成。
产品分析方法
因此，在一些方面，本发明的特征为用于分析一种糖蛋白制剂上的高甘露糖结构的方法，例如，用于鉴定和/或量化高甘露糖聚糖或糖型的方法。这样的方法可以用来测量以下各项的一个或多个：一种聚糖或糖蛋白制剂中高甘露糖的存在和/或数量（例如，相对于总聚糖质量）；高甘露糖结构的相对比率[例如，高甘露糖种类彼此的相对比率（例如，Man4、Man5、Man6、Man7、Man8和/或Man9以及它们的同分异构体的相对丰度或比率），高甘露糖与混合结构的相对比率，高甘露糖与复杂结构的相对比率，高甘露糖与岩藻糖化的结构的相对比率]；修饰的高甘露糖结构的存在或丰度（例如，岩藻糖化的高甘露糖结构的存在或丰度）。
在一个这样的方面，本发明的特征是一种用于分析（鉴定和/或量化）在糖蛋白混合物（例如，糖蛋白制剂）中的高甘露糖糖型的方法。该方法包括：(a)提供一种含有糖蛋白的样品；(b)任选地进行一种缓冲液更换以便缓冲兼容酶消化和/或质谱法（MS）分析，(c)从该糖蛋白样品中去除较高丰度的聚糖（例如，用一种酶处理该糖蛋白样品，这种酶从糖蛋白中切割复杂的岩藻糖化聚糖，例如，用内切糖苷酶F3处理）；(d)任选地还原和烷化该样品和/或进行一种缓冲液更换以便缓冲兼容质谱法。在一个实施方案中，下个步骤(e)包括鉴定和/或量化在处理的样品中的含高甘露糖的糖型（例如，通过电泳法如毛细管电泳法（CE）；反相LC-MS或靶向反相-LC-MS）。在其中含高甘露糖的糖型的理论质量是已知的某些实施方案中，可以建立一种靶向MS实验以便只监测对应于这些种类的所选的m/z特征（m/z signature）的组。在另一个实施方案中，步骤(e)可替代地包括鉴定和/或量化在处理的样品中的低丰度糖型，包括但不限于高甘露糖糖型。
在一个实施方案中，该方法是一种高分辨率方法，例如，该方法分开地鉴定和/或量化在一种糖蛋白混合物中的个别糖型（例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种个别糖型）。
在一个实施方案中，该糖蛋白混合物是一种抗体制剂，例如，一种药物抗体制剂。在一个实施方案中，该抗体制剂从一种哺乳动物细胞培养表达的。
在另一个这样的方面，本发明的特征是一种用于分析（鉴定和/或量化）在聚糖或糖蛋白制剂中的高甘露糖和/或混合结构的方法。该方法包括(a)提供一种聚糖或糖蛋白混合物，(b)用一种酶处理该聚糖混合物或糖蛋白混合物，该酶切割在一种糖型的非还原端处的暴露的末端甘露糖苷酶残基，并且(c)量化所切割的末端甘露糖残基。在一个实施方案中，该量化步骤包括进行定量单糖分析（例如，通过HPLC或GC-MS）。在一个实施方案中，相对于总聚糖质量来量化所释放的末端甘露糖，从而分析在一种聚糖或糖蛋白制剂中的高甘露糖和/或混合结构。
在一个实施方案中，该糖蛋白制剂是一种抗体制剂，例如，一种药物抗体制剂。在一个实施方案中，该抗体制剂从一种哺乳动物细胞培养表达的。
在某些实施方案中，在此描述的一种分析方法检测在一种糖蛋白制剂中以低丰度存在的高甘露糖结构，例如，该方法检测以下列丰度存在的高甘露糖结构（例如，Man4、Man5、Man6、Man7、Man8和/或Man9的一个或多个），即：相对于总聚糖质量，以小于20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.3%、0.1%或小于0.05%的丰度存在。
在某些实施方案中，该方法是一种高通量方法，例如，该方法的所有步骤可以在每个样品少于8、7、6、5、4、3、2小时的时间内完成；该方法可以用来每天处理至少5个样品。在另一个实施方案中，每种方法使用一个操作员和一台仪器，每天可以运行超过20、30、40、50、60、70、80、90或100个样品。在另一个实施方案中，该方法要求最低限度的样品制备（例如，样品制备只包括一种任选的缓冲液更换；不要求多个净化或纯化步骤，和/或衍生程序）。
在一个实施方案中，该方法是一种在GMP条件下运行的方法。
在一个实施方案中，该糖蛋白是一种免疫球蛋白（IgG）（例如，一种治疗性抗体，如IgG1、IgG2）或一种Ig融合物（例如，一种治疗性受体-Fc融合物）。一些例子包括：贝伐单抗、托西莫单抗、阿昔单抗、阿仑单抗、阿西莫单抗、西妥昔单抗、阿达木单抗、兰尼单抗、吉姆单抗、依法珠单抗、英利昔单抗、阿昔单抗、利妥昔单抗、巴利昔单抗、依库珠单抗、帕利珠单抗、奥马佐单抗、达利珠单抗、替伊莫单抗、赛妥珠单抗、达克珠单抗、依库珠单抗、莫罗单抗-CD3、那他珠单抗、帕尼单抗、兰尼单抗、托西莫单抗、阿法赛特、依那西普、阿巴西普。
在其他实施方案中，该糖蛋白是一种治疗性激素（例如，FSH）、一种干扰素、一种促红细胞生成素、一种集落刺激因子、或一种治疗性替换酶（例如，葡糖脑苷脂酶、α-半乳糖苷酶）。
本披露的方法可以用于评定一种治疗性或其他商业有关的糖蛋白的生产过程的一个或多个发展阶段中的高甘露糖结构，例如，在宿主细胞选择、克隆选择、培养基优化、培养条件的确定、工艺条件，和/或纯化程序的过程中。
还可以利用在此披露的方法来监测在细胞培养中所产生的高甘露糖聚糖的程度和/或类型，从而允许调节或可能终止这种培养，以便（例如）实现一种所希望的特定高甘露糖模式或目标，或避免产生一种所不希望的特定高甘露糖模式或目标。在一些实施方案中，可以利用这些方法来比较发生在不同的细胞培养中的高甘露糖糖基化的程度和/或类型。在一些实施方案中，可以使用这些方法来监测在由细胞产生糖蛋白的过程中所产生的糖蛋白的糖基化模式。例如，糖蛋白的生产（例如，商业生产）可以涉及以下步骤：(1)培养产生该糖蛋白的细胞，(2)在培养过程中以规则或不规则的间隔获得样品，并且(3)分析在所获得的样品中所产生的一种或多种糖蛋白的糖基化模式。在一些实施方案中，这样的方法可以包括以下步骤：将在所获得的样品中所产生的糖蛋白的糖基化模式彼此进行比较。在一些实施方案中，这样的方法可以包括将在所获得的样品中所产生的糖蛋白的糖基化模式与一个参比样品（例如一个对照样品或一种GMP或药物规范或标准）的糖基化模式进行比较。
还可以利用披露的方法来评定细胞或细胞系的高甘露糖糖基化特征，这些细胞或细胞系正被考虑用于产生一种所希望的特定糖蛋白（例如，甚至是在对这些细胞或细胞系进行工程化以产生该糖蛋白、或在商业有关水平上生产该糖蛋白之前）。
可以将本披露的方法应用于从多种来源中获得的聚糖或糖蛋白上，这些来源包括但不限于治疗制剂以及生物样品。根据本披露，生物样品在被分析之前或之后可以经历一个或多个分析和/或纯化步骤。可以利用本披露的方法来分析处于多种状态中的任何一种的聚糖，包括例如游离的聚糖、糖缀合物（例如，糖肽类、糖脂类、蛋白聚糖类、等等）、与细胞结合的聚糖（例如，与细胞核、细胞质、细胞膜结合的聚糖、等等）；与细胞的、细胞外、细胞内、和/或亚细胞的组分（例如蛋白质）结合的聚糖；在细胞外空间（例如，细胞培养基）中的聚糖、等等。
在一些实施方案中，对于特定的目标糖蛋白的所希望的高甘露糖糖基化模式是已知的，并且在此描述的方法允许对这些培养样品进行监测以沿着已知产生所希望的模式的路径而对生产的进展进行评定。例如，当该目标糖蛋白是治疗性糖蛋白（例如在一个或多个国家中已经历了监管评审）时，经常所希望的是对这些培养物进行监测以对它们将产生具有与药品的已确立的糖基化模式尽可能接近的糖基化模式的产物的可能性进行评定，无论它是否正在通过确实相同的路径而产生。在这样的实施方案中，典型地在多个时间点获取这些生产培养物的样品并将它们与一个已确立的标准物或与一个对照培养物进行比较以便评定相对的糖基化作用。除其他事项之外，本披露可以促进在用于治疗性蛋白的生产体系中的高甘露糖糖基化作用的实时分析。
