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CN108883199A - 肝配蛋白受体a2(epha2)的纳米脂质体靶向和相关诊断 - Google Patents

肝配蛋白受体a2(epha2)的纳米脂质体靶向和相关诊断 Download PDF

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CN108883199A CN201780014763.3A CN201780014763A CN108883199A CN 108883199 A CN108883199 A CN 108883199A CN 201780014763 A CN201780014763 A CN 201780014763A CN 108883199 A CN108883199 A CN 108883199A
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D·B·科波汀
W·卡莫恩
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Merrimack Pharmaceuticals Inc
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Abstract

靶向EphA2的多西紫杉醇生成性纳米脂质体可用于治疗包括表达超过约3000个EphA2受体/细胞的癌细胞的EphA2阳性癌症。提供了用于鉴定EphA2阳性癌症患者的诊断方法和用包封多西紫杉醇前药的靶向Eph‑A2的纳米脂质体治疗所鉴定的患者的方法。

Description

肝配蛋白受体A2(EPHA2)的纳米脂质体靶向和相关诊断
交叉引用
本专利申请要求以下待审美国临时专利申请中的每一个的优先权，每个临时专利申请通过引用整体并入本文：62/309,215(2016年3月16日提交)和 62/322,971(2016年4月15日提交)。
序列表
通过引用整体并入的是与此同时提交并且如下标识的计算机可读序列表：一个名为“1107sequence_ST25.txt”的48.0KB ASCII(文本)文件。
技术领域
本公开涉及可用于治疗EphA2阳性癌症的靶向肝配蛋白受体A2的纳米脂质体，以及相关的诊断方法。
背景技术
肝配蛋白受体A2(EphA2)是在几种实体肿瘤中高度过表达的肝配蛋白家族的细胞-细胞接合蛋白的一部分，并且与预后不良有关。Eph受体由基于 N-末端配体结合结构域的同源性分成两组(A和B)的酪氨酸激酶受体大家族组成。Eph受体涉及控制细胞生长、迁移和分化的几种关键信号传导途径。这些受体的独特之处在于它们的配体与相邻细胞的表面结合。Eph受体及其配体在发育过程中显示出特定的表达模式。例如，EphA2受体在胚胎发育期间在神经系统中表达，并且还在成人的增殖上皮细胞表面上表达。EphA2在通过配体肝配蛋白A1介导的血管生成和肿瘤血管形成中也起重要作用。此外，EphA2在多种人上皮肿瘤中过表达，包括乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、前列腺癌以及胰腺癌。也可以在肿瘤血管和基质细胞中检测到EphA2的表达。
发明内容
我们开发了一种用于基于机械学单细胞界定值(cut-off)前瞻性选择EphA2+患者以使用包封多西紫杉醇前药的靶向EphA-2的纳米脂质体进行治疗的诊断框架，以及一种临床级IHC测定。本发明部分基于以下发现：将表达EphA2的细胞与靶向EphA2的脂质体一起孵育(实施例3)展示出与具有大于约3,000个EphA2受体/细胞的细胞的特异性结合，如通过本文所述的测定方法所确定的。例如，图6为示出与不包括EphA2靶向部分的可比脂质体相比，实施例3的靶向EphA2的荧光脂质体与表达不同水平的EphA2的细胞的脂质体-细胞缔合的增加的图。如本文所用，“EphA2阳性”是指每个细胞具有至少约3,000个EphA2受体的癌细胞(或具有包含所述癌细胞的肿瘤的患者)。如图4所示，EphA2阳性细胞可以每个细胞特异性地结合靶向Eph-A2 的脂质体。在一个实例中，靶向EphA2的脂质体(例如，如实施例3中所公开的)可以特异性地结合具有至少约3,000或更多个(例如，75,500或更多个)EphA2受体的EphA2阳性癌细胞。实施例2描述了IHC测定。
如实施例1中所述，我们使用qFACS和脂质体(Ls)-细胞相互作用的体外测定来鉴定能够实现Ls的抗体介导的结合和内化的EphA2受体的最小数目。如实施例2中所述，我们开发了能够区分EphA2-细胞系和EphA2+细胞系的 IHC测定。我们在各种适应症的肿瘤样品中表征EphA2染色模式，并开发了一种允许在早期临床试验中选择患者的评分算法。
附图说明
图1为示出在体外的一组细胞系中46scFv-ILs和40scFv-ILs相对NT-Ls 的脂质体-细胞缔合的图
图2为示出在体外的相同细胞系中进行的46scFv-ILs相对40scFv-ILs的脂质体-细胞缔合的图
图3为示出对于使用qFACs定量的一组细胞系，每个细胞的受体中表达的EphA2的表达的图
图4为示出在体外的一组细胞系中46scFv-ILs和40scFv-ILs以及NT-Ls 的脂质体-细胞缔合相对于EphA2表达的图
图5为示出在体外的一组细胞系中收集的且拟合至Michaels-Menten方程的46scFv-ILs和40scFv-ILs的脂质体-细胞缔合相对于EphA2表达的图
图6为对数标度的图，其示出相对于EphA2表达的46scFv-ILs和 40scFv-ILs以及NT-Ls的脂质体-细胞缔合以及体外分离EphA2阴性(-)细胞系、EphA2低(+)细胞系以及EphA2高(++)细胞系的界定值的确定
图7为示出46scFv-ILs和40scFv-ILs的接受者操作特征曲线的图，其说明了3000的界定值将EphA2阴性细胞与EphA2阳性细胞正确分类的能力。
图8为示出在不同的一抗浓度下IHC染色细胞阵列的褐色信号强度分析的图。
图9为示出由IHC染色细胞阵列定量的褐色信号强度与使用qFACs定量的每个细胞的EphA2受体之间的相关性的图
图10为示出通过EphA2转染细胞相对EphA2阴性野生型的染色示出的 IHC染色的特异性的图像。
图11为示出用于解释EphA2 IHC的评分决策矩阵的图。
图12为包含EphA2结合部分(抗-EphA2 scFv PEG-DSPE)的多西紫杉醇生成性脂质体的示意图。
图13A为可用于制备靶向EphA2的多西紫杉醇生成性脂质体的scFv的氨基酸序列和相应的编码DNA序列。该DNA序列进一步编码N-末端前导序列，其被表达编码的scFv的哺乳动物(例如，人或啮齿动物)细胞切割下来。
