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DE68926245T2 - Nachweis der basismembrankomponenten, diagnose von krebs und sonstigen krankheiten - Google Patents

Nachweis der basismembrankomponenten, diagnose von krebs und sonstigen krankheiten

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Publication number
DE68926245T2
DE68926245T2 DE68926245T DE68926245T DE68926245T2 DE 68926245 T2 DE68926245 T2 DE 68926245T2 DE 68926245 T DE68926245 T DE 68926245T DE 68926245 T DE68926245 T DE 68926245T DE 68926245 T2 DE68926245 T2 DE 68926245T2
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DE
Germany
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antibody
basement membrane
complexes
absence
detecting
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Stefan Paskell
Aken Morgan Van
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Original Assignee
Bard Diagnostic Sciences Inc
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Publication date
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Description

    Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Diagnose von Krankheiten, wie z.B. Krebs, die zur Freisetzung von Komplexen aus Basalmembrankomponenten führen. Diese Erfindung betrifft genauer gesagt den Nachweis der Komplexe durch physikochemische und immunologische Verfahren.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Seit ihren Anfängen ist für die Medizin die Entwicklung von Verfahren, die einen schnellen und zuverlässigen Nachweis von Krankheiten erlauben, eine Herausforderung gewesen. Trotz Fortschritten in der Diagnosetechnologie über die Jahre hinweg sind die gegenwärtigen Techniken für die Diagnose vieler Krankheiten entweder unzulänglich oder sie verbieten sich für eine weitverbreitete Anwendung aus Kostengründen. Eine derartige beispielhafte Krankheit ist Blasenkrebs.
  • Es wird geschätzt, daß, als ein weltweites Problem, es 50.900 neue Fälle von Blasenkrebs pro Jahr in Westeuropa, 3.700 in Japan und 34.000 in Nordamerika (WHO 1984) gibt, wobei mindestens drei- bis viermal diese Anzahl von Patienten die Hospitäler für Nachfolgeuntersuchungen oder Behandlungen aufsuchen.
  • Blasenkrebs tritt in zwei Hauptformen auf: oberflächlich und invasiv. Etwa 70 % der oberflächlichen Tumore werden innerhalb eines Nachfolgezeitintervalls von 5 Jahren ein oder mehrere Rezidive entwickeln.
  • Die invasive Form von Blasenkrebs macht etwa 20 % bis 30 % aller Blasenkrebserkrankungen aus. Invasiver Blasenkrebs beginnt in der Mucosa, die die Blase auskleidet, dringt durch die Basalmemoran, um Muskelwand- und schließlich das Beckengewebe und umgebende Organe, einschließlich lokaler Lymphknoten, zu erreichen. Die Aussicht hängt vom Stadium ab, mit 5-Jahresüberlebenszeiten von 11 % bis 60 %. Die Behandlung erfolgt durch Strahlentherapie, Chemotherapie und
  • Patienten mit invasiven Blasentumoren werden durch Zytologie und Kontrollzystoskopie überwacht. Obwohl die Zytologie eine nichtinvasive und weniger schwierige Verfahrensweise ist, kann sie für Fehler oder Unsicherheiten anfällig sein. Zum Beispiel kann ein positives cytologisches Ergebnis hilfreich sein, aber ein negatives Ergebnis kann nicht als Beweis für die Abwesenheit eines Tumors gelten. Weiterhin schwankt der Bericht stark mit der Erfahrung der Zytologen. Zystoskopie ist eine invasive, teure und gelegentlich gefährliche Verfahrensweise, da sie häufig unter Narkose durchgeführt wird. Trotz der Unsicherheiten, die mit den zystoskopischen Kontrollen verbunden sind, werden sie nichtsdestoweniger noch von vielen praktizierenden Ärzten als das diagnostische Mittel der Wahl betrachtet, weil bessere Test fehlen.
  • Es herrscht allgemein Zustimmung, daß zuverlässige Tests für das Vorhandensein von invasivem Blasenkrebs nicht nur für den Anfangsnachweis hilfreich wären, sondern auch für die Wiedererkrankungen und folglich bei der Behandlung von Patienten mit histologisch erwiesenem Blasenkrebs helfen. Wenn ein solcher zuverlässiger Test verfügbar wäre, dann könnte er verwendet werden, um Risikopersonen, z.B. Männer über 60 Jahren, zu screenen. Weiterhin sollte ein Test, der nicht vom makroskopischen Sichtbarmachen eines Tumors abhängt, den Nachweis in einem früheren Stadium erlauben.
  • Verschiedene Tumormarker sind hinsichtlich ihres Potentials als Werkzeuge für die Diagnose von Blasenkrebs evaluiert worden. Positive Serumtests für Tumormarker, wie z.B. das carcinoembryonische Antigen (CEA) sind gewöhnlicherweise beschränkt auffortgeschrittene Tumoren. Weiterhin ist gezeigt worden, daß Harninfektionen falsch positive Ergebnisse verursachen.
  • Zusätzlich zur Verwendung von Tumormarkern sind verschiedene alternative Ansätze zur Diagnose von Blasenkrebs vorgeschlagen worden. Zum Beispiel sind mehrere Harnenzyme beschrieben worden mit bei Blasenkrebs erhöhter Harnaktivität. Jedoch wurde keines als in einem Screeningtest nützlich gefunden. Obwohl Antikörper gegen Harnwegsephithel und seine Tumoren zuerst als gewebsspezifisch betrachtet wurden, wurden in ähnlicher Weise von einigen gezeigt, daß sie Onkoentwicklungsantigene sind.
  • Die deutsche Patentanmeldung DE 34 10 049 von Timpl et al. beschreibt ein Verfahren zur immunologischen Bestimmung einer Domäne von Basalmembrankollagen mit einer Molekülmasse von 170.000 Dalton, die ein Hexamer aus Untereinheiten mit 28.000 Dalton darstellt. Die europäische Patentanmeldung 021 152 von Timpl beschreibt ein Verfahren für die immunologische Bestimmung von Basalmembranmaterial und eine neue Basalmembran, die dazu geeignet ist. Die europäische Patentanmeldung 198 259 von Timpl et al. beschreibt ein Verfahren zur immunologischen Bestimmung eines Heparinsulfatproteoglycans der Basalmembran. US-Patent Nr. 4,628,027 von Gay beschreibt Verfahren, die monoklonale Antikörper gegen Bindegewebeproteine verwenden. Chemical Abstracts 102:360, Zusammenfassung 109379f, 1985, beschreibt einen Antikörper für die Bestimmung von Basalmembranprotein der menschlichen Plazenta. Patent Abstracts of Japan 8:281, eine Zusammenfassung von JP 59-35144, beschreibt glomeruläres Basalmembran (GBM)-Antigen, das an Latexpartikeln angeheftet ist, zur Verwendung beim Nachweis von anti-GBM-Antikörper. US-Patent Nr. 4,264,766 von Fischer betrifft Latexzusammensetzungen, die aus Latexpartikeln bestehen, an die eine wasserlösliche Polyhydroxyverbindung kovalent gebunden ist. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 22:895, 1984, beschreibt heterogene und homogene Enzymimmunoassays. Bio/Technology 2:667, 1984 beschreibt Verwendungen von Protein A zu diagnostischen und therapeutischen Zwecken.
  • Obwohl die Unzulänglichkeit und Probleme bei der Diagnose einer speziellen Krebsart der Schwerpunkt der obengenannten Diskussion sind, ist Blasenkrebs nur ein typisches Beispiel. Die Diagnose von zahlreichen anderen Krankheiten, einschließlich anderer Arten von Krebs ebenso wie Nicht-Krebszuständen, weisen ähnliche Probleme auf.
  • Somit besteht in der Technik ein Bedarf für ein Verfahren zum Nachweis von Krankheiten, wie z.B. Krebsarten, welches schnell, genau, kosteneffektiv und angenehm ist. Die vorliegende Erfindung befriedigt diese Bedürfnisse und sieht weitere, damit verbundene Vorteile vor.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Kurz gesagt sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Screenen auf Krebs vor, der zur Freisetzung von Komplexen aus einer oder mehreren Basalmemörankomponenten führt, welches die Schritte umfaßt:
  • Kontaktieren einer biologischen Flüssigkeit mit einer Suspension aus Latexkügelchen, die mit einem Blockierungsreagenz behandelt sind, und die in Gegenwart von Komplexen aus Basalmembrankomponenten agglutinieren, wobei besagte Agglutination nicht auf einer spezifischen Antikörper-Antigen-Wechselwirkung beruht; und
  • Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit von Agglutination besagter Suspension aus Latexkügelchen, und dadurch Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit besagten Krebses.
  • In einem verwandten Aspekt sieht die Erfindung ein Verfahren vor zum Screenen auf Krebs, der zur Freisetzung von Komplexen aus einer oder mehreren Basalmembrankomponenten führt, welches die Schritte umfaßt:
  • Kontaktieren einer biologischen Flüssigkeit mit einem Antikörper, der spezifisch ist für einen Komplex aus einer oder mehreren Basalmembrankomponenten; und
  • Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit von einem oder mehreren Immunkomplexen, die zwischen besagtem Antikörper und besagtem Komplex gebildet werden, und dadurch Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit besagten Krebses.
  • Entsprechend der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren vorgesehen zum Nachweis der Anwesenheit von Komplexen aus Basalmemörankomponenten in einer Probe, welches die Schritte umfaßt:
  • Kontaktieren einer Probe mit einer Suspension aus Latexkügelchen, die mit einem Blockierungsreagenz behandelt sind, und die in Gegenwart von Komplexen aus Basalmembrankomponenten agglutinieren, wobei besagte Agglutination nicht auf einer spezifischen Antikörperantigen-Wechselwirkung beruht; und
  • Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit von Agglutination besagter Suspension aus Latexkügelchen, und dadurch Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit besagter Komplexe in besagter Probe.
  • Andere Aspekte der Erfindung werden unter Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung und die beigefügten Zeichnungen offensichtlich werden.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Fig. 1 ist ein Elutionsprofil des Urins eines Blasenkrebspatienten, der Gelfiltrationschromatographie unterzogen wurde.
  • Fig. 2 ist ein Elutionsprofil des Urins einer normalen Person, der Gelfiltrationschromatographie unterzogen wurde.