在此描述的方法还可以用来评定、控制和/或比较治疗性产品的质量，例如，评定一种治疗性或其他商业上有关的糖蛋白产品中的高甘露糖结构的存在、数量、比率和/或种类。例如，这些方法可以用在一种质量控制测定或API或药物产品释放测定中，例如，这些方法可以包括以下步骤：如果一种糖蛋白产品符合高甘露糖结构的一种对照或参考规范，则释放该糖蛋白产品用于药物用途。该参考水平可以是一种含有该糖蛋白组合物的药物制剂的一种规范（例如，一种GMP标准，一种FDA标签或医嘱（Physician’s Insert）或质量标准。在其他实施方案中，与糖蛋白的一个先前或标准批次的历史记录和/或与一个其参比样品进行了比较。该分析的特征可以在（例如）记录在一个质量控制记录（例如，一个测试认证证书或一个分析认证证书）中。
在一些实施方案中，该参比水平或质量标准是在一种糖蛋白组合物中存在的高甘露糖结构不超过20%、15%、12%、10%，例如，不超过9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.25%、0.2%、0.1%或0.05%。在一个实施方案中，该糖蛋白具有高甘露糖结构（例如，具有至少0.01%、0.05%或0.1%的高甘露糖）但是具有不超过10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.25%、0.2%、0.1%或0.05%，例如，具有在0.05%至20%之间的高甘露糖、0.05%至15%之间的高甘露糖、0.05%至10%之间的高甘露糖，在1%-10%之间的高甘露糖，在1%至5%之间的高甘露糖。通常可以将存在于一种糖蛋白组合物中的高甘露糖结构的水平测量为相对于样品（例如糖蛋白制剂）中的聚糖总量的含有高甘露糖结构的聚糖的水平。
在一些实施方案中，将会针对一种特定结构而富集一种所希望的高甘露糖糖基化模式。例如，在一些实施方案中，一种所希望的糖基化模式将具有较低水平（例如，小于大约20%、大约15%、大约10%、大约8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.2%、0.1%或更少）的高甘露糖结构，或高水平（例如高于大约5%、10%、20%、25%、30%、40%、50%）的高甘露糖结构，或规定水平的Man4、Man5、Man6、Man7、Man8和/或Man9（例如，相对于其他高甘露糖种类或相对于总聚糖质量的Man5和/或Man8的富集）。
基于细胞的分析方法
已经发现多个细胞途径互相作用以便确定存在于从一种特定细胞产生的糖蛋白上的高甘露糖聚糖的模式。已经发现由一种细胞制造的一种糖蛋白上的高甘露糖聚糖的模式将取决于在此描述的形成性与消耗性组分的平衡和模式（例如，在此描述的某些基因的表达以及某些代谢物的可用性），这些组分出乎意料地与高甘露糖结构的生物合成有关。在一个细胞或细胞群体中表达的模式或这样的组分的可用性指示或预示了由该细胞或细胞群体产生的高甘露糖结构的模式，例如，指示或预示了由这样的细胞或细胞群体产生的一种治疗性糖蛋白的高甘露糖含量。
因此，在另一方面，本发明的特征为一种评估一种细胞产生高甘露糖结构的能力和/或潜力的方法。该方法包括：提供了一种细胞，并且评估了在此描述的细胞机器（cellular machinery）的两个或更多个（例如，3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、或10个或更多个）组分，其中评估的结果指示了存在于由该细胞产生的一种糖蛋白中的高甘露糖聚糖模式。
在一个实施方案中，该细胞机器的组分选自：
糖基转移酶类/酶类
MGAT1(GlcNAc T1)；
α-甘露糖苷酶II、IIx；
α-甘露糖苷酶IB；
α-甘露糖苷酶IA；
FucT1-9；
葡萄糖苷酶（例如，GCS1、GANAB），
前体水平
UDP-GlcNAc
GDP-Man
UDP/UTP
GDP/GTP
尿嘧啶核苷
鸟嘌呤核苷
前体生物合成或定位或运输
GNE（葡萄糖胺(UDP-N-乙酰基)-2-表异构酶/N-乙酰甘露糖胺）
高尔基体UDP磷酸酶
UDP-GlcNAc转运蛋白
UAP-1（UDP-N-乙酰己糖胺焦磷酸化酶）
PGM-3-葡萄糖磷酸变位酶3
NAGK-N-乙酰基-D-葡糖胺激酶
GNPNAT1-磷酸葡萄糖胺-N-乙酰转移酶1
UGP-2-UDP-葡萄糖焦磷酸化酶2
UGDH-UDP-葡萄糖6-脱氢酶GAlK-1-半乳糖激酶-1
PGM-1-葡萄糖磷酸变位酶-1
GCK-葡萄糖激酶
改变通过ER和高尔基体（golgi）的定位或运输的靶标
伴侣蛋白（BiP、SNARE、cpn’s、hsp’s）
EDEM（ER 降解性甘露糖苷酶样蛋白）
MANEA
甘露糖受体
高尔基体构造，结构性的
高尔基体脂质含量（鞘脂、胆固醇含量）
运输组分（A1P1、VIP36）
在一个实施方案中，评估了MGAT1与α-甘露糖苷酶IB的表达的比率。例如，一个小于1的低比率指示在由该细胞产生的一种糖蛋白中的Man5水平相对于总聚糖池将升高。
在一个实施方案中，评估了MGAT1与α-甘露糖苷酶IA的比率。例如，一个小于1的低比率指示在由该细胞产生的一种糖蛋白中的Man5水平相对于总聚糖池将升高。
在一个实施方案中，评估了MGAT1与MGAT2的表达的比率。例如，一个小于1的低比率指示在由该细胞产生的一种糖蛋白中的Man5水平相对于总聚糖池将升高。<0}
在一个实施方案中，评估了NAGK/GNE和/或NAGK与MGAT2的表达的比率。两个都是低比率，例如，每个都小于1，指示高甘露糖结构的水平相对于总聚糖池将升高。
在一个实施方案中，评估了MGAT1与葡萄糖苷酶的表达的比率。一个小于1的低比率指示某些高甘露糖结构（Man5、Man6、Man7、Man8、和/或Man9）的水平相对于总聚糖池将升高。
在一个实施方案中，评估了甘露糖苷酶IA与IB的表达的比率。这些表达的比率中的差异能够影响存在于一种糖基化蛋白上的高甘露糖结构（例如，特别是Man8和Man9）的构成。
在一个实施方案中，评估了EDEM与甘露糖苷酶IA的表达的比率。例如，一个大于1的高比率将指示在一种细胞中产生的糖蛋白中偏向于高甘露糖。
在一个实施方案中，评估了甘露糖苷酶IIx与MGAT1的表达的比率。例如，一个大于1的高比率指示在一种细胞中产生的糖蛋白中偏向于较低的甘露糖。
在一个实施方案中，评估了甘露糖苷酶IA与一种1,3葡萄糖苷酶（GANAB）的表达的比率。例如，一个大于1的高比率将指示在一种细胞中产生的糖蛋白中偏向于高甘露糖（例如，Man9）。
在一个实施方案中，评估了岩藻糖基转移酶与甘露糖苷酶1b的比率。一个小于1的低比率指示在高甘露糖（例如，Man5）方面的富集。
在一个实施方案中，评估了甘露糖苷酶II与甘露糖苷酶IB的。一个小于1的低比率指示在高甘露糖（例如，Man5）方面的富集。
在一个实施方案中，评估了VIP36表达的水平。VIP36的表达水平影响在细胞中产生的糖蛋白的甘露糖含量。在一个实施方案中，评估了VIP36与甘露糖苷酶IA的表达的比率。在一个实施方案中，评估了VIP36与甘露糖苷酶IB的表达的比率。
在一个实施方案中，评估了UGP-2的水平。UGP-2的表达水平影响在一种细胞中表达的糖蛋白的甘露糖含量。在一个实施方案中，评估了UGP-2与甘露糖苷酶IB的表达的比率。一个高比率（例如，大于1）将指示一种较高水平的高甘露糖结构。
