DE60030696T2

DE60030696T2 - Spezifische antikörper für cyp1b1

Info

Publication number: DE60030696T2
Application number: DE60030696T
Authority: DE
Inventors: William Melvin; Ian Graeme MURRAY
Original assignee: University of Aberdeen
Current assignee: University of Aberdeen
Priority date: 1999-03-19
Filing date: 2000-03-20
Publication date: 2007-10-04
Anticipated expiration: 2020-03-21
Also published as: GB9906380D0; CA2365121A1; AU768885B2; WO2000056773A1; JP2011157363A; JP2002543765A; EP1163272B1; EP1163272A1; ATE339453T1; US7419794B1; DE60030696D1; AU3308100A; ES2272261T3; US20090023160A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Tumordiagnose und -therapie, genauer gesagt Antikörper, die für Tumor-spezifisches Cytochrom P450 CYP1B1 spezifisch sind.
Hintergrund der Erfindung
Cytochrom P450 (P450) CYP1B1 ist das einzige bekannte Mitglied einer vor kurzem identifizierten Unterfamilie der CYP1-Gen-Familie. Human-CYP1B1 wurde ursprünglich aus einer mit Dioxin behandelten Keratinocyten-Zelllinie (Sutter et al., 1994) im Rahmen einer Untersuchungsreihe isoliert, um unterschiedliche Expression von Genen infolge von Dioxin-Exposition zu identifizieren. Das Human-CYP1B1-Gen befindet sich auf Chromosom 2p22-21, erstreckt sich über 12 kb und besteht aus drei Exons und zwei Introns (Tang et al., 1996). Die mRNA ist 5,2 kb lag und kodiert für ein Protein aus 543 Aminosäuren (Sutter et al., 1994). Es handelt sich hierbei um das größte bekannte Human-P450-Gen – sowohl hinsichtlich der mRNA-Größe als auch hinsichtlich der Anzahl an Aminosäuren –, und es ist auch strukturell das einfachste. Sowohl Nucleinsäure- als auch Aminosäuresequenz-Analyse zeigen, dass CYP1B1 nur etwa 40 % Homologie mit CYP1A1 und CYP1A2 aufweist. Das geringe Ausmaß an Ähnlichkeit mit bestehenden Mitgliedern der CYP1-Familie führte dazu, dass P450 einer neuen CYP1-Unterfamilie CYP1B zugeordnet wurde, die bis dato als einziges Mitglied CYP1B1 enthält. Hybridisierungsstudien von Human-DNA legen nahe, dass es nur ein Mitglied der CYP1B-Gen-Familie gibt (Sutter et al., 1994). Das CYP1B1-Gen wird durch Liganden des Ah-Rezeptors, die planare aromatische Kohlenwasserstoffe enthalten, transkriptional aktiviert (Sutter et al., 1994; Hakkola et al., 1997), wobei der wirksamste dieser Ah-Rezeptor-Agonisten zur Induktion von Transkription des CYP1B1-Gens Dioxin zu sein scheint (Hakkola et al., 1997).
Orthologe Formen dieses P450 wurden vor kurzem aus einer mit Benzanthracen induzierten Zelllinie isoliert, die aus Mausembryo-Fibroblasten (Savas et al., 1994; Shen et al., 1994) und der Nebennierenrinde adulter Ratten (Bhattacharyya et al., 1995; Walker et al., 1995) stammte. Obwohl ein hoher Grad an Nucleinsäure- und Aminosäuresequenz-Homologie zwischen den Human-, Maus- und Ratten-Formen von CYP1B1 besteht (mehr als 80 %), scheinen auch beträchtliche Speziesunterschiede betreffend die gewebespezifische Expression, Regulierung und metabolische Spezifität von CYP1B1 vorzuliegen (Savas et al., 1994; Sutter et al., 1994; Bhattacharyya et al., 1995; Savas et al., 1997).
Brustkrebs ist das häufigste Frauen betreffende Karzinom und ein Östrogen-abhängiger Tumor. In Hefe (S. cerevisiae) exprimiertes Human-CYP1B1 zeigt hohe spezifische Aktivität gegenüber der 4-Hydroxylierung von 17β-Östradiol (Hayes et al., 1996) und setzt es zu 4-Hydroxyöstradiol um; man geht davon aus, dass Human-CYP1B1 die wirksamste 4-Hydroxylase von 17β-Östradiol ist. Im Gegensatz dazu scheint Maus-CYP1B1 nicht als Östradiol-Hydroxylase zu fungieren (Savas et al., 1997) – ein Indiz für Speziesunterschiede hinsichtlich der metabolischen Fähigkeit von CYP1B1. Liehr und Ricci (1996) zeigten, dass es ein signifikantes Ausmaß an 4-Hydroxylierung von 17β-Östradiol in Brustkrebs-Mikrosomen gibt. Die Forscher stießen auf deutlich höhere 4-Hydroxylierung von 17β-Östradiol in aus Brustkrebs gebildeten Mikrosomen und auf nur sehr niedrige 4-Hydroxylierung in normalem Brustgewebe. Sowohl immunreaktives CYP1B1-Protein (Murray et al., 1997) als auch CYP1B1-mRNA (McKay et al., 1995) wurden in Brustkrebs identifiziert – ein Indiz dafür, dass CYP1B1 eine Hauptform von bei Brustkrebs exprimiertem Cytochrom P450 ist.
Zusammenfassung der Erfindung
Die ersten immunhistochemischen Studien von CYP1B1 von Murray et al. (1997) zeigten verstärkte CYP1B1-Expression in mehreren Arten von Humankarzinom, z.B. Brustkrebs, und erfolgten unter Einsatz eines polyklonalen Antikörpers gegen CYP1B1. Die vorliegende Erfindung betrifft Weiterentwicklungen auf diesem Gebiet, insbesondere zusätzliche Antikörper, die für Human-CYP1B1 spezifisch sind, vor allem monoklonale Antikörper, die unter Einsatz synthetischer Peptide auf der Basis der CYP1B1-Aminosäuresequenz als Immunogene gezüchtet wurden. Die hierin beschriebene Arbeit offenbaren die Verwendung der Antikörper im Bereich der Immun histochemie und bei der Untersuchung der Expression von CYP1B1 durch Immunhistochemie in einer Reihe primärer Humanbrustkrebs-Arten.
Demzufolge stellt die vorliegende Erfindung in einem ersten Aspekt ein Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers bereit, der sich spezifisch an Cytochrom P450 CYP1B1 bindet, wobei das Verfahren das Züchten des Antikörpers unter Verwendung eines Peptids, das aus der Aminosäuresequenz VNQWSVNHDPVKWPN oder PExFDPARFLDKDGy, worin x für D oder N steht und y für L oder F steht, besteht, oder eines antigenen Fragments davon umfasst.
Typischerweise bestehen die antigenen Fragmente innerhalb dieser Peptidsequenzen aus 3 bis 10 Aminosäuren, noch häufiger aus 3 bis 6 Aminosäuren.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers nach Erhalt eines Hybridoms mittels des obigen Verfahrens bereit, wobei das Verfahren das Kultivieren eines den Antikörper produzierenden Hybridoms und das Isolieren des so gebildeten Antikörpers umfasst. Das Verfahren kann den weiteren Schritt des Konjugierens des Antikörpers an eine Effektorgruppe, wie z.B. einen Marker, ein Toxin, einen Wirkstoff oder ein Transportmolekül, vorsehen.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung einen Antikörper bereit, der zur spezifischen Bindung an Cytochrom P450 CYP1B1 fähig ist, worin der Antikörper ein Epitop im Cytochrom P450 CYP1B1-Protein erkennt, das in der Aminosäuresequenz VNQWSVNHDPVKWPN oder PExFDPARFLDKDGy, worin x für D oder N steht und y für L oder F steht, enthalten ist.
Vorzugsweise erkennt der Antikörper ein Epitop mit zwischen 3 und 10 Aminoäsuren aus den Aminosäuresequenzen, noch bevorzugter ein Epitop mit zwischen 3 und 6 Aminosäuren aus den Aminosäuresequenzen.
Bevorzugte Antikörper sind monoklonale Antikörper, die beispielsweise erhältlich sind durch:

(a) Immunisieren eines Tieres mit dem an einen immunogenen Träger konjugierten Peptid;
(b) Töten des Tieres und Fusionieren von Milzzellen, die dem Tier entnommen wurden, mit Myelomzellen, um ein oder mehrere Hybridome zu bilden; und
(c) Screenen der Hybridome auf Antikörper, die zur Bindung des Peptids fähig sind.

Die Antikörper können an einen Effektor konjugiert sein, z.B. einen Marker, ein Toxin, ein Arzneimittel oder Prodrug, ein Enzym oder ein Transportmolekül.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung die obigen Antikörper zur Verwendung in einem medizinischen Behandlungsverfahren bereit.
In einem zusätzlichen Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung dieser Antikörper zur Herstellung eines Medikaments zur Krebsbehandlung bereit.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Peptid bereit, das im Wesentlichen aus der Aminosäuresequenz VNQWSVNHDPVKWPN oder PExFDPARFLDKDGy besteht, worin x für D oder N steht und y für L oder F steht.
