DE69209763T2

DE69209763T2 - Effektive Gensonden-Konjugationen mittels eines aussergewöhnlichen Mischanhydridverfahrens

Info

Publication number: DE69209763T2
Application number: DE69209763T
Authority: DE
Inventors: Say-Jong Law; Hana Lukinsky
Original assignee: Ciba Corning Diagnosys Corp
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1991-10-16
Filing date: 1992-10-14
Publication date: 1996-10-02
Anticipated expiration: 2012-10-15
Also published as: JPH05219998A; EP0537994A1; EP0537994B1; DE69209763D1; JP3390468B2; US5622825A

Description

Diese Erfindung betrifft eine effiziente Gensondenkonjugierung mit Hilfe eines unüblichen Mischanhydrid-Verfahrens; insbesondere betrifft sie ein Verfahren zur Konjugierung einer Markierung an ein aminoalkylfunktionalisiertes Polynukleotid, dadurch gekennzeichnet, daß es die Umsetzung eines Mischanhydrid- Zwischenprodukts, das von einer eine Carboxylgruppe enthaltenden Markierung abstammt, mit einem Polynukleotid umfaßt.
Gensonden sind wichtig im Bereich der Medizindiagnostik. Die Identifizierung von genetischem Material in einem Organismus kann dabei helfen, die Anfälligkeit dieses Organismus' für bestimmte Krankheiten vorherzusagen. Außerdem kann die Identifizierung von genetischem Material aus infektiäsen Organismen bei der genauen Bestimmung der Ursache von Erkrankungen hilfreich sein.
Das Gensondengebiet entwickelt sich seit mehreren Jahren und seine technische und allgemeine Literatur ist produktiv. Siehe z.B. Klausner et al., Bio/Technology, Aug. 1983, S. 471; Bylinsky, Fortune, 9. Juli 1984, S. 140; Engleberg, ASM News, Bd. 57, Nr. 4, 1991, S. 183; Gillespie, Veterinary Microbiology, 24 (1990) 217.
In Gensondentests ist eines der verwendeten Schlüsselreagenzien die Nukleinsäuresonde, die mit einer aktiven Molekülspezies konjugiert ist. Eine Nukleinsäuresonde ist eine einzelsträngige Nukleinsäuresequenz, die mit einer kamplementären einzelsträngigen Ziel-Nukleinsäuresequenz kombiniert (hybridisiert), so daß ein doppeisträngiges Molekül (Hybrid) gebildet wird. Die Sonde kann entweder vollständig synthetisch oder aus einer biologischen Quelle (rekombinante DNA) oder eine Kombination aus beidem sein.
Die aktive Molekülspezies kann u.a. ein Hapten, ein Ligand oder eine Lumineszenzmarkierung sein. Ein Hapten ist ein unvollständiges Antigen, das selbst keine Immunreaktion hervorrufen kann. Ist es jedoch geeigneterweise an ein anderes Molekül gebunden, kann es Antikörper erzeugen, die das Hapten spezifisch erkennen. Ein Ligand ist eine Verbindung, für die natürlicherweise ein Rezeptor existiert oder hergestellt werden kann. Ein Rezeptor ist eine Verbindung, die eine besondere räumliche und polare Anordnung eines Moleküls, d.h. Epitopstelle, erkennen kann. Beispielhafte Rezeptoren sind u.a. Antikörper, Enzyme, Antikörperfragmente (wie Fab-Fragmente), Lectine, Bestandteile des Komplementsystems, Rheumafaktoren, Hormone, Avidin, Staphylokokkenprotein A und dergleichen. Lumineszenzmarkierungen sind u.a. organische Chemikalien, organische Metallchelatkomplexe oder Biopolymere, die Licht mit längeren Wellenlängen aussenden können, wenn sie mit verschiedenen Energiequellen angeregt werden, die entweder in Form von Licht kürzerer Wellenlängen (Fluoreszenz) eingebracht werden oder aus dem Inneren des Moleküls selbst stammen als Folge von chemischer Umwandlung (Chemilumineszenz).
Bei einigen Tests, zum Beispiel in einem Sandwich-Test, können zwei Arten Nukleinsäuresondenkonjugate (Abfangsonde und Signalsonde) verwendet werden. Die Hauptaufgabe des Haptens oder Liganden in der Abfangsonde ist, das Abfangen von hybridisierten (reassozuerten) Nukleinsäuren (bestehend aus der Zielnukleinsäure und der Abfangsonde) durch Komplexieren mit dem anti-Hapten-IgG oder dem an einer Festphase immobilisierten Rezeptor zu vermitteln. Die Signalsonde erleichtert durch Hybridisieren an den Nachbarbereich der Zielnukleinsäure den Nachweis des Sandwich-Hybrids mittels seiner eingebauten Signalmarkierung, die entweder ein Signal erzeugen kann oder an ein Bindungsprotein spezifisch gebunden werden kann, das wiederum amplifizierte Signale trägt oder solche erzeugen kann. Ein amplifiziertes Signal kann beispielsweise ein Biotin/Avidin- System sein. Avidin, ein großes Molekül, kann mit mehreren Acridiniumestergruppen umgesetzt werden, so daß das entstandene modifizierte Avidinmolekül ein viel größeres Signal besitzt, als wenn nur der Acridiniumester vorliegt. Somit wird ein "amplifiziertes" Signal erhalten. Ein weiteres Beispiel eines ein amplifiziertes Signal tragenden Bindungsproteins ist das Rezeptor/Liposomen-System. Ein Liposom, ein zellähnliches Vesikel, kann Tausende geeignet modifizierte Acridiniumester (hydrophile Acridiniumester) oder andere Lumineszenzverbindungen einschließen und anschließend an eine Reihe von Rezeptoren auf seiner äußeren Oberfläche über kovalente Bindungen gebunden werden (siehe Parallel-Patentanmeldung EP-A-353971). Beispiele für Abfangund Signalsonden sind in Figur 1 gezeigt.