  • Genaue Beschreibung der Erfindung
  • Vor der Mitteilung der Erfindung kann es für ein Verständnis derselben hilfreich sein, die Definitionen bestimmter Bezeichnungen, die im folgenden verwendet werden, anzuführen.
  • Komplex - wie hierin verwendet, schließt die Assoziation von einer oder mehreren intakten Basalmembrankomponenten, Fragmenten derselben oder Kombinationen aus Fragmenten und intakten Komponenten ein.
  • Antikörper - wie hierin verwendet, schließt sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper ein; und kann ein intaktes Molekül, ein Fragment desselben oder ein funktionelles Äquivalent desselben sein; und kann gentechnologisch hergestellt sein; Beispiele von Antikörperfragmenten schließen F(ab')&sub2;, Fab', Fab und Fv ein.
  • Wie oben festgehalten sieht die vorliegende Erfindung Verfahren zum Nachweis von Krankheiten vor, die zur Freisetzung von Komplexen aus einer oder mehreren Basalmembrankomponenten führen. Basalmembranen sind extrazelluläre Matrizes, die parenchymale Zellen von Organen von Bindegewebemesenchym trennen. Normalerweise verbleiben parenchymale Zellen und Stromazellen auf ihrer entsprechenden Seite der Basalmembran ausgerichtet, selbst während der Organentwicklung und Gewebereparatur. Bestimmte Krankheiten sind in der Lage, Basalmembranen zu durchtrennen. Zum Beispiel dringen invasive Tumorzellen in die epitheliale und endotheliale Basalmembran ein und durchqueren diese während der aufeinanderfolgenden Stadien des metastatischen Prozesses. Lokale Desintegration der Basalmembran ist eines der ersten Ereignisse im metastatischen Prozeß und erfolgt an der Kontaktregion der Membran mit eindringenden Tumorzellen.
  • Die Basalmembran (auch als Basallamina bezeichnet) besteht aus mindestens mehreren identifizierten Proteinen und Peptidderivaten, einschließlich mehrerer spezifischer Typen von Collagen (z.B. Typ IV und Typ V), Laminin, verschiedener Formen von Zelladhäsionsmolekülen (CAMs), Proteoglycanen und Fibronektin. Basalmembrankomponenten und Fragmente derselben werden durch die Wirkung von invasiven Tumoren freigesetzt. Vermutlich sind proteolytische Enzyme, die durch Tumorzellen sekretiert werden, oder auf ihrer äußeren Oberflächenmembran, für diese Wirkung verantwortlich (Sab et al., Int. J. Cancer 30:669-673, 1982; Garbisa et al., Cancer Lett. 9:359-366, 1980). Nach der Freisetzung können Fragmente von Basalmembrankomponenten weiteren Abbau erfahren, enzymatisch oder andersartig, was zu kleineren Fragmenten führt.
  • In der vorliegenden Erfindung ist gefunden worden, daß zusätzlich zu keineren Fragmenten Komplexe aus Basalmembrankomponenten in nachweisbaren Konzentrationen in den biologischen Flüssigkeiten von Patienten fortbestehen, die ein invasives Krebsleiden haben. Zum Beispiel enthüllt die Fraktionierung des Urins von einem Patienten mit Blasenkrebs und von einer normalen Person (Fig. 1 bzw. 2) durch Gelfiltrationschromatographie, daß nur Urin vom Krebspatienten immunreaktives Mate rial, das von der Basalmembran stammt, mit einem relativen Molekulargewicht von mindestens 1,5 x 10&sup6; aufweist. Zusätzliche Charakterisierung dieses Materials mit hohem Molekulargewicht zeigt auch die Anwesenheit von Material an, das von der Basalmembran stammt, dargestellt durch Collagen und Laminin. Da das beobachtete Molekulargewicht über demjenigen dieser Komponenten der Basalmembran liegt, scheinen Komplexe vorhanden zu sein.
  • Es gibt mindestens zwei Erklärungen für das Auftreten von Komplexen aus Basalmembrankomponenten in den Körperflüssigkeiten von Patienten mit invasivem Krebs. Erstens kann Desintegration der Basalmembran durch einen eindringenden Tumor zur Freisetzung von Komplexen aus Basalmembrankomponenten führen. Diese Komplexe stellen Moleküle dar, die durch dieselbe Assoziation angelagert bleiben, wodurch die strukturelle Integrität in der intakten Membran aufrechterhalten wird. Solche Komplexe können aus einem Typ von Basalmembrankomponente oder mehr als einem Typ von Basalmembrankomponente und/oder Fragmenten von jeder zusammengesetzt sein. Zweitens kann Desintegration der Basalmembran durch einen eindringenden Tumor zur Freisetzung von individuellen Basalmembrankomponenten und/oder Fragmenten derselben führen. Komplexe können dann durch ihre Assoziation nach der Freisetzung von Zellen gebildet werden.
  • Die Assoziation von Basalmembrankomponenten und/oder Fragmenten, nach ihrer Freisetzung, um Komplexe zu bilden, kann von unspezifischen Wechselwirkungen, wie z.B. hydrophoben Wechselwirkungen zwischen apolaren Aminosäureresten herrühren. Andere Wechselwirkungen, die diese Assoziation fördern, können von einer spezifischeren Art und Weise sein, wie z.B. die Affinität von Fibronektin und Collagen für einander. Konsequenterweise können Komplexe, die aus einem Typ von Basalmembrankomponente bestehen, ebenso wie Komplexe aus mehr als einem Typ von Basalmembrankomponente nach dem Abbau einer Basalmembran durch einen Tumor gebildet werden. Zum Beispiel kann ein Komplex nur Collagen (und/oder Collagenfragmente) enthalten, oder er kann eine Mischung aus Collagen und Fibronektin (und/oder ihren Fragmenten) enthalten.
  • Die Einzigartigkeit eines besonderen Komplexes, oder besonderen Fragmentes, kann von dem beteiligten spezifischen Organ oder spezifischen Tumor, oder beidem herrühren. Es ist wahrscheinlich, daß die Zusammensetzung der Basalmembran von Organ zu Organ variiert, z.B. enthält die Basalmembran von neuralen Zellen ein einzigartiges Zelladhäsionsmolekül, n-CAM. In ähnlicher Weise können verschiedene Tumorzellinien verschiedene Proteasen exprimieren, die in der Metastase verwendet werden.
  • Eine weitere mögliche Quelle von Basalmembrankomponenten und/oder -Fragmenten ist die Tumorzelle. Man hat von bestimmten Tumorzellen gezeigt, daß sie Basalmembranproteine in vitro sekretieren (Alitab et al., Int. J. Cancer 27:755-761, 1981). Es ist möglich, daß eine oder mehrere der durch Tumorzellen sekretierten Basalmembrankomponenten ein Teil der gebildeten Basalmembrankomplexe ist.
  • Wie oben festgehalten sieht die vorliegende Erfindung zusätzlich zu einem physikochemischen Verfahren ein immunologisches Verfahren zum Nachweis einer Krankheit vor, die zur Freisetzung von Basalmembrankomplexen aus einer oder mehreren Basalmembrankomponenten führt. Dieses Verfahren umfaßt im allgemeinen zuerst Kontaktieren einer biologischen Flüssigkeit mit einem Antikörper, der spezifisch für ein Fragment einer Basalmembrankomponente oder einen Komplex aus einer oder mehreren Basalmembrankomponenten ist. Nachfolgend wird die Anwesenheit oder Abwesenheit von einem oder mehreren zwischen dem Antikörper und dem Fragment oder dem Komplex gebildeten Immunkomplexen nachgewiesen und dadurch eine Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit der Krankheit erlaubt.
  • Andere Krankheiten als invasive Krebsarten können ebenso zur Freisetzung von Fragmenten, intakten Molekülen und/oder Komplexen aus Basalmembrankomponenten führen. Zum Beispiel können solche Fragmente, intakte Moleküle und/oder Komplexe in Patienten mit Collagen-degenerativen Krankheiten oder Hepatitis nachgewiesen werden. Typische Krankheiten, die durch dieses Verfahren nachgewiesen werden können, schließen Krebsarten, Collagen-degenerative Krankheiten und Hepatitis ein Beispiele für nachweisbare Krebsarten schließen Urogenital-, Melanom-, Lungen- und Brustkrebsarten ein. Urogenitalkrebsarten schließen Blasen- und Prostatakrebsarten ein.
  • Die Art der biologischen Flüssigkeit, in der sich die Fragmente akkumulieren, hängt hauptsächlich vom Ort der Erkrankung ab. Es wäre für den Fachmann offensichtlich, eine spezielle biologische Flüssigkeit mit einer speziellen Krankheit zu assozueren. Typische Arten von biologischen Flüssigkeiten schließen Urin, Serum, Synovial- und Cerebrospinalflüssigkeit ein. Besonders bevorzugt sind Urin und Serum.
  • Obwohl polyklonale Antikörper in den Verfahren der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind monoklonale Antikörper bevorzugt. Da der Tumor Fragmente der Basalmembrankomponenten erzeugt, können potentielle antigenische Stellen, die auf der intakten Komponente nicht zugänglich sind, kreiert werden, oder auf einem Fragment exponiert werden. Solch neu kreierte oder exponierte Antigendeterminanten können als "Neoantigendeterminanten" bezeichnet werden. Monoklonale Antikörper können hergestellt werden, die spezifisch für ein Fragment einer Basalmembrankomponente, wie z.B. Collagen, sind. Da mindestens einige der Basalmembrankomponenten oder Fragmente derselben, in der Form von Komplexen vorliegen, können zusätzlich neue Antigenstellen gebildet werden. In der vorliegenden Erfindung werden monoklonale Antikörper gegen solche Basalmembrankomplexe hergestellt.