图13B为可用于制备靶向EphA2的多西紫杉醇生成性脂质体的scFv的氨基酸序列和相应的编码DNA序列。该DNA序列进一步编码N-末端前导序列，其被表达编码的scFv的哺乳动物(例如，人或啮齿动物)细胞切割下来。
图13C为可用于制备靶向EphA2的多西紫杉醇生成性脂质体的scFv的氨基酸序列和相应的编码DNA序列。该DNA序列进一步编码N-末端前导序列，其被表达编码的scFv的哺乳动物(例如，人或啮齿动物)细胞切割下来。
图14A为示出EphA2检出率和用于对临床样品进行评分的计划的一组图。
图14B示出EphA2在原发性肿瘤和转移瘤(卵巢癌)中的检出率。
具体实施方式
靶向EphA2的纳米脂质体可用于将多西紫杉醇(例如，作为包封的多西紫杉醇前药)递送至癌细胞和/或肿瘤，其通过增强的渗透性和保留(EPR)效应以及通过EphA2靶向实现的细胞特异性的组合充分发挥器官特异性。本文公开的诊断框架可用于例如基于EphA2的排除标准的临床实施，以选择癌症患者接受含有多西紫杉醇前药的靶向EphA2的纳米脂质体、或任何其他稳定缔合(药物保留的T1/2大于24h)的药物有效负载。
我们开发了一种新型的靶向EphA2的多西紫杉醇纳米脂质体，其通过增强的渗透性效应和通过EphA2靶向实现的细胞特异性充分发挥器官特异性。该研究的目标是开发能够在未来的试验中实现基于EphA2的排除标准的临床实施的诊断框架。
在EphA2阳性肿瘤(例如，由癌细胞或癌症相关基质表达)中，靶向EphA2 的纳米脂质体可以与EphA2结合，这可以减少或最小化脂质体从肿瘤中的洗出(washout)，从而导致脂质体的内吞作用和包封在靶向EphA2的纳米脂质体中的多西紫杉醇前药的加速释放。据信这两种机制均有助于增加细胞内和细胞外递送至肿瘤的多西紫杉醇的水平，从而导致癌细胞死亡和肿瘤缩小。介导这些机制的关键步骤是靶向EphA2的纳米脂质体与过表达EphA2的细胞的结合。
“EphA2”是指肝配蛋白A型受体2，也称为“上皮细胞激酶(ECK)”，一种可以与肝配蛋白-A配体结合并被其激活的受体酪氨酸激酶。术语“EphA2”可以指EphA2的任何天然存在的同种型。人EphA2的氨基酸序列记录为 GenBank登录号NP_004422.2。
如本文所用，“EphA2阳性”是指每个细胞具有至少约3000个EphA2受体的癌细胞(或具有包含所述癌细胞的肿瘤的患者)。EphA2阳性细胞可以每个细胞特异性地结合靶向Eph-A2的脂质体。具体地讲，靶向EphA2的脂质体可以特异性地结合每个细胞具有至少约3000或更多个EphA2受体的 EphA2阳性癌细胞。
如本文所用，非靶向脂质体可以命名为“Ls”或“NT-Ls”。Ls(或NT-Ls)可以指具有或不具有多西紫杉醇前药的非靶向脂质体。“Ls-DTX”是指含有任何合适的多西紫杉醇前药的脂质体，所述前药包括本文公开的那些多西紫杉醇前药的等同或替代性实施方案。“NT-Ls-DTX”是指包封任何合适的多西紫杉醇前药的不具有靶向部分的脂质体，所述前药包括本文公开的那些多西紫杉醇前药的等同或替代性实施方案。包括特定多西紫杉醇前药的非靶向脂质体的实例可以“Ls-DTXp[y]”或“NT-DTXp[y]”的形式指定，其中[y]是指本文指定的特定化合物编号。例如，除非另外指明，Ls-DTXp1是含有本文化合物1 的多西紫杉醇前药而不具有抗体靶向部分的脂质体。
如本文所用，靶向免疫脂质体可命名为“ILs”。“ILs-DTXp”的表述是指包含靶向部分(诸如scFv)的靶向多西紫杉醇生成性免疫脂质体的任何实施方案或变型。本文公开的ILs是指免疫脂质体，其包含用于结合生物表位的部分，诸如免疫脂质体的表位结合性scFv部分。除非另外指明，否则本文引用的ILs 是指EphA2结合性免疫脂质体(或者称为“EphA2-ILs”)。术语“EphA2-ILs”在本文是指具有靶向结合EphA2的部分的通过本公开实现的免疫脂质体。ILs 包括具有结合EphA2的部分的EphA2-ILs(例如，使用结合EphA2的任何scFv 序列)。优选的靶向多西紫杉醇生成性免疫脂质体包括ILs-DTXp3、ILs-DTXp4 和ILs-DTXp6。在没有相反指示的情况下，这些包括具有EphA2结合部分且包封化合物3、化合物4或化合物6(分别)的多西紫杉醇前药的免疫脂质体。 EphA2-ILs可以指并包括具有或不具有多西紫杉醇前药的免疫脂质体(例如，包封捕集剂诸如蔗糖八硫酸盐的不具有多西紫杉醇前药的免疫脂质体)。
缩写形式“[x]scFv-ILs-DTXp[y]”在本文用于描述免疫脂质体(“ILs”)的实例，其包括具有在特定的SEQ ID NO:[x]中指定的氨基酸序列的scFv“靶向”部分，所述scFv“靶向”部分附接至包封或以其他方式含有具有本文所指定的特定化合物编号([y])的多西紫杉醇前药(“DTXp”)的脂质体。除非另外指明，否则靶向ILs的scFv序列可以与EphA2靶标结合。
术语“NT-Ls”是指通过本公开实现的不具有靶向部分的非靶向脂质体。术语“NT-Ls-DTX”是指通过本公开实现的包封多西紫杉醇前药(“DTX”)的非靶向脂质体。
使用一组细胞系在体外对脂质体的充分结合所需的最小EphA2表达进行分析(实施例1)，以确定EphA2表达(通过qFAC测量)与靶标介导的脂质体- 细胞缔合之间的关系。
如实施例1中所述，靶向EphA2的脂质体/细胞相互作用与靶标表达直接相关，而非靶向脂质体与细胞的相互作用极小且不受靶标表达的影响。可以通过评估非靶向脂质体/细胞缔合来确定可以基于EphA2-ILs/细胞相互作用对细胞系进行分层的界定值，并将其确立为最高非靶向脂质体/细胞缔合的值 (343个脂质体/细胞)。我们接下来使用统计分区方法来确定误分类最小的最佳EphA2表达界定值(≈3,000个受体/细胞)。
虽然非靶向Ls不与细胞体外缔合，但在EphA2表达与EphA2-ILs细胞缔合之间存在强烈的相关性，这与细胞系来源无关。我们使用非靶向Ls来确定可以实现的非特异性结合的程度(～340个Ls/细胞)并使用分区来确定介导靶向所必需的EphA2受体的最小数量(～3,000个受体/细胞)。我们已经开发并验证了针对EphA2的qIHC测定(精确度～90％，线性0.8且再现性～5％)。我们将来自各种适应症的一组～200个肿瘤样品染色。发现EphA2在肿瘤细胞、肿瘤相关性成肌纤维细胞以及肿瘤相关血管中表达。使用10％的包括性界定值，在所评价的肿瘤类型中发现EphA2检出率在50％至100％的范围内。在匹配的样品中，在转移性肿瘤与原发性肿瘤之间未观察到染色的显著差异。
结果汇总于下表1中。
表1
实施例
实施例1：靶标的细胞表达对体外脂质体靶向的影响的分析。