Für unsere Zwecke ist der Signaltyp nicht entscheidend. Dieser kann u.a. radioaktive, Lumineszenz-, Phosphoreszenz- und andere Typen von Signalen beinhalten, z.B. die Verwendung von Acridiniumestern, Phycobiliproteinen und indirekte Biotin-Avidin- oder alkalische Phosphatase-Systeme.
Man kennt viele Verfahren, mit denen man die Sonden an aktive Molekülspezies kuppelt. Diese sind u.a.: (1) Modifizieren des Purin- oder Pyrimidinanteils des Nukleotids oder (2) Binden bestimmter funktioneller Gruppen an das 5'- oder 3'-Ende der Sonde. Obwohl der zweite Ansatz der Funktionalisierung der 5-- oder 3'-Enden von Nukleinsäuren gewöhnlich bevorzugt ist, da die Interferenz zwischen den Sonden und den Ziel-Nukleinsäuren minimiert werden kann, können die Verfahren hier ebenfalls verwendet werden, um die einzelnen vorderivatisierten Basen der Polynukleotide zu modifizieren.
Beispielsweise kann die Arbeit von Chu & Orgel (PNAS, 82, 963-967) erwähnt werden, die die Konjugation eines mit EDTA oder DTPA 5'-aminoalkylfunktionalisierten Oligonukleotids durch Bilden eines zyklischen oder symmetrischen Anhydrids beinhaltet.
Es ist allgemein üblich, Polynukleotide von sogar mehr als 100 Basen Länge zu synthetisieren, da DNA-Synthesegeräte, die neben anderen Verfahren die Phosphoramidit- Kupplungschemie einsetzen, im Handel erhältlich sind. Mehrere Verfahren zur Funktionalisierung von Sonden an den 5'- oder 3'-Enden sind beschrieben worden. Agrawal et al., [Nucleic Acids Res., 14, (1986), 6227] befestigten ein Ribonukleosid am 5'-Ende des Desoxyoligonukleotids und oxidierten den Ribosylanteil mit Periodat, um die funktionellen Dialdehydruppen für das Kuppeln zu erzeugen. Außerdem sind eine Reihe von Desoxyoligonukleotid-Modifikatoren mit homologen Aminoalkyl- oder Mercaptoalkyl-Gruppen kommerziell erhältlich (z.B., bei dontech Laboratories, Inc., Pab Alto, CA). Diese können, wo sie erwünscht sind (am 3'-Ende, in der Mitte der Oligomerkette, oder am 5'-Ende), während der Herstellung der Oligonukleotide in einem automatischen Synthetisiergerät zugegeben werden.
Wenn eine aminoalkylfunktionalisierte Sonde für das Kuppeln ausgewählt wird, können Liganden, die eine Reihe funktioneller Gruppen tragen, zur Bildung stabiler Konjugate verwendet werden. Beispielsweise ist die Verwendung von Fluorescein mit Isothiocyanat (FITC), eine bereits aktivierte Ligandenform, in Nucleic Acids Res., Bd. 13 (1985) 1529 beschrieben worden. Die Verwendung von Biotin mit Carboxylat, beschrieben in Nucleic Acids Res. Bd. 14 (1986) 6227, erfordert die Voraktivierung mit N-Hydroxysuccinimid (NHS) für die Bildung von Biotin-NHS. In beiden Fällen wurden jedoch große Ligandenüberschüsse, die ein Molverhältnis von 500:1 übersteigen, benotigt, um die Reaktion durchzuführen und die Verwendung synthetischer Oligonukleotide zu maximieren. Der Einsatz eines solch hohen Beladungsverhältnisses ist bei denen, die diese Kupplungschemie anwenden, weitverbreitet. Vermutlich ist dieses wegen der Wasserunbeständigkeit und/oder der schwachen Reaktivität beider Aktivierungsformen notwendig. Die Ausbeute an Sondenkonjugat aus diesen Reaktionen ist vergleichsweise hoch (größer als 80%). Die Nachteile stehen jedoch mit der Verwendung eines Reaktanten im großen Überschuß in Zusammenhang, nämlich langwierige Verarbeitung, schwierige Reinigung und Kosten.
Ein neuartiges Verfahren für die Konjugierung von Haptenen, Liganden oder Lumineszenzmarkierungen an Polynukleotide ist entwickelt worden. Dieses Verfahren beinhaltet die Bildung eines Mischanhydrids, gefolgt von der Umsetzung des Mischanhydridzwischenproduktes mit einem eine nukleophile Gruppe enthaltenden Polynukleotid in einem DMF/Wasser-Lösungsmittelsystem. Die entstandene Verbindung wird besonders im Gensonden-Bereich verwendet.
Die begleitende anschauliche Figur 1 zeigt mehrere Gensonden-Sandwichtestkonfigurationen mit Abfang- und Signalsonden.
In der organischen Chemie ist eine Technik, wohlbekannt für die Umsetzung einer Verbindung, die eine Carboxylatgruppe enthält, mit einer Verbindung, die eine Amino- oder Sulfhydrylgruppe enthält, um ein stabiles Amid oder die weniger stabile Thioesterbindung zu bilden. Ein übliches Verfahren zur Carboxylatgruppen-Aktivierung ist die Herstellung eines Mischanhydrid-Derivats in nichtwäßrigen Medien. Die Technik beinhaltet die Aktivierung der Carboxylatgruppe mit einem Alkylchlorformiat oder Arylchlorformiat, um ein reaktives Mischanhydrid- Zwischenprodukt zu bilden, das weiter mit der Amino- oder Sulfhydrylgruppe der zweiten Verbindung unter Bildung eines Konjugates reagiert. Siehe z.B. Schroeder et al., Methods in Enzymology, Bd. 57 (1978), S. 424, die die Herstellung eines Thyroxin-Isoluminol-Konjugates mit einem Mischanhydrid- Verfahren unter Verwendung eines wasserfreien organischen Läsungsmittelgemischs als Lösungsmittel beschrieben. Law [Parallelanmeldung EP-A-307175] verwendete diese Technik in einem wasserfreien Chloroform/DMF-Gemisch, um ein Thyroxin- Succinat-Phosphatidylethanolamin-Konjugat herzustellen. Eine wäßrige Umgebung wird vermieden, da das Mischanhydrid- Zwischenprodukt stark reaktiv ist und gegenüber Feuchtigkeit sehr empfindlich ist und da möglicherweise Nebenreaktionen an den Purin- oder Pyrimidinringen des Nukleotids eintreten können, was somit die Hybridisierung behindert.