  • Polyklonale Antikörper können durch Immunisierung eines Tieres und nachfolgendem Sammeln seines Serums hergestellt werden. Es ist im allgemeinen bevorzugt, der Anfangsimmunisierung vor dem Sammeln der Seren eine oder mehrere Auffrischungsimmunisierungen folgen zu lassen. Monoklonale Antikörper werden im allgemeinen nach dem Verfahren von Kohler und Milstein (Nature 256:495-497, 1975; Eur. J. Immunol. 6:511-519, 1976) hergestellt. Kurz gesagt werden die Lymphknoten und/oder Milzen eines Tieres, dem ein Basalmembranfragment oder Komplex aus Fragmenten injiziert wurden, mit Myelomzellen fusioniert, um Hybridzeliinien ("Hybridome" oder "Klone") zu bilden. Jedes Hybridom sekretiert einen einzigen Typ von Immunglobulin, der spezifisch für das Fragment oder den Fragmentkomplex ist, und, ähnlich den Myelomzellen, das Potential zur unbeschränkten Zellteilung aufweist.
  • Ein gereinigtes Basalmembranfragment oder -komplex ("Basalmembranpräparation") wird zur Immunisierung verwendet. Vorzugsweise werden die Tiere mit mindestes je 100 ng der Basalmembranpräparation immunisiert, bevorzugtesterweise mit mehr als je 500 ng. Zur Immunisierung kann die Basalmembranpräparation an eine Festphasenmatrix adsorbiert sein, vorzugsweise an Nitrocellulosepapier. Das Papier wird dann in das Tier eingeführt. Techniken zur Einführung der adsorbierten Antigenpräparation schließen Implantation [US-Patent Nr. 4,689,220] oder Solubilisierung der festen Phase und Injektion des solubilisierten Materials (Knudsen, Anal. Biochem. 147:285-288, 1985) ein. Die Festphasenmatrix kann in einem geeigneten organischen Lösungsmittel (z.B. DMSO) solubilisiert werden und entweder mit Adjuvans oder physiologischer Kochsalzlösung gemischt werden, oder direkt injiziert werden.
  • Alternativ kann die Basalmembranpräparation in Abwesenheit einer festen Matrix und/oder eines Adjuvans injiziert werden. Die Injektion oder Implantation kann intraperitoneal, in den Fußballen, subkutan, intramuskulär oder intravenös, aber bevorzugterweise intraperitoneal erfolgen. Den Tieren kann auch Antigen, das mit Adjuvans komplexiert ist, wie z.B. Freundschem Adjuvans, injiziert werden. Eine einzelne oder mehrere Auffrischungsimmunisierungen werden verwendet. Zwischen einem und sieben Tagen vor dem Fusionsdatum, bevorzugterweise an den Tagen 1 bis 4, können intravenöse Injektionen der geeigneten Basalmembranpräparation täglich gegeben werden.
  • Zwischen 1 und 7 Tagen, bevorzugterweise 4 Tagen, nach der Verabreichung der letzten Auffrischungsimmunisierung werden die Milzen oder Teile davon von den immunisierten Tieren geerntet. Zu diesem Zeitpunkt können auch die Lymphknoten geerntet und in die Zellpräparation eingeschlossen werden. Die geernteten Organe werden fein zerkleinert unter Verwendung von Techniken, die die Struktur des Organs zerstören, die aber für die Lymphozyten nicht schädlich sind. Die Organe werden bevorzugterweise mit Scheren fein zerkleinert, durch einen Maschendraht gegeben und mit Wachstumsmedium gemischt, um die Präparation hinsichtlich Lymphozyten anzureichern. Das fein zerkleinerte und gesiebte Gewebe wird durch Zentrifugation geerntet, dann mit Wachstumsmedium gemischt, um eine Zellsuspension zu bilden. Die roten Blutzellen können durch Zugabe einer hypotonischen oder hypertonischen Lösung zur Zellsuspension lysiert werden. Ein bevorzugtes Verfahren zur Zellysis besteht darin, destilliertes Wasser zu den Suspensionen zuzugeben und die Suspensionen schnell in einen isotonischen Zustand mit einer hypertonischen Natriumchloridlösung zurückzuführen. Irgendwelches verbleibendes Gewebe kann durch Filtration durch Gaze entfernt werden.
  • Die geerntete Zellsuspension wird dann mit einer Myelomzellinie gemischt, bevorzugterweise einer, die syngeneisch zum immunisierten Tier ist. Myelomzellinien von verschiedenen Arten sind weit erhältlich durch, z.B. American Type Culture Collection, Rockville, Md. Myelomzellinien, die gewöhnlicherweise verwendet werden, schließen P3X63Ag8 (ATCC TIB 9), SP2/0-Ag14 (ATCC CRL 1581), FO (ATCC CRL 1646) und 210RCY-Ag1 (Galfre et al., Nature 277:131, 1979) ein. Eine bevorzugte Zellinie ist P3/NS1/1-Ag4-1, die im folgenden als NS-1 (ATCC TIB 18) bezeichnet wird. Die NS-1-Zellen werden bevorzugterweise getestet, um die Klonierungseffizienz des Stammes zu testen. Dies kann gemacht werden, indem der NS-Stamm auskloniert wird durch limitierende Verdünnung und Durchführung von Testfusionen mit den einzelnen NS-1-Klonen, um Kandidaten mit den höchsten Fusionseffizienzen zu finden.
  • Die Myelomzellen werden in einem geeigneten Säugerzellwachstumsmedium kultiviert, von denen eine Anzahl allgemein in der Technik bekannt und von kommerziellen Quellen erhältlich sind. Säugerzellinien werden routinemäßig zwischen 36ºC und 40ºC unter Bedingungen kultiviert, die einen optimalen pH-Wert zwischen 6,0 und 8,0, bevorzugterweise etwa pH 7,2, aufrechterhalten. Der pH kann durch die Verwendung einer Anzahl von Puffersystemen, die in der Technik bekannt sind, aufrechterhalten werden. Ein bevorzugtes Puffersystem umfaßt die Kultivierung von Zellen in einem Bicarbonatpuffer in einem befeuchteten Inkubator, der CO&sub2;, vorzugsweise etwa 7 % CO&sub2;, enthält.
  • Die Fusion zwischen den Lymphozyten aus dem immunisierten Tier und den Myelomzellen kann durch eine Anzahl von in der Literatur beschriebenen Verfahren durchgeführt werden. Diese Verfahren schließen die Verwendung von Polyethylenglycol (PEG) (Brown et al., J. Biol. Chem. 255:4980-4983, 1980) und Elektrofusion (Zimmermann und Vienken, J. Membrane Biol. 67:165- 182, 1982) ein; ein Elektrofusionsgenerator ist kommerziell erhältlich von Biotechnologies and Experimental Research, Inc., San Diego, Calif.
  • Nach der Fusion werden die Zellen in Kulturschalen mit mehreren Näpfen, vorzugsweise 96-Napf-Platten, auspiattiert. Ein Reagenz, das selektiv das Wachstum von fusionierten Myelomzellen gegenüber den nicht fusionierten Zellen erlaubt, wird dem Medium zugesetzt. Eine bevorzugte Selektionstechnik verwendet HAT (Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin)-Selektion. Andere Selektionstechniken können, abhängig von der verwendeten Myelomzellinie, auch verwendet werden.
  • Alternative Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper verwenden in vitro-Immunisationstechniken. Lymphozyten können aus lymphatischen Organen geerntet werden, wie z.B. Milz oder Lymphknoten, oder als periphere Blutlymphozyten aus Vollblut. Die Lymphozyten werden in Gegenwart der geeigneten Basalmembranpräparation in Kultur genommen. Oft werden gleichzeitig immunstimmulatorische Polypeptide zum Kulturmedium zugesetzt werden. Zu verschiedenen Zeiten nach der Kultivierung der Lymphozyten in vitro werden die Lymphozyten geerntet und mit einer Myelomzellinie fusioniert, wie oben beschrieben.
  • Andere Techniken zur Herstellung und Beibehaltung von Antikörper sekretierenden Lymphozytenzellinien in Kultur schließen virale Transfektion der Lymphozyten ein, um eine transformierte Zellinie herzustellen, die in Kultur weiterwachsen wird. Epstein-Bar-Virus (EBV) ist für diese Technik verwendet worden. EBV-transformierte Zellen bedürfen keiner Fusion mit einer Myelomzellinie, um fortgesetztes Wachstum in Kultur zu erlauben.
  • Thymozyten können als eine Futterzellschicht verwendet werden, um das Medium für die fusionierten Zellen zu konditionieren. Alternativ können peritoneale Makrophagen oder nicht-immune Milzzellen als eine Futterzellschicht verwendet werden. Eine andere Alternative besteht darin, konditioniertes Medium von Thymozyten oder Makrophagen zu verwenden. Thymozyten können hergestellt werden von juvenilen Mäusen, die weniger als 8 Wochen alt sind. Die Thymusdrüsen werden geerntet und fein zerkleinert unter Verwendung von Techniken, die die Thymusdrüse zerstören, aber für die Thymozyten nicht schädlich sind. Diese Verfahrensweise wird bevorzugterweise unter Verwendung von Scheren ausgeführt, um das Gewebe fein zu zerkleinern, gefolgt von einer Passage des Gewebes durch ein Maschensieb. Das fein zerkleinerte und gesiebte Zellmaterial wird dann durch Zentrifugation geerntet. Zellsuspensionen werden unter Verwendung von Wachstumsmedium hergestellt. Irgendwelches verbleibende Bindegewebe kann durch Filtration durch Gaze entfemt werden.
  • Zu einer geeigneten Zeit nach dem Tag, an dem die Zellen fusioniert werden, werden die fusionierten Zellen (Hybridome) dann auf die Produktion von Antikörpern gegen das Antigen der Wahl analysiert. Dieses "Screening" kann durch eine große Anzahl von Techniken vorgenommen werden, einschließlich Western Blot, ELISA, Immunpräzipitation, Tests, die den Einfluß auf eine biologische Aktivität bestimmen, und immunzytochemisches Färben. Diese Techniken und andere sind in der Literatur gut beschrieben. (Siehe z.B. J.G.R. Hurrell (ed.), Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press Inc., Boca Raton, Fla., 1982.) Die Einführung eines Screeningverfahrens erlaubt weiterhin die Definition von Antikörpern mit geeigneter Reaktivilät. Zum Beispiel können von der Basalmembran abstammende Materialien, die aus dem Urin einer typischen Krankheit, wie z.B. Blasenkrebs, gewonnen werden, in irgendeiner der oben genannten Techniken verwendet werden, um Antikörper zu definieren, die z.B. mit Determinanten reagieren, die allen Patienten gemeinsam sind, wie z.B. jene, die in dem oben beschriebenen physikochemischen Verfahren funktionell sind. Derartige Antikörper können auch gegen intakte, gereinigte Basalmembrankomponenten gescreent werden, um zu entdekken, ob die Antikörper mit einer Neoantigendeterminante reagieren.