In einem zusätzlichen Aspekt stellt die Erfindung ein Testverfahren zur Detektion von Krebszellen bereit, die in einer Probe aus einem Patienten vorhanden sind, wobei das Verfahren das Kontaktieren einer Gewebeprobe aus einem Patienten mit einem der obigen Antikörper und das Nachweisen von Bindung des Antikörpers an CYP1B1-Protein, das in der Probe vorhanden ist, als Abzeichen der Gegenwart von Krebszellen in der Gewebeprobe umfasst.
Beispielsweise erfolgt der Schritt des Nachweisens der Bindung des Antikörpers an CYP1B1-Protein mithilfe eines Antikörper-Einfangtests, eines Doppel-Antikörper-Sandwichtests oder eines Antigen-Einfangtests.
Vorzugsweise dient das Verfahren dazu, die Diagnose oder Prognose von Brustkrebs, Kolorektalkrebs, Prostatakrebs, Leberkrebs oder Ovarialkrebs zu unterstützen.
Verschiedene weitere Aspekte und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ergeben sich für Fachleute auf dem Gebiet aus der vorliegenden Offenbarung. Bestimmte Aspekte und Ausführungsformen der Erfindung werden nun anhand von Beispielen und unter Bezugnahme auf die beigelegten Abbildungen erläutert.
Kurzbeschreibung der Abbildungen
1: Immunoblot von exprimiertem CYP1B1 mit monoklonalem Antikörper (5D3), der Spezifität für CYP1B1 zeigt. Spur 1 – exprimiertes CYP1B1 (10 μg mikrosomales Protein, 0,86 pMol CYP1B1); Spur 2 – exprimiertes CYP1A1 (10 μg mikrosomales Protein, 0,53 pMol CYP1A); Spur 3 – Lymphoblastoidmikrosomen als Vergleich, umfassend nur Vektor (10 μg mikrosomales Protein); und Spur 4 – normale Humanleber-Mikrosomen (10 μg mikrosomales Protein). Molekulargewichtsmarker sind auf der rechten Seite in kDa angegeben.
2: Immunoblot, aus dem die minimale nachweisbare Menge von CYP1B1 unter Einsatz des monoklonalen Antikörpers 5D3 ersichtlich ist. Die Spuren 1 bis 6 zeigen abnehmende Mengen an exprimiertem CYP1B1. Spur 1 – 0,86 pMol CYP1B1; Spur 2 – 0,43 pMol CYP1B1; Spur 3 – 0,21 pMol CYP1B1; Spur 4 – 0,1 pMol CYP1B1; Spur 5 – 0,05 pMol CYP1B1; und Spur 6 – 0,025 pMol CYP1B1. Molekulargewichtsmarker sind auf der rechten Seite in kDa angegeben.
3: Immunoblot von CYP1B1 von aus verschiedenen normalen Humangeweben gebildeten Mikrosomen. Spur 1 – exprimiertes CYP1B1 (10 μg mikrosomales Protein, entspricht 0,86 pMol CYP1B1); Spur 2 – Leber; Spur 3 – Niere; Spur 4 – Lunge; Spur 5 – Pankreas; Spur 6 – Nebennierenrinde; Spur 7 – Gehirn (Medulla); Spur 8 – Magen; Spur 9 – Jejunum; Spur 10 – Kolon; Spur 11 – Brust; und Spur 12 – Ovarien (es wurden 30 μg mikrosomales Protein pro Spur von normalem Humangewebe geladen). Molekulargewichtsmarker sind auf der rechten Seite in kDa angegeben.
4: Immunhistochemischer Nachweis von CYP1B1 in Brustkrebs unter Einsatz des monoklonalen Antikörpers 5D3. A – Lokalisierung von CYP1B1 in einem invasiven duktalen Karzinom der Stufe 3. Es besteht starke Immunreaktivität für CYP1B1 in Tumorzellen. B – Lokalisierung von CYP1B1 in einem invasiven lobulären Karzinom, die starke Immunreaktivität in Brustkrebszellen zeigt. C – Keine Immunreaktivität wurde in einem invasiven duktalen Karzinom der Stufe 3 beobachtet, als der primäre monoklonale CYP1B1-Antikörper im immunhistochemischen Verfahren durch TBS ersetzt wird. Der Maßstabsbalken stellt 60 μm dar.
Ausführliche Beschreibung
Antikörper
Auf der Grundlage der vorliegenden Beschreibung können Fachleute auf dem Gebiet unter Anwendung von Standardtechniken weitere Antikörper erhalten, die zur spezifischen Bindung von CYP1B1 in der Lage sind. Verfahren zur Herstellung von Antikörpern umfassen das Immunisieren eines Säugetiers (z.B. einer Maus, einer Ratte, eines Kaninchens, eines Pferds, einer Ziege, eines Schafs oder eines Affen) mit dem Protein oder einem Fragment davon. Antikörper können aus immunisierten Tieren unter Anwendung einer Vielzahl an auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Techniken erhalten und gescreent werden, vorzugsweise mithilfe der Bindung des Antikörpers an das Antigen von Interesse. Beispielsweise eignen sich Western-Blotting-Techniken oder Immunfällung [Armitage et al., Nature 357, 80–82 (1992)]. Die Isolierung aus Antikörpern und/oder Antikörper-produzierenden Zellen aus einem Tier kann den Schritt des Tötens des Tiers umfassen.
Als Alternative bzw. Ergänzung zur Immunisierung eines Säugetiers mit einem Peptid (siehe Beispiele) kann ein für ein Protein spezifischer Antikörper aus einer rekombinant produzierten Bibliothek exprimierter variabler Immunglobulin-Domänen erhal ten werden, z.B. unter Verwendung von λ-Bakteriophagen oder filamentösen Bakteriophagen, die funktionelle Immunglobulin-bindende Domänen auf ihren Oberflächen aufweisen; siehe etwa WO 92/01047. Die Bibliothek kann naiv sein, d.h. bestehend aus Sequenzen, die aus einem Organismus stammen, der mit keinem der Proteine (oder Fragmente) immunisiert wurde, oder eine Bibliothek sein, die unter Einsatz von Sequenzen gebildet wird, die aus einem Organismus stammen, der dem Antigen von Interesse ausgesetzt wurde.
In der vorliegenden Anmeldung bezieht sich der Ausdruck „Antikörper" auf jede beliebige Bindungssubstanz mit einer Bindungsdomäne mit der erforderlichen Spezifität, d.h. mit der Eigenschaft, sich spezifisch an CYP1B1 zu binden, wobei vorzugsweise im Wesentlichen keine Bindung an verwandte Proteine, wie z.B. CYP1A1 und CYP1A2, die etwa 40 % Homologie mit CYP1B1 aufweisen, oder an nicht verwandte Proteine erfolgt. Der Ausdruck „Antikörper" umfasst auch Antikörperfragmente, Derivate, funktionelle Äquivalente und Homologe von Antikörpern, einschließlich synthetischer Moleküle und Moleküle, deren Form jene eines Antikörpers imitiert, wodurch die Bindung an Antigen oder Epitop ermöglicht wird. Vorzugsweise binden sich die Antikörper an ein Epitop innerhalb der Aminosäuresequenzen von Peptid D oder E, wobei derartige Epitope aus zwischen 3 und 10, noch bevorzugter aus zwischen 3 und 6, Aminosäuren bestehen. Bevorzugte Antikörper binden sich mit einer Bindungsaffinität von mehr als 10^–6, noch bevorzugter von mehr als 10⁸, Mol^–1 an CYP1B1 (bestimmt durch Scatchard-Analyse; siehe: Antibodies, A Laboratory Manual, Harlow und Lane (Hrsg.), Cold Spring Harbor, 1988).
Beispiele für Antikörperfragmente, die zur Bindung eines Antigens oder eines anderen Bindungspartners in der Lage sind, sind das Fab-Fragment, bestehend aus den VL-, VH-, C1- und CH1-Domänen; das Fd-Fragment, bestehend aus den VL- und VH-Domänen eines einzelnen Arms eines Antikörpers; das dAb-Fragment, bestehend aus einer VH-Domäne; isolierte CDR-Regionen und F(ab')₂-Fragmente, ein zweiwertiges Fragment, das zwei Fab-Fragmente umfasst, die über eine Disulfidbrücke in der Hinge-Region miteinander verbunden sind. Einzelkettige Fv-Fragmente sind ebenfalls möglich.
Ein einen monoklonalen Antikörper der Erfindung produzierendes Hybridom kann genetischer Mutation oder anderen Veränderungen unterzogen werden. Es ist für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig, dass ein monoklonaler Antikörper DNA-Rekombinationstechniken unterzogen werden kann, um andere Antikörper oder chimäre Moleküle zu produzieren, die die Spezifität des ursprünglichen Antikörpers beibehalten. Solche Techniken können die Verwendung von DNA umfassen, die für die variable Immunglobulinregion oder die Komplementarität bestimmenden Regionen (CDR) eines Antikörpers gegen die Konstantregionen – oder Konstantregionen plus Rahmenregionen – eines unterschiedlichen Immunglobulins kodiert. Siehe beispielsweise EP 0.184.187 , GB 2.188.638 oder EP 0.239.400 A . Das Klonieren und die Expression chimärer Antikörper sind in EP 0.120.694 A und EP 0.125.023 A beschrieben.
