DE60010956T2

DE60010956T2 - Carbodiimidverbindungen, die eine fluoreszierende Gruppe enthalten, deren Vorstufen und Verfahren zu deren Herstellung

Info

Publication number: DE60010956T2
Application number: DE60010956T
Authority: DE
Inventors: Naoki Chiba-shi Kimura; Namiko Chiba-shi Shiohata; Yoko Chiba-shi Yoshikawa
Original assignee: Nisshinbo Industries Inc; Nisshin Spinning Co Ltd
Current assignee: Nisshinbo Holdings Inc
Priority date: 1999-03-25
Filing date: 2000-03-22
Publication date: 2005-06-16
Anticipated expiration: 2020-03-23
Also published as: US20040059111A1; US20040049047A1; EP1038938A2; EP1038938B1; US7176330B2; US7135293B2; DE60010956D1; US6642380B1; EP1038938A3

Description

Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine neue Vorstufe einer eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung und eine eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Carbodiimid-Verbindung. Genauer bezieht sie sich auf eine Vorstufe einer eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung, die ein Halogenatom oder eine Sulfonsäuregruppe aufweist, die einfaches und effizientes Binden einer fluorseszierenden Gruppe erlaubt, und ein Verfahren zu ihrer Herstellung, ebenso wie eine eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Carbodiimid-Verbindung, die mindestens eine Gruppe aufweist, die aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe ausgewählt ist, die einfache und effiziente Einführung einer fluorseszierenden Gruppe in Nukleinsäuren und Proteine erlaubt, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und eine Analysemethode unter ihrer Verwendung.
Als Verfahren zum Einführen einer fluoreszierenden Substanz in Nukleinsäuren sind z.B. das Einführen einer fluoreszierenden Substanz in eine Nukleinsäure unter Verwendung eines an eine fluoreszierende Substanz gebundenen Nukleotids mittels einer enzymatischen Reaktion und so weiter, bekannt (Japanische Patentanmeldung Offenlegungsnummer 6-271599), das Binden von Streptavidin, an das bereits eine fluoreszierende Substanz gebunden ist, an eine Biotin-markierte Nukleinsäure, eine Reaktion einer fluoreszierenden Substanz, die eine mit Amin reagierende Gruppe aufweist, mit einer Nukleinsäure, die an einen Amino-Linker gebunden ist, usw. Zusätzlich gibt es andere als die oben genannten Verfahren, wie die Verwendung einer eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung, die gegenüber Nukleinsäurebasen hochreaktiv ist (Japanische Patentanmeldung Offenlegungsnummer 10-287870).
Jedoch haben unter den vorgenannten Verfahren das Verfahren, das in der Japanischen Patentanmeldung mit der Offenlegungsnummer 6-271599 beschrieben wird, das Verfahren unter Verwendung von Biotinmarkierung und das Verfahren unter Verwendung von Bindungen mit Amino-Linkern Nachteile, so dass es nicht möglich ist, die fluoreszierende Substanz in natürlich vorkommende Nukleinsäuren einzuführen, und die Durchführung ist kompliziert. Die eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Carbodiimid-Verbindung zeigt eine gute Löslichkeit in Wasser wegen des Vorhandenseins eines quaternären Ammoniumsalzes in seiner Molekülstruktur. Jedoch war eine weitere Verbesserung der Wasserlöslichkeit erwünscht, um eine fluoreszierende Substanz mit einer geringen Löslichkeit in Wasser wie eine fluoreszierende Substanz mit einem so großen Elektronensystem, dass es im nahen Infrarotbereich absorbieren sollte, verwenden zu können.
Zusammenfassung der Erfindung
Gegenstand der Erfindung ist es, eine neue, eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Carbodiimid-Verbindung, die effizientes und einfaches Einführen fluoreszierender Gruppen in Proteine und Nukleinsäuren einschließlich natürlich vorkommender Nukleinsäuren ermöglicht und ausreichende Wasserlöslichkeit aufweist, zur Verfügung zu stellen, und eine Vorstufe einer eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung zur Verfügung zu stellen, die einfach an eine fluoreszierende Gruppe gebunden werden kann und zur Herstellung der vorgenannten eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung verwendet werden kann.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung studierten gründlich, um den vorgenannten Gegenstand zu erreichen. Als Ergebnis fanden sie, dass eine eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Carbodiimid-Verbindung, die mindestens eine Gruppe aufweist, die aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe ausgewählt ist, die in Wasser ausreichend löslich ist; hergestellt werden konnte, indem man von einer Carbodiimid-Verbindung ausgeht, die ein Halogenatom oder eine Sulfonsäuregruppe aufweist, und dass eine fluoreszierende Gruppe einfach in Nukleinsäuren einschließlich natürlich vorkommender Nukleinsäuren und Proteine eingeführt werden konnte, indem die vorgenannte, eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Carbodiimid-Verbindung verwendet wird. So haben sie die vorliegende Erfindung gemacht.
Die vorliegende Erfindung stellt Folgendes zur Verfügung:

(1) Eine Vorstufe einer eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung, die ein Halogenatom oder eine Sulfonsäuregruppe aufweist, welche durch die folgende allgemeine Formel (I) dargestellt ist: B-Y³-N=C=N-Y²-W-Y¹-[A]_n-Y⁴-X (I)wobei X ein Halogenatom oder eine Sulfonsäuregruppe darstellt, A eine funktionelle Gruppe darstellt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus -CH₂-, -NHCO-, -CONH-, -O-, -S-, -NR¹-, wobei R¹ eine lineare, zyklische oder verzweigte gesättigte oder ungesättigte Kohlenwasserstoffgruppe darstellt, die 1 bis 20 Kohlenstoffatome aufweist, -NR²R³-, wobei R² und R³ jeweils unabhängig ein Wasserstoffatom, eine lineare oder verzweigte gesättigte oder ungesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe, die 1 bis 20 Kohlenstoffatome aufweist, oder eine Cycloalkylgruppe, eine Arylgruppe oder eine Aralkylgruppe darstellen, die einen Substituenten aufweisen können, unter der Voraussetzung, dass, wenn eines von R² und R³ ein Wasserstoffatom ist, das andere eine lineare oder verzweigte gesättigte oder ungesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe, die 1 bis 20 Kohlenstoffatome aufweist, oder eine Cycloalykylgruppe, eine Arylgruppe oder eine Aralkylgruppe darstellt, die einen Substituenten aufweisen können, oder R² und R³ miteinander verbunden sein können, um als Ganzes eine Stickstoff enthaltende heterozyklische Gruppe zu bilden, die ein Sauerstoffatom aufweisen kann, -COO-, -OCO-, -NHSO₂-, -NHC(S)NH- und -SO₂NH- besteht, n 0 oder 1 darstellt, W eine direkte Bindung oder eine quartäre Oniumgruppe darstellt, Y¹, Y², Y³ und Y⁴ jeweils unabhängig eine funktionelle Gruppe darstellen, die durch die allgemeine Formel (II) dargestellt ist: -(CH₂)_p-(L)_r-(CN₂)_q- (II)wobei L eine funktionelle Gruppe darstellt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus -CH₂-, -NHCO-, -CONH-, -O-, -S-, NR¹-, wobei R¹ die gleiche Bedeutung aufweist, wie sie für die Formel (I) definiert ist, -NR²R³, wobei R² und R³ die gleichen Bedeutungen aufweisen, wie sie für die Formel (I) definiert sind, -COO-, -OCO-, -NHSO₂, -NHC(S)NH- und -SO₂NH- besteht, p und q jeweils eine ganze Zahl von 0 bis 20 darstellen und r 0 oder 1 darstellt, B ein Wasserstoffatom oder eine einwertige organische Gruppe darstellt, die entweder gleich oder verschieden von -W-Y¹-[A]_n-Y¹-X in der Formel (I) ist, und mindestens eine funktionelle Gruppe, die aus B, Y¹, Y², Y³, Y⁴, A und W ausgewählt ist, mindestens eine Gruppe aufweist, die aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe ausgewählt ist, die eine Substitution durch ein Alkalimetall, ein Erdalkalimetall oder eine basische Gruppe aufweisen, die ein Stickstoff- oder Phosphoratom enthält.
(2) Eine eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Carbodiimid-Verbindung, die mindestens eine Gruppe aufweist, die aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe ausgewählt ist, die eine Substitution durch ein Alkalimetall, ein Erdalkalimetall oder eine basische Gruppe aufweisen, die ein Stickstoff- oder ein Phosphoratom enthält, welche durch die folgende allgemeine Formel (III) dargestellt ist:
wobei B, Y¹, Y², Y³, Y⁴, A, X, W und n die gleichen Bedeutungen aufweisen, wie sie für die allgemeine Formel (I) definiert sind, F eine fluoreszierende Gruppe darstellt, Q entweder ein tertiäres oder quartäres Stickstoffatom oder ein tertiäres oder quartäres Phosphoratom darstellt, R⁴ und R⁵ jeweils unabhängig ein Wasserstoffatom, eine lineare oder verzweigte gesättigte oder ungesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe, die 1 bis 20 Kohlenstoffatome aufweist, oder eine Cycloalkylgruppe, eine Arylgruppe oder eine Aralkylgruppe darstellen, die einen Substituenten aufweisen können, unter der Voraussetzung, dass, wenn eines von R⁴ und R⁵ ein Wasserstoffatom ist, das andere eine lineare oder verzweigte gesättigte oder ungesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe, die 1 bis 20 Kohlenstoffatome aufweist, oder eine Cycloalkylgruppe, eine Arylgruppe oder eine Aralkylgruppe darstellt, die einen Substituenten enthalten können, oder R⁴ und R⁵ miteinander verbunden sein können, um eine Stickstoff enthaltende heterozyklische Gruppe oder eine Phosphor enthaltende heterozyklische Gruppe zu bilden, die wie -Q⁺R⁴R⁵- ein Sauerstoffatom aufweisen können, Y⁵ die gleiche Bedeutung aufweist, wie sie für Y¹, Y², Y³, Y⁴ definiert ist, und mindestens eine funktionelle Gruppe, die aus B, Y¹, Y², Y³, Y⁴, Y⁵, A, W, R⁴, R⁵ und F ausgewählt ist, mindestens eine Gruppe aufweist, die aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe ausgewählt ist, die eine Substitution durch ein Alkalimetall, ein Erdalkalimetall oder eine basische Gruppe aufweisen, die ein Stickstoff- oder Phosphoratom enthält.
(3) Die Vorstufe einer eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung nach (1), wobei mindestens eine funktionelle Gruppe, die aus B, Y¹, Y², Y³, Y⁴, A und W in der Formel (I) ausgewählt ist, mindestens eine Gruppe aufweist, die aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe ausgewählt ist, die eine Substitution durch ein Alkalimetall, ein Erdalkalimetall oder eine basische Gruppe aufweisen, die ein Stickstoff- oder Phosphoratom enthält.
(4) Die eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Carbodiimid-Verbindung nach (2), wobei mindestens eine funktionelle Gruppe, die aus B, Y¹, Y², Y³, Y⁴, A und W in der Formel (III) ausgewählt ist, mindestens eine Gruppe aufweist, die aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe ausgewählt ist, die eine Substitution durch ein Alkalimetall, ein Erdalkalimetall oder eine basische Gruppe aufweisen, die ein Stickstoff- oder Phosphoratom enthält.
(5) Die eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Carbodiimid-Verbindung nach (2), wobei mindestens eine funktionelle Gruppe, die aus Y⁵, R⁴, R⁵ und F in der Formel (III) ausgewählt ist, mindestens eine Gruppe aufweist, die aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe ausgewählt ist, die eine Substitution durch ein Alkalimetall, ein Erdalkalimetall oder eine basische Gruppe aufweisen, die ein Stickstoff- oder Phosphoratom enthält.
(6) Ein Verfahren zur Herstellung der in (1) definierten Vorstufe einer eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung, welches die folgenden Schritte (A), (B) und (C) umfasst: (A) Schritt der Synthetisierung einer durch die folgende allgemeine Formel (VI) dargestellten (Thio)-Harnstoff-Verbindung durch eine Reaktion einer durch die folgende allgemeine Formel (IV) dargestellten Iso(thio)cyanat-Verbindung mit einer durch die folgende allgemeine Formel (V) dargestellten Amin-Verbindung:
wobei B, Y¹, Y², Y³, Y⁴, A, W und n die gleichen Bedeutungen aufweisen, wie sie für die vorgenannte Formel (I) definiert sind, T ein Sauerstoffatom oder ein Schwefelatom darstellt und Z eine Hydroxylgruppe, eine Alkylgruppe, eine Alkenylgruppe, eine Vinylgruppe, eine Allylgruppe, eine Phenylgruppe, eine Carboxylgruppe, eine eine Sulfonylgruppe enthaltende Derivatgruppe oder eine Phosphoniumgruppe darstellt, (B) einen Schritt der Halogenierung oder der Sulfonierung der durch die allgemeine Formel (VI) dargestellten Verbindung, welche in dem vorgenannten Schritt (A) erhalten worden ist, um eine durch die folgende allgemeine Formel (VII) dargestellte Verbindung herzustellen:
wobei B, Y¹, Y², Y³, Y⁴, A, W, n und X die gleichen Bedeutungen aufweisen, wie sie für die Formel (I) definiert sind, T ein Sauerstoffatom oder ein Schwefelatom darstellt, und (C) einen Schritt der Carbodiimidierung der durch die allgemeine Formel (VII) dargestellten Verbindung, welche in dem vorgenannten Schritt (B) erhalten worden ist, durch Dehydration oder oxidative Entschwefelungsreaktion.
(7) Das Herstellungsverfahren entsprechend (6), welches die in (3) definierte Vorstufe einer eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung herstellt, wobei mindestens eine funktionelle Gruppe, die aus B, Y¹, Y², Y³, Y⁴, A und W ausgewählt ist, mindestens eine Gruppe aufweist, die aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe ausgewählt ist, die eine Substitution durch ein Alkalimetall, ein Erdalkalimetall oder eine basische Gruppe aufweisen, die ein Stickstoff- oder Phosphoratom enthält.
(8) Ein Verfahren zur Herstellung der in (2) definierten, eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung, das den folgenden Schritt umfasst: Auswählen einer Carbodiimid-Verbindung und einer eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Verbindung aus der in (1) definierten Vorstufe einer eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung und einer eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden, durch die folgende allgemeine Formel (VIII) dargestellten Verbindung: Q'R⁴R⁵-Y⁵-F (VIII)wobei R⁴, R⁵, Y⁵ und F dieselben Bedeutungen aufweisen, wie sie für die allgemeine Formel (III) definiert sind, und Q' eine sekundären oder tertiären Stickstoff enthaltende Gruppe oder eine sekundären oder tertiären Phosphor enthaltende Gruppe darstellt, die eine Substitution durch eine Gruppe aufweisen können, die aus einer Hydroxylgruppe, einer Alkylgruppe, einer Alkenylgruppe, einer Vinylgruppe, einer Allylgruppe, einer Phenylgruppe, einer Carboxylgruppe, einer eine Sulfonylgruppe enthaltenden Derivatgruppe bzw. einer Phosphoniumgruppe ausgewählt ist, so dass mindestens eine unter Carbodiimid-Verbindung und eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Verbindung eine funktionelle Gruppe aufweisen müsste, die aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe ausgewählt ist, die eine Substitution durch ein Alkalimetall, ein Erdalkalimetall oder eine basische Gruppe aufweisen, die ein Stickstoff- oder Phosphoratom enthält, um ein Reagieren der Carbodiimid-Verbindung mit der eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Verbindung zu ermöglichen.
(9) Das Herstellungsverfahren nach (8), welches die in (4) definierte, eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Carbodiimid-Verbindung herstellt, wobei mindestens eine funktionelle Gruppe, die aus B, Y¹, Y², Y³, Y⁴, A und W ausgewählt ist, mindestens eine Gruppe aufweist, die aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe ausgewählt ist, die eine Substitution durch ein Alkalimetall, ein Erdalkalimetall oder eine basische Gruppe aufweisen, die ein Stickstoff- oder Phosphoratom enthält.
(10) Das Herstellungsverfahren nach (8), welches die in (4) definierte eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Carbodiimid-Verbindung herstellt, wobei mindestens eine funktionelle Gruppe, die aus Y⁵, R⁴, R⁵ und F ausgewählt ist, mindestens eine Gruppe aufweist, die aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe ausgewählt ist, die eine Substitution durch ein Alkalimetall, ein Erdalkalimetall oder eine basische Gruppe aufweisen, die ein Stickstoff- oder Phosphoratom enthält.
(11) Ein Verfahren zur Detektion einer Nukleinsäure durch Hybridisierung unter Verwendung einer Nukleinsäure, die mit einer Markierungssubstanz markiert ist, wobei die in (2) definierte, eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Carbodiimid-Verbindung als Markierungssubstanz verwendet wird.
(12) Das Verfahren nach (11), wobei die in (4) definierte, eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Carbodiimid-Verbindung als die Markierungssubstanz verwendet wird.
(13) Das Verfahren nach (11), wobei die in (5) definierte eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Carbodiimid-Verbindung als die Markierungssubstanz verwendet wird.