在一些实施方案中，该方法进一步包括选择一种细胞作为宿主细胞用于表达一种治疗性糖蛋白（例如一种IgG分子），该选择是基于评估一种细胞产生高甘露糖结构的能力和/或潜力的方法的结果。例如，在一个实施方案中，如果评估该细胞产生高甘露糖结构的能力和/或潜力的方法的结果指示该细胞可以或将会产生具有低水平的高甘露糖结构（例如，相对于总聚糖质量<20%、<15%、<10%、<9%、<8%、<7%、<6%、<5%、<4%、<3%、<2%、<1%、<0.5%的高甘露糖结构）的一种糖蛋白，则选择该细胞作为宿主细胞。在另一个实例中，在一个实施方案中，如果评估该细胞产生高甘露糖结构的能力和/或潜力的方法的结果指示该细胞可以或将会产生具有较高水平的高甘露糖结构（例如，相对于总聚糖质量>10%、>15%、>20%的高甘露糖结构）的一种糖蛋白，则选择该细胞作为宿主细胞。在另一个实例中，在一个实施方案中，如果评估该细胞产生高甘露糖结构的能力和/或潜力的方法的结果指示该细胞可以或将会产生具有预定的高甘露糖结构（例如，一种高甘露糖种类与另一种高甘露糖种类的预定相对比率，例如，Man4、Man5、Man 6、Man7、Man8和/或Man9以及它们的同分异构体的相对丰度或比率，高甘露糖与混合结构的预定相对比率，高甘露糖与复杂结构的预定相对比率，高甘露糖与岩藻糖化结构的预定相对比率，修饰的高甘露糖结构（例如，岩藻糖化的高甘露糖结构）的预定丰度）的一种糖蛋白，则选择该细胞作为宿主细胞。
在一个实施方案中，该方法进一步包括以下步骤：基因工程化所选的细胞用于表达一种治疗性糖蛋白，例如，一种基于IgG的治疗性分子，如，一种治疗性抗体或受体-Fc融合蛋白，例如，贝伐单抗、托西莫单抗、阿昔单抗、阿仑单抗、阿西莫单抗、西妥昔单抗、阿达木单抗、兰尼单抗、吉姆单抗、依法珠单抗、英利昔单抗、阿昔单抗、利妥昔单抗、巴利昔单抗、依库珠单抗、帕利珠单抗、奥马佐单抗、达利珠单抗、替伊莫单抗、赛妥珠单抗、达克珠单抗、依库珠单抗、莫罗单抗-CD3、那他珠单抗、帕尼单抗、兰尼单抗、托西莫单抗、阿法赛特、依那西普、阿巴西普。
在一些实施方案中，该方法进一步包括从基因工程化的细胞表达和收获该糖蛋白并且评估所产生的糖蛋白的高甘露糖结构，例如，使用在此描述的方法。
控制高甘露糖结构的方法
已经开发了调节高甘露糖结构的方法。因此，在一个方面，本发明的特征为一种用于调节糖蛋白（例如，一种重组治疗性糖蛋白）的聚糖结构的方法，例如，调节存在于一种重组治疗性糖蛋白或其他商业上有关的糖蛋白中的高甘露糖结构的数量或模式。该方法包括(a)提供一种宿主细胞，该宿主细胞经过基因工程化以便表达一种主题糖蛋白，并且(b)在一定条件下培养细胞以便表达该重组蛋白，其中该宿主细胞经受一种操作，该操作调节在此描述的细胞机器的一种或多种组分，例如，两个或更多个（3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、或10个或更多个）组分，从而调节一种糖蛋白的高甘露糖聚糖结构。在一些实施方案中，在这些细胞的培养过程中和/或收获时或收获后评估高甘露糖含量。
在一个实施方案中，该宿主细胞经受一种操作，该操作调节在此描述的一种糖基转移酶（例如，MGAT1）。在一个实施方案中，糖基转移酶的表达有所减少但是并未被消除，例如，相对于亲本细胞，糖基转移酶的表达降低了10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、或90%。在某一些实施方案中，这通过使用以下各项而实现：siRNA、反义RNA、靶向敲除、靶向突变、二价阳离子（例如，Mn++、Mg+、Co++或Zn++）的浓度的调节、氨的调节、升高pH（例如，使用乌司他丁或氯喹）、化学抑制剂（如：澳粟精胺、脱氧野尻霉素、脱氧甘露野尻霉素、澳大利亚栗籽豆碱（Australine）、2,5-二羟甲基-3,4-二羟基吡咯烷、基夫碱（Kifunensine）、苦马豆素、制甘糖酶素A（Mannostatin A）、1,4-双脱氧-1,4-亚氨基-D-甘露醇）；油酸的调节（例如，添加）、视黄酸的调节（例如，添加）、转录因子（例如，RFX1、Pax-4a、CHOP-10、COUP-TF1、MIF-1、Evi-1、MZF-1、STAT-6、Elk-1、MAZR）的调节。
在一个实施方案中，该方法包括用一种二价阳离子补充细胞培养基，这种二价阳离子为，例如，锰（Mn++），如，MnCl2（例如，从25至250μM的MnCl2、从25至150μM的MnCl2、25至100μM的MnCl2、25至75μM的MnCl2、或25至50μM的MnCl2）。在这一实施方案中，该方法增加了由该细胞产生的糖蛋白的一种制剂中的高甘露糖水平，例如增加了HM5的水平。在一个实施方案中，相对于在由未用Mn++补充的同样的培养基中培养的同样的宿主细胞所产生的糖蛋白，该水平增加了至少10%、20%、25%、30%、40%、50%或更多。在一个实施方案中，该方法还增加了该糖蛋白的去岩藻糖基化种类的水平，例如，增加了由该细胞产生的糖蛋白的一种制剂中去岩藻糖基化种类相对于岩藻糖基化种类的比率。这个实施方案还可以包括以下步骤：测量糖蛋白中高甘露糖的水平，例如，高甘露糖种类的总水平或HM4、HM5、HM6、HM7、HM8、HM9中的一个或多个的水平，或它们的比率。该实施方案还可以包括以下步骤：测量糖蛋白中的岩藻糖基化的水平，例如，在由细胞产生的糖蛋白的一种制剂中去岩藻糖基化种类的总水平或去岩藻糖基化种类相对于岩藻糖基化种类的比率。
在一个实施方案中，该方法包括：获得或确定糖蛋白样品中的一种高甘露糖糖型的个性特征或数量，例如，通过在此描述的一种方法；并且用一种二价阳离子补充细胞培养基，这种二价阳离子为，例如，锰（Mn++），如，MnCl2（例如，从25至250μM的MnCl2、从25至150μM的MnCl2、25至100μM的MnCl2、25至75μM的MnCl2、或25至50μM的MnCl2），从而增加由该细胞产生的糖蛋白的一种制剂中高甘露糖的水平，例如，增加HM5的水平。在一个实施方案中，相对于在由未用Mn++补充的同样的培养基中培养的同样的宿主细胞所产生的糖蛋白，该水平增加了至少10%、20%、25%、30%、40%、50%或更多。在一个实施方案中，该方法包括：用一种二价阳离子补充细胞培养基，这种二价阳离子为，例如，锰（Mn++）（例如，MnCl2（例如，从25至250μM的MnCl2、从25至150μM的MnCl2、25至100μM的MnCl2、25至75μM的MnCl2、或25至50μM的MnCl2））；获得或确定糖蛋白样品中的一种高甘露糖糖型的特性或数量，例如，通过在此描述的一种方法；将该高甘露糖糖型的个性特征或数量与一个参比样品（例如，一个对照样品或一种GMP或药物规范或标准）的个性特征或数量进行比较；并且做出有关糖蛋白的决定，例如，在此描述的一个决定。
在一个实施方案中，该方法还增加了该糖蛋白的去岩藻糖基化种类的水平，例如，增加了在由该细胞产生的糖蛋白的一种制剂中去岩藻糖基化种类相对于岩藻糖基化种类的比率。这个实施方案还可以包括以下步骤：测量糖蛋白中的高甘露糖的水平，例如，高甘露糖种类的总水平或HM4、HM5、HM6、HM7、HM8、HM9中的一个或多个的水平，或它们的比率。这个实施方案还可以包括以下步骤：测量糖蛋白中的岩藻糖基化的水平，例如，在由该细胞产生的糖蛋白的一种制剂中去岩藻糖基化种类的总水平或去岩藻糖基化种类相对于岩藻糖基化种类的比率。
在一个实施方案中，通过减少在此披露的一种基因（例如，MGAT1）的表达而增加了高甘露糖的水平，其中通过种方法或试剂减少了表达，该方法或试剂导致在该基因（例如，MGAT1）的表达降低与高甘露糖的增加之间的一种非线性关系。在一个实施方案中，（例如，MGAT1的）表达的降低与高甘露糖的增加的曲线图主要具有三个期：其中表达降低对高甘露糖的水平具有极小或没有影响的一个期（它并未实质上增加高甘露糖），其中表达水平的降低与高甘露糖的增加基本上呈线性关系的一个期，以及其中基因表达的进一步降低导致高甘露糖极少或没有进一步增加的一个期。在一个实施方案中，在增加高甘露糖的一种方法中，基因表达（例如，MGAT1表达）的水平是在线性期。在一个实施方案中，降低是在线性期的中间，正好在最大值和非线性期之前。在一个实施方案中，降低是在线性期的最后25%、10%、5%或1%，正好在最大值和非线性期之前。在一个实施方案中，降低的水平不超过处于一个拐点处的基因表达降低水平的1.5、2.5或4.0倍，该拐点是位于线性期与其中进一步降低基因表达而没有带来高甘露糖进一步显著增加的期之间。