In einer Ausführungsform sind die Antikörper der Erfindung humanisiert. Humanisierte Formen von Nicht-Human- (z.B. Maus-) Antikörpern sind chimäre Immunglobuline, Immunglobulinketten oder Fragmente davon (z.B. Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ oder andere Antigen-bindende Subsequenzen von Antikörpern'), die minimale Sequenzen aus Nicht-Human-Immunglobulin enthalten. Humanisierte Antikörper sind z.B. Human-Immunglobuline (Rezipientenantikörper), worin Reste aus einer CDR des Rezipienten durch Reste aus einer CDR einer nichthumanen Spezies (Donorantikörper), wie z.B. einer Maus, einer Ratte oder eines Kaninchens, mit der gewünschten Spezifität, Affinität und Kapazität ersetzt sind. In einigen Fällen sind Fv-Rahmenreste des Human-Immunglobulins durch entsprechende nichthumane Reste ersetzt. Humanisierte Antikörper können auch Reste umfassen, die sich weder im Rezipientenantikörper noch in der importierten CDR oder den Rahmensequenzen befinden. Im Allgemeinen umfasst der humanisierte Antikörper im Wesentlichen die Gesamtheit zumindest einer – und typischerweise zweier – variabler Domänen, worin alle oder im Wesentlichen alle der CDR-Regionen mit jenen eines nichthumanen Immunglobulins entsprechen; alle oder im Wesentlichen alle der FR-Regionen sind jene aus einer Human-Immunglobulin-Konsenssequenz. Der humanisierte Antikörper umfasst idealerweise auch zumindest einen Teil einer Immunglobulin-Konstantregion (Fc), typischerweise jenen aus einem Human-Immunglobulin; siehe z.B. Jones et al., Nature, 321, 522–525 (1986); Riechman et al., Nature 332, 323–329 (1988); und Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593–596 (1992).
Verfahren zur Humanisierung nichthumaner Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt. Im Allgemeinen besitzt ein humanisierter Antikörper eine oder mehrere Aminosäurereste, die aus einer nichthumanen Quelle stammen und darin eingebunden sind. Diese nichthumanen Aminosäurereste werden häufig als „Import"-Reste bezeichnet, die typischerweise aus einer variablen „Import"-Domäne entnommen sind. Die Humanisierung kann im Wesentlichen gemäß dem Verfahren durchgeführt werden, das in Jones et al., Nature 321, 522–525 (1986); Riechmann et al., Nature 332, 323–327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534–1536 (1988), geoffenbart ist, indem Nagetier-CDR oder CDR-Sequenzen für die entsprechenden Sequenzen eines Human-Antikörpers substituiert werden. Demzufolge sind solche „humanisierte" Antikörper chimäre Antikörper (US-Patent 4.816.567), in denen wesentlich weniger als eine intakte variable Humandomäne durch die entsprechende Sequenz aus einer nichthumanen Spezies substituiert wurde. In der Praxis sind humanisierte Antikörper typischerweise Human-Antikörper, in denen einige CDR-Reste und möglicherweise einige FR-Reste durch Reste aus analogen Stellen in Nagetier-Antikörpern substituiert sind.
Bispezifische Antikörper sind monoklonale, vorzugsweise Human- oder humanisierte, Antikörper, die Bindungsspezifitäten für zumindest zwei unterschiedliche Antigene aufweisen. Im vorliegenden Fall ist eine der Bindungsspezifitäten für das CYP1B1, die andere für ein beliebiges anderes Antigen. Verfahren zur Herstellung bispezifischer Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Traditionellerweise beruht die rekombinante Produktion bispezifischer Antikörper auf der Co-Expression zweier Immunglobulin-Schwerketten-Leichtketten-Paare, wobei die zwei Schwerketten unterschiedliche Spezifitäten besitzen; siehe Milstein und Cuello, Nature 305, 537–539 (1983). Aufgrund der zufälligen Anordnung von Immunglobulin-Schwer- und Leichtketten produzieren diese Hybridome (Quadrome) ein potenzielles Gemisch von zehn unterschiedlichen Antikörpermolekülen, von denen nur eines die korrekte bi spezifische Struktur aufweist. Die Reinigung des korrekten Moleküls erfolgt typischerweise durch Affinitätschromatographie-Schritte.
Hybridome, die Antikörper mit gewünschten Bindungseigenschaften produzieren können, werden hierin ebenso bereitgestellt wie Wirtszellen eukaryotischer oder prokaryotischer Beschaffenheit, die für Antikörper (einschließlich Antikörperfragmente) kodierende Nucleincäure enthalten und zu deren Expression fähig sind. Die Erfindung betrifft überdies Verfahren zur Produktion der Antikörper, umfassend das Züchten einer Zelle, die zur Produktion des Antikörpers unter Bedingungen fähig ist, unter denen der Antikörper produziert und vorzugsweise sekretiert wird.
Die Antikörper der Erfindung können an eine Effektorgruppe gekoppelt bzw. konjugiert werden, z.B. an einen Marker, ein Toxin, ein Arzneimittel oder ein Transportmolekül, wofür nach dem Stand der Technik bekannte Techniken zum Einsatz kommen. Für diagnostische Verwendungszwecke werden Antikörper typischerweise mit einem Marker verbunden. Die Reaktivitäten von Antikörpern bezüglich einer Probe können auf geeignete Weise festgestellt werden. Das Markieren mit individuellen Reportermolekülen ist eine Möglichkeit. Die Reportermoleküle können direkt oder indirekt detektierbare – und vorzugsweise messbare – Signale erzeugen. Die Anknüpfung von Reportermolekülen kann direkt oder indirekt, kovalent (z.B. über eine Peptidbindung) oder nichtkovalent erfolgen. Die Verknüpfung über eine Peptidbindung kann die Folge der rekombinanten Expression einer Gen-Fusion sein, die für Antikörper und Reportermolekül kodiert.
Eine bevorzugte Möglichkeit ist die kovalente Bindung jedes Antikörpers mit einem individuellen Fluorochrom-, Phosphor- oder Laserfarbstoff mit spektral isolierten Absorptions- oder Emissionseigenschaften. Geeignete Fluorochrome sind Fluorescein, Rhodamin, Phycoerythrin und Texasrot. Zweckmäßige chromogene Farbstoffe umfassen beispielsweise Diaminobenzidin.
Andere Reporter sind makromolekulare kolloidale Partikel oder Teilchenmaterial, wie z.B. Latexperlen, die gefärbt, magnetisch oder paramagnetisch sind, sowie biolo gisch oder chemisch aktive Mittel, die direkt oder indirekt detektierbare Signale erzeugen können, die visuell zu beobachten, elektrisch zu detektieren oder auf andere Weise aufzuzeichnen sind. Diese Moleküle können Enzyme sein, die Reaktionen katalysieren, die Farben entwickeln oder verändern bzw. Veränderungen beispielsweise der elektrischen Eigenschaften bewirken. Sie können molekular anregbar sein, so dass Elektronenübergänge zwischen Energiezuständen zu charakteristischen Spektralabsorptionen oder -emissionen führen. Sie können chemische Strukturen enthalten, die zusammen mit Biosensoren verwendet werden. Biotin/Avidin oder Biotin/Streptavidin und alkalische-Phosphatase-Detektionssysteme kommen in Frage.
Tests
Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart oder Menge eines Markers, wie z.B. CYP1B1, in einer Probe aus einem Individuum sind auf dem Gebiet allgemein bekannt und können von Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung problemlos so angepasst werden, dass die hierin geoffenbarten Antikörper als Bindungs- und/oder Entwickler verwendet werden, z.B. zur Unterstützung der Bestimmung der Gegenwart oder Menge an CYP1B1 in einem Test. Die Ergebnisse solcher Tests können ihrerseits einen Mediziner in die Lage versehen, die Frage zu klären, ob ein Patient an einem Leiden erkrankt ist oder erkranken könnte, das mit CYP1B1-Expression assoziiert ist (entweder Über- oder Unterexpression), z.B. Krebs. Die Testergebnisse erlauben es dem Arzt, die Behandlung des Leidens zu optimieren, indem zweckmäßige therapeutische und/oder prophylaktische Behandlungsmöglichkeiten bereitgestellt werden und die Feinabstimmung von Behandlungsverfahren ermöglicht wird, um genau jene Patienten zu identifizieren, die wahrscheinlich am meisten von ihnen profitieren.
In bevorzugten Ausführungsformen dient die Gegenwart oder Menge an CYP1B1 zur Krebsdiagnose, insbesondere von Brust-, Prostata-, Kolorektal-, Leber- oder Ovarialkrebs.
Die Verfahren sehen typischerweise die Verwendung einer biologischen Probe aus einem Patienten vor, z.B. Blut, Serum, Gewebe, Harn oder andere geeignete Körperflüssigkeiten. Eine bevorzugte Patientenprobe ist Gewebe ausgewählt aus Blase, Gehirn, Brust, Kolon, Bindegewebe, Niere, Lunge, Lymphknoten, Speiseröhre, Ovarien, Haut, Magen, Hoden und Uterus.
Die Antikörper können als Bindemittel verwendet werden, da sie Bindungsstellen aufweisen, die zur spezifischen Bindung an CYP1B1 fähig sind (ihnen wird gegenüber anderen Molekülen der Vorzug gegeben). In einigen Testformaten sind die Bindemittel auf festem Träger immobilisiert, z.B. an definierten, räumlich getrennten Positionen, damit ihre Manipulation während des Tests vereinfacht wird. Die Probe wird im Allgemeinen mit dem bzw. den Bindemittel(n) unter zweckmäßigen Bedingungen kontaktiert, die die Bindung des Analyten in der Probe an das bzw. die Bindemittel erlauben. Der Anteil an Besetzung der Bindungsstellen des bzw. der Bindemittel(s) kann dann entweder durch direktes oder durch indirektes Markieren des Analyten oder durch Verwendung eines bzw. mehrerer Entwickler(s) bestimmt werden, um Indikatoren für die Gegenwart oder Menge des Analyten in der Probe zu erhalten.