  • Hybridome, die die interessierenden Antikörper sekretieren, werden in Kultur gehalten. Die Zellen werden in Kultur expandiert und können zur gleichen Zeit in solcher Art und Weise kloniert werden, daß Kolonien erhalten werden, die von einzelnen Zellen abstammen. Dies liefert die monoklonale Natur der aus Hybridomen erhaltenen Antikörper. Eine große Anzahl von Techniken existiert zum Klonieren von Zellen, einschließlich limitierender Verdünnung, Softagar-Klonierung und fluoreszenzaktiviertes Zellsortieren.
  • Nachdem einmal Zellklone erhalten sind, werden sie auf die Produktion des interessierenden Antikörpers hin erneut getestet. Diese Zellen werden dann in Kultur expandiert, um die Produktion größerer Mengen des Antikörpers zu erlauben. Verfahren zur Expansion der Zellen schließen Halten der Zellen in Kultur, Plazieren der Zellen in einen Bioreaktor oder einen anderen Typ von großmaßstäblicher Zellkulturumgebung, oder Kultivierung der Zellen unter Verwendung verschiedener Agaroder Gelatine-Carrier-Matrizes ein. Antikörper werden dann aus dem Zellkulturmedium isoliert.
  • Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung großer Mengen von Antikörpern umfaßt Kultivieren der Hybidomzellen in der Bauchhöhle von syngeneischen Mäusen und dadurch Produzieren von Ascitesflüssigkeit. Die Hybridome werden bevorzugterweise aus den Kulturmedien durch Zentrifugation isoliert und mit einer isoosmotischen Lösung gewaschen, bevorzugterweise phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung. Die Zellen werden dann in einer isoosmotischen Lösung resuspendiert und in die Bauchhöhle eines geeigneten Wirtstieres, bevorzugterweise einer Maus, injiziert und im Wirtstier zu wachsen erlaubt. Das Wirtstier kann eine Vorabinjektion von Pristane (2, 6, 10, 14- Tetramethylpentadecan) vor der Injektion der Hybridomzellen erhalten, vorzugsweise 7 bis 30 Tage vor der Einführung der Hybridome. Nach Wachstum der Zellen in der Bauhöhle wird Ascitesflüssigkeit, die den interessierenden Antikörper enthält, gesammelt.
  • Antikörper können aus konditionierten Medien oder Ascitesflüssigkeit mittels einer Anzahl von in der Technik bekannten Verfahren gereinigt werden. Diese Verfahren schließen Ammoniumsulfatfällung, Ionenaustauschchromatographie (siehe Hurrell, aaO.) und Hochdruckflüssigchromatographie unter Verwendung eines Hydroxylapatitträgers (Stanker et al., J. Immunol. Methods 76:157, 1985) ein. Ein bevorzugtes Verfahren zur Reinigung von Antikörpern aus konditionierten Medien oder Ascitesflüssigkeit verwendet eine kommerziell erhältliche Protein A- Sepharose-CL-48-Säule (Pharmacia, Piscataway, N.J.; Sigma, St. Louis, Mo.). Antikörper können mit diesen Säulen unter Verwendung von Bedingungen gereinigt werden, wie sie vom Hersteller vorgeschlagen werden. Typischerweise wird das konditionierte Medium oder die Ascitesflüssigkeit mit einem gleichen Volumen von TNEN gemischt (20 mM Tris-Base pH 8,0, 100 mM NaCl, 1 mM Na&sub2;EDTA, 0,5 % NP-40) und auf die Säule aufgetragen. Die Antikörper werden unter Verwendung eines Puffers mit niedrigem pH eluiert. Bevorzugterweise umfaßt der Elutionspuffer 0,1 M Natriumcitrat, pH 3,5. Antikörper enthaltende Elemente werden sofort auf pH 7,4 eingestellt, bevorzugterweise unter Verwendung einer gesättigten Trinatriumphosphatlösung.
  • Der Nachweis eines oder mehrerer Immunkomplexe, die aus einem Fragment, oder Komplex, von einer oder mehreren Basalmembrankomponenten und einem für das Fragment oder den Komplex spezifischen Antikörper gebildet sind, kann durch eine Anzahl von bekannten Techniken, wie z.B. Radioimmunoessays (RIA) und Enzymimmuntest (ELISA) , vorgenommen werden.
  • Die in der Technik bekannten Immuntests schließen die Sandwich-Immuntest-Technik mit doppeltem monoklonalen Antikörper von David et al. (U.S. Patent Nr. 4,376,110); monoklonal-polyklonale Antikörpersandwichtests (Wide et al., in Kirkham und Hunter (eds.), Radioimmunoassay Methods, E. und S. Livingstone, Edingburgh, 1970); das Western Blot-Verfahren von Gordon et al. (US. Patent Nr. 4,452,901); Immunpräzipitation von markierten Liganden (Brown et al., J. Biol. Chem. 255:4980- 4983, 1980); Enzymimmuntests, wie z.B. von Raines und Ross beschrieben (J. Biol. Chem. 257:5154-5160, 1982); immunocytochemische Techniken, einschließlich der Verwendung von Fluorochromen (Brooks et al., Clin. Exp. Immunol. 39:477, 1980); und Aktivitätsneutralisation (Bowen-Pope et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:2396-2400, 1984) ein, die alle hierdurch durch Bezugnahme aufgenommen sind. Zusätzlich zu den oben beschrie- benen Immuntests ist eine Anzahl anderer Immuntests verfügbar, einschließlich jener in den U.S. Patent Nr.: 3,817,827; 3,850,752; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; und 4,098,876, die alle hierin durch Bezugnahme aufgenommen sind.
  • Zu Nachweiszwecken können die Antikörper entweder markiert oder unmarkiert sein. Wenn die Antikörper unmarkiert sind, dann finden sie Verwendung in Agglutinationstests. Zusätzlich können unmarkierte Antikörper in Kombination mit anderen markierten Antikörpern (zweiten Antikörpern) verwendet werden, die mit dem Antikörper reagieren, wie z.B. Antikörper, die für Immunglobulin spezifisch sind. Alternativ können die Antikörper direkt markiert sein. Wo sie markiert sind, kann die Reportergruppe Radiosisotope, Fluorophore, Enzyme, Luminesceren oder Farbstoffpartikel einschließen. Diese und andere Markierungen sind in der Technik gut bekannt und sind z.B. in den folgenden U.S. Patenten beschrieben: 3,766,162; 3,791,932; 3,817,837; 3,996,345; und 4,233,402.
  • In einem ELISA-Test wird Antigen typischerweise an die Oberfläche eines Mikrotiternapfes adsorbiert. Verbleibende Protein-Bindungsstellen auf der Oberfläche werden dann mit einem geeigneten Agens, z.B. Rinderserumalbumin (BSA) , hitzeinaktiviertem normalen Ziegenserum (NGS) oder BLOTTO (gepufferte Lösung von fettfreier Trockenmilch, die auch einen Konservierungsstoff, Salze und ein Antischaummittel enthält) blockiert. Der Napf wird dann mit einer Probe inkubiert, von dqr angenommen wird, daß sie spezifischen Antikörper enthält. Die Probe kann als solches aufgetragen werden, oder öfters, sie kann verdünnt sein, gewöhnlicherweise in einer gepufferten Lösung, die eine geringe Menge (0,1 Gew.-% bis 5,0 Gew.-%) Protein enthält, wie z.B. BSA, NGS oder BLOTTO. Nach Inkubation für eine Zeitspanne, die ausreicht, um zu erlauben, daß spezifisches Binden erfolgt, wird der Napf gewaschen, um ungebundenes Protein zu entfernen und dann mit einem anti-Maus-Immunglobuim-Antikörper, der mit einer Reportergruppe markiert ist, inkubiert. Die Reportergruppe kann ausgewählt werden aus einer Anzahl von Enzymen,, einschließlich Meerrettichperoxidase, beta-Galactosidase, alkalischer Phosphatase und Glucoseoxidase. Es wird ausreichend Zeit gewährt, damit spezifisches Binden erfolgt, dann wird der Napf wieder gewaschen, um ungebundenes Konjugat zu entfernen und das Substrat für das Enzym wird zugesetzt. Man erlaubt, daß sich Farbe entwickelt und die optische Dichte des Napfinhaites wird visuell oder instrumentell bestimmt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Reportergruppe an den Antikörper gebunden. Der Schritt des Nachweises eines Immunkomplexes umfaßt wesentliches Entfernen von etwaigem ungebundenen Antikörper und dann Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit der Reportergruppe.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist eine Reportergruppe an einen zweiten Antikörper gebunden, der in der Lage ist, an den Antikörper zu binden, der spezifisch für einen Komplex aus einer oder mehreren Basalmembrankomponenten ist. Der Schritt des Nachweises eines Immunkomplexes umfaßt (a) wesentliches Entfernen von etwaigem ungebundenen Antikörper, (b) Zugabe des zweiten Antikörpers, (c) wesentliches Entfernen von etwaigem ungebundenen zweiten Antikörper und dann (d) Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit der Reportergruppe. Wo der Antikörper, der für das Fragment spezifisch ist, von einer Maus stammt, ist der zweite Antikörper ein anti-Maus-Antikörper.
  • In einer dritten bevorzugten Ausführungsform zum Nachweis eines Immunkomplexes ist eine Reportergruppe an ein Molekül gebunden, das in der Lage ist, an den Immunkomplex zu binden. Der Schritt des Nachweises umfaßt (a) Zugabe des Moleküls, (b) wesentliches Enfernen von etwaigem ungebundenen Molekül und (c) Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit der Reporter- gruppe. Ein Beispiel für ein Molekül, das in der Lage ist, an den Immunkomplex zu binden, ist Protein A.