Man fand unerwarteterweise, daß die durch das Mischanhydridverfahren aktivierten Liganden unter wohlausgewählten Bedingungen gut mit dem aminoalkylfunktionalisierten Oligonukleotid in Dimethylformamid (DMF)/Wasser-Gemischen reagieren können, was eine vergleichbare Ausbeute an Sondenkonjugat bei einem viel geringeren Beladungsverhältnis von 20:1 erzeugt.
Das Reaktionsschema beinhaltet die Aktivierung der carboxylathaltigen Liganden mit einem Alkyl- oder Arylchlorformiat in einem wasserfreien organischen Lösungsmittel, um das reaktive Mischanhydrid-Zwischenprodukt als erste Stufe der Kupplung zu bilden, siehe Reaktion A. REAKTION A Ligand organische Base Chlorformiat organische Base HCL Mischanhydrid
In dem Chlorformiat ist R Aryl, eine geradkettige oder verzweigte Alkyl- oder Aralkylgruppe mit 1-20, bevorzugt 1-8, am stärksten bevorzugt 1-4 Kohlenstoffatomen. Beispiele üblicherweise verwendeter Chlorformiate sind Ethyl-, Isobutyl-, Benzyl- und Phenylchlorformiate. Eine organische Base, wie Triethylamin, wird gewöhnlich an der Reaktion beteiligt und dient als Akzeptor der Salzsäure, einem Nebenprodukt bei der Bildung des Mischanhydrids.
Das Molverhältnis von Ligand Chlorformiat organische Base kann auf 1:1:1 eingestellt werden oder auf mehrfachen überschuß von Chlorformiat und organischer Base, um vollständige Aktivierung der Carboxylatgruppe des Liganden zu gewährleisten. Die verwendeten wasserfreien organischen Lösungsmittel sind bevorzugterweise aprotische Lösungsmittel, die je nach der Löslichkeit des Liganden vom weniger polaren Chloroform bis zu dem stärker polaren DMF reichen können. Man kann auch Lösungsmittelgemische in verschiedenen Verhältnissen verwenden (Siehe Beispiele in der Parallelpatentanmeldung EP-A-361817).
Die Reaktion wird gewöhnlich bei Umgebungstemperatur, jedoch bevorzugt bei niedrigeren Temperaturen bis hinunter zu -20ºC und am stärksten bevorzugt in einem Eisbad durchgeführt. Die Temperatur wird bei Umgebungs- oder vorzugsweise niedrigerer Temperatur gehalten, um unkontrollierte exotherme oder Nebenreaktionen, insbesondere beim Scale-up zu vermeiden. Temperaturen zwischen 0-15ºC werden allgemein für Reaktionen beschrieben, bei denen Ethylchlorformiat verwendet wird. Die Reaktionsdauer kann wenige Minuten bis zu einer Stunde betragen, vorzugsweise 30 Minuten nach Mischen sämtlicher Reaktanten. Die Aufarbeitung der Reaktion sollte unter vollständiger Verdampfung sämtlicher flüchtiger Stoffe erfolgen, um überschüssiges Chlorformiat zu entfernen und um die zweite Stufe der Kupplungsreaktion vorzubereiten. Überschüssiges Chlorformiat wird (sofern dies angebracht ist) entfernt, um Schwierigkeiten zu vermeiden, die aufgrund unerwünschter Reaktionen zwischen dem Chlorformiat und den funktionellen Gruppen des Oligonukleotids entstehen können.
In der zweiten Stufe der Reaktion (siehe Reaktion B), wird das Mischanhydridzwischenprodukt mit dem 3'- oder 5'- Ende des aminoalkyl- oder mercaptoalkylfunktionalisierten Oligonukleotids unter Verwendung eines Gemischs aus einem organischen Lösungsmittel und Wasser als Lösungsmittelsystem umgesetzt. Das organische Lösungsmittel ist vorzugsweise Dimethylformamid (DMF), wie in dem folgenden Reaktionsschema gezeigt ist. R' ist je nach der Konstruktion der aminoalkyl- oder sulfhydryltragenden Modifikatoren vorzugsweise eine geradkettige oder verzweigte Alkylgruppe, kann jedoch auch Heteroatome und/oder Arylgruppen enthalten. REAKTION B Ende Oliganonucleotid Ligand organische Base
In der Reaktion wurden Oligonukleotide und Polynukleotide verschiedener Länge verwendet, wobei diese Ausdrücke untereinander austauschbar verwendet werden. Das Schema ist für Kettenlängen von bis zu 100 Nukleotiden oder noch länger, jedoch vorzugsweise für Kettenlängen bis zu 40 Nukleotiden geeignet.
Das nukleophilhaltige Oligonukleotid wird in wäßrigem Medium bei Konzentrationen von 1 bis 0,01 mM, vorzugsweise 0,1 bis 0,025 mM gelöst. Eine Vorbehandlung der aminoalkylfunktionalisierten Oligonukleotidlösung mit überschüssiger organischer Base wie Triethylamin bis zu einem bofachen molaren überschuß ist z.B. erforderlich, damit die Aminogruppe des Oligonukleotids sicher frei ist, um reagieren zu können. Die Vorbehandlung wird unmittelbar oder mehrere Stunden vor dem Mischen des Oligonukleotids mit dem Mischanhydridzwischenprodukt durchgeführt. Der Rückstand, der das frisch hergestellte Mischanhydridzwischenprodukt enthält, wird dann in DMF aufgenommen und die Lösung tropfenweise zu der Oligonukleotidlösung zugegeben.