In anderen Ausführungsformen können die Antikörper der Erfindung als Entwickler zur Detektion von CYP1B1 in biologischen Proben durch direktes oder indirektes Markieren der Antikörper verwendet werden, z.B. mit radioaktiven, fluoreszierenden oder Enzymmarkern wie etwa Meerrettich-Peroxidase, so dass sie unter Anwendung auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Techniken detektiert werden können. Direkt markierte Entwickler besitzen einen Marker, der mit dem Mittel assoziiert oder daran gebunden ist. Indirekt markierte Entwickler können in der Lage sein, sich an eine markierte Spezies zu binden (z.B. ein markierter Antikörper, der zur Bindung an den Entwickler fähig ist), oder sie können auf eine andere Spezies einwirken, um ein detektierbares Ergebnis zu produzieren. Somit können radioaktive Marker unter Verwendung eines Szintillationszählers oder anderer Strahlungszählvorrichtungen, Fluoreszenzmarker unter Verwendung eines Lasers und konfokalen Mikroskops und Enzymmarker mittels der Wirkung eines Enzymmarkers auf ein Substrat, typischerweise zur Herbeiführung einer Farbänderung, detektiert werden. In weiteren Ausfüh rungsformen ist der Entwickler markiert, um seine Detektion zu ermöglichen, z.B. gebunden an eine Nucleotidsequenz, die in einer PCR amplifiziert werden kann, um den Analyten zu detektieren. Andere Marker sind Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und unten angeführt. Der bzw. die Entwickler kann bzw. können in einem kompetitiven Verfahren eingesetzt werden, in dem der Entwickler mit dem Analyten um besetzte Bindungsstellen des Bindemittels konkurriert; es ist auch die Verwendung in einem nichtkompetitiven Verfahren möglich, in dem der markierte Entwickler Analyt bindet, der über das Bindemittel oder an die besetzten Bindungsstellen gebunden ist. Beide Verfahren liefern Hinweise für die Anzahl der vom Analyten besetzten Bindungsstellen und somit auch für die Konzentration des Analyten in der Probe, z.B. durch Vergleich mit Standards aus Proben, die bekannte Konzentrationen des Analyten enthalten. In alternativen Ausführungsformen kann der Analyt markiert werden, bevor er an den das Bindemittel umfassenden Träger gebunden wird.
Pharmazeutische Verwendungen
Die Antikörper der Erfindung können zu Zusammensetzungen für diagnostische oder therapeutische Zwecke formuliert werden. In diesem Fall sind die Antikörper in isolierter und/oder gereinigter Form bereitgestellt und in der Zusammensetzung als zumindest etwa 90 %, noch bevorzugter zumindest etwa 95 %, noch bevorzugter zumindest etwa 98 %, der Wirkstoffe enthalten. Eine solche Zusammensetzung kann allerdings inerte Trägermaterialien und andere pharmazeutisch und physiologisch annehmbare Exzipienten enthalten. Wie unten angeführt, kann eine Zusammensetzung der Erfindung zusätzlich zum offenbarten Antikörper eine oder mehrere Moleküle von therapeutischem Nutzen enthalten, z.B. ein Antitumor-Mittel. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Antikörper mit Effektoren verbunden, die Antitumor-Arzneimittel oder Prodrugs sind, um den Effektor auf CYP1B1 exprimierende Zellen abzuzielen.
Ein Antikörper der Erfindung, der an ein Individuum zu verabreichen ist, wird vorzugsweise in einer „prophylaktisch wirksamen Menge" oder einer „therapeutisch wirk samen Menge" verabreicht (je nach konkreter Gabe, obwohl man davon ausgehen kann, dass Prophylaxe als Therapie angesehen werden kann), wobei diese Menge ausreicht, um dem Individuum Vorteile zu verschaffen. Die tatsächliche verabreichte Menge sowie die Rate und der zeitliche Verlauf der Verabreichung hängen von der Beschaffenheit und dem Schweregrad des behandelten Leidens ab. Die Verschreibung des Medikaments, z.B. Entscheidungen zur Dosierung usw., liegen im Verantwortungsbereich und Ermessensspielraum von Allgemeinmedizinern und anderen Ärzten.
Eine Zusammensetzung kann entweder alleine oder in Kombination mit anderen Behandlungen entweder gleichzeitig oder hintereinander (hängt vom konkreten zu behandelnden Leiden ab) verabreicht werden.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die der vorliegenden Erfindung entsprechen und hierin zu verwenden sind, können zusätzlich zum Wirkstoff einen pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten, Träger, Puffer, Stabilisator oder andere Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Materialien enthalten. Solche Materialien sollten nichttoxisch sein und die Wirksamkeit des Wirkstoffs nicht beeinträchtigen. Die genaue Beschaffenheit des Trägers oder ähnlicher Materialien hängt vom Verabreichungsweg ab – es kommen die orale Verabreichung oder Injektion in Frage, z.B. kutan, subkutan oder intravenös.
Pharmazeutische Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung können in Form von Tabletten, Kapseln, Pulvern oder Flüssigkeiten vorliegen. Eine Tablette kann einen festen Träger, wie z.B. Gelatine, oder ein Adjuvans enthalten. Flüssige pharmazeutische Zusammensetzungen enthalten im Allgemeinen einen flüssigen Träger wie z.B. Wasser, Petroleum, tierische oder pflanzliche Öle, Mineralöl oder synthetisches Öl. Physiologische Salzlösung, Dextrose oder andere Saccharidlösungen oder Glykole wie etwa Ethylenglykol, Propylenglykol oder Polyethylenglykol können ebenfalls enthalten sein.
Für die intravenöse, kutane oder subkutane Injektion bzw. Injektion an der betroffenen Stelle liegt der Wirkstoff in Form einer parenteral annehmbaren wässrigen Lösung vor, die pyrogenfrei ist und einen geeigneten pH-Wert sowie zweckmäßige Isotonie und Stabilität aufweist. Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung können problemlos geeignete Lösungen z.B. unter Verwendung isotonischer Vehikel wie z.B. Natriumchloridlösung, Ringerlösung oder Ringerlaktat bilden. Konservierungsstoffe, Stabilisatoren, Puffer, Antioxidanzien und/oder andere Additive sind gegebenenfalls ebenfalls vorhanden.
Beispiele für die oben erwähnten Techniken und Arbeitsvorschriften finden sich in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Aufl., Osol, A. (Hrsg.), 1980.
Das Mittel kann lokalisiert an einer Tumorstelle oder einer anderen gewünschten Stelle verabreicht oder solcherart zugeführt werden, dass es auf Tumor- oder andere Zellen abzielt.
Die Antikörper der Erfindung können dazu dienen, die Therapie auf Zellen oder Bereiche des Körpers abzuzielen, in denen CYP1B1 exprimiert wird. Mithilfe von Therapie-Targeting kann der Wirkstoff – entweder Arzneimittel oder Prodrugs – auf spezifischere Weise Zellen zugeführt werden, die CYP1B1 exprimieren oder präsentieren. Das Targeting kann aus vielen unterschiedlichen Gründen wünschenswert sein, z.B. wenn das Mittel unannehmbar toxisch ist, wenn es sonst eine zu hohe Dosierung erfordern würde oder wenn es sonst nicht in die Zielzellen eindringen könnte. Das Mittel kann in Vorläuferform verabreicht werden; dies dient der Umwandlung in die aktive Form durch ein Aktivierungsmittel, das in den zu behandelnden Zellen produziert wird oder auf diese abzielt. Diese Vorgangsweise wird manchmal als ADEPT bezeichnet und umfasst das Targeting des Aktivierungsmittels auf die Zellen durch Konjugation an einen zellspezifischen Antikörper der Erfindung.
Experimenteller Teil
P450-Sequenzabgleich, Peptidauswahl und Immunisierung
Auf der Grundlage einer Kombination struktureller Homologiemodellierung und von Sequenzabgleichen der Human-CYP1B1-Aminosäuresequenz mit den Human-CYP1A1- und CYP1A2-Aminosäuresequenzen wurde prognostiziert, dass ein 148 Aminosäuren umfassendes Segment im C-terminalen Drittel des CYP1B1-Proteins Regionen von Aminosäuren enthält, die auf dem äußeren Teil des CYP1B1-Proteins angeordnet wären. Peptide mit entweder 14 oder 15 Aminosäureresten, die diesem Segment des CYP1B1-Proteins entsprechen, wurden an der University of Aberdeen Protein Facility synthetisiert. Die individuellen Peptidsequenzen und die Aminosäureposition auf dem CYP1B1-Protein sind in Tabelle 1 angeführt. Die rechte Spalte gibt die Peptidfragmente an, die eine Immunreaktion hervorriefen (Peptide D und E). Tabelle 1 Peptidsequenzen und die Aminosäureposition auf dem CYP1B1-Protein von zur Immunisierung verwendeten Peptiden
Individuelle Peptide wurden dann unter Verwendung von Glutaraldehyd an Eialbumin konjugiert, wie dies bereits beschrieben wurde (Duncan et al., 1992). Individuelle Peptidkonjugate, vermischt mit inkomplettem Freundschen Adjuvans, wurden intraperitoneal in BALB/c-Mäuse injiziert, die mit dem gleichen Peptid 2 bis 4 Wochen nach der ersten Immunisierung erneut immunisiert wurden. Das Vorliegen einer Immunantwort auf jedes Peptidkonjugat wurde durch Untersuchen von Serum (10 Tage nach der zweiten Immunisierung erhalten) aus jeder Maus bestimmt; dies diente der Erkennung von exprimiertem CYP1B1 durch Immunoblotting. Die Mäuse, deren Seren die beste Erkennung von CYP1B1 lieferten, erhielten dann eine letzte Immunisierung mit dem geeigneten Peptidkonjugat und wurden zur Produktion monoklonaler Antikörper herangezogen.