Die erfindungsgemäße, eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Carbodiimid-Verbindung zeigt ausreichende Wasserlöslichkeit und ihre Verwendung ermöglicht effektives und einfaches Einführen von fluoreszierenden Gruppen in Proteine und Nukleinsäuren. Darüber hinaus ist die erfindungsgemäße Vorstufe einer eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid- Verbindung besonders geeignet zur Herstellung der vorgenannten, eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung, weil sie einfach und effektiv an eine fluoreszierende Gruppe gebunden werden kann.
Die hier verwendete Bezeichnung "Iso(thio)cyanat-Verbindung" bezieht sich auf eine Isocyanat-Verbindung oder eine Isothiocyanat-Verbindung. Die hier verwendete Bezeichnung "(Thio)-Harnstoff-Verbindung" bezieht sich auf eine Harnstoffverbindung oder eine Thioharnstoff-Verbindung. Die hier verwendete Bezeichnung "Sulfonylgruppe enthaltende Derivatgruppe" bezieht sich auf eine einwertige Gruppe, die gebildet wird, wenn eine der Valenzen eines zweiwertigen Sulfonylmoleküls zur Bindung an ein Atom oder eine Gruppe verwendet wird. Beispiele für die eine Sulfonylgruppe enthaltende Derivatgruppe sind Alkylsulfonylgruppen und Alkoxyphenylgruppe, Genaue Beschreibung der Erfindung Im Folgenden werden Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beschrieben. Die erfindungsgemäße, eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Carbodiimid-Verbindung wird als erstes erklärt.
(1) Eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Carbodiimid-Verbindung
Die erfindungsgemäße, eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Carbodiimid-Verbindung, die mindestens eine Gruppe aufweist, die aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe ausgewählt ist, die eine Substitution durch ein Alkalimetall, ein Erdalkalimetall oder eine basische Gruppe aufweisen, die ein Stickstoff- oder ein Phosphoratom enthält, ist eine Verbindung, die durch die allgemeine Formel (III) dargestellt wird. Das Verfahren zur Herstellung dieser Verbindung ist nicht besonders eingeschränkt. Z.B. kann sie hergestellt werden, indem eine Carbodiimid-Verbindung und eine eine flouroeszierende Gruppe enthaltende Verbindung aus den Vorstufen der eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindungen, die ein Halogenatom und eine Sulfonsäuregruppe aufweisen und durch die allgemeine Formel (I) dargestellt werden, und der eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Verbindungen, die durch die allgemeine Formel (VIII), respektive, dargestellt werden, ausgewählt werden, so dass mindestens eine von Carbodiimid-Verbindung und eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Verbindung eine funktionelle Gruppe aufweist, die aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe ausgewählt ist, die eine Substitution durch ein Alkalimetall, ein Erdalkalimetall oder eine basische Gruppe aufweisen, die ein Stickstoff- oder Phosphoratom enthält, um sie miteinander reagieren zu lassen.
(i) Vorstufe einer eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung hat die Vorstufe einer eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung, die ein Halogenatom oder eine Sulfonsäuregruppe aufweist, eine durch die allgemeine Formel (I) dargestellte Struktur.
X in der Formel (I) ist nicht besonders beschränkt, so lange es entweder ein Halogenatom oder eine Sulfonsäuregruppe ist, und die bekannten Vertreter können verwendet werden. Insbesondere sind als Halogenatom wegen ihrer Reaktivität Cl-, Br- oder Iodatome bevorzugt. Als Sulfonsäuregruppe sind eine Tosylgruppe und eine Mesylgruppe wegen der Reaktivität bevorzugt.
In der Formel (I) stellt A eine funktionelle Gruppe dar, die aus der aus -CH₂-, -NHCO-, -CONH-, -O-, -S-, -NR¹, -NR²R³-, -COO-, -OCO-, -NHSO₂-, -NHC(S)NH- und -SO₂NH bestehenden Gruppe ausgewählt ist, und n stellt 0 oder 1 dar. R¹ stellt eine lineare oder verzweigte gesättigte oder ungesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe, die 1 bis 20 Kohlenstoffatome aufweist, dar. R² und R³ stellen jeweils unabhängig ein Wasserstoffatom, eine lineare oder verzweigte gesättigte oder ungesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe, die 1 bis 20 Kohlenstoffatome aufweist, oder eine Cycloalkylgruppe, eine Arylgruppe oder eine Aralkylgruppe dar, die einen Substituenten aufweisen können. Wenn jedoch eines von R² und R³ ein Wasserstoffatom ist, stellt das andere eine lineare oder verzweigte gesättigte oder ungesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe dar, die 1 bis 20 Kohlenstoffatome aufweist, oder eine Cycloalkylgruppe, eine Arylgruppe oder eine Aralkylgruppe, die einen Substituenten aufweisen können. Weiterhin können R² und R³ miteinander verbunden sein, um als Ganzes eine Stickstoff enthaltende heterozyklische Gruppe zu bilden, die ein Sauerstoffatom aufweisen kann. Wie oben beschrieben, stellt n 0 oder 1 dar, und so kann die durch die allgemeine Formel (I) dargestellte Verbindung A enthalten oder nicht enthalten.
Eine aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe ausgewählte Gruppe, die eine Substitution durch ein Alkalimetall, ein Erdalkalimetall oder eine basische Gruppe aufweisen, die ein Stickstoff- oder Phosphoratom enthält, kann jedes ersetzbare Wasserstoffatom in A substituiert haben.
W stellt eine direkte Bindung oder eine quartäre Oniumgruppe dar. Die hier verwendete Bezeichnung "quartäre Oniumgruppe" bezieht sich auf eine Gruppe, die ein quartäres Oniumsalz bilden kann, wenn sie in die Verbindung mit der Formel (I) eingeführt wird. Spezifische Beispiele für solche quartäre Oniumgruppen schließen solche ein, die durch die folgenden allgemeinen Formeln (IX), (X) und (XI) dargestellt werden:
in denen R⁶, R⁷, R⁸ und R⁹ jeweils unabhängig eine lineare oder verzweigte gesättigte oder ungesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe, die 1 bis 20 Kohlenstoffatome aufweist, eine Cycloalkylgruppe, eine Arylgruppe oder eine Aralkylgruppe, die 6 bis 20 Kohlenstoffatome aufweist, darstellen. Diese Kohlenwasserstoffgruppen können eine Substitution durch eine Carboxylgruppe, eine Sulfongruppe, eine eine Sulfongruppe enthaltende Derivatgruppe, eine Phosphonogruppe, eine Phenylgruppe, eine Cycloalkylgruppe oder eine Hydroxylgruppe aufweisen.
Unter den oberen quartären Oniumgruppen werden besonders bevorzugte in der Erfindung verwendete Gruppen durch die Formel (IX) dargestellt, in der R⁶ und R⁷ Alkylgruppen sind, und durch die allgemeine Formel (X).
Weiterhin kann eine aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe ausgewählte Gruppe, die eine Substitution durch ein Alkalimetall, ein Erdalkalimetall oder eine basische Gruppe aufweisen, die ein Stickstoff- oder Phosphoratom enthält, jedes ersetzbare Wasserstoffatom in W substituiert haben.
Y¹ Y² Y³ und Y⁴ sind Verbindungen, die Carbodiimid-Gruppen an B, A oder X binden, und jede unter ihnen stellt eine durch die allgemeine Formel (II) dargestellte funktionelle Gruppe dar. In der allgemeinen Formel (II) stellt L eine funktionelle Gruppe dar, die aus der aus -CH₂-, -NHCO-, -CONH-, -O-, -S-, -NR¹, -NR²R³-, -COO-, -OCO-, -NHSO₂-, -NHC(S)NH- und -SO₂NH bestehenden Gruppe ausgewählt ist; p und q stellen jeweils unabhängig eine ganze Zahl zwischen 1 bis 20 dar; und r stellt 0 oder 1 dar. R¹, R² und R³ haben sie selben Bedeutungen wie in der Formel (I).
Eine direkte Bindung oder eine Alkylengruppe, die in ihrer Hauptkette 1 bis 10 Kohlenstoffatome aufweist und als Seitenkette eine Methylgruppe haben kann, kann bevorzugt als Y¹, Y², Y³ und Y⁴ verwendet werden. Diese Alkylengruppe ist nicht besonders eingeschränkt und es können die bekannten Vertreter verwendet werden. Y¹, Y², Y³ und Y⁴ können die Alkylengruppen sein, die über eine aus der aus -NHCO-, -CONH-, -O-, -S-, -NR¹, -NR²R³-, -COO, -OCO-, -NHSO₂-, -NHC(S)NH- und -SO₂NH bestehenden Gruppe ausgewählten funktionelle Gruppe gebunden sind.
Weiterhin kann eine aus einer Carboxylgruppe; einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe ausgewählte Gruppe, die eine Substitution durch ein Alkalimetall, ein Erdalkalimetall oder eine basische Gruppe aufweisen, die ein Stickstoff- oder Phosphoratom enthält, jedes ersetzbare Wasserstoffatom in jedem der Y¹, Y², Y³ und Y⁴ substituiert haben.
B stellt ein Wasserstoffatom oder eine einwertige organische Gruppe dar. Diese einwertige organische Gruppe kann entweder die selbe oder eine andere sein, wie die in W-Y¹-[A]_n-Y⁴-X in der Formel (I). Sie ist vorzugsweise eine Alkylgruppe, eine tertiäre Aminogruppe oder eine quartäre Ammoniumgruppe und bevorzugte Beispiele sind im folgenden aufgeführt.

(a) Eine Stickstoff enthaltende heterozyklische Gruppe, in der ein Stickstoffatom durch ein Wasserstoffatom, eine gesättigte oder ungesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe, eine Arylgruppe, eine Aralkylgruppe oder eine eine fluoreszierende Gruppe enthaltende organische Gruppe wie eine Pyridylgruppe, eine Pyrrolidingruppe und eine Piperidingruppe in einen quartären Stickstoff überführt wurde.
(b) Eine Aminogruppe, in der ein Stickstoffatom durch ein Wasserstoffatom, eine gesättigte oder ungesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe, eine Arylgruppe, eine Aralkylgruppe oder eine eine fluoreszierende Gruppe enthaltende organische Gruppe wie eine Dimethylaminogruppe, eine Diethylaminogruppe und eine Diisopropylaminogruppe in einen quartären Stickstoff überführt wurde.
(c) Eine heterozyklische tertiäre Aminogruppe oder quartäre Ammoniumgruppe, die durch die folgenden allgemeinen Formeln (XII) oder (XIII) dargestellt wird:
in denen R¹¹ und R¹² jeweils unabhängig ein Wasserstoffatom, eine lineare oder verzweigte gesättigte oder ungesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe, die 1 bis 10 Kohlenstoffatome aufweist, eine Arylgruppe oder eine Aralkylgruppe darstellen, J stellt ein Anion wie ein Sulfation, ein Alkylsulfation, ein Arylsulfation, ein Halosulfation und ein Halogenidion dar, R¹³ stellt ein Sauerstoffatom oder ein ionisiertes Atom davon oder eine Methylengruppe dar, und m stellt 0 oder 1 dar.
Genauer können diejenigen Gruppen, die durch die folgenden Formeln dargestellt werden, genannt werden
in denen R¹⁴ und R¹⁵ jeweils unabhängig ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe, die 1 bis 10 Kohlenstoffatome aufweist, oder eine Phenylgruppe, die mit einer Alkylgruppe, die 1 bis 10 Kohlenstoffatome aufweist, substituiert ist, darstellen.
(d) Eine Alkylgruppe, die einen Substituenten haben kann, z.B. eine Methylgruppe, eine Ethylgruppe, eine n-Propylgruppe, eine Isopropylgruppe, eine n-Butylgruppe, eine sek.-Butylgruppe, eine tert.-Butylgruppe und eine Cyclohexylgruppe, eine Arylgruppe wie eine Phenylgruppe und so weiter.