Damit sämtliche Reaktanten gut löslich bleiben, liegt das DMF/Wasser-Gemisch in dem endgüligen Reaktionsgemisch gewöhnlich im Bereich von 9:1 bis 1:9, vorzugsweise von 4:1 bis 1:4 und stärker bevorzugt bei etwa 1:1. Das erforderte DMF-Endvolumen wird gewöhnlich derart bestimmt, daß das Mischanhydridzwischenprodukt in einem geeigneten Volumen DMF gelöst werden kann und daß die erwünschte Menge der Lösung für die Kupplung in einer Reaktion im sehr kleinen Maßstab aliquotiert werden kann. Das Mischanhydridzwischenprodukt wird gewöhnlich in dem erwünschten molaren Überschuß von 5- bis weniger als 500fach, bevorzugt 10- bis 200fach und am stärksten bevorzugt 20- bis 100fach zugegeben.
Die Kupplungsreaktion wird gewöhnlich bei Raumtemperatur 0,5 Stunden lang bis über Nacht lang fortgesetzt. Der Einsatz niedrigerer Temperatur während der kürzesten Reaktionszeit kann notwendig sein, um die Stabilität labiler Reaktanten zu verbessern.
Das Konjugat kann über ein Zweischrittverfahren gereinigt werden. Der erste Schritt beinhaltet: das Trennen molekularer Bestandteile nach der Größe unter Verwendung von z.B. Gel-Permeationschromatographie. Bei diesem Schritt werden kleine Molekülverbindungen, einschließlich dem Liganden und dessen unkonjugierte Derivate von dem makromolekularen Oligonukleotid getrennt.
Eine weitere Trennung des nicht umgesetzten Oligonukleotids aus dem Konjugat erfolgt durch Umkehrphasen- HPLC. Beide Chromatographieverfahren (Gelpermeation und Umkehrphasen-HPLC) sind im Fachgebiet wohlbekannt. Wegen der Bindung des hydrophoberen Liganden wird das Konjugat gewöhnlich länger auf der HPLC-Säule gehalten und gut vom nicht umgesetzten Oligonukleotid getrennt. Die Effizienz der Umwandlung des Oligonukleotids in das Konjugat kann aus dem mit einem Integrator/Aufzeichnungsgerät ausgerüsteten HPLC- System bestimmt werden.
Man fand, daß viele carboxylathaltige Liganden, die in Bindungstests häufig verwendet werden, mit dieser Mischanhydridaktivierung (d.h. keine komplizierten Nebenreaktionen) kompatibel sind. Sie können effizient mit den aminofunktionalisierten Nukleinsäuren konjugiert werden. In dieser Gruppe sind polysubstituierte Aryl-Acridiniumester (z.B. der Dimethylester, DMAE, beschrieben in US-Patent Nr. 4745181), Biotin und diazetyliertes 5'-Carboxyfluoreszein. Deren Strukturen sind nachstehend gezeigt. diazetyliertes Carboxyfluorescein Biotin
Liganden, die keine Carboxylgruppen haben, muß man in carboxyltragende Analoga derivatisieren, um sie an aminofunktionalisierte Polynukleotide unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren zu kuppeln. Diese Technik kann auch verwendet werden, wenn die Liganden verschiedene funktionelle Gruppen besitzen [beispielsweise 2,4- Dinitrofluorbenzol (DNFB) oder 2,4-Dinitrobenzolsulfonat (DNBS)] oder wenn die Aktivierung komplexe/vielfache Produkte (z.B. die Diazotierung von Arsanilsäure) zur Folge haben kann. Man kennt zahlreiche Verfahren zur Einbringung einer Carboxylatgruppe. Beispielsweise kann DNFB mit β-Alanin unter Bildung des 3-(2',4'-Dinitrophenylamino)propionsäure-(DNP- Ala)-Derivats mit einer gebundenen Carboxylatgruppe umgesetzt werden. Dieses Ligandenanalogon kann dann durch das neuartige Mischanhydridverfahren in ein funktionelles Sondenkonjugat umgewandelt werden. Andere Beispiele für die Verwendung mit diesem Kupplungsverfahren beinhalten o- oder p-Arsanilsäure. Der Ligand kann auch mit einem zyklischen Anhydrid wie Bernsteinsäureanhydrid derivatisiert werden, so daß die carboxylathaltige Hemisuccinamidoarsanil säure entsteht. Ersatzweise kann eine bifunktionelle Verbindung, die eine Carboxylatgruppe und einen Phenolteil enthält, mit einer diazotierten Arsanilsäure umgesetzt werden, um ein carboxylathaltiges Azoarsanilderivat zu bilden. Strukturen der Verbindungen sind nachstehend gezeigt. o- oder p-Arsanilsäure carboxylathaltige Hemisuccinamido-Arsanilsäure carboxylathaltiges Azoarsinilsäurederivat X = Seitenkette
Mit dieser Technik hergestellte Sonden sind in dem neuartigen Hybridiserungsassay für Campylobacter rRNA verwendet worden, siehe zum Beispiel EP-A-425217, basierend u.a. auf US-Anmeldenummer 426387. [Anmerkung: Das Nomenklatur-/Nummerierungs-System, das für die Sonden in dieser Anmeldung verwendet wird, unterscheidet sich jedoch von dem dort verwendeten System.] Diese Verbindungen sind jedoch weder öffentlich verwendet worden, noch ist ihr Syntheseverfahren zuvor offenbart worden.
Die folgenden Beispiele beschreiben verschiedene Gesichtspunkte der Herstellung, Reinigung und Analyse von Verbindungen, die anhand der vorliegenden Technik hergestellt wurden.