  • Es wird für den Fachmann offensichtlich sein, daß eine Anzahl von Verfahren zum Nachweis des Immunkomplexes in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann. Reportergruppen, die zur Verwendung in irgendeinem der Verfahren geeignet sind, schließen Radioisotope, Fluorophore, Enzyme, Luminesceren und Farbstoffpartikel ein.
  • Wie oben festgehalten, sieht die vorliegende Erfindung auch ein physikochemisches Verfahren zum Nachweis einer Krankheit vor, die zur Freisetzung von Fragmenten, intakten Molekülen und/oder Komplexen aus einer oder mehreren Basalmembrankomponenten führt. Dieses Verfahren, anders als das oben beschriebene immunologische Verfahren, basiert auf der Fähigkeit von Molekülen ("Analyten"), die durch eine Krankheit in biologische Flüssigkeiten freigesetzt werden, eine Suspension aus Mikropartikeln zu agglutinieren. Im Falle von Krebsarten zum Beispiel stellen die Analyte Moleküle dar, die in eine biologische Flüssigkeit freigesetzt werden als Ergebnis des metastatischen Prozesses oder des Wachstums eines Tumors und die eine Suspension aus Mikropartikeln agglutinieren.
  • Das physikochemische Verfahren umfaßt allgemein Kontaktieren einer biologischen Flüssigkeit mit einer Suspension aus Mikropartikeln, die in Gegenwart von Fragmenten, intakten Molekülen und/oder Komplexen aus Basalmembrankomponenten agglutinieren. Nachfolgend wird die Anwesenheit oder Abwesenheit von Agglutination der Suspension aus Mikropartikeln nachgewiesen und dadurch die Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit der Krankheit erlaubt. Typische Krankheiten und biologische Flüssigkeiten schließen diejenigen ein, die oben für das immunologische Verfahren beschrieben sind.
  • Mikropartikel, die zur Verwendung in diesem Verfahren geeignet sind, schließen Kunststofflatex, z.B. Latexkügelchen, ein. Eine solche Suspension aus mikroskopischen Kunststoffpartikeln wird allgemein aus Polystyrol und Derivaten desselben hergestellt. Andere Kohlenwasserstoffpolymere und feste Materialien, wie z.B. Glas, können auch verwendet werden. Das Plastik kann in einer underivatisierten Form oder in Form von Derivaten vorliegen, wie z.B. carboxyliert oder aminiert. Typischerweise weist das Mikropartikel einen Durchmesser von etwa 0,01 bis 5 auf, wobei etwa 0,7 bevorzugt ist. Es ist vorteilhaft, die Mikropartikelsuspension mit einem oder mehreren Agenzien, wie z.B. Rinderserumalbumin, zu behandeln, um Stellen an der Oberfläche der Partikel zu blockieren, die für unspezifische Interaktionen verfügbar sind.
  • Die Mikropartikelsuspension agglutiniert in Gegenwart einer biologischen Flüssigkeit von einem Patienten mit einer Krankheit, die zur Freisetzung von Komplexen aus einer oder mehreren Basalmembrankomponenten führt. Diese Agglutinationsreaktion erlaubt den Nachweis geringer Mengen von Komplexen in der Gegenwart von vergleichsweise großen Mengen von exogenen Proteinen, die in der zu testenden biologischen Flüssigkeit vorhanden sind. Somit ist eine Vorbehandlung der biologischen Flüssigkeit vor dem Testen im allgemeinen nicht erforderlich Im Falle von biologischen Flüssigkeiten, die partikuläre Verunreinigungen enthalten, wie z.B. Urin, der Bakterien, Zellen, Kristalle oder andere Sedimente enthält, kann eine kurze Zentrifugation bei geringen Geschwindigkeiten, die ausreichend ist, um die partikulären Verunreinigungen zu entfernen, wünschenswert sein.
  • Es wird für einen Fachmann offensichtlich sein, daß eine Anzahl von Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit von Agglutination einer Mikropartikelsuspension in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Zum Beispiel ist eine einfache Objektträgeragglutinationstechnik, wie z.B. jene, die extensiv bei Agglutinationstechniken mit kleinen Partikeln verwendet werden, geeignet. Bei dieser Technik wird ein Aliquot der Mikropartikelsuspension mit einem Aliquot der zu testenden Probe auf der Oberfläche eines Glasobjektträgers gemischt. Die Reaktanten werden gemischt indem der Objektträger manuell oder auf einem mechanischen Rotator rotiert wird. In Zeitintervallen wird das Aussehen der gemischten Reaktanten relativ zum Aussehen der gemischten Reaktanten bewertet relativ zum Aussehen einer positiven und negativen Kontrolle bewertet, die aus bekanntem Probenmaterial besteht, das einen Analyten bzw. keinen Analyten enthält. Wenn die unbekannte zu testende Probe, wenn entweder makroskopisch oder mikroskopisch betrachtet, eine Agglutination der Mikropartikel größer als diejenige verursacht hat, die in der Negativkontrolle zu sehen ist, dann wird die Anwesenheit eines Analyten in der Unbekannten nachgewiesen.
  • Andere Verfahren zum Bestimmen des Umfangs der Aggregation einer Suspension können auch verwendet werden. Kurz gesagt schließen diese Systeme ein, die die Zunahme der Partikelsedimentationsrate aufgrund von Aggregation nachweisen. Sedimentation kann visuell oder mit der Hilfe einer Meßgeräteausrüstung beurteilt werden, die die erhöhte Sedimentationsrate mittels optischer oder anderer Eigenschaften der Suspension aufzeichnen wird. Die charakteristischen Lichtstreuungseigenschaften von Aggregaten gegenüber nicht-aggregierten Mikropartikeln können mit einem Spektralphotometer oder Nephelometer gemessen werden, das auf irgendeine Wellenlänge eingestellt ist, die in der Lage ist, Änderungen in diesen Eigenschaften zu messen, z.B. 350, 660 oder 700 nm.
  • Es beschreibt, um die folgenden Beispiele zusammenzufassen, Beispiel 1 den Latexagglutinationstest. Beispiel 2 liefert die Reinigung von Komplexen aus Basalmembrankomponenten. Beispiel 3 offenbart die Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen Fragmente und Komplexe aus Fragmenten von Basalmembrankomponenten. Beispiel 4 beschreibt die Identifizierung der hergestellten Antikörper. Beispel 5 sieht die Charakterisierung von monoklonalen Antikörpern vor. Beispiel 6 offenbart die Kultur von Hybridomen im Großmaßstab
  • Die folgenden Beispiele werden zu Zwecken der Veranschaulichung und nicht zu Zwecken der Beschränkung angeführt.
  • BEISPIELE BEISPIEL 1 Latexagglutinationstest
  • A. Herstellung von Latexreagenz
  • Zu 750 ml einer 49 %igen Suspension von carboxyliertem Polystyrollatex mit 0,7 Mikron Durchmesser (Morton-Thiokol, Morton International, Chicago, Ill.) werden 4 ml Ziegenserum von einer gesunden, unimmunisierten Ziege gegeben, das 1:20 in 0,85 % physiologischer Kochsalzlösung verdünnt worden ist. Die Mischung wird unter Verwendung eines Magnetrührers, oder einer ähnlichen Vorrichtung, für 24 Stunden gerührt. 75 ml dieser Latexstammlösung werden 1:40 mit 2.925 ml 0,005 M Glycinpuffer (pH 8,2, der 0,1 % Natriumazid enthält) verdünnt, der 4 g Rinderserumalbumin (BSA) enthält. Diese Latexsuspension wird für 2 Stunden unter Verwendung eines Magnetrührers oder einer ähnlichen Vorrichtung gerührt. Die Suspension wird dann in einem Spektralphotometer auf eine optische Dichte von 0,31 OD (optische Dichte-Standard)-Einheiten bei 700 nm eingestellt unter Verwendung von destilliertem Wasser als Referenz, um "Latexreagenz" zu ergeben.
  • Die Fähigkeit des Latexreagenz, mit Bestandteilen der Basalmembran zu reagieren und eine sichtbare Agglutination herzustellen, kann durch die Herstellung einer Lösung von Typ IV- Collagen (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) oder Laminin (Sigma) beobachtet werden.
  • Kurz gesagt wird je 1 mg des obigen Materials in 0,05 M Essigsäure gelöst und eine 1/10-Verdünnung in 0,013 M Glycinpuffer, pH 5,0, der 0,075 M NaCl enthält, hergestellt, um ein Arbeitsreagenz mit 100 µg/ml herzustellen. Zweifachverdünnungen dieser Lösung in dem selben Puffer können hergestellt werden und 50 µl einer jeden Verdünnung werden in einen Kreis oder einen Napf auf einem serologischen Schwarzglasobjektträger oder ähnlichem Objektträger plaziert 50 µl des Latexreagenz werden zu jedem Tropfen dieser Lösungen gegeben und die Mischung wird zum äußeren Rand des Kreises unter Verwendung eines sauberen Kunststoffrührers oder anderen Rührers gerührt und der Objektträger wird langsam für 2 Minuten geschwenkt.