实施例1详细描述了实施例3的示例性的靶向Eph-A2的脂质体(在本文为“EphA2-ILs”)在其结合肿瘤细胞的能力方面的表征，并确立了对于 EphA2-ILs结合充足的EphA2表达的界定值。通过将来自评估结合两种 EphA2靶向克隆40scFv和46scFv的免疫脂质体的结合亲和力的筛选测定的结果与非靶向脂质体(NT-Ls)相比较，我们已经确立了克隆之间的结合能力存在高度相关性(R2＝0.97)。此外，与非靶向脂质体对照相比，具有两种EphA2 克隆的免疫脂质体表现出统计学上显著的结合增加(P<.0001)。随后的分析确定，在所测试的两种克隆中，46scFv-ILs表现出比克隆40scFv更高的49％的脂质体/细胞缔合增加。此外，用于定量EphA2表达的qFACS分析显示出靶向EphA2的脂质体对EphA2阳性细胞的高水平特异性。在靶向EphA2的脂质体和细胞的缔合与EphA2表达之间存在强烈的相关性(皮尔逊相关系数> 0.8)。
材料
表2，试剂：
使用来自BD的Quantibrite小珠产生每个小珠的PE(藻红蛋白)分子数量的标准曲线。按照Becton Dickinson的说明，对于每个实验，将500ul的FAC 缓冲液添加到所提供的管中，随后在先前用Right Reference小珠校准的BD FACs Calibur流式细胞仪上进行读取。
将细胞在适当的培养基中培养(参见细胞系图表)，直到～70-80％汇合，然后用胰蛋白酶处理、计数，并且在FACs缓冲液中洗涤，以在96孔圆底板中的每个孔中获得4x10^6个细胞/孔的最终浓度。然后将细胞与200nM的R& D系统的EphA2PE抗体一起在冰上孵育20分钟，洗涤并重悬于100ul的 FACs缓冲液中。在BD FACs Calibur流式细胞仪上读取细胞，并如本文相对于qFACs方法验证所描述的那样表示数据。
脂质体-细胞缔合测定：共价scFv-缀合脂质体的细胞摄取
通过乙醇注射-挤出法制备脂质体。对于鞘磷脂(SM)脂质体，脂质由鞘磷脂、胆固醇和PEG-DSG(3:2:0.24摩尔份)组成，具有以总磷脂的0.3摩尔％的比率添加的DiIC18(3)-DS(DiI3-Ls)或DiIC18(5)-DS(DiI5-Ls)荧光脂质标签。简而言之，对于30ml脂质体制剂，将脂质溶解于70摄氏度的50-ml圆底烧瓶中的3ml乙醇中。将HEPES缓冲盐水(5mM HEPES，144mM NaCl， pH 6.5)在70摄氏度水浴中温热至65摄氏度以上，并在剧烈搅拌下与脂质溶液混合，以得到具有50-100mM磷脂的悬浮液。然后例如使用热屏障Lipex 挤出机(NorthernLipids,Canada)将所获得的乳状混合物在65-70℃下重复挤出通过0.2μm和0.1μm聚碳酸酯膜。通过磷酸盐测定测量磷脂浓度。通过动态光散射分析粒径。通过该方法制备的脂质体具有约95～115nm的尺寸。将抗 -EphA2 scFv蛋白在哺乳动物细胞培养物中表达，通过蛋白A亲和层析纯化，并通过C-末端半胱氨酸残基与马来酰亚胺封端的脂质聚合物mal-PEG-DSPE以1:4蛋白质/mal-PEG-DSPE摩尔比在水溶液中缀合。在Ultrogel AcA34或 AcA44(Sigma,USA)上通过凝胶层析纯化所得的胶束scFv-PEG-DSPE缀合物。将抗-EphA2 scFv蛋白在哺乳动物细胞培养物中表达，通过蛋白A亲和层析纯化，并通过C-末端半胱氨酸残基与马来酰亚胺封端的脂质聚合物 mal-PEG-DSPE以1:4蛋白质/mal-PEG-DSPE摩尔比在水溶液中缀合。在 Ultrogel AcA34(Sigma,USA)上通过凝胶层析纯化所得的胶束 scFv-PEG-DSPE缀合物。靶向DiI3-Ls或DiI5-Ls通过与胶束抗-EphA2 scFv-PEG-DSPE缀合物一起在60℃下孵育30分钟制备，其中对于40scFv-ILs， scFv/脂质体比率为10-12g/mol磷脂，并且对于46scFv-ILs，scFv/脂质体比率为5g/mol磷脂。°插入配体的脂质体在Sepharose CL-4B柱上纯化，通过磷酸盐测定分析脂质浓度并通过SDS-PAGE分析抗体定量。
本研究中使用的细胞应处于70-90％汇合。在研究之前24小时，用 RPMI(含有10％FBS、2mM谷氨酰胺和青霉素/链霉素)的新鲜等分试样替换培养基，并通过胰蛋白酶处理进行收获。然后将细胞重悬于生长培养基中，以每孔100,000个细胞/孔铺板，洗涤，并与100ul含有50μM磷脂脂质体的培养基一起孵育。随后，将细胞在持续摇动下、在黑暗中于37℃下孵育4小时。此后，将细胞用PBS洗涤2-3次并重悬于100ul/孔PBS中以用于FACS 分析。使用FACScalibur(BD bioscience)确定DiI5标记的脂质体的平均细胞荧光(MCF)。所观察到的荧光信号代表表面结合和内化的纳米颗粒，而与空白脂质体(未缀合的scFv)一起孵育的细胞的MCF用于确定非特异性结合。
表3，细胞系：
分析验证
该测定旨在评估靶标介导的脂质体-细胞缔合，以便相对于非靶向脂质体，对共价scFv-缀合的脂质体的摄取进行定量。我们测试了EphA2抗体的两种克隆46scFv-ILs和40scFv-ILs。简而言之，将细胞与用亲脂性荧光团荧光标记的靶向或非靶向脂质体一起孵育4小时，然后洗涤并使用流式细胞术测量单细胞荧光。使用具有已知数量的荧光团的荧光小珠作为标准曲线，以由平均荧光值确定脂质体的数量。总体而言，该测定展示出高线性(平均值 R2＝0.98)、再现性(标准曲线的截距和斜率在10％以内)和低测定内变异性(技术重复之间的平均CV＝2.1％[0.03％-19％])。将细胞系的子集(20％＝13/65) 运行两次并且数据显示出在运行(run)之间可再现的脂质体摄取：标记为 POC10的1号运行和标记为74号运行的2号运行。对于测定再现性，使用 40scFv-ILs。为了反向计算脂质体的数量和所估计的多西紫杉醇负载，我们使用以下方程。
为了验证脂质体-细胞缔合测定，我们在两个生物学重复中测试了再现性。POC10和74号运行代表相隔一个月进行的测定的两次运行并且每次运行历经4天完成。对于EphA2-脂质体(40scFv-ILs)和NT-脂质体水平，两次运行之间没有显著差异。B.来自74号运行的标准曲线在每次流式细胞术运行时进行，并显示出测定的线性和稳定性。
表4：脂质体-细胞缔合的再现性和线性
靶向EphA2的脂质体相对非靶向脂质体-细胞缔合
图1示出进行以表征脂质体-细胞缔合范围的分析的结果。我们使用 40scFv-ILs或46scFv-ILs筛选了一大组细胞系，并将其与NT-Ls进行比较。我们发现与细胞缔合的EphA2-ILs以统计学上显著的方式超过NT-Ls，这与所使用的EphA2克隆无关。参考图1(EphA2-ILs相对NT-Ls细胞缔合)，用靶向EphA2的免疫脂质体46scFv-ILs和40scFv-ILs测试一组细胞系。在与 NT-Ls进行比较时，EphA2-ILs展示出统计学上显著高的与细胞的缔合(配对 t检验)。两种EphA2抗体克隆均具有相似的结合，其中在46scFv-ILs的情况下具有小但统计学上显著较高水平的缔合。