BEISPIEL 1

Derivatisierung einer Markierung ohne Carboxylatgruppe in ein carboxylhaltiges Analogon

Herstellung von 3-(2',4'-Dinitrophenylamino)propionsäure (DNP-Ala)

Zu einer Lösung aus beta-Alanin (1,0 g, 11,1 mMol) in 50 ml 1 M NaHCO&sub3; wurde 2,4-Dinitrofluorbenzol (10,4 g, 56 mmol) in 100 ml Ethanol gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden lang gerührt und verdampft, um die flüchtigen Stoffe im Vakuum zu entfernen. Der Rückstand wurde in einen Scheidetrichter mit Wasser überführt und zweimal mit Ethylether gewaschen. Die wäßrige Schicht wurde mit 1 N HCl angesäuert, bis die Fällung beendet war. Das Gemisch wurde filtriert, und der nasse Filterkuchen wurde mit Ether gewaschen. Dieses Reinigungsverfahren, ausgehend vom Lösen des Feststoffes in 1M NaHCO&sub3;, Waschen des Ethers und Fällen mit 1 N HCl wurde auf gleiche Weise wiederholt, so daß ein gelber Feststoff entstand (1,6 g, 77%). e(Me (OH) = 7900 (260 nm), 15900 (350 nm). Die NMR-Spektroskopieanalyse stimmte mit der Struktur überein.