Monoklonale Antikörper gegen CYP1B1
Vier Tage nach der letzten Immunisierung mit Peptidkonjugat wurden die Mäuse getötet, ihre Milz isoliert und Milzzellen mit Maus-Myelomzellen (Ag8.653) fusioniert. Die resultierenden Hybridomklone wurden anschließend durch ELISA unter Einsatz des relevanten Peptids, konjugiert mit Rinderserumalbumin (BSA), auf Antikörperproduktion gescreent. Die BSA-Konjugate wurden durch Inkubation über Nacht bei 4 °C in 50 mM Natriumcarbonat/Bicarbonat-Puffer, pH 9,6, an eine ELISA-Platte gebunden und der ELISA gemäß bekannten Verfahren durchgeführt (Duncan et al., 1992; Murray et al., 1998b). Hybridomklone, die sich im ELISA als stark positiv herausstellten, wurden zwei Mal subkloniert und durch Immunoblotting mit exprimiertem CYP1B1, exprimiertem CYP1A1, Vergleichsmikrosomen und Humanleber-Mikrosomen näher untersucht. Die monoklonalen Antikörper wurden unter Einsatz eines Isostrip-Kits (Roche Diagnostics, Lewes, Sussex, UK) isotypisiert; dies erfolgte gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Gewebe
Proben von normalem Gewebe (Leber, Niere, Lunge, Pankreas, Nebennierenrinde, Gehirn, Magen, Jejunum, Kolon, Brust und Ovarien) wurden aus frischen, nichtfixier ten Gewebeproben erhalten, die dem Department of Pathology an der University of Aberdeen zu Diagnosezwecken zur Verfügung gestellt worden waren. Die Gewebeproben wurden in flüssigem Stickstoff gefroren und vor der Bildung von Mikrosomen bei –75 °C gelagert. Proben von primärem Brustkrebs (n = 61) stammten aus Brustgewebeproben, die dem Department of Pathology an der University of Aberdeen zu Diagnosezwecken zur Verfügung gestellt worden waren. Alle Brustgewebeproben stammten aus Nadelbiopsien fühlbarer Brustknoten, die als diagnostischer Schritt vor der definitiven Behandlung durchgeführt wurden. Die Kernbiopsien wurden in 10 % neutralem gepuffertem Formalien bei Raumtemperatur fixiert und dann routinemäßig in Wachs eingebettet.

Die Diagnose von Brustkrebs erfolgte mit hämatoxylin- und eosingefärbten Schnitten unter Anwendung histopathologischer Kriterien. Die Tumoren wurden gemäß den von Elston und Ellis (1991) entwickelten Kriterien klassifiziert und der Östrogen-Rezeptorstatus der Brustkarzinome durch Immunhistochemie für Östrogen-Rezeptorprotein bewertet; siehe King et al., 1997. Der Lymphknotenstatus wurde anhand nachfolgender Achsellymphknoten-Proben bewertet, die der histopathologischen Untersuchung vorgelegt wurden. Die klinisch-pathologischen Eigenschaften der Brustkarzinome sind aus Tabelle 2 ersichtlich. Tabelle 2 Klinisch-pathologische Eigenschaften von Brustkrebs

Alter (Mittelwert und Bereich)	52,3 Jahre (34–76)
Histologischer Typ
Invasives duktales Karzinom	52 (85,2 %)
Invasives lobuläres Karzinom	8 (13,1 %)
Tubulo-lobuläres Karzinom	1 (1,7 %)
Klassifikation von Brustkrebs
Stufe 1	10 (16,4 %)
Stufe 2	27 (44,3 %)
Stufe 3	24 (39,3 %)
Lymphknotenstatus
negativ (keine Metastasen)	34 (55,7 %)
positiv (Gegenwart von Metastasen)	22 (36,1 %)
nicht bestimmt	5 (8,2 %)
Östrogenrezeptorstatus
negativ	25 (41,0 %)
positiv	34 (55,7 %)
nicht bestimmt	2 (3,3 %)

Exprimiertes CYP1A1 und CYP1A1
Mikrosomen aus Human-Lymphoblastoidzellen, die exprimiertes Human-CYP1B1 oder exprimiertes Human-CYP1A1 enthielten, oder Vergleichs-Lymphoblastoidzellen, die nur Vektor enthielten, stammten von der Gentest Corp., Woburn, MA, USA.
Herstellung von Mikrosomen
Gefrorene Gewebeproben wurden auf Eis in 0,01 M Tris-HCl, pH 7,4, umfassend 1,15 % KCl, aufgetaut. Die aufgetauten Gewebeproben wurden aus Bindegewebe und Fett geschnitten, mit einem Skalpell fein zerkleinert und dann in 0,91 M Tris-HCl mit 0,25 M Saccharose und 15 % Glycerin unter Verwendung eines Polytron PT3000-Homogenisators (Kinematica AG, Schweiz) homogenisiert. Die Homogenate wurden anschließend 20 Minuten lang bei 15.000 g und 4 °C unter Verwendung einer Centrikon T-124-Zentrifuge (Kontron Instruments, Cumbernauld, UK) zentrifugiert. Die resultierenden Überstände wurden danach bei 180.000 g (44.000 U/min) 1 Stunde lang bei 4 °C unter Verwendung einer Centrikon T-1160-Zentrifuge (Kontron Instruments) zentrifugiert. Das nach dem Zentrifugieren erhaltene Pellet wurde in 0,1 M Tris-HCl, umfassend 15 % Glycerin und 1 mM EDTA (Sigma-Aldrich Co., Poole, Dorset, UK), resuspendiert und erneut bei 180.000 g (44.000 U/min) 1 Stunde lang bei 4 °C zentrifugiert. Das resultierende mikrosomale Pellet wurde in 0,1 M Tris-HCl, umfassend 15 % Glycerin und 1 mM EDTA, resuspendiert, bevor die mikrosomalen Proben vor ihrer Verwendung bei –75 °C gelagert wurden. Die Proteinkonzentration jeder Mikrosomenprobe wurde gemäß dem Bradford-Verfahren (Bradford, 1976) ermittelt. Rinderserumalbumin (Sigma-Aldrich) wurde als Proteinstandard herangezogen.
Immunoblotting
Proben mikrosomaler Proteine wurden bei konstantem Strom in einem 10 % Polyacrylamidgel unter Verwendung einer vertikalen Hoefer SE600 Gel-Elektrophorese-Vorrichtung (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, Bucks, UK) elektrophore tisch getrennt und dann bei konstantem Strom 18 Stunden lang auf Nitrocellulose (Hybond ECL, Amersham Pharmacia Biotech) mittels Elektroblotting unter Verwendung eines Hoefer TE42 Blotting-Systems (Amersham Pharmacia Biotech) übertragen. Nach dem elektrophoretischen Transfer wurden nichtspezifische Proteinbindungsstellen durch Inkubation der Nitrocellulose-Membran 60 Minuten lang bei Raumtemperatur in Waschpuffer, bestehend aus 2 % fettfreier Milch (Marvel, Premier Beverages, Stafford, UK) in 10 mM Phosphat-gepufferter Salzlösung mit 0,05 % Tween 20 (Sigma), blockiert. Die Nitrocelluluse wurde anschließend nacheinander mit Maus-Immunserum (1/250) oder monoklonalem CYP1B1-Antikörper (1/100) und Ziegen-Anti-Maus-Immunglobulin, konjugiert an Meerrettich-Peroxidase (1/2000; Bio-Rad, Hemel Hempstead, UK), inkubiert. Nach der Inkubation mit jedem Antikörper wurde die Membran 5 Mal jeweils 10 Minuten lang mit Waschpuffer gewaschen; nach der Entfernung von ungebundenem sekundärem Antikörper wurde die Membran in 10 mM Phosphat-gepufferter Salzlösung 5 mal jeweils 10 Minuten lang gewaschen. Meerrettich-Peroxidase wurde dann mittels einer Weiterentwicklung eines bereits beschriebenen (McKay et al., 1995; Murray et al., 1997) Chemolumineszenz-Verfahrens (ECL plus, Amersham Pharmacia Biotech) nachgewiesen. Zusammenfassend gesagt wurde die Nitrocellulose-Membran in einer Lösung, die aus 4 ml Detektionsreagens 1 (Lumigen PS-3, Amersham Pharmacia Biotech) und 100 μl Detektionslösung 2 (Luminol PS-3, Amersham Pharmacia Biotech) bestand, 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, trocken getupft, in eine durchsichtige Kunststofffolie eingewickelt und dann Röntgenfilm (Amersham Pharmacia Biotech) damit belichtet.