为了确定克隆之间的相关性，并排评估了一组34个细胞系。两种克隆显示出彼此的高度相关性，如通过0.97的R2值所指示的。然而，46scFv-ILs 导致比克隆40scFv-ILs在统计学上显著更高的脂质体-细胞缔合(p<0.0001)，其中每个细胞的脂质体数量平均增加49％且标准偏差为21％。
图2(40scFv-ILs相对46scFv-ILs Ls细胞缔合)示出在同一研究中用于比较两种EphA2 scFv克隆的34个细胞系的分析结果。在两种抗体克隆之间看到强烈的线性相关性，其中对于46scFv-ILs具有显著更高的脂质体-细胞缔合。
EphA2 qFACs测定验证
EphA2 qFACS测定旨在使用定量流式细胞术(qFACs)对每个细胞的 EphA2分子进行定量。总而言之，将细胞与缀合至PE的EphA2抗体(R&D Clone 3035小鼠单克隆抗体)一起孵育1小时。然后洗涤感兴趣的细胞并使用流式细胞术评估荧光强度。使用流式细胞术同时分析PE标记的小珠 (QuantibtriteTMPE-定量试剂盒，BD bioscience)，并进行线性回归分析以反向计算与每个细胞结合的抗体的数量。我们假设一种抗体仅可结合一种抗原，因此抗体数量等于每个细胞的受体数量。就测定性能而言，该测定是高度线性的(平均值R2＝0.99)且可再现的(标准曲线的截距和斜率在10％以内)并且测定内变异性低(技术重复之间的平均CV＝5.6％[0.6％-37％])。将细胞系的子集运行两次，数据显示出可再现的EphA2水平。参考EphA2 qFACs测定验证，相隔一个月进行测定的两次运行并且每次运行历经4天完成。在两次运行之间EphA2水平没有显著差异。此外，在每次qFACs运行时进行标准曲线，并显示出测定的线性和稳定性。
癌细胞系中的EphA2表达的表征
我们在同一天且使用相同批次的细胞进行qFACs和脂质体-细胞缔合研究。qFACs数据显示EphA2的范围为每个细胞422至143,888个受体(图3)。
EphA2表达相对靶标介导的脂质体-细胞缔合
该分析的目标是评估EphA2表达与靶标介导的脂质体-细胞缔合之间的相关性。我们在EphA2表达与EphA2-ILs-细胞缔合之间发现显著的相关性(对于46scFv-ILs，皮尔逊相关系数＝0.81，对于F5-10A7，皮尔逊相关系数为0.88)，其与EphA2抗体克隆无关。
参考图4(一组癌细胞系中的EphA2表达)，EphA2表达与靶标介导的脂质体缔合之间的关系通过表明标准抗原-抗体结合动力学的Michaelis-Menten 方程最佳拟合并且与细胞系来源无关。
鉴于EphA2表达与靶标介导的脂质体-细胞缔合之间的关系，我们已经确定了可以对细胞系进行分类的界定值。通过评估非靶向脂质体-细胞缔合来确定界定值，并通过采用99百分位数的NT-Ls-细胞缔合来确立，其为约340 个脂质体/细胞。我们使用统计分区方法来确定误分类最小(≈1％误差)的最佳 EphA2表达界定值(约3000个受体/细胞)。该界定值将靶向阴性细胞系与靶向阳性细胞系分开。图6是示出一组特定的选定癌细胞系中的EphA2表达的图。
虽然第一界定值来源于非靶向脂质体-细胞缔合，但是通过在数据中寻找聚类斑点(clustering spot)来确定第二界定值(将EphA2+与EphA2++分开，图 6)，从而分离大量细胞。所鉴定的聚类斑点在46scFv-ILs中进行，然后外推至40scFv-ILs。我们将5,000个脂质体/细胞确定为下一个水平，其通过分区分析导致约17,500个受体/细胞。由于40scFv-ILs具有比46scFv-ILs更低的脂质体-细胞缔合，17,500个受体/细胞与约4,000个脂质体/细胞相关联。对于两种分区分析，对于40scFv-ILs和46scFv-ILs，计算为ROC曲线下面积的分区误差分别为0.94和0.98。
实施例2：IHC测定性能的定量评估
该实施例描述了EphA2 IHC CDx测定。调整该测定以允许视觉检测与所确定的3000个受体/细胞的界定值匹配的EphA2表达。该测定展示了可接受水平的灵敏度、特异性和精确度。完成所有计划的任务，EphA2 IHC CDx展示出EphA2染色的特异性和灵敏度，并具有如通过使用定量图像分析所定义的坚实精确度。
当在具有一定范围的EphA2表达的一组癌细胞系中测试时，EphA2 IHC CDx显示出高水平的特异性和灵敏度。细胞系和组织样品中的测定内和测定间变异性非常低。
材料和方法
细胞阵列和TMA图谱可见于附录A中，并描述于表5。选择所有组织样品以包括将包括在1期试验中的所有相关肿瘤类型。对于所有细胞系，我们专注于三种肿瘤类型，我们从中包括一大组细胞组。
表5.用于测定定量的TMA列表
在Dako Autostainer仪器上进行EphA2 IHC CDx切片和染色方案
将组织切片切割成5微米厚并安装在带正电荷的载玻片上以用于免疫组织化学分析。所用的一抗：兔mAb EphA2(D4A2)(Cell Signaling Technology-22050BF)，以1:1000稀释度至2μg/ml的工作浓度使用。测试了一定范围的浓度，并且可接受的浓度被确定为低至1μg/ml且最高至10 μg/ml(图8)。
所用的标记聚合物：En Vision+System-HRP标记聚合物抗兔(DAKO K400311)
一般程序
1.+脱蜡
2.+抗原修复：在102℃下25分钟
3.+内源酶封闭(过氧化物酶处理)：10分钟
4.+缓冲液冲洗：4分钟
5.+蛋白质封闭：10分钟
6.+缓冲液冲洗：4分钟
7.+2μg/ml剂量的一抗，持续60分钟
8.+缓冲液冲洗：4分钟
9.+标记聚合物：30分钟
10.+缓冲液冲洗：4分钟
11.+Flex DAB+底物-色原：10分钟
12.+缓冲液冲洗：4分钟
13.+自动苏木精：6分钟
14.+缓冲液冲洗：4分钟
15.+盖玻片
定量流式细胞术
使用在先前实施例(实施例1)中表征的细胞系评价测定的性能。概括地说，使用qFACs对65个细胞系(其中的13个一式两份进行)中的每个细胞的 EphA2受体进行定量。EphA2表达范围为每个细胞422至143,888个受体。
福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)细胞沉淀物
处理每个细胞系以扩增和处理以模拟临床样品，从而导致产生福尔马林固定的石蜡包埋的细胞沉淀物。概括地说，将细胞扩增至50-200百万个细胞，用PBS洗涤，用0.05％胰蛋白酶进行胰蛋白酶处理，离心并在PBS中洗涤，在10％福尔马林中固定2-4小时，然后将其转换为70％乙醇。将细胞在4℃下在70％乙醇中储存至多一周。以1x105/μl组织凝胶的密度将细胞包埋在组织凝胶中。在石蜡包埋处理器中进行标准处理之前，将组织凝胶包埋的细胞沉淀物储存在70％乙醇中。从FFPE块中，通过从每个块中提取2mm核心并将它们转移到细胞阵列块而产生细胞阵列。