BEISPIEL 2

Herstellung des Konjugates

Das allgemeine Verfahren zur Herstellung von Ligand-/Nukleinsäure-Konjugat durch das unübliche Mischanhydridverfahren wird nachstehend beschrieben, wobei als Beispiel die Herstellunng der 5'-Biotinsonde CJ 641.31 verwendet wurde. Die Sonde CJ 641.31 hat die Sequenz 5'-TCT GCC TCT CCC TCA CTC TAG ACT ATG AGT T-3'.

(A) Herstellung von Biotin-Mischanhydrid-(Biotin-MA)- Zwischenprodukt:

Zu einer Lösung aus Biotin (2 mg, 8,2 µMol) (Anmerkung 1) in 2 ml wasserfreiem DMF (Aldrich, Milwaukee, WI, Katalog-Nr. #22705-6), die in einem Eisbad mehrere Minuten lang vorgekühlt wurde, wurden Triethylamin (6,9 µl 49 µMol) und Ethylchlorformiat (2,4 µl, 25 µMol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten lang im Eisbad gerührt, mit 2 ml Xylenen behandelt und bis zur Trockne im Vakuum verdampft.

(B) Konjugation von 5'-Aminoalkyl-CJ 641.31 mit Biotin- Mischanhydrid:

Zu einem mit einem 1/8 Inch x 1/2 Inch Rührstab ausgerüsteten 2-4-ml-Gefäß wurde das 5'-Aminoalkyl- CJ 641.31 (4 nMol, Promega Corp. Madison, WI) in 200 µl Wasser gegeben. Die Lösung wurde mit Triethylamin (400 nmol) in etwa 7 µl DMF behandelt und 3 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Zu dem aus Präparation (A) erhaltenen Rückstand, der das aktivierte Biotin enthält, wurde 1 ml DMF zugegeben. Ein 48,8 µl-Aliquot dieser Biptin-MA-Lösung, die 400 nMol Äquivalent des aktivierten Biotins enthielt, wurde zu der CJ 641.31-Lösung gegeben. Weitere 145 µl DMF und 400 nMol Triethylamin in 7 µl DMF wurden sofort zu der CJ 641.31- Lösung gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde dann bei Raumtemperatur über Nacht gerührt.

(C) Zwei-Schritt-Isolierung des Biotin-CJ-641.31- Konjugates:

1. Gelpermeation: Das Reaktionsgemisch aus Präparation (B) wurde durch eine Sephadex-(Handelsmarke von Pharmacia) G25 (fein)-Säule (1x40cm) geleitet, die mit Wasser gepackt und eluiert wurde. Der Peak des bei 260 nm überwachten Hohlraurnvolumens wurde gesammelt und auf etwa 0,5 ml in einem Rotationsverdampfer eingeengt. Der gesammelte Peak wurde auf die gleiche Weise durch eine weitere frische Sephadex-G25- Säule geleitet, um eine sauberere Trennung zu bewirken.
2. HPLC: Die Chromatographiebedingungen sind wie folgt:
Säule: Aquapore (Warenzeichen von Ramm) C8, RP300, 4,6 mm x 25 cm (Ramm, Woburn, MA)
Lösungsmittel: 0,1 M Et&sub3;NHOAc, pH-Wert 7,2-7,4 (als Lösungsmittel A), Acetonitril (als Lösungsmittel B) Gradient (linear): 8% bis 20% B über 20 Minuten, bis 40% B über 10 Minuten, bis 90% B über 5 Minuten.
Fließgeschwindigkeit 1ml/min
Nachweis: 254 oder 260 nm
Das Sondenkonjugat, das als Hauptpeak mit einer Retentionszeit von etwa 12,7 Min. erschien, wurde gesammelt und auf korrekte Mobilität und Reinheit auf einem 12%igen denaturierenden Polyacrylamidgel analysiert, wobei es neben den Oligonukleotidmarkern wanderte. Sämtliche mittels Gelelektrophorese analysierte Proben wurden mit ³²P-haltigern Phosphat oder Cordycepintriphosphat am 5'- bzw. 3'-Ende enzymatisch vormarkiert, um sie sichtbar zu machen. Nach dem Gellauf wurde eine Autoradiographie durchgeführt, um das Mobilitäts-(Banden-)Muster jeder Probe auf einem Film zu erhalten. Diese Gel-Autoradiographie-Technik ist die übliche Praxis, die täglich in einem molekularbiologischen Labor durchgeführt wird (Literaturstelle: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, S. 173, 1982, T. Maniatis, Hrsg., Cold Spring Harbor Laboratory).
Bemerkung: Biotin wurde im überschuß verwendet, so daß das Wiegen vereinfacht wurde. Der Maßstab der Präparation (A) konnte proportional gesenkt werden, da nicht das gesamte Biotin-MA in der Konjugierung verwendet wurde.