Immunhistochemie
Die immunhistochemische Detektion von CYP1B1 erfolgte unter Anwendung eines katalysierten Signalverstärkungsverfahrens (King et al., 1997). In dieser Studie verwendeten die Erfinder Fluoresceintyramid und nichtbiotinyliertes Tyramid, das in der früheren Studie der Anmelder zum Einsatz kam (King et al., 1997), um mögliche Interferenzen aufgrund von endogenem Biotin zu vermeiden. Schnitte mit einer Dicke von 4 μm wurden auf mit Aminoethylpropoxysilan beschichtete Objektträger geschnitten und dann in Xylol entwachst, in 100 % Ethanol und 95 % Ethanol rehydrati siert und in 0,05 M Tris-HCl, pH 7,6, umfassend 150 mM NaCl (TBS), gewaschen. Endogene Peroxidase wurde unter Verwendung einer Lösung von 90 ml Methanol und 3 ml Wasserstoffperoxid gehemmt. In einigen Experimenten erfolgte die Antigen-Gewinnung durch Mikrowellenbehandlung der Schnitte in 0,01 M Citratpuffer, pH 6,0, 20 Minuten lang in Mikrowellen (Proline^TM, Proline, UK), betrieben bei voller Leistung (800 W), während in anderen Versuchen keine Antigen-Gewinnung stattfand. Nach dem Schritt der Antigen-Gewinnung wurden die Schnitte auf Raumtemperatur abgekühlt und dann der primäre monoklonale Anti-CYP1B1-Antikörper aufgebracht.
Der primäre Antikörper wurde als Gewebekulturüberstand in verschiedenen Verdünnungen (unverdünnt bis 1/160) 60 Minuten lang bei Raumtemperatur aufgebracht. Nach der Inkubation in primärem Antikörper wurden die Schnitte in TBS 3 Mal nacheinander jeweils 5 Minuten lang gewaschen, bevor an Peroxidase konjugiertes Kaninchen-Anti-Maus-Immunglobulin (1/100 in TBS mit 4 % normalem Humanserum; Dako, High Wycombe, UK) 30 Minuten lang bei Raumtemperatur aufgebracht wurde. Die Schnitte wurden anschließend in TBS und TBS mit 0,05 % Tween 20 (TNT-Puffer) gewaschen. Die Schnitte wurden in TNT-Puffer weitergewaschen und Fluoresceintyramid (NEN, Hounslow, Middlesex, UK) 10 Minuten lang bei Raumtemperatur aufgebracht. Die Schnitte wurden in TNT-Puffer weitergewaschen, gefolgt vom Aufbringen von monoklonalem Maus-Anti-Fluorescein (1/20, Dako) 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Nach weiterem Waschen in TNT-Puffer wurde an Peroxidase konjugiertes Kaninchen-Anti-Maus-Immunglobulin (1/100 in TBS, umfassend 4 % normales Humanserum) 30 Minuten lang bei Raumtemperatur aufgebracht. Nach dem Waschen in TBS wurden Stellen gebundener Peroxidase unter Verwendung einer Lösung von Diaminobenzidin und Wasserstoffperoxid (Liquid DAB plus, Dako) kolorimetrisch angezeigt. Nach dem Inkubieren der Schnitte 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in Peroxidase-Substrat-Lösung wurde die Reaktion durch Waschen der Objektträger in kaltem Leitungswasser abgebrochen und das Enzymreaktionsprodukt mithilfe von 0,5 % Kupfersulfat intensiviert. Die Objektträger wurden danach in kaltem Leitungswasser gewaschen, mit Hämatoxylin gegengefärbt, in Alkohol dehydratisiert, in Xylol geklärt und in einem synthetischen Montagemedium montiert (DPX, BDH, Poole, Dorset, UK). Die Schnitte wurden mittels Hellfeld-Lichtmikroskopie durch zwei unabhängige Beobachter untersucht, um die Gegenwart oder die Abwesenheit von Immunfärbung sowie ihre Verteilung, Lokalisierung und Intensität festzustellen. Ein Tumor galt als positiv, wenn jegliche Tumorzellen Immunfärbung aufwiesen, während ein Tumor als negativ klassifiziert wurde, wenn Immunfärbung in Tumorzellen völlig fehlte.
Positives Vergleichsgewebe bestand aus Schnitten von Brustkrebs, in denen die Erfinder bereits früher die Anwesenheit von CYP1B1 durch Immunoblotting und Immunhistochemie mit einem polyklonalen Antikörper gegen CYP1B1 ermittelten (Murray et al., 1997). Negative Vergleiche, die statt dem primären monoklonalen Antikörper verwendet wurden, waren TBS und Gewebekulturmedium. In einem Versuch wurde Antikörper mit Flüssigphase mit dem Peptid (Peptid E, 10 nMol Peptid/ml Antikörper) präadsorbiert, das als Immunogen für die monoklonalen Antikörper vor der Durchführung der Immunhistochemie verwendet worden war.
Lokalisierung von CYP1B1 in Ovarialkrebs
Die immunhistochemische Detektion von CYP1B1 mit einem monoklonalen Antikörper gegen CYP1B1 erfolgte unter Anwendung eines Tyramin-Signalverstärkungsverfahrens. Stellen von Immunreaktivität wurden mit Diaminobenzidin und Wasserstoffperoxid (Liquid DAB plus, Dako Ltd., High Wycombe, Bucks, UK) kolorimetrisch nachgewiesen. Positives Vergleichsgewebe bestand aus Schnitten von Brustkrebs mit CYP1B1, und der negative Vergleich verwendete TBS statt des primären monoklonalen Antikörpers. Um die Gegenwart oder Abwesenheit von CYP1B1 sowie seine Verteilung, Intensität und zelluläre Positionierung festzustellen, wurden die Schnitte mithilfe von Hellfeld-Lichtmikroskopie von zwei unabhängigen Beobachtern untersucht. CYP1B1-Immunreaktivität in den Tumoren wurde mit stark, mäßig, schwach oder negativ bewertet. Tumoren mit CYP1B1-Immunreaktivität in mehr als 5 % der Zelle galten als positiv.
Ergebnisse
Entwicklung von monoklonalen Antikörpern gegen CYP1B1
Die Immunantwort von Seren aus Mäusen, denen das jeweilige Peptidkonjugat injiziert worden war, wurde durch Natriumdodecylsulfat-Polyamildgel-Elektrophorese und Immunoblotting unter Verwendung von exprimiertem CYP1B1 als Antigen bewertet. Die Seren von Mäusen, denen unterschiedliche Peptide injiziert worden waren, wiesen eine variable Immunantwort auf (Tabelle 1, s.o.). Seren von Mäusen, denen die Peptiden D und E injiziert worden waren, wiesen beide Erkennung von CYP1B1 auf und riefen eine positive Immunantwort hervor. Seren aus Mäusen, denen Peptid E injiziert worden war, zeigten eine etwas stärkere Erkennung von exprimiertem Human-CYP1B1 als Peptid D. Allerdings wiesen Seren aus Mäusen, denen die Peptide A und B sowie die Peptide F bis J injiziert worden waren, keine offenkundige Erkennung von CYP1B1 auf; man klassifizierte sie als Seren, die keine signifikante Immunantwort hervorriefen. Mit Peptid E immunisierte Mäuse wurden deshalb ausgewählt, um monoklonale Antikörper gegen CYP1B1 zu entwickeln. Die zur Entwicklung der monoklonalen Antikörper verwendete Peptidsequenz zeigt ein höheres Ausmaß an Ähnlichkeit mit entsprechendem Ratten-CYP1B1 und Maus-CYP1B1-Sequenzen, wobei 13 der 15 Aminosäurereste identisch waren. Peptid E
Aminosäurereste, die allen drei P450 gemeinsam waren, sind mit einem Stern versehen.
Fünf monoklonale Antikörper wurden aus mit Peptid E immunisierten Mäusen entwickelt. Die einzelnen Antikörper wurden als 5C4, 5D3, 5D9, 5E2 und 5G7 bezeichnet, wobei Isotypisierung zeigte, dass alle Antikörper vom IgG1k-Subtyp waren. Alle monoklonalen Antikörper erkannten eine einzige immunreaktive Bande mit einer Molekülgröße von 52 kDa, die der erwarteten Molekülgröße von exprimiertem Human-CYP1B1 entsprach, durch Immunoblotting und erkannten kein exprimiertes Human-CYP1A oder irgendein anderes Protein in Nur-Vektor-Vergleichsmikrosomen oder Humanleber-Mikrosomen (1). Reihenverdünnungen von exprimiertem CYP1B1 zeigten, dass die minimale durch Immunoblotting detektierbare Menge an CYP1B1 0,05 pMol exprimiertes CYP1B1 betrug (2). CYP1B1 wurde durch Immunoblotting von Mikrosomen nicht identifiziert, die aus einer Reihe normaler adulter Humangewebe stammen, z.B. Niere, Magen, Dünndarm, Kolon und Lunge (3).