  • Der Objektträger wird visuell auf Agglutination von Latexpartikeln untersucht und das Ausmaß der Agglutination kann als 0, 1, 2, 3 oder 4 eingestuft werden, wobei keine Agglutination 0 und starke Agglutination 4 ist. Ein typisches Beispiel für die Ergebnisse dieses Experiments ist in Tabelle 1 angegeben. TABELLE 1 Agglutination von Latex-Reagenz in der Gegenwart von einigen Bestandteilmolekülen der Basalmembran Vorliegen von Agglutination Keine Agglutination Konzentration Analyte Kollagen Typ IV (Sigma, St. Louis, Mo.) Laminin
  • B. Reaktion von Latexreagenz mit einer biologischen Flüssigkeit und Nachweis von Agglutination
  • Ein geeignetes Verfahren zum Nachweis von Agglutination stützt sich auf die visuelle Interpretation von Agglutination des Latex gegen einen schwarzen Hintergrund. Dieses Testverfahren wird vorgenommen indem 50 µl Serum oder Urin in einem Kreis oder Napf auf einem serologischen Schwarzglas- oder ähnlichem Objektträger plaziert werden. Danach werden etwa 50 µl des Latexreagenz aus Teil A auf den Serum- oder Urintropfen in dem Kreis oder Napf gegeben, Die Mischung wird zum äußeren Rand des Kreises gerührt unter Verwendung eines sauberen Kunststoff- oder anderen Rührers, und langsam für 2 Minuten ge schwenkt. Der Objektträger wird visuell auf Agglutination der Latexpartikel untersucht. Ein Beispiel der Ergebnisses dieses Experiments, wie am Urin von Personen mit und ohne Blasenkrebs und am Serum von Individuen mit und ohne nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Melanom und Brustkrebs vorgenommen, ist in Tabelle 2 angegeben. TABELLE 2 Agglutinations von Latex-Reagenz, das dem Urin oder dem Serum von Personen mit und ohne mehreren Formen von Krebs ausgesetzt wird (n = Anzahl der Patienten) Art des Patienten/Probe Anzahl der Proben Anzahl der positiven Proben Anzahl der negativen Proben Kein Krebs/Urin Übergangsepithelkarzinom der Blase/Urin Kein Krebs/Serum Nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom/Serum Melanom/Serum Brustkrebs/Serum (Beachte: In Fällen, in denen n kleiner ist als die Anzahl der gesteten Proben, wurden die Patienten über einen Zeitraum von Monaten in zufälliger Weise ohne Berücksichtigung der vorliegenden Testergebnisse erneut getestet.
  • BEISPIEL 2 Reinigung von Komplexen aus Basalmembrankomponenten
  • Urin, der im Latextest positiv ist, z.B. Urin, der von Patienten mit Blasenkrebs gepoolt ist, wird auf 0,1 % Natriumacid durch die Zugabe von festem Natriumazid, 0,005 M Jodacetamid durch die Zugabe von festem Jodacetamid und 0,005 M Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) durch die Zugabe von 1 M PMSF in absolutem Alkohol gebracht. Es ist wichtig, daß der Urin nach dem Sammeln bei etwa 4ºC gehalten wird, und daß die folgenden Schritte bei dieser Temperatur ausgeführt werden.
  • Der Urin wird bei 1500 x g für 10 Minuten zentrifugiert und der Überstand wird vom Pellet, falls vorhanden, abgesaugt. Der Überstand wird etwa 40 - 50 x in einem Druckkonzentrator unter Verwendung einer Ausschlußmembran mit geringer nicht-spezifischer Bindung und mit einem MW-Cutoff von etwa 30.000 (z.B. eine Amicon YM-30-Membran) konzentriert.
  • Der konzentrierte Urin wird auf einer Agarosegelsäule chromatographiert, die aus 8 % Agarosekügeichen, mit einer Größe von 100 - 200 Mikron hergestellt ist und mit 0,02 M Tris HCL, 0,13 m NaCl, 0,025 M EDTA und 0,002 M Benzamidin, pH 7,8, äquilibriert ist.
  • Die Fraktionen, die den Hauptteil des Latextest-positiven Materials enthalten, werden vereinigt und durch Druckultrafiltration unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran mit geringer nicht-spezifischer Bindung und einem MW-Cutoff von etwa 30.000 (z.B. Amicon YM-30-Membran) konzentriert. Das resultierende Konzentrat wird erneut auf einer 4 % Agarosesäule mit einem ungefähren MW-Cutoff von 15.000.000 im selben Puffer wie für die 8 % Agarosesäule chromatographiert. Da dieser Gelfiltrationsschritt ein Harz mit einer Fähigkeit zum Sieben von sehr hochmolekulargewichtigen Verbindungen verwendet, tritt eine gewisse Trennung von immunreaktivem Material auf.
  • Die Anwesenheit von Material, zur Verwendung beim Herstellen von Antikörpern, in Unterfraktionen des Ablusses aus den 8 %- oder 4 %-Agarose-Säulen wird bestimmt mittels Durchführung eines ELISA für die Bestandteilmoleküle der Basalmembranfragmente, ebenso wie mittels Umsetzen von Aliquots der Subfraktionen mit dem Mikropartikelaggregationstest, oben. Die ELISA- Reaktivität verschiedener Urinfraktionen von Blasenkrebspatienten mit Antikörpern gegen bekannte Basalmembranbestandteile (Sigma, St. Louis, NO.; Telios, San Diego, Calif.) ist in Tabelle 3 zusammengefaßt TABELLE 3 Reaktivität von gemäß Beisniel 2 fraktionierten Subfraktionen des Urins von normalen und Blasenkrebspatienten Festphasenantigen; Subfraktionen aus Gelchromatographie mit 4% Agerose gemäß Beispiel 2 Maximale Absorbanz im Verhältnis zum Hintergrund Spezifität des primären Antikörpers Typ IV-Collagen Laminin Fibronektin immunreaktiver immunreaktiver Patient
  • Die ELISAs werden unter Verwendung von Mikrotiterplatten als Festphase durchgeführt, die mit Subfraktionen von Material adsorbiert sind, das aus Agarosegelchromatographie eluiert ist. Kurz gesagt werden Subfraktionen zu 2 µl/ml in ELISA-Puffer A (Tabelle 5 in Beispiel 3) in Mikrotiterplatten (100 µl/Napf) über Nacht bei 4ºC inkubiert. Die Platten werden dreimal mit ELISA-Puffer C (Tabelle 5 in Beispiel 3) gewaschen und 100 µl anti-Basalmembranbestandteil (z.B. anti-Laminin oder anti-Collagen-Typ IV)-Antikörper (der "erste" Antikörper) , der 1/1000 in ELISA-Puffer C verdünnt ist, werden zugegeben und die Platten bei 37ºC für 0 bis 5 Stunden inkubiert. Die Platten werden dann dreimal mit ELISA-Puffer C gewaschen. 100 µl einer 1/1000-Verdünnung, in ELISA-Puffer C, von Antikörper, der spezifisch für das IgG der Spezies ist, von der der erste Antikörper gewonnen wurde, konjugiert mit Meerrettichperoxidase, wird zugegeben und die Platten für 0,5 Stunden bei 37ºC inkubiert. Die Platten werden dreimal mit ELISA-Puffer C gewaschen und 100 µl Substrat (1 Volumen von 2 mg/ml N,N,N',N'-Tetramethylbenzidin in Methanol in 2 Volumina ELISA- Puffer D) zugegeben. Nach Inkubation bei Raumtemperatur für 10 bis 20 Minuten werden die Platten bei 380 nm in einem ELISA- Plattenlesegerät abgelesen (z.B. Dynatech Laboratories, Inc., Alexandria, Va.) und die Absorbanzen aufgezeichnet.
  • Zusätzlich kann, wenn der unkonzentrierte Urin eines Blasenkrebspatienten über eine Agarosegelsäule fraktioniert wird, von der Basalmembran stammendes Material im Lückenvolumenpeak (Fig. 1) nachgewiesen werden, wenn der Abfluß durch das oben beschriebene ELISA-Verfahren getestet wird. Normaler Urin zeigt, wenn ähnlich behandelt, keine derartige Immunreaktivität (Fig. 2).
  • BEISPIEL 3 Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen Fragmente und Komglexe aus Basalmembrankomgonenten
  • A. Immunisierung von Mäusen
  • 8 Wochen alte männliche oder weibliche Balb/c-Mäuse werden mit individuellen Basalmembranfragmenten oder Komplexen ("Fragment/Komplex") immunisiert. 1 oder 2 µg eines gereinigten Fragmentes/Komplexes werden in die Bauchhöhle der Balb/c-Mäuse injiziert. Alternativ werden den Mäusen 200 µl desselben Immunogens injiziert, das in einem Volumen vollständigen Freundschen Adjuvans (ICN Biochemicals, Costa Mesa, Calif.) emulgiert ist. Jedes Verfahren wird insgesamt viermal in 2-Wochen-- Intervallen wiederholt, ausgenommen daß im Falle der Adjuvansbehandelten Mäuse das unvollständige Freundsche Adjuvans an Stelle des vollständigen Freundschen Adjuvans eingesetzt ist. Vier Tage vor dem Fusionsdatum werden den Mäusen intravenös 100 ng gereinigtes Fragment/Komplex injiziert. Die Immunantwort von auf diese Art und Weise immunisierten Mäusen wird mittels ELISA titriert unter Verwendung von Mikrotiterplatten, an die Antigen adsorbiert ist, das aus dem Urin von Blasenkrebspatienten als Immunogen gereinigt ist. Mäuse, die, wenn auf diese Weise getestet, einen hohen Titer aufweisen (z.B. über 12.000), können für die Fusion verwendet werden.
  • B. Herstellung von immunisierter Mausmilz und Lymphknotenzellen.
  • Um sie für die Fusion zwischen den Zellen der immunisierten Mäuse und der Mausmyelomzellinie vorzubereiten, werden die Milzen und Lymphknoten der immunisierten Mäuse entfernt und mit Scheren in einer Petrischale fein zerkleinert. Die fein zerkleinerten Gewebe werden in 10 ml RPMI 1640 (RPMI Gibco, Lawrence, Mass.) suspendiert und man erlaubt dem Debris, sich für 5 Minuten abzusetzen.
  • Der Überstand wird in 50 ml Zentrifugenröhrchen überführt. Die Zellsuspensionen werden für 10 Minuten bei 200 x g zentrifugiert. Die Überstände werden verworfen und die Pellets in 10 ml RPMI resuspendiert.
  • C. Herstellung von Mausmyelomzellen.
  • Die NS-1-Mausmyelomzellinie wird für die Fusion verwendet.
  • TABELLE 4
  • NS-1-Medium
  • Für eine Lösung von 500 ml:
  • 5 ml 100 mM Natriumpyrunat (Irvine, Santa Ana, Calif.)
  • 5 ml 200 mM L-Glutamin (Gibco)
  • 5 ml 100x Penicillin/Streptomycin/Neomycin (Gibco)
  • 50 ml inaktiviertes fötales Kälberserum (BioCell, Carson, Calif.)
  • 1 g NaHCO&sub3;
  • Geben Sie RPMI 1640 (Gibco, Lawrence, Mass.) bis zu einem Gesamtvolumen von 500 ml zu. Sterilisieren Sie durch Futration durch einen 0,22 µm-Filter.