细胞系转染
为了产生EphA2过表达细胞系，我们使用了准备出发(ready to go)颗粒(GeneCopoeia,Rockville,MD)。该构建体基于pReceiver-Lv105，一种嘌呤霉素可选择的慢病毒载体。
EphA2基因信息：NM_004431.1。病毒目录号：LP-A0125-LV105-0205。信息和方案可以在www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigm a/General_Information/lentiviraltransdprotocol.pdf下载。
然而，我们根据需要调整和修改了感染方案。我们的IGROV-1细胞系方案如下进行：第1天，将细胞计数并接种到96孔(100ul培养基中每孔4,000 个细胞)板中；第2天，1)移除培养基并添加含有聚凝胺[有效浓度8μg/ml] 和5μl[低MOI]或30ul[高MOI]EphA2表达病毒的100μl感染溶液。2a)在室温下以2300rpm旋转90分钟并在37℃的培养箱中放置过夜。2b)如果细胞显示出聚凝胺敏感性，则在孵育6h后，在同一天添加150μl/孔的新鲜生长培养基。2c)可选地，将聚凝胺最终浓度降低至4μg/ml。2d)如果细胞对长时间旋转显示出敏感性，则将时间减少至30分钟并将温度增加至30℃；第3天，移除所有培养基并用200μl新鲜生长培养基替换，第4天休息，第5天通过用含有2μg/ml嘌呤霉素的生长培养基替换培养基来开始5天嘌呤霉素选择，并且第6天通过FACS或类似方法测试EphA2表达水平。
验证方法
为了评估测定内和测定间精确度，将载玻片一式三份一起染色三次，从而产生染色的载玻片(运行1.1、运行1.2、运行1.3、运行2.1、运行2.2、运行2.3、运行3.1、运行3.2、运行3.3)。由两个不同的操作员在不同的日子(第 1天、第3天、第5天)进行染色运行。1)第1天-注意：用于测定内精确度的测定运行也代表了测定间精确度第1天的样品。2)第3天-将在来自第1天所用的相同TMA块的第二重复组的3个未染色载玻片上重复测定。3)第5天- 将在来自第1天和第3天所用的相同TMA块的第三重复组的3个未染色载玻片上重复测定
显微镜检查和图像分析
用AperioBF Scanscope(Leica Biosystems,Buffalo Grove IL)在20X放大倍数下收集图像。使用利用Matlab(Mathworks,Natick,MA)开发的内部算法和用户界面进行EphA2褐色信号的定量。概括地说，使用基于半自动阈值的算法对细胞或组织区域进行分割，其中用户可以改变阈值或手动包括或排除区域。核心注释工具用于将核心与样品ID进行匹配，对于每个图像，由用户对其进行质量控制。存储快照图像以用于进一步QC。使用更高分辨率的组织分割算法来收紧组织或细胞周围的掩码。从每个核心，通过将RGB图像转换为色彩空间CYMK并使用黄色通道作为褐色的最佳代表来计算平均褐色染色强度。将捕获TMA内的每个细胞系或肿瘤的平均褐色信号强度，并用于灵敏度、特异性和精确度计算。
统计分析
使用JMP(SAS,NC)进行所有统计分析。对于细胞系CA022515的分析，进行线性回归以评估EphA2 IHC褐色强度相对EphA2受体/细胞的线性，并且使用R2作为线性的度量。进行分区分析以评价该测定对EphA2+细胞系相对EphA2-细胞系进行分类的能力(使用我们预先确立的约3,000个受体/细胞的机械学界定值)。还进行了分区分析以评价该测定基于约17,500个受体/细胞的第二界定值对EphA2-细胞系相对EphA2+细胞系相对EphA2++细胞系进行分类的能力。通过计算每个细胞系的CV、线性回归的斜率和分区分析的界定值来评估测定内和测定间变异性。对于HTMA060915的分析，通过计算 TMA的每个肿瘤样品的变异系数(CV)来评估测定内和测定间变异性。对于细胞系CA111014的分析，当将其与亲本细胞系相比较时定性评估EphA2过表达细胞系中EphA2的染色模式。
使用IHC染色定量图像分析与定量流式细胞术的相关性确定灵敏度和特异性以及精确度
优化IHC测定，以使能够将细胞系分类成EphA2-、EphA2+、EphA2++。我们使用我们的细胞系组并测试了几种浓度的一抗，保持方案的所有其他参数相同。我们测试了0、1μg/ml、2μg/ml、6μg/ml、10μg/ml和20μg/ml的一抗。我们发现该测定是高度可调的，并且通过ROC的AUC计算的误差对于1μg/ml、2μg/ml和5μg/ml为<10％并且对于10μg/ml和20μg/ml为11％和14％。在20μg/ml下，细胞系的上部范围饱和。为了实现基于病理学家的信号检测，我们通过眼睛评价了褐色染色的强度，发现10与14之间的强度是不可见的，因此我们选择2μg/ml的浓度，其可以通过眼睛实现染色的评分。
为了评估EphA2 IHC测定的灵敏度和特异性以及精确度，将含有78个细胞系的含有65个独特细胞系的块切片并染色，所述细胞系具有已知的不同水平的EphA2表达。通过分析EPhA2褐色染色相对每个细胞的受体来评估相关性和线性(图9)。还进行了分区分析和ROC分析以证实灵敏度和特异性 (表6)。先前的实验已经证明，3,000个受体/细胞是该测定的灵敏度，并且用于将细胞系定义为阳性或阴性以用于分区分析(表6)。细胞系的进一步聚类允许鉴定约17,500个受体/细胞的第二基于体外的界定值。将两个界定值组合在一起，我们将细胞系分为三组EphA2-、EphA2+、EphA2++。使用分区分析，我们评估了定量IHC对细胞系进行分类的能力(表7)。
表6.EphA2-/+细胞的分区分析
IHC测定能够可再现地对EphA2-细胞系和EphA2+细胞系进行分类，误差<10％。运行内和运行间变异性极小。
表7.通过分区分析对IHC界定值定量，实现EphA2-细胞相对EphA2+ 相对EphA2++细胞系的分类
IHC测定还能够以2％至3％范围内的误差将EphA2细胞系可再现地分类，以22％至10％范围内的误差将EphA2+细胞系可再现地分类，并且以10％至7％范围内的误差将EphA2++细胞系可再现地分类。界定值的内和间精确度在运行之间和运行之内显示出非常低的变异性。
还通过在细胞系水平上计算CV来评估定量图像分析的内和间精确度。在所有细胞系中计算得到的CV显示出在1.28％-1.55％范围内的测定内平均 CV，其中最大CV为6.2％。对于测定间，平均CV为2.24％，最大CV为23.8％，其中>95％的细胞系具有<20％的CV。
使用组织微阵列的精确度
使用TMA样品的精确度运行由三个重复载玻片的三个染色日组成，并由两个操作员进行。以下是该运行的描述：