Eine aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe ausgewählte Gruppe, die eine Substitution durch ein Alkalimetall, ein Erdalkalimetall oder eine basische Gruppe aufweisen, die ein Stickstoffatom oder ein Phosphoratom enthält, kann jedes ersetzbare Wasserstoffatom in B substituiert haben.
Wie oben beschrieben, kann in der erfindungsgemäßen Vorstufe einer eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung mit einem Halogenatom oder einer Sulfonsäuregruppe, die durch die allgemeine Formel (I) dargestellt wird, jede der durch B, Y¹, Y², Y³, Y⁴, A und W dargestellten funktionellen Gruppen mindestens eine Gruppe aufweisen, die aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe ausgewählt ist, die eine Substitution durch ein Alkalimetall, ein Erdalkalimetall oder eine basische Gruppe aufweisen, die ein Stickstoff- oder Phosphoratom enthält. Jedoch ist es vorteilhaft, dass mindestens eine funktionelle Gruppe, die aus diesen Gruppen ausgewählt ist, mindestens eine aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe ausgewählte Gruppe aufweisen, die eine Substitution durch ein Alkalimetall, ein Erdalkalimetall oder eine basische Gruppe aufweisen, die ein Stickstoff- oder Phosphoratom enthält.
Spezifische Beispiele für die Carboxylgruppe, die Sulfongruppe, die Phosphonogruppe und die Phosphogruppe, die eine Substitution durch das Alkalimetall, das Erdalkalimetall oder die basische Gruppe aufweisen, die ein Stickstoffatom oder ein Phosphoratom enthält, sind -COONa, -COOK, (-COO)₂Mg, (-COO)₂Ca, (-COO)₂Ba, -COONH₄, -COONHR¹H₃, -COONR¹ ₂H₂, -COONR¹ ₃H, -COONR¹ ₄, -SO₃Na, -SO₃NH₄, -SO₃NHR¹H₃, -SO₃NR¹ ₂H₂, -SO₃NR¹ ₃H, -SO₃NR¹ ₄, -PO₃Na₂, -PO₃K₂, -PO₃Ca, -PO₃(NH₄)₂, -PO₃(NR¹H₃)₂, -PO₃(NR¹H₂)₂, -PO₃(NH¹ ₃H)₂, -PO₃(NR¹ ₄)₂, -OPO₃Na₂, -OPO₃K₂, -OPO₃(NR¹ ₄)₂, und so fort, wobei R¹ die selbe Bedeutung wie in der Formel (I) hat.
Spezifische Beispiele für die durch die Formel (I) dargestellte, erfindungsgemäße, eine Vorstufe einer eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung schließen z.B. N-Methyl-(3-morpholinopropyl)-N-(hexan-6-iodid)-carbodiimid, N-Methyl-(3-morpholinopropyl)-N-(hexan-6-bromid)-carbodiimid, N-Methyl-(3-morpholinopropyl)-N-(hexan-6-chlorid)-carbodiimid, N-Methyl-(3-morpholinopropyl)-N-(hexan-6-tosylat)-carbodiimid, N-Methyl-(3-morpholinopropyl)-N-(hexan-6-mesylat)-carbodiimid, N-Methyl-(3-morpholinopropyl)-N-propyl(natrium-2-ethylcarboxylat)-3-iodid)-carbodiimid, N-Methyl-(3-morpholinopropyl)-N-propyl(kalium-2-ethylcarboxylat)-3-iodid)-carbodiimid, N-Methyl-(3-morpholinopropyl)-N-(propyl-(natrium-2-propylcarboxylat)-3-iodid)-carbodiimid, N-Methyl-(3-morpholinopropyl)-N-(propyl-(natrium-2-isopropylcarboxylat)-3-iodid)-carbodiimid, usw, ein.
(ii) Eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Carbodiimid-Verbindung
Die erfindungsgemäße, eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Carbodiimid-Verbindung, die mindestens eine Gruppe aufweist, die aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe ausgewählt ist, die eine Substitution durch ein Alkalimetall, ein Erdalkalimetall oder eine basische Gruppe aufweisen, die ein Stickstoff- oder Phosphoratom enthält, kann erhalten werden, indem z.B. eine Carbodiimid-Verbindung und eine eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Verbindung aus den Vorstufen der eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindungen, die das Halogenatom oder die Sulfonsäuregruppe aufweisen und durch die allgemeine Formel (I) dargestellt werden, und den durch die allgemeine Formel (VIII) dargestellten, eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Verbindungen, respektive, ausgewählt werden, so dass mindestens eine von Carbodiimid-Verbindung und eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Verbindung eine funktionelle Gruppe aufweisen müsste, die aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphongruppe und einer Phosphogruppe ausgewählt ist, die eine Substitution durch ein Alkalimetall, ein Erdalkalimetall oder eine basische Gruppe aufweisen, die ein Stickstoff- oder Phosphoratom enthält, so dass sie miteinander reagieren können. Die Struktur der erfindungsgemäßen, eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung wird durch die allgemeine Formel (III) dargestellt.
Die fluoreszierende Gruppe F in der Formel (III) ist nicht besonders eingeschränkt und irgendeine der bekannten fluoreszierenden Gruppen kann verwendet werden. Spezifische Beispiele dafür schließen z.B. diejenigen von Anthracenderivaten, Coumarinderivaten, Pyrenderivaten, Perylenderivaten, Dansylderivaten, Rhodaminderivaten, Oxazolderivaten, Benzothiazolderivaten, Benzoxadiazolderivaten, Bordipyrromethandiflouridderivaten, Thiazolorangederivaten, fluoreszierenden Seltenerdenmetallverbindungsderivaten, Cyaninderivaten usw. abgeleiteten ein.
Eine aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphongruppe und einer Phosphogruppe ausgewählte Gruppe, die eine Substitution durch ein Alkalimetall, ein Erdalkalimetall oder eine basische Gruppe aufweisen, die ein Stickstoff- oder Phosphoratom enthält, kann gegen jedes ersetzbare Wasserstoffatom der fluoreszierenden Gruppe ausgetauscht sein.
In der Formel (III) stellt Q ein tertiäres oder quartäres Stickstoffatom oder Phosphoratom dar. In der Formel (III) stellen R⁴ und R⁵ jeweils unabhängig ein Wasserstoffatom, eine lineare oder verzweigte gesättigte oder ungesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe, die 1 bis 20 Kohlenstoffatome aufweist, oder eine Cycloalkylgruppe, eine Arylgruppe oder eine Aralkylgruppe dar, die einen Substituenten aufweisen können. Jedoch, wenn eines von R⁴ und R⁵ ein Wasserstoffatom ist, stellt das andere eine lineare oder verzweigte gesättigte oder ungesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe, die 1 bis 20 Kohlenstoffatome aufweist, dar, oder eine Cycloalkylgruppe, eine Arylgruppe oder eine Aralkylgruppe, die einen Substituenten enthalten können. Weiterhin können oder R⁴ und R⁵ miteinander verbunden sein, um eine Stickstoff enthaltende heterozyklische Gruppe oder eine Phosphor enthaltende heterozyklische Gruppe zu bilden, die ein Sauerstoffatom aufweisen können wie -Q⁺R⁴R⁵-. D.h. das Q bildet in Kombination mit R⁴ und R⁵ eine quartäre Oniumgruppe in Form von -Q⁺R⁴R⁵-. Bevorzugte Beispiele für die tertiäre oder quaratäre Oniumgruppe schließen diejenigen quartären Oniumgruppen ein, die als bevorzugte Gruppen für W genannt wurden.
Eine aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe ausgewählte Gruppe, die eine Substitution durch ein Alkalimetall, ein Erdalkalimetall oder eine basische Gruppe aufweisen, die ein Stickstoff- oder Phosphoratom enthält, kann als Substituenten jeden ersetzbaren Wasserstoffatom in R⁴ und R⁵ ersetzt haben.
In der Formel (III) haben B, Y¹, Y², Y³, Y⁴, A, X, W, R², R³ und n die selben Bedeutungen wie sie in der allgemeinen Formel (I) definiert wurden. Weiterhin hat Y⁵ in der Formel (III) die selbe Bedeutung, wie sie für Y¹, Y², Y³ und Y⁴ in der Formel (I) definiert wurde.
Wie oben beschrieben, kann in der erfindungsgemäßen, durch die allgemeine Formel (III) dargestellten eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung jede der durch B, Y¹, Y², Y³, Y⁴, Y⁵, A, W, R⁴, R⁵ und F dargestellten funktionellen Gruppen eine Gruppe aufweisen, die aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe ausgewählt ist, die eine Substitution durch ein Alkalimetall, ein Erdalkalimetall oder eine basische Gruppe aufweisen, die ein Stickstoff- oder Phosphoratom enthält. Gleichzeitig ist es notwendig, dass mindestens eine der aus diesen funktionellen Gruppen ausgewählten Gruppen eine Gruppe aufweist, die aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe ausgewählt ist, die eine Substitution durch ein Alkalimetall, ein Erdalkalimetall oder eine basische Gruppe aufweisen, die ein Stickstoff- oder Phosphoratom enthält Zum Beispiel kann in der durch die allgemeine Formel (III) dargestellten, erfindungsgemäßen, eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Verbindung, die erhalten werden kann, indem man die durch die allgemeine Formel (I) dargestellte Vorstufe einer eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung, die ein Halogenatom oder eine Sulfonsäuregruppe aufweist, mit der durch die allgemeine Formel (VIII) dargestellten, die fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung reagieren lässt, wobei zumindest eine der aus B, Y¹, Y², Y³, Y⁴, A und W ausgewählten, aus der Vorstufe stammenden funktionellen Gruppen aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe ausgewählt ist, die eine Substitution durch ein Alkalimetall, ein Erdalkalimetall oder eine basische Gruppe aufweisen, die ein Stickstoff- oder Phosphoratom enthält, und irgendeine der von Y⁵, R⁴, R⁵ und F dargestellten funktionellen Gruppen, die von der die fluoreszierende Gruppe enthaltenden Verbindung stammen, eine Gruppe aufweisen oder nicht aufweisen kann, die aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe ausgewählt ist, die eine Substitution durch ein Alkalimetall, ein Erdalkalimetall oder eine basische Gruppe aufweisen, die ein Stickstoff- oder Phosphoratom enthält.
Ähnlich, wenn mindestens eine der von Y⁵, R⁴, R⁵ und F dargestellten funktionellen Gruppen, die von der die fluoreszierende Gruppe enthaltenden Verbindung stammen, eine Gruppe aufweist, die aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe ausgewählt ist, die eine Substitution durch ein Alkalimetall, ein Erdalkalimetall oder eine basische Gruppe aufweisen, die ein Stickstoff- oder Phosphoratom enthält, kann irgendeine der von B, Y¹, Y², Y³, Y⁴, A und W dargestellten, aus der Vorstufe stammenden funktionellen Gruppen eine aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe ausgewählte Gruppe, die eine Substitution durch ein Alkalimetall, ein Erdalkalimetall oder eine basische Gruppe aufweisen, die ein Stickstoff- oder Phosphoratom enthält, aufweisen oder nicht aufweisen.
Spezifische Beispiele für die erfindungsgemäße, eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Carbodiimid-Verbindung, die durch die allgemeine Formel (III) dargestellt wird, schließen z.B. das Kalium-N-Methyl-(3-morpholinopropyl)-N-(hexan-6-(N-3-dimethylaminopropyl)-1-(Rhodamin B)thioharnstoffsalz)carbodiimid, Natrium-N-Methyl-(3-morpholinopropyl)-N-(hexan-6-(N-3-dimethylaminopropyl)-1-(Rhodamin B)thioharnstoffsalz)carbodiimid, Tetraammonium-N-Methyl-(3-morpholinopropyl)-N-(hexan-6-(N-3-dimethylaminopropyl)-1-(Rhodamin B)thioharnstoffsalz)carbodiimid, Kalium-N-Methyl-(3-morpholinopropyl)-N-(hexan-6-(N-3-dimethylaminopropyl)-1-fluoroescinthioharnstoffsalz)carbodiimid, 2-[2-[3[[1,3-Dihydro-1,1-dimethyl-3-(4-sulfobutyl)-2H-indol-2-yliden]ethyliden]-2-phenoxy-1-cyclohexen-1-yl]ethenyl]-1,1-dimethyl[3-propylthioharnstoff-N-methyl-(3-morpholinopropyl)-N-hexan-6-(N-3-(dimethylaminopropyl)carbodiimid))] 1H-benz[e]-indoliumsalz, Trinatrium-N-Methyl-(3-morpholinopropyl)-N-(hexan-6-(N-3-(dimethylaminopropyl)-1-(Cascade Blau)aminoethyl-4-azidobenzamidsalz)carbodiimid usw. ein.
Das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen, eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung wird im Folgenden erklärt.
(2) Verfahren zur Herstellung der eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung
Während das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen, eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung nicht besonders eingeschränkt ist, wird sie im Allgemeinen hergestellt, indem eine Carbodiimid-Verbindung und eine eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Verbindung aus der durch die allgemeine Formel (I) dargestellten Vorstufe einer eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung und der durch die allgemeine Formel (VIII) dargestellten, eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Verbindung, respektive, ausgewählt wird, so dass zumindest eine unter Vorstufe einer Carbodiimid-Verbindung und eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Verbindung eine funktionelle Gruppe haben müsste, die aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe, die eine Substitution durch ein Alkalimetall, ein Erdalkalimetall oder eine basische Gruppe aufweisen, die ein Stickstoff- oder Phosphoratom enthält, ausgewählt ist, um sie miteinander reagieren zu lassen.
Spezieller kann die erfindungsgemäße, eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Carbodiimid-Verbindung hergestellt werden, indem (i) ein Schritt der Herstellung der durch die allgemeine Formel (I) dargestellten Vorstufe einer eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung, (ii) ein Schritt der Herstellung der durch die allgemeine Formel (VIII) dargestellten eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Verbindung, und (iii) ein Schritt, bei dem man die im Schritt (i) hergestellte Vorstufe einer eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung, und die im Schritt (ii) hergestellte, durch die allgemeine Formel (VIII) dargestellte, eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Verbindung miteinander reagieren lässt. Bei der oben beschriebenen Herstellung werden die durch die allgemeine Formel (I) dargestellte Vorstufe einer eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung und die durch die allgemeine Formel (VIII) dargestellte, eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Verbindung kombiniert, so dass mindestens eine der beiden Verbindungen eine funktionelle Gruppe, die aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe, die eine Substitution durch ein Alkalimetall, ein Erdalkalimetall oder eine basische Gruppe aufweisen, die ein Stickstoff- oder Phosphoratom enthält, ausgewählt ist, aufweisen müsste.
(i) Schritt zur Herstellung der durch die allgemeine Formel (I) dargestellten Vorstufe einer eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung
Die in der vorliegenden Erfindung verwendete Vorstufe einer eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung, die ein Halogenatom oder eine Sulfonsäuregruppe aufweist, kann entsprechend der Struktur einer gewünschten, eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung ausgewählt werden. Das Verfahren zur Herstellung einer solchen Vorstufe einer eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung, die ein Halogenatom oder eine Sulfonsäuregruppe aufweist, ist nicht besonders eingeschränkt. Z.B. kann sie durch (A) Herstellung einer Harnstoff- oder Thioharnstoffverbindung ausgehend von einer Isocyanatverbindung und einer Aminverbindung wie einem Derivat eines primären Amins mit einer funktionellen Gruppe, die zur Umwandlung in ein halogeniertes Derivat oder sulfoniertes Derivat, nötig ist, (B) Halogenierung oder Sulfonierung der (Thio)-Harnstoffverbindung, und (C) Carbodiimidierung der resultierenden Verbindung durch Dehydrierung oder oxidative Entschwefelung hergestellt werden. Die Schritte (A), (B) und (C) werden im Folgenden genauer beschrieben.
(A) Schritt zur Herstellung der (Thio)-Harnstoffverbindung
Harnstoffverbindungen können im Allgemeinen mittels einer Reaktion einer Aminoverbindung und einer Isocyanatverbindung synthetisiert werden [J.H. Saunders und R. Slocombe, Chem. Rev., 43, 203 (1948)]. Weiterhin ist es gängige Praxis, dass (Thio)-Harnstoffderivate durch eine Reaktion einer Aminoverbindung und einer Isothiocyanatverbindung hergestellt werden [N. A. Ivanov, R. V. Viasova, V. A. Gancharava und L. N. Smirnov, Izv. Vyssh, Zaved. Khim. Tekhnol., 19 (7), 1010 (1976)].
Die vorgenannten Verfahren können ebenfalls als Herstellungsverfahren für die vorliegende Erfindung verwendet werden. Die durch die allgemeine Formel (VI) dargestellte (Thio)-Harnstoffverbindung kann hergestellt werden, indem man die durch die allgemeine Formel (IV) dargestellte Iso(thio)cyanatverbindung und eine Aminoverbindung mit einer funktionellen Gruppe, die zur Umwandlung in ein durch die allgemeine Formel (V) dargestelltes halogeniertes Derivat oder sulfoniertes Derivat, nötig ist, miteinander reagieren lässt. Die durch diese Reaktion erhaltene, durch die allgemeine Formel (VI) dargestellte Thioharnstoffverbindung hat auch eine funktionelle Gruppe, die zur Umwandlung in ein halogeniertes Derivat oder sulfoniertes Derivat, nötig ist, z.B. eine Hydroxylgruppe, eine Alkylgruppe, eine Alkenylgruppe, eine Vinylgruppe, eine Allylgruppe, eine Phenylgruppe, eine Carboxylgruppe, eine eine Sulfonylgruppe enthaltende Derivatgruppe, ein Phosphoniumion, usw.
Als spezifische Beispiele für die vorgenannte Reaktion können z.B. genannt werden: eine Reaktion durch Mischen der durch die allgemeine Formel (IV) dargestellten Iso(thio)cyanatverbindung wie N-(3-Morpholinopropyl)isothiocyanat, N-(3-Dimethylaminopropyl-N-3-(4-morpholino)propyl)isothiocyanat, 1-Ethyl-3,3-diemethylamino-propyl-isothiocyanat und Bis(3,3-diethylamino)propyl-isothiocyanat, mit der Aminoverbindung, die eine funktionelle Gruppe hat, die zur Umwandlung in ein durch die allgemeine Formel (V) dargestelltes halogeniertes Derivat oder sulfoniertes Derivat, nötig ist, wie 6-Aminohexanol, 5-Aminopentanol, 4-Aminobutanol und 3-Aminopentanol, in einem bekannten Lösungsmittel wie Dichlormethan, Chloroform und Dimethylformamid (im Folgenden mit "DMF" abgekürzt). So kann die (Thio)-Harnstoffverbindung mit der funktionellen Gruppe, die zur Umwandlung in ein durch die allgemeine Formel (VI) dargestelltes halogeniertes Derivat oder sulfoniertes Derivat nötig ist, erhalten werden.