Die Immunhistochemie auf mit Formalin fixierten und in Wachs eingebetteten Schnitten von Brustkrebs diente als positiver Vergleich und zeigte, dass drei der monoklonalen Antikörper (5D3, 5E2 und 5G7) starke Färbung aufwiesen, während zwei der Antikörper (5C4, 5D9) keine Immunreaktivität besaßen. Alle monoklonalen Antikörper, die positive Immunreaktivität aufwiesen, erforderten einen Antigen-Gewinnungsschritt für optimale immunhistochemische Ergebnisse, und alle drei Antikörper wiesen ein identisches Lokalisierungs- und Verteilungsmuster immunhistochemischer Färbung auf. Daher wurde nur einer der monoklonalen Antikörper (5D3) für die nachfolgenden immunhistochemischen Studien von Brustkrebs herangezogen. Flüssigphasen-Vorinkubation von Anti-CYP1B1-Antikörper mit Peptid E vor der Durchführung von Immunhistochemie eliminierte die Immunreaktivität fast völlig.
CYP1B1-Immunreaktivität wurde in 47 (77 %) der Brustkrebsfälle identifiziert, während in 14 Fällen (23 %) keine nachweisbare CYP1B1-Immunreaktivität vorlag. In jedem Fall, in dem CYP1B1 Immunreaktivität bestand, war diese auf das Zytoplasma von Tumorzellen lokalisiert. Die Intensität der Immunreaktivität reichte von stark in 10 Fällen (16,4 %) bis zu mäßig in 12 Fällen (19,7 %); schwache Immunreaktivität wurde in 25 Fällen (41 %) beobachtet. Die Gegenwart von CYP1B1 in unterschiedlichen Abstufungen sowie histologische Typen von Brustkrebs und Lymphknotenstatus sind in den Tabellen 3 bis 5 zusammengefasst. Tabelle 3 Vorliegen von CYP1B1 bei unterschiedlichen histologischen Brustkrebsarten
Tabelle 4 Vergleich von CYP1B1 mit unterschiedlichen Abstufungen von Brustkrebs
Tabelle 5 Vergleich von CYP1B1 in Lymphknoten-positiven und Lymphnoten-negativen Brustkrebsfällen
Es öag keine CYP1B1-Immunreaktivität in Stromazellen oder Bindegewebe vor und auch nicht in den folgenden Zelltypen, einschließlich Lymphozyten und Plasmazellen, wenn sie in individuellen Biopsien vorhanden waren. Die Gegenwart von CYP1B1 war mit der Gegenwart von Östrogen-Rezeptorprotein assoziiert (Tabelle 6; x² = 8,54; p = 0,03), während keine Beziehung zwischen der Gegenwart von CYP1B1 und dem histologischen Typ des Tumors, der Tumorklasse oder der Gegenwart oder Abwesenheit von Lymphknotenmetastasen vorlag. Tabelle 6 Korrelation der Gegenwart von CYP1B1-Immunreaktivität bei Brustkrebs mit der Gegenwart von Östrogen-Rezeptor (x² = 8,54; p = 0,03)
CYP1B1-Expression bei primärem Kolorektalkrebs
Die Antikörper wueden anschließend zur Untersuchung der CYCP1B1-Expression in 80 primären Kolorektalkarzinomen und 14 Lebermetastasen von primärem Kolorektalkarzinom eingesezt. Von den 14 untersuchten Lebermetastasen zeigten 13 Expression von CYP1B1.
Lokalisierung von CYP1B1 bei Ovarialkrebs
CYP1B1-Immunreaktivität wurde bei der Mehrzahl (153/167; 92 %) von primären Ovarialkrebsschnitten identifiziert und spezifisch im Zytoplasma von Tumorzellen lokalisiert. Es gab keine detektierbare CYP1B1-Expression in normalen Ovarialgewebeproben. In einem hohen Prozentsatz der Ovarialkarzinome gab es entweder starke (85/1967; 50,9 %) oder mäßige (391167; 23,4 %) Immunreaktivität auf CYP1B1. Darüber hinaus wurde die Gegenwart von CYP1B1 bei der Mehrzahl (45/48; 94 %) von Metastasen beobachtet, wobei ein hoher Prozentsatz mäßige (22/48; 45,8 %) bis starke (18/48; 37,5 %) Immunreaktivität aufwies. Ein ähnlicher Wert für CYP1B1-Expression wurde für die unterschiedlichen histologischen Subtypen sowohl in primären als auch in metastatischen Tumoren festgestellt. In jenen Fällen, in denen sowohl primärer Ovarialtumoren als auch Metastasen vorlagen, konnte eine signifikante Korrelation der CYP1B1-Expression (p = 0,02 im Spearman-Korrelationstest) beobachtet werden.
Diskussion
Erhöhte Expression von CYP1B1 wird für eine Vielzahl von Tumoren gezeigt, z.B. bei Brustkrebs (Murray et al., 1997), und erhöhte CYP1B1-assoziierte 4-Östradiol-Hydrolase-Aktivität bei Brustkrebs ist feststellbar (Liehr und Ricci et al., 1996). CYP1B1 kann auch eine Vielzahl vermeintlicher Humankarzinogene metabolisieren, einschließlich polyzyklischer aromatischer Kohlenwasserstoffe und heterozyklischer Amine (Shimada et al., 1996; Crespi et al., 1997). Somit scheint CYP1B1 möglicherweise wichtige Funktionen in der Tumorentwicklung und Tumorprogression als potenzielles Ziel für krebsbekämpfende Arzneimittel und als Tumor-Biomarker zu erfüllen. Die ersten Studien der Gegenwart von CYP1B1 in individuellen Tumortypen erfolgten mit einem polyklonalen Antikörper gegen CYP1B1, wobei für jeden Tumortyp nur eine kleine Anzahl an Tumorproben untersucht wurde (Murray et al., 1997). Um das Potenzial von CYP1B1 (Tumorentwicklung und Tumorprogression) als Tumormarker näher untersuchen zu können, werden die hierin geoffenbarten monoklonalen Antikörper benötigt, die CYP1B1 in Formalin-fixierten und in Wachs eingebette ten Gewebeschnitten spezifisch erkennen; ferner ist die Untersuchung einer größeren Anzahl an Tumoren erforderlich. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Entwicklung solcher monoklonaler Antikörper gegen CYP1B1 und legt dar, dass sie CYP1B1 durch Immunoblotting und Immunhistochemie sensitiv und spezifisch detektieren; diese Antikörper werden verwendet, um die Gegenwart von CYP1B1 in einer Reihe von primären Brustkarzinomen, bei Prostatakrebs und bei Ovarialkrebs zu untersuchen.
Die Strategie zur Entwicklung monoklonaler Antikörper gegen CYP1B1 war eine Kombination aus struktureller Molekülmodellierung und Sequenzabgleich, um Regionen von CYP1B1 zu identifizieren, die wahrscheinlich an der Außenseite des CYP1B1-Proteins liegen und somit wahrscheinlich immunogen sind. Eine Region im C-terminalen Drittel des CYP1B1-Proteins, einschließlich der Häm-Bindungsregion, wurde identifiziert, und es wurden Peptide, die aus entweder 14 oder 15 Aminosäureresten bestanden, synthetisiert und an Trägerproteine konjugiert. Jedes Protein wurde Mäusen injiziert und die Immunreaktivität jedes Peptids für CYP1B1 durch Immunoblotting mithilfe von Mikrosomen, die aus Human-Lymphoblastoidzellen stammten, die exprimiertes CYP1B1 enthielten, und mithilfe von nur Vektor umfassenden Mikrosomen bewertet. Nur Seren aus mit Peptiden D und E immunisierten Mäusen zeigten eine Erkennung von CYP1B1, während keines der anderen Peptide signifikante Immunreaktivität auf CYP1B1 aufwies. Mit Peptid E immunisierte Mäuse wurden für die Entwicklung monoklonaler Antikörper gegen CYP1B1 ausgewählt. Die Peptidsequenz für die Erzeugung der monoklonalen Antikörper zeigt ein hohes Maß an Ähnlichkeit (13 von 15 Aminosäuren identisch) mit Ratten-CYP1B1 und Maus-CYP1B1, und man kann davon ausgehen, dass die monoklonalen Antkörper auch Ratten-CAP1B1 und Maus-CYP1B1 erkennen. Alle monoklonalen Antikörper waren für CYP1B1 spezifisch und erkannten weder CYP1A1 noch CYP1A2, die anderen bekannten Mitglieder der CYP1-Gen-Familie. Die Antikörper erkannten auch keinerlei andere Proteine in Humanleber-Mikrosomen. Humanleber-Mikrosomen dienten als Quelle für CYP1A2, da CYP1A2 eine der Hauptformen von konstitutiv in der Leber exprimiertem P450 ist; Lebermikrosomen dienten auch als Quelle verschiedener an derer Formen von P450, wodurch ein umfangreicher Screen zur Bestätigung der Spezifität der Antikörper für CYP1B1 erhalten wurde.
Die vorliegende Studie konnte CYP1B1 durch Immunoblotting in einer Reihe normaler Humangewebe nicht detektieren. Die Abwesenheit von CYP1B1-Protein sowohl in normaler Humanleber als auch in einer Reihe extrahepatischer Gewebe stimmt mit früheren immunhistochemischen Studien überein (Murray et al., 1997), in denen CYP1B1-Protein ebenfalls nicht detektiert wurde. In der gegenständlichen Studie lag eine relativ große Menge an mikrosomalem Protein (30 μg) pro Spur vor, und es wurde ein hochsensitives Chemilumineszenz-Detektionssystem verwendet, so dass man vermutlich davon ausgehen kann, dass mit diesem System selbst eine sehr geringe Menge an CYP1B1 in den untersuchten normalen Geweben detektiert worden wäre.