将在由不同的操作员(操作员间)进行，并在不同的仪器(仪器间)上染色的相同的免疫组织化学染色批次内(测定内)、单独的免疫组织化学染色批次上(测定间)评估染色的可再现性的测定内和测定间精确度。从包括基质和肿瘤组织的每个核心提取平均褐色强度(单位)。计算该运行内的每个核心的CV(测定内)，并且使用该运行内的三个载玻片的平均值计算核心之间的CV(测定间)(表3)。总体而言，没有核心达到20％的％CV最大允许水平，并且大多数低于10％。中位测定内CV为2.9％，其中25％百分位数为2％并且75％百分位数为4.76％。中位测定间CV为2.6％，其中25％百分位数为1.5％并且75％百分位数为3.9％。测定内和测定间变异性与平均褐色强度无关(表8)。
表8.肿瘤样品中的测定内变异性
使用EphA2转染的细胞系测试EphA2 IHC CDx的特异性。
通过qFACs发现IGROV-1细胞系具有最低EphA2表达水平，这也使用 EphA2 IHCCDx在细胞沉淀物中观察到。我们使用慢病毒构建体过表达 EphA2并通过qFACS确认表达。亲本IGROV-1细胞具有约1,000个EphA2 受体/细胞，而IGROV-1-EPhA2具有约10000个受体/细胞。由于我们的机械学界定值是3,000个受体/细胞，因此转染能够生成EphA2+IGROV细胞系。中等表达还允许我们定性评估测定的灵敏度。由于分析仅限于比较两个配对细胞系，我们对染色模式进行了定性评估并在报告中包括了细胞系的快照(图 10)。EphA2 IHC CDx仅在高EphA2+细胞系中显示出细胞膜染色，而在亲本细胞系中不显示。
EphA2 IHC评分指南
对照载玻片
1.评价对照载玻片
a)如果不满足质量控制标准，那么该运行被视为失败并且不应对样品 EphA2 IHC进行评分。
b)应评价接近阈值的EphA2+细胞系的染色强度，并将其用作染色强度的标准。
c)组织样品的H&E染色切片被推荐用于第一次评价。(当观察用EphA2 IHC染色的样品时，肿瘤可能不明显。H&E染色允许病理学家验证肿瘤细胞的存在。
2.继续进行到对样品评分。评价并报告阳性癌细胞和肿瘤相关血管的百分比。使用决策矩阵鉴定样品的EphA2总分(+或-)。
表9：IHC的QC标准定义(对照载玻片)(如果不满足≥2QC标准，那么对照载玻片失败)
癌细胞评分(IHC)
图13提供了IHC评分指南。
目标是估计阳性癌细胞的百分比，这与染色强度无关。染色强度仅被参考以促进评分指南。
-评价EphA2染色切片以估计在低倍第一4x放大倍数下显示出膜染色的肿瘤细胞的百分比。
-为了验证具有膜染色的染色肿瘤细胞的百分比，使用10x放大倍数。应使用样本的良好保存且良好染色的区域确定阳性肿瘤细胞的百分比
标准
如果染色强烈但包括细胞膜和细胞质染色模式的混合物或如果染色非常暗淡的话，使用20X和40X确认细胞膜位置的存在。
·具有平均强度(++或+++)但主要是细胞质位置的明显染色的癌细胞应被视为EphA2+并且包括在阳性细胞百分比的估计中
·具有暗淡(+)细胞膜染色的癌细胞应被视为EphA2+并且包括在阳性细胞百分比的估计中
·具有仅跨越细胞膜的一部分的不完全膜染色的癌细胞应包括在阳性细胞百分比的估计中。
·具有暗淡的(+)弥散细胞质染色而没有细胞膜模式的癌细胞应排除。
·强烈细胞膜染色与弱且阴性的癌细胞的混合模式
·在暗淡(+)细胞(黑色箭头)中确认细胞膜位置所需的20x和/或40x。红色箭头示出具有几乎检测不到的弥散的暗淡(+)细胞质染色的阴性细胞。
肿瘤相关血管(TAV)评分指南
目标是估计含有至少一个阳性TAV的高倍视野的百分比，其与染色强度无关。
评价EphA2切片以估计在低倍第一10x放大倍数下具有至少一个 EphA2+TAV的阳性高倍视野的百分比。
方法
1.确定肿瘤区域中或周围包括高微血管密度和/或内皮染色证据的3-4个低倍视野(推荐10x)
2.对于每个低倍视野，在可能的情况下，对于12的总高倍视野数，确定3个高倍视野，40x放大倍数
3.评价EphA2内皮染色的存在
4.仅当一个或多个血管被完全或部分染色时，视野才被视为阳性的。
5.报告阳性和总高倍视野的数量
标准
·EphA2+TAV的评估应限于包括癌细胞的组织片段。良性片段应从分析中排除。
·TAV定义为距离肿瘤区域≤2mm内的血管。距离肿瘤区域>2mm的血管应从分析中排除。
·似乎是基质的但不明确是血管的染色应排除。这适用于非特异性染色和成肌纤维细胞。
·可以看到血清染色并且可能潜在地干扰内皮染色评估。具有弱的内皮染色和血清染色的血管不应排除在外。
·在更高放大倍数下确认在10x下观察到的EphA2阳性TAV
·当血清染色伪影妨碍内皮评估时排除
·当染色不确切是内皮时排除
实施例3：靶向EphA2的多西紫杉醇前药纳米脂质体
靶向EphA2的纳米脂质体优选是单层脂质双层囊泡，直径大约为110 nm，其包封含有多西紫杉醇前药的含水空间，所述多西紫杉醇前药在治疗部位存在的pH下转化为多西紫杉醇。
图12是示出包封多西紫杉醇前药的聚乙二醇化的靶向EphA2的脂质体的结构的示意图。脂质体包括与脂质体结合(例如，通过共价结合的PEG-DSPE 部分)的肝配蛋白A2(EphA2)靶向部分，诸如scFv。包封多西紫杉醇前药的聚乙二醇化的靶向EphA2的脂质体可以通过以下方式产生：将识别EphA2 受体的单链Fv(scFv)抗体片段共价缀合至含有呈本文所述的前药形式的多西紫杉醇的聚乙二醇化的脂质体，从而产生免疫脂质体药物产品。
优选地，多西紫杉醇前药包含通过酯键引入多西紫杉醇的2'羟基基团以形成多西紫杉醇前药的弱碱，诸如叔胺。适于装载到脂质体中的优选的2'-多西紫杉醇前药的特征在于在酸性pH下相当高的稳定性，但在生理pH下通过简单的水解转化成多西紫杉醇。
多西紫杉醇前药在储存期间以及当完整脂质体处于一般循环中时在脂质体内部可以是稳定的，但是在从脂质体中释放并进入循环血液的环境时迅速水解(例如，t1/2＝～10h)为活性多西紫杉醇。
多西紫杉醇前药可以在温和的酸性pH下装载并使用电化学梯度包埋在脂质体的酸性内部，其中所述前药稳定处于不溶形式。
多西紫杉醇生成性脂质体可包含EphA2靶向部分。如本文所用，除非另外指明，术语“抗-EphA2 scFv”是指免疫特异性结合EphA2，优选EphA2的 ECD的scFv。EphA2特异性scFv优选不与EphA2蛋白中不存在的抗原结合。靶向部分可以是单链Fv(“scFv”)，一种可以与脂质体共价结合以靶向本文公开的产生多西紫杉醇的脂质体的蛋白质。scFv可以由单个多肽链组成，其中 VH和VL彼此共价连接，通常通过允许形成由VH和VL CDR组成的功能性抗原结合位点的接头肽。Ig轻链或重链可变区由与三个超变区(也称为“互补决定区”或“CDR”)交替的多个“框架”区(FR)组成。
在某些实施方案中，本文公开的scFv包括表10中列出的VH FR1、VH FR2、VH FR3、VL FR1、VL FR2以及VL FR3中的一个或任何组合。在一个实施方案中，scFv含有下表10的序列的框架。
表10：示例性框架序列