Weiterhin können neben dem vorgenannten Verfahren eine erste Aminoverbindung und Harnstoff kondensiert werden, um einfach substituierten Harnstoff zu erhalten, und der einfach substituierte Harnstoff kann mit einem zweiten primären Amin zur Reaktion gebracht werden, das eine funktionelle Gruppe, die zur Umwandlung in ein halogeniertes Derivat oder sulfoniertes Derivat, nötig ist, aufweist, um eine zweifach substituierte Harnstoffzwischenstufe zu erhalten [T. L. Davis und K.C. Blanchard, Org. Synth. Coll Vol. 1, 453 (1941)] entsprechend dem folgenden Reaktionsschema:
wobei B, Y¹, Y², Y³, Y⁴, A, W und n die gleichen Bedeutungen aufweisen, wie sie für die Formel (I) definiert wurden, T ein Sauerstoffatom oder ein Schwefelatom darstellt, und Z eine Hydroxylgruppe, eine Alkylgruppe, eine Alkenylgruppe, eine Vinylgruppe, eine Allylgruppe, eine Phenylgruppe, eine Carboxylgruppe, eine eine Sulfonylgruppe enthaltende Derivatgruppe oder eine Phosphoniumgruppe darstellt.
Weiterhin kann der einfach substituierte Harnstoff auch durch die Reaktion einer ersten Aminoverbindung und Zyansäure oder einem Salz davon synthetisiert werden [F. Kurzer, Org. Synth. Coll., Vol. 4, 49 (1963)]. Weiterhin ist es auch möglich, ein erstes primäres Amin mit einer funktionellen Gruppe, die zur Umwandlung in ein halogeniertes Derivat oder sulfoniertes Derivat, nötig ist, für die obigen Reaktionen zu verwenden. In diesem Fall kann das zweite Amin eine funktionelle Gruppe, die zur Umwandlung in ein halogeniertes Derivat oder sulfoniertes Derivat, nötig ist, aufweisen oder nicht.
Zusätzlich kann das zweifach substituierte Harnstoffderivat auch direkt durch eine Reaktion einer Aminoverbindung mit einer funktionellen Gruppe, die zur Umwandlung in ein halogeniertes Derivat oder sulfoniertes Derivat, nötig ist, und einer Isocyanatverbindung erhalten werden.
Wenn die durch die allgemeine Formel (VI) dargestellte (Thio)-Harnstoffverbindung eine Gruppe aufweist, ein tertiares Stickstoffatom oder ein Phosphoratom enthält, wie eine Morpholinoalkylgruppe, eine Morpholinoalkylestergruppe, eine Morpholinoalkylethergruppe, eine Morpholinoalkylamidgruppe, eine Morpholinoalkylketongruppe, eine Morpholinoalkylthioharnstoffgruppe, eine Trialkylaminogruppe, eine (Trialkylester)aminogruppe, eine Trialkyletheraminogruppe, eine Trialkylamidoaminogruppe, eine (Trialkylketon)aminogruppe, eine Trialkylthioharnstoffaminogruppe, eine Trialkylphosphoniumgruppe, eine (Trialkylester)phosphoniumgruppe, eine (Trialkylether)phosphoniumgruppe, eine Trialkylamidophosphoniumgruppe, eine (Trialkylketon)phosphoniumgruppe und eine Trialkylthioharnstoffphosphoniumgruppe, kann ihre Wasserslöslichkeit verbessert werden, indem sie in ein quartäres Oniumsalz mittels einer Reaktion mit Methyl-p-toluensulfonat, Methyliodid, Dimethylsulfat usw. in einem bekannten Lösungsmittel wie DMF überführt wird.
Wie unten erklärt wird, kann der vorgenannte Schritt (A) auch mittels zweier Schritte (A'), einem Schritt zur Herstellung einer Harnstoff oder Thioharnstoffverbindung, ausgehend von einer Iso(thio)cyanatverbindung und einer Aminoverbindung wie Derivaten von primären Aminen, und (A") einem anschließenden Schritt, bei dem eine funktionelle Gruppe, die zur Umwandlung in ein halogeniertes Derivat oder sulfoniertes Derivat, nötig ist, in die (Thio)-Harnstoffverbindung eingeführt wird, durchgeführt werden.
Bei diesem Verfahren wird eine durch die folgenden allgemeine Formel (IV') dargestellte (Thio)-Harnstoffverbindung zuerst im Schritt (A) durch eine Reaktion einer Iso(thio)cyanatverbindung ähnlich der durch die allgemeine Formel (IV) dargestellten, und einer durch die folgende allgemeine Formel (V') dargestellten Aminoverbindung synthetisiert. Wie die vorgenannte Reaktion ist auch diese Reaktion eine gewöhnliche Reaktion einer Iso(thio)cyanatzverbindung und einer Aminverbindung.
In den Formeln haben B, Y² und Y³ die selbe Bedeutung wie für die allgemeine Formel (I) definiert, W' stellt eine Gruppe dar, die eine sekundäres oder tertiäres Stickstoffatom oder ein sekundäres oder tertiäres Phosphoratom enthält, die eine Substitution durch eine Gruppe aufweisen können, die aus einer Hydroxylgruppe, einer Alkylgruppe, einer Alkenylgruppe, einer Vinylgruppe, einer Allylgruppe, einer Phenylgruppe, einer Carboxylgruppe, einer eine Sulfonylgruppe enthaltenden Derivatgruppe und einer Phosphoniumgruppe ausgewählt ist, und T stellt ein Sauerstoffatom oder ein Schwefelatom dar.
Thioharnstoffgruppen wie die unten genannten können auch wie die durch die Formel (IV') dargestellte Verbindung, durch eine Reaktion einer Aminverbindung und Kohlenstoffdisulfid synthetisiert werden [W. W. Lewis, Jr. und E. A. Waipert, U.S. Patent Nr. 3,168,560 (1965)].
In den Formeln haben B und Y³ die selben Bedeutungen wie für die allgemeine Formel (I) definiert. Zusätzlich kann eine solche zweifach substituierte Harnstoffzwischenstufe wie die unten erwähnte synthetisiert werden wie die durch die Formel (IV') dargestellte, indem eine Aminoverbindung und Harnstoff kondensiert werden, um einfach substituierten Harnstoff zu erhalten, und man das Produkt dann mit einem zweiten Amin oder dem selben Amin reagieren lässt [T. L. Davies und K. C. Blanchard, Org. Synth. Coll. Vol 1, 453, (1941)]
In den Formeln haben B, Y² und Y³ die selbe Bedeutung wie für die allgemeine Formel (I) definiert und W' stellt eine Oniumgruppe da, die substituiert sein kann.
Weiterhin kann der einfach substituierte Harnstoff auch durch eine Reaktion einer Aminoverbindung und Zyansäure oder einem Salz davon synthetisiert werden [F. Kurzer, Org. Synth. Coll. Vol. 4, 49 (1963)].
Dann wird der Schritt (A'') durchgeführt, bei dem man die durch die allgemeine Formel (IV') dargestellte im vorgenannten Schritt (A') erhaltene Thioharnstoffverbindung mit einer Aminoverbindung reagieren lässt, die eine funktionellen Gruppe aufweist, die zur Umwandlung in ein durch die allgemeine Formel (V'') dargestelltes halogeniertes Derivat oder sulfoniertes Derivat, nötig ist, um die durch die allgemeine Formel (VI) dargestellte Verbindung herzustellen.
In der Formel weisen B, Y¹, Y², Y³, Y⁴, W, A, und n die gleichen Bedeutungen auf, wie sie für die allgemeine Formel (I) definiert sind, T stellt ein Sauerstoffatom oder ein Schwefelatom dar, D stellt eine Hydroxylgruppe, ein Halogenatom oder eine eine Sulfonylgruppe enthaltende Derivatgruppe dar, und Z stellt eine Hydroxylgruppe, eine Alkylgruppe, eine Alkenylgruppe, eine Vinylgruppe, eine Allylgruppe, eine Phenylgruppe, eine Carboxylgruppe, eine eine Sulfonylgruppe enthaltende Y Derivatgruppe oder eine Phosphoniumgruppe dar.
Wie oben beschrieben, kann die durch die allgemeine Formel (VI) dargestellte (Thio)-Harnstoffgruppe mit einer funktionellen Gruppe, die zur Umwandlung in ein halogeniertes Derivat oder sulfoniertes Derivat, nötig ist, im Schritt (A) durch die vorgenannte einstufige Reaktion oder die zweistufige Reaktion der Schritte (A') und (A") erhalten werden.
(B) Halogenierungs- oder Sulfonierungsschritt
Was das Verfahren zur Einführung eines Halogenatoms in die durch die allgemeine Formel (VI) dargestellte (Thio)-Harnstoffverbindung, betrifft, so kann, nachdem eine Hydroxylgruppe in die (Thio)-Harnstoffverbindung eingeführt worden ist, das Halogenatom in die (Thio)-Harnstoffverbindung eingeführt werden, indem z.B. die (Thio)-Harnstoffverbindung mit einem Halogenierungsreagens, z.B. einem Halogenwasserstoff, einem Natriumhalogenid, einem Kaliumhalogenid, einem Phosphohalogenid, halogeniertem Phosphonsäuretriester, einem Phosphinhalogenid, einem Thionylhalogenid, eine Halogensäureverbindung usw. in einem bekannten Lösungsmittel wie DMF, Benzol und Pyridin vermischt wird, so dass sie miteinander reagieren können [O. Kamm, C. S. Marvel, Org. Synth., 1, 25, (1941); T. A. Wunk, P. Kovacic, J. Am. Chem. Soc., 97, 5807 (1975); J. D. Barrleson, R. E. Burk, H. P. Lankelma, J. Am. Chem. Soc., 68, 2513 (1946); K. Friedlich, H. K. Thieme, Synthesis, 111 (1973); H. Stone, H. Shechter, Org. Synth., 4, 323 (1963); T. H. Bevan, T. Malkin, D. B. Smitz, J. Chem. Soc., 1383 (1955)].
Spezifische Beispiele für das Halogenierungsreagenz schließen Bromwasserstoffsäure, Natriumbromid, Zinkchlorid, Phosphortribromid, Phosphortrichlorid, Kaliumiodid, Methyltriphenylphosphonsäureiodid, Iod, Natriumiodid, Methansulphonylchlorid, Triphenylphosphindibromid, Triphenylphosphindichlorid, Triphenylphosphindiiodid, Thionylchlorid, Thionylbromid usw. ein.
Weiterhin, was das Verfahren zum Einführen einer Sulfonsäuregruppe in die durch die allgemeine Formel (VI) dargestellte (Thio)-Harnstoffverbindung betrifft, so kann dann, wenn in die (Thio)-Harnstoffverbindung eine Hydroxylgruppe eingeführt worden ist, die Sulfonsäuregruppe in die (Thio)-Harnstoffverbindung eingeführt werden, indem z.B. die Verbindung mit einem Sulfonierungsreagenz wie einem Sulfonsäurehalogenid in einem bekannten Lösungsmittel wie Dichlormethan und Chloroform vermischt wird, so dass sie miteinander reagieren können.
Spezifische Beispiele für das Sulfonierungsagens schließen Benzensulfonsäurechlorid, p-Toluensulfonsäurechlorid, Methansulfonsäurechlorid, p-Toluensulfonsäurebromid, Methansulfonsäurebromid usw. ein.
Auf diese Weise kann ein halogeniertes oder sulfoniertes Derivat der durch die allgemeine Formel (VII) dargestellten (Thio)-Harnstoffverbindung durch Halogenierung oder Sulfonierung der durch die allgemeine Formel (VI) dargestellten (Thio)-Harnstoffverbindung erhalten werden.
(C) Schritt der Dehydrierung oder der oxidativen Entschwefelung
Beim erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren kann die durch die allgemeine Formel (I) dargestellte, erfindungsgemäße Vorstufe einer eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung aus der durch die allgemeine Formel (VII) dargestellten Verbindung erhalten werden, indem sie einer Dehydrierung oder der oxidativen Entschwefelung unterzogen wird.
Die Dehydrierungsreaktion wird bei den Harnstoffverbindungen verwendet, die unter den durch die allgemeine Formel (VII) dargestellten Verbindungen als T ein Sauerstoffatom enthalten, und sie kann durchgeführt werden, indem die Harnstoffverbindung mit p-Toluensulfonsäurechlorid in einer tertiären Aminverbindung erhitzt wird [G. Amiard und R. Heymers, Bull. Soc. Chim. Fr., 1360 (1956)]. Weiterhin kann sie auch unter Verwendung von p-Toluensulfonsäurechlorid und Kaliumcarbonat in Gegenwart eines quartären Ammoniumsalzes durchgeführt werden [Zsuzsa M. Jaszay, Synthesis, 520 (1987].
Was die Thioharnstoffverbindungen betrifft, die unter den durch die allgemeine Formel (VII) dargestellten Verbindungen als T ein Schwefelatom enthalten, so wird eine oxidative Entschwefelung durchgeführt, um die erfindungsgemäße Vorstufe einer eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung zu erhalten. Im Allgemeinen wird Quecksilberoxid als Entschwefelungsreagenz für die oxidative Entschwefelung verwendet. Neben Quecksilberoxid können auch Bleioxid [F. Zetzehe und A. Friedrich, Chem. Ber. 73, 1114 (1940)], Zinkoxid [R. F. Coles, U.S. Patent Nr. 2946819 (1960)], Bleicarbonat, Bleinitrat, Bleichlorid [J. C. Sheehan, U.S. Patent Nr. 3135748 (1964)] usw. verwendet werden. Weiterhin kann auch Natriumhypochlorid unter alkalischen Bedingungen verwendet werden [H. Stetter und C. Wulff, Chem. Ber., 95, 2302 (1962)].
Obwohl die erfindungsgemäße Vorstufe einer eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung, die ein Halogenatom oder eine Sulfonsäuregruppe aufweist und durch die allgemeine Formel (I) dargestellt wird, so wie oben beschrieben, hergestellt werden kann, ist das oben beschriebene Herstellungsverfahren ein reines Beispiel und die Reihenfolge der Verfahrensschritte ist nicht auf die oben genannte beschränkt. Z.B. kann jeder der Schritte der Halogenierung oder Sulfonierung und der Carbodiimidierung vor dem anderen Verfahrensschritt liegen.
Weiterhin ist es auch möglich, wenn der Schritt (A) durch eine zweistufige Reaktion mit den Schritten (A') und (A'') durchgeführt wird, die erfindungsgemäße Vorstufe einer eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung, die ein Halogenatom oder eine Sulfonsäuregruppe aufweist und durch die allgemeine Formel (I) dargestellt wird, durch Carbodiimidierung der durch die allgemeine Formel (VI') beim Schritt (A') erhaltenen Verbindung herzustellen, indem eine funktionelle Gruppe, die zur Umwandlung in ein halogeniertes Derivat oder sulfoniertes Derivat beim Schritt (A''), nötig ist, in die Verbindung eingeführt wird, und die Verbindung schließlich dem Halogenierungsschritt zu unterziehen.
So wird die erfindungsgemäße Vorstufe einer eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung, die ein Halogenatom oder eine Sulfonsäuregruppe aufweist und durch die allgemeine Formel (I) dargestellt wird, erhalten. In der allgemeinen Formel (I) kann eine aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe ausgewählte Gruppe, die eine Substitution durch ein Alkalimetall, ein Erdalkalimetall oder eine basische Gruppe aufweisen, die ein durch Stickstoff- oder Phosphoratom ersetzbares Wasserstoffatom enthält, gegen jedes substituierbare gegenwärtige Wasserstoffatom in jeder der durch B, Y¹, Y², Y³, Y⁴, A und W dargestellten funktionellen Gruppen substituiert sein.
Die vorgenannte aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe ausgewählte Gruppe, die eine Substitution durch ein Alkalimetall, ein Erdalkalimetall oder eine basische Gruppe aufweisen, die ein Stickstoff- oder Phosphoratom aufweist, kann in einer Verbindung enthalten sein, die als Ausgangsmaterial zur Herstellung der Vorstufe einer oben beschriebenen, eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung, die durch die allgemeine Formel (I) dargestellt wird, verwendet wird, oder sie kann in einem ersten Schritt bei der Herstellung in das Ausgangsmaterial eingeführt werden, oder sie kann während der Herstellung in eine Zwischenstufenverbindung eingeführt werden, wenn die Verbindung des Ausgangsmaterials die Gruppe nicht enthält. Weiterhin kann sie dann, wenn eine durch die allgemeine Formel (I) dargestellte Vorstufe einer eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung eine solche Gruppe nicht aufweist, darüber hinaus in das Endprodukt eingeführt werden.
Um die Gruppe einzuführen, kann z.B. eine Verbindung mit einer aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe ausgewählte Gruppe und einer funktionellen Gruppe zur Einführung der Gruppe in ein Alkalimetallsalz wie das Kaliumsalz, ein Erdalkalimetallsalz wie das Calciumsalz oder das Magnesiumsalz oder ein Salz, das eine basische Gruppe aufweist, die ein Stickstoff- oder Phosphoratom an der Carboxylgruppe, der Sulfongruppe, der Phosphonogruppe oder der Phosphogruppe aufweist, überführt werden, und in ein Ausgangsmaterial oder ein Zwischenprodukt der Vorstufe einer eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung oder das Endprodukt eingeführt werden. Alternativ kann die Verbindung, die eine Carboxylgruppe, eine Sulfongruppe, eine Phosphonogruppe, eine Phosphogruppe oder ähnliches aufweist, nicht in ein Salz übergeführt auch in das Ausgangsmaterial oder ein Zwischenprodukt der Vorstufe oder des Endprodukts eingeführt werden und dann können die funktionellen Gruppen wie oben erwähnt in Salze überführt werden.
Wenn das Ausgangsmaterial der Vorstufe eine Verbindung mit einer aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe ausgewählten Gruppe ist, kann es in ein Alkalimetallsalz, ein Erdalkalimetallsalz oder ein Salz einer basischen Gruppe, die ein Stickstoff- oder Phosphoratom aufweist, überführt werden und dann für das Herstellungsverfahren verwendet werden. Alternativ kann die Carboxylgruppe, die Sulfongruppe, die Phosphonogruppe, und die Phosphogruppe des Ausgangsmaterials nicht in ein Salz überführt werden, und das Ausgangsmaterial kann so wie es ist für das Herstellungsverfahren verwendet werden, und diese funktionellen Gruppen einer Verbindung, die nach einem geeigneten Schritt erhalten worden ist, können in ein Salz überführt werden.
Das Verfahren zur Überführung der vorgenannten Verbindung in ein Alkalimetallsalz, ein Erdalkalimetallsalz oder ein Salz einer basischen Gruppe, die ein Stickstoff- oder Phosphoratomsalz an der Carboxylgruppe, der Sulfongruppe, der Phosphonogruppe oder der Phosphogruppe aufweist, ist nicht besonders eingeschränkt. Irgendeines der bekannten Verfahren kann dafür verwendet werden.
Spezifisch ein Verfahren, das das Zugeben eines bekannten Lösungsmittels wie Wasser und Alkohol zu der Verbindung mit einer aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe ausgewählten Gruppe zum Lösen der Verbindung im Lösungsmittel umfasst, und anschließendes Zugeben von Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Calciumhydroxid, Natriumcarbonat, Kaliumcarbonat, Natriumhydrogencarbonat, Tetramethylammoniumhydroxid, Tetramethylammoniumchlorid, Tetramethylammoniumbromid, Tetramethylammoniumiodid oder Ähnlichem zu der erhaltenen Lösung, und Vermischen, um eine Reaktion zu ermöglichen.
(ii) Schritt der Herstellung der durch die allgemeine Formel (VIII) dargestellten, eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Verbindung