Ein weiteres Hauptziel dieser Studie bestand in der Entwicklung von Antikörpern gegen CYP1B1, die in der Immunhistochemie eingesetzt werden können und die auf mit Formalin fixierten und in Wachs eingebetteten Gewebeschnitten ihre Wirkung entfalten. Alle monoklonalen Antikörper wurden mittels Immunhistochemie unter Verwendung von mit Formalin fixierten und in Wachs eingebetteten Brustkrebsschnitten bewertet, die – wie dies zuvor bereits mittels Immunoblotting aufgezeigt worden war – eine relativ große Menge an CYP1B1 enthielten (Murray et al., 1997). Mittels Immunhistochemie wurde festgestellt, dass drei der monoklonalen Antikörper CYP1B1 wirksam detektierten. Da die drei Antikörper, die positive Immunreaktivität aufwiesen, alle ein identisches Muster und identische Intensität der Immunreaktivität ergaben, wurde nur einer der Antikörper zur Untersuchung der CYP1B1-Expression herangezogen.
Die vorliegende Studie ergab, dass 77 % der Brustkarzinome CYP1B1 enthielten und in jedem Tumor CYP1B1 spezifisch auf Tumorzellen lokalisiert war. Die hohe Häufigkeit der Expression von CYP1B1 in Brustkrebs ist ein Ergebnis, das starke Ähnlichkeit zu früheren Studien mit einer geringen Anzahl an Brustkarzinomen aufweist und das die Vorstellung untermauert, dass CYP1B1 eine Hauptform von Cytochrom P450 in Brustkrebs darstellt (McKay et al., 1995; Murray et al., 1997). CYP1 B1 wurde bei allen histologischen Typen von Brustkrebs beobachtet, und die Gegenwart von CYP1B1 war mit keinerlei histologischem Brustkarzinomtyp, noch mit der Gegenwart oder Abwesenheit von Lymphknotenmetastasen assoziiert. Allerdings korrelierte die Expression von CYP1B1 sehr wohl mit der Gegenwart von Östrogen-Rezeptorprotein. Dies ist von Interesse, da vor kurzem eine Assoziation zwischen einem CYP1B1-Polymorphismus (Valin/Leucin) an Aminosäure 432 und Östrogen-Rezeptorstatus bei Brustkrebs beschrieben wurde (Bailey et al., 1998). Es besteht auch die Möglichkeit des „Übersprechens" zwischen dem Östrogen-Rezeptorkomplex und dem Arylkohlenwasserstoff-Rezeptorkomplex (Wang et al., 1998), der an der Transkriptionsregulierung von CYP1B1 beteiligt ist (Schmidt & Bradfield, 1996).
Da CYP1B1 insofern am Östrogen-Metabolismus beteiligt ist, als es als spezifische C4-Hydroxylase von Östradiol dient (Hayes et al., 1996), kann die Gegenwart von CYP1B1 in Brustkrebszellen wahrscheinlich signifikant zum intratumoralen Metabolismus von Östradiol beitragen. Die Gegenwart von CYP1B1 bei Brustkrebs bietet auch ein molekulares Ziel für spezifisch durch CYP1B1 aktivierte Arzneimittel.
Die Entwicklung monoklonaler Antikörper gegen CYP1B1, die in mit Formalin fixierten und in Wachs eingebetteten Schnitten ihre Wirkung entfalten, sollte sie zu interessanten Kandidaten zur Untersuchung der CYP1B1-Expression bei unterschiedlichen Tumortypen und verwandten präneoplastischen Läsionen machen. Die Antikörper können zur Krebsdiagnose herangezogen werden. Die Antikörper können auch als Basis für immunochemische diagnostische In-vivo-Versuche und als Therapeutika entwickelt werden, die auf das CYP1B1-Protein oder ein Abbauprodukt davon abzielen.
Literaturzitate

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Sequenzprotokoll

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers, der sich spezifisch an Cytochrom P450 CYP1B1 bindet, wobei das Verfahren das Züchten des Antikörpers unter Verwendung eines Peptids, das aus einer Aminosäuresequenz VNQWSVNHDPVKWPN oder PExFDPARFLDKDGy, worin x für D oder N steht und y für L oder F steht, besteht, oder eines antigenen Fragments davon umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Peptid aus 3 bis 10 Aminosäuren besteht.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das Peptid aus 3 bis 6 Aminosäuren besteht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Peptid an einen immunogenen Träger konjugiert ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 5, worin der monoklonale Antikörper durch ein Verfahren erhältlich ist, das die folgenden Schritte umfasst: (a) das Immunisieren eines Tiers mit dem Peptid, das an einen immunogenen Träger konjugiert ist; (b) das Töten des Tiers und Fusionieren von Milzzellen, die dem Tier entnommen werden, mit Myelomzellen, um ein oder mehrere Hybridome zu bilden; und (c) das Screenen der Hybridome auf Antikörper, die in der Lage sind, das Peptid zu binden.
Verfahren zur Herstellung eines Hybridoms, das in der Lage ist, einen Antikörper zu produzieren, der sich spezifisch an Cytochrom P450 CYP1B1 bindet, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) das Immunisieren eines Tiers mit einem Peptid, das an einen immunogenen Träger konjugiert ist, worin das Peptid aus einer Aminosäuresequenz VNQWSVNHDPVKWPN oder PExFDPARFLDKDGy, worin x für D oder N steht und y für L oder F steht, besteht, oder einem antigenen Fragment davon; (b) das Töten des Tiers und Fusionieren von Milzzellen, die dem Tier entnommen werden, mit Myelomzellen, um ein oder mehrere Hybridome zu bilden; und (c) das Screenen der Hybridome auf Antikörper, die in der Lage sind, das Peptid zu binden.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Peptid aus 3 bis 10 Aminosäuren besteht.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das Peptid aus 3 bis 6 Aminosäuren besteht.
Hybridom, das durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9 erhältlich ist.
Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers, umfassend das Bereitstellen eines Hybridoms nach Anspruch 10, das Kultivieren des Hybridoms und das Isolieren des so gebildeten Antikörpers.
Verfahren nach Anspruch 11, weiters umfassend das Konjugieren des Antikörpers an einen Effektor.
Verfahren nach Anspruch 12, worin der Effektor eine Markierung, ein Toxin, ein Wirkstoff oder ein Prodrug, ein Enzym oder ein Transportmolekül ist.
Antikörper, der in der Lage ist, sich spezifisch an Cytochrom P450 CYP1B1 zu binden, worin der Antikörper ein Epitop im Cytochrom-P450-CYP1 B1-Protein erkennt, das in der Aminosäuresequenz VNQWSVNHDPVKWPN oder PExFDPARFLDKDGy, worin x für D oder N steht und y für L oder F steht, eingebunden ist.
Antikörper nach Anspruch 14, worin der Antikörper ein Epitop aus zwischen 3 und 10 Aminosäuren aus den Aminosäuresequenzen erkennt.
Antikörper nach Anspruch 14, worin der Antikörper ein Epitop aus zwischen 3 und 6 Aminosäuren aus den Aminosäuresequenzen erkennt.
Antikörper nach einem der Ansprüche 14 bis 16, worin der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Antikörper nach einem der Ansprüche 14 bis 16, der humanisiert ist.
Antikörper nach einem der Ansprüche 14 bis 18, worin der Antikörper an einen Effektor konjugiert ist.
Antikörper nach Anspruch 19, worin der Effektor eine Markierung, ein Toxin, ein Wirkstoff oder ein Prodrug, ein Enzym oder ein Transportmolekül ist.
Antikörper nach einem der Ansprüche 14 bis 20 zur Verwendung in einem medizinischen Behandlungsverfahren.
Verwendung eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 14 bis 21 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs.
Peptid, das aus Aminosäuresequenz VNQWSVNHDPVKWPN oder PExFDPARFLDKDGy, worin x für D oder N steht und y für L oder F steht, besteht, oder ein antigenes Fragment davon.
Testverfahren zur Detektion von Krebszellen, die in einer Probe aus einem Patienten vorhanden sind, wobei das Verfahren das Kontaktieren einer Gewebeprobe aus einem Patienten mit einem Antikörper nach einem der Ansprüche 14 bis 20 und das Nachweisen von Bindung des Antikörpers an CYP1B1-Protein, das in der Probe vorhanden ist, als ein Hinweis auf die Gegenwart von Krebszellen in der Gewebeprobe umfasst.
Verfahren nach Anspruch 24, worin der Schritt des Nachweisens der Bindung des Antikörpers an CYP1B1-Protein unter Verwendung eines Antikörper-Einfangtests, eines Zwei-Antikörper-Sandwichtests oder eines Antigen-Einfangtests durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 24 oder Anspruch 25, worin der für das CYP1B1-Protein spezifische Antikörper an einem auf einem festen Träger basierenden Immuntest immobilisiert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 26, worin die Krebserkrankung Brustkrebs, Kolorektalkrebs, Prostatakrebs, Leberkrebs oder Ovarialkrebs ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 27, worin die Gewebeprobe aus Blase, Gehirn, Brust, Kolon, Bindegewebe, Niere, Lunge, Lymphknoten, Speiseröhre, Ovarien, Haut, Magen, Hoden und Uterus ausgewählt ist.