在一个实施方案中，宿主细胞经受一种延迟或后期收获。在一些实施方案中，这包括延迟该收获直到这些细胞的活力低于40%、30%、20%或10%。在其他实施方案中，这将涉及延迟该收获直到细胞数高于6x106、7x106、8x106、10x106、或15x106细胞/ml。在其他实施方案中，延迟收获可以指但将不限于：一旦培养基组分的水平达到一个目标水平（如低于起始水平的70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%、2%或0%）时进行收获。这些培养基组分可以包括但将不限于葡萄糖、半乳糖、谷氨酰胺或氨基酸水平。在其他实施方案中，延迟收获可以指但将不限于：一旦细胞副产物的水平达到一个目标水平（如大于起始水平的2、4、6、8或10倍增加时）进行收获。这些副产物可以包括但将不限于氨和乳酸盐。在其他实施方案中，延迟收获可以指与一种现有的补料方案相比，延迟收获的时间。这可以涉及但不限于从现有过程延迟收获时间达6、12、18、24、48、72或96小时。在其他实施方案中，延迟收获可以指延迟收获的时间直到满足一个气体消耗值。这可以包括但不限于延迟收获时间直到氧消耗水平大于50、100、150、200、250、300或350mmol/L。在其他实施方案中，延迟收获可以指延迟收获直到满足1个、2个、3个或4个上述参数中的多个。在其他实施方案中，延迟收获可以指延迟收获直到满足两个上述参数的比率。这可以包括但不限于乳酸盐/葡萄糖小于2、1、0.5、0.25或0.1的比率。可替代地，这可以包括但不限于氧/葡萄糖大于3、4、5、6、或7的比率。
在一个实施方案中，宿主细胞经受一种延迟补料策略。在一些实施方案中，延迟补料策略可以指但不限于在补料分批或灌注培养系统中推迟添加补料营养物（例如，葡萄糖、半乳糖、氨基酸、维生素、磷酸盐组分等）直到细胞活力低于90%、80%或70%，或直到这些细胞达到特定的细胞密度，如超过5x106、6x106、7x106、8x106、10x106细胞/ml。在其他实施方案中，延迟补料策略可以指但将不限于：一旦培养基组分的水平达到一个目标水平（如低于起始水平的70%、60%、50%、40%、30%、20%或10%时）添加补料营养物。这些培养基组分可以包括但将不限于葡萄糖、半乳糖、谷氨酰胺或氨基酸水平。在其他实施方案中，延迟补料策略可以指但将不限于：一旦细胞副产物的水平达到一个目标水平（如大于起始水平的2、4、6、8、或10倍增加时）添加补料营养物。这些副产物可以包括但将不限于氨和乳酸盐。在其他实施方案中，延迟补料策略可以指与一种现有补料方案相比，延迟补料策略开始的时间。这可以涉及但不限于：从现有过程中的补料开始延迟初始补料开始时间达6、12、18、24、48、72或96小时。在其他实施方案中，延迟补料策略可以指与一种现有的补料方案相比，延迟随后的补料的时间。这可以涉及但不限于：从先前的补料点延迟每一个随后的补料时间6、12、18、24、48、72或96小时。在其他实施方案中，延迟补料策略可以指延迟补料的时间直到满足一个气体消耗值。这可以包括但不限于延迟补料直到氧消耗水平大于10、25、50、100、150、200、250、300或350mmol/L。在其他实施方案中，延迟补料策略可以指延迟补料时间直到满足2个、3个或4个上述参数中的多个。在其他实施方案中，延迟补料可以指延迟补料直到满足两个上述参数的比率。这可以包括但不限于乳酸盐/葡萄糖小于2、1、0.5、0.25或0.1的比率。可替代地，这可以包括但不限于氧/葡萄糖大于3、4、5、6、或7的比率。
在另一个实施方案中，宿主细胞经受一种操作，该操作调节高尔基体构造，例如，布雷菲尔德菌素A、麦考酚酸、腐败菌素B、伴刀球霉素B、白灰制菌素A、肽抑制素（Efrapeptins）的操作（例如，添加至细胞培养中）。
在另一个实施方案中，宿主细胞经受一种操作，该操作调节高尔基体运输（例如，影响一个高尔基体隔室（Golgi compartment）芽接（budding）到另一个高尔基体隔室的组分的调节（例如，添加至细胞培养中））。这些包括布雷菲尔德菌素A、麦考酚酸、腐败菌素B、伴刀球霉素B、白灰制菌素A、肽抑制素。
在另一个实施方案中，宿主细胞经受一种操作，该操作调节代谢物或前体水平，例如，半乳糖、3’F UMP、UDP二醛、UDP、UTP、UDP N-乙酰胞壁酸、5’氨氧基-尿苷、5’-氨氧基-甘氨酰-尿苷、ManNAc的调节（例如，添加至细胞培养中）。这样的试剂可以是天然发生的或非天然发生的衍生物。这些还可以包括在代谢物或前体的生物合成中所涉及的酶的水平或活性的靶向操作。这些可以包括但不应当限于以上所描述的那些（例如，GNE、UAP-1、PGM-3、NAGK、GNPNAT1、UGP-2、UGDH、GALK-1、PGM-1、GCK、高尔基体UDP磷酸酶、UDP-GlcNAc转运蛋白）。用来操作酶水平的机制包括，靶向诱变、siRNA、反义RNA、靶向敲除以及天然的和非天然的结构类似物。
在另一个实施方案中，宿主细胞经受一种操作，该操作调节高尔基体（Golgi）的脂质含量，如鞘脂生物合成抑制剂（例如，伏马菌素B1、伏马菌素B2、L-环丝氨酸、DL-PDMP、DL-PPMP、DL-苏式-二氢鞘氨醇、多球壳菌素、L-赤式MAPP、3-O-甲基鞘磷脂（3-O-methylsphingomylin）、N-丁基脱氧野尻霉素或油酸乙醇酰胺（Oleylethanolamide））的添加。在另一个实施方案中，宿主细胞经受一种操作，该操作调节胆固醇的水平，如一种胆固醇生物合成抑制剂（如焦磷酸异戊烯酯、依折麦布、辛伐他汀、或HMG-CoA还原酶抑制剂）的添加或一种胆固醇多价螯合剂（如甲基-β-环糊精）的添加。
在另一个实施方案中，宿主细胞经受脂质生物合成中所涉及的酶的水平的操作。可以在如由Alberts、Bray、Lewis、Raff、Robers以及Watson编辑的《细胞分子生物学》（Molecular Biology of the Cell）,(1994)中所描述而找到这些酶。用来操作酶水平的机制包括靶向诱变、siRNA、反义RNA、靶向敲除以及非天然的结构类似物。
在另一个实施方案中，宿主细胞经受一种操作，该操作调节存在于ER或高尔基体（例如，VIPL VIP36）中的L-型凝集素的结合亲和力以便通过隔室内pH的变化（例如，使用乌司他丁或氯喹）用于在糖基化途径中得到高甘露糖中间体。
在另一个实施方案中，宿主细胞经受一种操作，该操作调节在糖基化作用及蛋白质折叠中所涉及的“质量控制”组分（如EDEM、MANEA、GCS1）。
在另一个实施方案中，宿主细胞经受一种操作，该操作调节甘露糖苷酶1a和1b的细胞内分布（例如，这些酶优先定位至ER或高尔基体）。
在另一个实施方案中，宿主细胞经受一种操作，该操作调节含有高甘露糖结构的蛋白质（例如，一种抗体）的表达水平。这可以是通过添加用来乙酰化染色质的试剂（例如，丁酸酯）而实现。另外，这可以通过增加表达该蛋白质的基因的基因拷贝的数量（例如，抗体，例如，通过dhfr扩增、通过靶向嵌入、通过病毒插入、通过启动子序列）而实现。在其他实施方案中，这可以通过增加蛋白质转录或翻译的速率（例如，抗体，例如，通过增强子序列、通过密码子优化、启动子序列）而实现。