Die durch die allgemeine Formel (VIII) dargestellte, eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Verbindung, die zur Herstellung der erfindungsgemäßen eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung verwendbar ist, die eine Gruppe aufweist, die aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe ausgewählt ist, die eine Substitution durch ein Alkalimetall, ein Erdalkalimetall oder eine basische Gruppe aufweisen, die ein Stickstoff- oder Phosphoratom enthält, indem man die durch die allgemeine Formel (VIII) dargestellte, eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Verbindung mit der Vorstufe einer eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung, die ein Halogenatom oder eine Sulfonsäuregruppe aufweist und im vorgenannten Schritt (i) erhalten wurde, reagieren läßt, kann in Abhängigkeit der erwünschten eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindungen ausgewählt werden.
Um die durch die allgemeine Formel (VIII) dargestellte, eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Verbindung zu erhalten, kann eine Gruppe, die ein sekundäres oder tertiäres Stickstoffatom oder ein sekundäres oder tertiäres Phosphoratom aufweist, in eine verwendbare, eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Verbindung, die eine fluoreszierende Gruppe F aufweist, entsprechend eines gewöhnlichen Verfahrens eingeführt werden. Beispiele für die eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Verbindung schließen Anthracenderivate, Coumarinderivate, Pyrenderivate, Perylenderivate, Dansylderivate, Rhodaminderivate, Oxazolderivate, Benzothiazolderivate, Benzoxadiazolderivate, Bordipyrromethandiflouridderivate, Thiazolorangederivate, fluoreszierende Derivate von Seltenerden-Verbindungen, Cyaninderivate usw. ein. Das Verfahren zur Herstellung der durch die allgemeine Formel (VIII) dargestellten, eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Verbindung, die die fluoreszierende Gruppe enthält und die Gruppe, die das sekundäre oder tertiäre Stickstoffatom oder das sekundäre oder tertiäre Phosphoratom aufweist, enthält, ist nicht besonders eingeschränkt.
Als ein spezifisches Beispiel ist ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung, die -(CH₂)_p-NHC(S)NH-(CH₂)_q- als Y⁵ in der allgemeinen Formel (VIII) aufweist, unten dargestellt. Diese Reaktion ist eine gewöhnliche Reaktion, die eine Reaktion einer eine Isothiocyanatgruppe und eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Verbindung und einer Aminverbindung, die ein sekundäres oder tertiäres Stickstoffatom oder Phosphoratom aufweist, umfasst.
In den Formeln haben R⁴, R⁵ und F die selben Bedeutungen wie für die Formel (III) definiert, und Q hat die selbe Bedeutung wie für die Formel (VIII) definiert.
Als weitere spezifische Beispiele können Verfahren genannt werden, die das Vermischen von Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin B isothiocyanat, das 1H-Benz[e]-indoliumsalz von 2-[2-[3-[[1,3-Dihydrdo-1,1-dimehtyl-3-(4-sulfobutyl)-2H-indol-2-yliden]ethyliden]-2-phenoxy-1-cyclohexen-1-yl]-ethenyl]-1,1-dimethyl[3-propylisothiocyanat] oder Ähnlichem mit einem Aminderivat, das eine primäre oder tertiäre Aminogruppe aufweist, wie N-3-Dimethylaminopropyl-N-3-(4-morpholino)propylen, 1-Ethyl-3,3-dimethylaminopropylen; Bis-(3,3-dimethyl)aminopropylen, Bis-(3,3-dimethylamino)propylen in einem bekannten Lösungsmittel wie Dichlormethan, Chloroform und DMF umfassen, so dass sie miteinander reagieren.
Wie oben beschrieben, kann die durch die allgemeine Formel (VIII) dargestellte, eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Verbindung erhalten werden. Eine Carboxylgruppe, eine Sulfongruppe, eine Phosphonogruppe und eine Phosphogruppe, die eine Substitution durch ein Alkalimetall, ein Erdalkalimetall oder eine basische Gruppe aufweisen, die ein Stickstoff- oder ein Phosphoratom enthält, können gegen ersetzbare Wasserstoffatome, die in irgendeiner der durch Y⁵, R⁴, R⁵ und F in der allgemeinen Formel (VIII) dargestellten funktionellen Gruppen zugegen sind, ersetzt sein.
Bei der Herstellung der durch die allgemeine Formel (VIII) dargestellten, eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Verbindung kann die aus der Carboxylgruppe, der Sulfongruppe, der Phosphonogruppe und der Phosphogruppe ausgewählte Gruppe, die eine Substitution durch das Alkalimetall, das Erdalkalimetall oder die basische Gruppe aufweisen, die das Stickstoff- oder Phosphoratom enthält, in einem Ausgangsprodukt enthalten sein oder im ersten Schritt der Herstellung eingeführt werden, wenn das Ausgangsprodukt die Gruppe nicht enthält, oder während der Herstellung in ein Zwischenprodukt eingeführt werden. Weiterhin, wenn die zum Schluss erhaltene, durch die allgemeine Formel (VIII) dargestellte, eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Verbindung eine solche Gruppe nicht enthält, kann die Gruppe in die Verbindung nach deren Herstellung eingeführt werden.
Das Einführen der Gruppe kann auf die selbe Art erzielt werden wie im Falle der vorgenannten Vorstufe einer eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung. Wenn das Ausgangsmaterial eine aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe ausgewählte Gruppe enthält, kann sie auf eine Weise behandelt werden, die ähnlich wie die im Falle der vorgenannten Vorstufe einer eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung ist. Weiterhin kann eine Verbindung, die eine aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe ausgewählte Gruppe aufweist mit einem Alkalimetall, einem Erdalkalimetall oder einer basischen Gruppe, die an diesen funktionellen Gruppen ein Stickstoff- oder Phosphoratom enthalten, auf die selbe Art wie oben beschrieben in ein Salz umgewandelt werden.
(iii) Schritt, bei dem man die in Schritt (i) hergestellte Vorstufe einer eine fluoreszierende Gruppe
enthaltenden Carbodiimid-Verbindung und die durch die allgemeine Formel (VIII) dargestellte, eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Verbindung, die im Schritt (ii) hergestellt wurde, miteinander reagieren lässt.
Die erfindungsgemäße, durch die allgemeine Formel (III) dargestellte, eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Carbodiimid-Verbindung mit mindestens einer aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe ausgewählten Gruppe, die eine Substitution durch ein Alkalimetall, ein Erdalkalimetall oder eine basische Gruppe aufweisen, die ein Stickstoff- oder Phosphoratom enthält, kann hergestellt werden, indem man die durch die allgemeine Formel (I) dargestellte Vorstufe einer eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung, die im Schritt (i) hergestellt wurde, und die durch die allgemeine Formel (VIII) dargestellte, eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Verbindung, die im Schritt (iii) hergestellt wurde, miteinander reagieren lässt.
Mindestens eine unter der durch die allgemeine Formel (I) dargestellten Vorstufe einer eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung, die das Halogenatom oder die Sulfonsäuregruppe aufweist, und der durch die allgemeine Formel (VIII) dargestellte, die fluoreszierende Gruppe enthaltenden Verbindung muss notwendigerweise eine Verbindung sein, die mindestens eine aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe ausgewählte Gruppe enthält, die eine Substitution durch ein Alkalimetall, ein Erdalkalimetall oder eine basische Gruppe aufweisen, die ein Stickstoff- oder Phosphoratom enthält.
Das heißt, wenn die Vorstufe einer eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung, die das Halogenatom oder die Sulfonsäuregruppe aufweist, mindestens eine aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe ausgewählte Gruppe enthält, die eine Substitution durch ein Alkalimetall, ein Erdalkalimetall oder eine basische Gruppe aufweisen, die ein Stickstoff- oder Phosphoratom enthält, d.h. wenn mindestens eine aus B, Y¹, Y², Y³, Y⁴, A und W in der allgemeinen Formel (I) ausgewählte funktionelle Gruppe mindestens eine aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe ausgewählte Gruppe enthält, die eine Substitution durch ein Alkalimetall, ein Erdalkalimetall oder eine basische Gruppe aufweisen, die ein Stickstoff- oder Phosphoratom enthält, kann die durch die allgemeine Formel (VIII) dargestellte, die fluoreszierende Gruppe enthaltende Verbindung die vorgenannte funktionelle Gruppe aufweisen oder nicht aufweisen.
Ähnlich kann dann, wenn die durch die allgemeine Formel (VIII) dargestellte, die fluoreszierende Gruppe enthaltende Verbindung mindestens eine aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe ausgewählte Gruppe enthält, die eine Substitution durch ein Alkalimetall, ein Erdalkalimetall oder eine basische Gruppe aufweisen, die ein Stickstoff- oder Phosphoratom enthält, d.h. wenn mindestens eine der aus Y⁵, R⁴, R⁵ und F in der allgemeinen Formel (VIII) ausgewählte funktionelle Gruppe mindestens eine aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe ausgewählte Gruppe enthält, die eine Substitution durch ein Alkalimetall, ein Erdalkalimetall oder eine basische Gruppe aufweisen, die ein Stickstoff- oder Phosphoratom enthält, kann die durch die allgemeine Formel (I) dargestellte Vorstufe einer eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung, die das Halogenatom oder die Sulfonsäuregruppe aufweist, die vorgenannte funktionelle Gruppe aufweisen oder nicht aufweisen.
Das Verfahren für eine solche Reaktion der durch die allgemeine Formel (I) dargestellten Vorstufe einer eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung, die das Halogenatom oder die Sulfonsäuregruppe aufweist, und der durch die allgemeine Formel (VIII) dargestellten die fluoreszierende Gruppe enthaltenden Verbindung, wie die oben genannte, ist nicht besonders eingeschränkt.
Spezifisch kann die Herstellung erfolgen, indem die beiden Komponenten in geeignetem Verhältnis in einem bekannten Lösungsmittel wie Dichlormethan, Chloroform und DMF vermischt werden, so dass sie miteinander reagieren können.
Wenn die erfindungsgemäße, eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Carbodiimid-Verbindung hergestellt wird, kann z.B., selbst wenn die die fluoreszierende Gruppe enthaltende Verbindung eine funktionelle Gruppe wie eine Carboxylgruppe, eine Sulfongruppe, eine Phosphonogruppe und eine Phosphogruppe in ihrer Struktur aufweist, eine Carbodiimidgruppe eingeführt werden, ohne zuvor die funktionelle Gruppe aus der Verbindung zu entfernen und sie in Form eines Salzes zurückzulassen, indem die durch die allgemeine Formel (I) dargestellte Vorstufe der eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung, die das Halogen oder die Sulfonsäuregruppe aufweist, verwendet wird. Auf diese Weise wird die Herstellung in – verglichen mit konventionellen Verfahren – weniger Verfahrensschritten ermöglicht.
Darüber hinaus kann eine Carbodiimidgruppe in eine kommerziell erhältliche, eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Verbindung, die eine funktionelle Gruppe wie eine Carboxylgruppe, eine Sulfongruppe, eine Phosphonogruppe und eine Phosphogruppe in ihrer Struktur aufweist, durch Überführen der funktionellen Gruppe in ein Salz einfach eingeführt werden. Daher können die Arten verwendbarer fluoreszierende Gruppen enthaltender Verbindungen extrem gesteigert werden.
Die erfindungsgemäße, eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Carbodiimid-Verbindung, die mittels des oben beschriebenen Verfahrens erhalten wurde, kann gut als Markierungssubstanz zur Detektion von Nukleinsäuren oder in Imminoassays verwendet werden. In diesen Anwendungen kann die erfindungsgemäße, eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Carbodiimid-Verbindung an eine Nukleinsäure wie DNS oder ein Protein wie ein Antigen oder ein Antikörper, die markiert werden sollen, gebunden werden, in dem die erfindungsgemäße, eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Carbodiimid-Verbindung mit der Nukleinsäure oder dem Protein in Kontakt gebracht wird, z.B. indem sie in einen Lösungsmittel vermischt werden. Das heißt, indem die erfindungsgemäße, eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Carbodiimid-Verbindung über die Carbodiimidgruppe an eine Nukleinsäure oder ein Protein, die gegenüber Nukleinsäurebasen hochgradig reaktiv sind, gebunden wird, kann zu der Nukleinsäure oder dem Protein eine fluoreszierende Substanz, die als hochgradig empfindliches Detektionsreagenz wirkt, zugegeben werden, um als eine Markierung zu dienen. Daher ist es bevorzugt, wenn die die erfindungsgemäße, eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Carbodiimid-Verbindung an eine Nukleinsäure oder ein Protein gebunden wird, dass beide unter Bedingungen miteinander in Kontakt gebracht werden sollte, die eine einfache Reaktion der Carbodiimidgruppe erlauben, z.B. alkalische Bedingungen bei pH ca. 7,5 bis pH ca. 8,5. Darüber hinaus kann die erfindungsgemäße, eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Carbodiimid-Verbindung für Chemolumineszenzanalyse-Verfahren usw. verwendet werden.
Darüber hinaus kann in der die erfindungsgemäße, eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung die Carbodiimidgruppe in einem System zusammen mit Salzen funktioneller Gruppen wie einer Carboxylgruppe, einer Sulfogruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe existieren. Daher ist ihre Wasserlöslichkeit verglichen mit konventionellen, eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindungen ausreichend verbessert, und es ist vorteilhaft, wenn sie als Markierungssubstanz bei den vorgenannten Verfahren zur Detektion von Nukleinsäuren oder in Imminoassay-Verfahren ebenso wie in Chemolumineszenzanalyse-Verfahren verwendet wird.
(3) Erfindungsgemäßes Verfahren zur Detektion von Nukleinsäure
Die erfindungsgemäße, eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Carbodiimid-Verbindung, die mindestens eine aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe ausgewählte funktionelle Gruppe enthält, die eine Substitution durch ein Alkalimetall, ein Erdalkalimetall oder eine basische Gruppe aufweisen, die ein Stickstoff- oder Phosphoratom enthält, kann als Markierungssubstanz in einem Verfahren zur Detektion von Nukleinsäure mittels Hybridisierung unter Verwendung einer mit einer Markierungssubstanz markierten Nukleinsäure verwendet werden. D.h. eine mit der eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung markierte Nukleinsäure kann als Sonde für die Hybridisierung verwendet werden. Eine zu analysierende Nukleinsäure kann durch Hybridisieren der Sonde mit der zu analysierenden Nukleinsäure, so dass ein Nukleinsäure/Nukleinsäurehybrid gebildet werden müsste, Entfernen jeglicher freier Sonde aus dem System und Detektieren der im Hybrid enthaltenen Markierungssubstanz detektiert werden. Entsprechend der vorliegenden Erfindung kann die als Markierungssubstanz dienende, eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Carbodiimid-Verbindung durch Messen der Fluoreszenzintensität oder Ähnlichem unter Verwendung eines Spektrofotofluorometers, eines Spektrofotofluorometers für eine 96-Loch Mikrotiterplatte, ein Fluoreszenzmikroskop usw. direkt nachgewiesen werden. Die zu messende Nukleinsäure wird gewöhnlich auf einer Membran wie Nylonmembranen und Cellulosenitratmembranen oder einer Mikrotiterplatte immobilisiert, verwendet.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren zur Detektion von Nukleinsäuren verwendete Hybridisierung unterscheidet sich nicht besonders von der gewöhnlichen Hybridisierung von Nukleinsäuren wie Koloniehybridisierung, Plattenhybridisierung, Tüpfelhybridisierung, Southern Hybridisierung, Northern Hybridisierung, außer dass die erfindungsgemäße Hybridisierung zur Detektion der Nukleinsäure die eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Carbodiimid-Verbindung als Markierung einer Nukleinsäuresonde verwendet. Die zu messende Nukleinsäure kann sowohl RNS als auch DNS sein und die als eine Sonde verwendete Nukleinsäure kann ebenfalls sowohl RNS als auch DNS sein.
Während das Markieren einer als eine Sonde verwendeten Nukleinsäure vorzugsweise durchgeführt wird, indem ein Polynukleotid oder ein Oligonukleotid mittels des oben beschriebenen Verfahrens markiert wird, kann es auch erfolgen, indem ein markiertes Nukleotid mittels einer Polymerasereaktion in ein Polynukleotid oder ein Oligonukleotid eingebaut wird.
Beispiele
Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung mit Bezug auf die folgenden Beispiele erklärt.
Beispiel 1
(1) Herstellung einer durch die allgemeine Formel (I) dargestellten Vorstufe einer eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung
N-(3-Morpholinopropyl)isothiocyanat (1,68 g, 10 mmol) wurde in 15 ml trockenem Methylenchlorid gelöst und in einem Wasserbad gekühlt. Zu der Lösung wurde 6-Aminohexanol (1,17 g, 10 mmol) gegeben und das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nach der Zugabe von Wasser zum Reaktionsgemisch wurde das Gemisch mit Methylenchlorid extrahiert. Der Extrakt wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, durch Cellit gefiltert und getrocknet, so dass die Verbindung (I-I-A) (2,7 g, Ausbeute 95%) erhalten wurde.
Die NMR-spektroskopischen Daten sind im Folgenden dargestellt:

¹H-NMR (CDCl₃): δ = 1,35–1,85 (m, 12H), δ = 2,40–2,60 (m, 6H), δ = 3,45 (br, 2H), δ = 3,65 (t, 2H), δ = 3,75 (t, 4H)

Dann wurde die erhaltene Verbindung (I-I-A), (2,0 g, 4,87 mmol) in trockenem DMF (5 ml) gelöst. Zu der Lösung wurde Methyliodid gegeben (0,691 g, 4,87 mmol) und das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nachdem das Reaktionsgemisch aufkonzentriert worden war, wurde Ether/Methanol dazugegeben und das Gemisch wurde dekantiert, um die Verbindung (I-I-B) (2,6 g, Ausbeute 97%), zu erhalten.
Die NMR-spektroskopischen Daten sind im Folgenden dargestellt:

¹H-NMR (DMSO): δ = 1,25–1,65 (m, 10H), δ = 1,75 (t, 2H), δ = 2,30–2,45 (m, 2H), δ = 2,65 (s, 3H), δ = 3,20–3,50 (m, 6H), δ = 3,60 (t, 4H), δ = 3,75 (br, 2H)

Dann wurde die erhaltene Verbindung (I-I-B) (2 g, 3,62 mmol) in DMF (5 ml) gelöst. Methyl(triphenyl)-phosphoniumchlorid (3,27 g, 7,23 mmol) wurde zugegeben, und das Gemisch wurde drei Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Weiterhin wurde dieses Reaktionsgemisch aufkonzentriert und mittels Silicagelchromatographie aufgereinigt (Fließmittel: Chloroform/Methanol = 50/1), um die Verbindung (I-I-C) (2,98 g, Ausbeute 95%) zu isolieren. Die NMR-spektroskopischen Daten sind im Folgenden dargestellt:

¹H-NMR (CDCl₃): δ = 1,30–1,90 (m, 10H), δ = 2,25 (t, 2H), δ = 2,85–3,00 (m, 6H), δ = 2,95 (s, 3H); δ = 3,20 (t, 2H), δ = 3;45 (br, 2H), δ = 3,90 (t, 4H)

Dann wurde die erhaltene Verbindung (I-I-C) (2 g, 2,31 mmol) in Aceton (5 ml) gelöst. Es wurde Zinkoxid (1 g, 4,62 mmol) zugeben, und das Gemisch wurde drei Stunden lang am Rückfluss gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde durch einstündiges Stehen lassen abgekühlt, dann dekantiert und aufkonzentriert, um die Verbindung (I-I-D) (1,73 g, Ausbeute 90%) zu erhalten Diese Verbindung ist eine der erfindungsgemäßen Vorstufen einer eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung Die NMR-spektroskopischen Daten und die IR-spektroskopischen Daten sind im Folgenden dargestellt:

¹H-NMR (CDCl₃): δ = 1,30 – 1,90 (m, 10H), δ = 2,40–2,50 (m, 8H), δ = 3,15 (s, 3H), δ = 3,20 (t, 2H), δ = 3,30 (t, 4H), δ = 3,75 (t, 4H) IR: 2127 cm^–1 (-N=C=N-Gruppe)

(2) Herstellung einer durch die allgemeine Formel (VIII) dargestellten, eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Verbindung
Rhodamin B-isothiocyanat (2,00 g, 3,73 mmol, hergestellt von Sigma) wurde in Dichlormethan gelöst. Nachdem das Reaktionsgemisch auf 0°C abgekühlt worden war, wurde nach und nach N-3-(Dimethylaminopropyl)amin (0,57 g, 5,60 mmol) zugegeben und das Gemisch wurde 30 min lang gerührt. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch aufkonzentriert, weiterhin wurde Ether/Methanol zugegeben und das Gemisch wurde dekantiert, um die Verbindung (I-II-A) (2,25 g, Ausbeute 95%) zu erhalten.
Die NMR-spektroskopischen Daten sind im Folgenden dargestellt:

¹H-NMR (CDCl₃): δ = 1,00–1,20 (m, 8H), δ = 2,20–2,60 (m, 6H), δ = 2,20 (s, 6H), δ = 3,25–3,70 (m, 4H), δ = 6,30–8,00 (m, 9H)

Die erhaltene Verbindung (I-II-A) (2,26 g, 3,54 mmol) wurde in Methanol gelöst. Eine gesättigte Kaliumhydroxid-Lösung in Isopropylalkohol (etwa 15 ml) wurde dazugegeben, um das Absetzen von Feststoff von ermöglichen. Dann wurde er unter der Verwendung von Alkohol abfiltriert und getrocknet, um die Verbindung (I-II-B) (2,30 g, Ausbeute 96%) zu erhalten. Diese Verbindung korrespondierte mit der Verbindung (I-II-A), wobei die Carboxylgruppe in der Rhodamin B-Gruppe in ein Kaliumsalz (-COOK) überführt worden war.
Die NMR-spektroskopischen Daten sind im Folgenden dargestellt:

1¹H-NMR (CDCl₃): δ = 1,00–1,20 (m, 8H), δ = 2,20–2,60 (m, 6H), δ = 2,20 (s, 6H), δ = 3,25–3,70 (m, 4H), δ = 6,30–8,00 (m, 9H)

(3) Herstellung einer durch die allgemeine Formel (III) dargestellten, eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung
Die in (1) erhaltene Verbindung (I-I-D) (1,23 g, 1,48 mmol) und die in (2) erhaltene Verbindung (I-II-B) (1 g, 1,48 mmol) wurden in DMF gelöst und die Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Zum Reaktionsgemisch wurde Ether/Methanol gegeben und das Gemisch wurde dekantiert, um die Verbindung (1) (2,10 g, Ausbeute 94%) als erfindungsgemäße, eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Carbodiimid-Verbindung zu erhalten.
Die NMR-spektroskopischen, IR-spektroskopischen und UV-spektroskopischen Daten sind im Folgenden dargestellt:

¹H-NMR (CDCl₃): δ = 1,00–1,85 (m, 18H), δ = 2,40–2,55 (m, 12H), δ = 2,85 (s, 3H), δ = 2,90 (s, 6H), δ = 3,15 (t, 2H), δ = 3,25 (t, 4H), δ = 3,50–3,65 (m, 6H), δ = 3,75 (t, 4H), δ = 6,30–8,00 (m, 9H) IR: 2125 cm^–1 (-N=C=N-Gruppe) UV (EtOH): λ_max 542 nm

Beispiel 2
(1) Herstellung der durch die allgemeine Formel (VIII) dargestellten, eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Verbindung
2-[2-(3[(1,3-Dihydro-1,1-dimethyl-3-(4sulfobutyl)-2H-indol-2-yliden)ethyliden]-2-phenoxy-1-cyclohexen-1-yl]ethenyl]-1,1-dimethyl[3-propylisothiocyanat]-1H-benz[e]-indoliumsalz (400 mg, 0,502 mmol, hergestellt von LI-COR) wurde in Dichlormethan (10 ml) gelöst. Nachdem die Lösung auf 0°C gekühlt worden war, wurde nach und nach N-3-(Dimethylaminopropyl)amin (76,9 mg, 0,753 mmol) zugegeben und das Gemisch wurde 1,5 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde die Reaktionslösung aufkonzentriert, Ether/Methanol wurde zugegeben und das Gemisch wurde dekantiert, um die Verbindung (II-I-A) (402 mg, Ausbeute 89%) zu erhalten.
Die NMR-spektroskopischen Daten sind im Folgenden dargestellt:

¹H-NMR (CDCl₃): δ = 1,20–2,40 (m, 14H), δ = 2,25 (s, 6H), δ = 2,45 (t, 2H), δ = 2,65–3,05 (m, 4H), δ = 3,65–3,95 (m, 4H), δ = 4,45 (t, 2H), δ = 6,13 (d, 1H), δ = 6,35 (d, 1H), δ = 6,90–7,60 (m, 11H), δ = 7,70–8,15 (m, 5H)

(2) Herstellung einer durch die allgemeine Formel (III) dargestellten, eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung
Die in Beispiel 1 (1) erhaltene Verbindung (I-I-D) (232 mg, 0,445 mmol) und die in Beispiel 2 (1) erhaltene Verbindung (II-I-A) (400 mg, 0,445 mmol) wurden in DMF (10 ml) gelöst und die Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Zum Reaktionsgemisch wurde weiterhin Ether/Methanol zugegeben und das Gemisch wurde dekantiert, um die Verbindung (2) (575 mg, Ausbeute 91%) als erfindungsgemäße, eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Carbodiimid-Verbindung zu erhalten.
Die NMR-spektroskopischen, IR-spektroskopischen und UV-spektroskopischen Daten sind im Folgenden dargestellt:

¹H-NMR (CDCl₃): δ = 1,20–2,10 (m, 24H), δ = 2,30–2,50 (m, 12H), δ = 3,10–3,35 (m, 4H), δ = 2,90 (s, 3H), δ = 2,95 (s, 6H), δ = 3,60–3,85 (m, 10H), δ = 6,13 (d, 1H), δ = 6,35 (d, 1H), δ = 6,80–7,60 (m, 11H), δ = 7,80–8,18 (m, 5H) IR: 2127 cm^–1 (-N=C=N-Gruppe) UV (EtOH): λ_max 790 nm

Beispiel 3
(1) Herstellung einer durch die allgemeine Formel (VIII) dargestellten, eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Verbindung
Cy3.18.OSu (200 mg, 0,175 mmol), das entsprechend der Japanischen Patentanmeldung mit der Offenlegungsnummer 9-325147 und Ratnakaer B. Mujumadar et al., Bioconjugate Chem., 4, 2, 105–111 (1993) hergestellt worden war, wurde in DMF (5 ml) gelöst. Nachdem die Reaktionslösung auf 0°C gekühlt worden war, wurde nach und nach N-3-(Dimethylaminopropyl)amin (71,4 mg, 0,698 mmol) zugegeben und das Gemisch wurde 12 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde die Reaktionslösung aufkonzentriert, Ethylacetat/Methanol wurde zugegeben und das Gemisch wurde mehrmals dekantiert, um die Verbindung (III-I-A) (170 mg, Ausbeute 87%) zu erhalten.
Die NMR-spektroskopischen Daten sind im Folgenden dargestellt:

¹H-NMR (DMSO): δ = 1,30–1,60 (m, 12H), δ = 1,70 (m, 12H), δ = 2,05 (t, 4H), δ = 2,10–2,30 (m, 8H), δ = 2,15 (s, 12H), δ = 2,95 (q, 4H), δ = 4,12 (t, 4H), δ = 6,54 (d, 2H), δ = 7,36–7,95 (m, 6H), δ = 8, 36 (t, 1H)

(2) Herstellung einer durch die allgemeine Formel (III) dargestellten, eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung
Die in Beispiel 1 (1) erhaltene Verbindung (I-I-D) (79 mg, 0,152 mmol) und die in Beispiel 3 (1) erhaltene Verbindung (III-I-A) (170 mg, 0,152 mmol) wurden in DMF (10 ml) gelöst und die Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Zum Reaktionsgemisch wurde weiterhin Ethylacetat/Methanol zugegeben und das Gemisch wurde dekantiert, um die Verbindung (3) (249 mg; Ausbeute 100%) als erfindungsgemäße, eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Carbodiimid-Verbindung zu erhalten.
Die NMR-spektroskopischen, IR-spektroskopischen und UV-spektroskopischen Daten sind im Folgenden dargestellt:

¹H-NMR (DMSO): δ = 1,10–1,80 (m, 24H), δ = 1,70 (s, 12H), δ = 2,05 (m, 4H), δ = 2,10–2,30 (m, 8H), δ = 2,15 (s, 6H), δ = 2,72 (s, 3H), δ = 2,85 (s, 3H), δ = 2,85–3,50 (m, 12H), δ = 3,55 (m, 4H), δ = 4,12 (t, 4H), δ = 6,54 (d, 2H), δ = 7,36–7,95 (m, 6H), δ = 8,36 (m, 1H) IR: 2127 cm^–1 (-N=C=N-Gruppe) UV (EtOH): λ_max 532 nm

Beispiel 4
(1) Herstellung der durch die allgemeine Formel (VIII) dargestellten, eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Verbindung
Cy5.18.OSu (200 mg, 0,171 mmol), das entsprechend der Japanischen Patentanmeldung mit der Offenlegungsnummer 9-325147 und Ratnakaer B. Mujumadar et al., Bioconjugate Chem., 4, 2, 105–111 (1993) hergestellt worden war, wurde in DMF (5 ml) gelöst. Nachdem die Reaktionslösung auf 0°C gekühlt worden war, wurde nach und nach N-3-(Dimethylaminopropyl)amin (70 mg, 0,684 mmol) zugegeben und das Gemisch wurde 12 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde die Reaktionslösung aufkonzentriert, Ethylacetat/Methanol wurde zugegeben und das Gemisch wurde dekantiert, um die Verbindung (IV-I-A) (184 mg, Ausbeute 94%) zu erhalten.
Die NMR-spektroskopischen Daten sind im Folgenden dargestellt:

¹H-NMR (DMSO): δ = 1,32–1,65 (m, 12H), δ = 1,72 (s, 12H), δ = 2,05 (t, 4H), δ = 2,00–2,30 (m, 8H), δ = 2,15 (s, 12H), δ = 2,95 (q, 4H), δ = 4,17 (t, 4H), δ = 6,57 (d, 3H), δ = 7,36–7,95 (m, 6H), δ = 8,45 (m, 1H)

(2) Herstellung einer durch die allgemeine Formel (III) dargestellten, eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung
Die in Beispiel 1 (1) erhaltene Verbindung (I-I-D) (82 mg, 0,157 mmol) und die in Beispiel 4 (1) erhaltene Verbindung (IV-I-A) (180 mg, 0,157 mmol) wurden in DMF (10 ml) gelöst und die Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Zum Reaktionsgemisch wurde weiterhin Ethylacetat/Methanol zugegeben und das Gemisch wurde dekantiert, um die Verbindung (4) (246 mg, Ausbeute 94%) als erfindungsgemäße, eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Carbodiimid-Verbindung zu erhalten.
Die NMR-spektroskopischen, IR-spektroskopischen und UV-spektroskopischen Daten sind im Folgenden dargestellt:

¹H-NMR (DMSO): δ = 1,22–1,65 (m, 12H), δ = 1,72 (s, 12H), δ = 2,05 (m, 4H), δ = 1,95–2,30 (m, 8H), δ = 2,15 (s, 12H), δ = 2,95 (q, 4H), δ = 4,17 (t, 4H), δ = 6,57 (d, 3H), δ = 7,32 – 7,95 (m, 6H), δ = 8,45 (t, 2H) IR: 2127 cm^–1 (-N=C=N-Gruppe) UV (EtOH): λ_max 632 nm