BEISPIEL 3

Herstellung von zum Nachweis von Campylobacter geeignete Sonden

Die in Beispiel 2 verwendeten Techniken wurden ähnlich verwendet, um andere Sonden herzustellen. Deren Sequenzen sind unten im Abschnitt "Sequenzliste" dieser Patentanmeldung gezeigt.
Sonde CJ 437.27
Sonde CF 1107.27
Sonde CJ 706.27
Diese drei Sonden eignen sich zusätzlich zu der in Beispiel 2 beschriebenen Sonde CJ 641.31 für den Nachweis von Campylobacter.

BEISPIEL 4

Herstellung von Nukleinsäuren und Konjugaten

Ein übliches Verfahren zur Herstellung von 3'-Aminoalkyl funktionalisierten Nukleinsäuren und den 3'-Ligand- Nukleinsäure-Konjugaten durch das unübliche Mischanhydridverfahren wird nachstehend beschrieben, wobei die Herstellung von 3'-DMAE-SYOMPA 480.24 als Beispiel dient. Die Sequenz dieser Sonde ist nachstehend im Abschnitt "Sequenzuste" gezeigt. Diese Sonde eignet sich zum Nachweis von Salmonella.

(A) Herstellung von 3'-Aminoalkyl-SYOMPA 480.24:

Die Titelverbindung wurde mit einem DNA-Synthesegerät der Marke Applied Biosystems 391 synthetisiert, wobei ein Trityl- ON-Programm und eine 1 µMol 3'-Amin-ON-CPG-Säule von Clontech Laboratories, Inc. verwendet wurde. Das Spalten des fertigen Oligonukleotids aus CPG und das Entfernen der Schutzgruppe mit Ammoniumhydroxid erfolgte 2 Std. lang bei Raumtemperatur und anschließend bei 55ºC über Nacht. Die Lösung wurde getrocknet. Der Rückstand wurde in Wasser aufgenommen und durch HPLC mit folgenden Bedingungen gereinigt:
Säule: Aquapore C8, RP-300, 7,0 mm x 25 cm (Ramm, Woburn, MA).
Lösungsmittel: Gemisch aus 0,1 M Et&sub3;NHOAc, pH-Wert 7,4 (als Lösungsmittel A) und Acetonitril (als Lösungsmittel B)
Gradient: 8% B bis 18% B über 3 Minuten, Halten bei 18% B während 5 Minuten, 18% B bis 20% B über 20 Minuten.
Fließgeschwindigkeit: 2,32 ml/min
Nachweis: 254 nm
Der Hauptpeak bei 15-16 Minuten, der das 5'-Trityl-3'- aminoalkkyl-SA24 enthielt, wurde gesammelt, verdampft und in 600 µl Wasser aufgenommen. Detritylierung erfolgte, indem die Lösung mit einem gleichen Volumen 2%iger Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur während 8 Minuten behandelt wurde, gefolgt von Neutralisierung mit 600 µl 10fach verdünntem NH&sub4;OH- Konzentrat. Das Reaktionsgemisch wurde in einem Rotationsverdampfer getrocknet. Der Rückstand wurde in Wasser aufgenommen und durch HPLC unter folgenden Bedingungen gereinigt:
Säule: wie oben
Lösungsmittel: wie oben
Gradient: 5% B bis 13% B über 20 Minuten, 13% B bis 40% B über 5 Minuten, 40% B bis 60% B über 5 Minuten.
Fließgeschwindigkeit: wie oben
Nachweis: wie oben
Der Hauptpeak bei 20-21 Minuten wurde gesammelt, verdampft und erneut durch HPLC unter den folgenden Bedingungen gereinigt:
Säule: wie oben
Lösungsmittel: wie oben
Gradient: 5% B bis 15% B über 50 Minuten
Fließgeschwindigkeit: wie oben
Nachweis: wie oben
Der Hauptpeak bei 34-35 Minuten wurde gesammelt, getrocknet und in Wasser aufgenommen.