在一个实施方案中，该方法包括测量高甘露糖含量或模式的步骤，该步骤在以下一个或多个时候进行：在该操作之前和/或之后，在培养这些细胞的过程中，在收获这些细胞之后，在纯化该糖蛋白之后。
在某一实施方案中，该方法包括在操作之前确定高甘露含量的一个所希望的或目标水平的步骤。该目标或所希望的水平可以是，例如，>20%、>30%、>40%。该目标或所希望的水平可以是，例如，<20%、<15%、<10%、<8%、<7%、<6%、<5%、<4%、<3%、<2%、<1%、<0.5%。该目标或所希望的水平可以是，例如，Man4、Man5、Man6、Man7、Man8或Man9的富集或增加的水平。这一确定可以包括但不限于测量一种参考化合物上的高甘露糖的水平，或基于一种所希望的生物学、结构上的考虑因素来确定，或通过查阅文献来确定。
根据以下详细说明、并且根据权利要求书，本发明的其他特征和优点将是清楚的。
附图简要说明
图1是用于高甘露糖和复合聚糖的生物合成途径的草图。这些构成N-聚糖的单糖展示如下：岩藻糖（浅灰色三角形）、GlcNAc（黑色正方形）、甘露糖（深灰色圆圈）、以及半乳糖（浅灰色圆圈）。代表高甘露糖种类的结构指示为HM9、HM8等。
图2是从一个野生型细胞系（CHO）以及一个Lec1突变体（MGAT1null）细胞系收获的聚糖的一组LC谱。
图3是反映聚糖水平的一组标绘图，作为模型来反映不同水平的MGAT1。每个标绘图是指基于MGAT1表达水平（起始的%）所指示的聚糖的水平（起始的%）。这些展示了高甘露糖结构的升高并不要求完全消除MGAT1转移酶。
图4是代表一个细胞群体中的UGP-2基因表达的线性分析的一组标绘图，因为该基因与由细胞产生的糖蛋白上的Man5含量相关联。在这个标绘图上的每个圆点表示四种列出的转化细胞系之一的特定克隆。
图5是MnCl2的增加水平与Man5的水平（总聚糖的%）的关系标绘图。数据代表重复的决定因素。
详细说明
定义
在此使用的“高甘露糖”是指一个或多个N-聚糖结构，包括HM4、HM5、HM6、HM7、HM8以及HM9，分别含有3、4、5、6、7、8或9个甘露糖残基。可替代地，这些可以称为Man4、Man5、Man6、Man7、Man8、Man9。这些结构如所指示展示在图1中。
在此使用的“细胞的制剂”是指细胞的体外制剂。在细胞来自多细胞生物（例如，植物和动物）的情况下，细胞的纯化制剂是从该生物获得的细胞的亚群，而不是整个完整的生物。在单细胞微生物（例如，培养的细胞和微生物细胞）的情况下，它包括一种包含至少10%并且更优选地是50%的主题细胞的制剂。
提及细胞时，在此使用的术语“基因工程化的”意在包括将一种异源DNA分子引入细胞中后表达一种特定基因产物的细胞。该异源DNA可以是编码该基因产物和/或包括调控元件的一个序列，这些调控元件控制该基因产物的一个编码序列（例如一个内源序列）的表达。该DNA分子可以通过基因靶向或同源重组而被引入，即，在一个特定的基因组位点引入该DNA分子。
WO 2008/128227的披露内容以其全部内容结合在此。在下面进一步详述本发明的各个方面。
宿主细胞/基因工程化的细胞
用来产生在此描述的一种糖蛋白的宿主细胞可以是含有产生高甘露糖结构的细胞机器的任何细胞。例如，昆虫细胞、植物细胞、酵母或哺乳动物细胞（如，鼠类、人类或CHO细胞）。可用作宿主细胞的CHO细胞包括任何株系的CHO细胞，包括CHO K1（ATCC CCL-61）、CHO pro3-、CHO DG44、CHO-S、CHO P12或dhfr-CHO细胞系DUK-BII（Chassin等人，《美国科学院院报》（PNAS）77,1980,4216-4220）。可用作宿主细胞的鼠类细胞包括NS0株系或其他杂交瘤细胞类型，或相似的BHK啮齿动物细胞。可用作宿主细胞的人类细胞包括，举例来说，PerC6品系、杂交瘤细胞、或视网膜细胞。
适合的哺乳动物细胞包括任何正常的非永生的或正常的/异常的永生动物或人类细胞，包括：由SV40转化的猴肾CV1系（COS-7，ATCCCRL 1651）；人胚肾系（293）（Graham等人，《基因病毒学杂志》（J.Gen.Virol），36:59(1977)）；幼仓鼠肾细胞（BHK，ATCC CCL 10）；中国仓鼠卵巢细胞（CHO），例如，DG44、DUKX-V11、GS-CHO（ATCCCCL 61、CRL 9096、CRL 1793以及CRL 9618）；小鼠睾丸支持细胞（TM4,Mather,《繁殖生物学》（Biol.Reprod.）23:243 251(1980)）；猴肾细胞（CV1，ATCC CCL 70）；非洲绿猴肾细胞（VERO-76，ATCCCRL 1587）；人宫颈癌细胞（HeLa，ATCC CCL 2）；布法罗大鼠肝细胞（BRL 3A，ATCC CRL 1442）；人肺细胞（W138，ATCC CCL 75）；人肝脏细胞（Hep G2，HB 8065）；小鼠黑色素瘤细胞（NSO）；小鼠乳房肿瘤（MMT 060562，ATCC CCL 51）；TRI细胞（Mather等人,《纽约科学院年刊》（Annals N.Y.Acad.Sci.）383:44 46(1982)）；犬肾细胞（MDCK）（ATCC CCL 34和CRL 6253）、HEK 293（ATCC CRL1573）、WI-38细胞（ATCC CCL 75）（ATCC：美国典型培养物保藏中心，Rockville,Md.）、MCF-7细胞、MDA-MB-438细胞、U87细胞、A127细胞、HL60细胞、A549细胞、SP10细胞、DOX细胞、SHSY5Y细胞、Jurkat细胞、BCP-1细胞、GH3细胞、9L细胞、MC3T3细胞、C3H-10T1/2细胞、NIH-3T3细胞以及C6/36细胞。在Winnacker，《从基因到克隆》（FROM GENES TO CLONES）(VCH Publishers,纽约州纽约市,1987）大体上论述了使用哺乳动物组织细胞培养来表达多肽。
示例性植物细胞包括，例如，拟南芥、油菜籽、玉米、小麦、水稻、烟草等等）（Staub等人的2000年的《自然生物技术》（NatureBiotechnology）1(3):333-338以及McGarvey,P.B.等人的1995年的《生物技术》（Bio-Technology）13(13):1484-1487；Bardor,M.等人的1999年的《植物科学发展趋势》（Trends in Plant Science）4(9):376-380）。示例性昆虫细胞包括，例如，草地贪夜蛾sf9、Sf21、粉纹夜蛾等等。示例性的细菌细胞包括大肠杆菌。也可以选择各种酵母和真菌，如毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、多形汉逊酵母以及酿酒酵母。
其他适合的宿主细胞对于本领域的技术人员是已知的。
制造和使用本发明的宿主细胞的方法以及在这些宿主细胞中制造治疗性糖蛋白的方法在本领域是已知的。例如，在以下各项中提供了多种方法：细胞生物学实验指南（Current Protocols in Cell Biology）（2007,John Wiley & Sons,Inc.,Print ISSN:1934-2500）；蛋白质科学实 验指南（Current Protocols in Protein Science）（2007,John Wiley & Sons,Inc.,Print ISSN:1934-3655）；Wurm,重组蛋白治疗剂在培养的哺乳动物细胞中的产生（Production of recombinant protein therapeutics incultivated mammalian cells）（2004）《自然生物技术》（Nature Biotech.）22:1393-1398；《治疗性蛋白：方法与指南》（Therapeutic Proteins: Methods and Protocols），由Smales&James编辑（2005）Humana Press,ISBN-10：1588293904）。