Beispiel 5
Wasserlöslichkeitstest
Die in den Beispielen 1–4 erhaltenen Verbindungen (1)–(4) wurden bezüglich ihrer Löslichkeit in Wasser getestet. Zum Vergleich wurde der Test bezüglich der Löslichkeit in Wasser auch für die der Verbindung (1) entsprechenden Verbindung (1') durchgeführt, bei der die Kaliumcarboxylatgruppe (-COOK) in der Rhodamin B-Gruppe durch ein Wasserstoffatom ersetzt war, für die der Verbindung (2) entsprechenden Verbindung (2'), bei der die Natriumsulfonatgruppe (-SO₃Na) in der IRD-41-Gruppe durch eine Methylgruppe ersetzt war, für die der Verbindung (3) entsprechenden Verbindung (3'), in der die Kaliumsulfonatgruppe (-SO₃K) in der Cy3-Gruppe durch ein Wasserstoffatom ersetzt war und für die der Verbindung (4) entsprechenden Verbindung (4'), in der die Kaliumsulfonatgruppe (-SO₃K) in der Cy5-Gruppe durch ein Wasserstoffatom ersetzt war. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1
Aus diesen Ergebnissen wird klar, dass die erfindungsgemäßen, eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindungen sehr gut wasserlöslich sind.
Beispiel 6 Reaktionslösungen, die 0,1 M jeder der in den Beispielen 1, 3 und 4 erhaltenen Verbindungen (1), (3) und (4) und 1 μg Phagen-DNS (M13mp18-Replikattyp, hergestellt von Takara Shuzo Co, Ltd.) in Boratpuffer (pH 8,5) enthielten, wurden hergestellt und bei 85°C eine Minute lang inkubiert. Zu jedem Reaktionsgemisch wurde das 1/9-fache Volumen 3 M Natriumacatat und das 2,5-fache Volumen kaltes Ethanol gegeben und vermischt, und dann wurde das Gemisch 45 Minuten lang bei –80°C stehen gelassen. Das Gemisch wurde bei 4°C und 12 000 Umdrehungen pro Minute 1,5 Minuten unter Verwendung einer Zentrifuge (H-1500FR, hergestellt von Kokusan Co, Ltd.) zentrifugiert. Nachdem der Überstand entfernt worden war, wurden die erhaltenen Niederschläge in 100 μl sterilisiertem Wasser gelöst.
Dann wurden 480 ng bis 480 pg/100 μl jeweils 10-fach verdünnter Lösungen einer Lösungsreihe der Phagen-DNS (M13mp18-Replikattyp), die mit einem Restriktionsenzym (HindII) linearisiert worden waren, in 2 M NaCl hergestellt, bei 100°C 10 Minuten lang thermisch behandelt und auf Eis fünf Minuten lang gequencht, um thermisch denaturierte Nukleinsäure zu erhalten. Die wärmedenaturierten Nukleinsäuren verschiedener Konzentrationen wurden in die Vertiefungen einer Platte gegeben und bei 37°C 12 Stunden lang mit einer Plattenversiegelung immobilisiert.
Nachdem die Platte mit den immobilisierten wärmedenaturierten Nukleinsäuren mit destilliertem Wasser gewaschen worden waren, wurden zu jeder Vertiefung 100 μl einer Prähybridisierungslösung [5×SSC (1×SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat), 5× Denhardts Lösung (0,02% Polyvinylpyrrolidon, 0,2% Ficoll, 0,02% BSA), 25 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6,5), 50% Formamid, 0,5 mg/ml Hefe-t-RNS und 0,1% Natriumdodecylsulfat) gegeben und die Platte wurde mittels eines Plattenschüttelgerätes fünf Minuten lang bei Raumtemperatur geschüttelt. Dieses Verfahren wurde dreimal wiederholt. Die Lösung aus jeder Vertiefung wurde verworfen und 300 μl 2×SSC wurde in jede Vertiefung gegeben und bei Raumtemperatur fünf Minuten darin belassen.
Dann wurde in jede Vertiefung 100 ml eines 1.5 M NaCl enthaltenden 50 mM Natriumphosphatpuffers (pH 7,0) gegeben, um eine fluoreszierende Verbindung enthaltende DNS als Verbindungen (1A), (3A) und (4A) zu bilden. Die Lösungen der Vertiefungen wurden jeweils mit einem Kapillarröhrchen aufgenommen und mit einer Anregungsstrahlung bestrahlt, und Fluoreszenz, die von der von der fluoreszierenden Gruppe emitiert wurde, die zum Markieren der DNS vom M13-Replikattyp verwendet worden war, wurde mittels eines Spektrofotofluorometers (F-3010, hergestellt von Hitachi Co. Ltd.) gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.
Tabelle 2
Aus diesen Ergebnissen ist zu sehen, dass eine Detektion von Nukleinsäuren mit hoher Empfindlichkeit entsprechend des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Detektion von Nukleinsäuren durchgeführt werden kann.

Claims

Eine eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Vorstufe einer Carbodiimid-Verbindung, die ein Halogenatom oder eine Sulfonsäuregruppe aufweist, welche durch die folgende allgemeine Formel (I) dargestellt ist: B-Y³-N=C=N-Y²-W-Y¹-[A]_n-Y⁴-X (I),wobei X ein Halogenatom oder eine Sulfonsäuregruppe darstellt, A eine funktionelle Gruppe darstellt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus -CH₂-, -NHCO-, -CONH-, -O-, -S-, -NR¹-, wobei R¹ eine lineare, zyklische oder verzweigte gesättigte oder ungesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe darstellt, die 1 bis 20 Kohlenstoffatome aufweist, -NR²R³-, wobei R² und R³ jeweils unabhängig ein Wasserstoffatom, eine lineare oder verzweigte gesättigte oder ungesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe, die 1 bis 20 Kohlenstoffatome aufweist, oder eine Cycloalkylgruppe, eine ARYlgruppe oder eine Aralkylgruppe darstellen, die einen Substituenten aufweisen können, unter der Voraussetzung, dass, wenn eines von R² und R³ ein Wasserstoffatom ist, das. andere eine lineare oder verzweigte gesättigte oder ungesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe, die 1 bis 20 Kohlenstoffatome aufweist, oder eine Cycloalkylgruppe, eine Arylgruppe oder eine Aralkylgruppe darstellt, die einen Substituenten aufweisen können, oder R² und R³ miteinander verbunden sein können, um als Ganzes eine Stickstoff enthaltende heterozyklische Gruppe zu bilden, die ein Sauerstoffatom aufweisen kann, -COO-, -OCO-, -NNSO₂, -NHC(S)NH- und -SO₂NH- besteht, n 0 oder 1 darstellt, W eine direkte Bindung oder eine quartäre Oniumgruppe darstellt, Y¹, Y², Y³ und Y⁴ jeweils eine funktionelle Gruppe darstellen, die durch die allgemeine Formel (II) dargestellt ist: -(CH₂)_p-(L)_r-(CH₂)_q (II),wobei L eine funktionelle Gruppe darstellt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus -CH₂, -NHCO-, -CONH-, -O-, -S-, -NR¹-, wobei R¹ die gleiche Bedeutung aufweist, wie sie für die Formel (I) definiert ist, -NR²R³-, wobei R² und R³ die gleichen Bedeutungen aufweisen, wie sie für die Formel (I) definiert sind, -COO-, -OCO-, -NHSO₂-, -NHC(S)NH- und -SO₂NH- besteht, p und q jeweils eine ganze Zahl von 0 bis 20 darstellen und r 0 oder 1 darstellt, B ein Wasserstoffatom oder eine einwertige organische Gruppe darstellt, die entweder gleich oder verschieden von -W-Y¹-[A]_n-Y⁴-X in der Formel (I) ist, und mindestens eine funktionelle Gruppe, die aus B, Y¹, Y², Y³, Y⁴, A und W ausgewählt ist, mindestens eine Gruppe aufweist, die aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe ausgewählt ist, die eine Substitution eines Alkalimetalls, eines Erdalkalimetalls oder einer basischen Gruppe aufweisen, die ein Stickstoff- oder Phosphoratom enthält.
Eine eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Carbodiimid-Verbindung, die mindestens eine Gruppe aufweist, die aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe ausgewählt ist, die eine Substitution eines Alkalimetalls, eines Erdalkalimetalls oder einer basischen Gruppe aufweisen, die ein Stickstoff- oder ein Phosphoratom enthält, welche durch die folgende allgemeine Formel (III) dargestellt ist:
wobei B, Y¹, Y², Y³, Y⁴, A, X, W und n die gleichen Bedeutungen aufweisen, wie sie für die allgemeine Formel (I) definiert sind, F eine fluoreszierende Gruppe darstellt, Q entweder ein tertiäres oder quartäres Stickstoffatom oder ein tertiäres oder quartäres Phosphoratom darstellt, R⁴ und R⁵ jeweils unabhängig ein Wasserstoffatom, eine lineare oder verzweigte gesättigte oder ungesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe, die 1 bis 20 Kohlenstoffatome aufweist, oder eine Cycloalkylgruppe, eine Arylgruppe oder eine Aralkylgruppe darstellen, die einen Substituenten aufweisen können, unter der Voraussetzung, dass, wenn eines von R⁴ und R⁵ ein Wasserstoffatom ist, das andere eine lineare oder verzweigte gesättigte oder ungesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe, die 1 bis 20 Kohlenstoffatome aufweist, oder eine Cycloalkylgruppe, eine Arylgruppe oder eine Aralkylgruppe darstellt, die einen Substituenten enthalten können, oder R⁴ und R⁵ miteinander verbunden sein können, um eine Stickstoff enthaltende heterozyklische Gruppe oder eine Phosphor enthaltende heterozyklische Gruppe zu bilden, die wie -Q⁺R⁴R⁵- ein Sauerstoffatom aufweisen können, Y⁵ die gleiche Bedeutung aufweist, wie sie für Y¹, Y², Y³ und Y⁴ definiert ist, und mindestens eine funktionelle Gruppe, die aus B, Y¹, Y², Y³, Y⁴, Y⁵, A, W, R⁴, R⁵ und F ausgewählt ist, mindestens eine Gruppe aufweist, die aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe ausgewählt ist, die eine Substitution eines Alkalimetalls, eines Erdalkalimetalls oder einer basischen Gruppe aufweisen, die ein Stickstoff- oder Phosphoratom enthält.
Die eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Carbodiimid-Verbindung nach Anspruch 2, wobei mindestens eine funktionelle Gruppe, die aus B, Y¹, Y², Y³, Y⁴, A und W in der Formel (III) ausgewählt ist, mindestens eine Gruppe aufweist, die aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe ausgewählt ist, die eine Substitution eines Alkalimetalls, eines Erdalkalimetalls oder einer basischen Gruppe aufweisen, die ein Stickstoff- oder Phosphoratom enthält.
Die eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Carbodiimid-Verbindung nach Anspruch 2, wobei mindestens eine funktionelle Gruppe, die aus Y⁵, R⁴, R⁵ und F in der Formel (III) ausgewählt ist, mindestens eine Gruppe aufweist, die aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe ausgewählt ist, die eine Substitution eines Alkalimetalls, eines Erdalkalimetalls oder einer basischen Gruppe aufweisen, die ein Stickstoff- oder Phosphoratom enthält.
Verfahren zur Herstellung der in Anspruch 1 definierten, eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Vorstufe einer Carbodiimid-Verbindung, welches die folgenden Schritte (A), (B) und (C) umfasst: (A) Schritt der Synthetisierung einer durch die folgende allgemeine Formel (VI) dargestellten (Thio)-Harnstoff-Verbindung durch eine Reaktion einer durch die folgende allgemeine Formel (IV) dargestellten Iso-(thio)-cyanat-Verbindung mit einer durch die folgende allgemeine Formel (V) dargestellten Amin-Verbindung:
wobei B, Y¹, Y², Y³, Y⁴, A, W und n die gleichen Bedeutungen aufweisen, wie sie für die Formel (I) definiert sind, T ein Sauerstoffatom oder ein Schwefelatom darstellt und Z eine Hydroxylgruppe, eine Alkylgruppe, eine Alkenylgruppe, eine Vinylgruppe, eine Allylgruppe, eine Phenylgruppe, eine Carboxylgruppe, eine eine Sulfonylgruppe enthaltende Derivatgruppe oder eine Phosphoniumgruppe darstellt, (B) Schritt der Halogenierung oder der Sulfonierung der durch die allgemeine Formel (VI) dargestellten Verbindung, welche in dem Schritt (A) erhalten worden ist, um eine durch die folgende allgemeine Formel (VII) dargestellte Verbindung herzustellen:
wobei B, Y¹, Y², Y³, Y⁴, W, A, n und X die gleichen Bedeutungen aufweisen, wie sie für die Formel (I) definiert sind, und T ein Sauerstoffatom oder ein Schwefelatom darstellt, und (C) Schritt der Carbodiimidierung der durch die allgemeine Formel (VII) dargestellten Verbindung, welche in dem Schritt (B) erhalten worden ist, durch Dehydration oder oxidative Entschwefelungsreaktion.
Herstellungsverfahren nach Anspruch 5, welches die in Anspruch 3 definierte, eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Vorstufe einer Carbodiimid-Verbindung herstellt, wobei mindestens eine funktionelle Gruppe, die aus B, Y¹, Y², Y³, Y⁴, A und W ausgewählt ist, mindestens eine Gruppe aufweist, die aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe ausgewählt ist, die eine Substitution eines Alkalimetalls, eines Erdalkalimetalls oder einer basischen Gruppe aufweisen, die ein Stickstoff- oder Phosphoratom enthält.
Verfahren zur Herstellung der in Anspruch 2 definierten, eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Carbodiimid-Verbindung, welches einen Schritt umfasst: Auswählen einer Carbodiimid-Verbindung und einer eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Verbindung aus der in Anspruch 1 definierten, eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Vorstufe einer Carbodiimid-Verbindung und einer eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden, durch die folgende allgemeine Formel (VIII) dargestellten Verbindung: Q'R⁴R⁵-Y⁵-F (VIII),wobei R⁴, R⁵, Y⁵ und F dieselben Bedeutungen aufweisen, wie sie für die allgemeine Formel (III) definiert sind, und Q' eine sekundäre oder tertiäre Stickstoff enthaltende Gruppe oder eine sekundäre oder tertiäre Phosphor enthaltende Gruppe darstellt, die eine Substitution einer Gruppe aufweisen können, die aus einer Hydroxylgruppe, einer Alkylgruppe, einer Alkenylgruppe, einer Vinylgruppe, einer Allylgruppe, einer Phenylgruppe, einer Carboxylgruppe, einer eine Sulfonylgruppe enthaltenden Derivatgruppe bzw. einer Phosphoniumgruppe ausgewählt ist, so dass mindestens eine der Carbodiimid-Verbindung und der eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Verbindung eine funktionelle Gruppe aufweisen sollte, die aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe und einer Phosphogruppe ausgewählt ist, die eine Substitution eines Alkalimetalls, eines Erdalkalimetalls oder einer basischen Gruppe aufweisen, die ein Stickstoff- oder Phosphoratom enthält, um ein Reagieren der Carbodiimid-Verbindung mit der eine fluoreszierende Gruppe enthaltenden Verbindung zu ermöglichen.
Herstellungsverfahren nach Anspruch 7, welches die in Anspruch 4 definierte, eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Carbodiimid-Verbindung herstellt, wobei mindestens eine funktionelle Gruppe, die aus B, Y¹, Y², Y³, Y⁴, A und W ausgewählt ist, mindestens eine Gruppe aufweist, die aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe oder einer Phosphogruppe ausgewählt ist, die eine Substitution eines Alkalimetalls, eines Erdalkalimetalls oder einer basischen Gruppe aufweisen, die ein Stickstoff- oder Phosphoratom enthält.
Herstellungsverfahren nach Anspruch 7, welches die in Anspruch 5 definierte, eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Carbodiimid-Verbindung herstellt, wobei mindestens eine funktionelle Gruppe, die aus Y⁵, R⁴, R⁵ und F ausgewählt ist, mindestens eine Gruppe aufweist, die aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfongruppe, einer Phosphonogruppe oder einer Phosphogruppe ausgewählt ist, die eine Substitution eines Alkalimetalls, eines Erdalkalimetalls oder einer basischen Gruppe aufweisen, die ein Stickstoff- oder Phosphoratom enthält.
Verfahren zur Detektion einer Nukleinsäure durch Hybridisierung unter Verwendung einer Nukleinsäure, die mit einer Markierungssubstanz markiert ist, wobei die in Anspruch 2 definierte, eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Carbodiimid-Verbindung als die Markierungssubstanz verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die in Anspruch 4 definierte, eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Carbodiimid-Verbindung als die Markierungssubstanz verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die in Anspruch 5 definierte, eine fluoreszierende Gruppe enthaltende Carbodiimid-Verbindung als die Markierungssubstanz verwendet wird.