VH FR1(SEQ ID NO:1) QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS
VH FR2(SEQ ID NO:2) WVRQAPGKGLEWVT
VH FR3(SEQ ID NO:3) RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
VH FR4(SEQ ID NO:4) WGQGTLVTVSS
VL FR1(SEQ ID NO:5) SSELTQPPSVSVAPGQTVTITC
VL FR2(SEQ ID NO:6) WYQQKPGTAPKLLIY
VL FR3(SEQ ID NO:7) GVPDRFSGSSSGTSASLTITGAQAEDEADYYC
VL FR4(SEQ ID NO:8) FGGGTKLTVLG
在某些方面，本文公开的scFv是热稳定的，例如，由此使得scFv非常适合于稳健和可缩放的制造。如本文所用，“热稳定的”scFv是具有大于67℃或至少约70℃的解链温度(Tm)的scFv，例如，如使用差示扫描荧光法(DSF) 所测量的。
优选的抗-EphA2 scFv结合EphA2多肽的细胞外结构域，即EphA2蛋白的跨越GenBank登录号NP_004422.2或UniProt登录号P29317中所列出的序列的至少氨基酸残基25至534的部分。
在某些实施方案中，本文公开的抗-EphA2 scFv包括VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2以及VL CDR3，各自具有如表11 中列出的序列。应注意，VH CDR2序列(也称为CDRH2)将是选自表11中列出的18个不同VH CDR2序列中的任一个。
表11：互补决定区(CDR)
VH CDR1(SEQ ID NO:9) SYAMH
VH CDR2(SEQ ID NO:10) VISPAGNNTYYADSVKG
VH CDR2(SEQ ID NO:11) VISPAGRNKYYADSVKG
VH CDR2(SEQ ID NO:12) VISPDGHNTYYADSVKG
VH CDR2(SEQ ID NO:13) VISPHGRNKYYADSVKG
VH CDR2(SEQ ID NO:14) VISRRGDNKYYADSVKG
VH CDR2(SEQ ID NO:15) VISNNGHNKYYADSVKG
VH CDR2(SEQ ID NO:16) VISPAGPNTYYADSVKG
VH CDR2(SEQ ID NO:17) VISPSGHNTYYADSVKG
VH CDR2(SEQ ID NO:18) VISPNGHNTYYADSVKG
VH CDR2(SEQ ID NO:19) AISPPGHNTYYADSVKG
VH CDR2(SEQ ID NO:20) VISPTGANTYYADSVKG
VH CDR2(SEQ ID NO:21) VISPHGSNKYYADSVKG
VH CDR2(SEQ ID NO:22) VISNNGHNTYYADSVKG
VH CDR2(SEQ ID NO:23) VISPAGTNTYYADSVKG
VH CDR2(SEQ ID NO:24) VISPPGHNTYYADSVKG
VH CDR2(SEQ ID NO:25) VISHDGTNTYYADSVKG
VH CDR2(SEQ ID NO:26) VISRHGNNKYYADSVKG
VH CDR2(SEQ ID NO:27) VISYDGSNKYYADSVKG
VH CDR3(SEQ ID NO:28) ASVGATGPFDI
VL CDR1(SEQ ID NO:29) QGDSLRSYYAS
VL CDR2(SEQ ID NO:30) GENNRPS
VL CDR3(SEQ ID NO:31) NSRDSSGTHLTV
在包封多西紫杉醇前药的聚乙二醇化的靶向EphA2的脂质体的一个特定实例中，脂质膜可由N-(十六烷酰基)-4-鞘氨醇-1-磷酸胆碱(卵鞘磷脂)、胆固醇、以及1，2-二硬脂酰-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇(PEG-DSG)组成。纳米脂质体可以分散在含水缓冲溶液中，诸如配制用于肠胃外施用于人的无菌药物组合物。聚乙二醇化的靶向EphA2的脂质体可包括以下TS1(SEQ ID NO：40)、 D2-1A7(SEQ ID NO：41)或scFv3(SEQ ID NO：46)的靶向部分：
TS1 AA(SEQ ID NO：40)
D2-1A7 scFv AA(SEQ ID NO：41)
scFv3 AA(SEQ ID NO：46)
示例性的靶向EphA2的多西紫杉醇生成性纳米脂质体组合物命名为“46scFv-ILs-DTXp3”，其为包含命名为化合物3的式(I)化合物的靶向脂质体，所述化合物包封在由重量比为约4.4∶1.6∶1的卵鞘磷脂、胆固醇和PEG-DSG 形成的脂质囊泡中，其中SEQ ID NO：46的scFv附接至脂质囊泡(以提供对 EphA2的靶向)，其重量比为脂质囊泡中鞘磷脂总量的约1∶142。
优选的靶向EphA2的多西紫杉醇生成性纳米脂质体组合物的两个具体实例是46scFv-ILs-DTXp3(即，包含附接至包封本文的多西紫杉醇前药化合物3 的免疫脂质体的SEQ ID NO:46的scFv的靶向EphA2的多西紫杉醇生成性纳米脂质体组合物)和46scFv-ILs-DTXp4。另选的优选实施方案可包括靶向 EphA2的多西紫杉醇生成性免疫脂质体，其具有：
(1)脂质囊泡，其使用为靶向免疫脂质体提供期望的血浆稳定性的任何合适的比率的一种或多种不带电荷的脂质组分(例如，胆固醇或其他组分，诸如二酰基甘油、酰基(聚醚)和/或烷基聚(醚))、一种或多种中性磷脂(例如，二酰基磷脂酰胆碱、鞘磷脂、和/或二酰基磷脂酰乙醇胺)以及聚乙二醇化的脂质组分配制而成；
(2)适于装载到免疫脂质体中的多西紫杉醇前药(例如，使用捕集剂，诸如蔗糖八硫酸盐或其他磺化多元醇)，诸如本文的式(I)化合物(优选式(I)的多西紫杉醇前药化合物，其中n为1-4(优选2或3)并且R1和R2各自独立地为C1-C4烷基(优选C2或C3烷基)；更优选地，式(I)的多西紫杉醇前药化合物，其中n为2或3，并且R1和R2各自独立地为C1-C3烷基；最优选地，式(I)的多西紫杉醇前药化合物，其中n为2或3，并且R1和R2各自独立地为乙基)；
(3)包含scFv部分的脂质囊泡，所述scFv部分包含SEQ ID NO:9的VH CDR1、SEQ IDNo:11-27中的任一个的VH CDR2、SEQ ID NO:28的VH CDR3、SEQ ID NO:29的VL CDR1、SEQID NO:30的VL CDR2，以及SEQ ID NO:31的VL CDR3，其附接至聚乙二醇化的脂质，从而形成脂质体囊泡(例如，PEG-DSPE)；以及