检测基因表达或活性的方法
基于核酸的检测方法包括杂交或扩增测定，这些测定包括但不限于DNA印迹或RNA印迹分析、聚合酶链反应分析（例如，定量PCR）、SAGE分析、探针阵列或寡核苷酸阵列。在这样的方法中有用的探针常规地选自已知的基因序列。在一些情况下，可以使用从本领域发现的直系同源基因序列（例如，大鼠或小鼠衍生序列）鉴定的探针，来评估来自一个种类（例如，一种啮齿动物种类，如中国仓鼠）的细胞物质。
用于蛋白质检测的基于抗体的技术包括酶联免疫吸附测定（ELISAs）、免疫沉淀法、免疫荧光法、酶免疫测定（EIA）、放射免疫测定法（RIA）、蛋白质印迹分析、表面等离子体共振。其他方法可以包括使用基于质谱的方法检测肽类或其片段，这些方法包括但不限于LC-MS、MS/MS、MS/MS/MS、MALDI-MS、多重反应监测（MRM）。
在一个实施方案中，在此描述的检测方法是确定样品的基因表达谱的一部分，其中该谱包括代表一种基因的表达水平的一个值，其中至少一个其他值用于表示至少一种其他基因。该方法可以进一步包括将该值或该谱（即多个值）与一个参考值或参比谱进行比较。可以通过在此描述的任何方法来获得样品的基因表达谱（例如，通过从该样品提供一种核酸并且使该核酸接触一个阵列）。该方法可以用来评估或筛选CHO细胞。
在另一个方面，本发明的特征为一种具有多个数字编码的数据记录的计算机媒体。每个数据记录包括代表样品中一种基因的表达水平的值以及该样品的描述符。样品的描述符可以是样品的一种标识符，例如，该样品自其衍生的细胞类型（例如，一种CHO细胞株），或在其下对该样品的来源细胞进行培养的细胞培养条件。在一个实施方案中，该数据记录进一步包括代表除Ggta1以外的基因（例如，与聚糖合成有关的其他基因，或在一个阵列上的其他基因）的表达水平的值。该数据记录可以构成一个表格，例如，作为一种数据库一部分的一个表格，例如，一种关系数据库（例如，Oracle或Sybase数据库环境的SQL数据库）。
调节基因表达的方法
在本发明的某些方法中，可以调节基因表达，例如，提高或降低。这样的方法可以包括降低（敲低）一种主题基因的表达或消除（敲除）一种主题基因的表达。制造及使用反义分子来调节生物活性的方法在本领域中是已知的，例如参见：Pan和Clawson，用于生物控制的反义 应用（Antisense applications for biological control）（2006）《细胞生物化学杂志》（J.Cell Biochem.）98(1):14-35；Sioud和Iversen，作为 治疗剂的核糖酶类、DNA酶类以及小干扰RNA（Ribozymes,DNAzymes and small interfering RNAs as therapeutics）（2005）《药靶研究最新进展》（Curr Drug Targets）6(6):647-53；Bhindi等人，战火兄弟：DNA 酶、短干扰RNA以及基于小分子核酸的基因沉默策略的新兴波（Brothers in arms:the emerging wave of small-molecule nucleic acid-based gene-silencing strategies）(2007)《美国病理学杂志》（Am JPathol.）171(4):1079-88。进行基因敲除的方法在本领域是已知的，例如，参见Kuhn和Wurst (编辑)基因敲除实验指南（分子生物学中的 方法）（Gene Knockout Protocols(Methods in Molecular Biology)）Humana Pres（2009年3月27日）。
在一些实施方案中，可以选择一种细胞，该细胞已经基因工程化以用于一种基因的永久性或调节性失活，该基因编码涉及在此描述的一种特定聚糖的合成的一种蛋白质。例如，可以使编码一种酶（如，在此描述的酶）的基因失活。基因表达的永久性或调节性失活可以通过将具有转染的质粒DNA构建体或合成寡核苷酸靶向至一个基因座而实现。可将这种质粒构建体或寡核苷酸设计成几种形式。这些形式包括下列各项：1)在失活的基因的一种外显子之内插入选择标记基因或其他序列；2)在非编码序列的调控区中插入外源性序列；3)调控和/或编码序列的缺失或置换；以及4)通过位点特异性诱变改变一个蛋白质编码序列。
在将一个选择标记基因插入编码序列的情况下，有可能产生该基因的内源性外显子的一个框内融合，其中该外显子被工程化以包含（例如）一个选择标记基因。以这种方式，在成功靶向之后，该内源基因表达一种融合mRNA（核酸序列加上选择标记序列）。而且，该融合mRNA不能产生一个功能性翻译产物。
在将DNA序列插入调控区的情况下，通过在转录所需要的5’非翻译区（5’UTR）中干扰这种内源性启动子区或任何其他区可以使基因转录发生沉默。这样的区域包括，例如翻译控制区和内含子的剪接供体。其次，可以将新的调控序列插入该基因的上游，这使该基因经受细胞外因子的控制。因此将有可能下调或压制（extinguish）如所希望的针对糖蛋白产生的基因表达。而且，可以使用包括一个选择标记和一个启动子的序列来干扰该内源序列的表达。最后，可以通过靶向底物的适当设计来缺失这种内源基因的全部或部分。
其他影响基因表达（例如，提高或降低基因表达）的方法可涉及添加试剂，例如，添加规定的试剂至培养基（例如，如在此所描述的）。
高甘露糖结构的生物学
已知在蛋白质上含甘露糖的聚糖的存在对这些蛋白质与几种受体以及结合伴侣的相互作用具有影响，通过它们的相互作用影响这些含甘露糖的蛋白质的功能、分布以及稳定性。这样的结合伴侣包括Fc受体、FcRn、甘露糖结合凝集素（MBL）、C1q、甘露糖受体、DC和L-sign，以及特定细胞上的受体（参见，例如，Li等人，（2009）《生物技术新见》（Curr Opin Biotechnol.）20,678-684）。因此，在此描述的方法对于评估或调节糖蛋白对特定组织（例如，骨髓、乳腺上皮细胞、肠上皮细胞）、对特定细胞类型（例如，树突细胞、巨噬细胞）或特定隔室（例如，溶酶体）的靶向是有用的。在此描述的方法对于通过受体结合（例如，Fc受体）、血清半衰期/清除率（例如，通过结合至甘露糖受体FcRn）以及吸附作用来评估或调节生物活性也是有用的。
在此描述的方法对于评估或调节其他生物活性也是有用的，包括：抗体沉积和聚集。一种抗体的Fc部分上的聚糖结构改变了该抗体的3维结构。已知抗体结构的改变具有导致抗体聚集或沉积的可能性。在此使用的这些方法对于生成具有目标水平的高甘露糖的抗体以便减少抗体血清沉积、复合物形成和聚集将是有用的。同样地，可以利用这些结构变化来增加或降低一种抗体的免疫原性。
在某些实施方案中，抗体分子还可以含有在该分子Fab部分上的糖基化。在这些情况下，除了以上描述的那些生物学之外，一种高甘露结构的存在还可以改变对于表位的亲和力，或该抗体在细胞表面上形成交联复合物的能力。在此描述的这些方法对于生成具有改变水平的高甘露糖结构的抗体以便“调节”（“dial”）所希望的亲和力，并且实现所希望的受体交联水平从而减少靶效应并增大治疗窗将是有用的。另外，含有高甘露糖的肽类和多肽类的设计可以通过泛素连接酶介导的途径抑制蛋白质降解。
根据以下详细说明、并且根据权利要求书，本发明的其他特征和优点将是清楚的。