  • HT-Medium
  • 50 ml NS-1-Medium 1 ml 50 x HT Supplement (Sigma, St. Louis, Mo.)
  • HAT-Medium
  • 50 ml NS-1-Medium
  • 1 ml 50 x HAT-Supplement (Sigma, St. Louis, Mo.)
  • Einfriermedium
  • 8 ml NS-1-Medium
  • 1 ml fötales Kälberserum
  • 1 ml DMSO
  • Mischen Sie die Bestandteile und bereiten Sie es für jedes Einfrieren frisch zu.
  • 1 x 10&sup7; Zellen von einer wachsenden NS-1-Kultur werden verwendet, um ein 75 cm²-Gewebekulturgefäß, das 50 ml NS-1-Medium enthält, zu inokulieren. Die Gefäße werden bei 37ºC, 7 % CO&sub2;, inkubiert, bis die Zellen eine Dichte von mindestens 5 x 10&sup5; Zellen/ml erreichten.
  • Die Zellen werden dann auf 2 x 10&sup5; Zellen/ml täglich zurückgeschnitten. Einen Tag vor der Fusion werden zwei 75 cm²-Gefäße angesetzt, die 50 ml Zellkultur enthalten. Die NS-1-Zellen werden mit Milzzellen von immunisierten Mäusen gemischt und wie unten beschrieben fusioniert.
  • D. Herstellung von Thymozyten.
  • Thymusdrüsen, die von Baby-Mäusen erhalten werden, sind die Quelle für die Thymozyten, die als eine Futterzellschicht verwendet werden, um das Kulturmedium für die Zellfusionen zu konditionieren. Thymusdrüsen werden von drei bis vier Wochen alten Balb/c-Mäusen erhalten. Die Thymusdrüsen werden mit NS-1-Medium abgespült und in einer Petrischale fein zerkleinert. Die fein zerkleinerten Gewebe werden mit 10 ml NS-1-Medium suspendiert und man läßt den Debris für 5 Minuten absetzen.
  • Der Überstand wird in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen überführt und die Zellen werden für 10 Minuten bei 200 x g zentrifugiert. Die Überstände werden verworfen und die Pellets in 10 ml NS-1-Medium resuspendiert. Verdünnungen der Zellsuspensionen werden unter Verwendung eines Haemozytometers gezählt. Die Ausbeute von zwei Thymusdrüsen beträgt routinemäßig etwa 400 Millionen Zellen. Die Zellen werden bei Raumtemperatur gelagert, bis sie zur Verwendung bereit sind.
  • E. Fusion von Zellen von immunisierten Mäusen mit NS-1-Zellen.
  • Um Zellen für die Fusion vorzubereiten, werden Zellen von einem NS-1-Klon, der wie oben beschrieben angezogen wird, in 50 ml Zentrifugenröhrchen überführt und für 10 Minuten bei 200 x g zentrifugiert. Die Überstände werden verworfen und die Zellpellets werden resuspendiert und in 10 ml RPMI vereinigt. Die Zellsuspension wird mit einem Haemozytometer gezählt, um die Lebensfähigkeit der Zellen, wie durch Trypanblauausschluß bestimmt, aufzuzeichnen. Es wird bestimmt, daß die Lebensfähigkeit der Zellen 95 % sein soll.
  • Für die Fusion werden 2,5 x 10&sup7; Zellen des NS-1-Klons zu den Milz-/Lymphknotenzellen der immunisierten Mäuse gegeben (hergestellt wie oben beschrieben). Die gemischten Zellen werden für 10 Minuten bei 200 x g zentrifugiert. Der Überstand wird durch Absaugen mit einer an einem Vakuumschlauch befestigten Pasteur-Pipette entfernt.
  • Die sedimentierten Zellen werden vorsichtig in 1 ml einer 40 % Polyethylenglycol (PEG)-Lösung (Kodak, Durchschnitts-MW 1450), hergestellt in RPMI, suspendiert und der pH auf 8,0 mit 2 % Natriumbicarbonat eingestellt. Die Suspension wird bei 200 x g bei Raumtemperatur für 15 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und 10 ml RPMI-Medium wird zugegeben, um das Pellet vorsichtig zu resuspendieren, Die Zellen werden bei 200 x g für 5 Minuten zentrifugiert und der Überstand wird vorsichtig abgesaugt und verworfen. 45 ml HAT-Medium werden zum Zelipellet zugegeben und die Zellen vorsichtig resuspendiert. 5 x 10&sup7; Thymocyten (hergestellt wie oben) werden zur Zellsuspension zugegeben und diese letzte Suspension wird mit 200 µl pro Napf in zwei Kulturplatten mit 96 Näpfen überführt. Die Platten werden bei 37ºC in einem feuchten Inkubator mit 7 % CO&sub2; inkubiert. Die Platten werden mikroskopisch nach 3 Tagen untersucht, um die Fusionseffizient mit einer Erwartung von etwa fünf Hybridomkolonien pro Napf untersucht. Die Zellen werden nach 7 Tagen gefüttert, indem 100 µl des Mediums durch frisches NS-1-Medium ersetzt werden, das 1 x HAT und 2,5 x 10&sup6; Thymozyten pro ml enthält. Die Hybridome werden zwischen den Tagen 9 und 14 auf die Produktion spezifischer Antikörper getestet. Ausgewählte Hybridome werden für die weitere Charakterisierung ausgewählt.
  • BEISPIEL 4 Identifizierung der hergestellten Antikörper
  • Hybridome aus Zellfusionen werden auf die Produktion von Antikörpern gegen ein Basalmembranfragment oder einen Basalmembrankomplex getestet. Die Tests, die zur Identifizierung von positiven Hybridomen verwendet werden, schließen Enzymimmuntests (ELISA), Radioimmunpräzipitations (RIP)-Tests und Western Blots ein.
  • A. Screenen von Fusionen mittels ELISA.
  • Die ELISA-Tests werden in Mikrotiterplatten mit 96 Näpfen ausgeführt, die mit einem Fragment oder einem Komplex beschichtet worden sind, das bzw. der aus Urin, wie oben beschrieben, gereinigt wurde. Die Mikrotiterplatten, die zum Testen von Fusionen verwendet werden, sind mit 2 µg/ml Fragment/Komplex beschichtet. Um die Näpfe zu beschichten, wird Fragment/Komplex auf die geeignete Konzentration in ELISA-Puffer A (Tabelle 5) verdünnt und 100 µl der Fragment/Komplex-Lösung werden zu jedem Napf zugegeben. Die Platten werden danach bei 4ºC über Nacht inkubiert.
  • TABELLE 5 ELISA-Puffer A
  • 0,1 M NaHCO&sub3;, pH 9,6
  • 0,02 % NaN&sub3;
  • ELISA-Puffer B
  • Dieser Puffer kann mit 1 % oder 2 % Rinderserumalbumin (BSA, Sigma, St. Louis, Mo.) hergestellt werden.
  • 5 oder 10 g BSA (für 1% bzw. 2% BSA) 250 µl Tween (Marke) 20 (Sigma, St. Louis, Mo.) 100 mg NaN&sub3;
  • Geben Sie phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung pH 7,2 (PBS, Sigma, St. Louis, Mo.) bis auf ein Endvolumen von 500 ml zu. Alternativ kann der Puffer als 1 % oder 2 % BSA in ELISA-Puffer C hergestellt werden.
  • ELISA-Puffer C
  • 0,04 g NaH&sub2;PO&sub4;
  • 0,27 g Na&sub2;HPO&sub4;
  • 0,05 g NaN&sub3;
  • 8,50 g NaCl
  • 1,00 g BSA
  • 0,5 ml Tween-20 (Marke)
  • und mit destiliertem Wasser auf 1 l auffüllen
  • ELISA-Puffer D
  • 0,1 M Zitronensäure, pH auf 5,5 mit NaOH eingestellt
  • PBS
  • 0,02 M Natriumphosphat pH 7,4
  • 0,15 M NaCl
  • 0,5 % NaN&sub3;
  • Stellen Sie den pH auf 8 mit konzentrierter HCl ein.
  • Der ELISA-Test wird auf Mikrotiterplatten, hergestellt wie oben beschrieben, ausgeführt, die dreimal mit ELISA-Puffer C gewaschen worden sind. 100 µl Hybridomkulturüberstand werden zu jedem Testnapf zugegeben. Die Platten werden für 0,5 Stunden bei 37ºC inkubiert. Nach der Inkubation werden die Platten dreimal mit ELISA-Puffer C gewaschen. Die Näpfe werden dann für 0,5 Stunden bei 37ºC mit 100 µl Meerrettichperoxidase-konjugiertem Kaninchen-anti-Maus-IgG (Sigma, St. Louis, Mo.) inkubiert. Die Näpfe werden dann dreimal mit ELISA-Puffer C gewaschen. Nach dem Waschschritt werden 50 µl Substrat, das 1 Volumen 2 mg/ml N,N,N,N'-Tetramethyibenzidin in Methan (Sigma, St. Louis, Mo.) in zwei Volumina ELISA-Puffer D enthält, zu jedem Napf zugegeben und die Platten werden für 10 bis 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten werden dann unter Verwendung eines Dynatech ELISA-Plattenlesegeräts (z.B. Dynatech Laboratories, Inc., Alexandria, Va.) bewertet, das einen Filter verwendet, um die Absorbanz bei 380 nm zu überwachen. Diejenigen Näpfe mit A&sub3;&sub8;&sub0;-Anzeigen die signifikant größer als der Substratleerwert sind, werden als positiv betrachtet.
  • Die positiven Kandidaten werden durch einen ELISA-Test, wie oben beschrieben, erneut getestet. Diese Proben werden zweifach mit Mikrotiterplatten getestet, die mit 1 µg/ml Fragment/Komplex beschichtet sind oder die mit ELISA-Puffer A alleine inkubiert worden sind. Positive Ergebnisse, die von den Kandidaten auf den letztgenannten Platten (mit Puffer A alleine beschichtet) gezeigt werden, zeigen unspezifisches Binden an Kunststoff an. Kandidaten, die eine signifikante A&sub3;&sub8;&sub0; auf ELISA-Platten zeigen, die mit Fragment/Komplex beschichtet sind, und eine unwesentliche Reaktion gegenüber dem Kunststoff zeigen, werden für die Klonierung und Charakterisierung ausgewählt.