(B) Konjugation von 3'-Aminoalkyl-SYOMPA 480.24 mit DMAE-Mischanhydrid:

Das 3'-Aminoalkyl-SYOMPA 480.24 wurde mit 100 fachem molaren Überschuß Triethylamin 3 Stunden lang bei Raumtemperatur vorbehandelt. Das DMAE-Mischanhydrid wurde auf die gleiche Weise wie für das Biotin-Mischanhydrid in Beispiel 2, Abschnitt (A), beschrieben, hergestellt. Die Kupplung wurde in jeweils 150 µl Dimethylformamid und Wasser mit einem 100 fach molaren überschuß an DMAE-Mischanhydrid und einer zusätzlichen ähnlichen Menge an Triethylamin durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, durch eine Sephadex-G25-Säule geleitet und mit Wasser eluiert. Der erste Peak wurde gesammelt und in einem Rotationsverdampfer eingeengt. Das Konzentrat wurde durch HPLC unter folgenden Bedingungen weiter gereinigt:
Säule: Aquapore C8, RP-300, 7,0 mm x 25 cm (Ramm, Woburn, MA).
Lösungsmittel: Gemisch aus 0,1 M Et&sub3;NHOAC, pH-Wert 7,4 (als Lösungsmittel A) und Acetonitril (als Lösungsmittel B)
Gradient: 8% B bis 20% B über 20 Minuten, 20% B bis 40% B über 10 Minuten, 40% B bis 60% B über 10 Minuten.
Fließgeschwindigkeit: 2,32 ml/min
Nachweis: 254 nm
Ein Peak bei 21 Minuten als das erwünschte Produkt wurde gesammelt und getrocknet. Der Rückstand wurde in 400 µl Wasser aufgenommen und ein geringes Aliquot der Sondenkonjugatlösung wurde wie in Beispiel 2 beschrieben analysiert.

BEISPIEL 5

Optimierung der Reaktion

Es wurde ein Experiment durchgeführt, um die verschiedenen zur Aktivierung des Liganden verwendeten chemischen Spezies und die Reaktivität der verschiedenen endständigen Gruppen an dem Polynukleotid zu bewerten (siehe Tabelle 1). Die Untersuchung der Umsetzung verschiedener aktivierter Dimethylacridiniumester (DMAE) mit Polynukleotiden zeigte, daß das Polynukleotid mit der endständigen 5'-Hydroxygruppe (5'-OH-PM1) nicht wesentlich mit dem Mischanhydrid-Zwischenprodukt reagierte. Dies zeigt, daß die Nebenreaktionen mit Purin- oder Pyrimidingruppen des Oligonukleotids geringfügig sind. Außerdem reagiert DMAE, das mit N-Hydroxysuccinimid aktiviert ist (DMAE-NHS), nicht wesentlich mit dem Polynukleotid bei einem niedrigen Beladungsverhältnis von 20:1. TABELLE 1 Effizienz der DMAE-Markierung für Polylinker PM1 Reaktanten Molares Reaktions-Verhältnis Markierungs-Effizienz

Claims

1. Verfahren zur Konjugierung einer Markierung an ein aminoalkyl-funktionalisiertes Polynukleotid, dadurch gekennzeichnet, daß es die Umsetzung eines Mischanhydrid-Zwischenprodukts, das von einer eine Karboxylgruppe enthaltenden Markierung abstammt, mit einem Polynukleotid umfaßt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Reaktion in einem organischen Lösungsmittel / wäßrigen Lösungsmittelsystem stattfindet.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das organische Lösungsmittel Dimethylformamid ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 3, wobei die Markierung Haptene, Liganden oder lumineszierende Markierungen umfaßt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 4, wobei die Bildung des Zwischenprodukts die Umsetzung einer Markierung mit Chiorformiat in Gegenwart einer organischen Base um-

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die organische Base Triethylamin ist.

7. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Chiorformiat ROC(O)Cl ist, wobei R Aryl, Alkyl oder Aralkyl mit bis zu Kohlenstoffatomen darstellt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 7, wobei die Markierung Karboxylat enthält.

9. Verfahren nach Anspruch 5, wobei zuerst eine kein Karboxylat enthaltende Markierung mit einer Karboxylat enthaltenden Verbindung zur Bildung einer Karboxylat enthaltenden Markierung vor der Reaktion mit dem Chiorformiat umgesetzt wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 9, wobei das aminoalkyl-funktionalisierte Polynukleotid ein reaktives Amin an seinem 3'- oder 5'-Ende aufweist.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 - 10, wobei das Lösungsmittelsystem ein Verhältnis von organischem Mittel zu Wasser von 9:1 bis 1:9 aufweist.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 11, wobei die flüchtigen Stoffe verdampft werden.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 12 bei Verwendung zur Herstellung einer Konjugat-Gensonde, die für Campylobacter 165 rRNA oder Salmonella OmpA-Gen spezifisch ist, wobei die Sonde eine Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der nachfolgenden Gruppe, umfaßt:

(a) Sonde CJ 437.27: 5'-GTA CCG TCA GAA TTC TTC CCT AAG AAA-3'

(b) Sonde CJ 641.31: 5'-TCT GCC TCT CCC TCA CTC TAG ACT ATG AGT T-3'

(c) Sonde CF 1107.27: 5'-TGT TAG CAA CTA AAT ACG TGG GTT GCG-3'

(d) Sonde CJ 706.27: 5'-GCC TTC GCA ATG GGT ATT CTT CGT GAT-3'

(e) Sonde SYOMPA 480.24: 5'-AAA GCT CAG GGC GTT CAG TTG ACC-3'