通过以下实例进一步展示了本发明，这些实例不应解释为是限制性的。在本申请全文中引用的所有参考文献、专利、以及已公开的专利申请的内容都通过引用结合在此。
实例
实例1：高甘露糖蛋白质糖型的高通量分析
在一种混合物中表征低丰度糖型的主要挑战之一是在该混合物中存在较高丰度的糖型以及多种多样的糖型。低丰度糖型的分析典型地涉及通过酶处理（PNGAse-F或Endo-H）或者通过化学处理（即，肼解作用）从蛋白质释放聚糖。然后在没有进一步衍生作用下或在用不同的生色团/荧光团标记之后纯化并且随后分析所释放的聚糖。然而，在这个过程中所涉及的费力的样品制备步骤以及这些分析所需要的较高量的物质妨碍了在一种高通量设置中使用这些类型的方法的能力。
在此描述的方法可对于分析含高甘露糖的糖型，尤其是以低丰度（例如，<10%、<5%、<4%、<3%、<2%、<1%、<0.05%）存在的高甘露糖糖型是有用的。
以一种含糖蛋白的样品如抗体样品（例如，来自培养基，或来自一种蛋白质制剂）开始，任选地执行一种缓冲液更换以便缓冲兼容步骤#2的酶消化和/或步骤#3的质谱法分析。取决于样品配方或步骤3的色谱方法，这个步骤是任选的。用一种酶处理该糖蛋白样品，这种酶切割来自样品中的糖蛋白的复杂的岩藻糖化聚糖（例如，内切糖苷酶F3(http://glycotools.qa-bio.com/s.nl/it.A/id.96/.f)）。这个步骤出乎意料地展现了在剩余样品中的低丰度糖型，如高甘露糖种类。在下一个步骤中，任选地还原和烷化该样品和/或进行一种缓冲液更换以便缓冲兼容MS。在下一个步骤中，通过反相LC-MS或靶向反相LC-MS分析来分析酶处理的样品以便鉴定含高甘露糖的糖型。还可以采用其他类型的色谱柱化学。了解含高甘露糖的糖型的理论质量，可以建立一种靶向MS实验以便只监测对应于这些种类的所选的m/z特征的组。在一种比较分析设置中可以用多种样品重复该分析。
以上描述的方法在通量、分辨率以及灵敏度之间提供了一种优良的平衡，使得它特别适合在一种高通量设置中分析含高甘露糖的低丰度糖型。
实例2：MGAT1水平对Man5结构的影响
稳定地转化野生型CHO（WT）和Lec1（MGAT1 null）细胞系以便表达一种IgG模型融合蛋白。从细胞中收获重组产物，并且通过酰胺LC/MS分析N-聚糖。在图2中显示了来自WT（顶部）和MGAT1缺陷型（底部）CHO细胞的LC数据，其中以相对百分比标识代表性聚糖。如在图2中可见，从Lec1突变体产生的糖蛋白缺乏Man5结构。
然而，已经发现没有必要完全抑制MGAT1来产生这种影响。图3是反映聚糖水平的一组标绘图，作为模型来反映不同水平的MGAT1。每个标绘图是指基于MGAT1的表达水平（起始的%）的所指示的聚糖的水平（起始的%）。这些表明高甘露糖结构的升高并不要求完全消除或耗竭MGAT1转移酶。
实例3：与高甘露糖含量有关的非线性相关的鉴定
本实例展示了在糖基化调节剂与高甘露糖含量之间的出人意料的非线性相关的鉴定。
从细胞系CHOK1、CHOS、DG44以及Dhfr-中的每一个生成稳定转化的克隆，这些克隆表达一种IgG融合模型蛋白。从每个克隆分离该IgG产物并且通过2D LC/MS来表征聚糖。将Man5的水平确定为总聚糖的百分比。同时，从每个克隆提取mRNA并且表征涉及糖构建（glycobuilding）的不同方面的各种酶的水平。这样的酶包括糖基转移酶类、转运蛋白类、代谢酶类以及在聚糖的生物合成中所涉及的其他酶。使这些数据经受线性分析以便鉴定特定生物合成步骤与Man5含量之间的关系。图4A显示了UGP-2的基因表达水平，因为它出人意料地显示出与由细胞产生的糖蛋白上的Man5含量的线性相关。虽然不受理论限制，图4B展示了这种基因如何能（回顾一下）与Man5生物合成中所涉及的代谢物相关。
实例4：Man5水平受高浓度的二价阳离子影响
本实例展示了升高水平的二价阳离子对糖酶活性的抑制作用。
在增加水平的MnCl2存在下培养表达一种IgG融合模型蛋白的CHO细胞。5天之后从这些细胞收获产物，纯化并且使其经受正相HPLC进行N-聚糖分析。量化Man5的水平（总聚糖的%）并且显示在图5中。如图可见，当升高培养基中锰的水平时，高甘露糖的含量也会随之增加。虽然不受理论的限制，这可能主要是受转移酶上的锰辅因子（Mn cofactor）活性的驱动。
扩展和替代方案
在本申请中引用的所有文献和类似材料，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍、论文以及网页，无论这类文献和类似材料的格式如何，它们都通过引用以其全部内容明确地结合在此。在所结合的文献和类似材料的一个或多个不同于本申请或与本申请矛盾的情况下，包括但不限于定义的术语、术语使用、描述的技术等，以本申请为准。在此所使用的小节标题仅是出于组织性目的并且不应当解释为以任何方式限制所描述的主题。虽然已经结合各种实施方案和实例描述了这些方法，并不意图将这些方法限制于这样的实施方案或实例。相反，如将为本领域的技术人员所理解的是，这些方法涵盖各种替代方案、修改以及等效物。

Claims (55)

1.一种鉴定和/或量化在糖蛋白样品中的高甘露糖糖型的方法，该方法包括：(a)提供一种含有糖蛋白混合物的样品；(b)任选地进行一种缓冲液更换以便缓冲兼容酶消化和/或质谱法（MS）分析，(c)从该糖蛋白样品中去除较高丰度的聚糖，(d)任选地还原和烷化该样品和/或进行一种缓冲液更换以便缓冲兼容质谱法，并且(e)量化一种在该处理的样品中的含高甘露糖的糖型。
2.如权利要求1所述的方法，其中步骤(c)包括用一种酶处理该糖蛋白样品，该酶从该糖蛋白中切割复杂的岩藻糖化聚糖。
3.如权利要求1所述的方法，其中步骤(c)包括用内切糖苷酶F3处理该糖蛋白样品。
4.如权利要求1所述的方法，其中步骤(e)包括在处理的样品上进行毛细管电泳法（CE）；反相LC-MS或靶向反相-LC-MS。
5.如权利要求1所述的方法，进一步包括确定以下各项的一个或多个：
(i)相对于总糖型在该糖蛋白样品中的高甘露糖糖型的数量；
(ii)在该糖蛋白样品中，选自Man4、Man5、Man6、Man7、Man8以及Man9的两种高甘露糖种类的一个或多个相对比率；
(iii)在该糖蛋白样品中高甘露糖与混合结构的相对比率，
(iv)在该糖蛋白样品中高甘露糖与复杂结构的相对比率，
(v)在该糖蛋白样品中高甘露糖与岩藻糖化结构的相对比率；
(vi)在该糖蛋白样品中修饰的高甘露糖结构的存在或丰度（例如，岩藻糖化高甘露糖结构的存在或丰度）。
6.如权利要求1所述的方法，其中该方法分开地鉴定和/或量化在该糖蛋白样品中的至少两种个别糖型。
7.如权利要求1所述的方法，其中该糖蛋白样品是一种抗体制剂或一种受体-Fc融合制剂。
8.如权利要求7所述的方法，其中该抗体制剂是产生于哺乳动物细胞培养的一种药物制剂。
9.如权利要求1所述的方法，其中该方法是在GMP条件下进行的。
10.如权利要求1所述的方法，进一步包括将这些量化数量的高甘露糖糖型与一种参比水平或质量标准进行比较。
20.一种用于鉴定和/或量化在聚糖或糖蛋白制剂中的高甘露糖和/或混合结构的方法，该方法包括：(a)提供一种聚糖或糖蛋白混合物，(b)用一种酶处理该聚糖混合物或糖蛋白混合物，该酶切割暴露在一种糖型的非还原端处的末端甘露糖苷酶残基，并且(c)量化所切割的末端甘露糖残基，从而分析在一种聚糖或糖蛋白制剂中的高甘露糖和/或混合结构。
21.如权利要求20所述的方法，其中该量化步骤包括通过HPLC或GC-MS进行定量单糖分析。
22.如权利要求20所述的方法，其中所切割的末端甘露糖是相对于总聚糖质量而被量化的。
23.如权利要求20所述的方法，其中该糖蛋白制剂是一种抗体制剂或一种受体-Fc融合制剂。