(4)围绕靶向EphA2的多西紫杉醇生成性免疫脂质体以形成无菌药物产品的缓冲组合物，其包括缓冲体系(例如，柠檬酸和柠檬酸钠)、等渗剂(例如，氯化钠)以及作为稀释剂的无菌水载体(例如，注射用水)。
实施例4：肝配蛋白受体A2(EphA2)的纳米脂质体靶向：临床转化
肝配蛋白受体A2(EphA2)是在几种实体肿瘤中高度过表达的肝配蛋白家族的细胞-细胞接合蛋白的一部分，并且与预后不良有关。我们开发了一种新型的靶向EphA2的多西紫杉醇纳米脂质体，其通过增强的渗透性和保留效应以及通过EphA2靶向实现的细胞特异性充分发挥器官特异性。该研究的目标是开发能够在未来的MM-310试验中实现基于EphA2的排除标准的临床实施的诊断框架。
我们使用qFACS和脂质体(Ls)-细胞相互作用的体外测定来确定能够实现Ls的抗体介导的内化的EphA2受体的最小数量。我们开发了能够区分 EphA2-细胞系和EphA2+细胞系的IHC测定。我们在各种适应症的肿瘤样品中表征EphA2染色模式，并开发了一种允许在早期临床试验中选择患者的评分算法。
虽然非靶向Ls不与细胞体外缔合，但在EphA2表达与EphA2-Ls细胞缔合之间存在强烈的相关性，这与细胞系来源无关。我们使用非靶向Ls来确定可以实现的非特异性结合的程度(～340个Ls/细胞)并使用分区来确定介导靶向所必需的EphA2受体的最小数量(～3000个受体/细胞)。我们已经开发并验证了针对EphA2的qIHC测定(精确度～90％，线性0.8且再现性CV<5％)。我们将来自各种适应症的一组～200个肿瘤样品染色。发现EphA2在肿瘤细胞、肿瘤相关性成肌纤维细胞以及肿瘤相关血管中表达。使用10％的包括性界定值，在所评价的肿瘤类型中发现EphA2检出率在50％至100％的范围内。在匹配的样品中，在转移性肿瘤与原发性肿瘤之间未观察到染色的显著差异。
概括地说，我们开发了一种用于基于机械学单细胞界定值前瞻性选择用于MM-310试验的EphA2+患者的诊断框架，以及一种临床级IHC测定。
表13
图14A示出阳性肿瘤细胞百分比相对阳性肿瘤相关血管百分比的散点图。在各种所测试的肿瘤类型中可以看到几种不同的表达模式。在膀胱癌中，大多数患者在肿瘤细胞和肿瘤相关血管中呈阳性，在两个区室中均具有非常高的阳性百分比。在胃癌中，分布更均匀，并且在EphA2+患者中存在广泛范围的表达水平(在任何区室中>＝10％)。非小细胞肺癌(NSCLC)和卵巢癌在更接近肿瘤相关血管的位置处显示出更重的分布，而头颈癌和胰腺癌相比于肿瘤相关血管在肿瘤细胞中具有高表达。
为了评估疾病进展期间的EphA2表达演化，我们评价了EphA2在相同患者的匹配的原发性/转移性样品中的表达。我们获得了两组样品(1)12名患者的所有适应症组、(2)10名患者的膀胱癌组。EphA2表达在两组中的原发性与转移性之间是一致的，在所有适应症组和膀胱癌组中分别具有91％和90％的一致性。
使用体外细胞结合数据确定允许靶向脂质体摄取的最小数目的EphA2/ 细胞。对在福尔马林固定的石蜡包埋的组织中的EphA2的免疫组织化学测定进行分析验证并且用于由若干适应症调查人肿瘤。在肿瘤细胞、基质以及肿瘤相关血管中观察到EphA2，并且所述EphA2在匹配的原发性肿瘤和转移瘤中一致地表达。根据前瞻性筛查结果，EphA2阴性患者将从临床试验中排除。当患者结果数据可用时，将使用EphA2区室贡献的回顾性分析精化入选标准，以最好地服务将受益于MM-310的患者。

Claims (15)

1.一种治疗人患者的EphA2阳性人癌症的方法，所述方法包括施用治疗有效量的包封在包含靶向EphA2的抗体的脂质体中的多西紫杉醇前药，以治疗所述人患者的所述癌症。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述EphA2阳性人癌症包括每个细胞具有至少3,000个EphA2的癌细胞。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述靶向EphA2的scFv抗体包含特异性结合EphA2的表位的分离的单克隆抗体，其中所述表位与包含SEQ ID NO:41的scFv部分特异性结合。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多西紫杉醇前药包含式(I)的化合物。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多西紫杉醇前药选自化合物1-6，或其药学上可接受的盐。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多西紫杉醇前药是包封在脂质体中的化合物3的蔗糖八硫酸盐。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多西紫杉醇前药是包封在脂质体中的化合物6的蔗糖八硫酸盐。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述肿瘤中至少10％的所述细胞过表达EphA2并且/或者至少10％的所述肿瘤相关血管细胞过表达EphA2。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述肿瘤细胞和/或所述肿瘤相关血管细胞包括每个细胞具有平均至少3,000个EphA2受体的癌细胞。
10.一种用于鉴定具有EphA2阳性人癌症肿瘤的人患者的脂质体-细胞缔合方法，所述方法包括获得所述肿瘤的组织样品，以及确定所述肿瘤中至少10％的所述细胞过表达EphA2并且/或者至少10％的所述肿瘤相关血管细胞过表达EphA2。
11.根据权利要求7所述的方法，其中所述肿瘤细胞和/或所述肿瘤相关血管细胞包括每个细胞具有平均至少3,000个EphA2受体的癌细胞。
12.根据权利要求7所述的方法，其中所述肿瘤细胞每个细胞具有至少平均17,500个EphA2受体。
13.一种用于鉴定具有EphA2阳性人癌症肿瘤的人患者的脂质体-细胞缔合方法，所述方法包括获得所述肿瘤的组织样品，以及确定所述肿瘤中至少10％的所述细胞以2+范围(17,500个受体/细胞)过表达EphA2并且/或者至少10％的所述肿瘤相关血管细胞过表达EphA2。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所治疗的所述肿瘤是实体肿瘤。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述实体肿瘤选自卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌以及前列腺癌的列表。
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