  • B. Klonieren von Hybridomen.
  • Hybridome, von denen gezeigt wurde, daß sie sowohl durch das ELISA- als auch das RIP-Filter positiv sind, werden durch Grenzwert-Verdünnung zweifach kloniert und mittels ELISA gescreent, um die Monoklonalität der Hybridome zu isolieren und zu gewährleisten. Das Klonieren durch Grenzwert-Verdünnungsausplattierung wird wie folgt durchgeführt: Die Elternnäpfe werden mit NS-1-Medium bis zu einer Konzentration von 5 Zellen pro ml Kulturmedium verdünnt. Die Zelimischung wird dann zu 200 µl pro Napf in Kulturschalen mit 96 Näpfen ausplattiert, und damit durchschnittlich etwa eine Hybridomzelle pro Napf erhalten. Nach sieben Tagen in Kultur werden die Näpfe einzeln mikroskopisch abgetastet, um auf Näpfe zu screenen, die Einzelkolonien von Zellen enthalten.
  • Diejenigen Näpfe, die Einzelkolonien enthalten werden mittels ELISA auf die Anwesenheit spezifischer Antikörper in den konditionierten Medien unter Verwendung von Fragment/Komplex als das Antigen getestet.
  • Hinsichtlich Antikörperproduktion positive Zellen werden in Kultur expandiert, um große Mengen der monoklonalen Antikörper zu erhalten. Zellen, von denen festgestellt wurde, daß sie hinsichtlich Antikörperproduktion nach dem ersten Klonierungsdurchgang positiv sind, sind Kandidaten für einen zweiten Durchgang. Ein für jedes der Hybridome erhaltener Klon wird dann einem zweiten Klonierungsdurchgang durch Grenzwertverdünnung unterworfen unter Verwendung von Bedingungen, die identisch mit jenen oben beschrieben sind.
  • BEISPIEL 5
  • Charakterisierung von monoklonalen Antikörpern
  • Positive Hybridomkandidaten werden auf die Fähigkeit getestet, das Fragment oder den Komplex, das/der aus verschiedenen Subfraktionen der Agarosegelchromatographie, wie in Beispiel 2 oben beschrieben, isoliert wurde, ebenso wie gereinigte Bestandteilmoleküle der Basalmembran zu binden. Die Tests werden mittels ELISA durchgeführt, wobei als Festphase Mikrotiterplatten, die mit verschiedenen Subfraktionen aus der Agarosegelchromatographie adsorbiert sind, die als Fragmente der Basalmembran enthaltend erkannt wurden, und Mikrotiterplatten verwendet wurden, die mit Bestandteilmolekülen der Basalmembran, z.B. Typ IV-Collagen (Sigma, St. Louis, Mo.), adsorbiert sind, um Antikörper zu identifizieren, die gegen Fragment/Komplex aus dem Urin von Blasenkrebspatienten hergestellt wurden, und die mit bekannten Basalmembranbestandteilen nicht reaktiv sind. Ansonsten wird der ELISA gemäß der Verfahrensweise, wie in Beispiel 4 oben beschrieben, durchgeführt. Das Reaktionsmuster eines solchermaßen charakterisierten monoklonalen Antikörpers ist in Tabelle 6 zusammengefaßt. TABELLE 6 Charakterisierung des monoklonalen Antikörpers 3H2A1 Reaktivität mit: Absorbanz im Verhältnis zum Leerwert Latex-reaktiver Peak I, Gelchromatographie mit 8% Agarose Latex-reaktiver Peak II, Gelchromatographie mit 8% Agarose Menschliches plazentales Collagen von Typ IV
  • BEISPIEL 6 Kultur von Hybridomen im Großmaßstab
  • Nach der Identifizierung und Charakterisierung der Antikörper werden die Hybridome zur Produktion großer Mengen von Antikörpern kultiviert. Diese Herstellung von Antikörpern im Großmaßstab wird durchgeführt indem die Hybridome in Asciten, wie unten beschrieben, kultiviert werden.
  • Balb/c Mäusen wird zwischen sieben und zehn Tagen bevor die Hybridome injiziert werden intraperitoneal 1 ml Pristane injiziert (2,6,10,14-Tetramethylpentadecan, Aldrich Chemical, Milwaukee, Wis.). Den Mäusen werden etwa 5 x 10&sup6; Zellen pro Maus intraperitoneal injiziert.
  • Ascitesflüssigkeit wird aus den Mäusen mit einer 18 Gauge-Nadel zwischen sieben und zehn Tagen nach der Injektion entfernt. Etwaige Zellen und/oder etwaiges Zellmaterial werden/ wird von der Ascitesflüssigkeit mittels Zentrifugation entfernt.
  • Antikörper werden aus der Ascitesflüssigkeit unter Verwendung einer Protein A-Sepharose (Marke)-CL-4B (Sigma, St. Louis, Mo.)-Säule gereinigt, die mit TNEN äquilibriert ist. Die Ascitesflüssigkeit wird mit einem gleichen Volumen TNEN-Puffer gemischt. Die Mischung, die die Ascites enthält, wird dann auf die Säule aufgetragen und zweimal über die Säule zyklisiert. Die Säule wird mit drei bis vier Säulenvolumina TNEN gewaschen und gebundenes Material wird mit 0,1 M Natriumcitrat, pH 3,0 eluiert. Die Fraktionen werden gesammelt, durch die Zugabe von 1,5 M Tris-Base, pH 8,5, neutralisiert und die Absorption bei 280 nm überwacht. Die Peakfraktionen werden vereinigt und die Proteinkonzentration wird durch Absorption bei 280 nm unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 1,4 für eine Lösung mit 1 mg/ml bestimmt.

Claims (16)

1. Ein Verfahren zum Screenen auf Krebs, der zur Freisetzung von Komplexen aus einer oder mehreren Basalmembrankomponenten führt, welches die Schritte umfaßt:
Kontaktieren einer Probe einer biologischen Flüssigkeit mit einer Suspension aus Latexkügelchen, die mit einem Blockierungsreagenz behandelt sind und die in Gegenwart von Komplexen aus Basalmembrankomponenten agglutinieren, wobei besagte Agglutination nicht auf einer spezifischen Antikörper- Antigen-Wechselwirkung beruht; und
Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit von Agglutination der besagten Suspension aus Latexkügelchen, und dadurch Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit besagten Krebses.
2. Das Verfahren nach Anspruch 1, worin die Krebsarten aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Urogenital-, Melanom-, Lungenund Brustkrebsarten besteht.
3. Das Verfahren nach Anspruch 1, worin die biologische Flüssigkeit aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Urin, Serum, Synovialflüssigkelt und Cerebrospinalflüssigkeit besteht.
4. Ein Verfahren zum Screenen auf Krebs, der zur Freisetzung von Komplexen aus einer oder mehreren Basalmembrankomponenten führt, welches die Schritte umfaßt:
Kontaktieren einer Probe einer biologischen Flüssigkeit mit einem Antikörper, der spezifisch für einen Komplex aus einer oder mehreren Basalmembrankomponenten ist; und Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit eines oder mehrerer Immunkomplexe, die zwischen besagtem Antikörper und besagtem Komplex gebildet werden, und dadurch Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit besagten Krebses.
5. Das Verfahren nach Anspruch 4, worin die Krebsarten ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Urogenital-, Melanom-, Lungen- und Brustkrebsarten besteht.
6. Das Verfahren nach Anspruch 4, worin die biologische Flüssigkeit ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Urin, Serum, Synovialflüssigkeit und Cerebrospinalflüssigkeit besteht.
7. Das Verfahren nach Anspruch 4, worin der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
8. Das Verfahren nach Anspruch 4, worin eine Reportergruppe an den Antikörper gebunden ist, und worin der Nachweisschritt wesentliches Entfernen von etwaigem ungebundenen Antikörper und danach Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit der Reportergruppe umfaßt.
9. Das Verfahren nach Anspruch 8, worin die Reportergruppe ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Radioisotopen, Fluorophoren, Enzymen, Luminesceren und Farbstoffpartikeln besteht.
10. Das Verfahren nach Anspruch 4, worin eine Reportergruppe an einen zweiten Antikörper gebunden ist, der in der Lage ist an den Antikörper zu binden, und worin der Nachweisschritt (a) wesentliches Entfernen von etwaigem ungebundenen Antikörper, (b) Zugabe des zweiten Antikörpers, (c) wesentliches Entfernen von etwaigem ungebundenen zweiten Antikörper und (d) Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit der Reportergruppe umfaßt.
11. Das Verfahren nach Anspruch 10, worin der zweite Antikörper ein anti-Maus-Antikörper ist.
12. Das Verfahren nach Anspruch 10, worin die Reportergruppe ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Radioisotopen, Fluorophoren, Enzymen, Luminesceren und Farbstoffpartikeln besteht.
13. Das Verfahren nach Anspruch 4, worin eine Reportergruppe an ein Molekül gebunden ist, das in der Lage ist an einen Immunkomplex zu binden, und worin der Nachweisschritt (a) Zugabe des Moleküls, (b) wesentliches Entfernen von etwaigem ungebundenen Molekül und (c) Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit der Reportergruppe umfaßt.
14. Das Verfahren nach Anspruch 13, worin das Molekül, das in der Lage ist an einen Immunkomplex zu binden, Protein A ist.
15. Das Verfahren nach Anspruch 13, worin die Reportergruppe ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Radioisotopen, Fluorophoren, Enzymen, Luminesceren und Farbstoffpartikeln besteht.
16. Ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit von Komplexen aus Basalmembrankomponenten in einer Probe, welches die Schritte umfaßt:
Kontaktieren einer Probe mit einer Suspension aus Latexkügelchen, die mit einem Blockierungsreagenz behandelt sind und die in der Gegenwart von Komplexen aus Basalmembrankomponenten agglutinieren, wobei besagte Agglutination nicht auf einer spezifischen Antikörper-Antigen-Wechselwirkung beruht; und
Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit von Agglutination besagter Suspension aus Latexkügelchen, und dadurch Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit besagter Komplexe in besagter Probe.
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