24.如权利要求23所述的方法，其中该抗体制剂是产生于哺乳动物细胞培养的一种药物制剂。
25.如权利要求20所述的方法，其中该方法是在GMP条件下进行。
26.如权利要求20所述的方法，进一步包括将这些量化数量的高甘露糖糖型与一种参比水平或质量标准进行比较。
30.一种用于评估细胞产生高甘露糖结构的能力和/或潜力的方法，该方法包括：
(a)提供一种细胞，并且
(b)评估细胞机器的两个或更多个组分，这些组分选自下组，该组由以下各项组成：MGAT 1（GlcNAc T1）；α-甘露糖苷酶II；α-甘露糖苷酶IIx；α-甘露糖苷酶IB；α-甘露糖苷酶IA；FucT1-9；葡萄糖苷酶GCS1；GANAB；UDP-GlcNAc的水平；GDP-Man；UDP/UTP；GDP/GTP；尿嘧啶核苷；鸟嘌呤核苷；GNE（葡萄糖胺(UDP-N-乙酰基)-2-表异构酶/N-乙酰甘露糖胺）；高尔基体UDP磷酸酶；UDP-GlcNAc转运蛋白；UAP-1（UDP-N-乙酰己糖胺焦磷酸化酶）；PGM-3-葡萄糖磷酸变位酶3；NAGK-N-乙酰基-D-葡萄糖胺激酶；GNPNAT1-磷酸葡萄糖胺-N-乙酰转移酶1；UGP-2-UDP-葡萄糖焦磷酸化酶2；UGDH-UDP-葡萄糖6-脱氢酶；GAlK-1-半乳糖激酶-1；PGM-1-葡萄糖磷酸变位酶-1；GCK-葡萄糖激酶；伴侣蛋白（BiP、SNARE、cpn’s、hsp’s）；EDEM（ER降解性甘露糖苷酶样蛋白）；MANEA；甘露糖受体；高尔基体构造；高尔基体脂质含量（鞘脂，胆固醇含量）；A1P1，VIP36，
其中该评估的结果指示了存在于由该细胞产生的一种糖蛋白中的高甘露糖聚糖的含量或模式。
31.如权利要求30所述的方法，其中该细胞是一种哺乳动物细胞。
32.如权利要求30所述的方法，其中评估了MGAT1与α-甘露糖苷酶IB的表达的比率。
33.如权利要求30所述的方法，其中评估了MGAT1与α-甘露糖苷酶IA的比率。
34.如权利要求30所述的方法，其中评估了MGAT1与MGAT2的表达的比率。
35.如权利要求30所述的方法，其中评估了NAGK/GNE和/或NAGK与MGAT2的表达的比率。
36.如权利要求30所述的方法，其中评估了MGAT1与葡萄糖苷酶的表达的比率。
37.如权利要求30所述的方法，其中评估了甘露糖苷酶IA与IB的表达的比率。
38.如权利要求30所述的方法，其中评估了EDEM与甘露糖苷酶IA的表达的比率。
39.如权利要求30所述的方法，其中评估了甘露糖苷酶Ⅱx与MGAT1的表达的比率。
40.如权利要求30所述的方法，其中评估了甘露糖苷酶IA与一种1,3葡萄糖苷酶（GANAB）的表达的比率。
41.如权利要求30所述的方法，其中评估了岩藻糖基转移酶与甘露糖苷酶IB的比率。
42.如权利要求30所述的方法，其中评估了甘露糖苷酶II与甘露糖苷酶IB的表达的比率。
43.如权利要求30所述的方法，其中评估了VIP36表达的水平。
44.如权利要求30所述的方法，其中评估了VIP36与甘露糖苷酶IA的表达的比率。
45.如权利要求30所述的方法，其中评估了UGP-2表达或UGP-2与甘露糖苷酶IB的表达的比率。
46.如权利要求30所述的方法，其中评估了至少两种前体糖核苷酸的水平。
47.如权利要求30所述的方法，其中评估了至少一种糖核苷酸以及一种核苷酸的水平。
48.如权利要求30至47的任一项所述的方法，其中该方法进一步包括基于评估步骤的结果，选择一种细胞作为宿主细胞用于一种治疗性糖蛋白的表达。
49.如权利要求48所述的方法，其中如果评估步骤的结果指示一种细胞可以或将会产生具有<20%高甘露糖结构的一种糖蛋白，则选择该细胞作为宿主细胞。
50.如权利要求48所述的方法，其中如果评估步骤的结果指示一种细胞可以或将会产生具有>10%高甘露糖结构的一种糖蛋白，则选择该细胞作为宿主细胞。
51.如权利要求48所述的方法，其中如果评估步骤的结果指示一种细胞可以或将会产生具有预定的高甘露糖结构的一种糖蛋白，则选择该细胞作为宿主细胞。
52.如权利要求51所述的方法，其中该预定的高甘露糖结构选自：一种高甘露糖种类（Man4、Man5、Man 6、Man7、Man8和/或Man9）与另一种高甘露糖种类的预定相对比率、高甘露糖与混合结构的预定相对比率、高甘露糖与复杂结构的预定相对比率、高甘露糖与岩藻糖化结构的预定相对比率、修饰的高甘露糖结构（例如，岩藻糖化的高甘露糖结构）的预定丰度。
53.如权利要求48所述的方法，其中该方法进一步包括基因工程化所选的细胞以表达一种治疗性糖蛋白的步骤。
54.如权利要求53所述的方法，其中该治疗性糖蛋白是一种基于IgG的分子，这种分子选自：贝伐单抗、托西莫单抗、阿昔单抗、阿仑单抗、阿西莫单抗、西妥昔单抗、阿达木单抗、兰尼单抗、吉姆单抗、依法珠单抗、英利昔单抗、阿昔单抗、利妥昔单抗、巴利昔单抗、依库珠单抗、帕利珠单抗、奥马佐单抗、达利珠单抗、替伊莫单抗、赛妥珠单抗、达克珠单抗、依库珠单抗、莫罗单抗-CD3、那他珠单抗、帕尼单抗、兰尼单抗、托西莫单抗、阿法赛特、依那西普以及阿巴西普。
55.如权利要求54所述的方法，进一步包括从基因工程化的细胞表达和收获该糖蛋白，并且评估所产生的糖蛋白的高甘露糖结构。
56.一种用于调节重组糖蛋白的高甘露糖结构的数量或模式的方法，该方法包括：(a)提供一种宿主细胞，该宿主细胞被基因工程化以便表达一种主题糖蛋白，并且(b)在一定条件下培养该细胞以便表达该重组蛋白，其中该宿主细胞经受一种操作，该操作调节在此描述的细胞机器的一种或多种组分。
57.如权利要求56所述的方法，其中该宿主细胞经受一种操作，该操作调节在此描述的一种糖基转移酶（例如，MGAT1）。
58.如权利要求56所述的方法，其中MGAT1表达降低了至少10%，但是并未被消除。
59.如权利要求56所述的方法，其中通过使用以下各项，降低了在此描述的一种糖基转移酶的基因表达，即:siRNA、靶向敲除、靶向突变、一种二价阳离子（例如，Mn++、Mg+、Co++或Zn++）的浓度的调节、氨的调节、升高pH（例如，使用乌司他丁或氯喹）、化学抑制剂（如：澳粟精胺、脱氧野尻霉素、脱氧甘露野尻霉素、澳大利亚栗籽豆碱（Australine）、2,5-二羟甲基-3,4-二羟基吡咯烷、基夫碱（Kifunensine）、苦马豆素、制甘糖酶素A（Mannostatin A）、1,4-双脱氧-1,4-亚氨基-D-甘露醇）；油酸的调节（例如，添加）、视黄酸的调节（例如，添加）、转录因子（例如，RFX1、Pax-4a、CHOP-10、COUP-TF1、MIF-1、Evi-1、MZF-1、STAT-6、Elk-1、MAZR）的调节。
60.如权利要求56所述的方法，其中该宿主细胞经受一种延迟或后期收获。
61.如权利要求56所述的方法，其中该宿主细胞经受一种延迟补料策略。
62.如权利要求56所述的方法，其中该宿主细胞经受一种操作，该操作调节高尔基体构造。
63.如权利要求56所述的方法，其中该宿主细胞经受一种操作，该操作调节高尔基体运输。
64.如权利要求56所述的方法，其中该宿主细胞经受一种操作，该操作调节在此描述的代谢物水平。
65.如权利要求56所述的方法，其中该宿主细胞经受一种操作，该操作调节高尔基体的脂质含量。
66.如权利要求56所述的方法，进一步包括一个测量高甘露糖含量或模式的步骤，该步骤在以下各项的一个或多个时候进行：在该操作之前和/或之后、在培养这些细胞的过程中、在收获这些细胞之后、在纯化该糖蛋白之后。
67.如权利要求56所述的方法，进一步包括一个在操作之前确定一个所希望的或目标水平的高甘露糖含量的步骤。
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